KR102801338B1

KR102801338B1 - 브라시카·올레라세아 식물의 이형 검출법

Info

Publication number: KR102801338B1
Application number: KR1020207007727A
Authority: KR
Inventors: 아쯔시 이즈미다; 다까오 스즈끼; 데쯔야 히라모또
Original assignee: 가부시키가이샤 사카타노타네
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2025-04-30
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: EP3670657A4; AU2018318559B2; CN111201318A; AU2018318559A1; JPWO2019035480A1; EP4219758A1; US20210164057A1; TW201920684A; JP2023060024A; TWI873082B; ZA202001441B; RU2020110813A3; EP3670657A1; RU2020110813A; KR20200053500A; MX2020001675A; CL2020000385A1; CA3073173A1; JP7607402B2; WO2019035480A1

Abstract

본 발명은, 브라시카·올레라세아(Brassica oleracea) 식물의 이수체의 검출 방법으로서, 피검 브라시카·올레라세아 식물 유래의 샘플로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 브라시카·올레라세아 식물의 2 이상의 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 마커간의 증폭량의 상대차로부터 염색체의 이수성을 검출하는 것을 포함하여 이루어지는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 브라시카·올레라세아 품종에 있어서 발생하는 경우가 있는 이형(염색체 이수체)을, 종자의 품질 관리나, 육종 연구의 과정에서, 일반적인 분자 생물학적 방법을 갖는 실험실 등에 있어서, 간편하고, 정확하면서 또한 신속하게 검정하는 것이 가능해진다.

Description

브라시카·올레라세아 식물의 이형 검출법

관련 출원의 참조

본원은, 선행하는 일본 특허 출원인 특원 제2017-157384호(출원일: 2017년 8월 17일)에 기초하는 것이고, 그의 우선권의 이익을 주장하는 것이며, 그의 개시 내용 전체는 참조함으로써 본 명세서에 도입된다.

기술분야

본 발명은, 브라시카·올레라세아(Brassica oleracea) 작물의 이형(염색체 이수체(aneuploid))의 검출 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은, 브라시카·올레라세아(이하, 「B. oleracea」라고 약칭하는 경우가 있음) 작물에 있어서, 이수체를 원인으로 하여 각종 이상 형태를 나타내는 개체에 대하여, 이들을 어떠한 생육 스테이지에 있어서도, 분자 생물학적 방법에 의해 정확하면서 또한 신속하게 분류하여 검출하는 것을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.

유채과 식물은, 중근동이나 지중해 연안을 기원으로 하는 식물종이며, 브라시카(Brassica)속 식물에는 농업상 매우 중요한 작물이 포함된다. 그 중에서도 브라시카·올레라세아종은, B. oleracea var. capitata(양배추), B. oleracea var. italica(브로콜리), B. oleracea var. botrytis(콜리플라워), B. oleracea var. gemmifera(방울 양배추), B. oleracea var. gongyloides(콜라비), B. oleracea var. acephara(모란채, 케일) 및 B. oleracea var. albograbra(카이란) 등을 포함하는 매우 중요한 식물종이다.

일반적으로 브라시카·올레라세아 작물에 있어서는, 자가불화합성(self incompatibility, SI), 또는 세포질 웅성 불임성(cytoplasmic male sterility, CMS)의 성질을 이용한 잡종 제1대 교배(F1) 식물이 육종되어 왔다. F1 품종은, 재래 품종이나 고정종에 비해, 환경에 적응한 우수한 능력이나 품종 내의 높은 균일성을 나타내기 때문에, 상업적 이용 가치가 높고, 많은 나라에서 이용되고 있다.

한편, 부모의 유전자를 이어받은 F1 품종임에도 불구하고, 통상과는 다른 형태를 나타내는 개체도 일정한 빈도로 출현하는 것이 보고되어 왔다(문헌 V. Ruffio-Chable et al., (2000)(비특허문헌 1)). 이러한 이형 개체는, 통상, 농산물로서의 가치가 매우 낮으며, 통상은 청과물로서의 출하 대상으로는 될 수 없다. 또한, 이러한 이형을 나타내는 개체가 상품 종자 중에 대량으로 발생한 경우에는, 상업상 큰 문제로 발전하기 어렵지 않기 때문에, 종묘 회사는 그 로트를 폐기하는 등의 대응이 필요해지는 경우도 있다.

이러한 이형 발생 원인에 대하여는, 오랫동안 해명되지 않고, 채종 시 혹은 청과 재배에 있어서의 환경이 영향을 미치고 있다든가, 돌연변이, 후성적 변이 등이 영향을 미치고 있는 것은 아닌가라는, 각종 억측이 이루어지는 데 그치고 있었다.

또한, 상술한 이형 문제는, 농가에 종자를 판매하는 종묘 회사의 품질 관리 현장에 있어서도 매우 귀찮은 문제이다. F1 종자를 생산·판매하는 종묘 회사는, 상품 종자의 순도 검정을 목적으로 하여 DNA 마커나 동종효소를 이용한 검정을 실시한다. 그러나, 이들 이형 개체는, 유전자형으로서는 F1형을 나타내기 때문에, 통상은 검출할 수 없다. 이 때문에, 검사 현장에 있어서는, 오랫동안 검정 방법의 개발이 요망되고 있었다.

추가로, 육종 연구에 있어서도, 이러한 이형 개체가 다발하지 않도록 품종 특성을 개량할 필요가 있다. 그러나, 이러한 이형은, 유묘기에서는 외관으로부터 판단하는 것은 어렵다. 이 때문에, 이형의 발생률을 정확하게 카운트하기 위해서는, 포장(圃場)에서 대규모로 전개하고, 숙련된 육종자가 정성스럽게 개체의 특성을 조사할 필요가 있었다. 그러나, 이와 같은 그로우 아웃(grow-out) 검정은 주관에 의지하는 측면이 있어, 판정하는 사람에 의해 결과가 변동되어버릴 우려가 있었다. 또한, 식물의 생육 스테이지나 재배 환경에 따라서는, 가령 숙련된 육종자라도 정확하게 판단하는 것은 어렵고, 이러한 배경으로부터, 종묘 회사에서는 오랫동안, 유묘에서의 간이 검정법의 개발이 요망되고 있었다.

예를 들어, 문헌 V. Chable et al., (2009)(비특허문헌 2)에서는, 콜리플라워 F1 품종에 있어서 출현하는 이상 형태가, 이수체에서 기인할 가능성이 설명되고 있다. 이러한 이수체를 검출하는 일반적인 방법으로서, 플로우 사이토미터를 사용한 실험예가 몇가지 보고되어 있다.

그러나, 플로우 사이토미터를 사용한 방법은, 염색체 1개의 차를 정확하게 검출하는 것은 용이하지 않고, 내재성 컨트롤을 두었다고 해도, 문헌 N. Roux et al., (2003)(비특허문헌 3)에서 개시된 데이터과 같이, 판단이 어려워지는 경우가 일어날 수 있다. 또한, 염색체의 크기에는 차가 있고, 최대의 염색체와 최소의 염색체의 게놈량비는, 2배 가까이에 달하는 경우가 있다. 비교적 작은 염색체가 부가된 경우에는, 정상 개체와 이수체가 나타내는 피크의 차가 매우 작기 때문에 판단하기 어려워, 검출 감도가 결과의 신뢰성에 끼치는 영향은 크다.

이 때문에, 플로우 사이토미터를 사용한 방법은, 통상의 실험실에서 대규모의 검정을 실시할 수 없는 등의 문제가 있었다.

또한, 플로우 사이토미터를 사용한 방법에 있어서, 가령 신뢰도가 높은 실험계를 조합하였다고 해도, 복수의 염색체에 이수성을 발생한 식물의 경우, 예를 들어 제1 염색체 트리소미(Trisomy)와 제2 염색체 모노소미(Monosomy)가 조합된 이수체의 경우, 결과적으로 18개의 염색체가 핵에 포함되기 때문에 정상 개체라고 판정해버리는 등의 문제가 있었다.

