CN119199102A - 一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原‑2检测方法及试剂盒，属于免疫检测分析技术领域。本发明提供方法包括偶联胰蛋白酶原‑2捕获抗体的供体微球、受体微球的制备，向待检测样品加入偶联好的供体微球和受体微球，混匀孵育，无需清洗，最后用荧光检测仪检测。所述试剂盒包括偶联胰蛋白酶原‑2捕获抗体的供体微球，偶联胰蛋白酶原‑2检测抗体的受体微球，胰蛋白酶原‑2标准品溶液和分析缓冲液。本发明应用双抗体夹心免疫法和光激化学发光的特性，可以快速检测待测样本中胰蛋白酶原‑2的含量，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于临床对急性胰腺炎的早期辅助诊断，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法及试剂盒。
背景技术
胰蛋白酶原是一种由胰腺外分泌细胞分泌的蛋白酶。人胰液中的胰蛋白酶原主要有两种类型，即胰蛋白酶原-1和胰蛋白酶原-2。虽然健康人血清中胰蛋白酶原-1的浓度高于胰蛋白酶原-2，但在胰腺炎患者中，胰蛋白酶原-2的浓度远高于胰蛋白酶原-1，而且大量文献表明胰蛋白酶原-2是诊断急性胰腺炎的生物标志物，比临床上常用的淀粉酶和脂肪酶更可靠。
急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一种常见的外分泌胰腺炎症疾病，以胰蛋白酶原异常激活和分泌细胞的破坏为主要发病机制，会导致局部和全身炎症反应综合征(SIRS)，发病率较高，是胃肠道疾病入院的主要原因，大多数患者为轻度胰腺炎，不危及生命，但约20％的患者会发展为中度或重度急性胰腺炎，伴有胰腺或胰周组织坏死和器官衰竭，死亡率较高。早期诊断和干预不仅可以为AP患者提供更好的治疗选择，而且可以改善预后，降低死亡率。
对疑似急性胰腺炎患者的准确诊断可以避免不必要的手术，但如果要将检测技术应用于急诊科和门诊，则必须及时、准确、快速地检测。虽然临床上广泛支持使用血清淀粉酶和脂肪酶诊断AP，但其敏感性和特异性并不令人满意，CE-CT等影像学检查也因成本、伤害性等问题无法随时使用。现有的检测方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等也因检测时间长、操作复杂、稳定性差等原因而无法为临床医生提供及时可靠的结果，因此，开发一种针对胰蛋白酶原-2的快速检测方法对于急性胰腺炎的早期诊断具有重要意义。
均相光激化学发光免疫分析技术(AlphaLISA)是一种创新的免疫检测技术，利用生物分子间的特异性相互作用，通过荧光共振能量转移(FRET)原理，实现信号的放大。AlphaLISA技术以硅胶微球为载体，采用时间分辨荧光检测模式，其检测原理是通过抗原抗体的特异性相互作用，将供体和受体微球拉近至单线态氧的扩散范围内，从而激发化学发光反应。该技术的发光原理基于光激化学发光，其中供体微球表面涂布的光敏剂苯二甲蓝在680nm激光照射下，分解环境中的氧生成单体氧分子，这些分子随后扩散至受体微球并传递能量给稀土元素铕，产生615nm的激发光。
AlphaLISA技术的优势在于其高灵敏度、快速检测、操作简便以及无需复杂的清洗步骤，使其非常适合于急诊科和门诊的快速诊断需求。目前，已有相关专利涉及AlphaLISA技术在生物医学检测中的应用，现有专利如CN110907636A提出了一种光激化学发光均相免疫分析方法，用于检测生物样本中的目标分子。该方法通过两种微球之间借助抗原-抗体间结合，实现高能活性氧的传递，诱发光激发化学发光过程，具有高灵敏度、快速、操作简便等特点。然而，该专利并未针对胰蛋白酶原-2这一特定生物标志物进行检测方法的研究。
本发明在现有技术的基础上，提出了一种基于AlphaLISA技术的胰蛋白酶原-2浓度检测方法，旨在解决现有诊断方法在敏感性和特异性方面的不足，以及检测时间长、操作复杂等问题。通过本发明的实施，不仅能够为临床医生提供一种快速、可靠的诊断工具，而且有助于改善急性胰腺炎患者的治疗选择和预后，从而降低死亡率，对于提高AP的早期诊断水平、改善患者预后具有重要意义。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明公开了一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法及试剂盒。该方法通过特定的抗体偶联技术、荧光免疫复合物的形成以及时间分辨荧光测量法，实现了对胰蛋白酶原-2的高灵敏度检测。同时，本发明还提供了一种包含所有必需试剂的试剂盒，简化了检测过程。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2的检测方法，该检测方法包括：设置一个固相载体，所述固相载体为偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体的供体微球；将胰蛋白酶原-2抗原共价偶联于供体微球的表面；同时将胰蛋白酶原-2检测抗体偶联到受体微球上；利用双抗体夹心法将偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体和抗原的供体微球和偶联了胰蛋白酶原-2检测抗体的受体微球结合，形成偶联捕获抗体的供体微球-抗原-偶联检测抗体的受体微球的荧光免疫复合体；通过激发光照射供体微球上的光敏剂产生单线态氧；受体微球上的发光剂接受激发光照射供体微球产生的单线态氧能量传递产生荧光；最后根据荧光强度进行检测分析。
