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KR102738219B1 - Aav의 검출 방법 - Google Patents

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KR102738219B1
KR102738219B1 KR1020237017707A KR20237017707A KR102738219B1 KR 102738219 B1 KR102738219 B1 KR 102738219B1 KR 1020237017707 A KR1020237017707 A KR 1020237017707A KR 20237017707 A KR20237017707 A KR 20237017707A KR 102738219 B1 KR102738219 B1 KR 102738219B1
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린 리우
케이트 장
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젠자임 코포레이션
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Abstract

바이러스 입자의 혈청형을 결정하고/하거나, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 입자)의 이질성을 결정하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 AAV 입자의 이질성을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 캡시드 단백질의 아세틸화, 및/또는 탈아미드화를 증가시킴으로써, 안정성이 개선되고/되거나, 형질도입 효율이 개선된 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)를 제공한다.

Description

AAV의 검출 방법 {METHODS FOR DETECTING AAV}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 것으로, 2016년 8월 15일자로 출원된 미국 가출원 제 62/375,314호의 우선권 이익을 주장한다.
서열목록
ASCII 텍스트 파일의 다음의 제출물의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능 형식(CRF)(파일명: 159792014140SEQLIST.txt, 기록일: 2017년 8월 14일, 크기: 51 KB).
본 발명은, 예를 들어, 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS), 또는 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)을 사용하는 질량 결정법을 사용하여, 바이러스 입자(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자)의 혈청형을 분류하고/하거나, 이질성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 AAV 입자의 안정성을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
바이러스 캡시드 단백질(VP)이 바이러스 감염성에 중요하므로, 그의 서열 및 번역 후 변형을 포함하여, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)의 바이러스 캡시드 단백질의 완전한 특성화가 유전자 요법 연구 및 개발에 요망된다.
바이러스 벡터 산물 예컨대, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 산물은 통상적으로 핵산 전이유전자를 표적화하는 분자 툴을 사용하여 확인한다. 이들 방법은 전이유전자-특이적 서열을 표적화하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 기법을 포함할 수 있다. rAAV 기술이 발전함에 따라, 많은 연구소에서 표적화된 조직 방향성을 개선하기 위한 노력으로, 그의 치료용 전이 유전자를 인코딩하는 다수의 AAV 캡시드 혈청형을 연구하기 시작했다.
통상적인 분자 확인 방법은 고유한 전이유전자를 함유하는 산물을 확인하지만, 상이한 AAV 캡시드 혈청형을 가진 산물을 식별하지는 못한다. 현재, 대부분의 AAV 혈청형 동일성 시험은 SDS-PAGE 밴드 패턴, 항체 기반 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석을 기반으로 한다. 그러나, 밴드 패턴 및 항체는 상이한 AAV 혈청형을 구별하기에 충분하지 않다. Gel-LC/MS/MS가 캡시드 혈청형 확인 방법으로 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 방법은 SDS-PAGE, 겔 중 분해 및 LC/MS/MS를 포함하는 다수의 단계를 수반하므로, 분석에 수일이 소요되나, 제한된 서열 범위를 제공한다. rAAV 벡터와 같은 벡터를 확인하는 방법은 유전자 요법 벡터에 중요하다(예를 들어, 미국 특허 공보 제 US20110275529호 참조). 따라서, 바이러스 입자를 특성화하는 개선된 방법이 있는 것이 유용할 것이다.
특허 출원 및 공보물을 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
예로서, rAAV를 사용하여, 상이한 바이러스 캡시드 혈청형(예를 들어, rAAV 캡시드 혈청형)을 특이적으로 확인하기 위한 분석 툴로서 LC/MS의 용도가 본 명세서에 기재된다. 바이러스 특성화의 일부로서, LC/MS를 사용하여, 분자 확인 방법을 강화시킬 수 있다. 이러한 분석 조합은 산물의 치료용 전이유전자의 동일성, 및 캡시드 혈청형의 동일성 둘 모두를 식별함으로써, 조절 요건을 충족시킬 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 재조합 AAV 유전자 요법 개발에서 AAV 혈청형 동일성 시험으로서 또는 바이러스 캡시드 단백질 이질성을 모니터링하기 위해, 사용될 수 있다. 이는 또한, 캡시드 조작 연구에서 VP 서열을 확인하기 위해, 사용될 수 있다. 추가로, 이러한 기법을 사용하여, 형질감염 역가, 및 세포내 단백질 운반에 대한 바이러스 캡시드 단백질의 N-말단 아세틸화와 같은 번역 후 변형의 영향을 연구할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어, AAV 캡시드의 VP1 및/또는 VP3의 위치 2의 아미노산 잔기를 변이시켜, 위치 2의 아미노산이 야생형 AAV 캡시드와 비교하여, 더 높은 정도로 아세틸화되도록 함으로써, 더 큰 안정성 및/또는 개선된 형질도입 효율을 위한 AAV 입자를 설계할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법을 사용하여, 예를 들어, AAV 캡시드의 VP1 및/또는 VP3의 위치 2의 아미노산 잔기를 변이시켜, 위치 2의 아미노산이 야생형 AAV 캡시드와 비교하여, 더 높거나, 더 낮은 정도로 탈아세틸화되도록 함으로써, 형질도입 효율이 감소된 AAV 입자를 설계할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 바이러스 입자의 혈청형을 결정하는 방법으로서, a) 바이러스 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 바이러스 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS)에 적용하는 단계, 및 c) 바이러스 입자의 하나 이상의 캡시드 단백질의 질량을 결정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 캡시드 단백질의 질량의 특정 조합은 바이러스 혈청형의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 캡시드 단백질의 계산된 질량을 하나 이상의 바이러스 혈청형의 하나 이상의 캡시드 단백질의 이론적 질량과 비교한다.
일부 양태에서, 본 발명은 바이러스 입자의 이질성을 결정하는 방법으로서, a) 바이러스 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 바이러스 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석/질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, c) 바이러스 입자의 하나 이상의 캡시드 단백질의 질량을 결정하는 단계, 및 d) 단계 c)의 질량을 바이러스 혈청형의 하나 이상의 캡시드 단백질의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하고; 하나 이상의 캡시드 단백질의 질량 중 하나 이상의 편차는 바이러스 캡시드 이질성의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이질성은 혼합 혈청형, 변이체 캡시드, 캡시드 아미노산 치환, 절두된 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함한다.
상기 양태 중 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 이종성 전이유전자를 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명 바이러스 입자의 혈청형을 결정하는 방법으로서, a) 바이러스 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 바이러스 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계, c) 변성된 바이러스 입자를 분해에 적용하여, 바이러스 입자의 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편을 생성시키는 단계, d) 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, 및 e) 바이러스 입자의 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편의 질량을 결정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편의 질량의 특정 조합은 바이러스 혈청형의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편의 계산된 질량을 하나 이상의 바이러스 혈청형의 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편의 이론적 질량과 비교한다.
일부 양태에서, 본 발명은 바이러스 입자의 혈청형의 이질성을 결정하는 방법으로서, a) 바이러스 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 바이러스 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계, c) 변성된 바이러스 입자를 분해에 적용하여, 바이러스 입자의 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편을 생성시키는 단계, d) 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, e) 바이러스 입자의 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편의 질량을 결정하는 단계, 및 f) 단계 e)의 질량을 바이러스 혈청형의 하나 이상의 캡시드 단백질의 단편의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하고; 하나 이상의 캡시드 단백질의 질량 중 하나 이상의 편차는 바이러스 캡시드 이질성의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이질성은 혼합 혈청형, 변이체 캡시드, 캡시드 아미노산 치환, 절두된 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다.
본 명세서에 제시된 바와 같이, 이러한 방법은 겔 분리 단계(예를 들어, 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE))의 부재하에 수행될 수 있다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 이종성 전이유전자를 인코딩하는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 아데노바이러스(Adenoviridae), 파르보바이러스(Parvoviridae), 레트로바이러스(Retroviridae), 바쿨로바이러스(Baculoviridae), 및 헤르페스바이러스(Herpesviridae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스과에 속한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 앳아데노바이러스(Atadenovirus), 아비아데노바이러스(Aviadenovirus), 이트아데노바이러스(Ichtadenovirus), 매스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 시아데노바이러스(Siadenovirus), 암비덴소바이러스(Ambidensovirus), 브레비덴소바이러스(Brevidensovirus), 헤판덴소바이러스(Hepandensovirus), 이테라덴소바이러스(Iteradensovirus), 펜스틸덴소바이러스(Penstyldensovirus), 암도파르보바이러스(Amdoparvovirus), 아베파르보바이러스(Aveparvovirus), 보카파르보바이러스(Bocaparvovirus), 코피파르보바이러스(Copiparvovirus), 데펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus), 데리트로파르보바이러스(Erythroparvovirus), 프로토파르보바이러스(Protoparvovirus), 테트라파르보바이러스(Tetraparvovirus), 알파레트로바이러스(Alpharetrovirus), 베타레트로바이러스(Betaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 엡실론레트로바이러스(Epsilonretrovirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 스푸마바이러스(Spumavirus), 알파바쿨로바이러스(Alphabaculovirus), 베타바쿨로바이러스(Betabaculovirus), 델타바쿨로바이러스(Deltabaculovirus), 감마바쿨로바이러스(Gammabaculovirus), 일토바이러스(Iltovirus), 마르디바이러스(Mardivirus), 심플렉스바이러스(Simplexvirus), 바리셀로바이러스(Varicellovirus), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 무로메갈로바이러스(Muromegalovirus), 프로보스시바이러스(Proboscivirus), 로세올로바이러스(Roseolovirus), 림포크립토바이러스(Lymphocryptovirus), 마카바이러스(Macavirus), 페르카바이러스(Percavirus), 및 라디노바이러스(Rhadinovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스속에 속한다.
일부 양태에서, 본 발명은 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자의 혈청형을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS)에 적용하는 단계, 및 c) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 결정하는 단계를 포함하고, VP1, VP2, 및 VP3의 질량의 특정 조합은 AAV 혈청형의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, VP1, VP2, 및 VP3의 계산된 질량을 하나 이상의 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 이론적 질량과 비교한다.
일부 양태에서, 본 발명은 AAV 입자의 이질성을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석/질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, c) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 결정하는 단계, 및 d) 단계 c)의 질량을 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하고; VP1, VP2, 또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차는 AAV 캡시드 이질성의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이질성은 혼합 혈청형, 변이체 캡시드, 캡시드 아미노산 치환, 절두된 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, AAV 입자는 아세트산, 구아니딘염산 및/또는 유기 용매에 의해 변성된다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 액체 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피는 C4, 또는 C8 역상 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 물 중 포름산을 포함하는 이동상 A를 사용한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 약 0.1% 포름산을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 아세토니트릴 중 포름산을 포함하는 이동상 B를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 약 0.1% 포름산을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 이동상 B의 비율은 시간이 경과함에 따라 증가한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 이동상 B의 비율은 단계적 방식으로 증가한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 및 약 30% 내지 약 38% 증가한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 약 6분에 약 10% 내지 약 20%, 약 10분에 약 20% 내지 약 30%, 및 약 40분에 약 30% 내지 약 38% 증가한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)이다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 약 3.5 kV의 모세관 전압을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 약 45 V의 샘플링 콘 전압을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 보조 보정을 포함한다. 일부 구현예에서, 요오드화나트륨은 보정제로 사용된다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 N-말단은 아세틸화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 재조합 AAV(rAAV) 입자이다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, AAV LK03 캡시드, AAV2R471A 캡시드, AAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소과 동물 AAV 캡시드, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1(키메라 AAV/인간 보카바이러스 바이러스 1)을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, AAV LK03 캡시드, AAV2R471A 캡시드, AAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소과 동물 AAV 캡시드, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1(키메라 AAV/인간 보카바이러스 바이러스 1), AAV2HBKO 캡시드, AAVPHP.B 캡시드, 또는 AAVPHP.eB 캡시드 중 하나 이상의 이론적 질량과 비교한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR, 또는 AAV12 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자의 혈청형을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계, c) 변성된 AAV 입자를 분해에 적용시켜, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 생성시키는 단계, d) VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, 및 e) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계를 포함하고, VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량의 특정 조합은 AAV 혈청형의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편의 계산된 질량을 하나 이상의 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편의 이론적 질량과 비교한다.
일부 양태에서, 본 발명은 AAV 입자의 혈청형의 이질성을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계, c) 변성된 AAV 입자를 분해에 적용시켜, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 생성시키는 단계, d) VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, e) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계, 및 f) 단계 e)의 질량을 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하고; VP1, VP2, 또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차는 AAV 캡시드 이질성의 지표인 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이질성은 혼합 혈청형, 변이체 캡시드, 캡시드 아미노산 치환, 절두된 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 환원은 AAV 입자를 디티오프레이톨, 베타-머캅토에탄올, 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)에 적용함으로써, 이루어진다. 일부 구현예에서, 알킬화는 AAV 입자를 요오드아세트산, 요오드아세트아미드, 또는 4-비닐피리딘에 적용함으로써, 이루어진다. 일부 구현예에서, 분해는 효소적 분해, 또는 화학적 분해이다. 일부 구현예에서, 효소적 분해는 엔도펩티다제 분해이다. 일부 구현예에서, 효소적 분해는 트립신 분해, LysC 분해, Asp-N 분해, 또는 Glu-C 분해이다. 일부 구현예에서, 화학적 분해는 브롬화시안 분해, 또는 산 분해이다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 아세트산, 구아니딘염산 및/또는 유기 용매에 의해 변성된다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 액체 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 역상 크로마토그래피는 C18 역상 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 물 중 포름산을 포함하는 이동상 A를 사용한다. 일부 구현예에서, 이동상 A는 약 0.1% 포름산을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피는 아세토니트릴 중 포름산을 포함하는 이동상 B를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 약 0.1% 포름산을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피의 이동상 B의 비율은 시간이 경과함에 따라 증가한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 약 2% 내지 약 60% 증가한다. 일부 구현예에서, 이동상 B는 약 121분에 약 2% 내지 약 60% 증가한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 약 3.5 kV의 모세관 전압을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 약 45 V의 샘플링 콘 전압을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석은 보조 보정을 포함한다. 일부 구현예에서, 요오드화나트륨은 보정제로 사용된다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 N-말단은 아세틸화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 재조합 AAV(rAAV) 입자이다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, AAV LK03 캡시드, AAV2R471A 캡시드, AAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소과 동물 AAV 캡시드, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1(키메라 AAV/인간 보카바이러스 바이러스 1)을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, AAV LK03 캡시드, AAV2R471A 캡시드, AAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소과 동물 AAV 캡시드, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1(키메라 AAV/인간 보카바이러스 바이러스 1) 중 하나 이상의 이론적 질량과 비교한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR, 또는 AAV12 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하고; VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시키는 재조합 AAV(rAAV) 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 치환은 더 높은 빈도의 N-말단 아세틸화, 또는 더 낮은 빈도의 N-말단 아세틸화를 야기한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 VP1의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하고; VP1의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하고; VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기 2는 Ser, Asp, 또는 Glu에 의해 치환된다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B, 또는 AAVPHP.eB 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR, 또는 AAV12 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드, 및 AAV ITR은 동일한 혈청형으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드, 및 AAV ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 하나 이상의 AAV ITR에 측접된 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기-상보적 벡터이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 전이유전자를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 전이유전자의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열, 및 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포를 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공함으로써, 생성된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 바쿨로바이러스이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산을 포함하고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공하는 AAV 생성 세포에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, AAV 생성 세포는 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 AAV 생성 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 바쿨로바이러스이다. 일부 구현예에서, AAV cap 기능은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 제공하고, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV 입자, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV 입자, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 제품을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 모체 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하고; 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시키는 AAV 캡시드 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 치환은 더 높은 빈도의 N-말단 아세틸화, 또는 더 낮은 빈도의 N-말단 아세틸화를 야기한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 VP1, 또는 VP3이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2는 Ser, Asp, 또는 Glu에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 AAV 캡시드의 적은 탈아미드화를 야기한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B, 또는 AAVPHP.eB 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 추가로 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 모체 VP1 및/또는 VP3의, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2를 치환하는 단계를 포함하고; 아미노산 잔기 2의 치환은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2와 비교하여, VP1 및/또는 VP3의 N-말단 아세틸화를 변이시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 rAAV 입자의 조립을 개선시키는 방법으로서, VP1 및/또는 VP3, 또는 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함하고; 위치 2에서의 아미노산의 치환은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2와 비교하여, VP1 및/또는 VP3의 N-말단 아세틸화를 변이시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법으로서, VP1 및/또는 VP3, 또는 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함하고; 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2와 비교하여, VP1 및/또는 VP3의 N-말단 아세틸화를 변이시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치환된 아미노산은 더 높은 빈도의 N-말단 아세틸화, 또는 더 낮은 빈도의 N-말단 아세틸화를 야기한다. 일부 구현예에서, VP1의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 치환된다. 일부 구현예에서, VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기 2는 Ser, Asp, 또는 Glu에 의해 치환된다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포에서 rAAV 입자의 형질도입을 감소시키는 방법으로서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함하고; 위치 2에서 치환된 아미노산은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2와 비교하여, VP1 및/또는 VP3의 N-말단 아세틸화를 변이시키는 방법을 제공한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B, 또는 AAVPHP.eB 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 추가로 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR, 또는 AAV12 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드, 및 AAV ITR은 동일한 혈청형으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드, 및 AAV ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 하나 이상의 AAV ITR에 측접된 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기-상보적 벡터이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 전이유전자를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 전이유전자의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열, 및 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포를 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공함으로써, 생성된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 바쿨로바이러스이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산을 포함하고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공하는 AAV 생성 세포에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, AAV 생성 세포는 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 AAV 생성 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 바쿨로바이러스이다. 일부 구현예에서, AAV cap 기능은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 제공하고, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다.
일부 양태에서, 본 발명은 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, 모체 입자의 VP1, 또는 VP3의 아미노산 잔기 A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 재조합 AAV(rAAV) 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 VP1의 아미노산 잔기 A35, N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716에서 이루어지고, 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 VP1의 N57, VP3의 N382, VP3의 N511, 또는 VP3의 N715에서 Asp에 의한 치환을 포함하고; 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N57K, 또는 N57Q 치환을 포함하고, 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 VP1의 A35에서의 Asp에 의한 치환을 포함하고, 모체 AAV 입자의 VP1의 탈아미드화와 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 VP1의 G58, VP3의 G383, VP3의 G512, 또는 VP3의 G716에서 이루어지고, 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 일부 구현예에서, VP1의 G58은 Asp에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 입자, 또는 AAV2 입자이다.
일부 양태에서, 본 발명은 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, VP1, 또는 VP3의 아미노산 잔기 A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 AAV 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 AAV 입자, 또는 AAV 입자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트로서, AAV 입자는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, VP1, 또는 VP3의 아미노산 잔기 A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 AAV 입자, 또는 AAV 입자를 포함하는 조성물을 포함하는 제품으로서, AAV 입자는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, VP1, 또는 VP3의 아미노산 잔기 A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 제품을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 모체 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질로서; 아미노산 치환은 모체 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 캡시드의 탈아미드화를 변이시키는 AAV 캡시드 단백질을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 잔기는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716이고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 rAAV 입자의 조립을 개선시키는 방법으로서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 잔기는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716이고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법으로서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 잔기는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716이고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716에서 이루어지고; 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, VP1의 위치 35에서의 모체 Ala 잔기는 Asn에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, VP1의 위치 58에서의 모체 Gly 잔기는 Asp에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 입자, 또는 AAV2 입자이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 rAAV 입자의 안정성, 조립 및/또는 형질도입 효율을 개선하는 방법으로서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 잔기는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716이고, 아미노산 치환은 상기에 기재된 바와 같은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키며, AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 추가로 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR, 또는 AAV12 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드, 및 AAV ITR은 동일한 혈청형으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드, 및 AAV ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 하나 이상의 AAV ITR에 측접된 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기-상보적 벡터이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 전이유전자를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 전이유전자의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열, 및 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포를 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공함으로써, 생성된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 바쿨로바이러스이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산을 포함하고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공하는 AAV 생성 세포에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, AAV 생성 세포는 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 AAV 생성 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써, 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 바쿨로바이러스이다. 일부 구현예에서, AAV cap 기능은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 치환을 제공하고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자와 비교하여, 캡시드의 탈아미드화를 조절한다.
도 1a 내지 도 1d는 AAV2 VP의 LC/MS의 전체 이온 크로마토그램을 제공한다. 도 1a: 1.7%/min 구배에 의한 10 cm 길이의 BEH C4 컬럼, 도 1b: 0.5%/min 구배에 의한 10 cm 길이의 BEH C4 컬럼; 도 1c: 0.5%/min 구배에 의한 15 cm 길이의 BEH C4 컬럼, 도 1d: 0.5%/min 구배에 의한 15 cm 길이의 BEH C8 컬럼.
도 2a 및 2b는 도 1d 피크 1(도 2a), 및 도 1d 피크 2(도 2b)로부터의 디콘볼루션(deconvolution)된 질량 스펙트럼을 제공한다.
도 3은 AAV2 VP1(SEQ ID NO:3)의 서열 범위를 제공한다: 녹색, 트립신에 의한 펩타이드, 청색, Lys-C 펩타이드, 분홍색, Asp-N 펩타이드.
도 4a 내지 도 4c는 AAV2 VP N-말단 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼을 제공한다. 도 4a: VP1 N-말단 트립신에 의한 펩타이드 A(Ac)ADGYLPDWLEDTLSEGIR(SEQ ID NO: 4), 도 4b VP2 N-말단 Asp-N 펩타이드 APGKKRPVEHSPVEP (SEQ ID NO: 15). 도 4c: VP-3 N-말단 Asp-N 유래 펩타이드 A(Ac)TGSGAPM (SEQ ID NO: 5).
도 5는 13개의 AAV 혈청형의 서열 정렬을 제공한다: 흑색 문자/백색 백그라운드: 비 유사; 청색 문자/청색 백그라운드: 보존적; 흑색 문자/녹색 백그라운드: 유사 블록; 적색 문자/황색 백그라운드: 동일; 녹색 문자/백색 백그라운드: 미세하게 유사. AAVRh10(SEQ ID NO: 17); AAV10(SEQ ID NO: 18); AAV8 (SEQ ID NO: 19); AAV7(SEQ ID NO: 20); AAV1(SEQ ID NO: 21); AAV6(SEQ ID NO: 22); AAV2(SEQ ID NO: 23); AAV3(SEQ ID NO: 24); AAV11(SEQ ID NO: 25); AAV12(SEQ ID NO: 26); AAV4(SEQ ID NO: 27); AAV5(SEQ ID NO: 28); AAV9(SEQ ID NO: 29); 공통(SEQ ID NO: 30).
도 6a 및 6b는 TTx, 및 PCL 방법에 의해 생성된 AAV1, 및 AAV2 입자의 탈아미드화의 백분율을 비교하는 LC/MS/MS 분석의 결과를 도시한다. T9 펩타이드 YLGPF NG LDK(SEQ ID NO: 9)를 사용하여, AAV1, 및 AAV2 둘 모두에서의 잠재적 탈아미드화 부위 N57을 모니터링하였다.
