KR102814883B1

KR102814883B1 - CRISPR/Cas 시스템을 이용한 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법

Info

Publication number: KR102814883B1
Application number: KR1020210082687A
Authority: KR
Inventors: 강권규; 정유진; 이효주
Original assignee: 한경국립대학교 산학협력단
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2025-05-28
Anticipated expiration: 2041-06-24
Also published as: KR20230000353A

Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

Description

CRISPR/Cas 시스템을 이용한 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법{Method for producing rice plant having edited OsAAP2 gene using CRISPR/Cas system}

본 발명은 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

세계 인구의 거의 절반이 소비하는 주요 식량 작물 중 하나인 쌀은 매년 약 450만 헥타르에서 재배되고 있다(Food and Agriculture Organization (FAO), 2004). 경제 및 생활 수준의 향상과 함께 수확량 뿐만 아니라 곡물 품질 향상을 위한 방법을 탐색하고 있으며, 쌀 품종의 높은 수확량과 고품질의 개발은 필수적이다. 곡물 품질 특성은 제분, 외관, 요리 및 식생활, 영양가 특성을 평가하고 시장 가치를 결정한다. 제분 품질 평가 기준은 주로 현미 비율, 정미 비율 및 완전미 비율을 포함하며, 외관 품질은 주로 입자 크기, 반투명도, 백악질 입자 비율, 백악질 영역 및 백악도에 의해 결정된다. 곡물의 백악질 영역에 있는 전분 과립은 곡물의 반투명 영역에 있는 더 크고 조밀하게 포장 된 과립보다 작고 밀도가 낮다. 요리 및 식사 품질은 대부분 곡물 전분의 아밀로스 함량, 호화 온도 및 젤 농도에 의해 결정된다. 쌀은 대부분의 쌀 재배 국가에서 식이 단백질과 미량 영양소의 주요 공급원이기 때문에 영양가가 필수적이다. 수확량과 함께 품질 특성을 개선하기 위해서는 중요한 품질 특성을 이해하고, 육종 프로그램을 선택하고, 적절한 비배관리가 필요하다.

질소(nitrogen)는 식물 성장과 작물 수확을 위한 주요 영양소 중 하나로, 콩과 식물이 아닌 대부분의 식물은 질산염과 암모늄을 포함한 무기 질소를 흡수하여 아미노산 합성에 활용한다. 전달된 유기질소의 주요 형태인 아미노산은 뿌리와 잎의 목부와 체관을 통해 꽃, 과실 및 씨앗으로 재분배된다. 또한 식물은 토양에서 직접 아미노산을 흡수한다. 최근 연구에 따르면 체관과 배아의 아미노산 부하가 증가하면 완두콩의 바이오매스와 종자 생산량이 향상 될 수 있음이 보고되었다.

식물은 아미노산을 흡수하고 이동시키기 위해 막-통합 아미노산 수송 단백질(AAT)을 필요로 하며, 그 중에서도 기질 특이성이 넓은 양성자 결합 아미노산 수송체 역할을 하는 amino acid permease (AAP) 서브 패밀리가 집중적으로 연구되고 있다. 벼에서 OsAAP1, OsAAP4, OsAAP7 및 OsAAP16은 생물학적 기능이 명확하지 않지만 중성 아미노산의 흡수 및 재분배를 통해 생산량을 조절하는 역할을 하며(Fang et al., 2021; Taylor et al., 2015), OsAAP3는 리신(Lys) 및 아르기닌(Arg)을 포함한 염기성 아미노산을 수송한다. 또한 OsAAP3 또는 OsAAP5의 발현 저해는 Lys 및 Arg의 농도를 조절하여 수확량을 증가시키는 것으로 보고되었다(Lu et al., 2018; Wang et al., 2019). OsAAP6는 식물에서 다양한 아미노산 분포에 관여하며, 곡물 단백질 함량과 곡물 품질의 양성 조절자 역할을 하는 것으로 보고되었다(Peng et al. 2014).

본 발명에서는 eating cooking quality 및 바이오매스 향상을 위해 OsAAP2 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 편집하여 표적 돌연변이를 유발하였다.

