KR102169928B1 - 뎅기 바이러스 외막 단백질 도메인 ⅲ 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뎅기 바이러스의 각 혈청형 유래 외막 단백질 도메인 Ⅲ로부터 유래한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 뎅기 바이러스 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
뎅기열 질병은 세계적으로 공중 위생을 위협하는 질병으로, 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형(DENV-1, -2, -3 및 -4)에 의해 주로 유발되며, 뎅기열 질병의 발병은 최근 10년간 극적으로 증가하였다. 뎅기열 질병은 가벼운 뎅기열부터 심각하고, 삶을 위협하는 증상인 뎅기출혈열(dengue hemorrhagic fever, DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군(dengue shock syndrome, DSS)까지 다양하다. 뎅기 감염의 빈도가 증가함에 따라 관심도 증가하였으나, 아직까지 뎅기 바이러스 감염에 대한 치료법은 없으며, 이용가능한 백신이 현재까지 없기 때문에 대부분의 치료 형태는 증상을 완화시키는 방법뿐이다. 최초의 감염은 평생동안 감염된 혈청형에 대해서는 면역력을 수여하지만, 다른 혈청형의 뎅기 바이러스에 대한 이차 감염시에 교차 면역이 되지 않는 문제가 있어, DHF 또는 DSS에 대한 위험인자를 가지게 된다.
질병의 조기 진단의 필요성은 증상의 임상적 관리에 도움을 준다. 70%의 뎅기 바이러스 감염 환자는 증상이 없어(asymptomatic), 열대 또는 아열대 국가들에서 혈액 전파의 문제를 야기한다.
바이러스의 분리 및 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 통한 바이러스의 RNA 검출은 조기 진단에 주로 사용되는 방법이지만, 시간 소모적이며, 비싸고, 숙력된 기술을 요구하는 단점이 있다. 게다가, 뎅기 바이러스의 게놈은 대략 증상이 나타나고 5일동안 환자의 혈액에서 검출될 수 있다. 바이러스 RNA를 검출할 수 있는 범위가 최초 감염으로부터 5~7일로 제한적이고, 환자가 증상을 느끼고 병원에 도착했을 시에는 바이러스 RNA를 검출하기에는 늦어버리는 경우가 많다.
뎅기 바이러스의 게놈은 단일 폴리펩타이드로 번역되고, 바이러스 및 세포의 프로테아제에 의해 3개의 구조 단백질(C, prM/M 및 E) 및 7개의 비구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)로 절단된다. NS1 단백질은 매우 보존된 당단백질로, 질병의 초기 임상 단계 동안에 뎅기 바이러스에 감염된 환자의 혈청에 고농도로 존재하며, 최초 또는 이차 감염 환자의 시료에서 미열 발생 후 1일부터 9일까지 발견될 수 있다. 그러나, 항체 검정에서 플라비바이러스(flaviviruses) 간의 교차-반응성이 보고된 바 있다. 외막 단백질(envelope, E)은 도메인 Ⅲ를 통해 항체 중화반응을 이끌어내는 것으로 알려졌고, IgM의 결정을 통해 뎅기 바이러스의 혈청학적 진단에 사용되어 왔다. 뎅기 바이러스에 대한 IgM은 거의 모든 뎅기 바이러스 감염 환자에서 증상 개시 5일 내에 검출가능한 수준에 도달하여, 약 2주간 높은 수준을 유지하는 반면, IgG는 14일째부터 평생동안 유지되어, 급성 뎅기 감염에서 환자의 치료에는 IgM의 진단이 중요하다.
