CN109593801A

CN109593801A - 一种发酵生产l-色氨酸的工艺

Info

Publication number: CN109593801A
Application number: CN201811542814.2A
Authority: CN
Inventors: 徐庆阳; 李德衡; 王健; 刘元涛; 包鑫; 张宗华; 杨瑞丽; 边恩来; 王飞; 米永花
Original assignee: XINJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Jilin University; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: XINJIANG FUFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Jilin University; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种发酵生产L‑色氨酸的工艺，其包括如下步骤：将产L‑色氨酸大肠杆菌种子液以10%的接种量接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0℃，溶氧量为20%，通过流加氨水维持罐内pH在7.0～7.2之间；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5‑1g/L，直至发酵结束，总发酵时间为42‑48h，得到L‑色氨酸发酵液。本发明工艺简易，发酵效率和糖酸转化率高。

Description

一种发酵生产L-色氨酸的工艺

技术领域

本发明属于氨基酸发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产L-色氨酸的工艺。

背景技术

L-色氨酸的分子式为C₁₁H₁₂O₂N₂，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味。在水中溶解度1.14g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。

L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于饲料行业中。

L-色氨酸的生产最早主要依靠蛋白质水解法和化学合成法，但是随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法又可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法，目前L-色氨酸生产主要以微生物发酵法生产为主。微生物发酵法具有原料价格低廉、工艺控制简单、产品质量可靠等优点。但随着发酵工业的快速发展，发酵法生产L-色氨酸对培养基营养成分和发酵调控的合理性提出了更高的要求。优良的L-色氨酸生产菌株、合理的培养基组成和适当的发酵调控策略有利于提高L-色氨酸的产酸水平。

近年来，L-色氨酸作为必需氨基酸，价格一直较高，L-色氨酸更希望有廉价高效的生产及提取方法，以便推进L-色氨酸的应用。和其他生物工程产品一样，L-色氨酸工业生产也常常会受到生产成本的制约，而在生产成本的构成中，分离提取等下游工程的成本占有相当的比例。因此研究提高L-色氨酸发酵和提取收率的方法具有重要的理论意义和实用价值。申请人之前的专利技术“CN104694614A” 公开了一种L-色氨酸的提取新工艺，包括：菌液发酵、L-色氨酸微膜过滤、三柱串联离交柱离交、超滤脱色、反渗透、双效浓缩、结晶、干燥、包装等工艺得到精品L-色氨酸产品。本发明采用三柱串联离交柱离交、超滤膜脱色和一次结晶得到L-色氨酸产品，工艺简单且可连续化生产，工艺废料经过综合处理可以生产蛋白饲料，绿色环保；该方法采用混合发酵的方式，提高了产酸效率，但是存在发酵工艺相对复杂、发酵参数难以控制等问题。针对上述缺陷，申请人的专利技术“CN201711289822”公开了采用单一菌株发酵的方式，通过添加电气石以及使用透析培养基来提高发酵产酸量；该方法提高了发酵产酸量，但是需要更换培养基，操作难度较大，容易造成部分菌株死亡。在上述专利技术的基础上，申请人继续对单一菌株发酵条件进行了改进和优化。

发明内容

为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种生产和提取L-色氨酸的方法，该方法通过合理配伍培养基，提高了发酵效率，并且对提取方法进行了优化。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

一种发酵生产L-色氨酸的工艺，其包括如下步骤：将产L-色氨酸大肠杆菌种子液以10%的接种量接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0℃，溶氧量为20%，通过流加氨水维持罐内pH在7.0～7.2之间；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L，直至发酵结束，总发酵时间为42-48h，得到L-色氨酸发酵液。

优选地，

所述发酵培养基中添加了氯化胆碱；所述营养液中添加了吲哚和肌醇。

优选地，

所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.4-0.6g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。

优选地，

所述营养液为：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1-1.5g/L，肌醇的浓度为0.5-1g/L，115℃下灭菌15min。

优选地，

所述氯化胆碱为0.4-0.5g/L。

优选地，

所述吲哚的浓度为1g/L。

优选地，

所述肌醇的浓度为0.5g/L。

本发明还要求保护上述任其一所述的工艺制备的L-色氨酸。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：