또한, 플로우 사이토미터를 사용한 간이 검정에서는, 어느 염색체에 이수성이 발생한 것인지를 동정하는 것은 곤란하다. 트리소미가 된 염색체에 따라서는, 브로콜리의 제2, 제7 염색체 트리소미나, 콜리플라워의 제1, 제2, 제7 염색체 트리소미과 같이, 성숙기는 다소 어긋나지만 청과물을 문제없이 수확할 수 있는 타입도 있고, 이수체인 것이 즉시 상품 가치의 감퇴와 결부되지 않는 경우도 있다. 이 때문에, 현장에서는, 트리소미의 타입을 개별로 판별할 수 있는 것이 중요해진다. 또한, 육종을 진행시키는 관점에서는, 어느 염색체가 트리소미화하기 쉬운가라는 것도 중요한 정보가 되기 때문에, 간편하면서 염색체마다의 상세한 이수성을 해석할 수 있는 검정 방법의 개발이 요망되고 있었다.

식물에 있어서는, PCR을 이용한, DNA 마커를 사용한 유전자형의 판별 방법이 지금까지도 보고되고 있다. 예를 들어, 일본 특허 제3836451호(특허문헌 1)에는 고추속 식물의 매운 맛 성분의 생산에 관여하는 유전자형의 판정법이 개시되어 있다. 그러나, 유채과 식물의 이형의 검정법으로의 적용은, 본 발명자들이 아는 한, 지금까지 보고되어 있지 않다.

일본 특허 제3836451호

V. Ruffio-Chable et al., ISHS Acta Horticulturae 539(2000) p89, Developmentally "Aberrant" plants in F1 hybrids of Brassica oleracea. V. Chable et al., Euphytica 170(2009) p275, "Aberrant" plants in cauliflower: 2. Aneuploidy and global DNA methylation. N. Roux et al., Plant Cell Report 21(2003) p483, Rapid detection of aneuploidy in Musa using flow cytometry. I. Parkin et al., Genetics 171(2005) p765, Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsis thaliana. X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118(2009) p1121, Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome survey sequences in Brassica napus

본 발명의 목적은, 상술한 바와 같은 종래의 문제점, 즉, 브라시카·올레라세아 품종에 있어서 발생하는 경우가 있는 이형(염색체 이수체)을, 종자의 품질 관리나, 육종 연구의 과정에서, 정확하면서 또한 신속하게 검정하는 것을 가능하게 하는 방법을 제공하는 데 있다. 또한 이러한 방법은, 일반적인 분자 생물학적 방법을 갖는 실험실 등에 있어서, 간이하게 실시 가능한 것이다.

본 발명자들은 이번에, 종자의 품질 관리 및 육종 연구의 양쪽 사이드로부터의 높은 요구에 대응하기 위해 예의 검토한 결과, 브라시카·올레라세아종에 있어서, 리얼타임 PCR을 사용함으로써, 전체 염색체의 이수체를, 정확하면서 또한 신속하게 검정하는 데 성공하였다. 이 방법에 의하면, 리얼타임 PCR을 갖는 연구실이면 용이하게 실시 가능하고, 간이적으로 이형을 검출하는 것이 가능하였다. 또한 이 방법은, 이수체를 원인으로 하여 각종 이상 형태를 나타내는 개체에 대하여, 이들을 어떠한 생육 스테이지에 있어서도, 분자 생물학적 방법에 의해 정확하면서 또한 신속하게 분류하여 검출하는 것을 가능하게 하였다.

즉, 본 발명에 따르면, 이하의 발명이 제공된다.

<1> 브라시카·올레라세아 식물의 이수체의 검출 방법으로서,

피검 브라시카·올레라세아 식물 유래의 샘플로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 브라시카·올레라세아 식물의 2 이상의 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 마커간의 증폭량의 상대차로부터 염색체의 이수성을 검출하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.

<2> 상기 DNA 마커로서, 브라시카·올레라세아 식물의 제1 염색체로부터 제9 염색체의 전체 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커를 사용하고,

피검 식물이, 전체 염색체 중 어느 염색체에 관한 이수체인지를 판정하는 것을 포함하는, 상기 <1>의 방법.

<3> 상기 DNA 마커로서, 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이며, 그 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능한 프라이머를 사용하는, 상기 <1> 또는 <2>의 방법.

<4> 상기 DNA 마커로서,

(i) 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이며, 그 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능한 프라이머와

(ii) 상기 (i)의 어느 하나의 염색체 DNA와 동일한 염색체 DNA에 특이적이며, 상기 (i)의 프라이머에 기초하는 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 검출 가능한 프로브

를 사용하는, 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 하나의 방법.

<5> PCR 반응에 의해 합성되는 이중쇄 DNA에 결합하여 형광을 발하는 인터칼레이터를 사용하거나, 또는 PCR 신장 반응에 의해 형광을 발하도록 형광 색소에 의해 수식된 프로브를 사용하는, 상기 <3> 또는 <4>의 방법.

<6> 염색체의 이수체를 검출하는 지표로서, 리얼타임 PCR로부터 얻어지는 형광 시그널의 증가를 사용하는, 상기 <1> 내지 <5> 중 어느 하나의 방법.

<7> 상기 DNA 마커로서, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머를 1종 이상 사용하는, 상기 <1> 내지 <6> 중 어느 하나의 방법.

<8> 상기 DNA 마커로서, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머의 1종 이상과, 서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브의 1종 이상을 사용하는, 상기 <1> 내지 <7> 중 어느 하나의 방법.

<9> 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머를 적어도 1종 이상 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체 검출용 프라이머 세트.

<10> 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 중 적어도 1종 이상과,

서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는, 형광 색소에 의해 수식된 프로브 중 적어도 1종 이상

을 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체 검출용 프라이머 및 프로브의 세트.

<11> 상기 <1> 내지 <8> 중 어느 하나의 검출 방법을 사용하여, 브라시카·올레라세아 식물의 계통마다 그의 각 염색체의 이수체 발생 빈도를 평가함으로써, 이수체 발생률이 적은 계통을 선발하는 공정을 포함하는, 브라시카·올레라세아 작물의 육종 방법.

<12> 상기 <1> 내지 <8> 중 어느 하나의 검출 방법을 사용하여, 브라시카·올레라세아 식물의 종자에 포함되는 이수체의 혼입률을 검정하는 것을 포함하는, 브라시카·올레라세아 종자의 품질 관리 방법.

<13> 상기 <1> 내지 <8> 중 어느 하나의 검출 방법을 사용하여, 브라시카·올레라세아 식물에 포함되는 이수체의 혼입률을 검정하는 것을 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 품질 관리 방법.

본 발명의 검정 방법에 의하면, 이형 발생률 및 각 이형의 장래적인 형태를 간편하면서 정확하게 특정할 수 있고, 상품 종자의 순도 검정, 및 각 육종 계통의 이형 발생 빈도를 검정하는 것이 가능해진다. 그 결과, 품질이 양호한 종자의 안정 공급, 및 성질이 양호한 계통을 육성하는 수단을, 효율적이면서 또한 신속하게, 조기에 제공하는 것이 가능해진다.