도 7a 및 7b은 TTx, 및 PCL 방법에 의해 생성된 AAV1, 및 AAV2 입자의 탈아미드화의 백분율을 비교하는 LC/MS/MS 분석의 결과를 도시한다. T49 펩타이드 YNL NG R(SEQ ID NO: 11), 및 YHL NG R(SEQ ID NO: 12)를 사용하여, 각각 AAV1, 및 AAV2에서의 잠재적 탈아미드화 부위 N511을 모니터링하였다.
도 8a 및 8b는 TTx, 및 PCL 방법에 의해 생성된 AAV1, 및 AAV2 입자의 탈아미드화의 백분율을 비교하는 LC/MS/MS 분석의 결과를 도시한다. T67 펩타이드 SANVDFTVDN NG LYTEPR(SEQ ID NO: 13), 및 SVNVDFTVDT NG VYSEPR(SEQ ID NO: 14)를 사용하여, 각각 AAV1, 및 AAV2에서의 잠재적 탈아미드화 부위 N715을 모니터링하였다.
도 9는 AAV5 탈아세틸화된 돌연변이 변이체의 생성, 및 VP1:VP2:VP3 비율의 SYPRO 단백질 겔 분석의 결과를 도시한다.
도 10은 AAV5 탈아세틸화된 변이체의 형질도입 효율을 시험하기 위한 시험관내 형질도입 분석을 예시한다.
도 11은 벡터 게놈 카피/μg 단백질에 의해 측정된 바와 같은 지정된 AAV5 탈아세틸화된 변이체, 또는 비 변형된 모체 AAV5에 의한 세포 유입 효율을 도시한다. 3개의 세포주 293, HeLa, 및 HuH7을 사용하였다.
도 12는 비 변형된 모체 AAV5에 의한 형질도입과 비교하여, 지정된 AAV5 탈아세틸화된 변이체로 형질도입된 세포에 의한 eGFP 발현(ELISA에 의해 측정된 바와 같음)을 도시한다. 3개의 세포주 293, HeLa, 및 HuH7을 사용하였다.
도 13은 AAV2의 보존된 N57G58 탈아미드화 부위, 및 A35 잔기가 강조 표시된 13개의 AAV 혈청형의 서열 정렬을 제공한다. AAVRh10(SEQ ID NO: 31); AAV10(SEQ ID NO: 31); AAV8(SEQ ID NO: 32); AAV7(SEQ ID NO: 33); AAV1(SEQ ID NO: 31); AAV6(SEQ ID NO: 31); AAV2(SEQ ID NO: 34); AAV3(SEQ ID NO: 35); AAV11(SEQ ID NO: 31); AAV12(SEQ ID NO: 36); AAV4(SEQ ID NO: 37); AAV5(SEQ ID NO: 38); AAV9(SEQ ID NO: 39); 공통(SEQ ID NO: 40).
도 14는 PCL, 또는 TTx 방법에 의해 생성된 AAV1, 또는 AAV2 입자로부터의 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질의 단백질 겔을 도시한다. *절두된 VP1(tVP1) 단백질의 강조 표시.
도 15는 대조군 AAV2 캡시드와 비교하여, 지정된 AAV2 돌연변이의 탈아미드화의 LC/MS 분석의 결과를 도시한다.
도 16은 AAV2 탈아미드화 돌연변이 변이체의 생성, 및 VP1:VP2:VP3 비율의 SYPRO 단백질 겔 분석의 결과를 도시한다.
도 17은 AAV2 탈아미드화 변이체의 형질도입 효율을 시험하기 위한 시험관내 형질도입 분석을 예시한다.
도 18은 벡터 게놈 카피/μg 단백질에 의해 측정된 바와 같은 지정된 AAV2 탈아미드화 변이체, 또는 비 변형된 모체 AAV2의 세포 유입 효율을 도시한다. 3개의 세포주 293, HeLa, 및 HuH7을 사용하였다.
도 19는 비 변형된 모체 AAV2에 의한 형질도입과 비교하여, 지정된 AAV2 탈아미드화 변이체로 형질도입된 세포에 의한 eGFP 발현(ELISA에 의해 측정된 바와 같음)을 도시한다. 3개의 세포주 293, HeLa, 및 HuH7을 사용하였다.
일부 양태에서, 본 발명은 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자(들)의 혈청형을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS)에 적용하는 단계, 및 c) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 결정하는 단계를 포함하고, VP1, VP2, 및 VP3의 질량의 특정 조합은 AAV 혈청형의 지표인 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 AAV 입자의 이질성을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS)에 적용하는 단계, 및 c) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 결정하는 단계, 및 단계 c)의 질량을 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하고; VP1, VP2, 또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차는 AAV 캡시드 이질성의 지표인 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자의 혈청형을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계, c) 변성된 AAV 입자를 분해에 적용하여, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 생성시키는 단계, d) VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, 및 e) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계를 포함하고, VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량의 특정 조합은 AAV 혈청형의 지표인 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 혈청형의 AAV 입자의 이질성을 결정하는 방법으로서, a) AAV 입자를 변성시키는 단계, b) 변성된 AAV 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계, c) 변성된 AAV 입자를 분해에 적용하여, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 생성시키는 단계, d) VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계, e) AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계, 및 f) 단계 e)의 질량을 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함하고; VP1, VP2, 또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차는 AAV 캡시드 이질성의 지표인 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하고; VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시키는 재조합 AAV(rAAV) 입자를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 rAAV 입자의 조립을 개선시키는 방법으로서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함하고; 위치 2에서 치환된 아미노산은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2보다 더 높은 빈도로 N-아세틸화되는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법으로서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함하고; 위치 2에서 치환된 아미노산은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2보다 더 높은 빈도로 N-아세틸화되는 방법을 제공한다.
I. 일반 기법
본 명세서에 기재되거나 참조된 기법 및 절차는 일반적으로 잘 이해되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011]에 기재되어 있고, 광범위하게 사용되는 방법론과 같이, 당업자에게 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 활용된다.
II. 정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "벡터"는 시험관내, 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드, 또는 바이러스를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은 리보뉴클레오타이드, 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA, 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린, 및 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 다른 천연, 화학 또는 생화학적으로 변형된 비 천연의 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 핵산의 백본은 당 및 인산기(통상적으로 RNA 또는 DNA에 존재할 수 있는 바와 같음), 또는 변형되거나, 치환된 당 또는 인산기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산의 백본은 포스포르아미데이트와 같은 합성 하위단위의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서, 올리고데옥시뉴클레오사이드 포스포르아미데이트 (P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 추가로, 적절한 조건하에 상보적 가닥을 합성하고, 가닥을 어닐링하거나, 적절한 프라이머와 적절한 DNA 중합효소를 사용하여, 상보적 가닥을 새로 합성함으로써, 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 산물로부터 이중 가닥 핵산을 얻을 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 상호 혼용되어 사용되고, 최소 길이로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비 천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 아미노산 잔기의 펩타이드, 올리고펩타이드, 이량체, 삼량체 및 다량체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전장 단백질 및 그 단편은 둘 모두 본 정의에 포괄된다. 이 용어는 또한 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 추가로, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩타이드"는 단백질이 요망되는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 결실, 부가 및 치환(본질 상 일반적으로 보존적임)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이들 변형은 부위 특이적 돌연변이 유발을 통해 의도적으로 이루어지거나, PCR 증폭에 의한 오류 또는 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한 경우와 같이 우연히 발생할 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 서열(즉, 바이러스 유래의 것이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나, 예를 들어, 2개의 역위 말단 반복 서열(ITR)에 측접되어 있다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의, 예를 들어, 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)에 측접된 하나 이상의 이종성 서열(즉, AAV 유래의 것이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는 적합한 보조 바이러스(또는 적합한 보조 기능을 발현하는 것)에 의해 감염되고, AAV rep, 및 cap 유전자 산물(즉, AAV Rep, 및 cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재하는 경우, 복제되어, 감염 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오타이드 내(예를 들어, 염색체 내 또는 또 다른 벡터, 예컨대 클로닝 또는 형질감염에 사용되는 플라스미드 내)에 혼입된 후, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능, 및 적합한 보조 기능의 존재하에 복제 및 캡시드화에 의해, "구조"될 수 있는 "프로-벡터"로서 지칭할 수 있다. rAAV 벡터는 지질과 복합체화되고, 리포솜 내에 캡슐화되고, 구현예에서, 바이러스 입자, 특히 AAV 입자 내에 캡시드화된 인공 선형 염색체인 플라스미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 형태 중 어느 하나일 수 있다. rAAV 벡터를 AAV 바이러스 캡시드 내에 패키징하여, "재조합 아데노-연관 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성시킬 수 있다.
"rAAV 바이러스", 또는 "rAAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질, 및 캡시드화된 rAAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "모체 AAV 입자", 및 "모체 AAV 캡시드 단백질"은 N-아세틸화, 및/또는 탈아미드화와 비교하는 경우, 아미노산 변형이 도입되어, N-아세틸화, 및/또는 탈아미드화가 조절된 AAV 입자, 또는 캡시드 단백질(예를 들어, 본 발명의 AAV 입자/캡시드와 동일하거나, 유사하나, 본 명세서에 기재된 바와 같이, N-아세틸화, 및/또는 탈아미드화를 조절/변이시키는 돌연변이를 포함하지 않는 AAV 입자/캡시드 단백질)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 모체 AAV 입자는 재조합 AAV 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자이다. 일부 구현예에서, 모체 AAV 캡시드 입자, 또는 모체 AAV 캡시드 단백질은 AAV 입자의 다른 양태에 영향을 주는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 모체 AAV 입자는 AAV와 그의 수용체의 결합에 영향을 주는 아미노산 치환, 예컨대, AAV2와 헤파린 황산프로테오글리칸(예를 들어, AAV2 HBKO 입자)의 결합에 영향을 주는 것을 포함할 수 있다. AAV2 HBKO 입자는 N-아세틸화, 및/또는 탈아미드화를 조절하는 아미노산 치환이 도입되도록 돌연변이될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 그 후, 이러한 돌연변이된 AAV 입자는 본 발명의 양태에서, 모체 AAV2 HBKO 입자와 비교할 수 있다. 모체 AAV 캡시드 단백질은 모체 VP1 캡시드 단백질, 모체 VP2 캡시드 단백질, 또는 VP3 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 모체 분자와 관련하여, 용어 "조절하다", 또는 "변이시키다"는 모체 분자의 특성의 변화를 의미한다. 예를 들어, N-아세틸화가 변이된 AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 증가되거나, 저하된 N-아세틸화를 나타낼 수 있으며, 탈아미드화가 변이된 AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 증가되거나, 저하된 탈아미드화를 나타낼 수 있다.
"이종성"은 비교되거나, 도입되거나, 혼입되는 객체의 나머지와 유전자형이 상이한 객체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 조작 기법에 의해, 상이한 세포 유형으로 도입된 핵산은 이종성 핵산이다(그리고, 발현되는 경우, 이종성 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있음). 유사하게는, 바이러스 벡터 내로 혼입된 세포 서열(예를 들어, 유전자, 또는 그의 일부분)은 벡터와 관련하여, 이종성 뉴클레오타이드 서열이다.
용어 "전이유전자"는 세포 내로 도입되어, 적절한 조건하에서 RNA로 전사되고, 선택적으로, 번역되고/되거나, 발현되는 핵산을 지칭한다. 양태에서, 이는 도입된 세포에 요망되는 특성을 부여하거나, 달리는, 요망되는 치료 또는 진단 결과를 야기한다. 또 다른 양태에서, 이는 RNA 간섭을 매개하는 분자, 예컨대, siRNA로 전사될 수 있다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "게놈 입자(gp)", "게놈 균등물", 또는 "게놈 카피"는 감염성, 또는 기능성과 관계없이, 재조합 AAV DNA 게놈을 함유하는 비리온의 수를 지칭한다. 특정 벡터 제조물 내의 게놈 입자의 수는 본 명세서의 실시예 또는, 예를 들어 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278]에 에 기재된 것과 같은 절차에 의해 측정할 수 있다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자", 또는 "복제 단위"는 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이, 복제 중심 분석으로도 일컬어지는 감염성 중심 분석에 의해 측정되는 바와 같은 감염성의 복제-가능 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본 명세서의 실시예 또는, 예를 들어, 문헌[Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; or in Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU assay)]에 기재된 것과 같은 기능성 분석에서 측정되는 바와 같이, 기능성 전이유전자 산물의 생성을 유발하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
"역위 말단 반복", 또는 "ITR" 서열은 당 업계에서 잘 정립되어 있는 용어이며, 반대 방향의 바이러스 게놈의 말단에 존재하는 비교적 짧은 서열을 지칭한다.
당 업계에서 잘 정립되어 있는 용어인 "AAV 역위 말단 반복(ITR)" 서열은 천연 단일 가닥 AAV 게놈의 두 말단 모두에 존재하는 대략 145개의 뉴클레오타이드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오타이드는 2개의 다른 방향 중 어느 하나에 존재할 수 있으며, 상이한 AAV 게놈 사이 및 단일 AAV 게놈의 두 말단 사이에 이질성을 야기할 수 있다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오타이드는 또한 이러한 ITR 부분 내에 가닥내 염기쌍을 발생시킬 수 있는 수개의 더 짧은 자기-상보성 영역(A, A', B, B', C, C', 및 D 영역으로 지칭됨)을 함유한다.
"말단 분해 서열", 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 동안 AAV rep 단백질에 의해 절단되는 AAV ITR의 D 영역의 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의한 절단에 내성이다. "AAV 보조 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되어, 패키징될 수 있도록 하는 기능을 지칭한다. AAV 보조 기능은 AAV 복제, 및 패키징을 보조하는 보조 바이러스, 또는 보조 바이러스 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 형태 중 임의의 형태로 제공될 수 있다. 유전자독성 제제와 같은 다른 AAV 보조 기능은 당 업계에 공지되어 있다.
"AAV 보조 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되어, 패키징될 수 있도록 하는 기능을 지칭한다. AAV 보조 기능은 AAV 복제, 및 패키징을 보조하는 보조 바이러스, 또는 보조 바이러스 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 형태 중 임의의 형태로 제공될 수 있다. 유전자독성 제제와 같은 다른 AAV 보조 기능은 당 업계에 공지되어 있다.
AAV의 "보조 바이러스"는 AAV(결함이 있는 파르보바이러스)가 숙주 세포에 의해 복제되어, 패키징될 수 있도록 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스 예컨대, 백시니아, 및 바쿨로바이러스를 포함하여, 다수의 이러한 보조 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 하위그룹 C의 아데노바이러스 유형 5(Ad5)가 가장 통상적으로 사용되기는 하나, 아데노바이러스는 다수의 상이한 하위그룹을 포괄한다. 인간, 비 인간 포유류, 및 조류 유래의 다수의 아데노바이러스가 공지되어 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 이용 가능하다. 또한, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 이용 가능한 헤르페스 바이러스과는, 예를 들어, 단순 포진 바이러스(HSV), 엡스테인-바르 바이러스(EBV), 시토메갈로바이러스(CMV), 및 위광견병 바이러스(PRV)를 포함한다. 기탁기관으로부터 이용 가능한 바쿨로바이러스는 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다면체형성 바이러스를 포함한다.
기준 폴리펩타이드, 또는 핵산 서열과 관련하여, "서열 동일성 퍼센트(%)"는 가능한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위한 서열 정렬 및 갭의 도입 후, 기준 폴리펩타이드, 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기, 또는 뉴클레오타이드와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기, 또는 뉴클레오타이드의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 상정되지 않는다. 아미노산, 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하여, 예를 들어, 문헌[(Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것과 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 당 업계의 기술 내의 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 가능한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, 펜실베니아 소재)이다. 당업자는 비교되는 전장의 서열에 걸쳐, 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 본 명세서의 목적을 위해, 지정 아미노산 서열 B에 대해, 이에 의해, 또는 이와 관련하여, 지정 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(대안적으로는, 지정 아미노산 서열 B에 대해, 이에 의해, 또는 이와 관련하여, 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나, 이를 포함하는 지정 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산한다: 100 x X/Y 분율(X는 A, 및 B의 프로그램 정렬시, 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매칭으로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 총 아미노산 잔기 수임). 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않으며, A 대 B의 아미노산 서열 동일성 %는 B 대 A의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 본 명세서의 목적을 위해, 지정 핵산 서열 D에 대해, 이에 의해, 또는 이와 관련하여, 지정 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(대안적으로는, 지정 아미노산 서열 D에 대해, 이에 의해, 또는 이와 관련하여, 특정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나, 이를 포함하는 지정 아미노산 서열 C로서 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산한다: 100 x W/Z 분율(W는 C, 및 D의 프로그램 정렬시, 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매칭으로 스코어링된 뉴클레오타이드의 수이며, Z는 D의 총 뉴클레오타이드 수임). 핵산 서열 C의 길이는 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않으며, C 대 D의 핵산 서열 동일성 %는 D 대 C의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
"단리된" 분자(예를 들어, 핵산, 또는 단백질), 또는 세포는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리되고/되거나, 회수된 것을 의미한다.
"질량 분광분석"은 기체상 이온의 존재량 및 질량 대 전하 비율을 측정함으로써, 화합물(예를 들어, 폴리펩타이드)의 양 및/또는 유형을 확인하는 분석화학적 기법을 지칭한다. 용어 "질량 분광분석"은 본 명세서에서 상호 혼용되어 사용될 수 있다.
AAV 캡시드와 관련하여 사용되는 경우, "이질성"은 하나 이상의 캡시드 폴리펩타이드가 VP1, VP2, 및/또는 VP3 폴리펩타이드, 또는 그의 단편의 기준 질량으로부터 편향된 것으로 관찰되는 것을 특징으로 하는 AAV 캡시드를 지칭한다. 기준 질량은, 제한 없이, 예를 들어, 공지된 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 폴리펩타이드의 이론적 질량, 예측 질량 또는 기대 질량을 포함할 수 있다. 예를 들어, AAV 캡시드는 다음의 특성(제한 없이): 혼합 혈청형, 변이체 캡시드, 캡시드 아미노산 치환, 절두된 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 나타내는 경우, 이질성을 나타낸다고 언급될 수 있다.
본 명세서에서 "약" 값, 또는 매개변수에 대한 언급은 값, 또는 매개변수 자체에 대한 구현예를 포함(및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"로 언급된 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 관사("a", "an", 및 "the")는 달리 지정되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 발명의 양태, 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는", "이로 이루어진" 및/또는 "이로 필수적으로 이루어진"을 포함하는 것으로 이해된다.
III. 방법
본 개시내용의 특정 양태는 바이러스 입자의 혈청형을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양태는 바이러스 입자의 이질성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 하기에 기재된 바와 같이, 각각의 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 정확한 질량은 고유하며, 이를 사용하여, AAV 캡시드 혈청형을 확인하거나, 구별할 수 있다. 이들 방법은 부분적으로, 무손상 단백질 수준에서 정확한 질량을 측정하여, 변성 후, 상이한 유형의 AAV의 직접 LC/MS를 사용하여, 단백질 서열 및 번역 후 변형을 모니터링할 수 있다는 본 명세서에 기재된 발견을 기반으로 한다. 추가로, VP1, 및 VP3의 N-말단의 아세틸화가 또한 상이한 AAV 혈청형에서 확인되고/되거나, 모니터링될 수 있다. 이들 AAV 결과, 및 본 명세서에 제공되는 지침을 기반으로 하여, 이러한 방법은 본 개시내용의 다양한 바이러스, 예를 들어, 바이러스 과, 아과, 및 속의 프로파일링에 용이하게 적용될 수 있는 것으로 사료된다. 본 개시내용의 방법은, 예를 들어, VP 프로파일링시, VP 발현, 번역 후 변형 및 절두를 모니터링하고, VLP 생성 동안 산물의 일관성을 보장하고, 캡시드 단백질 조작 적용시 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 구조적 특성을 확인하고/하거나, 바이러스 입자 또는 제조물의 이질성을 모니터링하거나, 검출하기 위해, 사용될 수 있음을 인식할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 입자를 변성시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자와 같은 바이러스 입자는 세척제, 열, 고염 또는 저 pH 또는 고 pH의 완충액을 사용하여 변성될 수 있다. 특정 구현예에서, AAV 입자는 아세트산 또는 구아니딘 염산을 사용하여 변성될 수 있다. 당업자는 단백질 변성의 촉진 및/또는 모니터링에 유용한 다양한 방법이 당 업계에 이용 가능하며, 액체 크로마토그래피/질량 분광분석과 상호 호환 가능한 변성 방법을 적절하게 선택할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 열 변성이 사용되는 경우, 단백질 침전 및 역상 컬럼의 폐쇄를 피하기 위해 주의를 기울여야 할 수 있다. 유사하게, 고염 변성은 LC/MS, 또는 LC/MS/MS 이전에 탈염 단계와 연동될 수 있다. 다른 구현예에서, 고 pH 변성, 저 pH 변성, 또는 유기 용매를 사용한 변성이 사용된다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 본 개시내용의 변성된 바이러스 입자를 액체 크로마토그래피/질량 분광분석(LC/MS)에 적용하는 단계를 포함한다. 당 업계에 공지된 바와 같이, LC/MS는 액체 크로마토그래피를 사용하여, 이온을 물리적으로 분리하고, 질량 분광분석을 사용하여, 이온으로부터 질량 스펙트럼 데이터를 생성한다. 이러한 질량 스펙트럼 데이터를 사용하여, 예를 들어 분자량 또는 구조, 질량, 양, 순도 등에 의한 입자의 확인을 결정할 수 있다. 이들 데이터는 시간(예를 들어, 보유 시간)에 따른 신호 강도(예를 들어, 존재량) 또는 질량 대 전하 비율에 대한 상대적 존재량과 같은 검출 이온의 특성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨)는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC; 용어 "초고성능 액체 크로마토그래피" 또는 UHPLC는 본 명세서에서 상호 혼용되어 사용될 수 있음)이다. UPLC는 당 업계에서, 크로마토그래피 분해능, 효율, 피크 용량 및 감응성을 개선시키기 위해 감소된 입자 크기(예를 들어, 2 μm 미만) 및 증가된 유속에 의한 컬럼을 사용하는 LC 기법으로 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Plumb, R. et al. (2004) Rapid Commun. Mass Spectrom. 18:2331-2337] 참조). 일부 구현예에서, UPLC는 액체 크로마토그래피에서 2 μm 미만의 입자 크기에 의한 컬럼의 사용을 지칭한다. 일부 구현예에서, UPLC는 액체 크로마토그래피에서 (예를 들어, 6000 psi 이상으로 작동할 때 관찰되는 바와 같이) 높은 선형 용매 속도의 사용을 지칭한다. 예시적인 UPLC 장치는 시판용으로 이용 가능하다(예를 들어, Waters의 ACQUITY UPLC®, MA, Milford 소재).