뎅기 바이러스에 대한 면역글로불린의 반응은 각 외막 단백질의 도메인에 대해 높은 수준을 보여주어, 외막 단백질의 도메인 Ⅲ 교차-반응성의 면역글로불린 집단은 비슷하게 가변적이며, IgG보다 IgM이 훨씬 크다. 뎅기 바이러스의 혈청형 2의 외막 도메인 Ⅲ 단백질은 백신의 소재로 평가되었으나, 넓은 교차-반응성 때문에 지카와 구별될 수 있는 IgM의 검출에 한계가 있었다. 뎅기 바이러스 특이적인 IgM의 검출을 위해 메탄올자화(methylotrophic) 효모인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현시킨 뎅기 바이러스 혈청형 1의 외막 도메인 Ⅲ 단백질의 사용이 보고되었다.
본 발명에서는 대장균에서 발현시킨 4가지 혈청형 유래의 외막 도메인 Ⅲ 펩 타이드를 뎅기 감염 환자의 IgM 검출을 위한 혈청학적 분석에 사용하였다.
한편, 한국등록특허 제1763745호에는 '뎅기 바이러스 4가지 혈청형의 외막 도메인 Ⅲ에 대한 단일클론항체 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0096031호에는 뎅기 바이러스 NS1을 표적으로 하는 '타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 유래 분자결합자를 이용한 뎅기 바이러스 조기검출용 바이오칩 및 그 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 뎅기 바이러스 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 뎅기 바이러스의 각 혈청형 유래 외막 단백질 도메인 Ⅲ를 대장균에서 발현시키고, 발현된 재조합 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하였으며, 에피토프 예측 프로그램을 통해 각각의 펩타이드에서 고항원성 에피토프 서열을 분석하였으며, 뎅기 바이러스 감염 환자의 임상 시료를 이용하여 각각의 재조합 외막 단백질 도메인 Ⅲ 펩타이드를 항원으로 코팅한 간접 ELISA 분석을 수행한 결과, 뎅기 바이러스의 혈청형 1 및 혈청형 3 유래 재조합 외막 단백질 도메인 Ⅲ 펩타이드를 조합할 경우, 감염 초기(2~4일)의 뎅기 감염 환자를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 뎅기 바이러스 각 혈청형의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드와 반응시키는 단계를 포함하는, 뎅기 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 접근성(이용가능성)이 우수한 간접 ELISA 방법을 통해 급성 뎅기 바이러스 감염 진단의 효율을 증진시키기 위한, 민감도 및 특이도가 우수한 항원을 제공한다.
도 1은 재조합 뎅기 바이러스 외막 도메인 Ⅲ의 발현 및 정제 결과로, a는 각 혈청형 유래 외막 단백질의 도메인 Ⅲ에 관한 도면이며, b는 정제된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 겔 로딩 결과 사진 및 웨스턴 블랏 수행 결과이다.
도 2는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 유래 외막 도메인 Ⅲ의 아미노산 서열 정렬 결과이다.
도 3은 재조합 뎅기 바이러스 외막 도메인 Ⅲ와 주형 아미노산 서열(original)의 정렬 결과이다.
도 4는 재조합 뎅기 바이러스 외막 도메인 Ⅲ의 에피토프 서열을 3개의 에피토프 예측 프로그램(ABCpred, BCPreds, IEDB-BepiPred)을 통해 분석한 결과이다. *: 3개의 독립적인 프로그램에서 공통적으로 확인된 에피토프를 의미.
도 5는 IEDB를 통해 에피토프를 분석한 결과이다. b의 도면에 표시된 각 숫자는 각각 다음의 서열을 의미한다: 1-1, DAP; 1-2, FSTQDEKGATQ; 1-3, PVNIEAEPPFGE; 2-1, EGDGSP; 2-2, TEKDRPVNIEAEPPFG; 3-1, KGEDAP; 3-2, VVTKKEEPVNIEAEPP; 3-3, E; 4-1, EGAGAP; 4-2, EPPFG; 4-3, E; 4-4, N.
도 6은 뎅기 바이러스를 코팅한 후, 임상 시료를 이용하여 ELISA를 수행한 결과이다. Nor-: 정상인(뎅기 음성) 시료, VN-: 베트남에서 제공받은 뎅기 감염 의심 환자 시료.