所述荧光检测分析是指利用镧系稀土螯合物具有长寿命荧光这一特性，在样品被激发后、荧光信号采集之前，根据样品中所包含的不同的荧光物质其荧光衰变时间的各不相同通过延迟一定时间，在此时间段内待测样本中短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的稀土螯合物特异性荧光信号进行收集检测。通过时间分辨延迟可以有效消除来自样品、试剂、仪器等其他非特异性荧光的干扰，从而极大地提高检测的灵敏度。
通过采用上述技术方案，以生物分子间相互作用为原理，荧光共振能量转移发光为基础，以硅胶微球为载体，通过识别利用时间分辨荧光测量法和光谱分离技术排除样品中非特异性干扰，测定最后产物中的荧光强度，可以更便捷、准确地检测待测样品中的胰蛋白酶原-2浓度，从而有效地提高了检测的灵敏度和检测效率，为胰腺疾病的诊断和治疗提供重要依据。
作为本发明进一步的方案：所述检测方法还包括以下步骤：将胰蛋白酶原-2捕获抗体、胰蛋白酶原-2检测抗体采用离心过滤法进行纯化，所述离心过滤法为用带有滤膜的离心管对捕获抗体和检测抗体多次离心与洗涤。
作为本发明进一步的方案：所述检测方法还包括以下步骤：将供体微球和受体微球使用交联剂进行活化，所述交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
作为本发明进一步的方案：所述检测方法还包括以下步骤：所述双抗体夹心法为将优化剂量的偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测抗原一起加入聚丙烯孔板中反应，形成荧光免疫复合物。
作为本发明进一步的方案：所述检测方法中双抗体夹心法反应条件为37℃避光震荡15-20分钟。
作为本发明进一步的方案：所述供体微球和受体微球分别与胰蛋白酶原-2捕获抗体和胰蛋白酶原-2检测抗体形成偶联物的包被比例为1mg微球标记0.1mg抗体。
作为本发明进一步的方案：所述胰蛋白酶原-2捕获抗体和检测抗体分别与供体微球和受体微球的偶联条件设置为室温避光震荡孵育2小时。
作为本发明进一步的方案：一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测试剂盒，包括微孔板、试剂盒本体和荧光检测仪，其特征在于：所述试剂盒本体包括胰蛋白酶原-2标准品溶液、偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体的供体微球，偶联了胰蛋白酶原-2检测抗体的受体微球，所述试剂盒本体还设有可发性聚苯乙烯泡沫层，用于在运输和储存过程中保护试剂不受损坏。
通过采用上述技术方案，使用均相光激化学发光免疫分析技术，提高了胰蛋白酶原-2检测的灵敏度和特异性，简化了操作流程，缩短了检测时间。
作为本发明进一步的方案：所述试剂盒本体还包括辅助检测试剂，所述辅助检测试剂包括标记缓冲液、分析缓冲液、封闭液、终止液、交联剂和浓缩洗涤液的一种或多种。
作为本发明进一步的方案：所述分析缓冲液为pH 7.8的分析缓冲液，所述浓缩洗涤液为PBS缓冲液或Tris-HCl洗液。
通过采用上述技术方案，可以快速检测待测样本中胰蛋白酶原-2的含量，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测快速等特点，可用于临床对AP的辅助诊断，具有较好的应用前景；试剂盒结构简单，实用性强。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、灵敏度高：采用均相光激化学发光免疫分析技术，可准确、快速地检测待测样品中的胰蛋白酶原-2浓度，为胰腺炎等胰腺疾病的早期诊断和治疗提供重要依据。
2、操作简便：试剂盒组成简单，检测方法步骤少，操作方便，无需繁琐的样本处理过程，提高了检测灵敏度和特异性。
3、检测可靠：通过使用特定的交联剂、标记缓冲液和浓缩洗涤液，进一步优化了检测过程，提高了检测的稳定性和可靠性，满足临床对快速检测的需求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为胰蛋白酶原-2检测标准曲线。
图2为偶联捕获抗体的供体微球-抗原-偶联检测抗体的受体微球的荧光免疫复合体示意图，其中1-1为捕获抗体，1-2为胰蛋白酶原-2,2-1为检测抗体。