일부 구현예에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨)은 전기 분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS)을 지칭할 수 있다. ESI-MS는 질량 분광분석을 사용하여 용액으로부터 유래된 이온을 분석하기 위해 전기 에너지를 사용하는 기법으로서 당 업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Yamashita, M. and Fenn, J.B. (1984) J. Phys. Chem. 88:4451-4459] 참조). 이온 종(또는 용액 또는 기체상에서 이온화되는 중성 종)을 대전된 액적의 연무 형태의 분산에 의해, 용액으로부터 기체상으로 이동시킨 다음, 용매를 증발시켜, 용액이 접지(예를 들어, 챔버의 외벽)에 대한 상대 전압을 갖는 작은 모세관을 통과할 때, 대전된 액적의 크기 및 대전된 액적으로부터의 샘플 이온 방출을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모세관 전압은 약 2 kV 내지 약 10 kV, 또는 약 2.5 kV 내지 약 6.0 kV이다. 특정 구현예에서, 액체 크로마토그래피(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨)는 약 3.5 kV의 모세관 전압을 사용한다. 일부 구현예에서, 모세관 전압은 약 1 kV 내지 약 10 kV의 범위이다. 다른 구현예에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨)은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)를 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨)은, 이온이 분석기에 유입되기 전에 통과할 수 있는 샘플링 콘 및/또는 스키머(skimmer)를 사용한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이, 모세관에 전압을 적용하는 경우, 샘플 콘은 모세관 전압보다 더 낮은 전압에서 유지시킨다. 특정 구현예에서, 액체 크로마토그래피(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨)는 약 45 V의 샘플링 콘 전압을 사용한다. 일부 구현예에서, 샘플링 콘 전압은 약 0 V 내지 약 200 V의 범위이다.
일부 구현예에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS에 사용됨) 보조 보정을 사용한다. 질량 분광분석과 관련하여 사용되는 경우, 보정은 질량 검출(예를 들어, m/z 측정)과 관련하여, 장치를 보정할 목적으로, 소정의 질량(예를 들어, 표준)을 갖는 하나 이상의 화합물의 도입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 보조 보정은 소정의 표준(예를 들어, 보정제)의 피크 및/또는 위치와 특정한 질량 대 전하(m/z) 비율의 상관관계를 밝히기 위해, 소프트웨어를 사용하는 것을 지칭할 수 있다. 보정되면, 그 후, 사용자는, 예를 들어, 이전의 또는 공지된 실험 조건과 비교하여, 특정 정확도 또는 오류 및/또는 요망되는 수준의 재생성 내에서 하나 이상의 미지의 화합물 또는 미지의 함량 비율로 존재하는 화합물을 가진 샘플에 대해, 질량 분광분석을 수행할 수 있다. 제한 없이, 요오드화나트륨, 요오드화나트륨세슘, 폴리에틸렌 글리콜 및 퍼플루오로트리부틸아민을 포함하여, 다양한 보정제가 당 업계에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 요오드화나트륨은 보정제로 사용된다. 일부 구현예에서, 보정제는 LC/MS 조작 동안 질량을 고정시키는 Glu-1- 피브리노펩타이드 B 및 류신 엔세팔린 펩타이드이다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 본 개시내용의 변성된 바이러스 입자, 또는 변성된 바이러스 입자의 분해 단편을 액체 크로마토그래피/질량 분광분석-질량 분광분석(LC/MS/MS)에 적용하는 단계를 포함한다. 당 업계에 공지된 바와 같이, LC/MS/MS(용어 "액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석"은 본 명세서에서 상호 혼용되어 사용될 수 있음)는 이온의 물리적 분리를 위한 액체 크로마토그래피 및 이온으로부터의 질량 스펙트럼 데이터의 생성을 위한 질량 분광분석을 사용하고, 질량 분광분석은 다중 단계의 질량(예를 들어, m/z) 분리를 사용하며, 이는 통상적으로 단편화 단계로 분리된다. 예를 들어, m/z의 범위 내의 대상 이온을 제1 MS 라운드에서 분리하여, 단편화한 후, 제2 MS 라운드에서 개별 m/z를 기반으로 하여, 추가로 분리할 수 있다. 이온 단편화는 제한 없이, 충돌 유도 해리(CID), 고 에너지 충돌 해리(HCD), 전자 포획 해리(ECD) 또는 전자 전달 해리(ETD)와 같은 기법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 본 개시내용의 변성된 바이러스 입자를 환원, 및/또는 알킬화에 적용하는 단계를 포함한다. 바이러스 입자를 환원시키는 수단은 디티오트레이톨, β 머캅토에탄올 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)에 의한 처리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 입자를 알킬화시키는 수단은 요오드아세트산, 요오드아세트아미드, 또는 4-비닐피리딘에 의한 AAV 입자의 처리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 본 개시내용의 변성된 바이러스 입자를 분해에 적용하여, 예를 들어, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 생성하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 변성된 AAV 입자를 분해에 적용하여, 예를 들어, 분리용 LC 및 분석용 MS/MS를 사용하여, 분석할 수 있는 펩타이드 단편을 생성할 수 있다(더 자세한 기재내용을 위해 하기 참조). 일부 구현예에서, 분해는 효소적 분해이다. 일부 구현예에서, 분해는 장치 단편화의 CNBr 처리(예를 들어, 하향식)와 같은 화학적 분해를 사용한다. 일부 구현예에서, 분해는 산 분해와 같은 화학적 분해를 사용한다.
일부 구현예에서, 효소적 분해는 엔도펩티다제 분해이다. 엔도펩티다제는 폴리펩타이드의 비 말단 아미노산의 펩타이드 결합의 단백질 가수분해를 촉매하는 임의의 펩티다제를 포함할 수 있다. 공지된 엔도펩티다제는 제한 없이, 트립신, 키모트립신, AspN, Glu-C, LysC, 펩신, 써모리신, 글루타밀 엔도펩티다제, 엘라스타제 및 네프릴리신을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 효소적 분해는 트립신 분해, 또는 LysC 분해이다.
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS, 또는 LC/MS/MS에 사용됨)는 역상 액체 크로마토그래피이다(용어 "역위상 액체 크로마토그래피(reversed phase liquid chromatography)" 또는 RPLC는 본 명세서에서 역상 액체 크로마토그래피와 상호 혼용되어 사용될 수 있음). 당 업계에 공지된 바와 같이, 역상 액체 크로마토그래피는 극성 이동상에서 소수성 분자를 흡착하기 위해, 소수성 고정상(예를 들어, 컬럼과 같은 지지체 또는 기질)을 사용하는 크로마토그래피 분리를 지칭할 수 있다. (예를 들어, 유기 용매를 첨가하여) 이동상의 극성을 저하시킴으로써, 더 많은 소수성 분자가 더 강한 컬럼과의 소수성 상호작용으로 인해 더 고 농도의 유기 용매의 컬럼 상에 유지될 것이므로, 소수성에 의한 분자의 구배 분리를 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 모세관 전기영동(CE), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC) 예컨대, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)에 의해 이루어지며, 이는 온라인 LC/MS 예컨대, MS 전에 오프라인 분리; 예를 들어, 팁, 컬럼; 플레이트 또는 카트리지에 제한되지 않는다.
일반적으로, 역상 액체 크로마토그래피에 적합한 고정상(예를 들어, 소수성 모이어티)을 제한 없이, 입자 또는 비드(예를 들어, 다공성 실리카 입자 또는 폴리스티렌)로 패키징된 컬럼 또는 수지를 포함하는 지지체에 연동시킬 수 있다. 제한 없이, 소수성 알킬 사슬, 옥틸 또는 옥타데실 실릴 모이어티, 시아노 모이어티 및 아미노 모이어티를 포함하여, 다양한 소수성 고정상이 당 업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 고정상은 특정 길이의 소수성 알킬 사슬, 예컨대, C4, C8, 또는 C18을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 역상 크로마토그래피는 C4, 또는 C8 역상 크로마토그래피(예를 들어, C4, 또는 C8 고정상을 사용하는 역상 크로마토그래피)이다. 당업자는 대상 분자(예를 들어, 변성된 AAV 입자, 또는 그의 단편)를 기반으로 하여, 고정상을 적절히 선택할 수 있다.
역상 액체 크로마토그래피에 적합한 다양한 이동상이 당 업계에 공지되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 역상 액체 크로마토그래피 이동상은 유기(예를 들어, 소수성), 및 수성(예를 들어, 극성) 용매의 혼합물을 포함할 수 있다. 유기 용매의 비율을 증가시킴으로써, 고정상으로부터 소수성 화합물을 용리시키는 그의 용량을 증가시킨다. 화합물 보유, 및/또는 선택성은, 예를 들어, 고정상의 유형 또는 노출의 변화, 말단 캡 형성 시약과 같은 극성 시약의 첨가, 온도의 변이 및/또는 유기 용매의 비율, pH, 완충액, 및 사용되는 유기 용매의 유형과 같은 이동상 특성의 변이에 의해 변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 이동상의 극성 성분은 제한 없이, 물, 또는 수성 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이동상의 극성 성분은 제한 없이, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜, 테트라히드로푸란(THF), 및 포름산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 이동상(예를 들어, 이동상 A, 이동상 B 등)을 요망되는 구배 또는 비율로 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 크로마토그래피는 물 중 포름산을 포함하는 이동상 A를 사용한다. 특정 구현예에서, 이동상 A는 약 0.1% 포름산을 포함한다. 특정 구현예에서, 이동상 A는 약 0.1% 내지 약 5% 포름산을 포함한다. 특정 구현예에서, 크로마토그래피는 아세토니트릴 중 포름산을 포함하는 이동상 B를 사용한다. 특정 구현예에서, 이동상 B는 약 0.1% 포름산을 포함한다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피의 이동상 B의 비율은 시간이 경과함에 따라 증가한다. 예를 들어, 크로마토그래피의 이동상 B의 비율은 단계적 방식으로 증가할 수 있다. 특정 구현예에서, 이동상 B는 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 및 약 30% 내지 약 38% 증가한다. 다른 구현예에서, 이동상 B는 약 2% 내지 약 60% 증가한다. 다른 구현예에서, 이동상 B는 약 2% 내지 약 100% 약 1분 내지 약 200분 증가하고, 일부 구현예에서, 나머지 이동상은 본 개시내용의 제2 이동상, 예를 들어, 이동상 A이다. 특정 구현예에서, 이동상 B는 약 6분에 약 10% 내지 약 20%, 약 10분에 약 20% 내지 약 30%, 및 약 40분에 약 30% 내지 약 38% 증가한다. 다른 구현예에서, 이동상 B는 약 121분에 약 2% 내지 약 60% 증가한다. 당업자는 요망되는 크로마토그래피 분리 및/또는 대상 분석물을 기반으로 하여, 대상 이동상 및 사용되는 구배 일정을 적절하게 조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. HPLC는 샘플을 함유하는 액체 용매가 고체상을 함유하는 컬럼을 통과할 때 가압되는 액체 크로마토그래피의 형태로서 당 업계에 공지되어 있다. 통상의 또는 저압의 LC는 중력을 이용하여, 이동상을 고체상을 통해 통과시킬 수 있으나, HPLC는 펌프를 사용하여, 이동상에 압력을 가하고, 통상적으로 작은 입자의 고체상을 사용하여, 분해능을 증가시킨다. 일부 구현예에서, HPLC는 약 50 bar 내지 약 350 bar의 압력을 사용한다. 일부 구현예에서, MS 분석을 위해 역위상 HPLC를 사용하여, 단백질(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)을 농축시키고/시키거나, 탈염시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 제한 없이 공급원 전압, 모세관 온도, ESI 전압(ESI-MS를 사용하는 경우), CID 에너지, 및 MS/MS 이벤트의 수를 포함하는 하나 이상의 매개변수를, 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 LC/MS/MS에서, 본 명세서에 기재된 결과를 기반으로 하여, 조정할 수 있다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS/MS에 사용됨)은 약 2.5 kV의 공급원 전압(예를 들어, 모세관 전압)을 사용한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS/MS에 사용됨)은 약 275℃의 모세관 온도를 사용한다. 일부 구현예에서, 모세관 온도는 약 20℃ 내지 약 400℃의 범위이다.
제한 없이 비행 시간(TOF) 분석기, 4극자 질량 필터, 4극자 TOF(QTOF), 및 이온 트랩(예를 들어, 푸리에 변환 기반 질량 분광분석기 또는 Orbitrap)을 포함하여, LC/MS, 및/또는 LC/MS/MS에 적합한 다양한 질량 분석기가 당 업계에 공지되어 있다. Orbitrap에서는 접지 전위의 배럴형 외부 전극 및 스핀들형 중심 전극을 사용하여, 원심력 및 정전기력의 균형에 의해 국한된 범위에서 중심 축을 따라 진동하면서, 중심 전극 주위로 타원형으로 회전하는 궤도의 이온을 트래핑(trapping)한다. 이러한 장치의 사용은 영상 전류의 검출로부터 시간 도메인 신호(예를 들어, 주파수)를 고 분해능 질량 측정(예를 들어, 나노 LC/MS/MS)으로 변환하기 위해 푸리에 변환 작업을 사용한다. 추가 기재내용 및 세부 정보는, 예를 들어, 문헌[Scheltema, R.A. et al. (2014) Mol. Cell Proteomics 13:3698-3708; Perry, R.H. et al. (2008) Mass. Spectrom. Rev. 27:661-699; and Scigelova, M. et al. (2011) Mol. Cell Proteomics 10:M111.009431]에서 찾아 볼 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, MS는, 예를 들어, Orbitrap 질량 분석기를 사용하는 나노 LC/MS/MS를 포함한다. 일부 구현예에서, 이온 공급원은 적층 고리 이온 가이드 또는 S-렌즈를 포함할 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이, S-렌즈를 사용하여, 무선 주파수(RF)를 사용하여 이온 빔을 집속시킴으로써, 장치 내로의 이온의 투과를 증가시킬 수 있다. 이는 (예를 들어, 저 강도 이온의) 감응성을 개선할 수 있고/있거나, 주사 속도를 개선시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 질량 분광분석의 S-렌즈 RF 수준은 약 55%이다. 특정 구현예에서, 질량 분광분석의 S-렌즈 RF 수준은 약 20% 내지 약 100%이다.
일부 구현예에서, 바이러스 캡시드 단백질의 질량을, 예를 들어, LC/MS, 및/또는 LC/MS/MS 데이터를 기반으로 하여 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3, 또는 AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을, 예를 들어, LC/MS, 및/또는 LC/MS/MS 데이터를 기반으로 하여 결정할 수 있다. MS 데이터로부터 단백질 질량, 및/또는 동일성을 결정하기 위한 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 펩타이드 질량 핑거프린트법(fingerprinting)을 사용하여, MS 데이터를 기반으로 단백질 서열을 결정할 수 있거나, 하나 이상의 구성 펩타이드와 관련된 MS/MS 데이터를 기반으로 단백질을 확인할 수 있다. 탠덤 MS(tandem MS)를 사용하는 경우, 생성 이온 주사를 사용하여, 대상 단백질의 하나 이상의 펩타이드와 관련된 m/z 데이터를 분석할 수 있다. 그 후, 당 업계에 공지된 소프트웨어를 사용하여, 예를 들어, 확인된 피크를 기준 또는 공지 피크에 매칭시킴으로써, 동위원소 이성질체 분류로 피크를 그룹화할 수 있다. 펩타이드 질량 값을 공지된 펩타이드 서열의 데이터베이스와 비교할 수 있다. 예를 들어, Mascot를 사용하여, 예를 들어, 특정 분해 패턴을 인실리코 단백질 데이터베이스에 적용시켜 생성된 이론적 데이터베이스 펩타이드와 관찰된 펩타이드를 매칭시킬 수 있다. 다른 적합한 소프트웨어는, 제한 없이, Proteome Discoverer, ProteinProspector, X!Tandem, Pepfinder, Bonics, or MassLynx™ (Waters)를 포함할 수 있다. MS 데이터 분석의 다양한 단계에 적합한 다른 소프트웨어는, 예를 들어, www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 결정되거나, 계산된 질량(예를 들어, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 결정되거나, 계산된 질량)을 기준, 예를 들어, 하나 이상의 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 이론적 질량과 비교할 수 있다. 본 개시내용의 기준은 본 명세서에 기재된 임의의 AAV 혈청형 중 하나 이상의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 이론적 질량을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 질량을 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, AAV LK03 캡시드(미국 특허 제 9,169,299호 참조), AAV2R471A 캡시드, AAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드(미국 특허 제 7,588,772호 참조), AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소과 동물 AAV 캡시드, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1(키메라 AAV/인간 보카바이러스 바이러스 1), AAV2HBKO 캡시드, AAVPHP.B 캡시드, 또는 AAVPHP.eB 캡시드 중 하나 이상의 이론적 질량과 비교한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 결정되거나, 계산된 질량(예를 들어, AAV 입자의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 결정되거나, 계산된 질량)을 해당 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3의 이론적 질량과 비교할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 AAV 입자의 이질성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 질량(예를 들어, 기준 질량, 예컨대, 이론적, 예측 또는 기대 질량) 중 하나 이상의 편차는 AAV 캡시드 이질성의 지표이다. 일부 구현예에서, 이질성은, 제한 없이, 다음의 혼합 혈청형, 변이체 캡시드, 캡시드 아미노산 치환, 절두된 캡시드, 또는 변형된 캡시드 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, LC/MS, 및 LC/MS/MS의 용도를 조합할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 입자의 혈청형을 결정하는 방법은 변성된 AAV 입자를 LC/MS에 적용하는 단계(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), 및 AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 결정하는 단계뿐만 아니라, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 LC/MS/MS에 적용하는 단계, 및 AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계를 포함할 수 있다(VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량의 특정 조합은 AAV 혈청형의 지표임). 일부 구현예에서, AAV 입자의 이질성을 결정하는 방법은 변성된 AAV 입자를 LC/MS에 적용하는 단계(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음), AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 질량을 결정하는 단계, 및 이들 질량을 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 이론적 질량과 비교하는 단계뿐만 아니라, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 단편을 LC/MS/MS에 적용하는 단계, AAV 입자의 VP1, VP2, 및 VP3의 단편의 질량을 결정하는 단계, 및 이들 질량을 AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및 VP3의 이론적 질량과 비교하는 단계를 포함할 수 있다(VP1, VP2, 또는 VP3의 질량 중 하나 이상의 편차는 AAV 캡시드 이질성의 지표임).
일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 아세틸화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 N-말단은 아세틸화된다. 하기에서 더 자세하게 세부적으로 기재되는 바와 같이, AAV 캡시드 단백질의 개시 메티오닌 이후 제2 위치의 아미노산(iMet X)을 돌연변이시켜, AAV 입자 운반, 형질도입, 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화, 유비퀴틴화(ubiquitination) 등)에 대한 Nt-아세틸화에 대한 영향의 기능성 결과뿐만 아니라, N-말단(Nt-) 아세틸화에 대한 그 효과를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3)의 N-말단은 일부 경우, 예를 들어, Met-아미노펩티다제에 의해 제거될 수 있는 개시 메티오닌 이후 제1 아미노산을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 입자(예를 들어, 재조합 AAV, 또는 rAAV 입자)는 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은, 예를 들어, 기준(예를 들어, 아미노산 치환 전의 모체 AAV 입자 또는 VP1 및/또는 VP3의 상이한 아미노산 잔기 2를 갖는 AAV 입자)과 비교하여, N-말단 아세틸화의 빈도 또는 비율이 상이한 VP1 및/또는 VP3을 야기한다. 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 예를 들어, 특정 구현예에서, VP1의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 특정 구현예에서, VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, N-말단 아세틸화를 "변이"시키는 아미노산 치환(예를 들어, VP1, 또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환)은 치환되지 않은 VP1, 또는 VP3, 예컨대, 모체 VP1, 또는 VP3과 비교하여, 더 높은 빈도의 N-말단 아세틸화, 또는 더 낮은 빈도의 N-말단 아세틸화를 야기한다. 변이체, 또는 그의 혼성체(예를 들어, 티로신 돌연변이, 또는 헤파린 결합 돌연변이를 보유함)를 포함하여, VP1 및/또는 VP3은 본 명세서에 기재된 예시적 AAV 혈청형 중 어느 하나에 속할 수 있다. 예시적 N-말단 아세틸화 분석은 제한 없이, 질량 분광분석, 동위원소 표지(예를 들어, 동위원소-표지 아세틸기 또는 그의 전구체), 아세틸화-특이적 항체에 의한 웨스턴 블로팅 등을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3)의 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 AAV 캡시드의 적은 탈아미드화를 야기한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 입자는 탈아미드화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 N57, 및/또는 VP3의 N382, N511, 및/또는 N715는 탈아미드화된다. 하기에서 더 자세하게 세부적으로 기재되는 바와 같이, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3) 중 VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716으로부터 선택되는 아미노산을 돌연변이시켜, AAV 입자 운반, 형질도입, 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화, 유비퀴틴화 등)에 대한 탈아미드화에 대한 영향의 기능성 결과뿐만 아니라, 탈아미드화에 대한 그 효과를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 입자(예를 들어, 재조합 AAV, 또는 rAAV 입자)는 VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및 VP3의 G716으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716에서의 아미노산 치환은 기준(예를 들어, 아미노산 치환 전의 모체 AAV 입자, 또는 상이한 해당 아미노산 잔기 2를 가진 AAV 입자)과 비교하여, 탈아미드화의 빈도 또는 비율이 상이한 VP1 및/또는 VP3을 야기한다. 일부 구현예에서, 탈아미드화를 "변이"시키는 아미노산 치환(예를 들어, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716에서의 아미노산 치환)은, 예를 들어, 치환되지 않은 VP1, 또는 VP3, 예컨대, 모체 VP1, 또는 VP3과 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화, 또는 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 변이체, 또는 그의 혼성체(예를 들어, 티로신 돌연변이, 또는 헤파린 결합 돌연변이를 보유함)를 포함하여, VP1 및/또는 VP3은 본 명세서에 기재된 예시적 AAV 혈청형 중 어느 하나에 속할 수 있다. 예시적 탈아미드화 분석은 제한 없이, 질량 분광분석, HPLC(예를 들어, Promega로부터의 ISOQUANT® 이소아스파테이트 검출 키트 참조) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, VP1의 N57, VP3의 N382, VP3의 N511, 및/또는 VP3의 N715는 Asp에 의해 치환되고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 다른 구현예에서, 아미노산 치환은 N57K, 또는 N57Q이고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 다른 구현예에서, VP1의 G58, VP3의 G383, VP3의 G512, 및/또는 VP3의 G716은 Gly이 아닌 아미노산(예를 들어, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val)에 의해 치환되고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 다른 구현예에서, VP1의 A35는 Asn에 의해 치환되어, 모체 입자의 VP1의 탈아미드화와 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화를 야기한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "N-아세틸화"는 아세틸기가 단백질의 N-말단 아미노산의 아미노기에 공유 결합에 의해 첨가되는 방법을 지칭한다. 통상적으로, N-말단 아세틸트랜스퍼라제(NAT)는 아세틸기를 아세틸-조효소 A(Ac-CoA)로부터 단백질의 첫 번째 아미노산 잔기의 α- 아미노기로 전달한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "탈아미드화"는 아스파라긴 또는 글루타민의 측쇄의 아미드 작용기가 제거되거나, 또 다른 작용기로 전환되는 화학 반응을 지칭한다. 예를 들어, 아스파라긴은 아스파르트산 또는 이소아스파르트산으로 전환될 수 있다. 다른 예에서, 글루타민은 글루탐산 또는 피로글루탐산(5-옥소프롤린)으로 전환된다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 더 높은 정도로 N-아세틸화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나 초과보다 더 많은 N-아세틸기를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 약 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 55%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 100%, 5% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 75% 내지 100%, 5% 내지 50%, 또는 50% 내지 100% 중 어느 하나보다 더 많은 N-아세틸기를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 중 어느 하나 초과보다 더 많은 N-아세틸기를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 2배 내지 3배, 3배 내지 4배, 4배 내지 5배, 5배 내지 10배, 10배 내지 25배, 25배 내지 50배, 50배 내지 100배, 100배 내지 500배, 500배 내지 1000배, 2배 내지 10배, 10배 내지 100배, 또는 100배 내지 1000배 중 어느 하나보다 더 많은 N-아세틸기를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 더 낮은 정도로 N-아세틸화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나 초과보다 더 적은 N-아세틸기를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 55%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 100%, 5% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 75% 내지 100%, 5% 내지 50%, 또는 50% 내지 100% 중 어느 하나보다 더 적은 N-아세틸기를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 중 어느 하나 초과보다 더 적은 N-아세틸기를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 2배 내지 3배, 3배 내지 4배, 4배 내지 5배, 5배 내지 10배, 10배 내지 25배, 25배 내지 50배, 50배 내지 100배, 100배 내지 500배, 500배 내지 1000배, 2배 내지 10배, 10배 내지 100배, 또는 100배 내지 1000배 중 어느 하나보다 더 적은 N-아세틸기를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 더 높은 정도로 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나 초과보다 더 많이 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자보다 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 55%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 100%, 5% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 75% 내지 100%, 5% 내지 50%, 또는 50% 내지 100% 중 어느 하나보다 더 많이 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 중 어느 하나 초과만큼 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자보다 2배 내지 3배, 3배 내지 4배, 4배 내지 5배, 5배 내지 10배, 10배 내지 25배, 25배 내지 50배, 50배 내지 100배, 100배 내지 500배, 500배 내지 1000배, 2배 내지 10배, 10배 내지 100배, 또는 100배 내지 1000배 중 어느 하나보다 더 많이 탈아미드화된다.
