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KR102801127B1 - Ccl21을 인코딩하는 재조합 랍도바이러스 - Google Patents

Ccl21을 인코딩하는 재조합 랍도바이러스 Download PDF

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KR102801127B1
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leu
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필립 뮐러
클라우스 에르브
파트릭 에를만
토비아스 놀덴
존 에드워드 파크
귀도 볼만
Original Assignee
베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
비라테라퓨틱스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 종양 용해성 바이러스 분야, 특히, CCL21 단백질을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스, 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 치료에서 재조합 바이러스의 용도, 및 또한 이러한 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

CCL21을 인코딩하는 재조합 랍도바이러스
본 발명은 종양 용해성 바이러스 분야, 특히, CCL21 단백질을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스 (rhabdovirus)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 치료에서 재조합 바이러스의 용도, 및 또한 이러한 랍도바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
종양 용해성 바이러스는, 암 세포에서 선택적으로 복제하여 암세포를 사멸시키고 종양 내에서 확산할 수 있는 새로운 종류의 생물제제이다. 종양 용해성 바이러스를 추가로 개선하여 치료 가능성을 높이려는 노력은 게놈 종양 항원 또는 면역 조절 이식 유전자를 인코딩하여 종양 치료 효능을 개선하는 소위 탑재 바이러스 (armed virus)의 개발로 이어졌다.
다수의 경우에서, 종양에는 T 세포가 부족하므로, "면역 사막" -- 면역계의 T 세포가 통제 불능으로 자라는 세포를 사멸시키기 위해 종양을 침투할 수 없거나 침투하지 못하는 종양 미세 환경 -- 으로 공지된 것이 존재한다. 종양은 면역 감시를 회피하기 위해 골수 유래 억제 세포를 동원하여 면역 억제성 미세 환경을 생성하거나, 세포외 기질 유전자의 발현을 유도하고 필요한 케모카인 및 사이토카인의 발현을 억제하여 종양 내로의 T 세포 침윤을 용이하게 하는 이중 역할을 하는 TGFβ를 비롯한 인자를 분비하는 것으로 가정되었다 (문헌 [Pickup M, Novitskiy S, Moses HL. The roles of TGFbeta in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer 2013;13:788-99]). 또한, 연구에 따르면, 면역 억제성 미세 환경에 상응하는 유전자의 높은 발현을 나타내는 종양이 난소암 및 대장암을 비롯한 여러 암 유형에 걸쳐 불량한 결과와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Calon A, Lonardo E, Berenguer-Llergo A, Espinet E, Hernando-Momblona X, Iglesias M, et al. Stromal gene expression defines poor-prognosis subtypes in colorectal cancer. Nat Genet 2015;47:320-9]; [Ryner L, Guan Y, Firestein R, Xiao Y, Choi Y, Rabe C, et al. Upregulation of periostin and reactive stroma is associated with primary chemoresistance and predicts clinical outcomes in epithelial ovarian cancer. Clin Cancer Res 2015;21:2941-51]; [Tothill RW, Tinker AV, George J, Brown R, Fox SB, Lade S, et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clin Cancer Res 2008;14:5198-208]).
최근 하나의 접근법은 카고 (cargo)로서 IFN-ß 단백질을 이의 개놈에 인코딩하는 종양 용해성 바이러스를 예견한다. 추가의 접근법에서, 종양 항원 MAGE-A3의 발현이 고려되었다. 적절하고 효과적인 카고를 확인하는 것에 추가하여, 바이러스 백본 유래 추가 카고의 발현은 항종양 효능 뿐만 아니라 항바이러스 면역도 강화할 위험이 항상 있다. 치료학적 카고의 발현에 의해 수득된 이점이 종양 용해 효능의 손실에 의해 무효화될 정도로, 카고가 바이러스의 종양 용해 가능성을 제한하지 않도록 주의해야 한다.
따라서, 종양의 효과적인 치료에 사용될 수 있는 추가로 개선된 탑재 종양 용해성 바이러스에 대한 당해 분야의 필요성이 존재한다. 면역 억제성 종양 미세 환경 내로의 T 세포 및/또는 수지상 세포 침윤을 선택적으로 개선하는 당해 분야의 필요성이 추가로 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스, 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스를 제공함으로써 상기 필요성을 다룬다.
구체적인 양태와 관련된 임의의 실시 형태는 또한 다중 단계 및 해당 구체적인 양태에 대한 여러 실시 형태를 포함하는 조합에서도 심지어 해당 특이적인 양태와 관련된 또 다른 실시 형태와 결합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제1 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스에 관한 것이다.
제1 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 (i) 플라스민 처리된 CCL21 단백질, (ii) c-말단 절단된 CCL21 단백질, (iii) 서열 번호 2를 포함하거나 서열 번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (iv) 서열 번호 3을 포함하거나 서열 번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (v) 서열 번호 4를 포함하거나 서열 번호 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질, (vii) 서열 번호 1을 포함하거나 서열 번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, 또는 (viii) 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 베시큘로바이러스 (vesiculovirus)이다.
제1 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 베시큘로바이러스는 수포성 구내염 알라고아스 바이러스 (vesicular stomatitis alagoas virus: VSAV), 카라자스 바이러스 (carajas virus: CJSV), 찬디푸라 바이러스 (chandipura virus: CHPV), 코칼 바이러스 (cocal virus: COCV), 수포성 구내염 인디애나 바이러스 (vesicular stomatitis Indiana virus: VSIV), 이스파한 바이러스 (isfahan virus: ISFV), 마라바 바이러스 (maraba virus: MARAV), 수포성 구내염 뉴저지 바이러스 (vesicular stomatitis New Jersey virus: VSNJV) 또는 피리 바이러스 (piry virus: PIRYV), 바람직하게는 수포성 구내염 인디애나 바이러스 (VSIV) 또는 바람직하게는 수포성 구내염 뉴저지 바이러스 (VSNJV)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 복제 능력이 있다.
제1 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 사람 CCL21이다.
제1 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 당단백질 G를 코딩하는 기능적 유전자가 결여되어 있고/있거나, 기능적 당단백질 G가 결여되어 있거나; 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 또 다른 바이러스의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 또 다른 바이러스의 당단백질 GP에 의해 대체되거나; 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 아레나바이러스 (arenavirus)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 아레나바이러스의 당단백질 GP에 의해 대체된다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 단데농 바이러스 (Dandenong virus) 또는 모페이아 바이러스 (Mopeia virus)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 단데농 바이러스 또는 모페이아 바이러스의 당단백질 GP에 의해 대체된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (lymphocyte choriomeningitis virus: LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체된다.
제1 양태와 관련된 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 (i) 플라스민 처리된 CCL21 단백질, (ii) c-말단 절단된 CCL21 단백질, (iii) 서열 번호 2를 포함하거나 서열 번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (iv) 서열 번호 3을 포함하거나 서열 번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (v) 서열 번호 4를 포함하거나 서열 번호 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질, (vii) 서열 번호 1을 포함하거나 서열 번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, 또는 (viii) 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스를 제공하며, 여기서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체된다.
제2 양태에서, 본 발명은 적어도 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스에 관한 것이다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 핵단백질 (N)은 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 인단백질 (P)은 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 기질 단백질 (M)은 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
제2 양태와 관련된 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵단백질 (N)은 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 인단백질 (P)은 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 기질 단백질 (M)은 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 복제 능력이 있다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 당단백질 G를 코딩하는 기능적 유전자가 결여되어 있고/있거나, 기능적 당단백질 G가 결여되어 있거나; 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 또 다른 바이러스의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 또 다른 바이러스의 당단백질 GP에 의해 대체되거나; 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체된다.
제2 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 (i) 플라스민 처리된 CCL21 단백질, (ii) c-말단 절단된 CCL21 단백질, (iii) 서열 번호 2를 포함하거나 서열 번호 2와 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (iv) 서열 번호 3을 포함하거나 서열 번호 3과 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (v) 서열 번호 4를 포함하거나 서열 번호 4와 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질, (vii) 서열 번호 1을 포함하거나 서열 번호 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, 또는 (viii) 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제2 양태와 관련된 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스를 제공하며, 여기서, 상기 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 (i) 플라스민 처리된 CCL21 단백질, (ii) c-말단 절단된 CCL21 단백질, (iii) 서열 번호 2를 포함하거나 서열 번호 2와 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (iv) 서열 번호 3을 포함하거나 서열 번호 3과 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (v) 서열 번호 4를 포함하거나 서열 번호 4와 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질, (vii) 서열 번호 1을 포함하거나 서열 번호 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 단백질, (viii) 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 상기 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체되고, 상기 핵단백질 (N)은 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 인단백질 (P)는 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 기질 단백질 (M)은 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 10과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
제3 양태에서, 본 발명은 상기 조성물이 제1 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 제2 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 제1 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 제2 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 제3 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물을 제공한다.
제4 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 암, 바람직하게는 고형암의 치료에 사용하기 위한 재조합 랍도바이러스, 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 고형암은 생식기 종양, 난소 종양, 췌장 종양, 고환 종양, 내분비 종양, 위장 종양, 간 종양, 신장 종양, 결장 종양, 대장 종양, 방광 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 흑색종, 호흡기 종양, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 종양, 두경부 편평 세포 암종 (head and neck squamous-cell carcinoma: HNSCC) 및 골 종양을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
제4 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스, 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 약제학적 조성물은 종양내로 또는 정맥내로 투여된다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스, 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 약제학적 조성물은 종양내로 및 후속적으로 정맥내로 적어도 1회 투여되어야 한다. 추가의 관련 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스, 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 약제학적 조성물의 후속적인 정맥내 투여는 초기 종양내 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일에 제공된다.
제5 양태에서, 본 발명은 제1 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 제2 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스 및 추가의 억제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 억제제는 PD-1 경로 억제제 또는 SMAC 모방체이다.
제5 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 PD-1 경로 억제제는 PD-1 또는 PD-L1에 대해 지시된 길항성 항체이다. 추가의 관련 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 1 내지 26 중 어느 하나 또는 이들 화합물 중 하나의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관련 실시 형태에서, 상기 PD-1 경로 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5 (표 1에 나타낸 바와 같음)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 길항제이다.
제6 양태에서, 본 발명은 제1 내지 제3 양태들 중 어느 하나 또는 이들의 실시 형태들 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 재조합 랍도바이러스, 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 약제학적 조성물, 및 제5 양태 관련된 실시 형태들 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 PD-1 경로 억제제 또는 SMAC 모방체를 포함하는 부품 키트 (kit of parts)를 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 a) 제1 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 제2 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스 또는 제3 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물, 및 b) PD-1 경로 억제제 또는 SMAC 모방체를 포함하는 조합 치료제를 제공한다. 제7 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, a) 및 b)는 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여될 수 있다. 한 관련 실시 형태에서, a) 및 b)는 상이한 투여 경로를 통해 투여된다. 추가의 관련 실시 형태에서, a)는 종양내로 투여되고, b)는 정맥내로 투여된다.
제7 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 PD-1 경로 억제제는 PD-1 또는 PD-L1에 대해 지시된 길항성 항체이다. 한 관련 실시 형태에서, 상기 PD-1 경로 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5 (표 1 참조)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 관련 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2에 따른 화합물 1 내지 26 중 어느 하나 또는 이들 화합물 중 하나의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
제8 양태에서, 본 발명은 상기 세포가 제1 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 제2 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스를 생산하는 것을 특징으로 하는 바이러스 생산 세포를 제공한다.
제8 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 바이러스 생산 세포는 Vero 세포, HEK 세포, HEK293 세포, 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell: CHO) 또는 새끼 햄스터 신장 (baby hamster kidney: BHK) 세포이다.
제9 양태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 세포 배양으로 재조합 랍도바이러스를 생산하는 방법을 제공한다:
(i) 숙주 세포를 재조합 랍도바이러스, 바람직하게는 수포성 구내염 바이러스로 감염시키는 단계,
(ii) 상기 재조합 랍도바이러스의 복제를 허용하는 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,
(iii) 상기 세포 배양으로부터 재조합 랍도바이러스를 수확하는 단계,
(iv) 임의로, 바이러스 수확물의 효소 처리, 바람직하게는 벤조나아제 처리,
(v) 양이온 교환 단일체 막 흡착제 또는 수지 상에 부하한 후 용출시킴으로써 랍도바이러스 수확물을 포획하는 단계,
(vi) 단계 (v)의 용출액을 크기 배제, 다중 모드 크기 배제/이온 교환 또는 접선 유동 여과에 적용함으로써 랍도바이러스를 연마하는 단계,
(vii) 한외 여과/정용 여과에 의한 연마된 랍도바이러스의 완충액 변화,
(viii) 랍도바이러스의 멸균 여과.
제9 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 HEK293 세포이다.
제9 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 숙주 세포는 현탁액 중에서 배양된다.
제9 양태와 관련된 하나의 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 약제학적 조성물로 제형화된다. 바람직한 실시 형태에서, 제1 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 제2 양태 또는 이의 실시 형태들 중 어느 하나에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스는 약제학적 조성물로 제형화된다.
추가의 양태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 RNA 게놈에 인코딩하며, 여기서, 상기 재조합 랍도바이러스의 RNA 게놈은 서열 번호 24와 동일하거나 서열 번호 24와 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
도 1: 표시된 유전자에 대해 대조군 또는 VSV-GP 처리된 마우스로부터 유래된 LLC1-IFNARKO 종양 (전체 RNA)의 발현 분석.
도 2a~2d: CT26.CL25-IFNARKO 종양 보유 마우스의 단일 종양 성장 곡선. (도 2a) 대조군 마우스 (모의 처리), (도 2b) 항-PD-1로 처리된 마우스, (도 2c) VSV-GP i.v.로 처리된 마우스, 또는 (도 2d) VSV-GP와 항-PD-1의 조합으로 처리된 마우스.
도 3a~3c: VSV-GP (도 2c 참조) 또는 VSV-GP와 항-PD1의 조합 (도 2d 참조)으로 사전 처리된 치료 마우스의 종양 (재)챌린지 (challenge) 분석. (도 3a) CT26.CL25-IFNARKO 종양 세포를 함유하는 나이브 (naive) 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 (재)챌린지의 경우, CT26Cl25 IFNAR-/- 세포를 (도 3b) 도 2c에 나타낸 바와 같은 실험으로부터 VSV-GP 처리된 장기간 무종양 마우스 (치료됨), 또는 (도 3c) 도 2d에 나타낸 바와 같은 실험으로부터 VSV-GP 및 항-PD-1 조합 처리된 장기간 무종양 마우스 (치료됨)에 주사하였다.
도 4: 표시된 케모카인에 대해 대조군 또는 VSV-GP 처리된 마우스로부터 유래된 LLC1-IFNARKO 종양 (전체 RNA)의 발현 분석.
도 5a 및 5b: (도 5a) VSV-GP 게놈 내의 CCL21 (이식 유전자) 삽입 부위를 예시하는 카툰. (도 5b) 바이러스 구제를 예시하는 카툰.
도 6: (A) VSV-GP-muCCL21 (전장 쥐과 동물 CCL21을 인코딩하는 VSV-GP)로 감염된 HEK293 세포의 상청액 중 쥐과 동물 CCL21의 분석. (B) 트랜스웰 (Transwell) 설정 및 재조합 쥐과 동물 CCL21, 또는 VSV-GP 및 VSV-GP-muCCL21 감염된 HEK293 세포의 상청액을 사용하는 쥐과 동물 T 세포 이동의 기능적 분석.
도 7a~7c: CT26.CL25-IFNARKO 종양 보유 마우스의 단일 종양 성장 분석. 종양 보유 마우스를 (도 7a) VSV-GP, (도 7b) SMACm (SMAC 모방체) 또는 (도 7c) SMACm (SMAC 모방체)과 조합된 VSV-GP로 처리하였다. 짙은 흑색 선은 미처리 대조군 마우스의 종양 체적을 나타내는 반면, 옅은 회색 선은 (도 7a) VSV-GP, (도 7b) SMACm 또는 (도 7c) VSV-GP + SMACm으로 처리된 마우스의 종양 체적을 나타낸다.
도 8a~8c: CT26.CL25-IFNARKO 종양 보유 마우스의 단일 종양 성장 분석. 종양 보유 마우스를 (도 8a) VSV-GP-CCL21, (도 8b) SMACm (SMAC 모방체) 또는 (도 8c) SMACm (SMAC 모방체)과 조합된 VSV-GP-CCL21로 처리하였다. 짙은 흑색 선은 미처리 대조군 마우스의 종양 체적을 나타내는 반면, 옅은 회색 선은 (도 8a) VSV-GP-CCL21, (도 8b) SMACm 또는 (도 8c) VSV-GP-CCL21 + SMACm으로 처리된 마우스의 종양 체적을 나타낸다.
도 9: 도 7a~7c 및 도 8a~8c에 도시된 실험의 생존 분석.
도 10: CD3엡실론, CXCL10, 및 VSV-GP-muCCL21에 의해 인코딩된 쥐과 동물 CCL21의 코돈 최적화된 서열에 대한 대조군, VSV-GP 또는 VSV-GPmuCCL21 처리된 마우스 유래의 LLC1-IFNARKO 종양 (전체 RNA)의 발현 분석.
도 11a 및 11b: VSV-G DsRed (신경독성 wt VSV), VSV-GP, VSV-GP-muCCL21 또는 PBS의 뇌내 주사에 의해 유도된 신경독성의 평가. 패널 (도 11a)는 각각의 주사 후 시간 경과에 따른 마우스의 체중 증가/감소 백분율을 도시한 것이다. 패널 (도 11b)는 각각의 주사 후 시간 경과에 따른 마우스의 생존율을 도시한 것이다.
도 12: (A) VSV-GP-huCCL21 (전장 사람 CCL21을 인코딩하는 VSV-GP)로 감염된 HEK293 세포의 상청액 중 사람 CCL21의 분석. (B) 트랜스웰 설정 및 재조합 사람 CCL21, 또는 VSV-GP 및 VSV-GP-huCCL21 감염된 HEK293 세포의 상청액을 사용하는 사람 T 세포 이동의 기능적 분석.
도 13a 및 13b: 종 교차 반응성을 테스트하기 위해 각각 트랜스웰 설정 및 재조합 마우스 대 사람 CCL21 또는 래트 대 사람 CCL21을 사용하는 마우스 (도 13a) 및 래트 (도 13b) T 세포 이동의 기능적 분석.
도 14: CT26.CL25-IFNARKO 종양 보유 대조군 마우스 또는 VSV-GP 또는 VSV-GP-huCCL21 처리된 마우스의 단일 종양 성장 분석.
도 15: 짧은 확산 가능한 n-말단 단편을 생성하기 위해 플라스민에 의한 CCL21 처리를 예시하는 카툰.
도 16: 트랜스웰 설정 및 재조합 사람 CCL21 (rec. CCL21) 또는 CCL21의 표시된 c-말단 절단된 버전을 발현하는 플라스미드 형질 감염된 HEK293 세포의 상청액을 사용하는 사람 T 세포 이동의 기능적 분석.
도 17: 트랜스웰 설정 및 재조합 사람 CCL21, 또는 VSV-GP, VSV-GP-huCCL21 또는 VSV-GP-huCCL21(1-79) 감염된 HEK293 세포의 상청액을 사용하는 사람 단핵구 유래 수지상 세포 (moDC) 이동의 기능적 분석.
도 18: CCL21의 표시된 c-말단 절단된 버전 및 전장 버전을 발현하는 플라스미드 형질 감염된 HEK293 세포의 상청액, 또는 VSV-GP, VSV-GP-huCCL21(1-79) 또는 VSV-GP-huCCL21 감염된 HEK293 세포의 상청액 중 CCL21의 웨스턴 블롯 (Western Blot: WB) 분석.
도 19a~19c: 표시된 세포의 상청액 중 VSV-GP (GP), VSV-GP-huCCL21 (21) or VSV-GP-huCCL21(1-79) (21k)의 바이러스 역가를 바이러스 감염 후 표시된 시점에서 측정하여 바이러스 복제 능력을 결정한다. 상이한 패널은 좌측에서 우측으로 (도 19a) Vero 세포, (도 19b) BHK21 세포 및 (도 19c) HEK293 세포를 나타낸다. 각 패널에서, VSV-GP (GP), VSV-GP-huCCL21 (21) 또는 VSV-GP-huCCL21(1-79) (21k) 역가를 0h, 24h 및 48h에서 측정하였다.