도 1은 브로콜리의 품종으로부터 발생한 이수체(aneuploid)의 표현형을 나타낸다. 도면 중, 각각 (A)는 정상적인 개체(Normal), (B)는 제1 염색체 트리소미(Trisomy)(+C1), (C)는 제2 염색체 트리소미(+C2), (D)는 제3 염색체 트리소미(+C3), (E)는 제4 염색체 트리소미(+C4), (F)는 제5 염색체 트리소미(+C5), (G)는 제6 염색체 트리소미(+C6), (H)는 제7 염색체 트리소미(+C7), (I)는 제8 염색체 트리소미(+C8), 및 (J)는 제9 염색체 트리소미(+C9)를 나타낸다.
도 2는 리얼타임 PCR에 의한 정량 해석을 행하는 경우의 증폭 곡선의 이미지도를 나타낸다. 도면은, 제6 염색 트리소미 경우를 예로 하고 있다. PCR의 반응액에 첨가하는 주형의 DNA량이 일정하면, 예를 들어 제6 염색체 트리소미(Trisomy)의 경우, 제6 염색체에 좌승(座乘)하는 마커의 증폭 곡선은, 정상 개체(Normal)보다도 빨리 상승하는 것을 알 수 있다.
도 3은 이수체의 검출예를 나타낸다. 즉, 리얼타임 PCR을 실시함으로써 얻어진 염색체 마커의 증폭에 기초하는 상대 정량의 계산 결과의 일례를 나타낸다. 도면과 같이, 브로콜리 F1 품종 96개체를 재료로 하여, 제4 염색체 마커 및 제6 염색체 마커에 의한 멀티플렉스 PCR을 행하여 시험을 실시한 바, 제4 염색체 상의 마커를 기준으로 하여, 제6 염색체 상의 마커를 상대 정량한 결과, 제6 염색체 트리소미 및 제4 염색체 트리소미를 동정할 수 있었다.
도 4는 트리소미 식물의 화분 모세포에서 관찰된 염색체의 현미경 사진을 나타낸다. 도면과 같이, 화분 모세포 감수 분열 제1 분열 중기의 세포를 현미경으로 관찰한 결과, 정상형(Normal)의 염색체(2n=18)는 9개의 2가 염색체가 관찰된 것에 비해, 트리소미 식물의 염색체(2n+1)는 9개의 2가 염색체 플러스 1개의 염색체(화살표)가 관찰되었다.
도 5는 콜리플라워의 품종으로부터 발생한 이수체의 표현형을 나타낸다. 도면 중, 각각 (A)는 정상적인 개체(Normal), (B)는 제1 염색체 트리소미(+C1), (C)는 제2 염색체 트리소미(+C2), (D)는 제4 염색체 트리소미(+C4), (E)는 제6 염색체 트리소미(+C6), (F)는 제7 염색체 트리소미(+C7), 및 (G)는 제9 염색체 트리소미(+C9)를 나타낸다.
도 6은 양배추의 품종으로부터 발생한 이형을 나타낸다. 도면 중 각각, (A)는 정상적인 개체(Normal), (B)는 제1 염색체 트리소미(+C1), (C)는 제2 염색체 트리소미(+C2), (D)는 제4 염색체 트리소미(+C4), (E)는 제5 염색체 트리소미(+C5), (F)는 제6 염색체 트리소미(+C6), (G)는 제7 염색체 트리소미(+C7), (H)는 제8 염색체 트리소미(+C8), 및 (I)는 제9 염색체 트리소미(+C9)를 나타낸다. 또한, (J)는 제1 염색체 및 제2 염색체에 이수성이 발생한 개체(+C1, +C2), (K)는 제1 염색체 및 제8 염색체에 이수성이 발생한 개체(+C1, +C8), 및 (L)은 제5 염색체 및 제8 염색체에 이수성이 발생한 개체(+C5, +C8)를 나타낸다.
도 7은 브로콜리, 콜리플라워 및 양배추의 각 품종으로부터 발생한 이수체의 표현형의 특징을 나타낸다. 단, 이들의 특징은, 여기에서 채용한 각 품종에 관한 금회의 실시예의 시험에 있어서 관찰된 표현형의 특징의 일부에 관한 것이고, 식물종이나 이수체의 각각에 대하여, 반드시 일반화하여 특징지을 수는 없는 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명은, 상기한 바와 같이, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체의 검출 방법으로서, 피검 브라시카·올레라세아 식물 유래의 샘플로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 브라시카·올레라세아 식물의 2 이상의 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 마커간의 증폭량의 상대차로부터 염색체의 이수성을 검출하는 것을 포함하여 이루어지는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 검출 방법에 사용하는 염색체수는 3 이상이며, 보다 바람직하다고 할 수 있는 순으로, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상이며, 가장 바람직하게는 9개의 전체 염색체에 관한 마커를 사용한다.

따라서, 바람직하게는 본 발명의 방법은, 상기 DNA 마커로서, 브라시카·올레라세아 식물의 제1 염색체로부터 제9 염색체의 전체 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커를 사용하고, 피검 식물이, 전체 염색체 중 어느 염색체에 관한 이수체인지를 판정하는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, 브라시카·올레라세아(Brassica oleracea) 식물이란, 브라시카속 식물의 브라시카·올레라세아종의 식물을 의미하고, 여기에는, B. oleracea var. capitata(양배추), B. oleracea var. italica(브로콜리), B. oleracea var. botrytis(콜리플라워), B. oleracea var. gemmifera(방울 양배추), B. oleracea var. gongyloides(콜라비), B. oleracea var. acephara(모란채, 케일) 및 B. oleracea var. albograbra(카이란) 등이 포함된다. 바람직하게는 본 발명에 있어서, Brassica oleracea 식물은 브로콜리, 콜리플라워, 양배추이다.

여기서 「이수체」 또는 「이형」이란, 브라시카·올레라세아 식물에 있어서의 어느 염색체수에 이상이 있는 것, 즉, 염색체 수적 이상(aneuploidy)을 의미한다. 브라시카·올레라세아 식물의 염색체는 2n=18이기 때문에, 정상적인 식물의 경우, 1 세포 중에 9종의 염색체가 2개씩 존재한다. 한편, 이수체, 즉, 이수성 식물, 예를 들어 제1 염색체 트리소미(trisomy)의 경우에는, 제1 염색체가 3개로 증가하고 있으며, 제1 염색체에 이상이 있는 것이 된다. 이수체의 개체에 따라서는, 식물종이나 생육 상황 등에 따라서, 농산물이나 청과물로서 허용될 수 있는 경우도 있을 수 있지만, 통상적으로 이형 개체는, 농산물로서의 가치가 매우 낮은 경우가 많아, 청과물로서의 출하 대상으로는 될 수 없는 경우가 많다. 이 때문에, 이수체의 검출을 신속하면서 또한 간편하게 실시할 수 있는 방법이 중요해진다.

본 발명의 검출 방법에 있어서는, 먼저, 이수체인지 여부를 판단하고자 하는 피검 브라시카·올레라세아 식물을 준비하여, 이 피검 브라시카·올레라세아 식물 유래의 샘플로부터 DNA를 추출하고, 이것을 PCR에 있어서의 주형으로서 사용한다.

여기서 DNA의 추출 방법은, 핵산 추출법으로서 당업자에게 공지된 방법이면 어느 방법이라도 이용 가능하다. 본 발명에서는, 추출된 조질(crude) DNA를 그대로 PCR의 주형으로서 사용할 수 있지만, 예를 들어 페놀/클로로포름법, 계면 활성제에 의한 세포 용해나 프로테아제 효소에 의한 세포 용해, 글래스 비즈에 의한 물리적 파괴 방법, 동결 용융을 반복하는 처리 방법, 및 이들의 조합을 사용하여 DNA의 추출을 행해도 된다. 또한, 시약 메이커로부터 판매되고 있는 각종 DNA 추출 키트, 예를 들어 QIAGEN Plant mini Kit(QIAGEN GmbH사제) 등을 사용해도 된다. 이들 방법에 의해 추출한 DNA는, PCR의 주형으로서 사용하는 데 적합한 상태로 유지하는 것이 바람직하고, 예를 들어 적절한 완충액에 용해시켜 저온 하에서 보관하는 것이 바람직하다. 얻어진 DNA의 순도는, 분광 광도계를 사용하여 230, 260 및 280nm의 흡광도를 측정함으로써 검정할 수 있다. PCR을 행하는데 있어서, 260/230nm의 흡광도비가 2.0 이상, 260/280nm의 흡광도비가 1.8 내지 2.0인 것이 바람직하다. 또한, 얻어진 DNA 용액에 대하여, 식물이 공통으로 갖는 내재성 유전자에 대한 프라이머 쌍(프라이머 페어)을 사용하여 PCR을 행하고, 증폭이 일어나는 것을 확인해도 된다.

본 발명의 검출 방법에 있어서는, 피검 브라시카·올레라세아 식물 유래의 샘플로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 브라시카·올레라세아 식물의 각 염색체의 일부를 증폭할 수 있는 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 실시한다. 상세하게는, DNA 마커로서는, 브라시카·올레라세아 식물의 2 이상의 염색체의 각각에 특이적인 2종 이상의 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 실시한다. 보다 상세하게는, DNA 마커로서, 브라시카·올레라세아 식물의 제1 염색체로부터 제9 염색체의 전체 염색체 중 2 이상의 염색체의 각각에 특이적인 2종 이상의 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 실시한다.