일부 구현예에서, AAV의 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질과 비교하여, 더 낮은 정도로 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자와 비교하여, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나 초과보다 더 적게 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자보다 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 55%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 100%, 5% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 75% 내지 100%, 5% 내지 50%, 또는 50% 내지 100% 중 어느 하나보다 더 적게 탈아미드화된다다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자보다 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 중 어느 하나 초과보다 더 적게 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 모체 AAV 입자보다 2배 내지 3배, 3배 내지 4배, 4배 내지 5배, 5배 내지 10배, 10배 내지 25배, 25배 내지 50배, 50배 내지 100배, 100배 내지 500배, 500배 내지 1000배, 2배 내지 10배, 10배 내지 100배, 또는 100배 내지 1000배 중 어느 하나보다 더 적게 탈아미드화된다.
본 발명은 임의의 조합의 N-아세틸화, 및 탈아미드화를 제공한다. 예를 들어, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 높은 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 높은 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 높은 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 높은 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 낮은 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 높은 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 낮은 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 낮은 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 높은 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 낮은 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질과 동일한 정도로 탈아미드화될 수 있거나, AAV 캡시드 단백질은 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 낮은 정도로 N-아세틸화될 수 있고, 모체 AAV 캡시드 단백질보다 더 낮은 정도로 탈아미드화될 수 있다.
IV. 벡터
특정 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나에 사용하기에 적합한 바이러스 입자에 관한 것이며, 이는 AAV 벡터(예를 들어, rAAV 벡터), 또는 또 다른 바이러스 유래 벡터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 이종성 핵산, 예를 들어, 이종성 전이유전자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 이종성 핵산, 예를 들어, 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터 게놈을 포함한다.
본 발명은 rAAV 바이러스 입자로의 패키징을 위해, 치료용 폴리펩타이드, 및/또는 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 도입을 위한 재조합 바이러스 게놈의 사용을 고려한다. 재조합 바이러스 게놈은 치료용 폴리펩타이드, 및/또는 핵산의 발현을 달성하기 위한 임의의 요소, 예를 들어, 프로모터, 본 개시내용의 ITR, 리보솜 결합 요소, 종결인자, 인핸서, 선택 마커, 인트론 폴리A 신호, 및/또는 복제 기점을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩타이드를 인코딩한다. 치료용 폴리펩타이드는, 예를 들어, 세포 또는 유기체에 부재하거나, 감소된 수준으로 존재하는 폴리펩타이드, 및/또는 효소적 활성을 제공할 수 있다. 대안적으로, 치료용 폴리펩타이드는 세포 또는 유기체의 불균형을 간접적으로 제거하는 폴리펩타이드, 및/또는 효소적 활성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 대사 효소 또는 활성의 결핍으로 인한 대사산물의 축적과 관련된 장애 치료용 폴리펩타이드는 손실된 대사 효소 또는 활성을 제공할 수 있고, 대사산물의 감소를 야기하는 대체 대사 효소 또는 활성을 제공할 수 있다. 치료용 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어 우성 음성 폴리펩타이드로서 작용하여, 폴리펩타이드(예를 들어, 과발현되거나, 기능 획득 돌연변이에 의해 활성화되거나, 그렇지 않으면 그의 활성이 잘못 조절되는 것)의 활성을 감소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 세포 내 단백질이거나, 세포막에 고정되거나, 세포 내에 유지되거나, 본 발명의 벡터로 형질도입된 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 벡터를 수용한 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드의 경우; 폴리펩타이드는 가용성일 수 있다(즉, 세포에 부착되지 않음). 예를 들어, 가용성 폴리펩타이드는 막관통 영역이 부재하고, 세포로부터 분비된다. 막관통 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 확인하고, 제거하는 기법은 당 업계에 공지되어 있다.
본 발명(예를 들어, AAV 벡터 게놈)이 핵산인 경우, 핵산은 전이유전자로서, CNS-연관 장애를 조절하거나, 치료하는 단백질, 또는 기능성 RNA를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 다음은 CNS-연관 장애와 관련된 유전자의 비 제한 목록이다: 신경 세포사멸 억제 단백질(NAIP), 신경 성장 인자(NGF), 신경교 유도 성장 인자(GDNF), 뇌 유도 성장 인자(BDNF), 모양체 신경영양 인자(CNTF), 티로신 하이드록실라제(TM, GTP-사이클로하이드롤라제(GTPCH), 아스파르토아실라제(ASPA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1), 항산화제, 항 혈관신생 폴리펩타이드, 항 염증성 폴리펩타이드 및 아미노산 데카르복실라제(AADC). 예를 들어, 파킨슨병 치료에 유용한 전이유전자는 도파민의 합성에서 속도 제한 효소인 TH를 인코딩한다. TII 보인자 테트라하이드로비오테린을 생성하는 GTPCII를 인코딩하는 전이유전자가 또한 파킨슨병 치료에 사용될 수 있다. L-Dopa의 DA로의 전환을 촉진하는 GDNF, 또는 BDNF, 또는 AADC를 인코딩하는 전이유전자가 또한 파킨슨병의 치료에 사용될 수 있다. ALS의 치료를 위해 유용한 전이유전자는 GDNF, BDNF, 또는 CNTF를 인코딩할 수 있다. 또한, ALS의 치료를 위해 유용한 전이유전자는 SOD1의 발현을 억제하는 기능성 RNA, 예를 들어, shRNA, miRNA를 인코딩할 수 있다. 허혈의 치료를 위해 유용한 전이유전자는 NAIP 또는 NGF를 인코딩할 수 있다. 베타-글루쿠로니다제(GUS)를 인코딩하는 전이유전자는 특정 리소좀성 저장 질병(예를 들어, 뮤코다당체침착증 VII형(MPS VII))의 치료에 유용할 수 있다. 전구약물 활성화 유전자, 예를 들어, DNA 합성을 저해하고, 세포 사멸을 유도하는 독성 뉴클레오타이드로 간사이클로비르(ganciclovir)를 전환시키는 HSV-티미딘 키나제를 인코딩하는 전이유전자는, 예를 들어 전구약물과 조합하여 투여되는 경우, 특정 암의 치료에 유용할 수 있다. 내인성 아편 유사 물질인 β-엔돌핀을 인코딩하는 전이유전자는 통증 치료에 유용할 수 있다. 항산화제의 예는 제한 없이 SOD1; SOD2; 카탈라제; 시르투인(Sirtuin) 1, 3, 4, 또는 5; NRF2; PGC1a; GCL(촉매 하위단위); GCL(변형인자 하위단위); 아디포넥틴(adiponectin),; 글루타티온 페록시다제 1(glutathione peroxidase 1); 및 뉴로글로빈(neuroglobin)을 포함한다. 항-혈관신생 폴리펩타이드의 예는 제한 없이 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), PEDF, 가용성 VEGF 수용체, 및 가용성 PDGF 수용체를 포함한다. 항 염증성 폴리펩타이드의 예는 제한 없이 IL-10, 가용성 IL17R, 가용성 TNF-R, TNF-R-Ig, IL-1 억제제, 및 IL18 억제제를 포함한다. 본 발명의 rAAV 벡터에 사용될 수 있는 전이유전자의 다른 예는 당업자에게 명백할 것이다(예를 들어, 문헌[Costantini L C, et al., Gene Therapy (2000) 7, 93-109] 참조).
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산은 제한 없이 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 또는 DNAzyme을 포함할 수 있다. 이와 같이, 치료용 핵산은, 벡터의 핵산으로부터 전사되는 경우, 본 발명의 장애와 관련된 이상 또는 과잉 단백질의 번역 또는 전사를 간섭함으로써, 장애를 치료할 수 있는 RNA를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 이상 및/또는 과잉 단백질을 인코딩하는 mRNA의 고도의 특이적 제거 또는 감소에 의해, 장애를 치료하는 RNA를 인코딩할 수 있다. 치료용 RNA 서열은 이상 및/또는 과잉 단백질을 인코딩하는 mRNA의 고도의 특이적 제거 또는 감소에 의해 장애를 치료할 수 있는 RNAi, 작은 억제 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및/또는 리보자임(예컨대, 해머헤드, 및 헤어핀 리보자임)을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산은 CNS의 장애를 치료하는 데 사용된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산은 기능 획득이 장애와 관련되어 있는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나, 제거하거나, 장애와 관련된 결핍을 보완하기 위해 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 증진시키기 위해, 사용될 수 있는 것으로 사료된다(예를 들어, 그의 발현이 유사하거나 관련된 활성을 나타내는 유전자에서의 돌연변이). 본 발명의 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산에 의해 치료될 수 있는 본 발명의 장애의 비 제한 예(표적화되거나, 제공될 수 있는 예시적인 유전자가 각 장애에 대한 괄호 안에 제공됨)는 뇌졸중(예를 들어, 카스파제-3, Beclin1, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, 및/또는 문헌[Fukuda, A.M. and Badaut, J. (2013) Genes (Basel) 4:435-456]에 기재된 임의의 유전자), 헌팅턴병(돌연변이 HTT), 간질(예를 들어, SCN1A, NMDAR, ADK, 및/또는 문헌[Boison, D. (2010) Epilepsia 51:1659-1668]에 기재된 임의의 유전자), 파킨슨병(알파-시누클레인(alpha-synuclein)), 루게릭병(또한 근위축성측색경화증으로도 일컬어짐; SOD1), 알츠하이머병(타우(tau), 아밀로이드 전구체 단백질), 피질기저 퇴화, 또는 CBD(타우), 피질기저 신경절 퇴화, 또는 CBGD(타우), 전측두엽 치매, 또는 FTD(타우), 진행성 핵상 마비, 또는 PSP(타우), 다계통 위축, 또는 MSA(알파-시누클레인), 뇌암(예를 들어, 뇌암과 관련된 돌연변이, 또는 과발현 종양유전자), 및 리소좀성 저장 질병(LSD)을 포함한다. 본 발명의 장애는 피질의 넓은 영역, 예를 들어 피질의 하나 이상의 기능 영역, 피질의 하나 이상의 엽 및/또는 전체 피질을 포함하는 장애를 포함할 수 있다. 본 발명의 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산에 의해 치료될 수 있는 본 발명의 장애의 다른 비 제한 예는 외상성 뇌 손상, 효소 기능이상 장애, 정신의학적 장애(외상 후 스트레스 증후군 포함), 신경퇴행성 질병 및 인지 장애(치매, 자폐증 및 우울증 포함)를 포함한다. 효소 기능이상 장애는 제한 없이, 백혈구감소증(카나반병 포함) 및 하기에 기재된 리소좀성 저장 질병을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산은 리소좀성 저장 질병의 치료에 사용된다. 당 업계에 통상적으로 공지된 바와 같이, 리소좀성 저장 질병은 리소좀 기능의 결함을 특징으로 하는 희귀 유전성 대사 장애이다. 이러한 장애는 종종, 적절한 무코다당류, 당단백질, 및/또는 지질 대사에 필요한 효소가 결핍되어, 리소좀에 저장된 세포 물질의 병리학적 축적을 야기한다. 본 발명의 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산에 의해 치료될 수 있는 본 발명의 리소좀성 저장 질병의 비 제한 예(표적화되거나, 제공될 수 있는 예시적인 유전자가 각 장애에 대한 괄호 안에 제공됨)는 고셔병 2형, 또는 3형(산 베타-글루코시다제, GBA), GM1 강글리오시도시스(베타-갈락토시다제-1, GLB1), 헌터병(이두로네이트 2-술파타제, IDS), 크라베병(갈락토실세라미다제, GALC), 만노시도시스 질병(만노시다제, 예컨대, 알파-D-만노시다제, MAN2B1), β 만노시도시스 질병(베타-만노시다제, MANBA), 이염성 백질디스트로피 질병(슈도아릴술파타제 A, ARSA), 점액지질증II/III 질병(N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, GNPTAB), 니만 피크 A 질병(산 스핑고미엘리나제, ASM), 니만 피크 C 질병(니만 피크 C 단백질, NPC1), 폼페병(산 알파-1,4-글루코시다제, GAA), 샌드호프병(헥소사미니다제 베타 하위단위, HEXB), 산필리포 A 질병(N-술포글루코사민 술포하이드롤라제, MPS3A), 산필리포 B 질병(N-알파-아세틸글루코사미니다제, NAGLU), 산필리포 C 질병(헤파린 아세틸-CoA:알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제, MPS3C), 산필리포 D 질병(N-아세틸글루코사민-6-술파타제, GNS), 쉰들러병(알파-N-아세틸갈락토사미니다제, NAGA), Sly 질병(베타-글루쿠로니다제, GUSB), 테이 삭스병(헥소사미니다제 알파 하위단위, HEXA), 및 울만병(리소좀 산 리파제, LIPA)을 포함한다.
추가의 리소좀성 저장 질병뿐만 아니라, 각 질병과 관련된 결함 효소가 하기의 표 1에 열거되어 있다. 일부 구현예에서, 하기의 표에 열거된 질병은 해당 효소 결함을 보완하거나, 달리는 보충하는 본 발명의 치료용 폴리펩타이드, 또는 치료용 핵산에 의해 치료된다.
[표 1]
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 예시적 프로모터는 시토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세린 키나제- 1(PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터, 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 시토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β 글로빈 프로모터(CAG 프로모터; 문헌[Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9]), 및 연장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터(문헌[Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10])를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 인간 β 글루쿠로니다제 프로모터, 또는 닭 β 액틴(CBA) 프로모터에 연결된 시토메갈로바이러스 인핸서를 포함한다. 프로모터는 항시성, 유도성, 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 CBA 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 이종성 전이유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 예시적 프로모터, 및 기재내용은, 예를 들어, 미국 특허 공보 제 20140335054호에서 찾아볼 수 있다.
항시성 프로모터의 예는 제한 없이, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서), 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서)[예를 들어, 문헌[Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EFla 프로모터 [Invitrogen]를 포함한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하고, 외인성으로 제공되는 화합물, 온도와 같은 환경 인자, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 급성기, 세포의 특정 분화 상태의 존재에 의하거나, 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 제한 없이, Invitrogen, Clontech, 및 Ariad를 포함하여, 다양한 시중 공급원으로부터 구입 가능하다. 많은 다른 시스템이 기재된 바 있으며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 제공된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(제 WO 98/10088호); 엑디손 곤충 프로모터(문헌[No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]), 테트라사이클린 억제성 시스템(문헌[Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]), 테트라사이클린-유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조), RU486-유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) and Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]), 및 라파마이신-유도성 시스템(문헌[Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)])을 포함한다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의하거나, 복제 세포에서만 조절되는 것이다.
또 다른 구현예에서, 전이유전자의 천연 프로모터, 또는 그의 단편이 사용될 것이다. 전이유전자의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 요망되는 경우, 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 전이유전자의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로 또는 조직 특이적인 방식으로 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우, 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위, 또는 Kozak 공통 서열을 또한 사용하여, 천연 발현을 모방할 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 서열은 조직 특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우, 조직 특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자와 결합한다. 이러한 조직 특이적 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 당 업계에 잘 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 인트론을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인트론은 닭 베타-액틴, 및 토끼 베타-글로빈으로부터 유래된 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 미세 마우스 바이러스(MVM) 인트론이다.
일부 구현예에서, 벡터는 폴리아데닐화(폴리A) 서열을 포함한다. 소과 동물 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 서열(예를 들어, 수탁 번호 EF592533 참조), SV40 폴리아데닐화 서열, 및 HSV TK pA 폴리아데닐화 서열과 같은 폴리아데닐화 서열의 다수의 예가 당 업계에 공지되어 있다.
V. 바이러스 입자, 및 바이러스 입자의 생성 방법
본 개시내용의 특정 양태는 재조합 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)에 관한 것이다.
본 명세서에 제공되는 지침을 기반으로 하여, 본 개시내용의 기법은 다양한 상이한 바이러스와 사용하기 위해, 당업자에 의해 적절하게 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스는 통상적으로 아데노바이러스로 일컬어지는 비 외피 바이러스를 포함하는 아데노바이러스과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 앳아데노바이러스속, 아비아데노바이러스속, 이트아데노바이러스속, 매스트아데노바이러스속, 또는 시아데노바이러스속의 것이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 비 외피 바이러스 예컨대, AAV, 및 보카파르보바이러스를 포함하는 파르보바이러스과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 덴소바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 암비덴소바이러스속, 브레비덴소바이러스속, 헤판덴소바이러스속, 이테라덴소바이러스속, 또는 펜스틸덴소바이러스속의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 파르보바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 암도파르보바이러스속, 아베파르보바이러스속, 보카파르보바이러스속, 코피파르보바이러스속, 데펜도파르보바이러스속, 데리트로파르보바이러스속, 프로토파르보바이러스 또는 테트라파르보바이러스속의 것이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 렌티바이러스를 포함하여, 외피 바이러스를 포함하는 레트로바이러스과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 오르소레트로바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 알파레트로바이러스속, 베타레트로바이러스속, 델타레트로바이러스속, 엡실론레트로바이러스속, 감마레트로바이러스속, 또는 렌티바이러스속의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 스푸마레트로바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 스푸마바이러스속의 것이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 알파바쿨로바이러스를 포함하여, 외피 바이러스를 포함하는 바쿨로바이러스과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 알파바쿨로바이러스속, 베타바쿨로바이러스속, 델타바쿨로바이러스속, 또는 감마바쿨로바이러스속의 것이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 외피 바이러스 예컨대, 심플렉스 바이러스 HSV-1, 및 HSV-2를 포함하는 헤르페스바이러스과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 알파헤르페스바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 일토바이러스속, 마르디바이러스속, 심플렉스바이러스속, 또는 바리셀로바이러스속의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 베타헤르페스바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 시토메갈로바이러스속, 무로메갈로바이러스속, 프로보스시바이러스속, 또는 로세올로바이러스속의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 감마헤르페스바이러스 아과의 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 림포크립토바이러스속, 마카바이러스속, 페르카바이러스속, 또는 라디노바이러스속의 것이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 AAV 바이러스이다. AAV 입자에서, 핵산은 AAV 입자 내에 캡시드화된다. AAV 입자는 또한 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 및/또는 다음 성분, 전사 개시 및 종결 서열을 포함함으로써, 발현 카세트를 형성하는 제어 서열 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 AAV ITR 서열을 포함한다. 예를 들어, 발현 카세트는 5' 및 3' 말단에서 적어도 하나의 기능성 AAV ITR 서열에 측접될 수 있다. "기능성 AAV ITR 서열"은 AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징을 위해 의도된 ITR 서열 기능을 의미한다. 모두 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; 및 Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16]을 참조한다. 본 발명의 일부 양태의 실시를 위해, 재조합 벡터는 적어도, rAAV에 의한 감염을 위해, 물리적 구조 및 캡시드화에 필수적인 AAV 서열 전체를 포함한다. 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없으며(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음), 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 변이될 수 있거나, AAV ITR은 수종의 AAV 혈청형 중 어느 하나로부터 유래할 수 있다. 40종 초과의 AAV 혈청형이 현재 공지되어 있으며, 신규한 혈청형 및 기존 혈청형의 변이체가 계속해서 확인되고 있다. 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; 및 Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810]을 참조한다. 임의의 AAV 혈청형의 사용은 본 발명의 범위 내로 상정된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 제한 없이, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV DJ, AAV DJ8, 염소 AAV, 소과 동물 AAV, 또는 마우스 AAV ITR 등을 포함하는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV(예를 들어, rAAV 벡터)의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV DJ, AAV DJ8, 염소 AAV, 소과 동물 AAV, 또는 마우스 AAV ITR 등의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 입자는 하나 이상의 AAV ITR에 측접된 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6(예를 들어, 미국 특허 공보 제 2012/0164106호에 기재된 바와 같은 야생형 AAV6 캡시드, 또는 변이체 AAV6 캡시드 예컨대, ShH10), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9(예를 들어, 미국 특허 공보 제2013/0323226호에 기재된 바와 같은 야생형 AAV9 캡시드, 또는 변형된 AAV9 캡시드), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, 티로신 캡시드 돌연변이, 헤파린 결합 캡시드 돌연변이, AAV2R471A 캡시드,　 AAVAAV2/2-7m8 캡시드, AAV LK03 캡시드, AAV DJ 캡시드(예를 들어, AAV-DJ/8 캡시드, AAV-DJ/9 캡시드, 또는 미국 특허 공보 제 2012/0066783호에 기재된 임의의 다른 캡시드), AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소과 동물 AAV 캡시드, 마우스 AAV 캡시드, rAAV2/HBoV1 캡시드, AAV2HBKO 캡시드, AAVPHP.B 캡시드, 또는 AAVPHP.eB 캡시드, 또는 미국 특허 제 8,283,151호, 또는 국제특허출원 공보 제 WO/2003/042397호에 기재된 AAV 캡시드로부터 선택되는 캡슐화 단백질을 포함한다. 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 계통군 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하는 AAV(예를 들어, rAAV) 캡시드 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AAV 캡시드 단백질의 개시 메티오닌 이후 제2 위치에서의 아미노산(iMet X)을 N-말단 아세틸화, 운반, 형질도입, 및/또는 다른 번역 후 변형(들)(예를 들어, 글리코실화, 유비퀴틴화 등)에 대한 효과에 대해 조사할 수 있다. AAV 입자와 관련된 그의 아세틸화 또는 기능성 결과를 조사하기 위해, 본 명세서에 기재된 임의의 분석을 사용하여, N-말단 아세틸화를 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3)의 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 이러한 아미노산 치환은 AAV 캡시드의 적은 탈아미드화를 야기한다.