한편, 한국공개특허 제2019-0052553호에는 'OsNAC64 및 OsNAC69 유전자를 동시 인식하기 위한 가이드 RNA 및 이를 이용한 OsNAC64 및 OsNAC69 넉아웃 벼 돌연변이체의 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'CRISPR/Cas 시스템을 이용한 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 벡터를 구축하여 유전자 교정 벼 식물체를 개발하였고 야생형 벼와 비교한 결과, OsAAP2 유전자 교정 식물체는 전분의 이화학적 특성에 변화가 일어났음을 확인함으로써，본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, OsAAP2 유전자 교정 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에서 제시한 OsAAP2 유전자 편집을 통한 돌연변이 유도는 종자 내 전분 변화를 야기하였으므로, 벼의 식미와 관련된 연구에 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자연적 변이와 구별할 수 없는 변이를 유도하므로, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 OsAAP2 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 매개 표적 돌연변이 과정을 도식화한 것으로, A는 Cas9::OsU3::OsAAP2 sgRNA 벡터의 T-DNA 부위 구조이고, B는 벼 캘러스에서 아그로박테리움 매개 형질전환의 과정을 보여준다.
도 2는 OsAAP2 유전자의 교정을 위한 sgRNA 표적 위치 및 서열 정보(A)와, NGS 분석에 의한 sgRNA 표적 위치의 돌연변이 양상을 보여주는 결과(B)이다.
도 3은 야생형(WT) 및 T1 세대 osaap2 돌연변이체의 표현형을 관찰한 것으로, A는 종자와 현미의 사진이고, B는 낟알 길이, 낟알 너비, 낟알 두께 및 천립중 분석 결과이다.
도 4는 야생형(WT) 및 T1 세대 osaap2 돌연변이체 종자의 전자현미경 이미지로, A는 야생형 식물체의 성숙 배유의 이미지이고, B 및 C는 각각 osaap2 sg1-3 및 osaap2 sg2-12 식물체의 성숙 배유의 이미지이며, D는 야생형 식물체의 성숙 배유의 중앙 부분 이미지이고, E와 F는 각각 osaap2 sg1-3 및 osaap2 sg2-12 식물체의 성숙 배유의 중앙 부분 이미지이다.
도 5는 T1 세대 osaap2 돌연변이체에서 전분의 물리화학적 특성을 분석한 것으로, A는 아밀로스 함량, B는 점성(gel consistency)을 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, OsAAP2 유전자 교정 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

또한, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (also known as Cas12a), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제인 Cas9 또는 Cpf1 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 벼 유래 OsAAP2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.

본 발명은 또한,

(a) 벼 유래 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및

(b) 상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 벼 식물세포에 도입하는 것은, 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터가 식물 세포에 형질전환되면, DNA 결합 및 절단 활성이 있는 엔도뉴클레아제 단백질과 상기 엔도뉴클레아제 단백질에 결합되며 표적 서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 sgRNA가 함께 발현되게 된다.

본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

또한, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 난세포, 종자 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 벼 식물체는 OsAAP2 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, OsAAP2 유전자가 녹-아웃된 식물체이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 생장 조건

본 발명에서는 벼 품종 '동진' (Oryza sativa L., ssp. Japonica)을 사용하였다. 식물은 한경대학교 온실과 논에서 재배하였으며, 수확한 종자는 수분 함량이 약 14%가 되도록 건조하고 4℃에서 보관하였다.