여기서 사용하는 DNA 마커로서는, 브라시카·올레라세아 식물의 어느 염색체에 좌승하는 것이며, 염색체 게놈 내에 싱글 카피로서 존재하고, 다른 염색체 상에 존재하는 서열의 영향을 받지 않는 마커라면 특별히 제한은 없다. 본 발명에서는, 이러한 마커를 사용함으로써, 리얼타임 PCR에 의한 상대 정량을 실시하여, 브라시카·올레라세아의 각종 작물에 대하여 이수체의 검정을 실시 가능하게 하는 것이다.

따라서, 즉, 해당 마커는, 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이며, 그 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능한 프라이머가 바람직하다. 여기서, 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이라는 것은, 9종의 염색체 중 어느 하나의 염색체에만 특이적이며, 다른 염색체에는 특이적이지 않은 것을 의미하고, 그 특이적인 염색체 DNA가 존재할 때, 프라이머는 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능하다. 예를 들어, 사용하는 DNA 마커에는, 제1 염색체의 DNA에만 특이적이며, 그 제1 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의해 증폭 산물을 생성할 수 있는 프라이머가 포함될 수 있다.

여기서 사용하는 프라이머의 설계에 대하여는, 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이며, 그 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능하도록, 당업자라면 적절히 제작할 수 있다. 구체예를 들면, 후술하는 실시예 1의 기재를 참조함으로써, 당업자는 적절히 원하는 프라이머를 제작할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 상기와 같은 성질을 갖는 프라이머를 사용하여, 리얼타임 PCR을 실시함으로써 이수체 검정을 가능하게 하는 것이지만, 하나의 바람직한 양태로서, 인터칼레이터법을 들 수 있다. 인터칼레이터법에 있어서는, PCR 반응액에 첨가된 인터칼레이터는, PCR 반응에 의해 합성되는 이중쇄 DNA에 결합하여 형광을 발하기 때문에, 프라이머에 의한 신장 반응이 일어나고, 증폭 산물이 생성되면, 형광을 발한다. 이것을 검출함으로써, DNA 마커간에서의 증폭량의 상대차를 측정할 수 있다.

인터칼레이터로서는, 예를 들어 SYBR Green I를 사용할 수 있다.

인터칼레이터법의 구체적인 양태로서,

(ii) 인터칼레이터

를 PCR 반응액에 첨가하고, PCR에 있어서의 신장 반응의 스텝에서 발해지는 형광 시그널을 매사이클 측정하고, 상대 정량의 계산을 행한다. 이에 의해, DNA 마커간에서의 증폭량의 상대차를 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서의, 또 하나의 바람직한 양태로서, 상기와 같은 성질을 갖는 프라이머에 기초하는 PCR 반응에 의해 발생하는 증폭 산물을 검출할 수 있는 프로브를 사용하는, 프로브법을 들 수 있다. 사용 가능한 프로브로서는, 목적으로 하는 증폭 산물의 검출이 가능하면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 PCR 신장 반응에 의해 형광을 발하도록 형광 색소에 의해 수식된 표지 프로브를 사용한다. 상대 정량의 계산법에 대하여는, PCR의 신장 반응 시에 발해지는 형광을 측정함으로써, 인터칼레이터법과 동일한 원리로 행할 수 있다. 또한, 인터칼레이터법과 비교하여, 프로브법에서는, 비특이적인 PCR 산물을 검출해버리는 리스크를 낮출 수 있다.

프로브법의 구체적인 양태로서,

를 사용하여, PCR에 있어서의 신장 반응의 스텝에서 발해지는 형광 시그널을 매사이클 측정하고, 상대 정량의 계산을 행한다. 이에 의해, DNA 마커간에서의 증폭량의 상대차를 측정할 수 있다.

형광 표지 프로브로서는, 형광 물질과 소광 물질로 이중 표지한 TaqMan 프로브가 바람직하다. TaqMan 프로브는, 통상 핵산 프로브의 5' 말단을 형광 물질(리포터 형광 색소)로 수식하고, 3' 말단을 소광 물질(??처 형광 색소)로 수식한다. 리포터 형광 색소의 예로서는 Cy3, Cy5, 6-FAM(6-카르복시플루오레세인), TET(6-카르복시-4,7,2',7'-테트라클로로플루오레세인), HEX(6-카르복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인) 등의 플루오레세인계 형광 색소를 들 수 있다. ??처 형광 색소의 예로서는, 6-카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX) 등의 로다민계 형광 색소가 사용되는 경우도 있지만, 멀티플렉스 PCR을 실시하는 경우에는, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Eclipse 등의 다크 ??처를 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어 5' 말단에 FAM, HEX, Cy5의 3종류의 형광 색소, 3' 말단에는 BHQ-1, BHQ-3의 2종류의 ??처로 표지한 가수 분해 프로브를 적합하게 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 검출 방법에 있어서는, PCR 반응에 의해 합성되는 이중쇄 DNA에 결합하여 형광을 발하는 인터칼레이터를 사용하거나, 또는 PCR 신장 반응에 의해 형광을 발하도록 형광 색소에 의해 수식된 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

형광 색소에 의해 수식된 프로브를 사용하는 경우, 상이한 종류의 형광 색소를 라벨링한 프로브를 이용하고, 몇종류의 마커를 혼합하여 멀티플렉스 PCR을 실시할 수 있다. 전술한 방법과 동일하게, 각 형광 프로브가 발하는 형광 시그널로부터, 피검 샘플 각 개체 및 각 마커에 대하여, DNA 마커간에서의 증폭량의 상대차를 측정할 수 있지만, 그 때, 멀티플렉스 PCR의 경우에는 같은 반응액 중의 하나의 마커를 내재성 컨트롤로 설정한 상대 정량의 계산이 가능해지고, 실험 오차를 저감시킴으로써 결과의 신뢰성을 향상시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 양태에 의하면, 프로브법에 의한 멀티플렉스 PCR을 실시한다.

따라서 본 발명의 하나의 바람직한 양태에 의하면, 본 발명의 검출 방법에서는, 염색체의 이수체를 검출하는 지표로서, 리얼타임 PCR로부터 얻어지는 형광 시그널의 증가를 사용한다.

부언하면, 프라이머 또는 프로브가 되는 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드의 합성법으로서 당 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어 포스포트리에틸법, 포스포디에스테르법 등에 의해, 통상 사용되는 DNA 자동 합성 장치를 이용하여 합성하는 것이 가능하다.

본 발명의 보다 바람직한 양태에 의하면, DNA 마커로서, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머의 1종 이상을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 후술하는 표 1에 기재된 프라이머의 1종 이상을 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 다른 보다 바람직한 양태에 의하면, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머의 1종 이상과, 서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브의 1종 이상을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 표 1에 기재된 프라이머의 1종 이상과, 표 2에 기재된 프로브의 1종 이상을 사용할 수 있다. 이들 마커는, 제1 내지 제9의 9종류의 염색체에 대응하는 마커이다.

여기서, DNA 마커가 염기 서열을 「갖는」이란, 해당 마커가 그 염기 서열을 갖고 있는 것을 말한다. 본 발명에 있어서는, DNA 마커는 상기한 바와 같이, 소정의 염색체의 DNA에 특이적인 점에서, 그 마커로서의 성질을 갖는 한, DNA 마커는, 대응하는 염기 서열 내의 염기 중 어느 1개 또는 수개(예를 들어, 1, 2 혹은 3개, 바람직하게는 1 또는 2개, 보다 바람직하게는 1개)가 치환, 결실, 부가 혹은 삭제되어 있어도 되는 것을 의미하고, 혹은 대응하는 염기 서열을 일부로서 포함하면서 또한 소정의 성질을 유지하는 서열이어도 된다. 이러한 경우, 「갖는다」라는 단어는, 「포함한다」로 바꿔 말해도 된다. 또한, 1개의 염기의 치환, 결실, 부가 혹은 삭제가 허용되는 경우에 대하여는, 「갖는다」를 「로 실질적으로 이루어진다」로 바꾸어 말해도 된다.