도 20: CT26.CL25-IFNARKO 종양 보유 대조군 마우스 또는 VSV-GP-huCCL21 또는 VSV-GP-huCCL21(1-79) 처리된 마우스의 누적 종양 성장.
도 21: 도 20의 마우스의 30일 생존율.
도 22: CT26.CL25-IFNARKO 종양 보유 대조군 마우스 또는 VSV-GP-huCCL21 또는 VSV-GP-huCCL21(1-79)로 처리된 마우스에서 T 세포 침윤 (생존 비괴사성 종양 분절)의 IHC 기반 정량화.
도 23: 바이러스 감염 종양의 면역 침윤에 대한 VSV-GP, VSV-GP-CCL21 (전장 CCL21) 및 VSV-GP-CCL21(1-79) (c-말단 절단된 CCL21)의 영향을 예시하는 카툰.
도 24: CT26.CL25 종양 보유 대조군 마우스 또는 VSV-GP 또는 VSV-GP-muCCL21로 처리된 마우스에서 수지상 세포 (CD11c 양성) 침윤 (활성 바이러스 복제를 갖는 종양 면적 = 괴사성 여백)의 IHC 기반 정량화.
하기 상세한 설명에서, 다수의 특정 세부 사항이 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 본 기술이 이러한 특정 세부 사항의 일부를 제외하고도 실시될 수 있다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 다른 예에서, 널리 공지된 구조 및 기술은 본 발명을 모호하게 하지 않도록 하기 위해 상세하게 도시되지 않았다. 표제는 단지 정독을 보조하기 위한 편의를 위해 포함되었으며, 본 발명을 구체적인 양태들 또는 실시 형태들로 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
랍도바이러스
랍도바이러스과는 대략 10~16 kb의 네거티브-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 18개 속 및 134개 종을 포함한다 (문헌 [Walke et al., ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae, Journal of General Virology, 99:447-448 (2018)]).
랍도바이러스과 구성원의 특징은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 기질층과 지질 외피로 둘러싸인 나선형 뉴클레오캡시드로 구성된 길이 100~430 nm 및 직경 45~100 nm의 탄환형 또는 간균형 입자 (여기서, 일부 랍도바이러스는 비-외피성 섬유상 바이러스이다). 대부분 분절되지 않는 10.8~16.1 kb의 네거티브-센스 단일 가닥 RNA. 구조 단백질 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M) 및 당단백질 (G)을 인코딩하는 적어도 5개의 유전자를 인코딩하는 게놈.
본 출원에서 사용되는 랍도바이러스는 알멘드라바이러스, 큐리오바이러스, 사이토랍도바이러스, 디코라바이러스, 에페메로바이러스, 하파바이러스, 레단테바이러스, 리사바이러스, 노비랍도바이러스, 뉴클레오랍도바이러스, 페랍도바이러스, 시그마바이러스, 스프리비바이러스, 스리푸바이러스, 티브로바이러스, 투파바이러스, 바리코사바이러스 또는 베시큘로바이러스의 속에 속한다.
본 출원에서 언급된 속 내의 랍도바이러스는 열거된 종 중 어느 하나에 속할 수 있다. 알멘드라바이러스 속으로는 아르보레툼 알멘드라바이러스, 발사 알멘드라바이러스, 쿠트 베이 알멘드라바이러스, 푸에르토 알멘드라스 알멘드라바이러스, 리오 치코 알멘드라바이러스가 포함되며; 큐리오바이러스 속으로는 큐리오노폴리스 큐리오바이러스, 이리리 큐리오바이러스, 이타카이우나스 큐리오바이러스, 로샹보 큐리오바이러스가 포함되며, 사이토랍도바이러스 속으로는 알팔파 드워프 사이토랍도바이러스, 보리 황색 줄무늬 모자이크 사이토랍도바이러스, 브로콜리 괴사성 황색 사이토랍도바이러스, 콜로카시아 보본 질병 관련 사이토랍도바이러스, 페스투카 잎 줄무늬 사이토랍도바이러스, 상추 괴사성 황색 사이토랍도바이러스, 상추 황색 반점 사이토랍도바이러스, 북부 시리얼 모자이크 사이토랍도바이러스, 손쿠스 사이토랍도바이러스 1, 스트로베리 크링클 사이토랍도바이러스, 밀 아메리칸 줄무늬 모자이크 사이토랍도바이러스가 포함되며; 디코라바이러스 속으로는 커피 원형 반점 디코라바이러스, 난초 반점 디코라바이러스가 포함되며; 에페메로바이러스 속으로는 애들레이드강 에페메로바이러스, 베리마 에페메로바이러스, 소 열병 에페메로바이러스, 킴벌리 에페메로바이러스, 쿨피냐 에페메로바이러스, 코톤칸 에페메로바이러스, 오보디앙 에페메로바이러스, 야타 에페메로바이러스가 포함되며; 하마파이러스 속으로는 플란더스 하파바이러스, 그레이 롯지 하파바이러스, 하트 파크 하파바이러스, 조인자카카 하파바이러스, 카메세 하파바이러스, 라 조야 하파바이러스, 란지아 하파바이러스, 매니토바 하파바이러스, 마르코 하파바이러스, 모스케이로 하파바이러스, 모수릴 하파바이러스, 응아잉안 하바파이러스, 오드강 하파바이러스, 패리 크릭 하파바이러스, 웡가벨 하파바이러스가 포함되며; 레단테바이러스 속으로는 Barur 레단테바이러스, 피키리니 레단테바이러스, 후쿠오카 레단테바이러스, 칸야와라 레단테바이러스, 컨 캐년 레단테바이러스, 큐랄리바 레단테바이러스, 콜렌테 레단테바이러스, 쿠마시 레단테바이러스, 르 단텍 레단테바이러스, 마운트 엘곤 박쥐 레단테바이러스, 니시무로 레단테바이러스, 은콜비손 레단테바이러스, 오이타 레단테바이러스, 우한 레단테바이러스, 융자 레단테바이러스가 포함되며; 리사바이러스의 속으로는 아라반 리사바이러스, 호주 박쥐 리사바이러스, 보켈로 박쥐 리사바이러스, 듀벤헤이즈 리사바이러스, 유럽 박쥐 1 리사바이러스, 유럽 박쥐 2 리사바이러스, 가노루와 박쥐 리사바이러스, 이코마 리사바이러스, 이르쿠트 리사바이러스, 후잔트 리사바이러스, 라고스 박쥐 리사바이러스, 레리다 박쥐 리사바이러스, 모콜라 리사바이러스, 광견병 리사바이러스, 시모니 박쥐 리사바이러스, 서부 코카서스 박쥐 리사바이러스가 포함되며; 노비랍도바이러의 속으로는 히라메 노비랍도바이러스, 피신 노비랍도바이러스, 살모니드 노비랍도바이러스, 스네이크헤드 노비랍도바이러스가 포함되며; 뉴클레오랍도바이러스의 속으로는 다투라 황색 잎맥 뉴클레오랍도바이러스, 가지 반점 난쟁이 뉴클레오랍도바이러스, 옥수수 미세 줄무늬 뉴클레오랍도바이러스, 옥수수 이란 모자이크 뉴클레오랍도바이러스, 옥수수 모자이크 뉴클레오랍도바이러스, 감자 황색 난장이 뉴클레오랍도바이러스, 쌀 황색 스턴트 뉴클레오랍도바이러스, 방가지똥속 황색 네트 뉴클레오랍도바이러스, 방가지똥 황색 잎맥 뉴클레오랍도바이러스, 토란 잎맥 백화 뉴클레오랍도바이러스가 포함되며; 페랍도바이러스의 속으로는 뱀장어 페랍도바이러스, 퍼치 페랍도바이러스, 바다 송어 페랍도바이러스가 포함되며; 드로소필라 아피니스 시그마바이러스, 로소필라 아나나쌔 시그마바이러스, 로소필라 이미그란스 시그마바이러스, 로소필라 멜라노가스터 시그마바이러스, 로소필라 옵스쿠라 시그마바이러스, 로소필라 트리스티스 시그마바이러스, 무시나 스타불란스 시그마바이러스가 포함되며; 스프리비바이러스의 속으로는 잉어 스프리비바이러스, 파이크 프라이 스프리비바이러스가 포함되며; 스리푸바이러스의 속으로는 알피와르 스리푸바이러스, 차코 스리푸바이러스, 니아카 스리푸바이러스, 세나 마두레이라 스리푸바이러스, 스리푸르 스리푸바이러스가 포함되며; 티브로바이러스의 속으로는 바콩고 티브로바이러스, 베아트리체 힐 티브로바이러스, 해안 평야 티브로바이러스, 엑포마 1 티브로바이러스, 엑포마 2 티브로바이러스, 스위트워터 브랜치 티브로바이러스, 티브로가간 티브로바이러스가 포함되며; 투파바이러스의 속으로는 더럼 투파바이러스, 클라매스 투파바이러스, 투파이아 투파바이러스가 포함되며; 바리코사바이러스의 속으로는 상추 큰 잎맥 관련 바리코사바이러스가 포함되며; 베시큘로바이러스의 속으로는 알라고아스 베시큘로바이러스, 아메리카 박쥐 베시큘로바이러스, 카라자스 베시큘로바이러스, 찬디푸라 베시큘로바이러스, 코칼 베시큘로바이러스, 인디애나 베시큘로바이러스, 이스파한 베시큘로바이러스, 주로나 베시큘로바이러스, 말파이스 스프링 베시큘로바이러스, 마라바 베시큘로바이러스, 모레톤 베시큘로바이러스, 뉴저지 베시큘로바이러스, 페리넷 베시큘로바이러스, 피리 베시큘로바이러스, 라디 베시큘로바이러스, 유그 보그단노박 베시큘로바이러스 또는 무사 바이러스가 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 종양 용해성 랍도바이러스이다. 이와 관련하여, 종양 용해성은 당해 분야에 공지된 규칙적인 의미를 가지며, 정상 세포가 아닌 암 세포를 (임의의 유의한 정도까지) 감염 및 용해 (분해)시키는 랍도바이러스의 능력을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 종양 용해성 랍도바이러스는 암 세포 내에서 복제할 수 있다. 종양 용해 활성은 통상의 기술자에게 공지된 다양한 검정 시스템에서 테스트될 수 있다 (예시적인 시험관내 검정은 문헌 [Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014]에 기재되어 있다). 종양 용해성 랍도바이러스는 특정 유형의 암 세포만을 감염 및 용해시킬 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 상기 종양 용해 효과는 암 세포의 종류에 따라 다를 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 랍도바이러스는 베시큘로바이러스 속에 속한다. 베시큘로바이러스 종은 주로 게놈의 계통 발생학적 분석과 결합된 혈청학적 수단에 의해 정의되었다. 숙주 범위 및 전달 메커니즘과 같은 생물학적 특성은 또한 속 내에서 바이러스 종을 구별하는데 사용된다. 이와 같이, 베시큘로바이러스 속은 완전한 L 서열로부터 추론된 최대 가능성 계통수 (Maximum Likelihood tree)에 의해 잘 뒷받침되는 뚜렷한 단일 계통 그룹을 형성한다.
베시큘로바이러스 속 내에서 다른 종에 할당된 바이러스는 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: A) L에서 20%의 최소 아미노산 서열 발산; B) N에서 10%의 최소 아미노산 서열 발산; C) G에서 15%의 최소 아미노산 서열 발산; D) 혈청학적 테스트에서 구별될 수 있음; E) 숙주 및/또는 절지 동물 벡터의 차이에 의해 입증되는 바와 같이 다른 생태학적 지위를 차지함.
수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus: VSV) 및 특히 VSV-GP (LCMV의 GP와의 재조합체)가 바람직하다. VSV-GP의 유리한 특성은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 매우 강력하고 신속한 살해자 (<8h); 종양 용해성 바이러스; 전신 적용 가능; 감소된 향신경성/신경독소; 용해적으로 번식하고 면역원성 세포 사멸을 유도함; 인터페론 (IFN) 반응으로 인해 건강한 사람 세포에서 복제되지 않음; 선천성 면역의 강력한 활성화; 면역 조절 카고 및 항원을 위한 약 3 kb 공간; 림프-융모-수막염 바이러스(LCMV) 유래의 아레나바이러스 당단백질과의 재조합체; 야생형 VSV (VSV-G)와 비교하여 감소된 신경독성 및 중화 항체 반응 및 보체 파괴에 대한 덜한 민감성 측면에서 유리한 안전성 특징; 항바이러스성 선천성 면역 반응 (예를 들어, I형 IFN 신호 전달)을 탑재하고 이에 반응하는 능력을 상실한 종양 세포에서 특이적으로 복제함; "건강한 세포"에서 복제가 중단되므로 정상 조직에서 신속하게 제외됨; 종양 세포에서의 바이러스 복제가 면역원성 세포 사멸의 유도, 종양 관련 항원의 방출, 국소 염증 및 항종양 면역의 유도를 초래함.
본 발명은 적어도 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스에 의해 추가로 구현된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하는 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하는 인단백질 (P), 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 9와 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하는 거대 단백질 (L), 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 10과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 동일한 기능적 변이체를 포함하는 기질 단백질 (M)을 적어도 이의 게놈에 인코딩한다.
수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M) 또는 당단백질 (G) 서열에 대한 변형이 이러한 단백질의 염기성 기능을 잃지 않고 이루어질 수 있다는 것은 통상의 기술자에 의해 이해된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 이러한 기능적 변이체는 이들의 염기성 기능 또는 활성의 전부 또는 일부를 보유한다. 예를 들어, 상기 단백질 L은 폴리머라아제이며, 바이러스의 전사 및 복제 동안 필수적인 기능을 한다. 이의 기능적 변이체는 이러한 능력의 적어도 일부를 보유해야 한다. 염기성 기능 또는 활성의 보유에 대한 좋은 암시는 여전히 종양 세포를 복제하고 감염시킬 수 있는 이러한 기능적 변이체를 비롯한 바이러스의 성공적인 생산이다. 바이러스 생산 및 종양 세포에서의 감염 및 복제에 대한 테스트는 통상의 기술자에게 공지된 다양한 검정 시스템에서 테스트될 수 있다 (예시적인 시험관내 검정은 문헌 [Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014]에 기재되어 있다).
바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 적어도 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하며, 여기서, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9의 ≥ 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 적어도 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하며, 여기서, 상기 핵단백질 (N)은 서열 번호 7의 ≥ 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스는 적어도 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하며, 여기서, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9의 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 핵단백질은 서열 번호 7의 ≥ 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스의 RNA 게놈은 서열 번호 24에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또한, 본 발명의 재조합 랍도바이러스의 RNA 게놈은 또한 이들 서열로 이루어지거나 이를 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 RNA 게놈의 핵산은 각각의 아미노산 서열의 변경을 초래하지 않으면서 유전 코드의 축퇴성에 따라 교환된다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스의 RNA 게놈은 서열 번호 24와 동일하거나 서열 번호 24와 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 코딩 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스는 이의 게놈에 추가의 카고, 예를 들어, 종양 항원, 추가의 케모카인, 사이토카인 또는 기타 면역 조절 요소를 인코딩할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 이의 게놈에 요오드화 나트륨 공동 수송체 단백질 (NIS)을 추가로 인코딩한다. NIS의 발현 및, 예를 들어, 125I와의 공동 인큐베이션은 NIS를 이미징 리포터로서 사용할 수 있도록 한다 (문헌 [Carlson et al., Current Gene Therapy, 12, 33-47, 2012]).
재조합 랍도바이러스
야생형 VSV 바이러스주와 같은 특정 야생형 랍도바이러스 바이러스주는 신경독성인 것으로 간주되는 것이 공지되어 있다. 감염된 개체는 주로 당단백질에 대해 지시된 높은 항체 역가로 강한 체액성 반응을 신속하게 일으킬 수 있는 것으로 또한 보고된다. 일반적으로 랍도바이러스 및 VSV의 당단백질 G를 표적화하는 중화 항체는 바이러스 확산을 제한할 수 있어 바이러스 재감염으로부터 개체의 보호를 매개할 수 있다. 그러나, 바이러스 중화는 암 환자에 대한 랍도바이러스의 반복 적용을 제한한다.
이러한 단점을 제거하기 위해, 상기 랍도바이러스 야생형 당단백질 G는 또 다른 바이러스의 당단백질로 대체될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 당단백질의 대체는 (i) 또 다른 바이러스의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의한 야생형 당단백질 G를 코딩하는 유전자의 대체 및/또는 (ii) 또 다른 바이러스의 당단백질 GP에 의한 야생형 당단백질 G의 대체를 지칭한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 랍도바이러스 당단백질 G는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP, 바람직하게는 WE-HPI 바이러스주로 대체된다. 보다 더 바람직한 실시 형태에서, 상기 랍도바이러스는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP, 바람직하게는 WE-HPI 바이러스주를 갖는 수포성 구내염 바이러스이다. 이러한 VSV는, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2010/040526에 기재되어 있으며, VSV-GP로 명명된다. 제공되는 이점은 (i) VSV-G 매개 신경독성의 손실 및 (ii) 항체에 의한 벡터 중화의 결여 (마우스에 도시된 바와 같음)이다.
상기 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP는 GP1 또는 GP2일 수 있다. 본 발명은 다양한 LCMV 바이러스주 유래의 당단백질을 포함한다. 특히, LCMV-GP는 LCMV 야생형 또는 LCMV 바이러스주 LCMV-WE, LCMV-WE-HPI, LCMV-WE-HPlopt로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 LCMV의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자는 서열 번호 11에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90, 95%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 반면, 서열 번호 11에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 당단백질 GP를 포함하는 재조합 랍도바이러스의 기능적 특성은 유지된다.
다른 실시 형태에서, 재조합 랍도바이러스 당단백질 G는 단데농 바이러스(DANDV) 또는 모페이아(MOPV) 바이러스의 당단백질 GP로 대체된다. 보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 수포성 구내염 바이러스이며, 여기서, 당단백질 G는 단데농 바이러스(DANDV) 또는 모페이아(MOPV) 바이러스의 당단백질 GP로 대체된다. 제공되는 이점은 (i) VSV-G 매개 신경독성의 손실 및 (ii) 항체에 의한 벡터 중화의 결여 (마우스에 도시된 바와 같음)이다.
상기 단데농 바이러스 (DANDV)는 옛날 아레나바이러스이다. 지금까지, 당단백질 GP를 포함하고 본 발명의 재조합 랍도바이러스에 포함된 당단백질 GP의 공여체로서 본 발명 내에서 사용될 수 있는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 단일 바이러스주만이 존재한다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스에 포함된 DANDV 당단백질 GP는 6개 초과의 글리코실화 부위, 특히, 7개의 글리코실화 부위를 갖는다. 예시적인 바람직한 당단백질 GP는 Genbank 번호 EU136038로 접근 가능한 DANDV에 포함된 것이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 DNADV의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자는 서열 번호 12에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 반면, 서열 번호 12에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 당단백질 GP를 포함하는 재조합 랍도바이러스의 기능적 특성은 유지된다.
모페이아 바이러스 (MOPV)는 옛날 아레나 바이러스이다. 당단백질 GP를 포함하고 본 발명의 재조합 랍도바이러스에 포함된 당단백질 GP의 공여체로서 본 발명 내에서 사용될 수 있는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 여러 바이러스주가 존재한다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스에 포함된 MOPV 당단백질 GP는 6개 초과의 글리코실화 부위, 특히, 7개의 글리코실화 부위를 갖는다. 예시적인 바람직한 당단백질 GP는 Genbank 번호 AY772170로 접근 가능한 모페이아 바이러스에 포함된 것이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 MOPV의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자는 서열 번호 13에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 반면, 서열 번호 13에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 당단백질 GP를 포함하는 재조합 랍도바이러스의 기능적 특성은 유지된다.
CCL21 및 CCL21의 기능적 변이체
놀랍게도, CCL21 단백질을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스는 종양 미세 환경에서 면역원성 세포 사멸 및 선천성 면역 세포의 자극과 조합된 종양 세포 용해를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 연장된 생존율이 CCL21로 무장된 이러한 재조합 랍도바이러스로 처리된 확립된 마우스 종양 모델에서 관찰되었다.