2. CRISPR/Cas9 벡터 구축 및 벼 형질전환

표적 유전자의 서열은 https://www.gramene.org/로 부터 확인 된 엑손 서열 기반으로 CRISPR RGEN tools 프로그램 (https://www.rgenome.net/)을 사용하여 OsAAP2 게노믹 서열에서 두 개의 sgRNA (single-guide RNA)를 선정하였다(도 2A). pBOsC 벡터에서 Cas9 단백질은 35S 프로모터에 의해 발현되며, sgRNA는 OsU3 프로모터에 의해 발현된다(Jung et al., Plant Biotechnol Rep 2009, 13:521-531). 선정된 sgRNA는 정 등(2019)에 의해 보고된 방법을 이용하여 CRISPR/Cas9 벡터에 클로닝하였다. 간단하게, AarI 어댑터 부위가 있는 sgRNA를 ㈜바이오니아(Korea)에 의뢰하여 제작한 뒤 AarI으로 소화된 pBOsC 벡터에 클로닝하였다. pBOsC::sgRNA Ti-plasmid 벡터는 전기천공법에 의해 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA105에 도입하였다. 이 후 Lee 등(Plant Biotech J. 2011, 38:251-257)에서 설명된 프로토콜에 따라 동진 벼의 종자에서 유도된 캘러스 조직에 감염시키고, 재분화 개체를 유도하였다. T-DNA 도입 여부를 확인하기 위해 bar 유전자 영역을 PCR로 증폭하여 확인하였다. 형질전환 식물체는 화분에서 먼저 순화 과정을 거친 뒤 유리 온실 및 논에서 재배되었다.

3. Targeted Deep Sequencing 및 돌연변이 분석

DNA Quick Plant Kit (Inclone, Korea)를 사용하여 식물 조직에서 게노믹 DNA 추출을 수행하였다. Targeted Deep Sequencing 분석은 정 등(2019)에 의해 설명된 방법을 통해 수행하였으며, 표적 심층 시퀀싱에 사용되는 모든 프라이머는 표 1과 같다.

본 발명에 사용된 프라이머 정보

프라이머	염기서열(5'→3')	서열번호
AAP2-sg1/2 1^st FW	TTTGATTTCTGCAGGCAGGT	4
AAP2-sg1/2 1^st RV	CGAACACCACCATGTACGAG	5
AAP2-sg1 2^nd FW	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGTGATTTGACGAGCAGGA	6
AAP2-sg1 2^nd RV	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTAGTTCCTCTTCCCGGAGAC	7
AAP2-sg2 2^nd FW	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGAACCAACGACTCAACG	8
AAP2-sg2 2^nd RV	GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGAAACACACACACACCAATG	9

MiniSeq (Illumina, USA)를 사용하여 PCR 앰플리콘(amplicons)에 의한 paired-end read sequencing을 생성했으며, MiniSeq에서 파생된 모든 데이터는 Park 등(Bioinformatics 2017, 33:286-288)에서 보고된 것과 같이 Cas-Analyzer (http://www.rgenome.net/casanalyzer)에 의해 분석되었다.

4. 현미경 분석

전분의 입상 형태는 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 조사하였다. 야생형 및 aap2 돌연변이체 종자를 날카로운 칼날로 가로로 자르고 종자의 표면에 금을 코팅하여 시료를 준비하였다.

5. 아밀로스 함량 분석을 위한 요오드-아밀로스 색도 측정법

100 ㎎의 쌀가루에 1.0 ㎖의 95% 에탄올을 첨가하여 호화 과정이 분말이 생기는 것을 방지하였으며, 9.0 ㎖의 1N 수산화나트륨을 첨가한 뒤 10분 동안 끓이는 과정을 통해 호화시켰다. 그 다음, 상기 용액에 증류수를 첨가하여 100 ㎖로 만들고 균질화한 뒤 5 ㎖ 분취량을 93 ㎖의 증류수와 함께 100 ㎖ 부피 플라스크에 넣고, 1 N 아세트산 1.0 ㎖를 넣고 0.2% 의 요오드 용액 2 ㎖를 첨가하였다. 0.2%의 요오드 용액은 100 ㎖ 탈-이온수에 2 g의 요오드화 칼륨(KI)과 0.2 g의 요오드(I₂)를 혼합하여 제조되었다 증류수로 부피를 만들어 최소한의 간섭없이 안정된 짙은 청색을 획득하였다. 20~60분 내에 620 nm에서 색상을 판독하였다.