본 발명의 다른 보다 바람직한 양태에 의하면, DNA 마커로서, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍의 1종 이상을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 후술하는 표 1에 기재된 프라이머 쌍의 1종 이상을 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 다른 보다 바람직한 양태에 의하면, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍의 1종 이상과, 거기에 대응하는 서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브를 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 표 1에 기재된 프라이머 쌍의 1종 이상과, 표 2에 기재된 프로브의 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 보다 더욱 바람직한 양태에 의하면, DNA 마커는, 이하의 3개의 조로 나누어 사용함으로써, 보다 정확하면서 또한 안정적인 검정을 실시할 수 있다.

·제6 염색체 마커, 제4 염색체 마커 및 제2 염색체 마커,

·제9 염색체 마커, 제3 염색체 마커 및 제8 염색체 마커, 그리고

·제1 염색체 마커, 제5 염색체 마커 및 제7 염색체 마커.

본 발명에 있어서, 리얼타임 PCR법은, 상기 프라이머 쌍과 프로브를 사용하는 것 이외에는, 예를 들어 실험 의학 별책 원리로부터 잘 아는 리얼타임 PCR 실험 가이드(요도샤), Saiki RK, et al., Science, 230: 1350-1354(1985)나 식물 세포 공학 별책, 식물의 PCR 실험 프로토콜, 시마모토 코우·사사키 다쿠지 감수(1995년) 등에 기재되어 있는 통상의 방법에 기초하여, 시판되고 있는 리얼타임 PCR 키트나 리얼타임 PCR 장치를 사용하여, 그들에 첨부된 조작 설명서를 따라서 행하면 된다.

리얼타임 PCR 장치로서는, 예를 들어 LightCycler 480 System II(Roche사제) 등을 사용할 수 있다. 또한 이 때, 반응 시약으로서는, 예를 들어 「Premix Ex Taq(Perfect Real Time)」(다카라 바이오사제) 등을 사용할 수 있지만, 특별히 이것에 한정되지 않는다.

먼저, 상기 조작으로 얻어진 DNA 시료를 주형으로 하고, 본 발명에 있어서의 소정의 프라이머 또는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 행한다. PCR 증폭은 상기한 프라이머 또는 프라이머 쌍을 사용하는 것 이외에는 특별히 제한은 없고, 통상법에 따라서 행할 수 있다. PCR 조건(변성, 어닐링, 신장의 각 스텝의 온도 및 시간, 그리고 사이클수 등), PCR 반응액의 조성(주형 DNA량, 완충액의 종류, 프라이머 농도, DNA 폴리메라아제의 종류나 농도, dNTP 농도, 염화마그네슘 농도 등)은, 상기한 프라이머 또는 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 있어서 원하는 고감도로 PCR 증폭 산물이 얻어지는 조건을 예비 실험 등에 의해 당업자라면 적절하게 선택 및 설정할 수 있다. 또한, DNA 폴리메라아제, dNTP 농도, 염화마그네슘 농도 등이 거의 최적화된 리얼타임 PCR용 마스터믹스가 시판되고 있으므로, 적절히 이들을 이용해도 된다.

상기한 바와 같이, 브라시카·올레라세아의 염색체는 2n=18이기 때문에, 정상적인 식물의 경우, 1 세포 중에 9종의 염색체가 2개씩 존재한다. 한편 이수성 식물, 예를 들어 제1 염색체 트리소미의 경우에는, 제1 염색체가 3개로 증가하고 있다. 이들 식물로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 표 1, 혹은 표 1과 표 2에 기재된 DNA 마커를 사용하여 리얼타임 PCR을 실시하면, 반응액에 첨가하는 DNA량을 정확하게 통일한 경우, 제1 염색체 트리소미에서는, 정상 개체에 대하여 제1 염색체에 좌승한 마커의 증폭 곡선은 빠른 사이클로 상승하는, 즉, 낮은 임계 사이클(Threshold cycle)값(Ct값, 형광 강도로부터 얻어지는 마커의 증폭 곡선과, 어떤 일정한 기준으로 설정한 임계선(Threshold line)의 교점)이 된다.

구체예를 나타내면, 도 2에도 나타내고 있는 바와 같이, PCR의 반응액에 첨가하는 주형의 DNA량이 일정하면, 예를 들어 제6 염색체 트리소미(Trisomy)의 경우, 제6 염색체에 좌승하는 마커의 증폭 곡선은, 정상 개체(Normal)보다도 빨리 상승한다.

그러나, 실제의 검정 현장에서는, 다수의 피검 샘플의 DNA량을 정확하게 정렬시키는 것은 곤란하다. 이 때문에, DNA량을 정렬시키는 것은 아니고, 각 염색체의 마커 증폭을 상대 정량하여, 그들의 상대차로부터, 각 염색체의 수를 추정할 수 있고, 트리소미 등의 이수성을 판정하는 것이 가능해진다.

이 방법을 브라시카·올레라세아종에 폭넓게 적용하기 위해서는, 브라시카·올레라세아종 내에서 SNPs가 존재하지 않는 공통 영역에 PCR용의 프라이머 등을 설계할 필요가 있지만, 본 발명자들이 예의 검토한 결과, 브라시카·올레라세아종에 폭넓게 응용이 가능하고, 또한 멀티플렉스 PCR에 의한 효율적인 검정을 실시 가능하다고 할 수 있는 DNA 마커를 설계하는 것에 성공한 것이다. 이에 의해 본 발명의 검출 방법을 발명하기에 이른 것이다.

따라서, 본 발명의 검출 방법에서는, 상기한 바와 같이, 염색체에 특이적인 DNA 마커를 사용하여, 리얼타임 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 마커간의 증폭량의 상대차로부터 염색체의 이수성을 검출한다.

여기서, 얻어지는 DNA 마커간의 증폭량의 상대차는, 피검 브라시카·올레라세아 식물의 2 이상의 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커에 대하여, 리얼타임 PCR을 행한 결과, 염색체 마커마다의 상대적인 증폭량을 비교함으로써 확인할 수 있다. 즉, 복수의 염색체 마커에 관한 증폭량에 대하여 상대 정량함으로써, 그 어느 염색체에 대하여 이상이 있었을 경우, 그 염색체에 의한 마커의 증폭량과, 그 이외의 정상적인 염색체에 의한 마커의 증폭량 사이에서, 명확한 차이가 발생하게 되고, 이로부터, 이수체의 존재를 검출하는 것이 가능해지는 것이다.

마커의 증폭량에 대하여는, 마커의 증폭 곡선을 이용하여 확인할 수 있다. 마커의 증폭 곡선은, PCR 반응에 의해 측정되는 형광 강도에 기초하여, 용이하게 제작 가능하다.

증폭량의 상대차의 측정, 즉, 상대 정량을 행하는 경우에는, 마커에 대하여 얻어지는 증식 곡선을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 증식 곡선과, 어떤 일정한 기준으로 설정한 임계선의 교점을 임계 사이클값(Ct값)으로 하여, 다른 염색체의 마커가 나타내는 Ct값과 비교함으로써, 목적으로 하는 염색체의 수를 추정할 수 있다. 또한 보다 안정된 결과를 구하는 관점에서는, 증식 곡선을 2회 미분하여, 최댓값이 된 부분의 사이클값을 채용하고, 이것을 다른 염색체의 마커가 나타내는 값과 비교함으로써, 목적으로 하는 염색체의 수를 추정해도 된다(2차 미분법).

본 발명에 있어서, 피검 샘플 각 개체 및 각 마커가 나타내는 Ct값에 대하여는, 상기와 같이 하여 2차 미분법에 의해 산출된 값을 채용하고, △△Ct법에 의한 상대 정량에 기초하여 대상으로 한 게놈 영역의 카피수비를 추정할 수 있다.

본 발명에 의한 검출 방법의 바람직한 양태의 일부를, 환언하면, 구체적으로는 이하와 같은 (a)법 및 (b)법으로서 표현할 수도 있다.

(a) PCR 반응액에 SYBR Green I 등의 형광 색소를 혼합하여, 각 염색체의 마커를 별개로 PCR에서 증폭시킨다. SYBR Green I 등의 형광 색소가 발하는 시그널로부터, 피검 샘플 각 개체 및 각 마커의 Ct값을 검출하고, △△Ct법 등에 의한 상대 정량에 기초하여 대상으로 한 게놈 영역의 카피수비를 추정하는 방법.

