KR102817181B1 - 유로피움착물 비드를 포함하는 형광 진단 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에서 제공하는 형광진단조성물은 유로피움 착화합물을 유효성분으로 사용하고, 상기 유로피움 착화합물을 폴리스티렌과 물리적 또는 화학적으로 결합시켜 제조된 폴리스티렌형광비드를 형광 프로브로서 사용하는 형광 면역진단 조성물에 관한 것이고, 본 발명에서 제공하는 형광 면역진단 조성물은 존속시간이 길고 강도가 높은 형광신호를 발산할 수 있고, 폴리스티렌의 표면을 개질함으로써 다양한 단백질, 항체 등 생체물질을 검출할 수 있다는 장점이 있다.

Description

유로피움착물 비드를 포함하는 형광 진단 조성물{Flourescent diagnostic composition containing europium-complex beads}

본 발명은 유로피움과 유기화합물이 결합된 유로피움 착물을 포함하는 형광 면역진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 유로피움 착물은 폴리스티렌과 물리적 또는 화학적으로 결합하여 폴리스티렌형광비드를 형성하여 제조되고, 상기 비드는 형광 면역진단 조성물에서 형광을 발산하는 역할을 수행한다.

형광을 발산하는 유로피움은 주로 유기인산계 화합물과 착물을 형성하여 전자소자로서 사용되는 형광화합물이다. 본 발명에서는 상기 유로피움착물을 폴리스티렌 매개체에 담지하여 폴리스티렌형광비드를 형성하도록 제조하고, 상기 형광비드를 유효성분으로 하여 제조된 단백질, 세균 등 생체물질을 검출하기 위한 면역진단 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에서 제공하는 진단 조성물을 사용하여 다양한 생체물질을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 생세포 소기관을 형광 영상을 통해서 이미지화할 수 있다.

일반적으로 형광 면역진단 조성물은 형광을 발산하는 화합물을 프로브로 이용하여 생체물질을 검출함으로써 질병의 상태 또는 세균 등의 존재 유무를 진단하기 위한 조성물이다. 상기와 같은 형광 면역진단 조성물에 사용되는 형광물질로서 사용되기 위해서는 형광강도가 높고 형광의 존속시간이 긴 형광화합물을 사용하는 것이 일반적이다.

본 발명은 종래에 주로 전자소자로 사용되는 유로피움 착화합물을 유효성분으로 사용하고, 상기 유로피움 착화합물을 폴리스티렌과 물리적 또는 화학적으로 결합시켜 폴리스티렌형광비드를 제조한 후에, 이를 형광면역 진단조성물의 프로브로 사용하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기와 같이 폴리스티렌형광비드를 제조함으로서 폴리스티렌의 표면을 개질하여 항원, 항체, 단백질 파편 등에 특이적으로 결합할 수 있는 특징으로 부가하고, 이를 통해서 질병의 원인이 되는 항원이나 세균 등을 이미지화 할 수 있다.

국내특허공보 10-1079789

일반적으로 형광 면역진단 조성물은 형광을 발산하는 화합물을 프로브로 이용하여 생체물질을 검출함으로써 질병의 상태 또는 세균 등의 존재 유무를 진단하기 위한 조성물이다. 상기와 같은 종래의 형광 면역진단 조성물에 사용되는 형광 화합물은 대체적으로는 존속시간이 짧고 진폭이 낮은 형광을 발산함으로써 형광 신호가 낮아 특정 물질을 검출하는 데에 다수의 시행착오가 발생하여 진단 결과의 신뢰도가 낮아질 수 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 종래에 주로 전자소자로 사용되는 유로피움 착화합물을 유효성분으로 사용하고, 상기 유로피움 착화합물을 폴리스티렌과 물리적 또는 화학적으로 결합시켜 폴리스티렌형광비드를 제조한 후에, 이를 형광면역 진단조성물의 프로브로 사용함으로써 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 유로피움과 유기화합물의 결합체인 유로피움착화합물을 형광화합물로서 사용하고, 상기 유로피움착화합물을 폴리스티렌과 물리적 또는 화학적으로 결합시켜 폴리스티렌형광비드를 사용함으로써 상기의 문제점을 해결할 수 있었다.