6. 점성(gel consistency, GC) 측정

벼의 점성은 Cagampang 등(J. Sci. Food Agric. 1973, 24(12): 1589-1594)의 방법에 따라 측정되었다. 간단하게, 100 ㎎ 쌀가루를 10 mm x 110 mm 배양 튜브에서 칭량하고, 여기에 0.025% 티몰 블루(thymol blue)를 함유하는 0.2 ㎖의 95% 에탄올을 첨가하여 젤라틴화 과정에서 분말이 뭉치는 것을 방지하였다. 0.2N 수산화칼륨 1 ㎖를 첨가하고 볼텍싱하였다. 튜브 뚜껑을 닫고 수조에서 8분 동안 끓인 후, 상온에서 5분 동안 방치하고, 그 후 튜브를 얼음 위에 20분 동안 두었다가 테이블 표면에 수평으로 눕혔두었다. 겔 길이는 튜브 바닥에서 겔 이동 전면까지의 거리로 1시간 후에 측정하였으며, 이렇게 얻은 겔 길이는 겔 농도 측정의 정보를 제공한다.

7. 아미노산 분석

10 nmol L-(+)- norleucine (Wako Pure Chemicals, Japan)을 대조군으로 사용하였으며, 각 샘플에 1 ㎖의 6 mol·L^-1 염산을 첨가하여 2 ㎖ 스크류 캡 튜브 내에서 10 ㎎ 쌀가루를 가수분해시켰다. 용액을 110℃ 오븐에서 24시간 동안 유지하여 가수분해를 완료하였다. 샘플은 완전히 건조될 때까지 60℃ 수조에서 증발시키고 500 ㎕ 나트륨 완충액 (80-2037-67, Biochrom, England)에 용해시켰다. 완전히 용해된 후 샘플을 1,600xg에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 0.45 nm 나일론 막으로 여과하였다. 자동 아미노산 분석기(Biochrom, England)를 사용하여 아미노산 함량을 측정하였다.

8. 전분 특성 분석 및 배유(endosperm)의 물리화학적 특성

쌀 호화 특성을 결정하기 위해 쌀가루 3 g과 물 25g을 혼합하였다. Rapid Visco analyser (Model 3-D, Newport Scientific, Australia)를 사용하여 최고 점도, 최저 점도, 최종 점도, 강하 점도(최고 점도 - 최저 점도), 치반 점도(최종 점도 - 최고 점도) 및 호화 온도를 측정하였다. RVA 분석 사이클의 조건은 다음과 같다: 1분 동안 50℃, 2.5분 동안 95℃, 1.4분 동안 50℃. 가열 및 냉각 시간은 3.8분으로 설정하였다. RVA 패들 속도는 처음 10초 동안 960 r·min^-1으로 작동되었으며 이후 160 ·min^-1의 일정한 속도로 회전시켰다.

실시예 1. CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 OsAAP2 의 녹아웃

유전자 편집된 식물을 육성하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 OsAAP2 녹아웃 라인을 제조하였다. OsAAP2-sg1 및 OsAAP2-sg2에 대해 각각 총 30개 및 19개의 형질전환 식물이 각각 T0 세대에서 획득되었다(도 1 및 표 2).

CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 OsAAP2 유전자 편집 돌연변이 식물체의 돌연변이율 및 유형 분석

Target region	No. of regenerated plants	No. of transgenic plants	No. of edited plants	Genotype
Target region	No. of regenerated plants	No. of transgenic plants	No. of edited plants	Homo allelic	Hetero allelic	Bi allelic
OsAAP2 sg1	30	30	17 (56.6%)	3 (17.6%)	4 (23.5%)	10 (58.8%)
OsAAP2 sg2	20	19	18 (89.4%)	1 (5.9%)	-	16 (94.1%)

본 발명자는 표적 부위에서 돌연변이를 분석하기 위해 모든 형질전환 식물을 사용하여 표적 부위 시퀀싱 분석을 수행하였다. 돌연변이율은 OsAAP2-sg1 및 OsAAP2-sg2에서 각각 56.6%와 89.4% 였다(표 2). 돌연변이 영역의 염기서열 결과는 다른 뉴클레오티드의 삽입(1 bp) 및 삭제(1-48 bp)를 포함하여 다양한 돌연변이가 발생했음을 보여주었다(도 2). 이들 돌연변이는 동종(homo), 이종(hetero) 및 이중(bi) 대립유전자를 갖는 편집 유형으로 분류할 수 있었으며, 선택 마커 및 T-DNA 서열로서 비알라포스(bialaphos) 저항성 유전자(bar)를 제거하기 위해 NGS 분석으로 식별된 T0 편집 식물체를 자가 수분하여 T1 종자를 생성하였다. 동종 대립 유전자이면서 T-DNA가 없는 식물인 T1 자손 식물은 Bar-strip 테스트, 표현형 및 유전형 분석에 의해 분석되었다.

