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KR102701166B1 - 코리네박테리움 글루타미쿰 Hemo-P1 균주를 이용한 헴철 생산 방법 - Google Patents

코리네박테리움 글루타미쿰 Hemo-P1 균주를 이용한 헴철 생산 방법 Download PDF

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KR102701166B1
KR102701166B1 KR1020230172380A KR20230172380A KR102701166B1 KR 102701166 B1 KR102701166 B1 KR 102701166B1 KR 1020230172380 A KR1020230172380 A KR 1020230172380A KR 20230172380 A KR20230172380 A KR 20230172380A KR 102701166 B1 KR102701166 B1 KR 102701166B1
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KR
South Korea
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heme iron
liquid medium
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feso
strain
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KR1020230172380A
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조형권
성락선
최봉석
노기정
김성주
김은정
정영철
Original Assignee
주식회사 한풍네이처팜
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Abstract

본 발명의 헴철 생산 방법은 수탁번호 KCTC 13701BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteria glutamicum) Hemo-P1 균주를 액체 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 액체 배지는 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤 또는 소이톤; 및 염화나트륨;을 함유하는 액체 배지이고, 상기 액체 배지에 FeSO4를 공급하면서 배양하며, 배양 온도를 29 내지 31℃에서 시작하여 39 내지 41℃까지 상승시키는 것을 특징으로 한다.

Description

코리네박테리움 글루타미쿰 Hemo-P1 균주를 이용한 헴철 생산 방법{Heme iron producing method using Corynebacteria glutamicum Hemo-P1 strain}
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 Hemo-P1 균주를 이용한 헴철 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 상기 균주를 이용하여 헴철을 보다 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
철(Fe)은 식이를 통해 공급되는 필수 성분으로서, 동물에서 체내 곳곳에 산소를 전달하는 적혈구의 헤모글로빈 합성을 위해 필수적이다. 이러한 철의 공급이 부족하거나 임의의 원인으로 인해 철의 손실이 증가하게 되면, 철 결핍성 빈혈과 같은 질환이 발생할 수 있고, 가축의 경우 성장 둔화로 이어질 수 있다.
식품 중 철분은 헴철(heme iron)과 비헴철(non-heme iron)의 두 가지 형태로 존재하며, 주로 헴철을 영양제나 식품의 철분 강화제, 또는 사료의 철분 강화제로서 사용하는 것이 선호되고 있다.
헴철은 주로 도축 혈액으로부터 분리 및 정제하여 생산하는데, 이 경우 동물에서 유발될 수 있는 질환의 위험, 예를 들어 인수 공통 감염 질환 유발 바이러스의 오염 가능성 등의 위험이 존재한다. 따라서 이를 해결하기 위한 기술로서 미생물을 이용하여 헴철을 생산하는 기술에 대한 여러 연구가 이루어졌으며, 그 결과 중 하나로서 유전자 조작 없이(non-GMO) 수득된, 빠른 생장 속도 및 헴철 생산능을 갖는 균주 및 그를 이용한 헴철 생산 방법(한국등록특허 제10-2210764호)이 개발된 바 있다.
그러나 이러한 기술들이 개발되었음에도 여전히 생산 효율이 기대에 미치지 못하는 문제가 있어, 이를 보완하기 위한 기술의 개발이 필요하다.
한국등록특허 제10-2210764호
본 발명의 주된 목적은 미생물을 이용하여 헴철을 생산함에 있어서 보다 효율적으로 헴철을 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
일 양상에서, 본 발명은 다음 항목에 따른 헴철 생산 방법을 제공한다:
1. 수탁번호 KCTC13701BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteria glutamicum) Hemo-P1 균주를 액체 배지에서 배양하는 단계를 포함하되,
상기 액체 배지는 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤 또는 소이톤; 및 염화나트륨;을 함유하는 액체 배지이고,
상기 액체 배지에 FeSO4를 공급하면서 배양하며,
배양 온도를 29 내지 31℃에서 시작하여 39 내지 41℃까지 상승시키는 것을 특징으로 하는 헴철 생산 방법.