본 발명에서 사용되는 유로피움착화합물은 아래와 같은 화학식에 포함되는 범주의 화합물이다.

상기 화학식은 본 발명에서 사용되는 유로피움착화합물의 일부이고, 하기에서 본 발명의 유로피움착화합물에 대해서 자세히 설명하겠다.

본 발명에서 제공하는 형광진단조성물은 유로피움 착화합물을 유효성분으로 사용하고, 상기 유로피움 착화합물을 폴리스티렌과 물리적 또는 화학적으로 결합시켜 제조된 폴리스티렌형광비드를 형광 프로브로서 사용하고 있고, 상기 형광면역 진단조성물을 형광프로브로서 사용함으로써 종래의 형광 화합물을 이용한 진단 조성물에 비하여 존속시간이 길고 강도가 높은 형광신호를 발산할 수 있고, 이로 인해서 단백질, 항체 등 생체물질을 검출할 경우에 적은 양으로도 정확하게 검사할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 유로피움화합물의 용해도 및 형광을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 유로피움폴리스테린형광비드의 제타포텐셜을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 제공하는 유로피움과 폴리스티렌이 결합하여 비드를 형성한 후에 측정한 유로피움폴리스테린형광비드의 직경을 나타낸다.
도 4는 유로피움과 결합하지 못한 폴리스티렌비드의 직경을 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 유로피움폴리스테린형광비드를 포함하는 형광진단 조성물의 형광강도를 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 화합물 1과 폴리스티렌이 결합하여 형성된 유로피움폴리스테린형광비드를 포함하는 형광진단 조성물의 형광스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 화합물 3과 폴리스티렌이 결합하여 형성된 유로피움폴리스테린형광비드를 포함하는 형광진단 조성물의 형광스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 본 발명에서 제공하는 유로피움폴리스테린형광비드를 포함하는 형광진단 조성물을 이용한 형광이미지를 측정한 결과를 나타낸다.

이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

유로피움은 원자기호 Eu로 표시하고 란타넘족에 속하는 희토류 원소이다. 유로피움은 희토류 원소 중에서도 가장 존재비가 적은 원소로서, 주로 천연상태보다는 유기화합물과의 결합체인 착물상태로 존재하고 생물학적 반응성이 적고 독성이 없다. 유로피움은 일반적으로 2가 내지 3가의 이온을 나타내는 반응성이 매우 큰 금속으로서 용도가 제한적이며, 대게는 레이져 재료로 박막 전도체 합금 제조에 사용되거나 중성자를 흡수하는 능력 때문에 원자로에서 제어막대 물질로 이용된다. 또한 유로피움의 이러한 성질을 이용하여 전기제품의 적색 및 청색 형광체를 나타내는 전자소재를 제조하는데 사용된다.

본 발명에서는 상기와 같은 유로피움 착물을 폴리스티렌 매트릭스에 물리적 또는 화학적으로 결합하여 형광폴리스티렌비드를 제조하였고, 상기 형광폴리스티렌비드를 시료에 첨가된 생체물질을 검출 및 진단하기 위한 형광 프로브로서 사용한 형광 면역진단 조성물을 제공한다.

상기와 같이 본 발명의 형광 프로브는 형광폴리스티렌비드를 형성하도록 제조되는데, 폴리스티렌은 표면을 다양한 작용기로 개질할 수 있다는 장점이 있어서, 본 발명에서 제공하는 유로피움형광폴리스티렌비드는 다양한 생체물질의 검출 및 진단에 활용할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명은 하기의 화학식 1 내지 5로 표현되는 유로피움착화합물과 폴리스티렌을 결합시켜 형성된 유로피움-폴리스티렌형광비드를 프로브로 하는 생체물질 등을 검출 및 진단하기 위한 형광면역진단조성물에 관한 것이다.

(화학식 1)

상기 화학식에서 R₁은 수소 또는 -NH₂이고, R₂ 및 R₃는 서로 독립적으로 메틸, 페닐, 티오펜, CX₃ 중에서 선택되는 어느 하나이고, X는 할로겐이다.