도 7은 재조합 외막 도메인 Ⅲ를 코팅한 후, 임상 시료를 이용하여 ELISA를 수행한 결과이다. N-: 정상인 시료, VN-: 뎅기 감염 환자 시료.
도 8은 뎅기 감염 환자 시료를 이용하여 ELISA를 통해 임상적 검증을 수행한 결과를 ROC(receiver-operating characteristic) 곡선 분석을 통해 역치의 컷-오프값을 계산한 것이다.
도 2는 4가지 혈청형의 뎅기 바이러스 유래 외막 도메인 Ⅲ의 아미노산 서열 정렬 결과이다.
도 3은 재조합 뎅기 바이러스 외막 도메인 Ⅲ와 주형 아미노산 서열(original)의 정렬 결과이다.
도 4는 재조합 뎅기 바이러스 외막 도메인 Ⅲ의 에피토프 서열을 3개의 에피토프 예측 프로그램(ABCpred, BCPreds, IEDB-BepiPred)을 통해 분석한 결과이다. *: 3개의 독립적인 프로그램에서 공통적으로 확인된 에피토프를 의미.
도 5는 IEDB를 통해 에피토프를 분석한 결과이다. b의 도면에 표시된 각 숫자는 각각 다음의 서열을 의미한다: 1-1, DAP; 1-2, FSTQDEKGATQ; 1-3, PVNIEAEPPFGE; 2-1, EGDGSP; 2-2, TEKDRPVNIEAEPPFG; 3-1, KGEDAP; 3-2, VVTKKEEPVNIEAEPP; 3-3, E; 4-1, EGAGAP; 4-2, EPPFG; 4-3, E; 4-4, N.
도 6은 뎅기 바이러스를 코팅한 후, 임상 시료를 이용하여 ELISA를 수행한 결과이다. Nor-: 정상인(뎅기 음성) 시료, VN-: 베트남에서 제공받은 뎅기 감염 의심 환자 시료.
도 7은 재조합 외막 도메인 Ⅲ를 코팅한 후, 임상 시료를 이용하여 ELISA를 수행한 결과이다. N-: 정상인 시료, VN-: 뎅기 감염 환자 시료.
도 8은 뎅기 감염 환자 시료를 이용하여 ELISA를 통해 임상적 검증을 수행한 결과를 ROC(receiver-operating characteristic) 곡선 분석을 통해 역치의 컷-오프값을 계산한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뎅기 바이러스 각 혈청형의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열은 각각 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4 유래의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 펩타이드에 해당하며, 각각의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 각 펩타이드의 코딩 서열로부터 번역되는 본연의 아미노산 서열(서열번호 5 내지 8)에서 일부 아미노산 잔기에 돌연변이가 발생한 펩타이드이다(도 3).
용어 "혈청형(serotype)"은 일반적으로, 뎅기 바이러스 내에 상이한 변이를 지칭한다. 뎅기 바이러스 유전자 군을 포함하는 4가지 상이한 뎅기 바이러스 혈청형(DV1-4)은 아미노산 수준에서 서로 대략 25% 내지 40% 상이하다. 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형은 병원성에서 변하지만, 이들 모두 아시아, 아프리카, 중앙아메리카와 남아메리카 지역에 만연하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물에 있어서, 뎅기 바이러스 혈청형 1 및 혈청형 3의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 서열번호 9 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 조합하면, 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단 민감도가 증가한다(표 4).
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 펩타이드는 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료 내의 IgM을 검출하는 것을 특징으로 하며, 상기 펩타이드가 항원으로 작용하여 항원-항체 반응에 의해 뎅기 바이러스 감염증을 판단할 수 있는 것이다. 상기 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료 내의 IgM은 뎅기 바이러스에 대한 면역글로불린으로, 통상 뎅기 발병 후 2 내지 5일째의 혈청에 IgM이 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는, 바람직하게는 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드가 항원으로서 코팅된 형태의 간접 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 상기 펩타이드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함할 수도 있다.