2. 항목 1에 있어서, 상기 액체 배지는 2 내지 6%(w/v) 포도당, 0.1 내지 3%(w/v) 효모 추출물, 0.1 내지 3%(w/v) 대두 펩톤 또는 소이톤 및 0.001 내지 0.2%(w/v) 염화나트륨을 함유하는, 헴철 생산 방법.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 상기 FeSO4의 공급은 80 내지 140시간에 걸쳐 상기 액체 배지 1ℓ 당 10 내지 100㎎의 FeSO4를 2 내지 20회로 나누어 공급하는 것인, 헴철 생산 방법.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 온도의 상승은 29 내지 31℃에서 36 내지 38℃로의 1단계 상승 및 36 내지 38℃에서 39 내지 41℃로의 2단계 상승을 적용한 단계적 상승인, 헴철 생산 방법.
5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 550 내지 650rpm의 발효기 임펠러의 회전 속도를 적용한 교반 배양인, 헴철 생산 방법.
6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 액체 배지의 pH를 6.5 내지 7.5로 유지시키면서 배양하는, 헴철 생산 방법.
본 발명에 따르면 기 개발된 헴철 생산 미생물인 코리네박테리움 글루타미쿰 Hemo-P1 균주를 이용하여 헴철을 매우 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 헴철의 생산 정도를 나타낸 것으로서, 헴철 생산 균주의 배양 시간 별 배양물의 상태(적색 정도)를 나타낸 것이다. Cell free, 최종 배양물을 원심분리하여 세포를 제거한 상태.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 따른 헴철의 생산 정도를 비교한 것으로서, 대두 펩톤(soypeptone)을 사용한 경우(실시예 1)와 소이톤(soytone)을 사용한 경우(실시예 2)의 헴철 생산 균주의 배양 시간 별 배양물의 상태(적색 정도)를 비교하여 나타낸 것이다. Cell free, 최종 배양물을 원심분리하여 세포를 제거한 상태.
도 3은 본 발명의 일 실시형태에 따른 헴철의 생산 정도를 비교한 것으로서, FeSO4를 공급하지 않은 경우(비교예 1), FeSO4의 공급량을 2배로 한 경우(실시예 3) 및 1배로 한 경우(실시예 1)의 헴철 생산 균주의 배양물(142시간 배양)의 상태(적색 정도)를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4 및 5는 본 발명의 일 실시형태에 따른 헴철의 생산 정도를 비교한 것으로서, 발효기 임펠러의 회전 속도를 다르게 한 경우의 헴철 생산 균주의 배양물의 상태(적색 정도)를 비교하여 나타낸 것이다. 도 4는 임펠러의 회전 속도가 600rpm인 경우(실시예 1)와 800rpm인 경우(실시예 4)의 142시간 배양물을 비교한 것이고, 도 5는 임펠러의 회전 속도가 600rpm인 경우(실시예 1)와 700rpm인 경우(실시예 5)의 54시간 배양물을 비교한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시형태에 따른 헴철의 생산 정도를 비교한 것으로서, 배양 온도를 일정하게 유지하는 경우(비교예 2: 30℃로 유지; 비교예 3: 37℃로 유지), 배양 온도를 30℃에서 37℃로 상승시키는 경우(비교예 4) 및 배양 온도를 30℃에서 40℃로 상승시키는 경우(실시예 1)의 헴철 생산 균주의 배양물의 상태(적색 정도)를 비교하여 나타낸 것이다.
본 발명은 기 개발된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteria glutamicum) Hemo-P1 균주를 이용하여 헴철을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 헴철 생산 방법은 상기 균주를 액체 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 액체 배지는 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤 또는 소이톤; 및 염화나트륨;을 함유하는 액체 배지이고, 상기 액체 배지에 FeSO4를 공급하면서 배양하며, 배양 온도를 29 내지 31℃에서 시작하여 39 내지 41℃까지 상승시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 헴철 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 Hemo-P1 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 입수할 수 있다. 이 균주의 수탁번호는 KCTC 13701BP이며, 이 균주에 관한 구체적인 사항에 대해서는 한국등록특허 제10-2210764호를 참고할 수 있다(이의 내용 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).