图3为胰蛋白酶原-2检测试剂盒本体俯视图，其中11为试剂盒本体，22为辅助试剂，1为胰蛋白酶原-2标准品溶液，2为偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体的供体微球，3为偶联了胰蛋白酶原-2检测抗体的受体微球，4为标记缓冲液，5为分析缓冲液，6为封闭液，7为终止液，8为交联剂，9为浓缩洗涤液。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本实施例公开的一些方面相一致的装置和方法的例子。
需要说明，实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后......)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在实施例中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，并非特别指称次序或顺位的意思，亦非用以限定本发明，其仅仅是为了区别以相同技术用语描述的组件或操作而已，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下：
实施例一：供体(受体)微球-胰蛋白酶原-2捕获(检测)抗体偶联
用标记缓冲液(MES)，NHS和EDC对供体(受体)微球进行活化和清洗，后与纯化后的捕获(检测)抗体分别室温避光震荡孵育2h。随后加入100μL的BSA封闭液室温避光震荡孵育1小时。最后利用Tris-HCl洗液进行洗涤和分离，去除未结合的抗体,使用ELISA或流体细胞术等方法验证偶联后的微球上抗体的结合量，确保偶联效率达到最优。将制备好的微球保存于4℃冰箱中。
实施例二：抗体纯化
将待偶联的抗体原料加入带有滤膜的50KD离心管中，将浓缩后的抗体原料加入300μL标记缓冲液，10000rpm离心5min弃掉滤液，再加入300μL洗脱缓冲液，按上述离心步骤重复8次。将几次离心后的离心管取出，弃掉滤液，把离心管的滤膜返转，3000rpm，离心1min，收集滤液。然后再次将滤膜反转过来，加入50μL标记缓冲液，静置片刻，使滤膜将标记缓冲液吸收，留在滤膜上的残余抗体原料溶解下来，而后将滤膜重新反转过来3000rpm离心1min，收集滤膜上的液体，使滤膜上抗体原料尽可能多的被回收，即所需要的浓缩纯化抗体原料。整个过程收集抗体最佳体积为100μL左右。
实施例三：微球活化
将待偶联的微球原料使用ph4.5的醋酸缓冲液浸泡5分钟，以暴露更多的结合位点，将浸泡后的微球原料加入2mL离心管中，加入900μL标记缓冲液，17000rpm离心20min，弃上清，加入1mL标记缓冲液超声15min，震散混匀，之后分别加入10μL浓度为20mg/mL的NHS溶液和5μL浓度为20mg/mL的EDC溶液，室温避光震荡20min。随后将活化后的微球17000rpm离心20min，弃上清，加入1000μL标记缓冲液超声混匀，重复两遍。
实施例四：偶联于供体微球的胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体荧光免疫复合物形成
偶联捕获抗体的供体微球，偶联检测抗体的受体微球和待测样品一起加入聚丙烯孔板中，孵育条件为37℃避光震荡15min，得到偶联于供体微球的胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体荧光免疫复合物，荧光免疫复合体经激发光照射供体微球上的光敏剂产生单线态氧，受体微球上的发光剂接受单线态氧能量传递产生荧光，最后上机检测荧光强度确定检测指标含量。
实施例五：胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体偶联有效结合量的检测
酶联免疫吸附检测试验(ELISA)：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品依次加入ELISA板中，37℃避光震荡孵育15分钟，随后加入酶标二抗，继续孵育30分钟。经过5次洗涤后，加入底物显色溶液，室温避光反应15分钟。最后加入终止液，上机检测吸光度，确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体时间分辨荧光免疫分析：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品加入反应管中，37℃避光震荡孵育15分钟。随后加入Eu3+标记的二抗，继续孵育30分钟。经5次洗涤后，加入增强液，室温避光反应5分钟。最后上机检测时间分辨荧光强度，确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体化学发光免疫分析：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品加入反应管中，37℃避光震荡孵育15分钟。随后加入HRP标记的二抗，继续孵育30分钟。经5次洗涤后，加入化学发光底物，室温避光反应5分钟。