본 개시내용의 다른 양태는 탈아미드화를 변이시키는 아미노산 치환을 포함하는 AAV(예를 들어, rAAV) 캡시드 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 탈아미드화를 "변이"시키는 아미노산 치환(예를 들어, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716에서의 아미노산 치환)은, 예를 들어, 치환되지 않은 VP1, 또는 VP3, 예컨대, 모체 VP1, 또는 VP3과 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화, 또는 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3)의 잠재적 탈아미드화 부위를 탈아미드화, 운반, 형질도입, 및/또는 다른 번역 후 변형(들)(예를 들어, 글리코실화, 유비퀴틴화 등)에 대한 효과에 대해 조사할 수 있다. AAV 입자와 관련된 그의 탈아미드화 또는 기능성 결과를 조사하기 위해, 본 명세서에 기재된 임의의 분석을 사용하여, 탈아미드화를 평가할 수 있다.
수개의 잠재적 탈아미드화 부위가 본 명세서에 기재된다. 일부 구현예에서, 탈아미드화를 변이시키는 아미노산 치환은 VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 N57, VP3의 N382, VP3의 N511, 및/또는 VP3의 N715는 Asp에 의해 치환되고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 높은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 다른 구현예에서, 아미노산 치환은 N57K, 또는 N57Q이고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다. 다른 구현예에서, VP1의 G58, VP3의 G383, VP3의 G512, 및/또는 VP3의 G716은 Gly이 아닌 아미노산(예를 들어, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val)에 의해 치환되고, 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 더 낮은 빈도의 탈아미드화를 야기한다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 VP1, VP2, 또는 VP3이다. AAV 입자는 본 명세서에 기재된 예시적 AAV 캡시드 혈청형, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 중 어느 하나를 포함할 수 있다. AAV 캡시드 단백질은 본 명세서에 기재된 캡시드 단백질 돌연변이, 예컨대, 티로신, 및/또는 헤파린 결합 돌연변이 중 어느 하나를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태는 rAAV 입자의 안정성을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 아미노산 잔기 2는 치환된다. 다른 구현예에서, VP3의 아미노산 잔기 2는 치환된다. 일부 구현예에서, 위치 2에서 치환된 아미노산은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2보다 더 높은 빈도로 N-아세틸화된다. 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환은 rAAV 입자의 안정성을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%만큼 개선시킨다. 일부 구현예에서, 위치 2에서의 아미노산이 치환된 rAAV 입자의 안정성을, 예를 들어, 동일한 혈청형의 야생형, 또는 모체 AAV 캡시드와 비교할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환은, 예를 들어 야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 안정성과 비교하여, rAAV 입자의 안정성을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다. AAV 입자 안정성은 제한 없이, 특정 온도(예를 들어, 열적 안정성을 위해 실온, 또는 4℃)에서 지정된 시간 간격 동안 유지하거나, 특정 pH(예를 들어, pH 안정성)에서 처리하는 등의 AAV 입자 조성물에 대한 시차 주사 형광(DSF), 시차 주사 열량계(DSC), 다른 열 변성 분석, 변성을 관찰하기 위한 단백질 분해에 대한 감응성, 영상 또는 구조적 분석(예를 들어, 전자현미경 사용), 형질도입 효율, 또는 또 다른 기능성 분석을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태는 rAAV 입자의 조립을 개선하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 아미노산 잔기 2는 치환된다. 다른 구현예에서, VP3의 아미노산 잔기 2는 치환된다. 일부 구현예에서, 위치 2에서 치환된 아미노산은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2보다 더 높은 빈도로 N-아세틸화된다. 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환은 rAAV 입자의 조립을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%만큼 개선시킨다. 일부 구현예에서, 위치 2에서의 아미노산이 치환된 rAAV 입자의 조립을, 예를 들어, 동일한 혈청형의 야생형, 또는 모체 AAV 캡시드와 비교할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환은, 예를 들어, 야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 조립과 비교하여, rAAV 입자의 조립을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다. AAV 입자 조립은 제한 없이, 입자 생성 양 및/또는 비율의 측정, 캡시드 생성의 정량화(예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나를 사용한 정제 후), 완전한 벡터 대 빈 캡시드의 생성의 분석, 형질도입 효율의 측정, 입자 형성(예를 들어, 전자현미경 사용), AAV 캡시드 단백질의 생성(예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 분석되는 바와 같음)을 관찰하기 위한 영상, 또는 구조적 분석 등을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태는 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 아미노산 잔기 2는 치환된다. 다른 구현예에서, VP3의 아미노산 잔기 2는 치환된다. 일부 구현예에서, 위치 2에서 치환된 아미노산은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2보다 더 높은 빈도로 N-아세틸화된다. 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환은 rAAV 입자의 형질도입을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%만큼 개선시킨다. 일부 구현예에서, 위치 2에서의 아미노산이 치환된 rAAV 입자의 형질도입을, 예를 들어, 동일한 혈청형의 야생형, 또는 모체 AAV 캡시드와 비교할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환은, 예를 들어, 야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 형질도입과 비교하여, rAAV 입자의 형질도입을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다. AAV 입자 형질도입은 제한 없이, 본 명세서에 기재된 형질도입 효율 분석을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 예를 들어, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2의 치환에 의해, rAAV 입자의 형질도입을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양태는 rAAV 입자의 안정성을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 탈아미드화를 변이시키는 VP1 및/또는 VP3의 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716은 치환된다. 일부 구현예에서, 치환된 아미노산은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기보다 더 높은 빈도로 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716의 치환은 rAAV 입자의 안정성을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%만큼 개선시킨다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716이 치환된 rAAV 입자의 안정성을, 예를 들어, 동일한 혈청형의 야생형, 또는 모체 AAV 캡시드와 비교할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716의 치환은, 예를 들어, 야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 안정성과 비교하여, rAAV 입자의 안정성을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다. AAV 입자 안정성은 제한 없이, 특정 온도(예를 들어, 열적 안정성을 위해 실온, 또는 4℃)에서 지정된 시간 간격 동안 유지하거나, 특정 pH(예를 들어, pH 안정성)에서 처리하는 등의 AAV 입자 조성물에 대한 시차 주사 형광(DSF), 시차 주사 열량계(DSC), 다른 열 변성 분석, 변성을 관찰하기 위한 단백질 분해에 대한 감응성, 영상 또는 구조적 분석(예를 들어, 전자현미경 사용), 형질도입 효율, 또는 또 다른 기능성 분석을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태는 rAAV 입자의 조립을 개선하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 탈아미드화를 변이시키는 VP1 및/또는 VP3의 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716은 치환된다. 일부 구현예에서, 치환된 아미노산은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기보다 더 높은 빈도로 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716의 치환은 rAAV 입자의 조립을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%만큼 개선시킨다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716이 치환된 rAAV 입자의 안정성을, 예를 들어, 동일한 혈청형의 야생형, 또는 모체 AAV 캡시드와 비교할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716의 치환은, 예를 들어, 야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 조립과 비교하여, rAAV 입자의 조립을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다. AAV 입자 조립은 제한 없이, 입자 생성 양 및/또는 비율의 측정, 캡시드 생성의 정량화(예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나를 사용한 정제 후), 완전한 벡터 대 빈 캡시드의 생성의 분석, 형질도입 효율의 측정, 입자 형성(예를 들어, 전자현미경 사용), AAV 캡시드 단백질의 생성(예를 들어, 웨스턴 블로팅에 의해 분석되는 바와 같음)을 관찰하기 위한 영상, 또는 구조적 분석 등을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태는 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 탈아미드화를 변이시키는 VP1 및/또는 VP3의 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716은 치환된다. 일부 구현예에서, 치환된 아미노산은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기보다 더 높은 빈도로 탈아미드화된다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716의 치환은 rAAV 입자의 형질도입을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%만큼 개선시킨다. 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716이 치환된 rAAV 입자의 안정성을, 예를 들어, 동일한 혈청형의 야생형, 또는 모체 AAV 캡시드와 비교할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 및/또는 VP3의 G716의 치환은, 예를 들어, 야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 형질도입과 비교하여, rAAV 입자의 형질도입을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다. AAV 입자 형질도입은 제한 없이, 본 명세서에 기재된 형질도입 효율 분석을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자기-상보성 게놈(예를 들어, 자기-상보적, 또는 자기-상보성 rAAV 벡터)을 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 자기-상보성 벡터 게놈을 가진 AAV 바이러스 입자, 및 자기-상보성 AAV 게놈의 사용 방법이 각각 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 6,596,535호; 제 7,125,717호; 제 7,465,583호; 제 7,785,888호; 제 7,790,154호; 제 7,846,729호; 제 8,093,054호; 및 제 8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있다. 자기-상보성 게놈을 포함하는 rAAV는 그의 부분적 상보성 서열(예를 들어, 이종성 핵산의 상보성 코딩 및 비 코딩 가닥)에 의해 이중 가닥 DNA 분자를 빠르게 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 핵산의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 이종성 핵산 서열, 및 제2 이종성 핵산 서열은 돌연변이된 ITR(예를 들어, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오타이드 서열 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO:8)을 포함한다. 돌연변이된 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 게놈의 복제시, rep 단백질은 돌연변이된 ITR에서 바이러스 게놈을 절단하지 않을 것이며, 이렇게 됨으로써, 5'에서 3'순으로 다음을 포함하는 재조합 바이러스 게놈은 바이러스 캡시드 내에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 돌연변이된 AAV ITR, 제1 이종성 폴리뉴클레오타이드에 대해 역방향인 제2 이종성 폴리뉴클레오타이드 및 제3 AAV ITR.
상이한 AAV 혈청형을 사용하여, 특정 표적 조직(예를 들어, 질병 조직) 내의 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화하거나, 특정 세포 유형을 표적화한다. rAAV 입자는 동일한 혈청형, 또는 혼합 혈청형의 바이러스 단백질, 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, rAAV 입자는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된 하나 이상의 ITR, 및 캡시드를 함유할 수 있거나, rAAV 입자는 rAAV 입자의 캡시드 이외의 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 하나 이상의 ITR을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드는 돌연변이를 포함하며, 예를 들어, 캡시드는 돌연변이 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 돌연변이 캡시드 단백질은 AAV 캡시드를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 Y444, 또는 Y730(AAV2에 따라 넘버링됨)과 같은 AAV2, 또는 AAV5 티로신 돌연변이 캡시드(예를 들어, 문헌[Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832] 참조)를 포함한다. 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 계통군 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(문헌[Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381]).
일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 헤파린 황산프로테오글리칸과 상호작용하는 하나 이상의 위치 또는 AAV2의 VP1 넘버링을 기반으로 넘버링하여, 아미노산 484, 487, 527, 532, 585, 또는 588에 해당하는 하나 이상의 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 헤파란 황산프로테오글리칸(HSPG)은 AAV2 입자의 세포 수용체로서 작용하는 것으로 당 업계에 공지되어 있다(문헌[Summerford, C. and Samulski, R.J. (1998) J. Virol. 72(2):1438-45]). 세포막에서 AAV2 입자와 HSPG 사이의 결합은 입자를 세포에 부착시키는 역할을 한다. 섬유아세포 성장 인자 수용체 및 αvβ5 인테그린과 같은 다른 세포 표면 단백질이 또한 세포 감염을 촉진할 수 있다. 결합 후, AAV2 입자는 클라트린 코팅 피트(clathrin-coated pit)를 통한 수용체 매개 엔도사이토시스를 포함하는 메커니즘을 통해 세포로 유입될 수 있다. AAV2 입자는 엔도솜 산성화시 엔도사이토시스 소포로부터 방출될 수 있다. 이는 AAV2 입자가 핵 주위 영역으로, 이후 세포 핵으로 전달되도록 한다. AAV3 입자는 또한 헤파린에 결합하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Rabinowitz, J.E., et al. (2002) J. Virol. 76(2):791-801]).
AAV2 캡시드 단백질과 HSPG 사이의 결합은 염기성 AAV2 캡시드 단백질 잔기와 음으로 하전된 글리코사미노글리칸 잔기 사이의 정전기적 상호작용을 통해 일어나는 것으로 공지되어 있다(문헌[Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081]). 이러한 상호작용에 관여하는 특이적 캡시드 잔기는 R484, R487, K527, K532, R585, 및 R588을 포함한다. 이들 잔기에서의 돌연변이는 Hela 세포 및 헤파린 자체에 대한 AAV2 결합을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081], 제 WO 2004/027019 A2호, 미국 특허 제 7,629,322호). 추가로, 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, AAV2의 VP1 넘버링을 기반으로 넘버링하여, 아미노산 484, 487, 527, 532, 585, 또는 588에 해당하는 잔기 중 하나 이상에서의 아미노산 치환(들)이 HSPG에 결합하지 않는 AAV 캡시드 유형의 형질도입 특성을 조절할 수 있거나, HSPG에 결합하는 그의 능력과는 무관하게, AAV 캡시드 유형의 형질도입 특성을 조절할 수 있는 것으로 사료된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 AAV2의 VP1을 기반으로 넘버링하여, VP1, VP2, 및/또는 VP3의 위치 R484, R487, K527, K532, R585, 및/또는 R588에서 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 rAAV 입자와 헤파린 황산프로테오글리칸의 결합을 약 적어도 10%, 약 적어도 25%, 약 적어도 50%, 약 적어도 75%, 또는 약 적어도 100%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 rAAV 입자와 헤파린 황산프로테오글리칸의 결합을 약 적어도 10%, 약 적어도 15%, 약 적어도 20%, 약 적어도 25%, 약 적어도 30%, 약 적어도 35%, 약 적어도 40%, 약 적어도 45%, 약 적어도 50%, 약 적어도 55%, 약 적어도 60%, 약 적어도 65%, 약 적어도 70%, 약 적어도 75%, 약 적어도 80%, 약 적어도 85%, 약 적어도 90%, 약 적어도 95%, 또는 약 적어도 100%만큼 감소시킨다(야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 결합과 비교함). 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환 rAAV 입자와 헤파린 황산프로테오글리칸의 결합을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 감소시킨다(야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 결합과 비교함). 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 rAAV 입자와의 결합과 비교하여, rAAV 입자와 헤파린 황산프로테오글리칸의 검출 가능한 결합을 야기하지 않는다. AAV 입자와 HSPG의 결합, 예를 들어, 헤파린 술페이트 크로마토그래피 매질과의 결합 또는 그의 표면에 HSPG를 발현하는 것으로 인식되어 있는 세포와의 결합을 측정하는 수단은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006 and Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081]을 참조한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 rAAV 입자의 세포(예를 들어, 안구 또는 CNS의 세포)로의 형질도입 효율을 약 적어도 10%, 약 적어도 15%, 약 적어도 20%, 약 적어도 25%, 약 적어도 30%, 약 적어도 35%, 약 적어도 40%, 약 적어도 45%, 약 적어도 50%, 약 적어도 55%, 약 적어도 60%, 약 적어도 65%, 약 적어도 70%, 약 적어도 75%, 약 적어도 80%, 약 적어도 85%, 약 적어도 90%, 약 적어도 95%, 또는 약 적어도 100%만큼 개선시킨다(야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 형질도입 효율과 비교함). 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 rAAV 입자의 세포(예를 들어, 안구 또는 CNS의 세포)로의 형질도입 효율을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 중 어느 하나만큼 개선시킨다(야생형 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 형질도입 효율과 비교함). AAV 입자 세포(예를 들어, 배양 또는 조직의 일부분의 세포)로의 형질도입 효율을 측정하는 수단은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포의 집합(예를 들어, 배양 또는 조직의 일부분의 세포)을, 세포내에서 발현되는 경우, 분석 가능한 리포터(예를 들어, GFP 형광, sFLT 생성 등)를 생성하는 벡터를 함유하는 rAAV 입자의 농축물로 감염시킬 수 있다.
AAV 캡시드 단백질
일부 양태에서, 본 발명은 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 제공하며; 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 VP1, 또는 VP3이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3)의 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 AAV 캡시드 단백질의 적은 탈아미드화를 야기한다. 본 발명의 AAV 캡시드 단백질의 비 제한 예는 다음 AAV 혈청형 중 어느 하나의 VP1 및/또는 VP3을 포함한다: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, 또는 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 추가로 포함한다.
AAV 입자의 생성
형질감염, 안정한 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 혼성체, 헤르페스바이러스-AAV 혼성체(문헌[Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789]), 및 바쿨로바이러스-AAV 혼성체(문헌[Urabe, M. et al., (2002) Human Gene Therapy 13(16):1935-1943; Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet. 20(R1): R2-R6])를 포함하는 감염성 혼성체 바이러스 생성 시스템을 포함하는 다양한 방법이 rAAV 벡터의 생성을 위해 당 업계에 공지되어 있다. rAAV 바이러스 입자 생성을 위한 rAAV 생성 배양은 다음의 모든 것이 필요하다: 1) 적합한 숙주 세포, 2) 적합한 보조 바이러스 기능, 3) AAV rep, 및 cap 유전자, 및 유전자 산물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열에 측접된 핵산(예컨대, 치료용 핵산)(예를 들어, GNPTAB를 인코딩하는 AAV 게놈); 및 5) 적합한 배지, 및 rAAV 생성을 지원하는 배지 성분. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 영장류 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 인간-유래 세포주 예컨대, HeLa, A549, 293, 또는 Perc.6 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 보조 바이러스 기능은 야생형, 또는 돌연변이 아데노바이러스(예컨대, 온도 감응성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스(HSV), 바쿨로바이러스, 또는 보조 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV rep, 및 cap 유전자 산물은 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니나, AAV rep 유전자 산물은, rep 유전자 산물이 복제되어, rAAV 게놈을 패키징하는 기능을 할 수 있는 한, rAAV 벡터 게놈의 ITR과 동일한 혈청형의 것이다. 당 업계에 공지되어 있는 적합한 배지를 rAAV 벡터의 생성을 위해 사용할 수 있다. 이들 배지는, 제한 없이, 변형된 이글 배지(Eagle Medium)(MEM), 변형된 둘베코 이글 배지(Dulbecco's Eagle Medium)(DMEM), 주문제조형 제형, 예컨대, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에서 사용하기 위한 주문제조형 배지와 관련하여, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제 6,566,118호에 기재된 것, 및 미국 특허 제 6,723,551호에 기재된 바와 같은 Sf-900 II SFM 배지를 포함하여, Hyclone 연구소 및 JRH에 의해 생성된 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 아데노바이러스, 또는 HSV에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 보조 기능은 바쿨로바이러스에 의해 제공되며, 숙주 세포는 곤충 세포(예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 세포)이다. 일부 구현예에서, AAV cap 기능은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 제공하며, VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시킨다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, VP1, 또는 VP3)의 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 AAV 캡시드의 적은 탈아미드화를 야기한다.
rAAV 입자를 생성하는 한 가지 방법은 3중 형질감염 방법이다. 요약하면, 보조 아데노바이러스 플라스미드와 함께, rep 유전자, 및 캡시드 유전자를 함유하는 플라스미드를 (예를 들어, 인산칼슘 방법을 사용하여) 세포주(예를 들어, HEK-293 세포)로 형질감염시킬 수 있으며, 바이러스를 수집하고, 선택적으로 정제할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 입자를 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep, 및 cap을 인코딩하는 핵산, 및 AAV 보조 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 숙주 세포로의 3중 형질감염에 의해 생성하였으며, 숙주 세포로의 핵산의 형질감염은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 생성시킨다.
일부 구현예에서, rAAV 입자를 생성 세포주 방법에 의해 생성시킬 수 있다(문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269]; 미국 특허 공보 제 US2004/0224411호; 및 문헌[Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299] 참조). 요약하면, 세포주(예를 들어, HeLa, 293, A549, 또는 Perc.6 세포주)를 rep 유전자, 캡시드 유전자, 및 프로모터-이종성 핵산 서열(예를 들어, GNPTAB)을 포함하는 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드로 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 세포주를 스크리닝하여, rAAV 생성을 위한 우세한 클론을 선택할 수 있고, 그 후, 생성 생물반응기로 확장시킬 수 있으며, 보조 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 또는 HSV)로 감염시켜, rAAV 생성을 개시할 수 있다. 후속하여, 바이러스를 수집할 수 있고, 아데노바이러스를 (예를 들어, 열에 의해) 불활성화시킬 수 있고/있거나, 제거할 수 있으며, rAAV 입자를 정제할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 입자를 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep, 및 cap을 인코딩하는 핵산, 및 AAV 보조 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생성 세포주에 의해 생성하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 생성 세포주 방법은 3중 형질감염 방법과 비교하여, 거대한 게놈에 의한 rAAV 입자의 생성에 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, AAV rep, 및 cap 유전자, 및/또는 rAAV 게놈을 인코딩하는 핵산을 생성 세포주 내에서 안정하게 유지시킨다. 일부 구현예에서, AAV rep, 및 cap 유전자, 및/또는 rAAV 게놈을 인코딩하는 핵산을 하나 이상의 플라스미드 상에서 세포주로 도입시켜, 생성 세포주를 생성시킨다. 일부 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈을 동일한 플라스미드 상에서 세포내로 도입시킨다. 다른 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈을 상이한 플라스미드 상에서 세포내로 도입시킨다. 일부 구현예에서, 플라스미드로 안정하게 형질감염된 세포주는 세포주의 다회 계대배양(예를 들어, 세포의 5, 10, 20, 30, 40, 50회 이상의 계대배양) 동안 플라스미드를 유지시킨다. 예를 들어, 플라스미드(들)는 세포 복제물로서 복제될 수 있거나, 플라스미드(들)는 세포 게놈 내로 혼입될 수 있다. 세포(예를 들어, 인간 세포) 내에서 플라스미드가 자체적으로 복제할 수 있도록 하는 다양한 서열이 확인되었다(예를 들어, 문헌[Krysan, P.J. et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033] 참조). 일부 구현예에서, 플라스미드(들)는 플라스미드를 보유하는 세포의 선택을 가능하게 하는 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 마커)를 함유할 수 있다. 포유류 세포에서 통상적으로 사용되는 선택 마커는 제한 없이 블라스티시딘(blasticidin), G418, 히그로마이신 B(hygromycin B), 제오신(zeocin), 푸로마이신(puromycin), 및 이들의 유도체를 포함한다. 세포 내로 핵산을 도입하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 제한 없이 바이러스 형질도입, 양이온성 형질감염(예를 들어, 양이온성 중합체 예컨대, DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 또는 양이온성 지질 예컨대, 리포펙타민(lipofectamine) 사용), 인산칼슘 형질감염, 미세주입, 입자 충격, 전기천공, 및 나노입자 형질감염을 포함한다(더욱 세부사항을 위해, 예를 들어, 문헌[Kim, T.K. and Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178] 참조).