본 발명은 헴철 생산 균주를 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤(soypeptone) 또는 소이톤(soytone); 및 염화나트륨;을 함유하는 액체 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 이는 다양한 성분 조합의 배지들을 사용하여 연구한 결과를 바탕으로 안출된 것으로서, 이들 성분을 함유하는 배지를 사용하면 보다 효율적인 균주의 성장을 바탕으로 효율적인 헴철 생산을 기대할 수 있다. 상기 대두 펩톤과 소이톤은 둘 중 하나를 선택적으로 적용하거나 조합하여 적용할 수도 있다. 특히 대두 펩톤은 단가가 소이톤에 비해 현저히 저렴함(2022년 기준 약 10배의 차이)에도 불구하고 소이톤과 유사한 효과를 나타낼 수 있다는 점에서 이를 사용함에 따른 큰 장점이 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 액체 배지는 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤 또는 소이톤; 및 염화나트륨;만을 배지 성분으로 함유하는 액체 배지이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 액체 배지는 배지 성분으로서 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤 또는 소이톤; 및 염화나트륨; 이외에 미생물 배지의 성분으로서 사용될 수 있는 다른 성분을 더 함유하는 액체 배지이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 액체 배지는 2 내지 6%(w/v) 포도당, 0.1 내지 3%(w/v) 효모 추출물, 0.1 내지 3%(w/v) 대두 펩톤 또는 소이톤 및 0.001 내지 0.2%(w/v) 염화나트륨을 함유하는 액체 배지이다. 이러한 액체 배지를 사용하면 보다 효율적으로 헴철을 생산할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 액체 배지는 3 내지 5%(w/v) 포도당, 0.5 내지 2%(w/v) 효모 추출물, 0.5 내지 2%(w/v) 대두 펩톤 또는 소이톤 및 0.005 내지 0.1%(w/v) 염화나트륨을 함유하는 액체 배지이며, 보다 바람직하게는, 본 발명의 액체 배지는 3.5 내지 4.5%(w/v) 포도당, 0.5 내지 1.5%(w/v) 효모 추출물, 0.5 내지 1.5%(w/v) 대두 펩톤 또는 소이톤 및 0.01 내지 0.05%(w/v) 염화나트륨을 함유하는 액체 배지이다.
본 발명은 헴철 생산 균주를 액체 배지에서 배양하되 FeSO4를 공급하면서 배양하는 것을 특징으로 한다. 이 또한 연구 결과를 바탕으로 안출된 것으로서, FeSO4의 공급을 통해 보다 효율적인 헴철 생산을 기대할 수 있다.
헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, FeSO4를 헴철 생산 균주의 배양 기간 중 여러 차례에 걸쳐 공급한다. 바람직하게는, FeSO4를 헴철 생산 균주의 배양 기간 중 2 내지 20회에 걸쳐 공급하며, 보다 바람직하게는 배양 기간 중 5 내지 15회에 걸쳐 공급하고, 보다 바람직하게는 배양 기간 중 7 내지 9회에 걸쳐 공급한다.
또한 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, 헴철 생산 균주의 배양 기간 중 액체 배지 1ℓ 당 10 내지 100㎎의 FeSO4를 공급한다. 바람직하게는, 헴철 생산 균주의 배양 기간 중 액체 배지 1ℓ 당 10 내지 90㎎의 FeSO4를 공급하며, 보다 바람직하게는 배양 기간 중 액체 배지 1ℓ 당 20 내지 80㎎의 FeSO4를 공급하고, 보다 바람직하게는 배양 기간 중 액체 배지 1ℓ 당 30 내지 70㎎의 FeSO4를 공급하고, 보다 바람직하게는 배양 기간 중 액체 배지 1ℓ 당 30 내지 60㎎의 FeSO4를 공급하고, 보다 바람직하게는 배양 기간 중 액체 배지 1ℓ 당 40 내지 50㎎의 FeSO4를 공급한다.
또한 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, FeSO4의 첫 공급을 배양 시작 최소 2시간 이후에 하며, 보다 바람직하게는 배양 시작 최소 3시간 이후에 하고, 보다 바람직하게는 배양 시작 최소 4시간 이후에 한다.
또한 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, FeSO4의 첫 공급 시의 공급량을 다른 공급 시의 공급량에 비해 1.5 내지 2.5배(중량)로 한다.
또한 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, FeSO4의 공급 시간 간격을 최소 2시간으로 하며, 보다 바람직하게는 최소 3시간으로 하고, 보다 바람직하게는 최소 4시간으로 한다.
본 발명에서 배양 시간은 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는 80 내지 200시간이며, 보다 바람직하게는 90 내지 180시간이고, 보다 바람직하게는 100 내지 160시간이다.
본 발명은 헴철 생산 균주의 배양 온도를 29 내지 31℃에서 시작하여 39 내지 41℃까지 상승시키는 것을 특징으로 한다. 이 또한 연구 결과를 바탕으로 안출된 것으로서, 이러한 배양 온도 상승을 통해 별도의 세포 파쇄 과정, 예를 들어 균질화(homogenization) 과정 없이도 헴철이 세포 외부로 방출되도록 할 수 있다. 이는 헴철 정제의 용이성 측면에서 매우 큰 이점을 제공한다.