또한, 상기 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명은 또한, 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 서열번호 9 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드와 반응시키는 단계를 포함하는, 뎅기 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 '생물학적 시료'는 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 채취된 것으로, 바람직하게는 혈청일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 사용되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 세포 및 바이러스
흰줄숲모기(Aedes albopictus) 클론 C6/36 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 구입하였다(ATCC CRL-1660TM). C6/36 세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% Antibiotic-Antimycotic(Gibco REF# 15240.062)가 첨가된 고농도의 글루코스 및 피루베이트 함유 DMEM 배지(Gibco Cat.no 11995065)를 사용하여, 28~30℃, 5% 이산화탄소 조건의 배양기에서 배양하였다. 기타 다른 조직 배양 시약은 Life technologies(미국)로부터 구매하여 사용하였다. 본 발명에 사용된 뎅기 바이러스 strain은 다음과 같다.
| 혈청형 | 출처 | |
| DENV-1 (이하 DV 1) | 국가병원체자원은행 NCCP 41503 | Genbank Accession: KP406803.1 |
| DENV-2 (이하 DV 2) | KBPV-VR-29 | Genbank Accession: KP406804 |
| DENV-3 (이하 DV 3) | KBPV-VR-30 | Genbank Accession: KP406805 |
| DENV-4 (이하 DV 4) | KBPV-VR-31 | Genbank Accession: KP406806 |
2. 시약
Taq 중합효소 및 PCR 시약은 Takara(일본)에서 구매하였으며, 대장균 BL21 (DE3) 컴피턴트 세포 및 pET21b(+) 벡터는 Novagen(영국)으로부터 구입하였다. 제한효소 및 T4 DNA 리가제 효소는 NEB(New England Biolabs, 미국), HisPurTM Ni-NTA는 Thermo Scientific(미국), LB 액체배지, 염화나트륨, 요소, 구아니딘염산, L-아그기닌 및 다른 시약들은 Sigma Aldrich(미국)으로부터 구매하여 사용하였다.
3. 인간 혈청 시료
뎅기 바이러스 감염 환자의 혈액 시료(n=30)는 베트남의 뎅기 감염병 유행 지역으로부터 수집하였으며, 건강한 정상인 시료(뎅기 음성)는 익산 지역의 말라리아-청정 지역으로부터 수집하였다. 본 발명은 원광대학교 병원 생명윤리위원회의 승인을 받아 이루어졌다(Approval No. 201603-BR-015). 뎅기 양성 혈청은 NS1 항원 키트(SD BIOLINE, 미국)를 통해 검정하였다. 4개의 지카 바이러스-IgM 양성 혈청은 ABO Pharmacheuticals(미국)로 구매하여 음성 시료로 사용하였다.
4. 바이러스 증식 및 역가측정
C6/36 세포가 플레이트 면적에 70~90% 수준으로 자랐을 때 MOI(multiplicity of infection) 0.1로 뎅기 바이러스를 감염시켰다. 바이러스 흡착은 28~30℃, 5% 이산화탄소 조건에서 2~3시간 동안 수행하였으며, 매 20분 간격으로 배지를 흔들어주었다. 그 후, 바이러스 혼합물을 제거하고 2% FBS가 첨가된 DMEM으로 세포를 유지하며 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양시켰다. 7일 후, 바이러스를 포함하는 배지를 세포로부터 회수하고, 4,000xg, 30분 동안 원심분리하여 정화시켰다. 2% FBS가 첨가된 신선한 배지를 세포에 첨가하고, 상기 과정을 반복하여, 최초 감염일자 기준 14일 및 21일차에 바이러스 상층액을 회수하였다. 상기 상층액은 0.45μm 필터(GVS filter technology, 미국)로 여과하고, 수크로오스 초원심분리를 수행하였다. 바이러스의 역가(FFU)는 초점형성시험법(focus forming assay)을 수행하여 얻었다. 간단하게, 바이러스 상층액을 10배수로 계열희석하고, 24-웰 플레이트에 있는 Vero 세포 단층에 처리한 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시키고, 감염된 세포는 1.25% CMC(carboxylmethyl-cellulose)를 포함하는 배지에서 추가로 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하여 CMC를 완전히 제거한 후, 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 세포를 고정한 후, 0.1% Triton X-100을 처리하였다(permeabilization). 그 후, 3% BSA(bovine serum albumin), 0.1% Tween 20 및 22.52㎎/㎖ 글리신을 포함하는 용액으로 블록킹을 진행한 후, anti-flavivirus group antigen 4G2 (Merck, 독일)를 1차 항체로하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, horse-radish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG(H&L) (Abcam, 영국)로 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세포를 PBS로 5회 세척한 후 H2O2-diaminobenzidine과 반응시켜 시각화하였다.