(b) 상이한 종류의 형광 색소를 라벨링한 프로브를 이용하고, 몇종류의 마커를 혼합하여 멀티플렉스 PCR을 실시한다. 형광 프로브가 발하는 형광 시그널로부터, 피검 샘플 각 개체 및 각 마커의 Ct값을 검출하고, △△Ct법 등에 의한 상대 정량에 기초하여 대상으로 한 게놈 영역의 카피수비를 추정하는 방법.

부언하면 여기에서 상기 (a)법은, 비교적 저렴한 시약으로 실시할 수 있는 한편, 전체 염색체의 PCR을 별개로 실시하기 때문에, 시험 횟수가 증가하는 경향이 있다. 상기 (b)법은, 형광 프로브를 합성할 필요가 있는 한편, 내재성 컨트롤을 기준으로 하여 상대 정량을 실시하는 것이 가능해져, 실험 횟수도 저감시킬 수 있다.

상기한 프라이머, 프라이머 쌍 및 프로브는 키트화할 수도 있다. 본 발명의 키트는, 상기 프라이머 혹은 프라이머 쌍, 또는 프라이머 혹은 프라이머 쌍과 프로브를 적어도 포함하는 것이면 되고, 필요에 따라서, PCR의 양성 컨트롤이 되는 표적 서열을 포함하는 DNA 분자, DNA 추출용 시약, PCR용 완충액이나 DNA 폴리메라아제 등의 PCR용 시약, 표지 물질, 설명서 등을 포함하고 있어도 된다.

따라서 본 발명의 다른 바람직한 양태에 의하면, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머를 적어도 1종 이상 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체 검출용 프라이머 세트가 제공된다. 또한, 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 의하면, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 중 적어도 1종 이상과, 서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는, 형광 색소에 의해 수식된 프로브 중 적어도 1종 이상을 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체 검출용 프라이머 및 프로브의 세트가 제공된다.

본 발명의 이수체 검출 방법을 사용함으로써, 브라시카·올레라세아 식물의 계통마다 그의 각 염색체의 이수체 발생 빈도를 평가할 수 있다. 이것을 이용함으로써, 또한 본 발명에 의해, 이수체 발생률이 적은 계통을 선발하는 공정을 포함하는, 브라시카·올레라세아 작물의 육종 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명에 의한 이수체의 검출 방법을 사용함으로써, 브라시카·올레라세아 식물의 종자에 포함되는 이수체의 혼입률을 검정하는 것을 포함하는, 브라시카·올레라세아 종자의 품질 관리 방법을 제공할 수 있다.

종래에는, 그로우 아웃 검정에 의해 종자에 포함되는 이수체율을 검정하고 있었기 때문에, 재배를 위한 대규모의 포장 면적과 수개월의 생육 기간을 요하고 있었다. 또한, 숙련된 검정자가 아니면 정확한 결과를 도출할 수 없었다. 본 발명에 의한 종자의 품질 관리 방법에 의하면, 이수체율의 검정을, 공간 절약으로 실시할 수 있고, 신속하면서 또한 정확한 결과를 얻을 수 있다.

본 발명에 의한 이수체의 검출 방법을 사용함으로써, 브라시카·올레라세아 식물에 포함되는 이수체의 혼입률을 검정하는 것을 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 품질 관리 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 브라시카·올레라세아 식물의 품질 관리 방법에 의하면, 막 발아된 자엽을 재료로 하여 검정하는 것도 가능하다. 또한, 정식 스테이지까지 이수체 검정을 실시하면, 정상 개체만을 선정하여 재배하는 것이 가능해지고, 그 결과, 거의 모든 식물체로부터 정상적인 청과물을 수확할 수 있다.

실시예

하기 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 전혀 아니다. 예를 들어, DNA를 추출하는 피검 샘플은, 어떤 생육 단계여도 되고, 종자, 자엽, 본엽, 뿌리, 어느 조직을 사용해도 상관없다. DNA의 추출법에 대해서도 특별한 방법은 필요로 하지 않고, PCR을 문제없이 실시할 수 있을 정도로 정제되어 있으면 된다. 형광 색소에 대하여는, 리얼타임 PCR법에서 사용되는 일반적인 색소라면, 어떤 형광 색소를 사용해도 상관없다.

또한, 본 발명의 방법은, 이하의 실시예에서 나타내는 바와 같이, 다른 작물인 브로콜리, 콜리플라워 및 양배추에 있어서도 공통의 마커로 이수체의 검출이 가능한 것을 나타내어, 범용성이 높은 마커인 것을 증명한 것이다. 또한, 본 발명자들은, 이들 실시예 이외에도 다수의 계통에 있어서 본 방법이 실시 가능한 것을 확인하였으며, 본 방법은, 이하의 실시예에서 사용한 계통에 한정되는 것은 전혀 아니다.

실시예 1: 마커의 제작

OPERON사의 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 프라이머(10mer) 및 본 발명자들이 설계한 SRAP(Sequence Related Amplified polymorphism) 프라이머를 사용하고, 브로콜리 F2 집단의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시함으로써 브라시카·올레라세아의 연쇄 지도를 구축하였다.

이어서, 본 발명자들이 구축한 연쇄 지도와, 문헌 I. Parkin et al., Genetics 171(2005) p765(비특허문헌 4), 문헌 X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118(2009) p1121(비특허문헌 5), 및 NCBI에 등록되어 있는 공적 정보를 비교함으로써, 각 연관군(Linkage Group)에 좌승하는 마커와 공적인 연쇄 지도의 관계를 해석하였다.

또한, 각 염색체에 좌승하는 마커는, 모든 브라시카·올레라세아종에 대해서도 이용할 수 있도록 개변할 필요가 있었기 때문에, 양배추, 브로콜리, 콜리플라워의 폭넓은 유전 자원으로부터 특징적인 계통을 선정하고, 그들의 DNA를 주형으로 하여 SNPs가 존재하지 않는 영역을 동정하여, 프라이머를 재설계하였다.

이들 마커를 사용하여, 마커 제작의 과정에서 동정한 제1 염색체 내지 제9 염색체의 각 염색체가 트리소미가 된 9종의 트리소미 식물(도 1)을 주형으로 하여 PCR을 실시하고, 판정에 영향을 미치는 다른 염색체로부터의 비특이적 증폭이 없는 것을 확인한 후, 각 염색체에 특이적인 마커로서 취급하였다.

또한, 보다 간편하면서 안정적인 멀티플렉스 형광 프로브법을 실시하기 위해서, FAM, HEX, Cy5의 3종류의 형광 색소로 라벨링한 가수 분해 프로브를 설계하고, 3종의 마커를 하나의 반응액에 혼합, 즉 6종류의 프라이머와 3종류의 프로브를 혼합해도 서로 간섭하지 않고 안정적인 결과를 낼 수 있는 프라이머 및 프로브의 설계를 목표로 하였다. 일반적으로는, 멀티플렉스 PCR을 실시하면, 프라이머 다이머의 형성이나, 증폭 DNA 단편으로의 다른 프라이머의 어닐링 등 복잡한 반응이 일어나고, 조질 주형 DNA에 대하여, 염색체수가 2개와 3개의 차이(1.5배량의 차)를 안정적으로 검출하는 시스템을 구축하는 것은 어렵다. 그러나, 본 발명자들은, 마커 서열의 개량을 거듭하여, 예의 검토한 결과, 표 1 및 표 2에 나타내는 마커를 설계하는 것에 성공하였다.

또한, 얻어진 9종류의 염색체의 마커를 3종류 3조로 나눔으로써, 보다 정확하면서 또한 안정적인 검정을 실시할 수 있었다(후술하는 실시예 4 참조).

[표 1]

[표 2]

도 2는, 리얼타임 PCR을 이용한 상대 정량에 관한 기본적 원리를 나타낸다.