이러한 효과를 위해 바람직하게는, 헴철 생산 균주의 배양 온도를 단계적으로 상승시킨다. 예를 들어, 헴철 생산 균주의 배양 온도를 29 내지 31℃에서 36 내지 38℃로의 1단계 상승 및 36 내지 38℃에서 39 내지 41℃로의 2단계 상승으로 단계적으로 상승시킨다.
또한, 상기와 같은 효과를 위해 바람직하게는, 상기 1단계 상승을 배양 시작 20시간 후의 시점과 70시간 후의 시점 사이에 실시하며, 보다 바람직하게는 배양 시작 30시간 후의 시점과 60시간 후의 시점 사이에 실시하고, 보다 바람직하게는 배양 시작 40시간 후의 시점과 50시간 후의 시점 사이에 실시한다.
또한, 상기와 같은 효과를 위해 바람직하게는, 상기 2단계 상승을 상기 1단계 상승 10시간 후의 시점과 60시간 후의 시점 사이에 실시하며, 보다 바람직하게는 상기 1단계 상승 20시간 후의 시점과 50시간 후의 시점 사이에 실시하고, 보다 바람직하게는 상기 1단계 상승 30시간 후의 시점과 40시간 후의 시점 사이에 실시한다.
본 발명에서 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, 발효기 임펠러(impeller)의 회전 속도를 550 내지 650rpm으로 적용한다. 이 또한 연구 결과를 바탕으로 안출된 것으로서, 발효기 임펠러의 회전 속도에 따라 헴철 생산 효율에 차이가 발생할 수 있으며, 상기와 같은 rpm을 적용할 경우 보다 효율적으로 헴철을 생산할 수 있다. 이를 위해 보다 바람직하게는 발효기 임펠러의 회전 속도를 560 내지 640rpm으로 하고, 보다 바람직하게는 570 내지 630rpm으로 하고, 보다 바람직하게는 580 내지 620rpm으로 하고, 보다 바람직하게는 590 내지 610rpm으로 한다.
본 발명에서 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, 액체 배지의 pH를 6.5 내지 7.5로 유지시키면서 배양한다. 이 또한 연구 결과를 바탕으로 안출된 것으로서, 배지의 pH에 따라 균주의 생장이 영향을 받을 수 있으며, 상기와 같은 pH를 유지할 경우 보다 효율적으로 균주의 생장을 가능하게 하여, 결과적으로 보다 효율적인 헴철 생산을 가능하게 할 수 있다. 이를 위해 보다 바람직하게는 액체 배지의 pH를 6.6 내지 7.4로 유지시키며, 보다 바람직하게는 pH를 6.7 내지 7.3으로 유지시키고, 보다 바람직하게는 pH를 6.8 내지 7.2로 유지시키고, 보다 바람직하게는 pH를 6.9 내지 7.1로 유지시킨다.
본 발명에서 헴철 생산 효율을 위해 바람직하게는, 공기 공급을 0.5 내지 2vvm(air volume/working volume/min)으로 하여 배양한다. 보다 바람직하게는, 공기 공급을 0.7 내지 1.5vvm으로 하며, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.3vvm으로 하고, 보다 바람직하게는 0.9 내지 1.2vvm으로 한다.
본 발명의 헴철 생산 방법은 상기 액체 배지에서 배양하는 단계 이전에 종 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이에 따르면 본 배양 시 보다 빠른 균주의 생장을 달성할 수 있다. 종 배양하는 단계는 상기 액체 배지 배양의 규모보다 작은 규모의 액체 배지에서 배양하는 단계일 수 있다.
또한, 상기 종 배양하는 단계 이전에 헴철 생산 균주를 고체 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특히 초저온 냉장고에서와 같이 낮은 온도에서 보관 중인 헴철 생산 균주를 종 배양하기 전에 고체 배지에서 배양한 다음 배양된 균체를 종 배양 배지에 접종하면 보다 빠르고 안정적인 균주의 생장과 함께 최종적으로 효율적인 헴철 생산을 달성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1
1-1. 고체 배양
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteria glutamicum) Hemo-P1 균주(KCTC13701BP)를 초저온 냉장고(deep freezer)에서 꺼내어 고체 배지에 접종한 다음 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.