일부 구현예에서, AAV rep, 및 cap 유전자, 및/또는 rAAV 게놈을 인코딩하는 핵산을 생성 세포주의 게놈 내로 안정하게 혼입시킨다. 일부 구현예에서, AAV rep, 및 cap 유전자, 및/또는 rAAV 게놈을 인코딩하는 핵산을 하나 이상의 플라스미드 상에서 세포주로 도입시켜, 생성 세포주를 생성시킨다. 일부 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈을 동일한 플라스미드 상에서 세포내로 도입시킨다. 다른 구현예에서, AAV rep, AAV cap, 및 rAAV 게놈을 상이한 플라스미드 상에서 세포내로 도입시킨다. 일부 구현예에서, 플라스미드(들)는 플라스미드를 보유하는 세포의 선택을 가능하게 하는 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 마커)를 함유할 수 있다. 다양한 숙주 세포 내로 핵산을 안정하게 혼입시키는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 반복 선택(예를 들어, 선택 마커의 사용을 통함)를 사용하여, 선택 마커(및 AAV cap, 및 rep 유전자, 및/또는 rAAV 게놈)를 함유하는 핵산이 혼입된 세포를 선택할 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산을 부위 특이적 방식으로 세포주 내로 혼입시켜, 생성 세포주를 생성시킬 수 있다. FLP/FRT(예를 들어, 문헌[O'Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355] 참조), Cre/loxP(예를 들어, 문헌[Sauer, B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170] 참조), 및 phi C31-att(예를 들어, 문헌[Groth, A.C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000] 참조)와 같은 수종의 부위 특이적 재조합 시스템이 당 업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 생성 세포주는 영장류 세포주(예를 들어, 비 인간 영장류 세포주, 예컨대, Vero, 또는 FRhL-2 세포주)로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 세포주는 인간 세포주로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 생성 세포주는 HeLa, 293, A549, 또는 PERC.6®(Crucell) 세포로부터 유래한다. 예를 들어, 생성 세포주를 생성하기 위한, AAV rep, 및 cap 유전자를 인코딩하는 핵산, 및/또는 거대 rAAV 게놈의 세포주로의 도입 및/또는 안정한 유지/혼입 전에, 세포주는 HeLa, 293, A549, 또는 PERC.6®(Crucell) 세포주, 또는 이들의 유도체이다.
일부 구현예에서, 생성 세포주를 현탁액에서 성장하도록 적용시킨다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 지지체-의존적 세포는 통상적으로 마이크로담체 비드와 같은 기질이 부재하는 현탁액에서 성장할 수 없다. 세포주를 현탁액에서 성장하도록 적용시키는 단계는, 예를 들어, 응집(및 선택적으로 소포제)를 방지하기 위해, 칼슘 및 마그네슘 이온이 부재하는 배양 배지를 사용하고, 실리콘화 화합물로 코팅된 배양 용기를 사용하여, 패들(paddle)이 교반되는 스피너(spinner) 배양에서 세포주를 성장시키는 단계, 각 계대배양에서 (큰 응집물이 아니거나, 용기의 측면에 있는) 배양 중의 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로 기재된 것으로는, 예를 들어, ATCC 자주 묻는 질문 파일(atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspx의 월드와이드 웹에서 입수 가능함)을 참조한다.
본 발명에 적합한 AAV 생성 배양 배지는 0.5% 내지 20%(v/v, 또는 w/v)의 수준의 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질로 보충될 수 있다. 대안적으로, 당 업계에 공지된 바와 같이, AAV 벡터는 또한 동물-유래 산물 무함유 배지로서 지칭될 수 있는 무혈청 조건하에서 생성할 수 있다. 당업자는 생성 배양시 AAV의 역가를 증가시키기 위해, AAV 벡터의 생성을 지원하도록 설계된 시판용 또는 주문제조형 배지를 제한 없이, 글루코스, 비타민, 아미노산 및, 또는 성장 인자를 포함하는 당 업계에 공지된 하나 이상의 세포 배양 성분으로 보충할 수 있다는 것을 이해할 수있다.
AAV 생성 배양은 사용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 온도 범위에 걸쳐, 다양한 길이의 시간 동안 등) 하에서 성장시킬 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이, AAV 생성 배양은, 예를 들어 롤러 병, 중공 섬유 필터, 마이크로담체 및 패킹 층(packed-bed) 또는 유동층 생물반응기와 같은 적합한 부착 의존적 용기에서 배양될 수 있는 부착 의존적 배양을 포함한다. AAV 벡터 생성 배양은 또한, 예를 들어 스피너 플라스크, 교반 탱크 생물반응기 및 일회용 시스템, 예컨대 웨이브 백 시스템(Wave bag system)을 포함하는 다양한 방법으로 배양될 수 있는 HeLa, 293 및 SF-9 세포와 같은 현탁액-적용 숙주 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터 입자는 생성 배양의 숙주 세포의 용해에 의하거나, 생성 배양으로부터의 소비된 배지의 수확에 의해, AAV 생성 배양으로부터 수확될 수 있으며, 단, AAV 입자가 무손상 세포로부터 배지의 방출될 수 있도록 하기 위해, 당 업계에 공지된 조건하에서 세포를 배양한다(미국 특허 제 6,566,118호에 더욱 자세하게 기재된 바와 같음). 세포를 용해시키는 적합한 방법은 또한 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 다회의 동결/해동 사이클, 초음파 처리, 미세유체화 및 세척제 및/또는 프로테아제와 같은 화학 물질로의 처리를 포함한다.
추가의 구현예에서, AAV 입자를 정제한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된"은 AAV 입자가 자연 발생하거나, 초기에 제조되는 경우에도 존재할 수 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 부재하는 AAV 입자의 제조물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 AAV 입자는 배양 용해액 또는 생성 배양 상청액과 같은 공급원 혼합물로부터 이를 농축시키기 위한 정제 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 농축은, 예를 들어, 용액에 존재하는 DNase 내성 입자(DRP) 또는 게놈 카피(gc)의 비율 또는 감염성과 같은 다양한 방법으로 측정할 수 있거나, 보조 바이러스, 배지 성분 등을 포함하여, 생성 배양 오염물 또는 공정 중 오염물을 포함하는 오염물과 같은, 공급원 혼합물에 존재할 수 있는 제2의 잠재적 간섭 물질과 관련하여, 이를 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 숙주 세포 파편을 제거하기 위해, AAV 생성 배양 수확물을 정제한다. 일부 구현예에서, 생성 배양 수확물을, 예를 들어, DOHC 등급 DOHC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, A1HC 등급 Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 및 0.2 μm 필터 Opticap XL1O Millipore Express SHC 친수성 막 필터를 포함하는 일련의 깊이의 필터를 통한 여과에 의해 정제한다. 또한, 당 업계에 공지된 0.2 μm 이상의 공극 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 원심분리 또는 여과와 같이, 당 업계에 공지된 다양한 다른 표준 기법에 의해 정제를 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, AAV 생성 배양 수확물을 Benzonase®로 추가 처리하여, 생성 배양 중에 존재하는 임의의 고 분자량 DNA를 분해시킨다. 일부 구현예에서, Benzonase® 분해는, 예를 들어 주위 온도 내지 37℃의 범위의 온도에서 30분 내지 수시간 동안 Benzonase®의 1 단위/ml 내지 2.5 단위/ml의 최종 농도를 포함하는 당 업계에 공지된 표준 조건하에서 수행한다.
다음 정제 단계 중 하나 이상을 사용하여, AAV 입자를 단리하거나, 정제할 수 있다: 평형 원심분리; 관류식 음이온 교환 여과; AAV 입자를 농축시키기 위한 접선 유동 여과(TFF); 인회석 크로마토그래피에 의한 AAV 포획; 보조 바이러스의 열 불활성화; 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 AAV 포획; 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충액 교환; 나노여과; 및 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피에 의한 AAV 포획. 이 단계는 단독으로, 다양한 조합으로 또는 상이한 순서로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 하기에 기재된 바와 같은 순서로 모든 단계를 포함한다. AAV 입자를 정제하는 방법은, 예를 들어 문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232]; 미국 특허 제 6,989,264호 및 제 8,137,948호; 제 WO 2010/148143호에 제시되어 있다.
약제학적 조성물
일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 입자(예를 들어, rAAV 입자)는 약제학적 조성물 중에 존재한다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재되거나, 당업계에 공지된 임의의 투여 방식에 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은, rAAV 입자의 안정성을 개선시키고/시키거나, 형질도입 효율을 개선시키기 위해; 예를 들어 rAAV 캡시드 단백질의 아세틸화를 개선시키기 위해, VP1 및/또는 VP3의 위치 2의 아미노산 잔기의 치환에 사용하기 위해, 변형된 rAAV 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은, rAAV 입자의 안정성, 및/또는 형질도입 효율을 조절하기 위해(예를 들어, 안정성, 및/또는 형질도입 효율을 증가시키거나, 안정성, 및/또는 형질도입 효율을 저하시키기 위해); 예를 들어, 탈아미드화를 조절하는(예를 들어, 탈아미드화를 증가시키거나, 탈아미드화를 저하시키는) 아미노산 잔기의 치환에 사용하기 위해, 변형된 rAAV 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물 중에 존재한다. 당 업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이며, 액체 용액 또는 현탁액, 유제 또는 사용 전에 액체 중에서의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 부여하거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 다양한 삼투압을 위한 염, 캡슐화제, pH 완충 물질 및 완충액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성없이 투여될 수 있는 것으로, 안구에 직접 전달하기에 적합한 임의의 약제학적 제제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 소르비톨, 다양한 TWEEN 화합물 중 어느 하나, 및 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 및 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등과 같은 유기산의 염이 그 안에 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제에 대한 자세한 논의는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 rAAV 입자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 인간에 투여하기에 적합한 것이다. 이러한 담체는 당 업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580] 참조).
이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 땅콩유, 대두유, 광유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 것을 포함하는 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 추가의 구성성분, 예를 들어 보존제, 완충액, 긴장성 제제, 항산화제 및 안정화제, 비이온성 습윤제 또는 정제제, 점도-증가제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 단일 단위 투여 또는 다회투여 형태로 패키징될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 실질적으로 등장 성인 멸균 용액으로 제형화된다.
키트, 및 제품
본 발명은 또한 본 개시내용의 rAAV 입자, 및/또는 약제학적 조성물 중 어느 하나를 포함하는 키트 또는 제품을 제공한다. 키트, 또는 제품은 본 발명의 rAAV 입자, 또는 rAAV 입자 조성물 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 rAAV 입자의 안정성을 개선시키고/시키거나, 형질도입 효율을 개선시키기 위해; 예를 들어, rAAV 캡시드 단백질의 아세틸화를 개선시키기 위해, VP1 및/또는 VP3의 위치 2의 아미노산 잔기의 치환에 사용하기 위해, 사용된다. 일부 구현예에서, 키트는, rAAV 입자의 안정성, 및/또는 형질도입 효율을 조절하기 위해(예를 들어, 안정성, 및/또는 형질도입 효율을 증가시키거나, 안정성, 및/또는 형질도입 효율을 저하시키기 위해); 예를 들어, 탈아미드화를 조절하는(예를 들어, 탈아미드화를 증가시키거나, 탈아미드화를 저하시키는) 아미노산 잔기의 치환에 사용하기 위해, 사용된다.
일부 구현예에서, 키트, 또는 제품은 rAAV 입자 조성물의 투여에 대한 설명서를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 키트, 또는 제품은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서와 함께, 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 요망되는 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 패키징 재료가 또한 포함될 수 있으며, 예를 들어 바이알(예컨대, 밀봉된 바이알), 용기, 앰플, 병, 통, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함하여, 당 업계에 공지된 임의의 패키징 재료일 수 있다. 이들 제품은 추가로 멸균되고/되거나, 밀봉될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트, 또는 제품은 본 명세서에 기재된 완충액, 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 중 하나 이상을 추가로 함유한다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에 기재된 바와 같음). 일부 구현예에서, 키트, 또는 제품은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 용액, 및/또는 본 명세서에 기재된 추가의 구성성분을 포함한다. 본 명세서에 기재된 키트, 또는 제품은 단일 단위 투여 또는 다회투여 형태로 패키징될 수 있다. 키트 또는 제품의 내용물은 일반적으로 멸균 상태로 제형화되고, 동결건조될 수 있거나, 실질적으로 등장성 용액으로 제공될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것이고, 그에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 본 명세서에 기재된 본 출원의 사상 및 범주 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다.
실시예 1: 재조합 AAV 바이러스 캡시드 단백질의 완전한 특성화를 위한 직접 LC/MS, 및 LC/MS/MS
재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)는 비병원성 성질, 분열 및 비 분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력 및 장기적인 유전자 발현으로 인해, 일반적인 유전자 요법 벡터가 되었다. 현재, 근이영양증, 혈우병, 파킨슨병, 레베르 선천 흑내장(Leber's congenital amaurosis) 및 황반 변성과 같은 수많은 질병 표적에 대한 임상 시험에서 AAV 기반 유전자 요법이 사용된다.
AAV는 20면체 외피 내에 캡슐화된 단일 가닥 DNA 게놈을 가진 작은 비 외피 파르보바이러스이다. 각각의 캡시드는 3종의 바이러스 캡시드 단백질 VP1(87kDa), VP2(73kDa), 및 VP3(62 kDa)의 60개의 카피를 대략 1:1:10 비율로 포함한다. 3종의 바이러스 캡시드 단백질은 대체 스플라이싱 및 비정형 개시 코돈을 사용함으로써, 동일한 개방형 리딩 프레임으로부터 발현되며, 따라서 중첩 서열을 갖는다. VP1은 VP3과 비교하여, 약 137개의 추가의 N-말단 아미노산 잔기를 가지며, VP2는 VP3과 비교하여, 약 65개의 추가의 N-말단 아미노산 잔기를 가진다. 적어도 13개의 AAV 혈청형, 및 약 150개의 유전자 서열이 인간, 및 비 인간 영장류 조직으로부터 단리되었으며; AAV 혈청형은 바이러스 캡시드 단백질, 및 그의 해당 세포 수용체, 및 표적화를 위한 보조 수용체의 아미노산 서열이 상이하다.
AAV 캡시드는 내부의 게놈을 보호하는 것 이외에도 수용체 결합, 엔도솜으로부터의 바이러스 탈출 및 바이러스 감염 주기에서 바이러스 DNA의 핵으로의 수송을 매개하는 중요한 역할을 하여, 바이러스 감염성에 직접적으로 영향을 미친다. VP1 N-말단은 바이러스의 엔도솜 탈출에 중요한 포스포리파제 PLA2 도메인(아미노산 52 내지 97)을 함유하는 것으로 밝혀졌다[1-3]. VP1 및 VP2의 N-말단은 또한 핵 위치화 신호로서 3개의 염기성 아미노산 클러스터를 함유한다. 이들 서열은 상이한 AAV 혈청형 사이에 고도로 보존된다. 이들 아미노산의 돌연변이는 감염성을 완전히 감소시키거나, 제거하는 것으로 나타났다[4]. 추가로, 각각의 AAV 혈청형은 해당 서열 특이적 수용체 및 보조 수용체를 갖는다. 예를 들어 헤파린 황산프로테오글리칸은 AAV2의 주요 수용체로 확인되었고, αVβ5 인테그린, 섬유아세포 성장 인자 수용체 1 및 간세포 성장 수용체를 포함하여, 수개의 다른 보조 수용체가 확인되었다[5-8]. AAV2 캡시드 단백질의 돌연변이 분석에 의해, 헤파린 및 HeLa 세포 결합에 기여하는 헤파린 결합 모티프로서 염기성 아미노산 그룹(아르기닌484, 487, 585 및 리신532)이 확인되었다[9]. AAV2의 NGR 도메인은 바이러스 세포 유입에 필수적인 인테그린 α5β1 결합 도메인으로 확인되었다[10]. 요약하면, 바이러스 캡시드 단백질 서열은 바이러스 감염 주기에서 세포 표적화 및 운반에 중요하다. 상이한 생성 조건이 바이러스 캡시드 단백질의 상이한 발현 수준, 번역 후 변형 및 절두를 야기할 수 있으므로, 바이러스 캡시드 단백질은 유전자 요법 개발 프로그램에서의 제품 일관성을 보장하기 위해, 특성화되고, 모니터링될 필요가 있다.
통상적으로, SDS-PAGE는 AAV 바이러스 캡시드 단백질을 특성화하는 데 사용되어, 87 kDa, 73kDa, 및 62 kDa와 같은 대략적인 분자량 정보를 제공한다. VP2를 제외하고, 바이러스 캡시드 단백질의 차단된 N-말단으로 인해, Edman 시퀀싱으로부터는 서열 정보를 얻을 수 없었다. 다중 AAV의 X선 구조가 밝혀졌으나, 결정 구조에서 VP3 영역 서열만이 관찰되었다. VP3의 15개의 N-말단 아미노산 잔기는 가능하게는 그의 고유한 장애로 인해, 여전히 X선 구조에서 누락되어 있다[11-13]. 원자 구조에서 VP1 및 VP2 N-말단 영역의 정보 부족은 캡시드 내의 VP1 및 VP2의 낮은 화학양론성으로 인한 것일 수 있다. 추가로, 일부 문헌에 보고된 바와 같이, VP1과 VP2의 N-말단은 캡시드 내부에 내재되어 있으며, 천연 상태의 항체에는 접근할 수 없다[3, 14, 15]. 통상적으로, VP의 특성화에 Gel-LC/MS 방법(SDS-PAGE, 겔 중 트립신에 의한 분해, 및 LC/MS/MS)이 사용되었다[16-18]. 그러나, 이러한 방법에 의해서는 겔로부터의 펩타이드의 제한된 회수로 인해, VP의 100% 서열 범위를 얻을 수 없었으므로, 이러한 접근법을 사용하여서는 VP1, VP2 및 VP3의 N-말단이 확인되지 않았다.
유기산에 의한 해리 후에 담배 모자이크 바이러스 U2를 포함하는 수종의 바이러스 캡시드 단백질에 대해 MALDI-TOF MS를 사용한 직접 분석이 보고되었다[19]. 아미드 수소 교환 및 질량 분광분석 후의 직접 펩타이드 맵핑이 브롬 모자이크 바이러스(brome mosaic virus)(BMV)의 캡시드에서 pH에 의해 유도된 구조적 변화의 연구에 사용되어 왔다[20]. AAV는 캡시드 단백질 및 게놈만을 함유하는 비 외피 바이러스이므로, 단백질의 RP-LC/MS 및 펩타이드 맵핑의 LC/MS/MS에 의해 AAV 캡시드를 직접 분석하여, SDS-PAGE 분리없이 캡시드 해리 후 100% 서열 범위를 획득할 수 있다. DNA 단편은 공극 용적에서 용리될 수 있으므로, LC/MS에 의한 단백질/펩타이드 검출에 간섭하지 않는다. 이들 방법을 조사하기 위해, 변성 후 상이한 유형의 AAV의 직접 LC/MS를 사용하여, AAV 캡시드 단백질의 단백질 서열 및 번역 후 변형을 모니터링하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AAV의 VP1, VP2 및 VP3의 N-말단을 질량 분광분석에 의해 확인하였다. VP1 및 VP3의 N-말단의 아세틸화를 또한 AAV의 상이한 혈청형에서 확인하였다. VP1, VP2 및 VP3의 서열 범위를 제공하고, VP1 및 VP3의 N-말단 아세틸화를 확인하기 위해, AAV의 직접 LC/MS/MS 펩타이드 맵핑이 또한 개발되었다.
방법
재료 및 시약
디티오프레이톨(DTT), 4-비닐피리딘, 초순도 포름산, 아세트산, 구아니딘-HCl, Tris-HCl, 및 Tris 염기를 Sigma Chemicals(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다. Amicon 울트라-4 필터를 Millipore(미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)로부터 구입하였다. 돼지 시퀀싱 등급 트립신을 Promega(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 구입하였다. 엔도프로테나제 Lys-C 및 Asp-N을 Roche(독일 소재)로부터 구입하였다. 10,000 MWCO의 슬라이드-A-레이저 카세트를 Pierce(미국 일리노이주 록퍼드 소재)로부터 구입하였다.
벡터 생성, 및 정제
AAV 벡터를 이전에 기재된 바와 같이 일시적 3중 형질감염 방법을 사용하여 생성하였다(문헌[Xiao, 1998 #123]). 요약하면, HEK293 세포를 폴리에틸렌이민, PEI 및 1:1:1 비율의 3종의 플라스미드(ITR 벡터, AAV rep/cap, 및 Ad 보조 플라스미드)를 사용하여 형질감염시켰다. 벡터 플라스미드는 AAV2로부터의 ITR 서열 및 벡터 게놈 CBA-EGFP를 함유한다. EGFP 발현을 문헌[(Miyazaki, 1989 #124)(Niwa, 1991 #125)]에 기재된 바와 같은 CMV 인핸서 닭 베타 액틴 혼성체 프로모터(CBA)에 의해 유도한다. AAV rep/cap 보조는 AAV2로부터의 rep 서열 및 혈청형 특이적 캡시드 서열을 함유하였으며, rep2/cap2, rep2/cap5, rep2/cap7 등으로 명명된다. 사용된 pAd 보조는 pHelper(Stratagene/Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)였다. AAV의 정제를 문헌[Qu et al . (2007, J. Virol. Methods 140:183-192)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
LC/MS 무손상 단백질 분석
Amicon 울트라-4 필터(10kDa MWCO)에 의해 AAV 비리온을 농축시키고, 10% 아세트산에 의해 변성시킨 후, Acquity UPLC -Xevo® QTOF MS 장치(Waters, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재)에서 직접 분석을 수행하였다. UPLC BEH C4, 또는 C8 컬럼(1.7 μm, 2.1mm i.d.)에 의해 0.25 ml/min 유속으로 분리를 수행하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% 포름산이었고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다. 최종 구배는 다음과 같았다: 10% B에서 20% B로 6분, 20% B에서 30% B로 10분 후, 30% B에서 38% B로 40분. MS의 경우, 모세관 전압, 및 샘플링 콘 전압은 각각 3.5 kV, 및 45 V로 설정하였다. 500 내지 4000의 m/z 범위의 감도 모드로 질량 스펙트럼을 얻었다. 질량 보정을 위해 보정제로서 요오드화나트륨으로 보조 보정을 수행하였다. Masslynx 소프트웨어의 MaxEnt1을 단백질 디콘볼루션에 사용하였다.
AAV2 VP의 효소적 분해
농축된 AAV2 비리온을 pH 8.5에서 6M 구아니딘-HCl, 0.1 M Tris로 변성시켰다. 단백질을 암소에서 1시간 동안 55℃에서 30 mM DTT로 환원시키고, 실온에서 2시간 동안 0.07% 4-비닐피리딘으로 알킬화시켰다. 1M DTT를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 샘플을 슬라이드-A-레이저 카세트(10,000 MWCO)로 pH 8.5의 25 mM Tris 완충액에서 약 18시간 동안 투석하였다. 투석 후, 샘플을 3개의 분액으로 나누었다. 각각의 분액을 각각 1:25 효소: 단백질 비율(wt/wt)의 트립신, 또는 1:50의 Lys-C, 또는 1:100의 Asp-N으로 37℃에서 18시간 동안 분해하였다.
LC/MS/MS 펩타이드 맵핑
패킹 재료의 Magic C18(5 μm, Bruker, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)이 장착된 홈 패킹 nanoLC 컬럼(75 μm x10mm)을 사용하여, Orbitrap Velos 질량 분광분석기(Thermo-Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)와 함께 NanoAcquity HPLC 시스템(Waters, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재)을 사용하여, 300 nl/min 유속에서 나노 LC/MS/MS를 수행하였다. 이동상 A, 및 B는 각각 물 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다. 구배는 2% B에서 60% B로 121분 동안이었다.
velos의 공급원 매개변수는 다음과 같다: 공급원 전압: 2.5 kv, 모세관 온도 275℃; S-렌즈 RF 수준: 55%. 이온 트랩에서 60,000 분해능, 및 10 MS/MS에서 정확한 ms에 의해 상위 10개의 데이터 의존적 방법을 사용하여, 데이터를 얻었다. Mascot를 AAV2 바이러스 캡시드 단백질 서열에 대한 데이터베이스 검색에 사용하였다. 10 ppm의 MS 내성, 및 0.8 Da의 ms/ms 내성을 데이터베이스 검색을 사용하였다.