5. 재조합 외막 도메인 Ⅲ 항원의 발현
뎅기 바이러스 RNA로부터 cDNA의 역전사는 PCR 증폭으로 수행되었다. PCR 반응에 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 2와 같으며, PCR 반응 조건은 다음과 같다: 초기 변성 95℃ 5분 → 변성 94℃ 30초, 결합 55℃ 45초 및 신장 68℃ 45초의 과정을 30회 → 최종 신장 68℃ 7분.
| 항원 | 염기서열(5'→3') (서열번호) | 제한효소 | 산물크기 | |
| DV1-rED Ⅲ | F | GGATCCGTCATATGTGATGTGC (13) | Bam HI | 304bp |
| R | CTCGAGTTTCTTGAACCAGCTTAGTTTC (14) | Xho I | ||
| DV2-rED Ⅲ | F | CCGGATCCCGCGCATCTTAAGTGCAGGCTGAGAATG (15) | Bam HI | 441bp |
| R | TTTAGCGGCCGCCCAGGCTGTGTCACCTAAAATGG (16) | Not I | ||
| DV3-rED Ⅲ | F | GGATCCGAGCTATGCAATGT (17) | Bam HI | 304bp |
| R | CTCGAGTTTCTTATACCAGTTGATTTTC (18) | Xho I | ||
| DV4-rED Ⅲ | F | GGATCCGAAGTTCTCAATTGACAAAG (19) | Bam HI | 286bp |
| R | CTCGAGCCCTTTCCTGAACCAAT (20) | Xho I |
PCR 산물을 pET21b(+) 벡터에 클로닝한 후, 상기 벡터를 대장균 BL21 (DE3) 균주에 형질전환하고, 형질전환된 대장균 균주를 배지에 접종하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. DV3-rED Ⅲ 단백질은 수용성으로 발현되었고, DV1-, DV2- 및 DV4-rED Ⅲ 단백질은 불용성의 형태로 발현되었다. 대장균을 이용한 재조합 단백질의 발현유도, 단백질 발현 정제 등의 과정은 통상의 방법을 통해 이루어졌다.
6. ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
환자 혈청 시료를 스크리닝하기 위해서, 간접 ELISA를 수행하였다. 간단하게, 50mM 중탄산염(bicarbonate) 버퍼(pH 9.6)에 뎅기 바이러스(106 FFU) 또는 4가지 혈청형 유래의 재조합 외막 도메인 Ⅲ 단백질(rED Ⅲ, 1 ㎍/㎖)을 준비하고, 각각의 용액을 96-웰 플리스티렌 플레이트(NUNC, 미국)에 넣고 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 그 후, 플레이트를 PBS-T로 세척하고 5% 탈지유 용액으로 37℃에서 블록킹시켰다. 그 후, 플레이트를 세척하고, 인간 혈청 시료를 1:100의 비율로 희석(in PBS-T with 5% BSA)한 후 각각의 웰에 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후, PBS-T로 세척하고 HRP-conjugated anti-human IgM 항체를 각각의 웰에 첨가하여 반응시킨 후, PBS-T를 이용하여 5회 세척하고 TMB(3,3'5,5'-tetra methyl benzidine) 용액(Invitrogen)을 첨가하여 15분간 암 조건에서 반응시켰다. 최종적으로 0.18M의 황산을 첨가하여 반응을 종료시키고, 마이크로플레이트 리더기(SpectraMax® M Series, Molecular Devices, 미국)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 외막 도메인 Ⅲ 서열 분석 및 단백질 구조 그래픽
4가지 혈청형 유래의 rED Ⅲ의 아미노산 서열을 BioEdit 프로그램(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)을 사용하여 다중정렬하였다. rED Ⅲ의 3차원 구조는 I-tasser(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)를 사용하여 예측하고, Pymol 프로그램(http://www.pymol.org)을 사용하여 시각화하였다.