最后上机检测发光强度，确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体电化学发光免疫分析：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品加入电化学传感器中，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，加入电化学活性物质标记的二抗，继续孵育30分钟。洗涤后，使用电化学工作站检测电流信号，通过电流信号的变化确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体表面增强拉曼散射免疫分析：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品加入表面增强拉曼散射(SERS)活性基底上，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，加入拉曼标记的二抗，继续孵育30分钟。洗涤后，使用拉曼光谱仪检测SERS信号，通过信号强度确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体生物传感器检测：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品固定在生物传感器表面，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，加入生物素标记的二抗和链霉亲和素标记的酶，继续孵育30分钟。洗涤后，加入酶的底物，通过生物传感器检测底物的反应产物，从而确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体微流控芯片检测：在微流控芯片中，将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品按照预设的流程混合，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，通过微流控通道引入HRP标记的二抗，继续孵育30分钟。洗涤后，加入底物溶液，通过检测微流控芯片中的荧光信号或化学发光信号来确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体量子点免疫分析：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品加入含有量子点的反应体系中，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，加入特异性识别量子点的二抗，继续孵育30分钟。洗涤后，通过荧光光谱仪检测量子点的荧光信号，从而确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体磁分离免疫分析：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品加入含有磁性微粒的反应体系中，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，加入磁性标记的二抗，继续孵育30分钟。使用磁分离技术进行洗涤，然后加入底物溶液，通过检测磁性微粒的荧光或颜色变化来确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体微球阵列免疫分析：在微球阵列平台上，将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品进行孵育，37℃避光震荡15分钟。随后，加入荧光标记的二抗，继续孵育30分钟。洗涤后，使用微球阵列读取仪检测每个微球上的荧光信号，通过信号强度确定检测指标含量。
胰蛋白酶原-2捕获抗体-胰蛋白酶原-2抗原-偶联受体微球的胰蛋白酶原-2检测抗体免疫层析检测：将偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测样品应用于免疫层析试纸条上，37℃避光震荡孵育15分钟。随后，样品沿着试纸条移动，与固定在试纸条上的二抗结合。通过观察试纸条上的色带变化，可以定性或半定量地确定检测指标含量。
实施例六：胰蛋白酶原-2检测的线性范围、灵敏度、特异性、精密度及回收率。
配制胰蛋白酶原-2抗原标准品，利用本试剂盒进行检测，绘制标准曲线，利用荧光值和浓度值绘制标准曲线，胰蛋白酶原-2抗原检测的线性方程为：Log10Y＝1.2057×Log10X+2.4055，R2＝0.99296，线性范围为0.99ng/mL～300ng/mL，结果图1所示。
平行测定10次0ng/mL参考标准品的荧光值，并计算其均值(mean)及标准差(SD)，采用mean+2SD代入标准曲线方程，计算得到本试剂盒对胰蛋白酶原-2的检测灵敏度为0.99ng/mL。
测定3次Tim-3，CA242的抗原，并通过标准曲线计算其浓度。交叉反应率(％)＝检测浓度/实际浓度。结果如表1，计算得到本试剂盒对Tim-3和CA242几乎没有交叉反应率，特异性较好。
表1胰蛋白酶原-2检测特异性