CCL21은 CC 케모카인 계열에 속하며, 2차 림프성 조직 케모카인 (secondary lymphoid-tissue chemokine: SLC), 엑소더스-2, ckb9, scya21, TCA4 또는 6Ckine으로도 또한 공지되어 있다. CCL21은 세포외 기질에 결합하는 C-말단 영역을 포함한다. CCL21은 또한 CCR7 세포 표면 수용체에 결합하여 T 세포 및 수지상 세포의 유인 뿐만 아니라 후자의 활성화와 같은 기능을 발휘한다. CCR7은 건강한 환자와 암 환자 모두에서 광범위한 말초 T 세포와 수지상 세포 상에서 발현된다.
따라서, 하나의 양태에서, 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스는 T-세포 및 수지상 세포의 종양 환경으로의 동원을 증진시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 매우 강력한 케모카인 CCL21의 국부 발현은 T 림프구 및 수지상 세포의 종양 미세 환경으로의 우선적인 면역 세포 동원 및 재조합 랍도바이러스의 개선된 효능을 추가로 증진시킨다.
더 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스는 선천성 면역 자극제로서의 역할을 한다.
하나의 양태에서, 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스는 저온 종양을 고온 종양으로 바꾼다. 특히, 생성된 전염증성 종양 미세환경은 비-T 세포 침윤 ("저온") 종양을 T 세포 염증 ("고온") 종양으로 바꾸며, 종양 배수 림프절에서 적응성 항종양 면역 반응의 생성을 동반한다.
사람 CCL21 단백질은, 예를 들어, 문헌 [M. Nagira et al, The Journal of Biological Chemistry, 272, 19518-19524 (August 1, 1997)]에 기재되어 있으며, 23개 아미노산의 추정 신호 펩타이드를 갖는 총 134개 아미노산의 고도 염기성 폴리펩타이드이다:
MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP (서열 번호 1).
특히, CCL21 단백질은 하기 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CCL21을 포함한다:
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP (서열 번호 2).
바람직하게는, CCL21 단백질은 하기 서열을 갖는 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다:
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCR (서열 번호 4)의 서열 또는
서열 번호 4와 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열.
보다 바람직하게는, CCL21 단백질은 하기 서열을 갖는 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다:
SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG (서열 번호 3)의 서열 또는
서열 번호 3과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열.
"신호 펩타이드" 또는 "신호 펩타이드 서열"이라는 용어는 일반적으로 10 내지 30개 아미노산 길이이고 폴리펩타이드를 세포의 세포막 (원핵 생물의 원형질막 및 진핵 생물의 소포체막)을 가로질러 또는 세포막 내로 지시하는 새로 합성된 분비 또는 막 폴리펩타이드의 N-말단에 존재하는 펩타이드 서열을 기술한다. 이것은 일반적으로 후속적으로 제거된다. 특히, 상기 신호 펩타이드는 폴리펩타이드를 세포의 분비 경로 내로 지시할 수 있다.
본 발명의 경우 다른 (즉, 야생형 이외의 다른) 신호 펩타이드 서열이 CCL21 단백질과 함께 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 다른 신호 펩타이드 서열은 원래의 야생형 신호 펩타이드 서열을 대체할 수 있다. 신호 펩타이드는 리보솜에서 새로 합성된 단백질을 ER로 및 추가로 원형질막으로 또는 세포 밖으로 수송하는 골지 복합체로 지시하는 펩타이드를 포함한다. 이들은 일반적으로 여러 개의 소수성 아미노산들을 포함하며, 면역글로불린 리더 서열 뿐만 아니라 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 서열을 포함한다. 신호 펩타이드는 특히 소포체의 시스테나 (cisternal) 면에 위치한 특정 프로테아제인 신호 펩티다아제에 의해 작용할 수 있는 펩타이드를 포함한다. 신호 펩타이드는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되며, 임의의 공지된 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 단백질의 N-말단에 통합되며, 신호 펩티다아제에 의한 CCL21 단백질의 처리는 활성 생물학적 형태를 생성한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 신호 펩타이드는 서열 번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 바람직한 관련 실시 형태에서, 상기 CCL21 단백질은 하기 서열을 갖는 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다:
MGWSCIILFLVATATGVHSSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG (서열 번호 5)의 서열 또는
서열 번호 5와 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열.
관련 실시 형태에서, CCL21 단백질은 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 또는 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 각각 갖는 아미노산을 포함하거나 이로 이루어지고 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 단백질을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 신호 펩타이드 서열은 서열 번호 5의 1~19번 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다.
CCL21 단백질은 또한 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 또는 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 각각 갖는 아미노산을 포함하거나 이로 이루어지고 서열 번호 1의 1~23번 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 단백질을 포함한다.
CCL21 단백질은 CCL21의 플라스민 처리된 형태에 상응하는 단백질을 추가로 포함한다. CCL21은 헤파린 유사 글리코사미노글리칸과 같은 세포외 기질 성분의 결합에 기여하는 순 양전하를 갖는 확장된 특유의 C-말단 (예를 들어, 사람 CCL21 약 30aa)을 포함한다. 상기 C-말단의 절단/결실은 헤파린과 같은 글리코사미노글리칸에 대한 결합을 극적으로 감소시킨다. CCL21은 일부 사람 암에 결함이 있는 플라스민에 의해 인체 내에서 처리된다. 플라스민 절단의 필요성은 CCL21의 플라스민 처리된 형태와 유사한 CCL21의 생체 활성, 즉, 생물학적 활성 N-말단 단편을 재조합 랍도바이러스 내에 인코딩함으로써 극복될 수 있는 것으로 나타났다. CCL21의 플라스민 처리된 형태는 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있는 헤파린 및/또는 헤파란 설페이트에 결합하는 능력을 감소시키는 상기 C-말단의 절단/결실을 특징으로 한다. 이러한 맥락에서, 헤파린 및/또는 헤파란 설페이트에 결합하는 능력의 감소는 동일한 조건하에 동일한 검정으로 테스트되는 경우 서열 번호 1 또는 2를 갖고 서열 번호 1 또는 2 (각각 신호 펩타이드 서열이 있거나 없음)에 나타낸 바와 같은 서열을 을 갖는 CCL21 단백질의 결합 능력의 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% 또는 그 이하로 감소되는 결합 능력을 갖는 CCL21 단백질과의 비교를 지칭한다.
플라스민은 피브린 혈전을 용해시키는 작용을 하는 세린 프로테아제이다. 섬유소 분해 이외에도, 플라스민은 다양한 다른 시스템에서 단백질을 단백질 가수분해한다: 이것은 보체 시스템의 일부 매개체인 콜라게나아제를 활성화시키고 그라프 난포의 벽을 약화시켜 배란을 유도한다. 이것은 피브린, 피브로넥틴, 트롬보스폰딘, 라미닌 및 폰 빌레브란트 인자를 절단한다. 플라스민은 세린 프로테아제 계열에 속한다. 플라스민은 간에서 전신 순환계로 플라스미노겐이라는 효소 전구체로서 방출된다. 플라스미노겐의 활성 플라스민으로의 전환은, 예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성 인자 (tPA), 유로키나아제 플라스미노겐 활성 인자 (uPA), 칼리크레인 및 인자 XII (하게만 인자)에 의한 Arg-561과 Val-562 사이의 펩타이드 결합 절단을 포함한다.
플라스민에 의한 CCL21 단백질의 절단은 세포 표면 결합 CCL21 상에서 또는 시험관 내에서 일어날 수 있으며, 어느 경우에서나 CCL21 단백질을 플라스민과 함께 인큐베이션함으로써 이루어진다. 따라서, 플라스민 처리된 CCL21 단백질은 서열 번호 2의 1~88번 아미노산에 상응하거나 서열 번호 2의 1~88번 아미노산과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CCL21을 포함한다. 또한, CCL21 단백질은 서열 번호 2의 1~91번 아미노산에 상응하거나 서열 번호 2의 1~91번 아미노산과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CCL21을 포함한다. CCL21 단백질은 또한 서열 번호 2의 1~104번 아미노산에 상응하거나 서열 번호 2의 1~104번 아미노산과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CCL21을 포함한다.
C-말단 절단된 CCL21 단백질은 CCL21 단백질의 확장된 c-말단에서 아미노산(들)의 결실 및/또는 돌연변이를 특징으로 한다. 확장된 c-말단에서 아미노산을 결실 및/또는 돌연변이시킴으로써, 헤파린과 같은 글리코사미노글리칸에 대한 결합이 감소된다. 바람직한 실시 형태에서, c-말단 절단된 CCL21 단백질은 서열 번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나, 서열 번호 2의 1~79번 아미노산과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가지며, 단, 상기 단백질은 80~111번 위치에 표시된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산 잔기(들)이 결여되거나, 여기서, 상기 잔기들 중 하나 이상이 돌연변이된다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, c-말단 절단 CCL21은 서열 번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 서열 번호 2의 1~79번 아미노산과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 CCL21이며, 여기서, 서열 번호 2의 80~111번의 모든 아미노산은 결실된다 (즉, 32개 결실).
각각의 경우에서, 플라스민 처리된 CCL21 또는 c-말단 절단된 CCL21은 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 서열 번호 1의 1~23번 아미노산 또는 서열 번호 5의 1~19번 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 신호 펩타이드 서열이 특히 바람직하다. 또한, 원래의 신호 펩타이드 서열을 대체하는 다른 신호 펩타이드 서열이 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시 형태에서, 플라스민 처리되거나 c-말단 절단된 CCL21 단백질은 하기 서열을 갖는 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다:
MGWSCIILFLVATATGVHSSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQG (서열 번호 5)의 서열 또는
서열 번호 5과 적어도 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열.
CCL21 단백질은 또한 절단된 신호 펩타이드 서열을 갖는 CCL21을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 절단됨은 원래의 신호 펩타이드 서열보다 짧지만 신호 펩타이드로서 역할을 하는 기능의 적어도 일부를 여전히 보유하는 신호 펩타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 상기 사람 신호 펩타이드 서열은 서열 번호 1의 1~23번 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 절단된 신호 펩타이드 서열을 갖는 CCL21은 서열 번호 1의 1~23번 아미노산 중 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개를 가질 수 있다. 추가의 예에서, 상기 신호 펩타이드는 서열 번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 절단된 신호 펩타이드 서열을 갖는 CCL21은 서열 번호 6의 1~18번 아미노산 중 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개를 가질 수 있다.
절단된 신호 펩타이드 서열을 갖는 CCL21 단백질은 또한 서열 번호 2~4의 서열들 중 임의의 서열 및 추가로 원래의 신호 펩타이드 서열 보다 짧은 신호 펩타이드 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 다시, 예로서, 신호 펩타이드 서열은 서열 번호 1의 1~23번 아미노산 중 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개를 가질 수 있거나, 추가의 예에서, 상기 신호 펩타이드는 서열 번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 절단된 신호 펩타이드 서열을 갖는 CCL21은 서열 번호 6의 1~18번 아미노산 중 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개를 가질 수 있다.
상기 CCL21 단백질은 마우스 및 래트를 비롯하여 임의의 기원일 수 있다. 바람직하게는, 상기 CCL21 단백질은 사람 기원이다.
CCL21 단백질의 기능적 변이체는 전술한 CCL21 단백질의 생물학적 활성 변이체 및 생물학적 활성 단편을 포함한다. 변이체는 구체적으로 기재된 CCL21 단백질의 위치에 하나 이상의 상이한 아미노산을 가질 수 있다. 변이체는 이러한 CCL21 단백질과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 공유할 수 있다. 단편은 주어진 구체적으로 기재된 CCL21 단백질과 동일한 아미노산을 갖지만 상기 CCL21 단백질의 특정 부분 또는 영역을 결여할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "동일한" 또는 "% 동일성"이라는 용어는, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 최대 대응을 위해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 지칭한다. % 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 갭을 도입할 수 있다). 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열들 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # (예를 들어, 중첩 위치) × 100). 일부 실시 형태에서, 비교되는 2개의 서열들은, 적절한 경우, 갭이 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다 (예를 들어, 비교되는 서열을 초과하여 연장되는 추가의 서열 제외).
2개의 서열들 사이의 % 동일성 또는 % 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예로는 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이 있으며, 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 관심 대상 단백질을 인코딩하는 핵산에 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 관심 대상 단백질과 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST는 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안으로, PSI-Blast를 사용하여 분자들 사이의 원연 관계 (Id.)를 탐지하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적인 예로는 문헌 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당해 분야에 공지되어 있으며, 문헌 [Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]; 및 [FASTA described in Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM을 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 민감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup = 2인 경우, 정렬된 잔기 쌍을 살펴봄으로써 비교되는 2개의 서열 내의 유사한 영역을 발견하며; ktup = 1인 경우, 단일 정렬된 아미노산을 검사한다. ktup은 단백질 서열에 대해 2 또는 1, DNA 서열에 대해 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup이 명시되지 않는 경우, 디폴트는 단백질에 대해 2, DNA에 대해 6이다. 대안으로, 문헌 [Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에서 기재된 바와 같은 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 단백질 서열 정렬을 수행할 수 있다.
두 경우 모두에서, 상기 기능적 변이체는 생물학적으로 활성인 CCL21의 변이체 및 단편만 포함한다. 본 발명의 경우, - 재조합 랍도바이러스의 게놈에 인코딩된 - CCL21 변이체 또는 CCL21 단편의 생물학적 활성은 각각의 세포 또는 종양 세포에서의 발현 후에 결정된다. 이는 상기 생물학적 활성이 (예를 들어, 트랜스웰 검정 또는 시험관내 종양 모델에서) CCL21 변이체 또는 CCL21 단편을 인코딩하는 재조합 랍도바이러스의 맥락에서 결정된다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 활성은 CCL21 변이체 또는 CCL21 단편을 인코딩하는 베시큘로바이러스에 의해 결정된다. 보다 바람직하게는, 상기 생물학적 활성은 CCL21 변이체 또는 CCL21 단편을 인코딩하는 VSV-GP에 의해 결정된다.
생물학적 활성은 다음 능력들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 화학 유인 활성, 항종양 활성, 사이토카인 발현의 조절, 예를 들어, CD8 양성 T 세포, CD4 양성 T 세포, 항원 제시 세포 및 종양 세포를 포함하는 유전적 동계 포유 동물 세포 집단에서 인터페론-감마 (IFN-감마) 폴리펩타이드의 발현 증가 또는 형질 전환 성장 인자- 베타 (transforming growth factor- beta: TGF- 베타) 폴리펩타이드의 발현 감소. 생물학적 활성에 대한 테스트는, 예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같은 프로토콜에 따라 제한 없이 수행될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, CCL21 단백질의 기능적 변이체 또는 단편은 동일한 조건하에 동일한 검정으로 테스트되는 경우 서열 번호 1 또는 2 (각각 신호 펩타이드 서열이 있거나 없음)에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 CCL21 단백질의 활성의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%를 나타낸다면 생물학적으로 활성이다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 VSV-GP에 의한 종양 세포의 처리 후 여러 케모카인 및 사이토카인이 이에 대응하여 상향 조절된다는 것을 밝혀냈다. CCL21은 VSV-GP 처리 후 종양 세포에서 상향 조절되지 않는 케모카인 중 하나이다. 본 데이터는 CCL21 단백질을 게놈에 코딩하는 VSV-GP가 암 치료에 특히 효과적이며 종양 용해성 바이러스에 의해 감염된 종양으로의 면역 세포 침윤을 추가로 개선하여 항종양 면역을 더욱 강화하는 방향으로 맞물려 있다는 것을 나타낸다.
더욱 놀랍게도, 서열 번호 3 또는 4 및 특히 서열 번호 5의 서열을 포함하거나 함유하는 CCL21 단백질을 인코딩하는 재조합 랍도바이러스는 전장 CCL21 단백질과 비교하여 종양 치료에서 훨씬 더 강력하고 보다 효과적이며 단백질 가수분해 처리의 필요성 없이도 활성이다.
이러한 CCL21 단백질은 보다 작은 크기로 인해 전장 CCL21 단백질 보다 더 바람직하다. 보다 크거나 여러 개의 이식 유전자는 이식 유전자 자체 뿐만 아니라 랍도바이러스의 생존력, 안정성, 종양 용해 능력, 제조 가능성 또는 발현에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 보다 작은 이식 유전자의 활용은 추가의 이식 유전자를 수용하는 능력에서 제한을 가질 수 있는 랍도바이러스에 추가의 이식 유전자를 추가할 가능성을 또한 제공한다.
랍도바이러스는 유전 물질 (게놈)으로서 네거티브 센스 단일 가닥 RNA (ssRNA)를 갖는다. 네거티브 센스 ssRNA 바이러스는 포지티브 센스 RNA를 형성하기 위해 RNA 폴리머라아제를 필요로 한다. 상기 포지티브 센스 RNA는 새로운 바이러스 물질 생산을 위한 단백질로 번역되는 바이러스 mRNA로서의 역할을 한다. 새로 형성된 바이러스로 인해, 보다 많은 네거티브 센스 RNA 분자가 생성된다.
전형적인 랍도바이러스 게놈은 3'-N-P-M-G-L-5'의 순서로 적어도 5개의 구조 단백질을 인코딩한다. 상기 게놈은 구조 단백질들 사이에 보다 짧은 유전자간 영역 또는 추가의 유전자를 포함할 수 있으므로 길이 및 구조에서 다를 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 CCL21 유전자는 랍도바이러스 게놈의 임의의 위치에 도입될 수 있다. 삽입 부위에 따라, 상기 CCL21 유전자의 전사 효율은 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 상기 CCL21 유전자의 전사 효율은 3' 삽입에서 5' 프라임 삽입으로 감소한다. 상기 CCL21 유전자는 다음 게놈 위치에 삽입될 수 있다: 3'-CCL21-N-P-M-G-L-5', 3'-N-CCL21-P-M-G-L-5', 3'-N-P-CCL21-M-G-L-5', 3'-N-P-M-CCL21-G-L-5', 3'-N-P-M-G-CCL21-L-5' 또는 3'-N-P-M-G-L-CCL21-5'. 바람직한 실시 형태에서, 상기 CCL21 유전자는 G 단백질과 L 단백질 사이에 삽입된다.
종양 세포의 감염 후, 상기 재조합 랍도바이러스의 게놈에 인코딩된 CCL21 유전자는 포지티브 센스 RNA로 전사된 다음 종양 세포에 의해 CCL21 단백질로 번역된다. "인코딩" 또는 "코딩"이라는 용어는 뉴클레오타이드 (예를 들어, RNA 분자) 또는 아미노산의 정의된 서열 및 이로 인한 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대 분자의 합성을 위한 주형의 역할을 하는 핵산에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 목적하는 단백질이 mRNA의 전사 및 후속 번역에 의해 세포 또는 또 다른 생물학적 시스템에서 생성되는 경우, 유전자는 단백질을 코딩한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일한 코딩 가닥 및 비-코딩 가닥 모두는 유전자의 전사를 위한 주형의 역할을 할 수 있으며, 당해 유전자의 단백질 또는 다른 산물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 핵산 및 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
상기 CCL21 유전자의 전사는 바람직하게는 자신의 프로모터의 제어하에 있지 않고 바이러스 복제에만 엄격하게 연결되어 바이러스 복제 및 확산 (종양)의 위치에 CCL21의 표적화된 발현을 보장한다. 따라서, 상기 CCL21 유전자의 전사는 프로모터 또는 유도성 유전자 발현 요소와 같은 추가의 요소에 의해 제어되지 않는다.
핵산 서열은 인코딩된 폴리펩타이드의 1차 서열을 변경하거나 변경하지 않고 달라질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 단백질을 인코딩하는 핵산은, 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 유전 코드의 축퇴성으로 인해 단백질의 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 핵산을 포함한다. CCL21 단백질 및 특히 본 출원에서 개시된 바와 같은 임의의 특정 CCL21 단백질의 발현을 초래할 핵산 서열을 선택하는 것은 통상의 기술자의 지식 범위 내에 있다. CCL21 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법으로는 올리고뉴클레오타이드 매개성 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 미리 제조된 CCL21 단백질의 카세트 돌연변이 유발에 의한 천연 공급원 또는 제제로부터의 단리가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
약제학적 조성물
실제 약제학적 유효량 또는 치료학적 투약량은 물론 환자의 연령 및 체중, 투여 경로 및 질환의 중증도와 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 요인들에 따라 달라질 것이다. 임의의 경우에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 약제학적 유효량이 환자의 특유의 병태에 기초하여 전달되도록 하는 투약량 및 방식으로 투여될 것이다.