(화학식 2)

상기 화학식에서 R₄는 페닐 또는 이다.

(화학식 3)

(화학식 4)

(화학식 5)

상기 식에서 R₅는 -OH 또는 이다.

상기 화학식 1 내지 5에 해당되는 구체적인 화합물은 하기의 화합물 1 내지 10이다.

[화합물 1]

[화합물 2]

[화합물 3]

[화합물 4]

[화합물 5]

[화합물 6]

[화합물 7]

[화합물 8]

[화합물 9]

[화합물 10]

본 발명에서는 상기의 화학식 1 내지 5로 표현되는 유로피움 착화합물과 폴리스티렌을 결합시킨 형광폴리스티렌비드를 제조하고 이를 생체물질의 검출 및 진단을 위한 형광 면역진단 조성물을 제조하였으며, 상기 형광 면역진단 조성물을 이용하여 생체물질을 검출한 결과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기의 유로피움 착화합물과 폴리스티렌 매트릭스를 결합시켜 형광 폴리스티렌비드를 제조하는 과정은 다음과 같다.

상기 화학식 1 내지 5로 표시되는 유로피움 착화합물을 중 하나를 선택하여 용매에 용해시키는 제1단계;

제1단계의 유로피움 착화합물 용액에 폴리스티렌을 첨가한 후에 18 내지 25℃에서 8 내지 15시간 동안 초음파 볼텍싱하는 제2단계;

제2단계의 용액을 원심분리하고 상층액을 제거한 후에 증류수를 첨가하고 18 내지 25℃에서 8 내지 15시간 동안 초음파 볼텍싱하는 제3단계; 및

상기 제3단계를 2 내지 3회 반복하여 입자를 분산시킨 후에 여과하여 유로피움폴리스티렌비드를 수득하는 단계;를 포함하여 구성된다.

상기 단계에서 용매는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 헥산, 이소프로필알코올, 테트라히드로푸란 등이 사용될 수 있다.

하기의 실시예는 상기 유로피움 착물화합물을 이용하여 형광폴리스티렌비드를 제조하는 과정과, 상기 형광폴리스티렌비드를 유효성분으로 하는 형광 면역진단 조성물을 제조하고 그 형광신호를 시험한 결과를 나타낸다.

실시예 1. 유로피움 폴리스티렌 비드의 합성법

화합물 3으로 표시되는 유로피움 화합물 5mg을 유기용매(Ethyl acetate, Dichloromethane, Chloroform, Methanol, Ethanol, Acetone, Hexane, Isopropyl alcohol, Tetrahydrofuran, Distilled water) 100 uL에 녹인다. 2.5%의 폴리스티렌 입자 500uL에 녹인 유로피움 화합물을 첨가한다. 25℃에서 12시간 동안 교반한다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 500uL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 500uL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 500uL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 500uL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨후에 필터로 여과한다.

실시예 2. 유로피움 폴리스티렌 비드의 합성법

100mL Round bottom flask에 Distilled water 50mL을 주입한다. Styrene 5mL에 화합물 1로 표시되는 유로피움 화합물 10mg을 녹여 반응물에 넣는다. Acrylic acid 20uL를 넣는다. Distilled water 200uL에 녹인 Potassium persulfate 90mg을 넣는다. 고무셉타로 막고 N2를 흘려서 10분간 치환한다. N2 충전 상태에서 75℃에서 24시간 동안 교반하고 상온에서 식힌다. 40mL conical tube에 두 개에 23mL씩 주입하여 원심분리 10000RPM 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 각각 25mL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 각각 25mL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 각각 25mL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산시킨다. 원심분리 1시간 진행 후 상층액을 버린다. 증류수 20mL을 다시 첨가한다. Vortexing 및 Sonication을 통해 입자를 분산 후 한 개의 Tube에 모은 후에 필터로 여과한다.

실험예 1. 유로피움 화합물의 용해도 실험

화학식 3으로 표시되는 유로피움 화합물을 1.5mL microtube 10개에 1mg 씩 넣는다. 유기용매(Ethyl acetate, Dichloromethane, Chloroform, Methanol, Ethanol, Acetone, Hexane, Isopropyl alcohol, Tetrahydrofuran, Distilled water)를 100uL 씩 주입하여 유로피움 화합물의 용해 여부를 확인한다. UV Lamp 365nm 파장을 비추어 유기용매에서의 용해 후 형광 여부를 확인하고, 그 결과를 도 1에 제시하였다.