8. 통계처리
모든 결과 그래프는 Graphpad Prism(버전 5.0)을 사용하여 그렸으며, ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 및 95% 신뢰구간을 검정 민감도 및 정확도를 위해 계산하였다.
실시예 1. 재조합 외막 도메인 Ⅲ 단백질의 발현
진단 항원으로 사용될 재조합 외막 도메인 Ⅲ 단백질(rED Ⅲ)의 코딩 유전자는 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다(도 1a). 증폭된 각각의 산물은 적절한 제한효소로 자르고, pET21b(+) 발현 벡터로 클로닝하여 최종 컨스트럭트를 얻었다. 발현된 각각의 재조합 외막 도메인 Ⅲ 단백질은 히스티딘 태그(6 ×histidine)이 융합되어 있고, 분리정제된 각각의 재조합 단백질을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏(도 1b)을 통해 분석하였다. 그 결과, DV1-, DV2-, DV3- 및 DV4-rED Ⅲ는 각각 13kDa, 18kDa, 13kDa 및 12kDa의 크기로 확인되었다.
실시예 2. 재조합 외막 도메인 Ⅲ의 서열 분석
뎅기 바이러스의 외막 단백질에서 도메인 Ⅲ는 높은 면역성을 가지고 있어, IgM ELISA에서 항원으로서 사용되어 왔으나, 각 혈청형에 대해 매우 특이성을 가지고 있다. 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형 가운데 가장 높은 특이적인 도메인 Ⅲ를 결정하기 위해서, 4개의 재조합 단백질의 아미노산 서열을 분석하였다(도 2a). 그 결과, DV1- 및 DV3-rED Ⅲ가 가장 높은 서열 유사성(66%/87% identities/positives)을 나타냈다(도 2b). 또한, 대장균에서 발현시킨 rED Ⅲ는 원래의 각 ED Ⅲ 단백질 서열과 일부 아미노산 잔기에 돌연변이가 일어났음을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 3. 재조합 항원에서 항원성 에피토프 분석
외막 도메인 Ⅲ 내의 잠재적인 에피토프 서열을 예측하기 위해서, 각각의 서열을 바이오인포메틱스를 통해 분석하였다. 그 결과, 3개의 독립적인 에피토프 예측 프로그램(ABCpred (threshold: 0.7), BCPreds(specificity: 75%), 및 immune epitope database and analysis resource [IEDB]-BepiPred (threshold 0.7))을 통해 DV1-rED Ⅲ는 DAP, FSTQDEKGATQ(서열번호 21) 및 VNIEAEPPFGES(서열번호 22)의 공통 에피토프를 보였으며, DV2-rED Ⅲ는 EGDGSP(서열번호 23) 및 TEKDRPVNIEAEPPFG(서열번호 24)의 공통 에피토프를 보였으며, DV3-rED Ⅲ는 KGEDAP(서열번호 25), VVTKKEEPVNIEAEPP(서열번호 26) 및 E의 공통 에피토프를 보였으며, DV4-rED Ⅲ는 EGAGAP(서열번호 27), N 및 EPPFG(서열번호 28)의 공통 에피토프를 보여주었다(도 4). 흥미롭게로, 2개의 동일한 에피토프(DAP 및 VNIEAEPP)가 DV1- 및 DV3-rED Ⅲ에서 확인되었고, 1개의 동일한 에피토프(EPPFG)가 DV2- 및 DV4-rED Ⅲ에서 확인되었다.