일반적으로, 본 출원에서 언급된 질환, 장애 및 병태의 치료 및/또는 완화를 위해, 그리고 치료되는 구체적인 질환, 장애 또는 병태, 사용되는 본 발명의 구체적인 재조합 랍도바이러스의 효능, 구체적인 투여 경로 및 사용되는 구체적인 약제학적 제형 또는 조성물에 따라, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 일반적으로, 예를 들어, 주 2회, 매주 또는 매달 용량으로 투여될 것이지만, 특히, 이전에 언급된 파라미터에 따라 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 일부 경우에는 상기에서 주어진 최소 용량 미만으로 사용하는 것이 충분할 수 있는 반면, 다른 경우에는 상한을 초과해야 할 수 있다. 다량으로 투여될 때, 하루에 걸쳐 다수의 적은 용량으로 분할하는 것이 바람직할 수 있다.
요법에 사용하기 위해, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 동물 또는 사람에 대한 투여를 용이하게 하기에 적절한 약제학적 조성물로 제형화된다. 전형적인 제형은 상기 재조합 바이러스를 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 수용액 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태로 혼합하여 제조될 수 있다. 담체, 부형제, 조절제 또는 안정화제는 사용되는 투약량 및 농도에서 무독성이다. 이들로는 완충 시스템, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 무기산 또는 유기산 및 이들의 염; 산화 방지제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제, 예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 만노오스, 수크로오스, 트레할로오스, 덱스트린 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당 알코올, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 이온성 또는 비이온성 계면 활성제, 예를 들어, TWEEN™ (폴리소르베이트), PLURONICS™ 또는 지방산 에스테르, 지방산 에테르 또는 당 에스테르가 포함된다. 상기 부형제는 또한 방출 조절 또는 흡수 조절 기능을 가질 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 트리스, 아르기닌 및 임의로 시트레이트를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화된다. 트리스는 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 100 mM의 농도로 사용된다. 아르기닌은 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 100 mM의 농도로 사용된다. 시트레이트는 최대 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 바람직한 제형은 약 50 mM 트리스 및 50 mM 아르기닌을 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 액체, 냉동 액체 또는 감암 동결 건조 (lyophilized) 형태로 제공될 수 있다. 상기 냉동 액체는 약 0℃ 내지 약 -85℃의 온도, 예를 들어, -70℃ 내지 -85℃의 온도, 약 -15℃, -16℃, -17℃, -18℃, -19℃, -20℃, -21℃, -22℃, -23℃, -24℃ 또는 -25℃의 온도에서 보관될 수 있다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물은 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의로 제형화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 재조합 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 기타 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본 출원에서 기재된 바와 동일한 투약량 및 투여 경로로, 또는 본 출원에서 기재된 투약량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투약량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 때)의 적절한 투약량은 치료되는 질환의 유형, 재조합 랍도바이러스의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 재조합 랍도바이러스가 예방학적 또는 치료학적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 재조합 랍도바이러스에 대한 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 재조합 랍도바이러스의 TCID50에 의해 측정된 약 108 내지 1013개의 감염성 입자가, 예를 들어, 하나 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투약량일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 목적하는 질환 증상 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 재조합 랍도바이러스의 하나의 예시적인 투약량은 TCID50에 의해 측정된 약 108 내지 1013개의 감염성 입자의 범위일 것이다. 따라서, TCID50에 의해 측정된 약 108, 109, 1010, 1011, 1012 또는 1013개 (또는 이들의 임의의 조합)의 감염성 입자의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주 마다 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는, 예를 들어, 약 6회 용량의 재조합 랍도바이러스를 투여받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 초기 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량 또는 그 반대가 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기법 및 검정으로 용이하게 모니터된다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스 및 이를 포함하는 조성물의 효능은, 관련된 구체적인 질환에 따라 그 자체로 공지된 임의의 적합한 시험관내 검정, 세포 기반 검정, 생체내 검정 및/또는 동물 모델 또는 이의 조합을 사용하여 테스트될 수 있다. 적합한 분석 및 동물 모델은 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 하기 실시예에서 사용되는 검정 및 동물 모델을 포함한다.
실제 약제학적 유효량 또는 치료학적 투약량은 물론 환자의 연령 및 체중, 투여 경로 및 질환의 중증도와 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 요인들에 따라 달라질 것이다. 임의의 경우에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 약제학적 유효량이 환자의 특유의 병태에 기초하여 전달되도록 하는 투약량 및 방식으로 투여될 것이다.
대안으로, 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물은 치료되는 부위의 크기, 사용되는 바이러스 역가, 투여 경로 및 방법의 목적하는 효과에 따라 범위 내의 모든 수치를 포함한 약 50 μl 내지 약 100 ml의 부피로 전달될 수 있다.
종양내 투여의 경우, 상기 부피는 바람직하게는 약 50 μl 내지 약 5 ml, 예를 들어, 약 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 600 μl, 700 μl, 800 μl, 900 μl, 1000μl, 1100 μl, 1200 μl, 1300 μl, 1400 μl, 1500 μl, 1600 μl, 1700 μl, 1800 μl, 1900 μl, 2000 μl, 2500 μl, 3000 μl, 3500 μl, 4000 μl 또는 약 4500 μl의 부피이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 부피는 약 1000 μl이다.
예를 들어, 재조합 랍도바이러스의 주입에 의한 전신 투여의 경우, 상기 부피는 자연적으로 보다 높을 수 있다. 대안으로, 재조합 랍도바이러스의 농축 용액은 주입 직전에 보다 큰 부피의 주입 용액으로 희석될 수 있다.
특히 정맥내 투여의 경우, 상기 부피는 바람직하게는 1 ml 내지 100 ml, 예를 들어, 약 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 11 ml, 12 ml, 13 ml, 14 ml, 15 ml, 16 ml, 17 ml, 18 ml, 19 ml, 20 ml, 25 ml, 30 ml, 35 ml, 40 ml, 45 ml, 50 ml, 55 ml, 60 ml, 70 ml, 75 ml, 80 ml, 85 ml, 90 ml, 95 ml 또는 약 100 ml의 부피이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 부피는 약 5 ml 내지 15 ml이고, 보다 바람직하게는 부피는 약 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 11 ml, 12 ml, 13 ml 또는 약 14 ml이다.
바람직하게는, 동일한 제형이 종양내 투여 및 정맥내 투여에 사용된다. 종양내 투여와 정맥내 투여 사이의 용량 및/또는 부피 비율은 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 약 1:20일 수 있다. 예를 들어, 1:1의 용량 및/또는 부피 비율은 동일한 용량 및/또는 부피가 정맥내 뿐만 아니라 종양내로 투여된다는 것을 의미하는 반면, 예를 들어, 약 1:20의 용량 및/또는 부피 비율은 종양내 투여 용량 및/또는 부피 보다 20배 더 높은 정맥내 투여 용량 및/또는 부피를 의미한다. 바람직하게는, 종양내 투여와 정맥내 투여 사이의 용량 및/또는 부피 비율은 약 1:9이다.
재조합 랍도바이러스의 유효 농도는 바람직하게는 밀리리터 당 약 108 내지 1014개 벡터 게놈 (vg/mL)의 범위이다. 상기 감염 단위는 문헌 [McLaughlin et al., J Virol.;62(6):1963-73 (1988)]에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 농도는 약 1.5×109 내지 약 1.5×1013, 보다 바람직하게는 약 1.5×109 내지 약 1.5×1011이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1.5×109이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1.5×1010이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1.5×1011이다. 더 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1.5×1012이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1.5×1013이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1.5×1014이다. 바람직하지 않은 효과의 위험을 감소시키기 위해 가장 낮은 유효 농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 범위 내의 또 다른 투약량은 치료되는 대상체, 바람직하게는 사람의 신체 상태, 대상체의 연령, 암의 구체적인 유형 및 암이 진행성인 경우 발달한 정도를 고려하여 주치의에 의해 선택될 수 있다.
재조합 랍도바이러스의 유효 표적 농도는 TCID50으로 표현될 수 있다. TCID50은, 예를 들어 Spearman-Karber의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 범위는 1×108 / ml 내지 1×10 14 / ml TCID50의 유효 표적 농도를 포함한다. 바람직하게는 상기 유효 표적 농도는 약 1×109 내지 약 1×1012 / ml, 보다 바람직하게는 약 1×109 내지 약 1×1011 / ml이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 유효 표적 농도는 약 1×1010 / ml이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 유효 표적 농도는 5×1010 / ml이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 표적 농도는 약 1.5×1011 / ml이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 유효 표적 농도는 약 1×1012 / ml이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 표적 농도는 약 1.5×1013 / ml이다.
재조합 랍도바이러스의 유효 표적 용량은 또한 TCID50으로 표현될 수 있다. 바람직하게는, 범위는 1×108 내지 1×10 14 TCID50의 표적 용량을 포함한다. 바람직하게는 상기 표적 용량은 약 1×109 내지 약 1×1013, 보다 바람직하게는 약 1×109 내지 약 1×1012이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1×1010이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1×1011이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1×1012이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 유효 농도는 약 1×1013이다.
또 다른 양태에서, 본 출원에서 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 키트 또는 부품 키트가 제공된다. 상기 키트 또는 부품 키트는 용기 및 당해 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기들은 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물 자체 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하기에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균된 접속 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물이다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 선택되는 병태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다.
더욱이, 상기 키트 또는 부품 키트는 (a) 내부에 함유된 조성물을 갖는 제1 용기 (여기서, 상기 조성물은 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물을 포함한다); 및 (b) 내부에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기 (여기서, 상기 조성물은 PD-1 경로 억제제 또는 SMAC 모방체와 같은 추가의 세포독성제 또는 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시 형태에서의 키트 또는 부품 키트는 상기 조성물이 구체적인 병태, 특히, 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 상기 키트 또는 부품 키트는 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어, 정균 주사용수 (bacteriostatic water for injection: BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거액 또는 덱스트로오스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질들, 예를 들어, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 주사기, 주사기 펜, 마이크로 펌프 또는 다른 디바이스와 같은 재조합 랍도바이러스의 투여에 유용한 디바이스와 조합하여 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 부품 키트에 포함되며, 예를 들어, 재조합 랍도바이러스의 사용을 위한 설명서와 함께 패키지 삽입물도 또한 포함된다.
의학 용도
본 발명의 추가의 양태는 의약에서 사용하기 위한 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스를 제공한다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스는 종양 미세 환경에서 면역원성 세포 사멸 및 선천성 면역 세포의 자극과 조합된 종양 세포 용해를 효과적으로 유도한다. 따라서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
추가의 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 암을 앓고 있는 개체에게 치료학적 유효량의 재조합 랍도바이러스를 투여하여 암의 하나 이상의 증상을 개선하는 단계를 포함하는, 암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 재조합 랍도바이러스의 용도를 추가로 제공한다.
또 다른 추가의 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 치료학적 유효량의 재조합 랍도바이러스를 위장관암, 폐암 또는 두경부암을 앓고 있는 개체에게 투여하여 위장관암, 폐암 또는 두경부암의 하나 이상의 증상을 개선하는 단계를 포함하는, 위장관암, 폐암 또는 두경부암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 재조합 랍도바이러스의 적절한 투약량은 상기에서 정의된 바와 같은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 재조합 랍도바이러스가 예방학적 또는 치료학적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 재조합 랍도바이러스에 대한 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량과 같은 다양한 요인에 좌우될 것이다. 상기 재조합 랍도바이러스는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
하나의 양태에서, 상기 암은 고형암이다. 상기 고형암은 뇌암, 대장암, 구강인두 편평 세포 암종, 위암, 위식도 접합부 선암종, 식도 암종, 간세포 암종, 췌장 선암종, 담관 암종, 방광 요로 상피 암종, 전이성 흑색종, 전립선 암종, 유방 암종, 두경부 편평 세포 암종 (head and neck squamous-cell carcinoma: HNSCC), 교모세포종, 비소세포 폐암, 뇌 종양 또는 소세포 폐암일 수 있다. 위장관암, 폐암 및 두경부암의 치료가 바람직하다.
상기 재조합 랍도바이러스는 경구, 비경구, 피하, 종양내, 정맥내, 진피내, 복강내, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 상기 재조합 랍도바이러스는 펄스 주입에 의해 적절하게 투여된다. 하나의 양태에서, 상기 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 만성인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
본 발명의 구체적인 재조합 랍도바이러스 및 이의 구체적인 약동학적 및 다른 특성에 따라, 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다, 5일 마다 또는 6일 마다, 매주, 매달 등으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 장기의 주간 치료를 포함할 수 있다. "장기"란, 적어도 2주, 바람직하게는 수개월 또는 수년간의 지속을 의미한다.
치료 계획은 다양한 요법을 포함할 수 있으며, 전형적으로는 1, 2, 3 또는 4주의 기간에 걸쳐 환자에게 투여되는 다중 용량에 이어서 임의로 1회 이상의 추가 라운드의 치료를 필요로 할 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 주어진 기간 내에 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 용량으로 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 제1 라운드의 치료(들)는 3주 이내에 종료된다. 3주 치료 과정 동안, 상기 재조합 랍도바이러스는 다음 계획에서 기재된 바와 같이 환자에게 투여될 수 있다: (i) 0 일차; (ii) 0 일차 및 3 일차; (iii) 0 일차, 3 일차 및 6 일차; (iv) 0 일차, 3 일차, 6 일차 및 9 일차; (v) 0 일차 및 5 일차; (vi) 0 일차, 5 일차 및 10 일차; (vii) 0 일차, 5 일차, 10 일차 및 15 일차에 1회. 이러한 요법은 반복될 수 있으며, 제2 또는 제3 라운드의 치료가 제1 라운드의 치료 결과에 따라 필요할 수 있다. 제1 라운드의 치료에 기초하여 계산하면, 제2 라운드의 치료는 바람직하게는 21 일차, 42 일차 및 63 일차에 추가의 치료를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 다음 계획에 따라 환자에게 투여된다: 0 일차, 3 일차, 21 일차, 42 일차 및 63 일차.
"억제"라는 용어는 "개선" 및 "완화"와 동일한 맥락에서 질환의 하나 이상의 특징을 감소 또는 경감시키는 것을 의미하는데 본 출원에서 사용된다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투여 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 할 요인으로는 치료 중인 구체적인 장애, 치료 중인 구체적인 포유 동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 진료 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여되는 재조합 랍도바이러스의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 통제될 것이며, 암의 임상 증상을 예방, 개선 또는 치료하는데 필요한 최소량, 특히, 이러한 장애들에 효과적인 최소량이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 복수 회 및 여러 용량으로 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 재조합 랍도바이러스의 제1 용량은 종양내로 투여되고, 상기 재조합 랍도바이러스의 후속 용량은 정맥내로 투여된다. 추가의 양태에서, 상기 재조합 랍도바이러스의 제1 용량 및 적어도 1회 이상의 다음 용량은 종양내로 투여되고, 상기 재조합 랍도바이러스의 후속 용량은 정맥내로 투여된다. 상기 후속 용량은 초기 종양내 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 재조합 랍도바이러스의 제1 용량은 정맥내로 투여되고, 상기 재조합 랍도바이러스의 후속 용량은 종양내로 투여된다. 상기 후속 용량은 초기 정맥내 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 정맥내로 투여되고, 상기 재조합 랍도바이러스의 후속 용량은 종양내로 투여된다.
또 다른 양태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 각 시점에서 정맥내 및 종양내로 투여된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 암 세포에 대한 면역 반응을 자극하는데 많은 유용성을 갖는다. 강력한 면역 활성화 가능성은 종양 미세 환경에 제한되는 것으로 관찰되었다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 환자에게 전신적으로 투여될 수 있다. 많은 암이 고도로 전이되기 때문에, 전신 적용 가능성은 중요한 속성이며, 이것은 접근하기 어려울 뿐만 아니라 접근 불가능한 종양 병변의 치료를 가능하게 할 것이다. 이러한 특유의 면역 자극 특성으로 인해, 본 발명에 따른 재조합 랍도바이러스는 전이성 종양의 치료에 특히 유용하다.
일부 환자는 체크포인트 억제제 요법에 내성이 발생하며, 이러한 환자는 IFN 경로에 돌연변이를 축적하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스, 특히, 본 발명의 재조합 수포성 구내염 바이러스는 체크포인트 억제제 요법에 대한 내성이 발생한 환자의 치료에 유용하다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스, 특히, 재조합 수포성 구내염 바이러스의 특유의 면역 촉진 특성으로 인해, 이러한 치료된 환자는 체크포인트 억제제 요법의 지속에 적격이 될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스, 특히, 본 발명의 재조합 수포성 구내염 바이러스는 PD-1 또는 PD-L1 억제제, 예를 들어, PD-1 또는 PD-L1에 대한 길항성 항체에 의한 체크포인트 억제제 요법을 완료한 비소세포성 폐암 환자의 치료에 유용하다.
임의의 상기 약제학적 제형 또는 치료 방법은 본 발명의 재조합 랍도바이러스 또는 약제학적 조성물 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
조합
본 발명은 또한 현재 사용되고/되거나 종래 기술에서 공지된 치료/방법과 비교하여 특정 이점을 제공하는 조합 치료/방법을 제공한다. 이들 장점은 생체내 효능 (예를 들어, 임상 반응의 개선, 반응의 연장, 반응 속도, 반응 지속 기간, 질환 안정화 속도, 안정화 지속 기간, 질환 진행까지의 시간, 무진행 생존율 (progression free survival: PFS) 및/또는 전체 생존율 (overall survival: OS)의 증가, 내성의 늦은 발생 등), 안전하고 내약성을 갖는 투여 및 유해 사례의 빈도 및 중증도의 감소를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스는 다른 약리학적 활성 성분, 예를 들어, 최신 또는 표준 치료 화합물, 예를 들어, 세포 증식 억제 또는 세포 독성 물질, 세포 증식 억제제, 항혈관 형성 물질, 스테로이드, 면역 조절제/체크포인트 억제제 등과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스와 조합하여 투여될 수 있는 세포 증식 억제 및/또는 세포 독성 활성 물질로는 호르몬, 호르몬 유사체 및 항호르몬, 아로마타아제 억제제, LHRH 항진제 및 길항제, 성장 인자 (예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 (platelet derived growth factor: PDGF), 섬유아세포 성장 인자 (fibroblast growth factor: FGF), 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor: VEGF), 상피 성장 인자 (epidermal growth factor: EGF), 인슐린 유사 성장 인자 (insuline-like growth factor: IGF), 사람 상피 성장 인자 (human epidermal growth factor: HER, 예를 들어, HER2, HER3, HER4) 및 간 세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor: HGF)와 같은 성장 인자)의 억제제가 포함되지만 이들에 한정되지 않으며, 억제제는, 예를 들어, (항)성장 인자 항체, (항)성장 인자 수용체 항체 및 타이로신 키나아제 억제제, 예를 들어, 세툭시맙, 제피티닙, 아파티닙, 닌테다닙, 이마티닙, 라파티닙, 보수티닙 및 트라스투주맙; 항대사 물질 (예를 들어, 항폴린산제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 랄티트렉세드, 피리미딘 유사체, 예를 들어, 5-플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 이리노테칸, 독소루비신, TAS-102, 카페시타빈 및 젬시타빈, 퓨린 및 아데노신 유사체, 예를 들어, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 클라드리빈 및 펜토스타틴, 사이타라빈 (ara C), 플루다라빈); 항종양 항생제 (예를 들어, 안트라사이클린); 백금 유도체 (예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴); 알킬화제 (예를 들어, 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 다카바진, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 테모졸로마이드, 니트로소우레아, 예를 들어, 카르무스틴 및 로무스틴, 티오테파); 항유사 분열제 (예를 들어, 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈 및 빈크리스틴; 및 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀); 혈관형성 억제제, 예를 들어, 베바시주맙, 라무시루맙 및 아플리베르셉트, 튜블린 억제제; DNA 합성 억제제, PARP 억제제, 토포아이소머라아제 억제제 (예를 들어, 에피포도필로톡신, 예를 들어, 에토포사이드 및 에토포포스, 테니포사이드, 암사크린, 토포테칸, 이리노테칸, 미톡산트론), 세린/트레오닌 키나아제 억제제 (예를 들어, PDK1 억제제, Raf 억제제, A-Raf 억제제, B-Raf 억제제, C-Raf 억제제, mTOR 억제제, mTORC1/2 억제제, PI3K 억제제, PI3Kα 억제제, 이중 mTOR/PI3K 억제제, STK33 억제제, AKT 억제제, PLK1 억제제 (예를 들어, 볼라세르팁), CDK 억제제, 예를 들어, CDK9 억제제, 오로라 키나아제 억제제), 타이로신 키나아제 억제제 (예를 들어, PTK2/FAK 억제제), 단백질 단백질 상호 작용 억제제, MEK 억제제, ERK 억제제, FLT3 억제제, BRD4 억제제, IGF-1R 억제제, Bcl-xL 억제제, Bcl-2 억제제, Bcl-2/Bcl-xL 억제제, ErbB 수용체 억제제, BCR-ABL 억제제, ABL 억제제, Src 억제제, 라파마이신 유사체 (예를 들어, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 시롤리무스), 안드로겐 합성 억제제, 안드로겐 수용체 억제제, DNMT 억제제, HDAC 억제제, ANG1/2 억제제, CYP17 억제제, 방사성 의약품, 면역 치료제, 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, CTLA4, PD1, PD-L1, LAG3 및 TIM3 결합 분자/면역글로불린, 예를 들어, 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙) 및 다양한 화학 치료제, 예를 들어, 아미포스틴, 아나그렐리드, 클로드로나트, 필그라스틴, 인테페론, 인터페론 알파, 류코보린, 리툭시맙, 프로카바진, 레바미솔, 메스나, 미토테인, 파미드로네이트 및 포르피머; 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조밉); Smac 및 BH3 모방체; p53 기능 복원제, 예를 들어, mdm2-p53 길항제; Wnt/베타-카테닌 신호 전달 경로 억제제; 및/또는 사이클린 의존적 키나아제 9 억제제이다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스는 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제와의 조합 치료에 사용될 수 있다. 이러한 조합 치료는 물질들의 비고정 (예를 들어, 유리) 조합으로서 또는 키트 오브 파츠 (kit-of-parts)를 비롯한 고정 조합의 형태로서 제공될 수 있다.