성분명 g/ℓ
Glucose 40.00
Yeast Ext 10.00
Soytone 10.00
MgSO4 1.00
(NH4)2SO4 5.00
K2HPO4 1.50
NaH2PO4 0.50
CaCl2 0.40
FeSO4 0.02
Agar 20.00
1-2. 종 배양(seed culture)
상기 고체 배양된 균체를 백금이로 취하여 종 배양용 액체 배지에 첨가(1 loop)하여 접종한 다음 30℃에서 OD600이 2.2 내지 2.4가 될 때까지(약 18시간 동안) 진탕 배양하였다.
이때 종 배양용 액체 배지의 조성은 표 2와 같다.
성분명 g/ℓ %
Glucose 40.00 4%
Yeast Ext 10.00 1%
Soytone 10.00 1%
MgSO4 1.00 0.10%
(NH4)2SO4 5.00 0.50%
K2HPO4 1.50 0.15%
NaH2PO4 0.50 0.05%
CaCl2 0.40 0.04%
FeSO4 0.02 20ppm
1-3. 본 배양
상기 종 배양된 배양액 250㎖을 취하여 발효기(fermentor)에 담긴 5ℓ의 본 배양용 배지에 첨가하여 접종한 다음 140시간 이상 배양하였다.
이때 본 배양용 배지의 조성은 표 3과 같고, 발효기의 임펠러(impeller)의 회전 속도를 600rpm으로 하였으며, 공기 공급을 1vvm으로 하였고, 암모니아수를 사용하여 pH 7.0을 유지시켰다. 30℃의 배양 온도에서 시작하여 배양 약 45시간째가 되는 시점에 37℃로 배양 온도를 상승시키고 배양 약 75시간째가 되는 시점에 40℃로 배양 온도를 상승시키는 배양 온도의 단계별 상승을 적용하였다. 또한, 배양 약 5시간째가 되는 시점에 432g/ℓ의 함수 포도당 수용액 300㎖와 함께 FeSO4 50㎎(10ppm, 상기 함수 포도당 수용액에 포함시킨 상태로 공급)을 공급하였고, 배양 10시간째, 25시간째, 30시간째, 50시간째, 55시간째, 70시간째 및 80시간째가 되는 시점에 각각 432g/ℓ의 함수 포도당 수용액 150㎖와 함께 FeSO4 25㎎(5ppm, 상기 함수 포도당 수용액에 포함시킨 상태로 공급)을 공급하였다.
성분명 g/ℓ %
Glucose 40.00 4%
Yeast Ext 10.00 1%
Soypeptone 10.00 1%
NaCl 0.20 0.02%
실시예 2
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시 배지 성분(표 3) 중 대두 펩톤(soypeptone) 대신 소이톤(soytone)을 사용하였다.
실시예 3
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, FeSO4의 공급량을 2배로 하였다.
실시예 4
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, 발효기의 임펠러의 회전 속도를 800rpm으로 하였다.
실시예 5
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, 발효기의 임펠러의 회전 속도를 700rpm으로 하였다.
비교예 1
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, FeSO4를 공급하지 않았다.
비교예 2
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, 배양 온도의 단계별 상승을 적용하지 않고, 30℃에서 배양하였다.
비교예 3
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, 배양 온도의 단계별 상승을 적용하지 않고, 37℃에서 배양하였다.
비교예 4
상기 실시예 1과 같은 방법을 사용하되, 본 배양 시, 배양 약 75시간째가 되는 시점의 배양 온도 상승없이 배양하였다.
실험예 1
배양물의 적색 정도를 비교를 통해 상기 실시예 및 비교예의 배양에 따른 헴철의 생산 정도를 확인하였다.
대두 펩톤(soypeptone)을 사용한 경우(실시예 1)와 소이톤(soytone)을 사용한 경우(실시예 2)를 비교한 결과, 도 2와 같이, 헴철의 생산 정도에 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 값비싼 소이톤 대신 현저히 저렴한 대두 펩톤을 사용하더라도 유사한 수준의 헴철 생산을 달성할 수 있음을 보여준다.
FeSO4의 공급을 다르게 한 경우를 비교한 결과, 도 3과 같이, FeSO4를 공급하지 않은 경우(비교예 1) 헴철 생산 효율이 낮으며, FeSO4의 공급량이 높은 경우(실시예 3) 보다 오히려 적절히 낮은 경우(실시예 1)에 헴철의 생산 효율이 높은 것으로 나타났다. 이는 헴철의 생산 효율을 위해 FeSO4의 공급량을 적절히 조절할 필요가 있음을 보여준다.