도 1에 제시된 것처럼 상기 화합물 3은 각 용매에서 형광을 발산하는 것이 확인되었다.

실험예 2. 유로피움 폴리스티렌 비드의 Zeta-Potential 확인

실시예 1에서 수득된 유로피움 폴리스티렌 비드 1uL와 DW 3mL을 5mL tube에 넣는다. 수용액을 충분히 분산시킨다. 수용액을 분석 큐벳에 넣는다. 기기에 큐벳를 넣고 제타포텐셜 분석을 진행한다. Zeta-Potential 확인은 Otsuka Electronics ELSZ-2000으로 진행하였고, 그 결과를 도 2에 제시하였다.

도 2에 제시된 것처럼 본 발명에서 제공하는 유로피움폴리스티렌형광비드는 적절한 (-)의 제타포텐셜을 유지하고 있어서, 생체물질의 검출에 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.

실험예 3. 유로피움 폴리스타이렌 비드의 Size 확인 (Particle size analyzer)

실시예 1에서 수득된 유로피움폴리스티렌비드 1uL와 DW 3mL을 5mL tube에 넣는다. 수용액을 충분히 분산시킨다. 수용액을 분석 큐벳에 넣는다. 분석 기기에 큐벳을 넣고 분석을 진행한다. 분석 기기에 큐벳을 넣고 분석을 진행한다.Size 확인은 Otsuka Electronics ELSZ-2000으로 진행한다. 그 결과를 도 3에 제시하였다.

비교를 위해 반응하지 않은 폴리스티렌비드 1uL와 DW 3mL을 5mL tube에 넣는다. 수용액을 충분히 분산시킨다. 수용액을 분석 큐벳에 넣는다. 분석 기기에 큐벳을 넣고 분석을 진행한다. Size 확인은 Otsuka Electronics ELSZ-2000으로 진행하였고, 그 결과를 도 4에 제시하였다.

도 3 및 도 4에서 확인된 것처럼, 유러피움 착화합물과 폴리스티렌이 적절히 결합되어 비드를 형성하였을 때가 유로피움 착화합물과 비드를 형성하지 못하였을 때의 폴리스티렌비드보다 입자의 크기가 큰 것으로 확인되어, 상기 유로피웁 착화합물은 폴리스티렌과 효율적으로 결합되어 비드를 형성할 수 있다는 것이 확인되었다.

실험예 4. 표지된 유로피움 폴리스티렌 비드의 형광 강도 측정

실시예 1에서 수득된 유로피움폴리스티렌비드의 농도가 0.1%-0.5%가 되도록 증류수로 희석하여 stock solution을 제조하였다. anti-chicken IgY, Ethylene dichloride가 10mg/ml의 농도가 되도록 50mM MES Buffer에 녹인 후 stock solution과 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 반응액을 제거하고 50mM Phosphate buffered saline, 1% BSA를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 표지된 유로피움폴리스티렌비드를 0.00001-0.0001%가 되도록 50mM Phosphate buffered saline 으로 희석하였다. 이후 희석된 유로피움폴리스티렌비드를 chicken IgY가 도포된 Nitrocellulose membrane에 흘려주고 Lateral Flow Assay 분석기기를 이용하여 형광강도를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 제시하였다.

도 5에 제시된 것처럼 본 발명에서 제공하는 유로피움폴리스티렌비드는 생체물질을 검출할 수 있기에 충분한 형광강도를 나타내는 것이 확인되었다.

실험예 5. 화합물 1과 화합물 3의 광학분석

화합물 1과 화합물 3의 화합물에 각각 DMSO를 넣어 Stock solution을 제조하였다. 농도는 10 mg/mL로 동일하게 만들었다. 흡광 파장을 확인하기 위해 3mL 큐벳에 stock 10uL을 증류수 3mL와 충분히 분산시킨 후 광학특성을 분석하였다. 흡광은 Agilent 의 Cary 3500 UV-Vis 분광 광도계로 분석하였다. 이후 형광 파장을 분석하기 위해 3mL 큐벳에 stock 1.25uL을 증류수 3mL와 충분히 분산시킨 후 측정을 진행하였다. 형광은 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 활용하였다. 상기 결과를 도 6과 도 7에 제시하였다.