이러한 맥락에서, 본 발명의 의미내의 "조합" 또는 "조합된"은 1종 초과의 활성제의 혼합 또는 조합으로 생성되는 생성물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 고정 및 비고정 (예를 들어, 유리) 조합 (키트 포함)과, 예를 들어, 구성요소 또는 활성제의 동시적 (simultaneous), 동시적 (concurrent), 순차적, 연속적, 교대적 또는 개별적 사용과 같은 사용 둘 다를 포함한다. "고정 조합"이라는 용어는, 활성제 둘 다가 단일 단위 (entity) 또는 투약량의 형태로 환자에게 동시에 (simultaneously) 투여된다는 것을 의미한다. "비고정 조합"이라는 용어는, 활성제 둘 다가 어떠한 특정 시간 제한도 없이 동시에 (simultaneously), 동시에 (concurrently) 또는 순차적으로 개별 단위로서 환자에게 투여된다는 것을 의미하며, 여기서, 이러한 투여는 환자의 체내에서 2종의 화합물의 치료학적 유효 수준을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어, 3종 이상의 활성제의 투여에 적용된다.
본 발명은 본 출원에서 기재된 바와 같은 암의 치료, 바람직하게는 고형암의 치료에 사용하기 위한 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제와 조합된 재조합 랍도바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한 본 출원에서 기재된 바와 같은 암의 치료 및/또는 예방, 바람직하게는 고형암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제와 조합된 재조합 랍도바이러스의 용도를 제공한다.
본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 재조합 랍도바이러스 및 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제를 암으로 고통받는 개체에게 투여하여 암의 하나 이상의 증상을 개선하는 단계를 포함하는, 암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스 및 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제는 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여될 수 있다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스 및 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제는 동일한 투여 경로에 의해 또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제는 정맥내로 투여되며, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 종양내로 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제는 정맥내로 투여되며, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 종양내로 적어도 1회 투여되고, 상기 재조합 랍도바이러스의 후속 용량은 정맥내로 투여된다. 상기 후속 용량은 초기 종양내 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일에 투여될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제는 초기 종양내 투여 후 21일에 투여된다.
하기와 조합된 본 발명의 재조합 랍도바이러스에 의한 치료가 특히 바람직하다:
(i) SMAC 모방체 (SMACm) / IAP 길항제,
(ii) 면역 치료제, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2017/198741에 개시된 바와 같은 항-PD-1 및 항-PD-L1 작용제 및 항 LAG3 작용제, 예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙 및 항체.
본 출원에서 제공된 바와 같은 조합은 (i) 본 발명의 재조합 랍도바이러스와 (iia) PD-1 경로 억제제, 바람직하게는 PD-1 또는 PD-L1에 대해 지시되는 길항성 항체 또는 (iib) SMACm / IAP 길항제를 포함한다. 본 출원에서 기재된 바와 같은 암의 치료를 위한 (i)과 (iia), 또는 (i)과 (iib)를 포함하는 이러한 조합물의 용도가 추가로 제공된다.
또 다른 양태에서, (i) 본 발명의 재조합 랍도바이러스와 (iia) PD-1 경로 억제제 또는 (iib) SMACm / IAP 길항제의 사용을 포함하는 조합 치료가 제공된다. 이러한 조합 치료에서, 본 발명의 재조합 랍도바이러스는 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여될 수 있다.
예를 들어, 동시적 (concurrent) 투여는 활성제를 동일한 일반적인 기간내에, 예를 들어, 동일자(들)에 투여하는 것을 포함하지만, 반드시 동시에는 아니다. 교대적 투여는, 특정 기간 동안, 예를 들어, 수일 또는 일주일 동안 하나의 제제를 투여한 후, 후속 기간 동안, 예를 들어, 수일 또는 일주일 동안 나머지 제제를 투여하고, 이어서 1회 이상의 주기 동안 상기 패턴을 반복하는 것을 포함한다. 순차적 또는 연속적 투여는, 1회 이상의 용량을 사용하여 제1 기간 동안 (예를 들어, 수일 또는 일주일 동안) 하나의 제제를 투여한 후, 1회 이상의 용량을 사용하여 제2 기간 동안 (예를 들어, 수일 또는 일주일 동안) 나머지 제제를 투여하는 것을 포함한다. 반드시 규칙적인 순서에 따르지 않고 치료 기간 동안 상이한 날에 활성제를 투여하는 것을 포함하는 중복 스케줄도 또한 사용할 수 있다. 이러한 일반적인 지침에 대한 변형도 또한, 예를 들어, 사용되는 제제 및 대상체의 병태에 따라 사용할 수 있다.
순차적인 치료 계획은 본 발명의 재조합 랍도바이러스의 투여에 이어서 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제의 투여를 포함한다. 순차적인 치료 계획은 또한 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제의 투여에 이어서 본 발명의 재조합 랍도바이러스의 투여를 포함한다. 순차적 치료 계획은 서로 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일에 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 의미 내의 PD-1 경로 억제제 및 이의 모든 실시 형태는 PD-1과 이의 수용체(들)의 상호 작용을 억제하는 화합물이다. PD-1 경로 억제제는 바람직하게는 PD-1 수용체에 의해 매개되는 PD-1 경로 신호 전달을 손상시킬 수 있다. 상기 PD-1 억제제는 PD-1 경로 신호 전달을 길항할 수 있는 PD-1 경로의 임의의 구성원에 대해 지시된 임의의 억제제일 수 있다. 상기 억제제는 바람직하게는 PD-1 수용체, PD-L1 또는 PD-L2에 대해 지시되는 PD-1 경로의 임의의 구성원을 표적화하는 길항성 항체일 수 있다. 또한, 상기 PD-1 경로 억제제는 PD-1 리간드의 활성을 차단하는 PD-1 수용체 또는 PD-1 수용체의 단편일 수 있다.
PD-1 길항제는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151] (본 출원에 참조로 포함됨)에서 검토된다. 리 등 (Li et al.)의 문헌에서 개시된 것들 뿐만 아니라 본 출원에서 하기에 개시되는 추가의 항체들과 같은 임의의 PD-1 길항제, 특히, 항체를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 PD-1 길항제 및 이의 모든 실시 형태는 하기 항체들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
● 펨브롤리주맙 (항-PD-1 항체);
● 니볼루맙 (항-PD-1 항체);
● 피딜리주맙 (항-PD-1 항체);
● PDR-001 (항-PD-1 항체);
● 본 출원에서 하기에 기재된 바와 같은 PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5 (항-PD-1 항체).
● 아테졸리주맙 (항-PD-L1 항체);
● 아벨루맙 (항-PD-L1 항체);
● 더발루맙 (항-PD-L1 항체);
예를 들어, 문헌 [Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44]에 개시된 펨브롤리주맙 (예전에 람브롤리주맙으로도 또한 공지됨; 상표명 Keytruda; MK-3475로도 또한 공지됨)은, PD-1에 결합하는 사람화 IgG4 단클론 항체이며; 이것은 Fc-매개된 세포독성을 예방하도록 설계된 C228P에서의 돌연변이를 포함한다. 펨브롤리주맙은, 예를 들어, 미국 특허 US 8,354,509 및 국제공개공보 WO 2009/114335에 개시되어 있다. 이것은 절제 불가능 흑색종 또는 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자 및 전이성 NSCLC 환자의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다.
니볼루맙 (CAS 등록 번호: 946414-94-4; BMS-936558 또는 MDX1106b)은 검출 가능한 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular toxicity: ADCC)이 결여된, PD-1을 특이적으로 차단하는 완전한 사람 IgG4 단클론 항체이다. 니볼루맙은, 예를 들어, 미국 특허 US 8,008,449 및 국제공개공보 WO 2006/121168에 개시되어 있다. 이것은 절제 불가능 흑색종, 전이성 흑색종, 전이성 NSCLC 및 진행성 신세포 암종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다.
피딜리주맙 (CT-011; Cure Tech)은 PD-1에 결합하는 사람화 IgG1k 단클론 항체이다. 피딜리주맙은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2009/101611에 개시되어 있다.
PDR-001 또는 PDR001은 PD-1에 대한 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 차단하는 높은 친화성의 리간드 차단성 사람화 항-PD-1 IgG4 항체이다. PDR-001은 국제공개공보 WO 2015/112900 및 WO 2017/019896에 개시되어 있다.
항체 PD1-1 내지 PD1-5은 하기 표 1에 도시된 바와 같은 서열에 의해 정의된 항체 분자이며, 여기서, HC는 (전체 길이) 중쇄를 나타내고, LC는 (전체 길이) 경쇄를 나타낸다:
Figure 112021098441946-pct00001
Figure 112021098441946-pct00002
구체적으로, 본 출원에서 상기에 기재된 항-PD-1 항체 분자는 하기를 갖는다:
(PD1-1:) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(PD1-2:) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(PD1-3:) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(PD1-4:) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(PD1-5:) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
아테졸리주맙 (Tecentriq, MPDL3280A로도 또한 공지됨)은 PD-L1을 표적화하는 파지-유래된 사람 IgG1k 단클론 항체이며, 예를 들어, 문헌 [Deng et al. mAbs 2016;8:593-603]에 기재되어 있다. 이것은 요로상피 암종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다.
아벨루맙은 완전한 사람 항-PD-L1 IgG1 단클론 항체이며, 예를 들어, 문헌 [Boyerinas et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1148-1157]에 기재되어 있다.
더발루맙 (MEDI4736)은 PD-L1에 대해 높은 특이성을 갖는 사람 IgG1k 단클론 항체이며, 예를 들어, 문헌 [Stewart et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1052-1062] 또는 [Ibrahim et al. Semin. Oncol. 2015;42:474-483]에 기재되어 있다.
리 등의 문헌 (상동)에 개시되거나 임상 시험 중인 것으로 알려진 추가의 PD-1 길항제, 예를 들어, AMP-224, MEDI0680 (AMP-514), REGN2810, BMS-936559, JS001-PD-1, SHR-1210, BMS-936559, TSR-042, JNJ-63723283, MEDI4736, MPDL3280A 및 MSB0010718C를 상기에서 언급된 길항제에 대한 대체물로서 또는 이에 추가하여 사용할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 INN은 또한 미국의 42 USC §262 세부항목 (k) 및 다른 관할지역의 해당 규정에 따라 허가된 바이오시밀러 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 오리지네이터 (originator) 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 모든 바이오시밀러 항체를 포괄하는 것을 의미한다.
상기에서 열거된 PD-1 길항제는 이들의 각각 제조, 치료 용도 및 특성과 함께 당해 분야에 공지되어 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 펨브롤리주맙이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 상기 길항제는 니볼루맙이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 피딜리주맙이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 아테졸리주맙이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 아벨루맙이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 더발루맙이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PDR-001이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PD1-1이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PD1-2이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PD1-3이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PD1-4이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 PD-1 길항제는 PD1-5이다.
본 발명의 의미내의 SMAC 모방체 및 이의 모든 실시 형태는 IAP 단백질에 결합하여 이의 분해를 유도하는 화합물이다. 바람직하게는, 본 발명내의 SMAC 모방체 및 이의 모든 실시 형태는 하기 (A0)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
● 국제공개공보 WO 2013/127729에서 (일반적으로 및/또는 구체적으로) 개시된 바와 같은 SMAC 모방체 (즉, 화합물) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● 국제공개공보 WO 2015/025018에서 (일반적으로 및/또는 구체적으로) 개시된 바와 같은 SMAC 모방체 (즉, 화합물) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● 국제공개공보 WO 2015/025019에서 (일반적으로 및/또는 구체적으로) 개시된 바와 같은 SMAC 모방체 (즉, 화합물) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● 국제공개공보 WO 2016/023858에서 (일반적으로 및/또는 구체적으로) 개시된 바와 같은 SMAC 모방체 (즉, 화합물) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● 국제공개공보 WO 2008/0016893에서 (일반적으로 및/또는 구체적으로) 개시된 바와 같은 SMAC 모방체 (즉, 화합물) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● LCL161, 즉, 국제공개공보 WO 2008/016893 (28/29 페이지; [122])의 실시예 1의 화합물 A 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● Debio-1143으로서 공지된 SMAC 모방체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● 비리나판트로서 공지된 SMAC 모방체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● ASTX-660으로서 공지된 SMAC 모방체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● CUDC-427로서 공지된 SMAC 모방체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염;
● 표 2의 SMAC 모방체 1 내지 26 중 어느 하나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
Figure 112021098441946-pct00003
Figure 112021098441946-pct00004
Figure 112021098441946-pct00005
Figure 112021098441946-pct00006
Figure 112021098441946-pct00007
표 2의 화합물 1 내지 10의 예는 국제공개공보 WO 2013/127729에 개시되어 있다. 표 2의 화합물 11 내지 26의 예는 국제공개공보 WO 2016/023858에 개시되어 있다.
본 출원에서 사용되는 "SMAC 모방체 / IAP 길항제"라는 용어는 또한 상기에서 열거된 SMAC 모방체를 호변 이성질체, 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물 (약제학적으로 허용되는 염의 수화물 또는 용매화물 포함)의 형태로 포함한다. 이것은 또한 상기 SMAC 모방체를 이의 모든 고체, 바람직하게는 결정질 형태, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 및 용매화물 (약제학적으로 허용되는 염의 수화물 및 용매화물 포함)의 모든 결정질 형태로 포함한다.
상기에서 열거된 모든 SMAC 모방체는 각각의 합성 및 특성과 함께 당해 분야에 공지되어 있다. 상기에서 인용되는 모든 특허 출원은 그 전문이 본 출원에 참조로서 포함된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 LCL161 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A1).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A2).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 2 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A3).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 3 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A4).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 4 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A5).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 5 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A6).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 6 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A7).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 7 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A8).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 8 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A9).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 9 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A10).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 10 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A11).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 11 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A12).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 12 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A13).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 13 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A14).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 14 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A15).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 15 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A16).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 16 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A17).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 17 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A18).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 18 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A19).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 19 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A20).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 20 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A21).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 21 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A22).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 22 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A23).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 23 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A24).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 24 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A25).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 25 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A26).
또 다른 실시 형태에서, 상기 SMAC 모방체는 표 2의 화합물 26 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다 (A27).
모든 실시 형태 (A1) 내지 (A27)은 SMAC 모방체의 성질에 관해서 실시 형태 (A0)의 바람직한 실시 형태이다.
조합 치료와 관련된 바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 (i) 플라스민 처리된 CCL21 단백질, (ii) c-말단 절단된 CCL21 단백질, (iii) 서열 번호 2를 포함하거나 서열 번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (iv) 서열 번호 3을 포함하거나 서열 번호 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (v) 서열 번호 4를 포함하거나 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질, (vii) 서열 번호 1을 포함하거나 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, 또는 (viii) 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스이며, 여기서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체된다.
조합 치료와 관련된 추가의 바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스이며, 여기서, 상기 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 (i) 플라스민 처리된 CCL21 단백질, (ii) c-말단 절단된 CCL21 단백질, (iii) 서열 번호 2를 포함하거나 서열 번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (iv) 서열 번호 3을 포함하거나 서열 번호 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (v) 서열 번호 4를 포함하거나 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질, (vii) 서열 번호 1을 포함하거나 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질, (viii) 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 상기 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체되고, 상기 핵단백질 (N)은 서열 번호 7에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 인단백질 (P)는 서열 번호 8에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 9와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 기질 단백질 (M)은 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 아미노산 또는 서열 번호 10과 적어도80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
조합 치료와 관련된 보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 재조합 랍도바이러스는 적어도 하나의 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 사람 CCL21을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스이며, 여기서, 상기 CCL21 단백질 또는 이의 기능적 변이체는 서열 번호 5를 포함하거나 서열 번호 5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지며, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체된다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스, 특히, 본 발명의 수포성 구내염 바이러스와 PD-1 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제의 조합이 암 치료에 예외적으로 효과적인 반면, 본 발명자들은 추가의 카고를 인코딩하지 않는, 즉, CCL21 단백질을 인코딩하지 않는 수포성 구내염 바이러스의 조합도 또한 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제와 조합될 때 효과적이었다는 것을 밝혀냈다. 특히, VSV-GP (LCMV의 당단백질을 갖는 수포성 구내염 바이러스)와 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제 (둘 모두는 본 출원에서 기재된 바와 같음)의 조합 치료는 암, 바람직하게는 고형암의 치료에 효과적이었다. 따라서, CCL21 단백질을 인코딩하지 않는 VSV-GP와 PD-1 경로 억제제, 바람직하게는 PD-1 또는 PD-L1에 대해 지시되는 길항성 항체 또는 SMACm / IAP 길항제를 포함하는 조합이 또한 본 출원에서 제공된다. 본 출원에서 기재된 바와 같은 암의 치료를 위한 이러한 조합물의 용도가 추가로 제공된다. CCL21 단백질을 인코딩하지 않는 VSV-GP와 PD-1 경로 억제제 또는 SMACm / IAP 길항제의 사용을 포함하는 조합 치료가 추가로 제공된다.
CCL21 단백질을 인코딩하지 않는 VSV-GP의 조합 치료와 관련하여, 상기 재조합 랍도바이러스는 재조합 수포성 구내염 바이러스인 것이 바람직하며, 여기서, 상기 재조합 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체된다.
CCL21 단백질을 인코딩하지 않는 VSV-GP의 조합 치료와 추가로 관련하여, 상기 재조합 랍도바이러스는 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G)을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스인 것이 바람직하며, 여기서, 상기 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자는 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자로 대체되고/거나 상기 당단백질 G는 LCMV의 당단백질 GP로 대체되고, 상기 핵단백질 (N)은 서열 번호 7에 제시된 아미노산 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 인단백질 (P)은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 거대 단백질 (L)은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 또는 서열 번호 9와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함하고, 상기 기질 단백질 (M)은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 또는 서열 번호 10과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 기능적 변이체를 포함한다.
바이러스 생성, 생산 및 바이러스 생산 세포
본 발명은 또한 바이러스 생산 세포를 제공하며, 상기 세포는 본 발명에 따른 재조합 랍도바이러스 또는 재조합 수포성 구내염 바이러스를 생산하는 것을 특징으로 한다.
상기 세포는 임의의 기원일 수 있으며, 단리된 세포로서 또는 세포 집단에 포함된 세포로서 존재할 수 있다. 재조합 랍도바이러스 또는 재조합 수포성 구내염 바이러스를 생산하는 세포는 표유 동물 세포인 것이 바람직하다. 보다 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 바이러스 생산 세포는 상기 포유 동물 세포가 다능성 성체 전구 세포 (multipotent adult progenitor cell: MAPC), 신경 줄기 세포 (neural stem cell: NSC), 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC), HeLa 세포, HEK 세포, 임의의 HEK293 세포 (예를 들어, HEK293F 또는 HEK293T), 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포 또는 Vero 세포 또는 골수 유래 종양 침윤 세포 (bone marrow derived tumor infiltrating cell: BM-TIC)인 것을 특징으로 한다.