발효기 임펠러의 회전 속도를 다르게 한 경우를 비교한 결과, 도 4 및 도 5와 같이, 회전 속도가 높은 경우(실시예 4 및 실시예 5) 보다 오히려 적절히 낮은 경우(실시예 1)에 헴철의 생산 효율이 높은 것으로 나타났다. 이는 헴철의 생산 효율을 위해 발효기 임펠러의 회전 속도를 적절히 조절할 필요가 있음을 보여준다.
배양 온도를 다르게 한 경우를 비교한 결과, 도 6과 같이, 배양 온도를 일정하게 유지하는 경우(비교예 2 및 비교예 3) 및 배양 온도를 37℃ 수준으로 상승시키는 경우(비교예 4) 보다 배양 온도를 40℃ 수준으로 상승시키는 경우(실시예 1)에 헴철의 생산 효율이 높은 것으로 나타났다. 이는 헴철의 생산 효율을 위해 발효 온도의 상승과 그 상승 정도가 중요함을 보여준다.

Claims (6)

  1. 수탁번호 KCTC 13701BP로 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacteria glutamicum) Hemo-P1 균주를 액체 배지에서 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 액체 배지는 포도당; 효모 추출물; 대두 펩톤 또는 소이톤; 및 염화나트륨;을 함유하는 액체 배지이고,
    상기 액체 배지에 FeSO4를 공급하면서 배양하며,
    배양 온도를 29 내지 31℃에서 시작하여 39 내지 41℃까지 상승시키는 것
    을 특징으로 하는 헴철 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체 배지는 2 내지 6%(w/v) 포도당, 0.1 내지 3%(w/v) 효모 추출물, 0.1 내지 3%(w/v) 대두 펩톤 또는 소이톤 및 0.001 내지 0.2%(w/v) 염화나트륨을 함유하는, 헴철 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FeSO4의 공급은 80 내지 200시간에 걸쳐 상기 액체 배지 1ℓ 당 10 내지 100㎎의 FeSO4를 2 내지 20회로 나누어 공급하는 것인, 헴철 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양 온도의 상승은 29 내지 31℃에서 36 내지 38℃로의 1단계 상승 및 36 내지 38℃에서 39 내지 41℃로의 2단계 상승을 적용한 단계적 상승인, 헴철 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양은 550 내지 650rpm의 발효기 임펠러의 회전 속도를 적용한 교반 배양인, 헴철 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 액체 배지의 pH를 6.5 내지 7.5로 유지시키면서 배양하는, 헴철 생산 방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140077977A (ko) * 2011-10-21 2014-06-24 화이자 인코포레이티드 철을 첨가하여 세포 배양을 개선하는 방법
KR20180049611A (ko) * 2016-11-03 2018-05-11 가톨릭대학교 산학협력단 헴철을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제
KR20200056232A (ko) * 2018-11-14 2020-05-22 주식회사 헤모랩 가축 분변 균총의 육종진화에 의해 선별된 헴철 생산 미생물 및 이를 이용한 헴철 생산 방법
KR20210131184A (ko) * 2020-04-23 2021-11-02 주식회사 헤모랩 메주에서 유래한 미생물 군집으로부터 적응진화에 의해 수득된 헴철 생산 미생물 및 그의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140077977A (ko) * 2011-10-21 2014-06-24 화이자 인코포레이티드 철을 첨가하여 세포 배양을 개선하는 방법
KR20180049611A (ko) * 2016-11-03 2018-05-11 가톨릭대학교 산학협력단 헴철을 포함하는 철분 보충용 사료 첨가제
KR20200056232A (ko) * 2018-11-14 2020-05-22 주식회사 헤모랩 가축 분변 균총의 육종진화에 의해 선별된 헴철 생산 미생물 및 이를 이용한 헴철 생산 방법
KR102210764B1 (ko) 2018-11-14 2021-02-02 주식회사 헤모랩 가축 분변 균총의 육종진화에 의해 선별된 헴철 생산 미생물 및 이를 이용한 헴철 생산 방법
KR20210131184A (ko) * 2020-04-23 2021-11-02 주식회사 헤모랩 메주에서 유래한 미생물 군집으로부터 적응진화에 의해 수득된 헴철 생산 미생물 및 그의 용도

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