실험예 6. 유로피움폴리스티렌비드의 형광 측정, FOBI 촬영

실시예 1에서 수득된 유로피움폴리스티렌비드를 증류수에 농도 0.005%가 되도록 제조한다. 96 black well plate에 넣고 각 well 당 100ul volume 유지하며 증류수로 1/2 씩 serial dilution 한다. 310/610nm 파장에서 plate reader 형광 측정을 진행하였다. 형광은 PerkinElmer의 Enspire 2300으로 분석하였다. 이후 형광 측정한 동일 Plate를 FOBI에서 UV filter, Exposure 1000ms, Gain 3x 조건으로 촬영하고, 그 결과를 도 8에 제시하였다.

도 5 내지 도 8에 제시된 것처럼, 본 발명에서 제공하는 유로피웁폴리스티렌형광비드는 생체물질의 검출 및 진단에 다양하게 활용될 수 있다.

본원 발명을 상기의 실시예 및 도면에 의해서 설명하였으나, 본원 발명의 기술적 사상은 상기 실시예 등에 의해 한정되지 않고, 본원 발명의 기술적 특징을 포함하는 모든 구성까지 확장될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게는 주지의 사항이다.

본 발명은 산업상이용가능하다.

Claims (5)

1. 생체물질을 검출하기 위한 형광진단 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 하기의 화학식 1, 2, 4 및 5에서 선택되는 하나의 화합물과 폴리스티렌을 결합시켜 형성된 형광폴리스티렌비드를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 형광진단 조성물
   (화학식 1)
   
   상기 화학식에서 R₁은 수소 또는 -NH₂이고, R₂ 및 R₃는 서로 독립적으로 메틸, 페닐, 티오펜, CX₃ 중에서 선택되는 어느 하나이고, X는 할로겐이다.
   (화학식 2)
   
   상기 화학식에서 R₄는 페닐 또는 이다.
   (화학식 4)
   
   (화학식 5)
   
   상기 식에서 R₅는 -OH 또는 이다.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1, 2, 4 및 5에서 선택되는 하나의 화합물은 하기의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광진단 조성물
   
   
   
   
   
   
3. 유로피움폴리스티렌형광비드를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 제조방법은;
   하기 화학식 1, 2, 4 및 5로 표시되는 유로피움 착화합물을 중 하나를 선택하여 용매에 용해시키는 제1단계;
   제1단계의 유로피움 착화합물 용액에 폴리스티렌을 첨가한 후에 18 내지 25℃에서 8 내지 15시간 동안 초음파 볼텍싱하는 제2단계;
   제2단계의 용액을 원심분리하고 상층액을 제거한 후에 증류수를 첨가하고 18 내지 25℃에서 8 내지 15시간 동안 초음파 볼텍싱하는 제3단계; 및
   상기 제3단계를 2 내지 3회 반복하여 입자를 분산시킨 후에 여과하여 유로피움폴리스티렌비드를 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유로피움폴리스티렌형광비드를 제조하는 방법
   (화학식 1)
   
   상기 화학식에서 R₁은 수소 또는 -NH₂이고, R₂ 및 R₃는 서로 독립적으로 메틸, 페닐, 티오펜, CX₃ 중에서 선택되는 어느 하나이고, X는 할로겐이다.
   (화학식 2)
   
   상기 화학식에서 R₄는 페닐 또는 이다.
   (화학식 4)
   
   (화학식 5)
   
   상기 식에서 R₅는 -OH 또는 이다.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 화학식 1, 2, 4 및 5에서 선택되는 하나의 화합물은 하기의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유로피움폴리스티렌형광비드를 제조하는 방법
   
   
   
   
   
   
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 용매는 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 헥산, 이소프로필알코올, 테트라히드로푸란 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유로피움폴리스티렌형광비드를 제조하는 방법