대안으로, 상기 바이러스 생산 세포는 사람 세포, 원숭이 세포, 마우스 세포 또는 햄스터 세포일 수 있다. 통상의 기술자는 주어진 세포가 바이러스를 생산하는지 여부, 따라서, 특정 세포가 본 발명의 범위에 속하는지 여부를 테스트하는데 사용하기에 적합한 방법을 알고 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 세포에 의해 생산되는 바이러스의 양은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 바이러스 역가는 추가의 다운스트림 처리 없이도 감염 후 주어진 세포 배양물의 조질 상청액에서 ≥ 1×107 TCID50/ml 또는 ≥ 1×108개 게놈 카피/ml이다.
특별한 실시 형태에서, 본 발명의 바이러스 생산 세포는 상기 세포가 VSV의 단백질 N, L, P 및 M을 코딩하는 유전자 n, l, p 및 m 및 LCMV-GP, 단데농-GP 또는 모페이아-GP 당단백질을 코딩하는 유전자 gp로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자들 중 적어도 하나의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 의미에서의 바이러스 생산 세포는 복제 불가능한 벡터로부터 재조합 랍도바이러스를 생산하기 위한 고전적인 패키징 세포 뿐만 아니라 재생산할 수 있는 벡터로부터 재조합 랍도바이러스를 생산하기 위한 생산자 세포를 포함한다. 패키징 세포는 일반적으로 패키징되는 각각의 벡터가 결여되고/되거나 바이러스 생산에 필요한 필수 유전자의 발현을 위한 하나 이상의 플라스미드를 포함한다. 이러한 세포는 목적하는 목적에 적합한 적절한 세포주를 선택할 수 있는 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본 발명의 재조합 랍도바이러스는 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 생산될 수 있으며, (1) 세포 내로 형질 감염된 cDNA 또는 (2) 헬퍼 세포 내로 형질 감염된 cDNA의 조합, 또는 (3) 감염성 또는 비감염성 재조합 랍도바이러스를 생산하는데 필요한 나머지 성분 또는 활성을 트랜스로 제공하는 헬퍼/미니 바이러스로 추가 감염되는 세포 내로 형질 감염된 cDNA를 사용하는 것을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법들 (예를 들어, 헬퍼/미니 바이러스, 헬퍼 세포주 또는 cDNA 형질 감염만) 중 임의의 것을 사용하여, 필요한 최소 성분은 (1) 랍도바이러스 N 단백질, P 단백질 및 L 단백질에 의한 게놈 (또는 안티게놈) RNA의 캡시드화 및 (2) 게놈 또는 안티게놈 (복제 중간체) RNA 등가물의 복제를 위한 시스-작용 신호를 포함하는 DNA 분자이다.
복제 요소 또는 레플리콘은 5' 및 3' 말단에 랍도바이러스의 리더 서열 및 트레일러 서열을 최소한으로 포함하는 RNA 가닥이다. 게놈 의미에서, 상기 리더는 3' 말단에 있으며, 상기 트레일러는 5' 말단에 있다. 이러한 2개의 복제 신호 사이에 배치된 임의의 RNA는 차례로 복제될 것이다. 리더 및 트레일러 영역은 N 단백질에 의한 캡시드화 및 전사 및 복제를 개시하는데 필요한 폴리머라아제 결합을 위한 최소 시스-작용 요소를 추가로 포함해야 한다. 재조합 랍도바이러스를 제조하기 위해, G 유전자를 함유하는 미니 바이러스는 또한 G 단백질 mRNA를 생산하기 위한 적절한 개시 및 종결 신호를 갖는 리더 영역, 트레일러 영역 및 G 유전자를 포함할 것이다. 상기 미니 바이러스가 M 유전자를 추가로 포함하는 경우, M 단백질 mRNA를 생산하기 위한 적절한 개시 및 종결 신호도 또한 존재해야 한다.
재조합 랍도바이러스 게놈 내에 포함된 임의의 유전자의 경우, 상기 유전자는 해당 유전자의 발현 및 단백질 산물의 생산을 가능하게 하는 적절한 전사 개시 및 종결 신호에 의해 플랭킹될 것이다 (문헌 [Schnell et al., Journal of Virology, p.2318-2323, 1996]). "비감염성" 재조합 랍도바이러스를 생산하기 위해, 상기 재조합 랍도바이러스는 최소 레플리콘 요소와 N, P 및 L 단백질을 가져야 하며 M 유전자를 포함해야 한다. 이것은 세포로부터 발아 (budding)하지만 비감염성 입자인 바이러스 입자를 생산한다. "감염성" 입자를 생성하기 위해, 상기 바이러스 입자는, 예를 들어, 부착 단백질 또는 수용체 리간드의 사용을 통해 바이러스 입자 결합 및 융합을 매개할 수 있는 단백질을 추가로 포함해야 한다. 랍도바이러스의 본래의 수용체 리간드는 G 단백질이다.
재조합 랍도바이러스의 조립을 허용하는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 감염성 바이러스 입자를 제조하기 위한 하나의 방법은 T7 RNA 폴리머라아제 또는 다른 적합한 박테리오파지 폴리머라아제, 예를 들어, T3 또는 SP6 폴리머라아제를 인코딩하는 플라스미드로 감염된 적절한 세포주를 포함한다. 그 다음, 상기 세포는 G, N, P, L 및 M 랍도바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 각각의 cDNA로 형질 감염될 수 있다. 이러한 cDNA는 재조합 랍도바이러스 입자를 만들기 위한 단백질을 제공한다. 세포는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 형질 감염될 수 있다.
랍도바이러스 게놈 RNA 등가물을 함유하는 "다시스트론성 cDNA"가 또한 세포주 내로 형질 감염된다. 감염성 재조합 랍도바이러스 입자가 감염된 세포에서 용해성으로 되도록 의도되는 경우, N, P, M 및 L 단백질을 인코딩하는 유전자 뿐만 아니라 임의의 이종 핵산 분절도 존재해야 한다. 감염성 재조합 랍도바이러스 입자가 용해성으로 되도록 의도되지 않은 경우, M 단백질을 인코딩하는 유전자는 다시스트론성 DNA에 포함되지 않는다. "다시스트론성 cDNA"는 N, P 및 L 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 적어도 전사 단위를 포함하는 cDNA를 의미한다. 재조합 랍도바이러스 다시스트론성 DNA는 또한 단백질 변이체 또는 이의 폴리펩타이드 단편, 또는 치료학적 핵산 또는 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유할 수 있다. 대안으로, 처음 생산된 바이러스 입자 또는 이의 단편과 초기에 결합되는 임의의 단백질은 트랜스로 공급될 수 있다.
CCL21을 인코딩하는 유전자를 포함하는 다시스트론성 cDNA가 또한 고려된다. 고려되는 다시스트론성 cDNA는 단백질 변이체를 인코딩하는 유전자, 리포터를 인코딩하는 유전자, 치료학적 핵산, 및/또는 N-P-L 유전자 또는 N-P-L-M 유전자를 함유할 수 있다. 재조합 랍도바이러스를 생성하는 제1 단계는 cDNA의 게놈 또는 안티게놈 등가물인 RNA의 발현이다. 그 다음, 상기 RNA는 N 단백질에 의해 패키징된 다음, P/L 단백질에 의해 복제된다. 이렇게 생산된 재조합 바이러스는 회수될 수 있다. G 단백질이 재조합 RNA 게놈에 없는 경우, 이것은 일반적으로 트랜스로 공급된다. G 및 M 단백질 모두가 없는 경우, 둘 다는 트랜스로 공급된다. "비감염성 랍도바이러스" 입자를 제조하기 위한 절차는 세포 에에 형질 감염된 다시스트론성 cDNA가 랍도바이러스의 N, P 및 L 유전자만을 함유한다는 점을 제외하고는 상기와 동일할 수 있다. 비감염성 랍도바이러스 입자의 다시스트론성 cDNA는 단백질을 인코딩하는 유전자를 추가로 함유할 수 있다.
형질 감염된 세포는 일반적으로 목적하는 온도, 일반적으로는 약 37도에서 적어도 24시간 동안 인큐베이션된다. 비감염성 바이러스 입자의 경우, 상청액을 수집하고, 바이러스 입자를 단리한다. 감염성 바이러스 입자의 경우, 바이러스를 함유하는 상청액을 수확하고, 신선한 세포로 옮긴다. 상기 신선한 세포를 약 48 시간 동안 인큐베이션하고, 상청액을 수집한다.
본 발명의 기타 특징 및 장점은 본 발명의 원리를 예로서 예시하는 하기 보다 상세한 실시예로부터 분명해질 것이다.
실시예
실시예 1
VSV-GP 감염 종양에서 면역 침윤/활성화 및 면역 체크포인트 발현의 유도
발현 분석 / NanoString (도 1)
VSV-GP 플랫폼 면역 세포 침윤 (T 세포: CD3 엡실론, CD4 및 CD8)에 의한 치료학적 개입의 영향을 보다 잘 이해하기 위해, 활성화 (CD69, 그랜자임 B (GzmB) 및 퍼포린 (Prf1)) 뿐만 아니라 면역 체크포인트 (PD-L1 (CD274), PD-1 (Pdcd1), Ctla-4, Tigit 및 Lag3) 발현을 대조군 또는 VSV-GP 감염 종양에서 분석하였다. 이를 위해, 확립된 LLC1-IFNARKO (인터페론 알파 수용체에 대해 결실된 LLC1 종양 세포) 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 대조군으로서 사용하거나 1x108 TCID50의 VSV-GP의 단일 i.v. 주사로 처리하였다. 처리 후 7일에 종양을 절제하였으며; 제조업자의 지침에 따라 NanoString으로부터의 "팬 암 면역 프로파일링 패널 (Pan Cancer Immune Profiling Panel)"을 사용하여 전체 RNA를 추출하고 분석하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, VSV-GP 처리는 PD-L1 및 PD-1 유전자를 비롯한 분석된 유전자의 발현의 강력한 상향 조절을 초래하였다.
실시예 2
효능: 항-PD-1과의 VSV VSV-GP 조합
종양 성장 (도 2a~2d)
암 환자에서의 PD-1 및 PD-L1 차단 항체의 임상적 성공과 VSV-GP 플랫폼에 의한 치료가 PD-1 및 PD-L1과 같은 면역 체크포인트의 상향 조절과 함께 진행되는 종양 침윤 T 세포의 활성화를 초래하였다는 것을 예시하는 본 발명의 데이터 (도 1 참조)를 기반으로 하여, VSV-GP 유래 치료제와 PD-1 차단 항체를 조합하는 치료 가능성을, CT26.CL25-IFNARKO 종양 모델 (인터페론 알파 수용체에 대해 결실된 CT26.CL25 종양 세포)을 사용하여 분석하였다.
s.c. 주사된 CT26Cl25 IFNAR-/- 종양 세포의 생착률은 100%이었다 (50/50 마우스). 8 일차 (바이러스 적용일)에, 종양 크기 중앙값은 0.05 cm3이었다. 종양 성장을 60일 간격에 걸쳐 추적하였다. 모의 (=치료되지 않음) 대조군은 10%의 자발적 관해 (1/10)를 나타냈으며, 한 종양은 훨씬 느리게 성장하였다. VSV-GP i.v. 단독으로 치료된 마우스는 30% (3/10 마우스)의 완전 관해가 관찰되었다. 생착 후 11 일차에 시작하는 PD-1 단독 치료는 종양 성장에 어떠한 영향도 미치지 않았다. VSV-GP와 항 PD-1의 조합은 높은 종양 관해율을 초래하였다. 완전 관해는 VSV-GP 처리 후 항-PD-1을 적용하였을 때 70% (7/10 마우스)에서 나타났다. 마우스는 적어도 60일 동안 종양이 없는 상태를 유지하였다. 전반적으로, 높은 생존율은 조합 그룹에서 달성되었다 (도시되지 않음).
실시예 3
기억 정보: VSV-GP & VSV-GP/항-PD-1 조합
종양 성장 / 재챌린지 (도 3a~3c)
VSV-GP/항-PD-1 조합 실험의 치료된 마우스는 재챌린지로부터 보호된다. VSV-GP/항 PD-1 조합 그룹 (n=7) 또는 VSV-GP 단독 (저용량, n=3) 그룹의 마우스를 재챌린지하였다. 간단히 말하자면, CT26Cl25 IFNAR-/- 세포를 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하고, 시간 경과에 따라 종양 성장을 모니터링하였다. 양성 대조군으로서, 연령 및 성별 일치된 나이브 마우스 (n=10)를 CT26Cl25 IFNAR-/- s.c.로 생착시켰으며, 종양은 이전에 관찰된 바와 같이 1회의 자발적 관해와 일관되게 성장하였다. 어떠한 종양 증식도 VSV-GP/항-PD-1 조합 그룹 (n=7) 또는 VSV-GP 단독 (저용량, n=3) 그룹에서 관찰되지 않았는데, 이는 치료된 마우스가 특정 면역학적 기억을 발달시켰다는 것을 나타낸다.
실시예 4
종양에서의 CCL21 카고 및 VSV-GP 유도된 케모카인 발현의 선택
NanoString® 발현 분석 (도 4)
다중 케모카인의 발현을 측정함으로써 전임상 종양 모델에서 VSV-GP 플랫폼에 의한 치료학적 개입의 영향을 분석하였다 (도 4). CCL5, CXCL9, CXCL10 및 기타 케모카인 발현은 1x108 TCID50의 VSV-GP에 의한 단일 i.v. 치료 후 3 및 7일에 LLC1-IFNARKO 종양에서 강력하게 상향 조절되었다. 다른 한편, CCR7 리간드 CCL19 및 CCL21의 발현은 VSV-GP 감염에 의해 상향 조절되지 않았다.
실시예 5
VSV-CCL21 재조합체의 생성
바이러스 구제 (도 5)
실시예 4에 기재된 결과에 기초하여, 종양 용해성 바이러스 VSV-GP의 게놈을 CCL21 유전자 (도 5 참조)를 인코딩하도록 조작하여, 바이러스 복제 동안 종양 부위에서 CCL21 케모카인을 국부적으로 발현하고 VSV-GP의 "면역 치료 갭" (VSV-GP는 CCR7 리간드 CCL19 및 CCL21을 상향 조절할 수 없었음)을 채우고 종양 용해성 바이러스 VSV-GP의 치료학적 효능 뿐만 아니라 면역 세포 침윤을 추가로 개선하였다.
VSV-GP의 완전한 바이러스 게놈과 쥐 또는 사람 CCL21의 버전에 대한 cDNA를 함유하는 세균 플라스미드로부터 역유전학 (관심 대상 유전자 (gene of interest: GOI) 클로닝, 바이러스 구제 및 반복 플라크 정제)에 의해 복제 가능한 VSV-GP-CCL21 바이러스 변이체를 생성하였다. pVSV-GP-CCL21 플라스미드는 T7 프로모터의 제어하에 VSV 인디애나 혈청형의 완전한 cDNA 게놈을 함유하는 pVSV-XN1 플라스미드 (문헌 [Schnell et al.])를 기반으로 하였다. pVSV-GP-CCL21 변이체를 생성하기 위해, VSV G 외피 단백질에 대한 전체 서열을 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV, WE-HPI 바이러스주) 유래의 GP 외피 단백질의 코돈 최적화된 서열로 대체하였다. 또한, CCL21 유전자를 코딩하는 합성 핵산을 Gibson 어셈블리에 의해 당단백질 GP와 바이러스 폴리머라아제 L 사이에 삽입하였다. 바이러스 감염의 맥락에서의 CCL21 유전자의 전사는 3' 말단에서의 추가의VSV 개시 신호 서열과 CCL21 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에서의 추가의 정지 신호 서열에 의해 보장된다 (도 5a).
감염성 바이러스를 표준 형질 감염 방법 (예를 들어, CaPO4 침전, 리포솜 DNA 전달)에 의한 HEK293T 또는 임의의 다른 VSV 허용 세포주의 형질 감염에 의해 cDNA 플라스미드로부터 회수 (또는 구제)하였다. 간단히 말하자면, VSV 단백질 N, P 및 L 뿐만 아니라 코돈 최적화된 T7 폴리머라아제를 인코딩하는 pSF-CAG-amp 기반 발현 플라스미드로 HEK293T 세포를 형질 감염시켰다. 또한, VSV-GP, VSV-GP-CCL21 또는 이의 변이체의 바이러스 게놈 cDNA를 코딩하는 플라스미드를 공동 형질 감염시켰다 (도 5b). 구제 과정의 제1 단계에서, T7 폴리머라아제는 플라스미드 코딩된 바이러스 cDNA로부터 바이러스 RNA 게놈을 전사한다. 제2 단계에서, 공동 형질 감염된 플라스미드로부터 외인성으로 발현되는 VSV-L 및 -P 단백질은 바이러스 RNA 게놈을 추가로 증폭시킨다. 상기 바이러스 RNA 게놈을 VSV-N 단백질에 의해 공동 전사로 캡시드화한다. 또한, P/L 폴리머라아제 복합체는 바이러스 유전자 산물 N, P, M, GP 및 L의 전체 세트 뿐만 아니라 삽입된 CCL21 변이체의 전사를 가능하게 한다. 이후에 상기 바이러스 RNA 게놈을 리보핵단백질, 기질 단백질 및 바이러스 외피 GP를 함유하는 감염성 VSV 입자 내로 패키징한다. 바이러스 입자를 발아에 의해 세포로부터 방출시킨다.
구제된 바이러스를 처음에 HEK293T, BHK21Cl.13 또는 VERO와 같은 허용 세포주에서 계대하였다. 표준 방법에 의한 바이러스 종자 스톡의 생성 전에 여러 라운드의 플라크 정제를 수행하였다. 간단히 말하자면, HEK293T, BHK21Cl.13 또는 VERO 세포를 구제된 예비 종자의 연속 10배 희석액으로 감염시켰다. 약 2 시간 후, 세포 단층을 2회 세척하고, 0.8%의 저융점 아가로오스를 함유하는 배지로 덮었다. 감염 후 24 시간 내지 48시간에, 플라크를 채취하고, 바이러스를 추가 라운드의 플라크 정제를 위해 사용하거나 바이러스 종자 스톡을 생성하였다.
실시예 5.1
시험관내 바이러스 적합성 검증
TCID50 (도 19a~19c)
감염 하루 전에, Vero, BHK21 및 HEK293 세포를 6웰 플레이트에 씨딩하였다. 상응하는 배양 배지는 다음과 같았다: (a) Vero 세포: DMEM (Gibco, #31966-021) + 5% 열 불활성화 FBS (Gibco, #10500-064), (b) BHK21 세포: GMEM (Life Technologies, #21710-082/025) + 10% 열 불활성화 FBS (Gibco, #10500-064) + 5% TPB 트립토오스 포스페이트 브로스 (Life Technologies, #18050-039), (c) HEK293 세포: Freestyle™ 293 발현 배지 (ThermoFisher Scientific, #12338018).
감염 당일에, 모든 세포주는 60~70%의 밀집도를 가졌다. 세포주 당 하나의 웰을 계수한 후 (CountessTM 세포 계수기, Invitrogen), 다른 웰을 VSV-GP (GP), VSV-GP-huCCL21 (21) 또는 VSV-GP-huCCL21(1-79) (21k) 바이러스 작제물 중 하나의 0.005 MOI로 감염시켰다.
TCID50/mL를 측정하여 바이러스 복제 능력을 결정하기 위해 배양 상청액 (총 부피 3mL)을 감염 후 0 시간, 24 시간 또는 48 시간에 수확하였다.
감염 하루 전에 씨딩된 VERO 세포의 96웰 플레이트 상에서 TCID50 (조직 배양 감염 용량의 중앙값)을 결정하였다. 모든 상청액 중에서, 22개의 연속 절반 대수 희석액을 제조하고 (1E-1.0 내지 1E-11.5의 범위), 4배수로 적정하였다. 감염 후 6일에, 플레이트의 현미경 검사에 의해 세포 병변 효과 (cytopathic effect: CPE)를 판독하였다.
Spearman-Karber 식 M = x + d [0.5 - (1/n) (r)] (여기서, x: 테스트된 최고 희석의 양의 지수; d = 희석 사이의 간격; n = 희석 당 웰; r = 부정적인 응답 수의 합계)에 따라 TCID50/mL를 계산하였다.