色氨酸合成途径复杂，受较多因素的影响，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累色氨酸时，往往会出现生长问题，本研究通过优化营养物质改善了细胞代谢途径，色氨酸积累得到提升；为避免菌株因氮源切换而出现的细胞生长停滞期，在培养基中添加氯化胆碱，以刺激菌体生长；为解决菌体早衰和产酸效率低，提高中后期菌体活力，选择流加葡萄糖、吲哚和肌醇，并对添加时间进行了摸索，提高后期细胞产酸能力，进一步提高色氨酸产量。随着发酵时间的增加，大肠杆菌能够产生部分丝氨酸，通过流加吲哚，从而可以利用大肠杆菌色氨酸合成酶催化丝氨酸和吲哚合成色氨酸，提高色氨酸的产量；适量的肌醇可以强化CO2固定反应, 促进氨基酸的积累，提高发酵转化率；多种因素相互协同，提高了色氨酸的发酵产量。

说明书附图

图1：氯化胆碱添加量对发酵液中菌体生物量和色氨酸产量的影响；

图2：吲哚添加量对发酵液中色氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种发酵生产L-色氨酸的工艺，其包括如下步骤：

配制发酵培养基：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.4g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min；

配制流加营养液：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1g/L，肌醇的浓度为0.5g/L，115℃下灭菌15min；

以大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例，以10%的接种量将种子液（OD₆₀₀值为10.8）接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L；直至发酵结束，总发酵时间为42h，即得富含L-色氨酸发酵液。

实施例2

一种发酵生产L-色氨酸的工艺，其包括如下步骤：

配制发酵培养基：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.5g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.6，在115℃下灭菌15min；

配制流加营养液：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1.5g/L，肌醇的浓度为0.8g/L，115℃下灭菌15min；

以大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例，以10%的接种量将种子液（OD₆₀₀值为10.7）接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L；直至发酵结束，总发酵时间为48h，即得富含L-色氨酸发酵液。

实施例3

一、氯化胆碱添加量对发酵液中菌体生物量和色氨酸产量的影响。

操作方式参照实施例1，选择氯化胆碱的添加量为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1（g/L）；如图1-2所示，随着氯化胆碱添加量的增加，菌体生物量逐步增加，当当氯化胆碱添加浓度提升至0.4 g/L时，细胞生长情况得到明显改善，细胞快速生长，色氨酸积累速率也得到快递提升，继续增加氯化胆碱的添加量，菌体生物量和色氨酸产量没有明显提升，选择0.4-0.6g/L的添加量较为合适。

二、吲哚和肌醇对发酵液中菌体生物量、色氨酸产量、糖酸转化率以及发酵产酸速率的影响。

设置对照组，其中，对照组1：不添加吲哚和肌醇，其余同实施例1；对照组2：不添加吲哚，其余同实施例1；对照组3：不添加肌醇，其余同实施例1；实验组为实施例1。具体见表1：

表1

组别	实验组	对照组1	对照组2	对照组3
					菌体生物量g/L	44.9	41.1	44.7	41.5
色氨酸产量g/L	50.3	38.6	44.8	42.9
					糖酸转化率%	22.6	18.7	20.3	19.8
发酵产酸速率g/L·h	1.19	0.92	1.07	1.02

结论：色氨酸合成途径复杂，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累色氨酸时，往往会出现生长问题，本研究通过优化营养因子，逐步改善了细胞代谢途径，色氨酸积累得到提升。在发酵24 h添加吲哚和肌醇，两种组分相互协同，与对照组1相比，菌体生物量有所提高，色氨酸生产速率维持在1.19g/L·h，最终色氨酸产量在50.3 g/L，较对照组1提高30.3%；综合对照组2和对照组3的实验结果可知，吲哚对菌体生物量影响并不大，对色氨酸的产量有所提高，而肌醇对菌体生物量和色氨酸产量均起到正向调节作用。

本发明还检测了吲哚添加量对色氨酸产量的影响，设置吲哚的添加量分别为0,0.5,1, 1.5, 2, 2.5（g/L），如图2所示，随着吲哚添加量的增加，色氨酸的产量迅速增加，当增大1g/L后，增幅放缓，然后趋于平稳，因此，选择吲哚的浓度为1-1.5g/L。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种发酵生产L-色氨酸的工艺，其包括如下步骤：将产L-色氨酸大肠杆菌种子液以10%的接种量接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0℃，溶氧量为20%，通过流加氨水维持罐内pH在7.0～7.2之间；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L，直至发酵结束，总发酵时间为42-48h，得到L-色氨酸发酵液。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基中添加了氯化胆碱；所述营养液中添加了吲哚和肌醇。

3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.4-0.6g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。

4.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述营养液为：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1-1.5g/L，肌醇的浓度为0.5-1g/L，115℃下灭菌15min。

5.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述氯化胆碱为0.4-0.5g/L。

6.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述吲哚的浓度为1g/L。

7.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述肌醇的浓度为0.5g/L。

8.根据权利要求1－7任其一所述的工艺制备的L-色氨酸。