실시예 2. 편집 식물체의 농경학적 특성

편집된 계통의 몇 가지 농경학적 특성을 야생형과 비교해 보았다. osaap2-sg1-3 및 osaap2-sg2-12 계통은 야생형과 비교하여 초장, 원추화 길이 및 천립중에 있어서는 차이가 없었으나, 분얼 수, 임실률 및 종자생산량에 유의적인 감소가 확인되었다(표 3).

야생형 및 유전자 편집 식물체의 농경학적 특성

Traits	야생형(WT)	osaap2-sg1-3	osaap2-sg2-12
Plant height (cm)	95.8±2.0 a	94.9±2.2 a	94.4±3.0 a
Tiller numbers	8.4±1.2 a	5.4±1.2 b	5.4±1.0 b
Panicle length (cm)	20.5±1.2 a	20.0±1.2 a	19.7±1.2 a
1000-grain weight (g)	17.8±0.8 a	17.2±0.7 a	18.1±0.8 a
seed-setting rate (%)	86.3±5.0 a	59.8±4.9 b	51.4±3.7 b
Grain yield per plant (g)	14.9±1.7 a	6.2±1.9 b	6.3±2.2 b

또한 야생형과 osaap2-sg1-3 및 osaap2-sg2-12의 종자 표현형을 비교한 결과, 종자의 길이, 너비, 두께 및 천립중에 있어서 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 3).

또한, 성숙한 종자로부터 전분 과립을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과 야생형 종자는 배유의 중앙 영역에 있는 전분 과립이 육각형 모양으로 빽빽히 밀집되어 있었지만, osaap2-sg1-3 및 osaap2-sg2-12의 전분 과립은 과립 형성이 제대로 이루어지지 않아 부정형의 형태가 나타났으며 느슨하게 채워져 있음이 관찰되었다(도 4).

실시예3. osaap2 돌연변이체의 전분 특성 변화

유전자 편집 계통 및 야생형의 아밀로스 함량(AC), 젤라틴화 온도(GT) 및 점성(GC)를 포함한 곡물 품질을 추가로 조사하였다. osaap2-sg1-3 및 osaap2-sg2-12 계통의 GT, GC 및 AC는 야생형보다 낮았다(도 5 및 표 4). 이를 통해 osaap2-sg1-3 및 osaap2-sg2-12 계통에서는 아미노산 수송에 따른 종자 내 단백질 축적으로 인한 곡물 수율 및 곡물 품질이 감소한 것으로 유추되었다.

야생형과 osaap2 돌연변이체의 RVA 분석 결과

	Pasting Tem.	Viscosity			Breakdown (P-H) 강하점도	Setback (C-P) 치반점도
	Pasting Tem.	Peak (P) 최고점도	Hold (H) 최저점도	Final V (C) 최종점도	Breakdown (P-H) 강하점도	Setback (C-P) 치반점도
WT	72.25±0.2	187.67±4.92	82.79±0.04	147.17±0.42	104.88±4.96	-40.50±5.33
osaap2-sg1-3	71.3±0.1	110.33±1.25	52.42±0.59	97.21±1.29	57.92±0.66	-13.13±0.04
Osaap2-sg2-12	70.55±0.05	152.05±0.13	73.04±0.29	141.25±0.00	79.00±0.18	-10.80±0.13

RVA는 일반적으로 쌀의 감각 평가에서 품질을 예측하는 간접 지표 중 하나로 사용되며, 각 점도는 쌀 품종의 특정 특성을 식별하는 데 사용된다. 강하점도는 조리 중 안정성 정도를 나타내며, 팽창된 전분의 파괴 정도를 파악한다. 최고점도와 최저점도의 차이에 의해 나타나며 GC와 관련되어 있다. 치반점도는 냉각 시 전분의 노화정도를 나타내며 최종점도와 최고점도의 차이에 의해 나타난다. 보통 낮은 침반점도 값이 부드러운 식미를 갖는다. osaap2 변이체의 경우 낮은 강하점도 및 최고점도 값을 갖으며, 높은 치반점도 값을 나타내어, 식미에서 부정적인 변화가 나타날 것으로 예상되었다.