分别检测胰蛋白酶原-2低值样本、中值样本、高值样本各10次，结果如表2，得到胰蛋白酶原-2检测的批内变异系数为1.54％-2.20％(＜10％)，批间变异系数为3.17％-6.94％(＜15％)。
表2胰蛋白酶原-2分析精密度
将三种胰蛋白酶原-2抗原标准品(45、150和300ng/mL)与已知浓度为39.81ng/mL的血清样本按1:9的比例混合。使用标准曲线计算混合溶液的AlphaLISA信号，以确定混合溶液的实际浓度。将血清和抗原标准溶液按比例混合，制备出理论浓度为40.33、50.83和65.83ng/mL的混合溶液。回收率(％)的计算方法如下：回收率(％)＝实际浓度/理论浓度。回收率为96.23％-103.45％。
综上所述，本发明可以检测待测样品中胰蛋白酶原-2抗原含量，效率高、特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测快速，可用于AP诊断和筛查，具有较好的应用前景。
最后应说明的是：以上公开仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (10)
1.一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法，其特征在于：设置一个固相载体，所述固相载体为偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体的供体微球，将胰蛋白酶原-2抗原在标记缓冲液中共价偶联于供体微球的表面，同时将胰蛋白酶原-2检测抗体偶联到受体微球上，利用双抗体夹心法，将偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体和抗原的供体微球和偶联了胰蛋白酶原-2检测抗体的受体微球结合，形成偶联捕获抗体的供体微球-抗原-偶联检测抗体的受体微球的荧光免疫复合体，所述抗原为待测样品中的胰蛋白酶原-2，通过激发光照射供体微球上的光敏剂产生单线态氧，受体微球上的发光剂接受激发光照射供体微球产生的单线态氧能量传递产生荧光，最后根据荧光强度进行检测分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括以下步骤：将胰蛋白酶原-2捕获抗体、胰蛋白酶原-2检测抗体采用离心过滤法进行纯化，所述离心过滤法为用带有滤膜的离心管对捕获抗体和检测抗体多次离心与洗涤，利用Tris-HCl洗液进行洗涤和分离，去除未结合抗体。
3.根据权利要求1所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括以下步骤：将供体微球和受体微球使用交联剂进行活化，所述交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
4.根据权利要求1所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括以下步骤：所述双抗体夹心法为将优化剂量的偶联捕获抗体的供体微球、偶联检测抗体的受体微球和待测抗原一起加入聚丙烯孔板中反应，形成荧光免疫复合物。
5.根据权利要求1或4所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2的检测方法，其特征在于：所述检测方法中双抗体夹心法反应条件为37℃避光震荡15-20分钟。
6.根据权利要求1至5所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法，其特征在于：所述供体微球和受体微球分别与胰蛋白酶原-2捕获抗体和胰蛋白酶原-2检测抗体形成偶联物的包被比例为1mg微球标记0.1mg抗体。
7.根据权利要求1所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测方法，其特征在于：所述胰蛋白酶原-2捕获抗体和检测抗体分别与供体微球和受体微球的偶联条件设置为室温避光震荡孵育2小时。
8.一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测试剂盒，包括微孔板、试剂盒本体和荧光检测仪，其特征在于：所述试剂盒本体包括胰蛋白酶原-2标准品溶液、偶联了胰蛋白酶原-2捕获抗体的供体微球，偶联了胰蛋白酶原-2检测抗体的受体微球，所述试剂盒本体还设有可发性聚苯乙烯泡沫层，所述供体微球和受体微球为硅胶微球。
9.根据权利要求8所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒本体还包括辅助检测试剂，所述辅助检测试剂包括标记缓冲液、分析缓冲液、封闭液、终止液、交联剂和浓缩洗涤液的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的胰蛋白酶原-2检测试剂盒，其特征在于：所述分析缓冲液为pH 7.8的分析缓冲液，所述浓缩洗涤液为PBS缓冲液或Tris-HCl洗液。
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