UPLC/MS/MS 펩타이드 맵핑
Acquity UPLC-Xevo qTOF MS에서 UPLC/MS/MS에 의해 단백질 분해를 또한 분석하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 포름산의 이동상 구배와 유속 0.25 ml/min의 BEH300 C18 컬럼(2.1 x150 mm)을 분리에 사용하였다. 200 내지 2000의 질량 범위에서 양성 MSe 모드로 질량 스펙트럼을 얻었다.
결과
AAV 변성 방법
세척제, 열, 고염 또는 저 pH 또는 고 pH의 완충액을 사용하여, 다양한 방법을 통해 AAV를 변성시킬 수 있다. 열 변성은 단백질 침전을 야기할 수 있으며, 결과적으로 역상 컬럼이 쉽게 폐쇄되거나, 과압이 부가된다. 고염에 의한 변성은 LC/MS 분석 전에 추가적인 탈염 단계가 필요하다. 정확한 질량 스펙트럼을 가능하게 하므로, 10% 아세트산에 의한 변성을 LC/MS 무손상 단백질 분석에 사용하였다. 펩타이드 맵핑을 위해, 0.1% RapiGest 또는 6 M 구아니딘 HCl을 변성 시약으로 사용할 수 있다.
무손상 단백질 분석 방법 개발
급격한 구배에서 UPLC BEH C4 컬럼을 사용하여, AAV2의 초기 무손상 단백질 분석을 수행하였다. 이러한 조건 하에서, 전체 이온 크로마토그램 중 단 하나의 단일 피크만이 관찰되었고, 그 질량은 VP3에 해당하였다(도 1a). 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, VP가 모두 동시 용리된 경우, VP1 및 VP2의 낮은 화학량론 또는 VP3에 의한 VP1 및 VP2 신호의 저해에 의해, VP1 및 VP2의 부재가 가능한 것으로 사료된다. VP1 및 VP2를 검출하기 위해, 주입 또는 컬럼 길이의 증가, 더 완만한 구배의 사용 및 대체 컬럼의 사용을 시도하였다. 0.5% B/min에서의 더 완만한 구배와 더 높은 로딩(1.7 μg)은 좌측에 차상위 피크를 야기하였다(도 1b). 컬럼 길이를 10 cm에서 15 cm로 증가시키면, 차상위 피크의 분리가 강화되지 않았다(도 1c). 그러나, BEH C8 컬럼을 사용한 경우, 차상위 피크는 주 피크와 더 차이가 났으며, 개선된 신호 강도가 관찰되었다(도 1d).
결과적으로, 도 2a에 도시된 신호 강도에서 이러한 차상위 피크에서 VP1 및 VP2 질량이 얻어졌다. VP1 및 VP3의 질량은 각각 아미노산 2 내지 735(아세틸화), 및 아미노산 204 내지 735(아세틸화)에 해당한다(도 2a 및 도 2b). VP2(아미노산139 내지 735)에서는 아세틸화가 관찰되지 않았다. 추가로, VP3보다 더 작은 질량의 부 피크가 관찰되었으며, 그 질량은 하나가 아세틸화된 아미노산 서열 212 내지 735에 해당하였다(도 2b). VP3이 AAV2에서 2개의 ATG 코돈을 함유하고: ATG GCTACAGGCAGTGGCGCACCA ATG GCAGAC (SEQ ID NO:1), 2개의 가능한 N-말단(밑줄쳐짐)이 야기되므로: MATGSGAPMAD(SEQ ID NO:2), 이들 데이터는 DNA 서열에 일치한다. N-말단 메티오닌 잔기가 VP1 및 VP3 둘 모두에 존재하지 않았으며, 이는 무손상 단백질 분석에 의해 측정된 바와 같다. 아세트산을 사용하지 않는 대체 변성 방법을 사용하는 AAV 제조에서 VP1 및 VP3의 아세틸화가 또한 관찰되므로, VP1 및 VP3의 아세틸화는 방법에 의해 인위적으로 유도된 것이 아니다(10% 아세트산에 의한 AAV의 변성). 또한, 무손상 단백질 데이터에 의해, 수개의 N-연결 공통 서열이 존재함에도 불구하고, 바이러스 캡시드 단백질에 글리코실화가 존재하지 않음이 확인되었다[16].
LC/MS/MS 펩타이드 맵핑
무손상 단백질 분석에서 관찰된 N-말단 및 아세틸화를 추가로 확인하기 위해, 펩타이드 맵핑을 다중 효소를 사용하여 수행하고, 다중 장치를 사용하여 분석하였다. 변성 방법 및 탈염 단계를 포함하는 다양한 샘플 제조 방법을 평가하였다. 6M 구아니딘 HCl에 의한 변성, 4-비닐피리딘에 의한 환원 및 알킬화, 및 슬라이드-A-레이저를 사용한 투석 후, 효소적 분해를 포함하는 최종 분해 방법에 의해, 분해 과정 동안 인위적 변형이 적은 정확한 펩타이드 맵핑이 생성되었다. 5 μg의 출발 물질을 시험하여, 나노 LC/MS/MS 및 UPLC/MS/MS를 사용하여 전체 서열 범위를 생성시켰다.
나노 LC/MS/MS로부터 트립신에 의한 분해의 Mascot 검색만으로도 이온 점수 13 컷 오프가 나타난 78% 서열 범위가 생성되었으며, 이는 도 3에 도시된 바와 같다. LC/MS/MS로부터 누락된 2개의 큰 트립신에 의한 펩타이드 T27, 및 T38(박스 표시)이 BEH C18 컬럼이 장착된 Xevo TOF MS에서의 LC/MS에서 발견되었다(도 3). 추가로, T27 및 T38 펩타이드 서열의 대부분이 Asp-N 분해의 나노 LC/MS/MS에 의해 추가로 확인되었으며, 이는 도 3에서 이탤릭체로 도시된 바와 같다. 전체 N-말단 및 C-말단 펩타이드가 Lys-C 분해에 의해 포괄되었으며, 이는 도 3에 밑줄 친 바와 같다. 따라서, VP1의 100% 서열 범위가 다중 효소 분해 및 2회의 LC/MS/MS 방법을 통해 달성되었다.
LC/MS/MS에 의해, 무손상 단백질 분석에서 관찰된 VP1, VP2, 및 VP3의 N-, 및 C-말단 및 VP1, 및 VP3의 N-말단 아세틸화를 확인하였다. 도 4a 내지 도 4c에 VP1 N-말단 트립신에 의한 펩타이드 A(Ac)ADGYLPDWLEDTLSEGIR(SEQ ID NO:4)(도 4a), VP2 N-말단 Asp-N 유래 펩타이드(APGKKRPVEHSPVEP)(SEQ ID NO:15)(도 4b), 및 VP3 N-말단 Asp-N 펩타이드 A(Ac)TGSGAPM(SEQ ID NO:5)(도 4c)의 MS/MS 스펙트럼이 제시되어 있다. MS/MS에 의해, VP1, 및 VP3 펩타이드 둘 모두에서 N-말단 알라닌 잔기의 아세틸화의 위치를 확인하였다. 도 4a에서 42 Da 질량 이동이 나타난 검출된 모든 b 이온 및 비 변형된 y18, 및 y17 이온의 존재는 42 da-변형이 VP1의 N-말단에 위치함을 나타낸다. 유사하게는, 도 4c에서 비 변형된 y3 내지 y8 이온의 존재는 N-말단 알라닌 잔기에서의 아세틸화의 위치를 확인시켰다.
AAV VP N-말단의 비교
AAV2 이외에, AAV1, AAV5, AAV7, AAV9, 및 AAV Rh10을 또한 무손상 단백질 분석에 의해 분석하였다. AAV에서 VP의 이론적 질량, 및 예측된 질량이 표 2에 제시되어 있다.
[표 2]
AAV5가 가장 다양한 AAV 혈청형 서열로서 보고되어 있으나, 그의 N-말단뿐만 아니라, 번역 후 변형은 분석된 AAV 혈청형 사이에서 고도로 보존되어 있으며, 이는 도 5의 서열 정렬에 도시된 바와 같다. 13개의 AAV 혈청형 중 11개에서, VP1의 N-말단은 동일한 13개의 아미노산 잔기 서열(MAADGYLPDWLED)(SEQ ID NO:6)을 공유하며, 13개의 AAV 혈청형 모두는 동일한 VP2의 TAP...N-말단 서열을 갖는다(도 5). AAV2의 LC/MS에 의해, 단백질 수준에서 VP2에서 T가 누락되어 있는 것으로 나타났다. VP3의 N-말단은 3개의의 바이러스 캡시드 단백질 중에서 가장 다양하며, 13개의 AAV 혈청형 중 8개가 MA...N-말단 서열을 공유한다. AAV2와 유사하게, AAV1 및 AAV Rh10은 또한 2개의 ATG 개시 코돈을 가지며, LC/MS 무손상 단백질 분석에 따르면, 제1 코돈이 주 N-말단이다. 흥미롭게도, AAV7이 2개의 잠재적 개시 코돈( GTG GCTGCAGGCGGTGGCGCACCA ATG GCAGACAATAAC...)(SEQ ID NO:7)을 가지나, 무손상 단백질 분석에 따르면, 제2 개시 코돈(ATG)이 선호된다: 213(ac)-737의 VP3`이 주 피크였으며, 203(ac)-737의 VP3은 부 피크였다.
결론
유전자 요법 연구 및 개발에서의 AAV VP의 LC/MS 무손상 단백질 분석, 및 LC/MS/MS 펩타이드 맵핑의 적용
이들 결과에 의해, 변성 후 상이한 유형의 AAV의 직접 LC/MS가 무손상 단백질 수준에서의 정확한 질량 측정에 의해, 단백질 서열 및 번역 후 변형을 모니터하는 간단하고, 효과적인 방법인 것으로 나타났다. AAV의 VP1, VP2 및 VP3의 N-말단을 질량 분광분석에 의해 확인하였다. 또한, VP1 및 VP3의 N-말단의 아세틸화를 AAV의 상이한 혈청형에서 확인하였다. VP1, VP2 및 VP3의 100% 서열 범위를 제공하는 AAV의 직접 LC/MS/MS 펩타이드 맵핑을 개발하고, VP의 N-말단 아세틸화를 확인하였다. 수종의 AAV 혈청형의 서열 정렬 및 무손상 단백질 분석을 기반으로 한, 13개의 AAV 혈청형의 예측 서열의 이론적 질량이 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
각각의 혈청형의 VP1, VP2 및 VP3의 정확한 질량은 고유하며, 따라서, 무손상 단백질 분석은 AAV 캡시드 혈청형을 구별하기 위한 동일성 시험으로서 사용될 수 있다. 표 4 내지 표 6은 13개의 일반적인 AAV 혈청형 간의 VP의 질량 차이를 보여준다. 10 초과의 델타 질량은 보통 글꼴로 표시되고, 10 미만의 델타 질량은 볼드체로 표시된다.
[표 4]
Figure 112023057723104-pat00005
[표 5]
Figure 112023057723104-pat00006
[표 6]
Figure 112023057723104-pat00007
2개의 이소타입 사이의 3개의 모든 VP 중 10 Da 이내의 질량은 관찰되지 않았다. VP2 및 VP3 둘 모두가 AAV1과 AAV6 사이에 단지 2 Da의 차이만 있다 하더라도, AAV1과 AAV6 사이의 VP1의 질량 차이는 36이며, 이는 정확한 질량 측정으로 구별할 수 있을 정도로 유의한 것이다. 따라서, VP1, VP2 및 VP3의 무손상 단백질 측정은 동일성 시험으로서 고도로 특이적이다.
이들 결과는 무손상 단백질 분석, 및 LC/MS/MS를 사용하여, VP를 프로파일링하, VP 발현, 번역 후 변형 및 절두를 모니터링하고, VLP 생성 동안 산물 일관성을 보장할 수 있음을 시사한다. 또한, 이들 두 분석을 사용하여, 캡시드 단백질 조작 적용을 위한 부위 특이적 돌연변이 유발, 또는 구조적 특성화를 확인할 수 있다.
실시예 2: AAV 캡시드 단백질의 N-말단 아세틸화의 역할
세포 단백질의 화학적 변형은 그의 기능을 제어하는 일반적인 수단이다(문헌[Arnesen, T. (2006) Virology 353(2): 283-293]). 아세틸 조효소 A로부터 단백질의 제1 아미노산 잔기의 α-아미노기로의 아세틸기의 전달을 포함하는 N-말단 아세틸화(Nt-아세틸화)(문헌[Brown, J.L. and Roberts, W.K. (1976) J Biol Chem 251: 1009-1014; Arnesen, T. et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106: 8157-8162])은 단백질 변형이 가장 많이 이루어지는 것 중 하나이다. 대부분의 다른 단백질 변형과는 달리, Nt-아세틸화는 비 가역적이며; 이는 주로 단백질 합성 동안 이루어지고, 리보솜과 관련된 N-말단 아세틸트랜스퍼라제(NAT)에 의해 촉매된다(문헌[Gautschi, M. et al. (2003) Mol Cell Biol 23: 7403-7414; Pestana, A. and Pitot, H.C. (1975) Biochemistry 14: 1404-1412; Polevoda, B. et al. (2003) J Biol Chem 278: 30686-97]). 진핵생물에는 수개의 별도의 NAT―NatA-NatF가 존재하고-이들 각각은 하나 이상의 하위단위로 구성되며, 각각, 처음 몇 개의 아미노산의 아미노산 서열에 따라, N-말단의 특정 하위그룹을 아세틸화시킨다(문헌[Jornvall, H. (1975) J Theor Biol 55: 1-12; Persson, B. et al. (1985) Eur J Biochem 152: 523-527]).
실험 데이터는, 아세틸화된 N-말단을 갖는 단백질이 비 아세틸화된 단백질보다 생체내에서 더 안정하다는 것을 시사하며; 즉, Nt-아세틸화는 단백질을 분해로부터 보호한다(문헌[Hershko, A. et al. (1984) Proc Natl Acad Sci U S A 81: 7021-7025]). 이것에 대한 하나의 설명은 작은 단백질 유비퀴틴을 N-말단 아미노산 잔기에 직접 부착시키는 단계를 포함하는 또 다른 N-말단 변형인 유비퀴틴화가 단백질의 후속 분해를 촉진한다는 2004년의 발견일 것이다(문헌[Ben Saadon, R. et al. (2004) J Biol Chem 279: 41414-41421]). 이와 달리, Nt-아세틸화 신호는 또한, 접히지 않았거나, 잘못 접힌 단백질을 분해하고, 생체내 단백질의 화학양론을 조절하는 정성적 제어 메커니즘의 일부일 수 있다(문헌[Hwang, C.S. et al. (2010) Science 327: 973-977]).
분비 경로로 분류될 예정인 단백질 대 시토졸 단백질의 예측된 N-말단 가공에 대한 체계적인 분석에 의해, 시토졸 단백질은 가공에 대해 완전히 편향되었으나, 분비 단백질의 경우에는 이러한 변형에 대해 동일한 반대 편향성이 존재하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Forte, G.M.A. et al. (2011) PLoS Biology, 4 May 2011 Volume 9]). 그의 아세틸화를 야기하는 분비 신호 서열의 돌연변이는 N-말단 가공 기전에 의존적인 방식으로 시토졸로의 오 분류를 야기한다. 따라서, N-말단 아세틸화는 세포질에 유지될 예정인 단백질이 실제로 확실하게 세포질에 유지되도록 하기 위해, 엄격한 추가 단계에 해당하는 초기 폴리펩타이드의 세포 분류의 초기 결정 단계에 해당한다. 진핵 세포는 특정 기능의 수행에 필요한 세포기관으로 일컬어지는 수개의 별도의 구획을 포함한다. 이들 구획의 단백질은 세포질에서 합성되므로, 적절한 세포기관에 확실히 전달되도록 하기 위해서는 복잡한 분류 메커니즘이 필요하게 된다. 단백질은 그의 합성의 매우 초기 단계에서 그의 아미노 말단의 아세틸화에 의해 변형된다. 세포질 단백질 및 주요 세포기관 중 하나인 소포체(ER)에 예정된 단백질에 대한 이러한 변형의 가능성 사이에는 상당한 차이가 존재하며: 세포질 단백질은 통상적으로 아세틸화되지만, ER에 전달되는 단백질은 크게 변형되지 않는다. 더욱이, 특정 ER 단백질이 그의 아세틸화가 유도되도록 조작되는 경우, ER에 대한 그의 표적화는 억제된다(문헌[Forte, G.M.A. et al. (2011) PLoS Biology, 4 May 2011 Volume 9]).
수축성 단백질 액틴 및 트로포미오신(tropomyosin)은 특히 액틴-트로포미오신 결합 및 액토미오신(actomyosin) 조절에 관여하는 적절한 기능을 위해서는, NatB 매개된 Nt-아세틸화가 필요한 것으로 나타났다(문헌[Coulton, A.T. et al. (2010) J Cell Sci 123: 3235-3243; Polevoda, B. et al. (2003) J Biol Chem 278: 30686-97]). 따라서, AAV 캡시드 단백질의 Nt 아세틸화는 rAAV 벡터의 형질도입 가능성에 중요할 수 있다. AAV 벡터가 핵으로 유입되지 못하는 경우, 이는 결과적으로 세포를 형질도입시키지 못한다. 엔도솜으로부터 핵으로의 AAV 캡시드의 이동에서의 액틴 필라멘트 및 FKBP52(문헌[FK506-binding protein p52])의 역할은 잘 정의되어있다(문헌[Zhao, W. et al. (2006) Virology 353(2): 283-293]). 중요하게는, Nt-아세틸화는 단백질-단백질 상호작용을 조절함으로써, 액틴 필라멘트의 기능에 필수적이다(문헌[Coulton, A.T. et al. (2010) J Cell Sci 123: 3235-3243; Polevoda, B. et al. (2003) J Biol Chem 278: 30686-97] 참조).
단백질의 N-말단 아세틸화는 널리 공지된 현상이나, AAV 캡시드 단백질에 대한 Nt-아세틸화의 생물학적 유의성은 잘 이해되어 있지 않다. DNA 시퀀싱을 기반으로 하여, VP1 및 VP3의 예측된 N-말단은 둘 모두 메티오닌 이후 알라닌이다. Met-아미노펩티다제에 의한 N-말단 메티오닌의 제거는 종종 생성된 N-말단 알라닌, 발린, 세린, 트레오닌 및 시스테인 잔기의 Nt-아세틸화를 유도하고, N-말단의 아세틸화는 잠재적인 분해 신호로서 작용하는 것으로 보고되었다[21]. 바이러스 캡시드 단백질의 유비퀴틴화는 비리온 분해 시점에서 캡시드의 가공에 대한 잠재적 신호로 제시되었다[22]. VP1 및 VP3의 N-아세틸화 및 바이러스 캡시드 분해 및 핵 유입 전의 비 코팅 사이의 연관성을 추가로 조사한다.
AAV 캡시드 단백질과 관련하여 N-말단 아세틸화의 기능성 영향을 이해하기 위해, VP3 N-말단 개시 코돈의 부위 특이적 돌연변이 유발을 사용하여, AAV 돌연변이를 생성시킨다.
방법
개시 메티오닌 이후 제2 위치에서의 아미노산(iMet X)이 상이한 AAV 캡시드 단백질을 생성시켜, Nt-아세틸화가 억제되거나, 감소되었는지를 결정한 후, 기능성 결과를 측정한다. 글리코실화와 같이, 세포내로 운반되고/되거나, 번역 후 변형, 예컨대 글리코실화를 획득하는 캡시드 단백질의 능력을 평가하고, 후속하여, 이러한 능력이 조립된 AAV 입자의 감염성에 영향을 미치는지를 결정한다. 추가로, 유비퀴틴화/분해 및 리소좀, ER, 골지체, 또는 내부 핵막으로의 표적화에 대한 아세틸화의 영향을 결정한다.
예를 들어, 운반, 또는 표적화를 분석하기 위해, 캡시드 단백질이 제2 위치(예를 들어, iMet X)에서 돌연변이된 AAV 입자를 형광 표지하고, 이를 사용하여, 세포(예를 들어, HeLa 세포)를 감염시킨다. 이들 AAV 입자를 다음 중 하나 이상에 대해 분석한다: 바이러스 입자 흡수 시간, 특이적 구획화 마커(예를 들어, 골지체, ER, 또는 리소좀 단백질, 또는 다른 마커)에 의한 AAV 입자의 공동 위치화, 핵 축적(예를 들어, 핵 마커, 또는 염색에 의한 공동 위치화에 의해 분석된 바와 같음), 및/또는 초기 엔도솜 탈출의 특이적 억제제(예컨대, 바필로마이신 A, 또는 염화암모늄)에 대한 운반 감응성, 이를 동일한 세포주의 감염에 사용된 형광 표지된 야생형 AAV 입자와 비교한다(예를 들어, 이러한 분석에 대한 기재에 대해 문헌[Bartlett, J.S. et al. (2000) J. Virol. 74:2777-2785] 참조).
감염성를 분석하기 위해, 캡시드 단백질이 제2 위치(예를 들어, iMet X)에서 돌연변이된 AAV 입자를 사용하여, 세포(예를 들어, HeLa 세포)를 감염시키고, 그의 형질도입 효율을 야생형 AAV 입자(예를 들어, 동일한 AAV 혈청형을 가지며, 동일한 유형의 세포를 감염시킴)와 비교한다.
글리코실화를 분석하기 위해, 캡시드 단백질이 제2 위치(예를 들어, iMet X)에서 돌연변이된 AAV 입자를 사용하여, 세포(예를 들어, HeLa 세포)를 감염시킨다. 감염된 세포로부터의 AAV 입자를 제한 없이 글리코실화의 화학적 검출(예를 들어, 변성되고, 전기영동에 의해 분리된 캡시드 단백질에의 시판용 디곡시게닌(DIG) 글리칸 검출, 및/또는 형광 당단백질 검출 키트의 적용), 및 질량 분광분석(예를 들어, FT-ICR MS)을 포함하여, 하나 이상의 분석에 적용하고, 이를 동일한 세포주의 감염에 사용된 야생형 AAV 입자와 비교한다(예를 들어, 이러한 분석에 대한 기재에 대해 문헌[Murray, S. et al. (2006) J. Virol. 80:6171-6176] 참조).
유비퀴틴화를 분석하기 위해, 캡시드 단백질이 제2 위치에서 돌연변이된 AAV 입자를 사용하여, 세포(예를 들어, HeLa 세포)를 감염시킨다. AAV 입자를 항-캡시드 항체로 감염된 세포로부터 면역침전시킨 후, 항-유비퀴틴 항체에 의해 웨스턴 블로팅에 적용하고, 이를 동일한 방식으로 세포의 감염에 사용된 야생형 AAV 입자와 비교한다. 또한, 돌연변이 AAV 입자를 시험관내 유비퀴틴화 분석에 사용할 수 있으며, 이를 야생형 AAV 입자와 비교한다(예를 들어, 문헌[Yan, Z. et al. (2002) J. Virol. 76:2043-2053] 참조).