<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center <120> Method for producing rice plant having edited OsAAP2 gene using CRISPR/Cas system <130> PN21211 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1455 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggcgtcgg tcgacttgga gctggggcga cctctgtcgg cggcggcggc ggcgtaccct 60 cctccgctgc ggcggagcat caacgacgac gacgttgacg acgacgggaa gcccaagcga 120 acaggaacgg agtggacggc gagcgcgcac atcgtcacgg cggtggtcgg ctccggcgtg 180 ctgtcgctgg catggtccac ggcgcagctc ggctgggtcg ccggcccggc caccctcgtc 240 gtgttcgcgg tcatcaccta ctacacctcc gtgctcctcg ccgactgcta ccgcgccggc 300 ggcgatcagg tctccgggaa gaggaactac acatacatgg acgccgtcga gtcctatcta 360 ggtggtcggc aagtgtggtt ctgtggtctc tgtcagtacg ttaacctggt tggaactgca 420 atcgggtaca ccatcacagc atccatcagt gccgcggcgg tgtacaagtc caactgcttc 480 cacaagaacg gccactccgc cgactgcagc gtcttcacca cctcgtacat ggtggtgttc 540 ggcgttgtcc aggtcttctt ctcccagctg cagagcctcc acgaggtggc gtggctgtcc 600 gtgctcgccg ccgtcatgtc cttctcctac tcggccatcg ccgtcggcct ctccttggca 660 caaaccatat caggtcctac tggtatgacg actatgtctg ggactgtaat cggaatagat 720 gttgatttgt cgcacaagat atggcaggca ctgcaagccc tcggaaacat cgcgttcgca 780 tattcctact ccctggttct cattgaaatc caggacacga tcaggtcgcc gccggcggag 840 agcaagacga tgaggaaggc gaacgcgctg gccatgccgg tgatcacggc gttctacacg 900 ctctgcggct gcctcggcta cgcggcgttc gggaacgcgg cgccggggaa catgctcacg 960 ggcttcggct tctacgaccc ctactggctc gtcggcctcg ccaacgcctg catcgtcgtg 1020 cacctcgtcg gcgcctacca ggtgatgtcc cagcccgtct tcaccgccgt cgagtcctgg 1080 gcgtcctccc ggtggccccg gtgcggcttc ttcgtcaccg gcggcggcgg aacgaggctg 1140 atcagcgtga acgcgttcag gctcgcgtgg cgcacggcgt acgtcgtggc gtgcaccgcg 1200 gtcgccgccg tggtgccgtt cttcaacgac gtgctcggcc tcctcggcgc cgtcgggttc 1260 tggccgctca ccgtgtactt ccccgtggag atgtacatcc ggcggcggaa gctggagagg 1320 tcgtccaaga ggtgggtggc gctgcagagc ctcaacgccg tgtgcttcgt ggtgacgctc 1380 gcctcagcgg tcgcgtccgt gcaggggatc gccgaatcga tggcgcacta tgtaccgttc 1440 aagtcaaagt tgtaa 1455 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA1 <400> 2 gctgtcgctg gcatggtcca cgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA2 <400> 3 acccgattgc agttccaacc agg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tttgatttct gcaggcaggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgaacaccac catgtacgag 20 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgtgat ttgacgagca gga 53 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttagttc ctcttcccgg agac 54 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcatgaac caacgactca acg 53 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagaaa cacacacaca ccaatg 56

Claims

서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, OsAAP2 유전자 교정 식물체를 제조하기 위한 조성물.
(a) 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 벼 식물세포에 도입하는 것은, 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제2항 또는 제3항의 방법에 의해 제조된 OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체.
제5항에 따른 벼 식물체의 유전체가 교정된 종자.