실시예 5.2
시험관내 카고 발현
ELISA/웨스턴 블롯 (도 6의 A~B 및 도 12의 A~B 및 도 18)
바이러스 CCL21 카고 (이식 유전자)의 발현을 확인 및 정량화할 뿐만 아니라 다양한 CCL21 변이체를 보다 잘 특성화하기 위해, CCL21 특이적 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 6의 A 및 도 12의 A에 도시된 바와 같이, VSV-GP-muCCL21 (도 6의 A; 전장 쥐 CCL21을 발현하는 VSV-GP) 감염된 HEK293 세포 또는 VSV-GP-huCCL21 (도 12의 A; 전장 사람 CCL21을 발현하는 VSV-GP)로부터의 상청액 각각을, 마우스 및 사람 특이적 ELISA를 사용하여 바이러스 감염 후 다양한 시점에서 분석하였다. 또한, 사람 CCL21 특이적 웨스턴 블롯을 사용하여 사람 CCL21 변이체, 즉, 전장 사람 CCL21 및 사람 CCL21의 처음 79개 아미노산 (신호 서열 제외) = CCL21(1-79)과 유사한 c-말단 절단 버전을 특성화하였다. 도 18에 도시된 바와 같이 (좌측부터), CCL21(1-79) 또는 전장 CCL21 단백질을 인코딩하는 플라스미드 형질 감염된 HEK293 세포로부터의 상청액 뿐만 아니라, 표시된 바이러스로 감염된 HEK293 세포로부터의 상청액을 분석하였다. 케모카인 변이체는 두 시스템 (플라스미드 및 바이러스) 모두에서 잘 발현되었다. 전장 CCL21 샘플은 복수의 CCL21 종 및 분해/절단 산물을 함유한 반면, CCL21(1-79) 단백질은 깨끗한 단일 밴드로 표시되었다.
실시예 5.3
시험관내 카고 활성
트랜스웰 (T 세포/DC) (도 6의 A 및 도 12의 A 및 도 16 및 도 17)
바이러스 CCL21 카고 (이식 유전자)의 생물학적 기능을 확인하고 추가로 특성화하기 위해, 트랜스웰 이동 검정에서 T 세포 또는 단핵구 유래 수지상 세포 (moDC)를 유인하는 능력을 분석하였다. 이를 위해, 실시예 5.2에 기재된 상청액을 함유하는 마우스 및 사람 CCL21 (도 6의 A 및 12의 A), 이동 배지 단독 (배경 대조군), 재조합 CCL21 (양성 대조군) 또는 VSV-GP 감염된 HEK293 세포로부터의 일치된 상청액 (VSV-GP 배경 대조군)을 설정된 트랜스웰 이동 검정의 바닥 웰에 첨가하고, CD3/28 자극된 마우스 (도 6; 우측 위치) 또는 사람 (도 12, 우측 위치) T 세포를 상부 챔버 (Transwell Insert)에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 바닥 웰 내의 세포를 Promega® CellTiter-Glo® Cell Viability Assay를 사용하여 정량화하였다. 결과는 이동 배지 단독 대조군 대비 "배수 증가"로서 도시되어 있다. 추가의 실험은 상기에서 기재된 검정을 사용하여 CCL21의 짧은 카고 버전 CCL21(1-79) (사람 CCL21의 aa 1-79) 및 플라스민 매개된 처리로 생성된 가장 짧은 자연 발생 CCL21 단편 CCL21(1-81) (사람 CCL21의 aa 1-81)을 포함하였다 (도 15 참조). 이러한 목적를 위해, 발현 플라스미드 형질 감염된 HEK293 세포로부터의 상청액을 생성하고 분석하였다 (도 16 참조). 최종 단계에서, 상기에서 기재된 트랜스웰 이동 검정과 반응 세포로서의 moDC를 사용하여 VSV-GP, VSV-GP-huCCL21 (전장) 및 VSV-GP-huCCL21(1-79) 감염된 HEK293 세포로부터의 상청액들을 비교하였다. 본 검정에서, 전장 사람 CCL21 및 CCL21(1-79) 모두는 비슷한 moDC 이동을 초래하였다 (도 17 참조).
실시예 5.4
시험관내 종간 반응성 (사람과 마우스 및 쥐)
트랜스웰 (T 세포) (도 13)
마우스 및 래트 CCL21 수용체 (CCR7)에 대한 사람 CCL21의 종간 반응성을 확인하기 위해, 상기에서 기재된 트랜스웰 이동 검정을 응답군으로서 마우스 (도 13a) 또는 래트 (도 13b) T 세포에 사용하였다 (도 13 참조). 표시된 농도 (하단 웰)의 사람 대 마우스 (도 13a) 및 사람 대 래트 (도 13b) 재조합 케모카인을 사용하여 이동 검정을 수행하였다. 결론적으로, 사람 CCL21은 각각 상응하는 마우스 및 래트 케모카인만큼 마우스 및 래트 시스템에서 활성이었는데, 이는 사람 분자가 전임상 설치류 (마우스/래트) 모델에서 테스트될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6:
생체내 카고 CCL21 발현
RNAseq (도 10)
바이러스로 인코딩된 CCL21 발현을 대조군 또는 VSV-GP 및 VSV-GP-muCCL21 감염된 종양의 설치류 종양에서 분석/확인하였다. 이를 위해, 확립된 LLC1-IFNARKO 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 대조군으로서 사용하거나 1x108 TCID50의 VSV-GP 또는 VSV-GP-muCCL21의 단일 i.v. 주사로 처리하였다. 처리 후 7일에 종양을 절제하였으며; RNAseq를 사용하여 전체 RNA를 추출하고 분석하였다. CD3엡실론 및 CXCL10을 비교군으로서 사용하였다. 판독값으로서 코돈 최적화된 DNA 서열을 사용하여 바이러스로 인코딩된 CCL21을 특이적으로 검출하였다 (도 10 참조).
실시예 6.1:
VSV-GP 및 VSV-GP-CCL21의 신경독성 결여
생존 (도 11)
야생형 VSV 감염은 바이러스가 뇌에 접근할 때 신경학적 증상을 유발할 수 있다. 이러한 신경학적 합병증으로는 감염된 대상체의 사망으로 이어질 수 있는 중증 뇌염이 포함된다. 키메라 VSV-GP를 사용하는 이점은 신경 감염이 VSV 백본을 안전한 종양 용해제로 만드는데 거의 완전히 부재하는 것으로 나타났다. 약화된 표현형에 대한 이유는 바이러스 외피 당단백질을 통해 촉진되는 변경된 바이러스 향성 (tropism) 때문인 것으로 여겨진다. 뇌에서의 VSV-GP의 신경 감염 및 확산은 보이지 않지만, 예를 들어, 신경교세포 또는 성상교세포와 같은 다른 세포 유형에서의 바이러스 유전자 발현이 완전히 결여되어 있는지 여부는 분명하지 않다. VSV GP에 의한 CCL21 이식 유전자의 우발적 발현이 면역 세포를 유인하여 뇌 내에서 부작용을 일으킬 수 있으므로, VSV-GP-muCCL21의 신경독성 평가를 수행하였다.
우측 선조체에 대한 정위 주사를 통해 1x106 TCID50을 함유하는 3 μl의 단일 두개내 주사를 스위스 CD-1 마우스에게 투여하였다. PBS를 대조군에 i.c. 투여하였다. 동물을 신경독성 및 일반적인 웰빙의 징후에 대해 매일 모니터링하였다. PBS (점), VSV-G DsRed (다이아몬드), VSV-GP (사각형) 및 VSV-GP muCCL21 실험군의 마우스 생존율을 카플란-마이어 곡선으로 플롯팅하였다 (도 11b). 카플란-마이어 분석은 테스트된 바이러스 변이체 중 어느 것도 마우스에서 신경독성을 나타내지 않았다는 것을 나타낸다. 바이러스 표면에 야생형 VSV 당단백질을 함유한 VSV-G DsRed 대조군만이 증가된 체중 감소를 나타냈으며 (도 11a), i.c. 감염 후 첫 주 이내에 안락사로 이어지는 신경계 징후를 발병하였다.
실시예 6.2
VSV-GP 및 VSV-GP-CCL21의 생체내 효능
종양 성장 (도 14)
CT26.CL25-IFNARKO 종양 모델을 사용하여 VSV-GP 및 VSV-GP-huCCL21의 치료 가능성을 평가하고/비교하였다. 이를 위하여, 확립된 종양을 2x107 TCID50 VSV-GP 또는 VSV-GP-huCCL21의 2회 i.v. 주사 (0 및 3 일차)로 처리하였다. 표시된 바와 같이 처리된 마우스의 생존율은 도 14에 도시되어 있다.
실시예 6.3
VSV-GP-huCCL21 및 VSV-GP-CCL21(1-79)의 생체내 효능
종양 성장/생존 (도 20/21)
CT26.CL25-IFNARKO 종양 모델을 사용하여 VSV-GP-huCCL21 및 VSV-GP-huCCL21(1-79)의 치료 가능성을 평가하고/비교하였다. 이를 위하여, 확립된 종양을 2x107 TCID50 VSV-GP-huCCL21 또는 VSV-GP-huCCL21(1-79)의 2회 i.v. 주사 (0 및 3 일차)로 처리하였다. 표시된 바와 같이 처리된 마우스의 누적 종양 성장 및 30일 생존율은 도 20/21에 도시되어 있다. 완전히 플라스민 처리된 (aa 80/81 미만) 자유롭게 확산 가능한 형태의 사람 CCL21에 상응하는 짧은 CCL21 변이체 (CCL21(1-79))에 의한 처리는 전장 CCL21 보유 VSV-GP 변이체와 비교하여 종양 성장을 보다 잘 제어하고 생존율을 재선시킬 수 있었다.
실시예 6.4
MoA: VSV-GP-huCCL21 및 VSV-GP-huCCL21(1-79)에 의해 유도된 T 세포 침윤
IHC (도 22/23)
실시예 6.3에서와 같이 처리된 종양을 T 세포 침윤에 대해 분석하였다. FFPE 종양 절편을 CD4 및 CD8 뿐만 아니라 VSV-N 및 절단된 Caspase3에 대해 염색하였다. 생존 (비괴사) 종양 영역 내의 총 T 세포(CD4+ 및 CD8+ 세포)를 정량화하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, 완전히 플라스민 처리된 (aa 80/81 미만) 자유롭게 확산 가능한 형태의 사람 CCL21에 상응하는 짧은 CCL21 변이체 (CCL21(1-79))는 보다 많은 T 세포를 종양 내로 유인할 수 있었는데, 이는 관찰된 효능 증가에 대한 설명을 제공한다 (실시예 6.3).
또한, 바이러스로 발현된 CCL21은 수지상 세포 (CD11c 양성)를 감염된 CT26.CL25 종양 내로 유인할 수 있었다. 0 및 3 일차에, 확립된 CT26.CL25 종양에 2x107 TCID50의 VSV-GP 또는 VSV-GP-muCCL21을 국부로 (i.t.) 주사하였다. 각각의 종양의 FFPE 절편을 수지상 세포 침윤에 대해 분석하였다 (활성 바이러스 복제를 갖는 종양 면적 = 괴사 여백) (도 24 참조).
실시예 7
효능: SMACm와의 VSV-GP 및 VSV-GP-CCL21 조합
종양 성장/생존(도 7~9)
VSV-GP 및 PD-1 차단 항체 (실시예 2)의 조합으로부터 수득된 고무적인 데이터에 기초하여, 종양 세포를 세포 사멸 유도 자극/작용제에 대해 보다 더 민감하게 만드는 세포 사멸 경로의 조절제인 SMAC 모방체 (SMACm)와 VSV-GP (도 7/9) 및 VSV-GP-muCCL21 (도 8/9)의 추가 조합을 테스트하였다. CT26.CL25-IFNARKO 종양 모델을 사용하여 화합물들의 치료학적 상호 작용을 분석하였다. 이를 위해, 확립된 CT26.CL25-IFNARKO 종양을 갖는 Balb/c 마우스에게, VSV-GP 및 VSV-GP-muCCL21 처리와 같은 날에 시작하여 2주 동안 매일 (p.o.) 제공되는 4x106 TCID50의 VSV-GP 및 VSV-GP-muCCL21 및/또는 100 mg/kg의 SMACm에 의한 단일 i.v. 처리를 투여하였다. VSV-GP와 SMACm의 조합은 상응하는 단일 요법과 비교하여 개선된 효능을 초래하였다. VSV-GP-muCCL21과 SMACm을 조합할 때, 조합 효과는 훨씬 더 현저하여 처리된 모든 동물의 치료를 초래하였다.
<110> Boehringer Ingelheim International GmbH ViraTherapeutics GmbH <120> Recombinant rhabdovirus encoding for CCL21 <130> 01-3349-WO <150> EP19153668.9 <151> 2019-01-25 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe 1 5 10 15 Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys 20 25 30 Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr 35 40 45 Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe 50 55 60 Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu 65 70 75 80 Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro 85 90 95 Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr 100 105 110 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser 115 120 125 Gln Thr Pro Lys Gly Pro 130 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys 1 5 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cuauguuagc cuuauaaacu ggaacauagg aacuuucggg accugccgca ugaaggucua 420 ccucauagcc uacgaagguc uuggucgcgu cuacuguuua ccaacggaaa cauagaugaa 480 ccgaauaugu cucacccguc uuguguuuac ggacuuaugu cuuuuuucga guaccuaccc 540 gacuguuuag uuacguuuua cuaguuacuu gucaaacuug gagaacacgg ucuuccagca 600 cuguaaaaac uacacacccc uuuacuguca uuaauguguu uuuaacagcg acgucaccug 660 uacaagaagg uguacaaguu uuuuguacuu acacggagca agucuaugcc uugauaacaa 720 aggucuaagu uucuaacacg acguaaccgu uguaaaccug uggagacguu uuauuggccu 780 uacagauguc uucuacauug cuggaccuag aacuuggcuc uucaacgucu acuuuaccag 840 guuuacuacg aagguccggu ucuuuaacug uuccggcuaa guauguacgg aauaaacuag 900 cugaaaccua acagaagauu cagagguaua agaaggcagu uuuugggacg gaaggugaag 960 acccccguua acugucgaga agacgagucu agguggucuc guuccuuacg ggcugucgga 1020 cuacuguaac ucauauguag agaaugaugu cguccaaaca acaugcgaau acgucauccu 1080 aggagacggc ugaaccgugu ugucaaaaca caaccucuau uguuuaugug aggucuacua 1140 ucauggccuc cuaacugcug auuacguggc gguguuccgu cucuacacca gcuuaccgag 1200 ccuaccaaac uucuaguuuu gucuuuuggc ugaggacuau acuacgucau acgcuuuucu 1260 cgucaguaca gugacguucc ggauucucuc uucuguuaac cguucauacg auucagucuu 1320 aaacuguuua cugggauauu aagagucuag uggauaauau auaauacgau guauacuuuu 1380 uuugauuguc uauaguaccu auuagagugu uuucaagcac ucauagaguu caggauaaga 1440 gcagaccuag uccgccaucc ucucuaucua cucuagcuuc guguugcucg acuuuucagg 1500 uuaauacuca acaagguucu ccuaccucac cuucucguau gauucgggag aauaaaaguc 1560 cgucgucuac uaagacugug ucuuagacuu ggucuuuaac uucuguuagu uccgaacaua 1620 cguggucuag gucuucgacu cguucaacuu ccgaaauaug uccccggaaa ucuacugaua 1680 cgucuacucc uucaccuaca acauaaauga agccugaccu uugucggacu cgaacuuaga 1740 cugcucguac cuuucuggaa ugccaacugu agcggucucc caaauucacc ucucgucuuu 1800 agggucaccg aaagcugcua auuucgucag cacguuucac gguuuaugac cuuagaccgu 1860 cucacgugua aacuucguag cccucuuccc caguaauacu uccucgcggu cuauugaggc 1920 cuacauauau uccagugagg ucacuacuug uguguaggca ggguuagucu ucgucauagu 1980 cuacaaacca gagagaguuu cuguagguac ugaaagguug gguucuuucg uucagaaguc 2040 ggagaguggu auaggaaccu acuuaacaag aguagaucuc cucucaagua gagacagccu 2100 ccacugccug cuuacagagu auuucuccgg uaggacgagc cggacucuau guuuuucaac 2160 auguuagucc gcucucaguu uauaagagac aucugauacu uuuuuucauu gucuauagug 2220 cuagauucac aauaggguua gguaaguagu acucaaggaa uuucuucuaa gagccagacu 2280 uccccuuucc auucuuuaga uucuuuaauc ccuagcgugg ugggggaaua cuucuccugu 2340 gaucguaccu cauacgaggc ucgcgagguu aacuguuuag gauaaaaccu caacugcucu 2400 accuguggau acuaggcuua guuaauucua uacucuuuaa gaagaaaugu cacuuuuacu 2460 gccaaucuag auuagcaggc aagucuugua ugagucuaca ccgucggcga cauaggguaa 2520 cccuagugua cauguagccu uaccgucccu uugcagggaa gauguuuuag aaccgaaaaa 2580 acccaagaag auuagauuuc cggugagguc gccauaaccg ucuaguucca guuggucuca 2640 uagugcgagu gacgcuuccg ucccgaauaa acgguguauc cuaccccuuc uggggagggu 2700 acgaguuaca uggucucgug aagucuucug guaaguuaua uccagaaaug uucccuugcu 2760 aacucgagug uuacugguag augcuacuac ucagugaccu ucgucgagga uacuagaccc 2820 uaguaaaguu aagaagguuu aaaagacuaa agucucucuu ccggaauuac aaaccggacu 2880 aacagcucuu uuuccguaga ccucgcaccc aggaccugag auagccggug aaguuuacuc 2940 gaucagauug aagaucgaag acuuguuagg ggccaaauga gucagagggg auuaaggucg 3000 gagagcuugu ugauuauagg acagaaaaga uagggauacu uuuuuugauu gucucuagcu 3060 agacaaaugc gcagugccua gggggcccga cguccuuaag cggugguacc cggucuagca 3120 cugguacaag cuccgggacg ggguguagua gcugcuccac uaguuguagc acuaguagca 3180 cgaguaguag uaguggucgu aguuccggca cauguugaag cgguggacgc cguaggaccg 3240 ggaccacucg aaggacaagg accggccguc uucgacgccg uacaugccgg acuuaccggg 3300 gcuauagaug uucccgcaca uggucaaguu cucgcaccuc aagcuguacu cgguggacuu 3360 ggagugguac ggguugcgga cgucgcgguu guuaucggug gugauguagu cguacccguc 3420 gucgccggac cucaacugga agugguugcu gucguaggac uugguguuga agacguugga 3480 guggucgcgg aaguuguucu uuuggaagcu ggugugggag uacucguagc acucgucgga 3540 cguggacucg uagucuccgu ugucguuggu guuccggcac ucgacgcuga aguuguugcc 3600 guagugguag gucauguugg acucgaaguc gcuaggaguc ucgcgguagu cggucacguc 3660 uuggaagucu ccgucucacg accuguacaa gucuuggcgg aagccgccgu ucauguacuc 3720 uucgccgacc ccgacccggc cgucgcugcc guucuggugg accacgucgg ucuggucgau 3780 ggucauggag uaguaggucu ugucuuggac ccucuuggug acgucuaugc ggccuggaaa 3840 gccguacucg ucuuaggaca agcggguccu cuuuugguuc aaggaguggu ccucugaccg 3900 gccguggaag uggaccuggg acucgcuguc gucgccgcac cucuugggac cgccgaugac 3960 ggagugguuc accuacuagg accggcggcu cgacuucacg aagccguugu ggcggcaccg 4020 guucacguug cacuuggugc ugcuccucaa gacgcuguac gacucugagu agcugauguu 4080 guuccggcgg gacucguuca aguucguccu gcaccucucg cgggacgugc acaaguucug 4140 guggcacuug ucggaguagu cgcuggucga cgaguacucu uugguggacu cucuggagua 4200 cccgcacggg augacguuga ugucguucaa gaccauagac cucgugcggu ucuggccgcu 4260 cuggucgcac ggguucacga ccgaccacug guuaccgucg auggacuugc ucugggugaa 4320 gucgcugguc uagcucgucc uucggcuguu guacuagugg cucuacgacu ccuuccugau 4380 guaguucucu gucccgucgu ggggggaccg ggaguaccua gacgaguaca agucgugguc 4440 gcggauggag uagucguaga aggacgugga ccacuucuag gggugggugu cuguguaguu 4500 cccgccgucg acgggguucg gggugucuga gugguuguuc ccguagacgu cgacgccgcg 4560 gaaguuccac gggccgcacu uuugguagac cuucuccucu auucgccggc gaugcuggag 4620 cugauacuuu uuuugauugu cuauaggagc ugcgguggua cccgaccagg acguaguaag 4680 acaaagacca ccggugucgg uggccacagg uaucaagacu accgccgcga guccugacga 4740 cggacuucau gagagucucu uucuaggggc gguuccagca cgccucgaug ucuuucguuc 4800 ucggaagaga cccgacgaga uagggacggu aggacaaaga cggggccuuc ucuagugucc 4860 ggcuugacac gcggcuagga uuucuugaca cccacgucgu cgacuacguc guagaccugu 4920 ucugggguag aggagucuuc ggacgaguuc cgacuacuaa aaauaugauc ggucuaagaa 4980 guacaaaccu gguuuaguug aacacuaugg uacgaguuuc uccggaguua auauaaacuc 5040 aaaaauuaaa aauacuuuuu uugauugucg uuaguaccuu caggugcuaa aacucuggcu 5100 gcucaaguua cuaaaguuac uucuacugau acgguguucu cuuaaggacu uagggcuacu 5160 cgcguacugc augaacuuag uacgacuaau guuggacuua agaggagauu aaucacuacu 5220 auaacuguua aauuaguccu uuaaguuaag agaagguuaa gggagcuaca cccuaucauu 5280 cuugacccua ccucaagaac ucuacaauug caguacaguu cgguuagggu aggguuguag 5340 agucuacgua uuuaccuacc cuucaaccaa uuacagacua uuaguacuac ggucaguucc 5400 cauaucaaaa aauguacuuc accuguuucu ccgucuuuau uguaaacugc accaccucug 5460 gaaguaggcg ccgaccccgu uguuugguua acuuauguag uuuuuccuuu cuaccugacu 5520 gaguaaguuu uaagagcgaa uaaacacagu uuucaaaaac cugaaugugu ucaacuguaa 5580 uuagaauuua cgacagagac uccaccuuaa cgaguugaac cgcuccugaa aguuuccguu 5640 ucagucuucu ucaagaguac cuugcuugua uacguccuaa ucccaagggu cgaacccagg 5700 augaaaauaa agucuuccua cccgaaugaa guucuuugaa cuauaagauu accuggcuuu 5760 gaaagacaau uaccaguuuc uacacuaaua ucccuccuac guuugccacg auagguacca 5820 uacaucuuau cuguuggaca agagucucgu ucuguagaag agggaagauu uauagauguc 5880 uuaaccucua