PCR의 반응액에 첨가하는 주형의 DNA량이 일정하면, 예를 들어 제6 염색체 트리소미의 경우, 제6 염색체에 좌승하는 마커의 증폭 곡선은, 정상 개체보다도 빠르게 상승한다. 상대 정량을 행하는 경우에는, 이 증폭 곡선과, 어떤 일정한 기준으로 설정한 임계선의 교점을 Ct값으로 하여, 다른 염색체의 마커가 나타내는 Ct값과 비교함으로써, 목적으로 하는 염색체의 수를 추정할 수 있다.

도 3은, 리얼타임 PCR을 실시함으로써 얻어진 상대 정량의 계산 결과의 일례를 나타낸다. 여기에서의 시험에서는, 브로콜리 F1 품종 96개체를 재료로 하여, 제4 염색체 마커 및 제6 염색체 마커를 사용하여 형광 프로브법에 의한 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. 리얼타임 PCR기로서는 Roche사의 「LightCycler 480 System II」, 반응 시약으로서는 다카라 바이오사의 「Premix Ex Taq(Perfect Real Time)」을 사용하였다. 도면 중의 X축은 개체 번호를 나타내고, Y축은 제4 염색체 마커를 기준으로 하여 제6 염색체 마커의 상대 정량을 △△Ct법에 의해 계산한 값을 나타낸다.

공시한 96개체 중, 88개체의 정상형은 1 부근의 값을 나타내지만, 5개체의 제6 염색체 트리소미는 1.4 부근, 3개체의 제4 염색체 트리소미는 0.7 부근의 값을 나타냈다. PCR의 증폭 효율을 1 사이클당 2배로 한 경우의 이론값은, 제6 염색체 트리소미가 1.5, 제4 염색체 트리소미가 0.66이기 때문에, 실측값은 여기에 가까운 값이 되었다.

실시예 2 브로콜리의 트리소미 식물의 염색체 관찰

리얼타임 PCR에서 트리소미라고 판정된 식물 중, 제6 염색체 트리소미, 제7 염색체 트리소미 및 제2 염색체 트리소미를 재료로 하여 염색체를 관찰하였다.

길이가 1 내지 2mm인 브로콜리의 봉오리로부터 꽃밥을 취출하고, 1％ 아세트산오르세인 용액으로 염색하여, 화분 모세포의 감수 분열 제1 분열 중기(MI기)의 염색체를 관찰하였다.

결과는, 도 4에서 나타낸 바와 같았다.

도 4에 도시되어 있는 바와 같이, 정상 개체의 염색체(2n=18)는 9개의 2가 염색체가 관찰된 것에 비해, 트리소미 식물의 염색체(2n+1)는 9개의 2가 염색체 플러스 1개의 염색체(화살표)가 관찰되었다.

실시예 3 브로콜리에 있어서의 이형 검출예

가부시키가이샤 사카타노타네가 개발 중인 브로콜리 F1 품종 「SBR-48」의 종자를 육묘 트레이에 파종하고, 발아된 445개체의 자엽으로부터 DNA를 추출하고, 각 염색체에 특이적인 마커를 사용하여 SYBR법에 의한 리얼타임 PCR을 실시하였다.

구체적으로는, 각 염색체에 특이적인 마커로서, 서열 번호 1 내지 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머를 사용하여, 통상의 PCR 반응액에, 인터칼레이터로서 SYBR Green I(Roche사에서 입수)가 최종 농도 1/20000이 되도록 첨가하여 PCR을 실시하였다. 리얼타임 PCR에는 Roche사의 「LightCycler 480 System II」를 사용하고, PCR 조건은, 95℃에서 1분간 인큐베이팅한 후 95℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초의 3스텝 PCR을 40 사이클로 하였다. SYBR Green I의 시그널 측정에는, 여기 파장 465nm, 검출 파장 510nm의 필터를 사용하였다.

2차 미분법에 의해 얻어진 Ct값을 바탕으로, 제9 염색체의 마커를 기준으로 하여 △△Ct법에 의한 상대 정량의 계산을 행하였다.

결과는, 표 3에 나타난 바와 같았다.

이어서, 이들 표 3의 결과를 염색체별로 정리한 결과, 표 4와 같은 비율로 각 이수체가 포함되어 있는 것이 명백해졌다.

부언하면, 본 실시예에 있어서 제3 염색체 트리소미는 출현하지 않았지만, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 제3 염색체 트리소미도 드물게 출현하였다(각 염색체 트리소미의 표현형의 특징에 대하여는 도 7에 나타낸 바와 같았음). 또한 본 발명자들은, 제3 염색체 트리소미도 포함하여, 설계한 마커에 문제가 없는 것을 이미 별도로, 확인하였다.

[표 3-1]

[표 3-2]

[표 3-3]

[표 3-4]

[표 3-5]

[표 3-6]

[표 3-7]

[표 4]

실시예 4 콜리플라워에 있어서의 이형 검출예

가부시키가이샤 사카타노타네가 개발 중인 콜리플라워 F1 품종 「SCF-30」의 종자를 육묘 트레이에 파종하고, 발아된 654개체의 자엽으로부터 DNA를 추출하고, 각 염색체에 특이적인 마커를 사용하여 형광 프로브법에 의한 리얼타임 PCR을 실시하였다.

구체적으로는, 이하와 같이 행하였다.

콜리플라워의 자엽으로부터의 DNA의 추출은, 상기한 실시예 3과 동일하게 행하였다.

염색체에 특이적인 마커로서는, 이하의 3개의 조합으로 나누어, PCR 시험을 실시하였다.

·제6 염색체 마커, 제4 염색체 마커 및 제2 염색체 마커의 트리플렉스,

·제9 염색체 마커, 제3 염색체 마커 및 제8 염색체 마커의 트리플렉스, 그리고

·제1 염색체 마커, 제5 염색체 마커 및 제7 염색체 마커의 트리플렉스.

부언하면 여기에서 사용한 염색체 마커는, 각 염색체에 대하여 표 1 및 표 2에 나타낸 프라이머 및 프로브를 사용하였다. 예를 들어, 제1 염색체 마커는, 서열 번호 1 및 2에 나타낸 서열을 갖는 프라이머와, 서열 번호 19에 나타낸 서열을 갖는 프로브를 사용하였다.

리얼타임 PCR에 대하여는, 실시예 3과 동 기종을 사용하고, PCR 조건은, 95℃에서 1분간 인큐베이팅한 후, 95℃ 15초, 60℃ 45초의 2스텝 PCR을 40 사이클로 하였다. FAM, HEX, Cy5의 시그널 측정에는, 각각 여기 파장 465nm, 533nm, 618nm, 검출 파장 510nm, 580nm, 660nm의 필터를 사용하였다.

2차 미분법에 의해 얻어진 Ct값을 바탕으로, 각각 제2 염색체, 제8 염색체, 제7 염색체의 각 마커를 내재성 컨트롤로 하여 △△Ct법에 의한 상대 정량의 계산을 행하였다

결과는, 표 5에 나타난 바와 같았다.

이어서, 이들 표 5를 정리한 결과, 표 6과 같은 비율로 각 이수체가 포함되어 있는 것이 명백해졌다.

또한, 이 실험에서 이수체로 추정된 식물에 대하여, 그 후의 표현형을 조사하기 위해 포장에서 재배하였다. 그 결과, 브로콜리와 동일하게, 각 이수체가 각각 특징적인 외관을 나타내었다(도 5)(각 염색체 트리소미의 표현형의 특징에 대하여는 도 7에 나타낸 바와 같았음).

이상의 결과로부터, 콜리플라워에 있어서도 브로콜리와 동일하게 이수체가 출현하고, 당해 방법이, 이들 이수체를 검출하기 위한 유효한 수단인 것이 명백해졌다.

[표 5-1]

[표 5-2]

[표 5-3]

[표 5-4]

[표 5-5]

[표 5-6]

[표 5-7]

[표 5-8]

[표 6]

실시예 5 양배추에 있어서의 이형 검출예

가부시키가이샤 사카타노타네가 개발 중인 양배추 F1 품종 「SCB-81」의 재배 포장으로부터, 수확기에 있어서의 외관이 정상과는 다른 형태를 나타낸 개체를 선발하여, 성엽으로부터 DNA를 추출하고, 상기 실시예 4와 완전히 동일한 방법으로 이수체의 분석을 하였다.

결과는, 표 7에 나타난 바와 같았다.