실시예 3: AAV2 캡시드 단백질의 탈아미드화의 역할
AAV2 캡시드 단백질의 서열 분석에 의해, 잠재적 탈아미드화 부위가 밝혀졌으며, 이는 다음 아미노산 서열에 밑줄 표시하였다:
Figure 112023057723104-pat00008
특히, 잠재적 탈아미드화 부위는 포스포리파제 A2 도메인의 N57/G58에 존재하며(Ca++ 결합 부위), 이는 상기 서열에서 볼드체 및 이탤릭체로 표시된다. 다음 실험은 N57에서의 탈아미드화가 AAV2의 감소된 역가 및/또는 절두를 야기할 수 있는지 뿐만 아니라, 상이한 AAV 생성 방법은 탈아미드화에 상이한 효과를 줄 수 있는지에 대한 연구를 목적으로 하였다. 예를 들어, 생성 세포주 방법(문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269]; 미국 특허 공보 제 US2004/0224411호; 및 문헌[Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299] 참조)은 3중 형질감염 방법과 비교하여, N57에서 더 높은 수준의 탈아미드화를 유도할 수 있다. AAV2의 결정 구조에 따르면, N57은 노출되어 있지 않으나; N382, 및 N511은 부분적으로 노출되어 있으며, N715은 완전히 노출되어 있다.
방법
AAV1, 및 AAV2 VP의 효소적 분해
10 μg의 각각의 AAV1-EGFP, 또는 AAV2-EGFP 재료(3중 형질감염뿐만 아니라, 생성 세포주 방법으로부터 생성됨)를 Amicon 필터(10 kDa MWCO)를 사용하여, 농축시키고, pH 8.5의 6 M 구아니딘-HCl, 50 mM Tris로 변성시켰다. 단백질을 암소에서 30분 동안 60℃에서 5 mM DTT로 환원시키고, 실온에서 30분 동안 15 mM 요오드아세트아미드로 알킬화시킨 후, Bio-Spin® 6 Tris 마이크로-컬럼을 사용하여, 분해를 위해, 완충액을 25 mM Tris pH 7.1로 교체하였다. 완충액 교체 후, 샘플을 2개의 분액으로 나누었다. 각각의 분액을 각각 1:25 효소: 단백질 비율(wt/wt)의 트립신, 또는 1:50의 Asp-N으로 37℃에서 2시간 동안 분해하였다.
UPLC/MS/MS 펩타이드 맵핑
또한, Acquity UPLC-Xevo qTOF MS에서 UPLC/MS/MS에 의해 단백질 분해를 분석하였다. 물/아세토니트릴 중 0.1% 포름산의 이동상 구배와 유속 0.25 ml/min의 BEH300 C18 컬럼(2.1 Х 150 mm)을 분리에 사용하였다. 50 내지 2000의 질량 범위에서 양성 MSe 분해능 모드로 질량 스펙트럼을 얻었다.
AAV VP에서의 탈아미드화 수준의 결정
NG 부위(AA1, 및 AAV2 VP의 T9, T49, 및 T67)를 함유하는 펩타이드, 및 그의 해당 탈아미드화 종의 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 탈아미드화 수준의 계산에 사용하였다.
3중 형질감염(TTx), 및 생성 세포주(PCL) 방법에 의해 생성된 AAV 벡터를 비교하기 위해, EGFP가 태깅된 AAV1, 또는 AAV2를 TTx, 또는 PCL 방법을 사용하여 생성시켰다. 절두된 VP1(tVP1)이 PCL에 의해 생성된 AAV2-EGFP에 존재하였으나, TTx에 의해 생성된 AAV2-EGFP에는 존재하지 않는 것으로 나타났다. 생성 방법에 상관없이, AAV1-EGFP는 tVP1이 존재하지 않는 것으로 나타났다. 또한, PCL에 의해 생성된 AAV2 방법의 시험관내 역가가 TTx에 의해 생성된 AAV2와 비교하여, 감소한 것으로 나타났다. 또한, 돌연변이 N57K, 및 N57Q AAV2 입자는 역가가 감소하고, Ca++ 결합이 저해된 것으로 나타났다.
하기의 표는 각각의 잠재적 탈아미드화 부위뿐만 아니라, 해당 잔기를 조사하기 위해, 분석한 트립신에 의한 펩타이드를 제공한다.
[표 7]
표 7에 제시된 바와 같이, T9 펩타이드 YLGPF NG LDK(SEQ ID NO: 9)를 사용하여, N57를 모니터링하고, T38 펩타이드
Figure 112023057723104-pat00010
을 사용하여, N382를 모니터링하고, T49 펩타이드 YNL NG R(SEQ ID NO: 11), 및 YHL NG R(SEQ ID NO: 12)을 사용하여, AAV1, 또는 AAV2(각각)에서 N511을 모니터링하였으며, T67 펩타이드 SANVDFTVDN NG LYTEPR(SEQ ID NO: 13), 및 SVNVDFTVDT NG VYSEPR(SEQ ID NO: 14)을 사용하여, AAV1, 또는 AAV2(각각)에서 N715를 모니터링하였다.
LC/MS/MS 분석을 사용하여, TTx, 및 PCL 방법에 의해 생성된 AAV1, 및 AAV2 입자에서의 탈아미드화 백분율을 비교하였다. T9 펩타이드로부터의 결과가 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있다. T49 펩타이드로부터의 결과가 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다. T67 펩타이드로부터의 결과가 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다. 이들 결과는 표 8에 요약되어 있다. 그 크기로 인해, T38 펩타이드는 검출되지 않았다.
[표 8]
특히, TTx에 의해 생성된 AAV2와 비교하여, PCL에 의해 생성된 AAV2의 경우, 탈아미드화가 거의 3배 증가한 것으로 나타났다. 이들 결과는 PCL에 의해 생성된 AAV2의 시험관내 역가가 감소하므로, 탈아미드화가 AAV 역가를 저하시킴을 시사한다.
결론
종합하면, 실시예 1 내지 3은 LC/MS를 사용하여, 바이러스 입자의 무손상 단백질(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)을 분석하기 위한 방법을 예시한다. 분자량을 정확하게 측정하고, 또한, 이들 기법을 사용하여, 바이러스 캡시드 단백질의 N-말단, 및/또는 변형을 평가할 수 있다. 더욱이, 이들 방법은, 예를 들어 분석 플랫폼으로서 유전자 요법에 유용한 캡시드 혈청형 동일성 분석으로서 적용 가능하다. 이들 결과는 캡시드 단백질 구조(예를 들어, 절두, 탈아미드화 등)와 역가 사이의 상관관계를 추가로 확립함으로써, 주요 부위의 점 돌연변이가 더욱 효과적인 벡터를 조작하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: AAV 캡시드 단백질의 N-말단 아세틸화의 역할에 대한 설명
상기에서 논의된 바와 같이, AAV 캡시드 단백질의 N-말단은 혈청형 전반에 걸쳐 고도로 보존된다(도 5). 실시예 1에 기재된 기법은 VP 발현, 및 번역 후 변형의 조사를 가능하게 한다. 다음으로, AAV 캡시드 단백질의 N-말단 아세틸화의 역할 및 생물학적 유의성을 조사하였다.
결과
AAV 캡시드 단백질의 탈아세틸화의 잠재적 역할을 밝히기 위해, AAV5 탈아세틸화 변이체를 시험하였다. CBA 프로모터 하에서 eGFP를 발현하는 AAV5 입자(AAV5-CBA-Egfp)를 VP1, 및 VP3에 대해 개시 메티오닌(iMET)에 인접한 아미노산이 돌연변이된 AAV5 변이체(deAC-AAV5-CBA-eGFP)와 비교하였다. 하기의 표 9에 예시된 바와 같이, NatA, NatC 또는 NatD에 의한 아세틸화의 가능성이 낮을 것으로 예측되는 3개의 아미노산: Gly, Leu, 및 Pro를 변이체 생성을 위해 선택하였다.
[표 9]
다음의 AAV5 탈아세틸화된(deAC) 돌연변이를 생성시켰다:
S2GVP1-AAV5VP1의 위치 2에서 Ser이 Gly로 변경됨
S2LVP1-AAV5VP1의 위치 2에서 Ser이 Leu로 변경됨
S2PVP1-AAV5VP1의 위치 2에서 Ser이 Pro로 변경됨
S2GVP3-AAV5VP3의 위치 2에서 Ser이 Gly로 변경됨
S2LVP3-AAV5VP3의 위치 2에서 Ser이 Leu로 변경됨
S2PVP3-AAV5VP3의 위치 2에서 Ser이 Pro로 변경됨
S2PVP1/VP3-AAV5 VP1, 및 VP3 둘 모두의 위치 2에서 Ser이 Pro로 변경됨
S2GVP1/VP3-AAV5 VP1, 및 VP3 둘 모두의 위치 2에서 Ser이 Gly로 변경됨
S2LVP1/VP3-AAV5 VP1, 및 VP3 둘 모두의 위치 2에서 Ser이 Leu로 변경됨
상기에 기재된 바와 같은 TTX 방법을 사용하여, 이들 변이체를 생성시켰다. AAV5 변이체 모두는 양호한 생산성을 나타내었으며, 수율은 1013 총 VG를 초과하였다. SYPRO 단백질 겔 분석에 의해, AAV5 변이체 모두는 또한 기대된 VP1:VP2:VP3 단백질 비율을 나타내었다(도 9). 다음으로, LC/MS를 사용하여, 표 10에 제시된 바와 같이, AAV5 변이체 모두가 저하된 아세틸화를 나타내었음을 확인하였다.
[표 10]
Figure 112023057723104-pat00013
이들 LC/MS 분석은 AAV5 변이체가 탈아세틸화되었음을 확인시켰다. 변이체 S2LVP1, S2LVP3, 및 S2LVP1/VP3 모두는 VP1, 및 VP3 단백질에서 증가된 질량(173에서 182로 증가됨)을 나타내었으며, 이는 VP1, 또는 VP3에서 제2 N-말단 아미노산이 류신으로 변경되어, 단백질이 변이됨으로써, 질량의 증가가 야기됨을 시사한다.
다음으로, AAV5 변이체를 리포터 유전자로서 eGFP를 사용하여, 시험관내 형질도입 분석에서 분석하였다(도 10). 각각의 변이체를 비 변형된 모체 AAV5 입자와 비교하여, 106 감염 다중도(MOI)에서 AAV5 탈아미드화 돌연변이 변이체에 의한 형질도입을 평가하기 위한 분석을 설계하였다. 293, HuH7, 및 HeLa 세포의 3개의 세포주를 사용하였다. 감염 후, 세포를 분석하여, 벡터 게놈 카피 수(vg/μg 세포 단백질), 및 eGFP 발현(ELISA)을 결정하였다. 벡터 게놈 카피 수(vg/μg 단백질)는 AAV5 변이체가 세포에 유입된 효율을 나타내며, 전이유전자 발현에는 캡시드/벡터 DNA가 핵으로 효율적으로 운반되어야 할 필요가 있으므로, eGFP는 캡시드의 세포내 운반 효율을 나타낸다(도 10). 벡터 게놈을 TaqMan 분석에 의해 정량화하였다.
도 11은 벡터 게놈 분석을 기반으로 하여, AAV5 탈아세틸화된 돌연변이 벡터가 비 변형된 모체 AAV5 입자와 비교하여, 유사하지만 감소된 수준으로 3개의 시험 세포주 모두를 감염시켰다는 것을 보여준다. 도 12는 AAV5 탈아세틸화된 돌연변이 벡터 모두가 비 변형된 모체 AAV5에 의한 형질도입과 비교하여, 3개의 세포주 모두에서 감소된 eGFP 발현을 야기하였다는 것을 보여준다.
결론
예측된 바와 같이, LC/MS에 의해 조사했을 때, N-말단 Ser 내지 Pro/Leu/Gly 돌연변이 변이체에서 아세틸화가 관찰되지 않았다. AAV5 deAC 변이체 견고한 벡터 생성을 나타내었고, AAV5 deAC 변이체는 모체 AAV5에 근사한 수준으로 세포를 감염시켰다. 그러나, deAC 변이체에 감염된 세포의 기능성 단백질 수준은 모체 AAV5와 비교하여, 크게 감소하였다. 이들 데이터는 VP1/VP3의 N-말단 탈아세틸화의 부재에 의해 방향성은 최소한으로 영향을 받지만, 하류 가공(예를 들어, 운반, 및/또는 분해)에 유의한 영향을 미친다는 것을 시사한다. 시험된 변이체가 감소된 시험관내 활성을 나타내었으므로, 당업자는, 특히, 감소된 형질도입 수준이 요망되는 경우, 감소되거나, 제거된 아세틸화를 특징으로 하는 변이체가 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
실시예 5: AAV 캡시드 단백질의 탈아미드화의 평가
실시예 1, 및 3은 AAV 캡시드 단백질의 번역 후 변형에 대한 조사를 가능하게 하고, AAV2 캡시드의 탈아미드화의 역할을 연구하는 기법을 나타낸다. 다음의 실시예는 탈아미드화가 역가를 감소시키고/시키거나, 캡시드 단백질의 절두를 유도하는지 및 상이한 제조 방법이 상이한 수준의 탈아미드화를 유도할 수 있는지를 시험하였다.
방법
AAV 입자를 생성하여, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 탈아미드화 상태를 분석하였다.
결과
실시예 3에 기재된 바와 같이, 잠재적 탈아미드화 부위는 AAV2 캡시드의 VP1 내의 포스포리파제 A2 도메인의 N57/G58에 존재한다(Ca++ 결합 부위). N57/G58 모티프는 AAV 혈청형 전반에 걸쳐 보존된다(도 13). 실시예 3은 TTx에 의해 생성된 AAV2와 비교하여, PCL에 의해 생성된 AAV2의 경우, 탈아미드화가 거의 3배 증가한 것으로 나타났음을 보여주었다(도 6a 및 도 6b, 및 표 8 참조).
단백질 겔에 의한 VP1, VP2, 및 VP3 생성의 조사시, 절두된 VP1 단백질(tVP1)은 PCL 방법에 의해 생성된 AAV2 캡시드 단백질에서만 검출되었다(도 14).
그 후, 일련의 AAV2 탈아미드화 돌연변이를 생성시켰다. 이들 돌연변이는 정규 NG 서열 내의 Gly 잔기를 표적으로 하였다. tVP1의 N-말단 아미노산인 A35 잔기를 표적으로 한 돌연변이(도 13 참조)를 표 11에 제시된 바와 같이 생성하였다. 다중 돌연변이를 보유하는 pAF277, 및 pAF279 돌연변이는 패키징되지 않았다.
[표 11]
다음으로, 변이체의 탈아미드화를 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이, LC/MS에 의해 분석하였다. AAV2A35N, 및 AAV2G58D 변이체는 모체 AAV2와 비교하여, 탈아미드화가 변이되었다(도 15). 특히, AAV2A35N 돌연변이는 모체 AAV2(5.7%)와 비교하여, 탈아미드화가 증가하였다(17.8%). AAV2G58D 변이체는 모체 AAV2와 비교하여, 탈아미드화가 감소하였다(1.1%). SYPRO 단백질 겔 분석은 AAV2 탈아미드화 돌연변이가 정확한 VP1:VP2:VP2 비율을 나타내었음을 시사하였다(도 16).
다음으로, AAV2 탈아미드화 변이체를 리포터 유전자로서 eGFP를 사용하여, 시험관내 형질도입 분석에서 분석하였다(도 17). 각각의 변이체를 비 변형된 모체 AAV2 입자와 비교하여, 106 감염 다중도(MOI)에서 AAV2 탈아미드화 돌연변이 변이체에 의한 형질도입을 평가하기 위한 분석을 설계하였다. 293, HuH7, 및 HeLa 세포의 3개의 세포주를 사용하였다. 감염 후, 세포를 분석하여, 벡터 게놈 카피 수(vg/μg 세포 단백질), 및 eGFP 발현(ELISA)을 결정하였다. 벡터 게놈 카피 수(vg/μg 단백질)는 AAV2 변이체가 세포에 유입된 효율을 나타내며, 전이유전자 발현에는 캡시드/벡터 DNA가 핵으로 효율적으로 운반되어야 할 필요가 있으므로, eGFP는 캡시드의 세포내 운반 효율을 나타낸다(도 17). 벡터 게놈을 TaqMan 분석에 의해 정량화하였다.
벡터 게놈 분석에 의해, AAV2 탈아미드화 돌연변이 변이체가 모체 AAV2 벡터와 근사한 수준으로 시험된 모든 세포주를 감염시킨 것으로 나타났다(도 18). 중요하게는, AAV2A35N 변이체는 3개의 모든 세포주의 형질도입시 모체 AAV2 벡터보다 역가가 더 높은 것으로 나타났다(도 19). AAV2G58D 변이체는 HuH7 세포에서 모체 AAV2 벡터보다 역가가 더 높은 것으로 나타났다(도 19).
결론
요약하면, AAV2 탈아미드화 돌연변이 벡터는 모체 AAV2 입자에 근사한 수준에서 세포를 감염시킨다(예를 들어, 근사한 vg/μg 세포 단백질). 그러나, 형질도입된 세포의 eGFP 수준의 분석을 기반으로 하여, AAV2A35N 변이체는 시험된 모든 세포주에서 모체 AAV2보다 더 높은 역가를 나타내었으며, AAV2G58D 변이체는 HuH7 세포(간-유래 세포주)에서 모체 AAV2보다 더 높은 역가를 나타내었다. 이들 결과는 A35N 돌연변이가 다수의 세포 유형의 형질도입시 벡터 역가를 증가시키는 데 효과적일 수 있고, G58D 돌연변이가 또한 특정 세포 유형, 예를 들어, 간 세포에서 역가를 증가시키는 데 효과적일 수 있음을 시사한다.
참조문헌
서열
달리 언급되지 않는 한, 모든 폴리펩타이드 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제시된다.
달리 언급되지 않는 한, 모든 핵산 서열은 5'에서 3'으로 제시된다.
잠재적 AAV2 VP3 개시 코돈의 뉴클레오타이드 서열(ATG 코돈 밑줄쳐짐)
잠재적 AAV2 VP3 개시 코돈에 해당하는 폴리펩타이드 서열(메티오닌 밑줄쳐짐)
AAV2 VP1 폴리펩타이드 서열
VP1 N-말단 트립신에 의한 펩타이드(N-말단 알라닌은 아세틸화됨)
VP3 N-말단 Asp-N 펩타이드(N-말단 알라닌은 아세틸화됨)
공통 VP1 N-말단 서열
잠재적 AAV7 VP3 개시 코돈의 뉴클레오타이드 서열(개시 코돈 밑줄쳐짐)
돌연변이된 ITR의 뉴클레오타이드 서열
SEQUENCE LISTING <110> JIN, Xiaoying O'RIORDAN, Catherine LIU, Ling Zhang, Kate <120> METHODS FOR DETECTING AAV <130> 159792014140 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/375,314 <151> 2016-08-15 <160> 40 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly 1 5 10 15 Gly Cys Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala 20 25 30 Cys <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met Ala Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 2 <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> ACETYLATION <222> 1 <400> 4 Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 10 15 Gly Ile Arg <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> ACETYLATION <222> 1 <400> 5 Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp 1 5 10 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Gly Cys Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Ala 20 25 30 Cys Ala Ala Thr Ala Ala Cys 35 <210> 8 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Cys Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Gly Cys 1 5 10 15 Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala 35 40 45 Gly Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly 50 55 60 Gly Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly 65 70 75 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val 20 25 30 Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val 35 40 45 Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln 50 55 60 Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln 65 70 75 80 Met Leu Arg <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Tyr Asn Leu Asn Gly Arg 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Tyr His Leu Asn Gly Arg 1 5 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu Tyr Thr Glu 1 5 10 15 Pro Arg <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu 1 5 10 15 Pro Arg <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro 1 5 10 15 <210> 16 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 2 <400> 16 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His 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Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys 50 55 60 <210> 35 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys 50 55 60 <210> 36 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu 35 40 45 Pro Gly Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys 50 55 60 <210> 37 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 10 15 Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys 50 55 60 <210> 38 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg 50 55 60 <210> 39 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys 50 55 60 <210> 40 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 40 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Xaa Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys 50 55 60

Claims (20)

  1. rAAV 입자의 안정성을 개선시키거나, 세포에서의 rAAV 입자의 조립을 개선시키거나, 세포에서의 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법으로서, 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2를 치환하는 단계를 포함하고, 여기서 위치 2에서의 아미노산의 치환은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2와 비교하여, VP1 및/또는 VP3의 N-말단 아세틸화를 변이시키는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기 2는 Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile, Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro, 또는 Tyr에 의해 치환되는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 잔기 2는 Ser, Asp, 또는 Glu에 의해 치환되는 것인, 방법.
  4. rAAV 입자의 안정성을 개선시키거나, 세포에서의 rAAV 입자의 조립을 개선시키거나, 세포에서의 rAAV 입자의 형질도입을 개선시키는 방법으로서, 모체 VP1 및/또는 VP3의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 AAV2의 VP1을 기반으로 잔기 넘버링하여, A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715, 또는 G716이고, 아미노산 치환은 모체 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환은 VP1의 A35, VP1의 N57, VP1의 G58, VP3의 N382, VP3의 G383, VP3의 N511, VP3의 G512, VP3의 N715, 또는 VP3의 G716에서 이루어지고; 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키는 것인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, VP1의 위치 35에서의 모체 Ala 잔기는 Asn에 의해 치환되는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, VP1의 위치 58에서의 모체 Gly 잔기는 Asp에 의해 치환되는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) AAV 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8 캡시드, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소과 동물 AAV, 마우스 AAV, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B, 또는 AAVPHP.eB 혈청형 캡시드를 포함하고/하거나;
    b) rAAV 입자의 캡시드가 티로신 돌연변이 또는 헤파린 결합 돌연변이를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1 입자 또는 AAV2 입자인, 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV ITR을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, rAAV 벡터는 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, AAV6 ITR, AAV7 ITR, AAV8 ITR, AAVrh8 ITR, AAV9 ITR, AAV10 ITR, AAVrh10 ITR, AAV11 ITR, 또는 AAV12 ITR을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 입자는 하나 이상의 AAV ITR에 측접된 이종성 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자기-상보적 벡터인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, rAAV 벡터는 전이유전자를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 전이유전자의 보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 여기서 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있고,
    임의로 여기서 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는 것인,
    방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 숙주 세포를 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공함으로써 생성되는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시킴으로써 제공되고, 임의로 여기서 AAV 보조 기능은 숙주 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써 제공되는 것인, 방법.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, 및 AAV rep, 및 cap 기능을 인코딩하는 핵산을 포함하고, AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 제공하는 AAV 생성 세포에 의해 생성되는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, AAV 생성 세포는 AAV 보조 기능을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 임의로 여기서 AAV 보조 기능은 AAV 생성 세포를 AAV 보조 기능을 제공하는 AAV 보조 바이러스로 감염시킴으로써 제공되는 것인, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    a) AAV cap 기능은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 치환을 제공하고, 여기서 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 탈아미드화와 비교하여, 탈아미드화를 변이시키거나; 또는
    b) AAV cap 기능은 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환을 제공하고, 여기서 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 아미노산 치환은 모체 AAV 입자의 VP1 및/또는 VP3의 아미노산 잔기 2에서의 N-말단 아세틸화와 비교하여, N-말단 아세틸화를 변이시키는 것인, 방법.
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