uuuuaacacc ucuccguccc uuuaaaaaga auacugaacu aauuuuacca 5940 ccuuggcuau acguugaacu ucgacuacuu uaaucguucu cuuaguuccg gaaaucaggg 6000 uguuaaggga guaaaacuuu uaguauaguu cugaagacaa cuacuucccc guuuuuaacu 6060 ggcuccauau ucuaaggagg uacuagucua uuacucacac uuuugucacc uagaguguga 6120 ccacuaaaua ccuagcaagu cuguaacccc aguaggaaaa uaucuaauaa ugugaccuga 6180 ucuuuuuaau guaaggguuc auugguacuu cuuucuauaa cuacacagua uacguuuucg 6240 ugaacguuca cuaaaucgag ccuaacaaga uaaaguuguc aaguuacuag uauuuuucac 6300 caagcacuua ccucugaacg agggaguacu aguagggaaa uuuucaguac aauuucuuuu 6360 auguaccggg ugucgacgag uucaaguucu aaaaccucua uuuaccguac uugaaggcga 6420 cuaauuuaca aaacuuuaug ggcugaauga ucuggguagc uauuauauga gacuguuuuc 6480 aguaaguuac uuauccaguc uccacaacuu uguacaggcu uacuuaggcu ugugaggaua 6540 gggaucauuu uuccacaacg ucugauacaa ccuguguuuc cgaugguuaa ccuuucuuaa 6600 agaauuucuc uaacuacucu ucccgaaucu acuacuacua gauuaauaac cagaauuucc 6660 uuuccucucc cuugacuuca accguccauc uaaaaagagg gauuacagaa ccuuuaacgc 6720 ucuuaugaaa cauuaauggc uuauaaacua uuucugagua aagcagggau acaaauuucc 6780 ggacuguuac cgccugcuag auugacguca guaauuuuuc uacaaucuaa ggaguaggcc 6840 gguuccuaac uucaguauac uccguuaaac guaucgguua guguaacuaa ugcuuuuuac 6900 cuuauuggug guuuccuuca auaguuugcc gggucacaag gcucaauacc cggucaagaa 6960 uccaauaggu aggaauuagc ucucuugagu acuuaaaaaa cucuuuucag aauauaugau 7020 guuaccuucu ggucugaacu acgcacaagu guuguugugu gacuaguuaa guuggagggu 7080 ugcucaaaca accguuccug uucucccacc ugaccuucca gaugccguuu uuccuaccuc 7140 auaggaguua gaugaccaau aaguuucucu ccgauuuuag ucuuugugac gacaguuuca 7200 gaaccguguu ccacuauuag uucaauaaac gugugucaua uuuugcuucu uuagcucuuu 7260 gcaacaucuu aaugucccac gagaguuagu uuaccaaaga uuauuacucu uuuaauacug 7320 acguuaguuu uaucccuguc ccuucaaucc ugaaaacuau uuacugcuac ucugauacgu 7380 uagacgucua augaacuuaa uaccuuuuua uggcuaaaag gcaccucacu aaucucccaa 7440 ucucugguuc ucuaccagug cucacugaac acagugguua cugguuuaug ggugaacacg 7500 auuauauuac ucgagucaaa gguguuuacg agaguggcau cgaguaaaac gacucuuggg 7560 uuaguuacgg uacuauguca uguuaauaaa acccuguaaa cgaucugaga acaacuacua 7620 cguacuagga cgagaagcag uuaguaacau acuucaaguu cuauucuaug gcccgaacgu 7680 gucaagauga aaguuuaugc gguacaacau aaaccuggga agguaaccuc cucacagccc 7740 guacagaaac agguccaaaa acuaaucucg gaagggucua gggcauuguc uuucagagag 7800 uaagaccucu aaguagguac auguacgagc uucacucgua gacuuccucu acucacguca 7860 uaaaccuuug gggcucuauc gguucaaagc uuauugagug uaucuguucg aucaucuucu 7920 agguuggaga gacuuguagc gauacccuua cucaggucgc uugaacaauu ucugacucca 7980 auuuuuuacg aauuagcuua guucuguuug guaguccuug guccacuaau uccuacguug 8040 guauauaaac auaguacuuc uccuagccga gucuucaaag aauaccaguu auuuaggaga 8100 caagggaucu aaaaauucac uuaaguuuag uccgugaaaa aacccucagc gucugcccga 8160 guagucagau aaaguuuuaa gagcaugaua agccuugagg aaauucuuuu ucauaguauc 8220 ccuuaaccua cuaaacuaac acuccucacu ccauaggaga aacuguguaa aucccuuuga 8280 aguaaacucu uccccuagua cauuuuacac cuguacaagu cgaugaguac gacuguguaa 8340 uucuauguuu aggaccccgg caugucaaua acccuguuga caugggguag guaaucuuua 8400 caacccaggu guuguagcuu uucucugagg aacacguggu acauugugua gucccaaguu 8460 aauacaaaga cacguaacag gucugcccua gguacugcag aaaucaagug ccccugguaa 8520 cggacgaaua gaucccagau uuuguagacu uagauguaga uaaaacgucg gaacccuuuc 8580 ccuuucguuu cagggugacu aauuuucucg augugcagaa ucucuacgau agagaaccaa 8640 acaacuuggg cugagauuug aucguuacug auaugaaaga uuguagguga gaaauugucc 8700 gcuucuuacc ugguuuuccg ucguacccaa guuuucuugu cccagacggg aaguauccaa 8760 aagcuguaga gccuacucgg uaccacccaa gcguagaguc ucgugacguc guaacugguc 8820 caacuaccgu ugaugucugu gguacucccu agacccucua gucuuaaagc ugaaaaauaa 8880 gguucguugc aacgagauac gaguuuaaug guggugacaa cguucucugc cuaccuagug 8940 gucaacaugu cuaguaauag uauaacggac auucaggaca aacucugggu aucuucucua 9000 gugggaccug aguucauacc ugaugugcgg gggucuacau aggguacacg acuucuguac 9060 cuccuuaccc cuuccaagca ccccuguucu cuauuuuguc uagauaggaa aucuucccuu 9120 aaccuucuua aaucguggac gacucguuag gauaguucag ccgucuacau auccaaaaga 9180 uauaccucug aaccgcauau cuuuuagaug aguacggcuc cugucaagag auaaaggaga 9240 uagauauguu ccagcauaau cuccagcucc aaagaauuuu cccaacgauc ugccuaauua 9300 cucucguuca acgacgguuc auuauguggc cucuucagac cgaguaaacu ucuccggccg 9360 guugcgucac augccuccaa acuaaaugaa cuaacuauuu aacucacaua guggagguaa 9420 ggaaagagaa ugaucuaguc cuggauaauc ucugcuuaau cuuugcuaag ggguguucua 9480 ggguuggagg auaggcuguu cguuggcacu auacccccac uaacagucuu uaaugaaguu 9540 uaugguuacg gcagauuaac uuuucccuuu uaugucuagu guaauaagug uuaauaccaa 9600 uaagagucua cagaauaggu aucugaagua accugguaag agauaaaggu ggugggagaa 9660 cguuuaggau auguucggua aaaauagacc cuuucuauuc uuacucaacu cucucgaccg 9720 uuuagaaaga aguaacgauu cuaguccucu ccccacccuu cuguauguac acuuuaagaa 9780 gugguuccug uauaauaaca caggucuccu uuagucugua cgaacguuca agcccuaacg 9840 auuccuauua uuauuucugu acucgauagg gggaaccccu ucccuuaggu cucccuguua 9900 auguuguuag ggacaaauaa uaugcuggug gggaaugggu uucuacgauc ucuacggagg 9960 uucuuagguu uuaggggacg acaggccuua guccaacccg guuaaugguu gaccgcgagu 10020 aauauuuuaa gccucauaua auguaccuua cccuuaggua augucccuga agaacucaac 10080 accucugccg aggccucccu acugacgacg uaaugaugcu cuuuuacacg uaucgucucc 10140 uuauaaguua ucagacaauc uuaauagucc cagucaguac gcuccgcgga gaggacucgg 10200 ggggucacgg gaucuuugaa auccuccucu auuuagcucu acacauuuac cacuuuguac 10260 aacccuuaua gguagacuga auacacuggg uuccugaacc cugauaaagg aggcugaguu 10320 ucguccgaac cccgaaguuu aacuaaauua acauuaccua uaccuucaag cccuaagaag 10380 augaucggac uuuuaacucu gcuuacaauc uuuaauacac guggccuaaa accuacucgu 10440 uccucaaaau uagauguucu gaauaccuug uauauaaaca cucucgcuuu ucuuacguca 10500 uuguuaggaa ccaggguaca aguucugcca gcugaaucaa guuugucuua aaucaucaag 10560 aguuugcaga cuucauauau accauacauu uccaaacuuc uuuaauuagc uacuuggguu 10620 agggcuaacc agaagguagu uacuuaggac cuuuuuggac augcguaagg ucaguagucu 10680 uguccuuaaa cggucucguu ucuuccaauc auguaugaaa uggaacuguc cauaagggag 10740 gguuaaguaa ggacuaggaa aacauuugua acucugauac gauguuuaua agccucaugg 10800 gugcccacac agaguacgcc gacggaauuu uaguagacua ucuggacguc uaaauaacug 10860 guaaucggaa aaaauauacc gcuaauauag cauaauauug uaguuaguau agucucaucc 10920 uggcuaugga ggcuuggggg guagucuacc uuaacguguu uuacaccccu agcgauauug 10980 accauauucg aaaaccgacu caaacuaccu cuuucuguaa ggugauauag uugucacaaa 11040 ucgucaauag gucguuagua agggcuaauc cacccuccga caaagucauu uuccuccuau 11100 guucgucuuc accucaugau cuccacuacc cgaggguuuu cuaugggcuu aaagucugag 11160 gaaccggggu uagcccuuga ccuagucuag agaccuuaac caggcuuugg uucaagcaga 11220 uuuagguaag uuacucuaga acaaguuagu cgauacagca ugucaccuau uaguaaacuu 11280 uaccaguuua aacgcuucuu uguguccuua cuaacuuacc uaguuaucug cuuaaaguuu 11340 ucuucuggcc agauaugacu acaacuucuc acuggaugug cuccuuuuga gaaccucucu 11400 aauuuuuuag uacuccucug agguuugaaa uucauacuuu uuuugaaacu aggaauucug 11460 ggagaacacc aaaaauaaaa aauagaccaa aacaccagaa gcaucggacg aguuccgacu 11520

Claims (53)

  1. (i) 서열 번호 2의 1-79번, 1-81번, 1-88번, 1-91번 또는 1-104번 아미노산을 포함하는 단백질,
    (ii) 서열 번호 2의 80-111번 아미노산 중 적어도 하나가 결실된 서열 번호 2를 포함하는 단백질,
    (iii) 서열 번호 2를 포함하는 단백질,
    (iv) 서열 번호 3을 포함하는 단백질,
    (v) 서열 번호 4를 포함하는 단백질,
    (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질,
    (vii) 서열 번호 1을 포함하는 단백질,
    (viii) 서열 번호 5를 포함는 단백질
    을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 적어도 하나의 CCL21 단백질을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스로서,
    상기 재조합 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자가 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G가 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체되는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 2의 1-79번, 1-81번, 1-88번, 1-91번 또는 1-104번 아미노산을 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 2의 80-111번 아미노산 중 적어도 하나가 결실된 서열 번호 2를 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 2를 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 3을 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  6. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 4를 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  7. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 1을 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 서열 번호 5를 포함하는 단백질을 인코딩하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  10. 적어도 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스로서,
    (i) 상기 당단백질 G를 코딩하는 유전자가 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나,
    (ii) 상기 당단백질 G가 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체되는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵단백질 (N)이 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  12. 제10항에 있어서, 상기 인단백질 (P)이 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  13. 제10항에 있어서, 상기 거대 단백질 (L)이 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  14. 제10항에 있어서, 상기 기질 단백질 (M)이 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  15. 제10항에 있어서,
    - 상기 핵단백질 (N)이 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    - 상기 인단백질 (P)이 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    - 상기 거대 단백질 (L)이 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하고,
    - 상기 기질 단백질 (M)이 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  16. 제10항에 있어서, 복제 능력이 있는(replication-competent), 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  17. 제10항에 있어서, 상기 CCL21 단백질이 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 재조합 수포성 구내염 바이러스:
    (i) 서열 번호 2의 1-79번, 1-81번, 1-88번, 1-91번 또는 1-104번 아미노산을 포함하는 단백질,
    (ii) 서열 번호 2의 80-111번 아미노산 중 적어도 하나가 결실된 서열번호 2를 포함하는 단백질,
    (iii) 서열 번호 2를 포함하는 단백질,
    (iv) 서열 번호 3을 포함하는 단백질,
    (v) 서열 번호 4를 포함하는 단백질,
    (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질,
    (vii) 서열 번호 1을 포함하는 단백질,
    (viii) 서열 번호 5를 포함하는 단백질.
  18. 수포성 구내염 바이러스 핵단백질 (N), 거대 단백질 (L), 인단백질 (P), 기질 단백질 (M), 당단백질 (G) 및 적어도 하나의 CCL21 단백질을 이의 게놈에 인코딩하는 재조합 수포성 구내염 바이러스로서, 상기 CCL21 단백질이,
    (i) 서열 번호 2의 1-79번, 1-81번, 1-88번, 1-91번 또는 1-104번 아미노산을 포함하는 단백질,
    (ii) 서열 번호 2의 80-111번 아미노산 중 적어도 하나가 결실된 서열 번호 2를 포함하는 단백질,
    (iii) 서열 번호 2를 포함하는 단백질,
    (iv) 서열 번호 3을 포함하는 단백질,
    (v) 서열 번호 4를 포함하는 단백질,
    (vi) 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함하는 (i) ~ (v) 중 어느 하나에 따른 단백질,
    (vii) 서열 번호 1을 포함하는 단백질,
    (viii) 서열 번호 5를 포함하는 단백질
    을 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G를 코딩하는 유전자가 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV)의 당단백질 GP를 코딩하는 유전자에 의해 대체되고/되거나, 상기 당단백질 G가 LCMV의 당단백질 GP에 의해 대체되고,
    - 상기 핵단백질 (N)이 서열 번호 7에 제시된 아미노산을 포함하고,
    - 상기 인단백질 (P)이 서열 번호 8에 제시된 아미노산을 포함하고,
    - 상기 거대 단백질 (L)이 서열 번호 9에 제시된 아미노산을 포함하고,
    - 상기 기질 단백질 (M)이 서열 번호 10에 제시된 아미노산을 포함하는, 재조합 수포성 구내염 바이러스.
  19. 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암이 고형암이고, 상기 고형암이 교모세포종, 비소세포폐암, 생식기 종양, 난소 종양, 고환 종양, 내분비 종양, 위장 종양, 췌장 종양, 간 종양, 신장 종양, 결장 종양, 대장 종양, 방광 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 흑색종, 호흡기 종양, 폐 종양, 유방 종양, 두경부 종양, 두경부 편평 세포 암종 (head and neck squamous-cell carcinoma: HNSCC) 및 골 종양을 포함하는 목록으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 종양내로 또는 정맥내로 투여되는, 약제학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 종양내로 및 후속적으로 정맥내로 적어도 1회 투여되는, 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 후속적인 정맥내 투여가 초기 종양내 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일 또는 31일에 제공되는, 약제학적 조성물.
  24. 제19항에 있어서, PD-1 경로 억제제 또는 SMAC 모방체를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 PD-1 경로 억제제가 PD-1 또는 PD-L1에 대해 지시된 길항성 항체인, 약제학적 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 SMAC 모방체가 하기 화합물 1 내지 26 중 어느 하나 또는 이들 화합물 중 하나의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물:




    .
  27. 제24항에 있어서, 상기 PD-1 경로 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 길항제인, 약제학적 조성물.
  28. 하기를 포함하는 부품 키트 (kit of parts):
    a) 제19항에 정의된 약제학적 조성물, 및
    b) 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PD-1 경로 억제제, 또는 하기 화합물 1 내지 26 중 어느 하나 또는 이들 화합물 중 하나의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 SMAC 모방체:




    .
  29. 제19항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 PD-1 경로 억제제 또는 SMAC 모방체와 조합하여 사용되는, 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 상기 PD-1 경로 억제제 또는 상기 SMAC 모방체와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여되는, 약제학적 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 SMAC 모방체가 하기 화합물 1 내지 26 중 어느 하나 또는 이들 화합물 중 하나의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물:




    .
  32. 제29항에 있어서, 상기 PD-1 경로 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, PDR-001, PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 및 PD1-5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 상기 PD-1 경로 억제제 또는 상기 SMAC 모방체와 상이한 투여 경로를 통해 투여되는, 약제학적 조성물.
  34. 제29항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 종양내로 적어도 1회 투여되고, 상기 PD-1 경로 억제제 또는 상기 SMAC 모방체가 정맥내로 투여되는, 약제학적 조성물.
  35. 바이러스 생산 세포로서, 상기 세포가 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 재조합 수포성 구내염 바이러스를 생산하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 세포가 Vero 세포, HEK 세포, HEK293 세포, 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell: CHO) 또는 새끼 햄스터 신장 (baby hamster kidney: BHK) 세포인 것을 특징으로 하는, 바이러스 생산 세포.
  37. 적어도 하나의 CCL21 단백질을 이의 RNA 게놈에 인코딩하는 재조합 랍도바이러스로서, 상기 재조합 랍도바이러스의 RNA 게놈이 서열 번호 24와 동일한 코딩 서열로 이루어지는, 재조합 랍도바이러스.
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