그 결과, 제3 염색체 이외의 트리소미 식물은 모두 검출되고, 양배추에 있어서도 이형 개체의 대부분은 염색체의 이수성이 원인인 것이 명백해졌다.

이러한 점에서, 본 발명에 의한 방법은, 브로콜리나 콜리플라워 뿐만 아니라, 양배추의 이형 개체 분석에도 유효한 것이 증명되었다.

도 6은, 각종 이수체의 외관을 촬영한 것이다(각 염색체 트리소미의 표현형의 특징에 대하여는 도 7에 나타낸 바와 같았음). 도 6이나 표 7에서 나타낸 바와 같이, 대표적인 트리소미 이외에도, 복수의 염색체에 이수성이 발생한 개체도 존재하고 있었다.

[표 7]

SEQUENCE LISTING <110> Sakata Seed Corporation <120> Method for detection of aeuploid of Brassica oleracea <130> 800521JP01 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctggcaaatg taagcccttt ct 22 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cttgtcttat tacagcagat gcattc 26 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgccattgct ttctctctac tct 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaagaggaag gactcgagga ag 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cttaggattc gggttcgttt g 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gccgtaagat ttcaaagaga cttc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgtctcttgt ggtggttgaa g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcaacttcat ctgcttggta atg 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agcacatcat cccccatact t 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cagtctctct ctccttgatg acg 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aggaagagga aattgtcatt cg 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtgaccgttg cagcagataa 20 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aagaaattag ccacaagtcg taaata 26 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acgtgaatga tggatatttg atctc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aaagctcgtg aagcaaatac tacc 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaagcatacc aggagggaaa taa 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gccatcgcga atcaaagata 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atttggtatt ttgcaggcta cag 23 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 cacttgtaaa acatgggttt gatcaaaaga 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 tcctctactt ccaccccatc tgcc 24 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 ccgatctgaa aagggagcta acgac 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 22 ttgcagcaag gagcttagac cacag 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 23 tctcgagaaa tctcatcgct gcttg 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 ttctcagagc tgttccctcc tccac 25 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 ttgcaccacc gttacctttt aacacaa 27 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 tgttttgttt ggtgggcaaa tctctt 26 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 tggagatctt ccacctcatc ttgga 25

Claims

브라시카·올레라세아(Brassica oleracea) 식물의 이수체를 원인으로 하는 이상 형태 여부 확인을 위한 이수체의 검출 방법으로서,
피검 브라시카·올레라세아 식물 유래의 샘플로부터 추출한 DNA를 주형으로 하고, 브라시카·올레라세아 식물의 제1 염색체 내지 제9 염색체 중 어느 하나에만 특이적인 DNA 마커를, 2 이상의 다른 염색체에 대하여 준비하고, 이를 사용하여, 리얼타임 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 마커간의 증폭량의 상대차로부터 염색체의 이수성을 검출하는 것을 포함하여 이루어지고,
피검 식물이, 전체 염색체 중 어느 염색체에 관한 이수체인지를 판정하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA 마커로서, 브라시카·올레라세아 식물의 제1 염색체로부터 제9 염색체의 전체 염색체의 각각에 특이적인 DNA 마커를 사용하고,
피검 식물이, 전체 염색체 중 어느 염색체에 관한 이수체인지를 판정하는 것을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 마커로서, 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이며, 그 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능한 프라이머를 사용하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 마커로서,
(i) 브라시카·올레라세아 식물의 어느 하나의 염색체 DNA에만 특이적이며, 그 염색체 DNA가 존재할 때에 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 생성 가능한 프라이머와
(ii) 상기 (i)의 어느 하나의 염색체 DNA와 동일한 염색체 DNA에 특이적이며, 상기 (i)의 프라이머에 기초하는 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 검출 가능한 프로브
를 사용하는 방법.
제3항에 있어서, PCR 반응에 의해 합성되는 이중쇄 DNA에 결합하여 형광을 발하는 인터칼레이터를 사용하거나, 또는 PCR 신장 반응에 의해 형광을 발하도록 형광 색소에 의해 수식된 프로브를 사용하는 방법.
제4항에 있어서, PCR 반응에 의해 합성되는 이중쇄 DNA에 결합하여 형광을 발하는 인터칼레이터를 사용하거나, 또는 PCR 신장 반응에 의해 형광을 발하도록 형광 색소에 의해 수식된 프로브를 사용하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 염색체의 이수체를 검출하는 지표로서, 리얼타임 PCR로부터 얻어지는 형광 시그널의 증가를 사용하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 마커로서,
제1 염색체에 특이적인 서열 번호 1 및 2에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제2 염색체에 특이적인 서열 번호 3 및 4에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제3 염색체에 특이적인 서열 번호 5 및 6에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제4 염색체에 특이적인 서열 번호 7 및 8에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제5 염색체에 특이적인 서열 번호 9 및 10에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제6 염색체에 특이적인 서열 번호 11 및 12에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제7 염색체에 특이적인 서열 번호 13 및 14에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제8 염색체에 특이적인 서열 번호 15 및 16에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 및
제9 염색체에 특이적인 서열 번호 17 및 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍
으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 1종 이상 사용하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 마커로서,
제1 염색체에 특이적인 서열 번호 1 및 2에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제2 염색체에 특이적인 서열 번호 3 및 4에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제3 염색체에 특이적인 서열 번호 5 및 6에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제4 염색체에 특이적인 서열 번호 7 및 8에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제5 염색체에 특이적인 서열 번호 9 및 10에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제6 염색체에 특이적인 서열 번호 11 및 12에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제7 염색체에 특이적인 서열 번호 13 및 14에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제8 염색체에 특이적인 서열 번호 15 및 16에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 및
제9 염색체에 특이적인 서열 번호 17 및 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍
으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머 쌍의 1종 이상과, 서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는 프로브의 1종 이상
을 사용하는 방법.
제1 염색체에 특이적인 서열 번호 1 및 2에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제2 염색체에 특이적인 서열 번호 3 및 4에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제3 염색체에 특이적인 서열 번호 5 및 6에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제4 염색체에 특이적인 서열 번호 7 및 8에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제5 염색체에 특이적인 서열 번호 9 및 10에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제6 염색체에 특이적인 서열 번호 11 및 12에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제7 염색체에 특이적인 서열 번호 13 및 14에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제8 염색체에 특이적인 서열 번호 15 및 16에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 및
제9 염색체에 특이적인 서열 번호 17 및 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍
으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 적어도 1종 이상 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체 검출용 프라이머 세트.
제1 염색체에 특이적인 서열 번호 1 및 2에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제2 염색체에 특이적인 서열 번호 3 및 4에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제3 염색체에 특이적인 서열 번호 5 및 6에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제4 염색체에 특이적인 서열 번호 7 및 8에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제5 염색체에 특이적인 서열 번호 9 및 10에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제6 염색체에 특이적인 서열 번호 11 및 12에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제7 염색체에 특이적인 서열 번호 13 및 14에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍,
제8 염색체에 특이적인 서열 번호 15 및 16에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍, 및
제9 염색체에 특이적인 서열 번호 17 및 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 프라이머 쌍
으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머 쌍 중 적어도 1종 이상과,
서열 번호 19 내지 27에 나타내는 염기 서열을 갖는, 형광 색소에 의해 수식된 프로브 중 적어도 1종 이상
을 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 이수체 검출용 프라이머 및 프로브의 세트.
제1항 또는 제2항에 기재된 이수체의 검출 방법을 사용하여, 브라시카·올레라세아 식물의 계통마다 그의 각 염색체의 이수체 발생 빈도를 평가함으로써, 이수체 발생률이 적은 계통을 선발하는 공정을 포함하는, 브라시카·올레라세아 작물의 육종 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 이수체의 검출 방법을 사용하여, 브라시카·올레라세아 식물의 종자에 포함되는 이수체의 혼입률을 검정하는 것을 포함하는, 브라시카·올레라세아 종자의 품질 관리 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 이수체의 검출 방법을 사용하여, 브라시카·올레라세아 식물에 포함되는 이수체의 혼입률을 검정하는 것을 포함하는, 브라시카·올레라세아 식물의 품질 관리 방법.