그러나, DV4-rED Ⅲ의 에피토프 점수가 다른 혈청형에 비해 낮게 나타났다(도 5a). 상기 선형의 에피토프 후보들을 확인한 후에, 에피토프의 위치를 3차원 구조로 분석하였다. 그 결과, DV1-rED Ⅲ의 DAP, FSTQDEKGATQ 및 VNIEAEPPFGES의 에피토프는 다른 혈청형의 rED Ⅲ 에피토프 보다 표면에 노출된 것으로 확인되었다(도 5b).
실시예 4. 코호트의 임상적 분석
본 발명에 사용된 뎅기 바이러스 감염 의심 환자의 시료는 베트남의 National Children hospital로부터 2017년 9월과 10월 사이에 제공받았으며, 총 26명의 환자 특성은 하기 표 3과 같다.
| 총 환자 수 | 26명 |
| 평균 나이 (표준편차) | 23.38 (17.91) |
| 성별 (남성:여성) | 14:12 |
| 검체 수집 시점의 증상 | 열(fever) |
| 발병 후 일자 (표준편차) | 2.6 (0.57) |
| 계절 주기 | Sep. ~ Oct. 2017 |
모든 임상 시료는 급성 뎅기열을 가지고 있으며, SD Rapid kit of Dengue NS1를 통해 양성으로 확인되었다. 모든 뎅기 의심 시료는 베트남 내의 하노이(n=21), 박장(n=3), 하남(n=1) 및 하이즈엉(n=1)으로부터 수집되었다.
실시예 5. 임상적 시료를 이용한 ELISA 분석
재조합 외막 도메인 Ⅲ가 항원으로서, 환자 혈청 내의 IgM를 검출할 수 있는지 확인하기 위해서 임상 시료를 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, 각 혈청형의 뎅기 바이러스(106 ffu/well)를 96-웰 폴리스티렌 플레이트에 코팅한 후, 혈청을 1:100으로 희석하여 처리하였다. 그 결과 도 6에서 확인되는 것과 같이, DV1을 코팅한 경우, 모든 음성 시료보다 26개의 임상 시료 중 11개의 시료(VN6, 10, 12, 14, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 25)에서 높은 흡광도가 확인되었다. DV2를 코팅한 경우에는 26개의 임상 시료 중 13개의 시료(VN6, 8, 9,10, 12, 14, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 25)가, DV3를 코팅한 경우에는 26개의 임상 시료 중 8개의 시료(VN6, 10, 17, 19, 20, 21, 24, 25)가, DV4를 코팅한 경우에는 26개의 임상 시료 중 7개의 시료(VN6, 14, 17, 19, 20, 24, 25)가 음성 시료(22개) 보다 높은 흡광도를 보여주었다. 상기 결과를 통해, DV2가 환자 시료에 대해 가장 반응성이 좋은 것을 알 수 있었다.
그 다음, 각 혈청형 유래 rED Ⅲ를 1㎍/well의 농도로 코팅하여 ELISA 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 7에서 확인되는 것과 같이, DV1-rED Ⅲ를 코팅한 경우, 26개의 임상 시료 중 9개(VN6, 8, 9, 12, 14, 19, 20, 21, 24)의 시료가, DV2-rED Ⅲ를 코팅한 경우 26개의 임상 시료 중 3개(VN14, 19, 24)의 시료가, DV3-rED Ⅲ를 코팅한 경우 26개의 임상 시료 중 7개(VN6, 10, 14, 17, 19, 20, 24)의 시료가, 그리고 DV4-rED Ⅲ를 코팅한 경우 26개의 임상 시료 중 3개(VN12, 14, 24)의 시료가 음성 시료(22개) 보다 높은 흡광도를 보여주어, DV1-rED Ⅲ가 환자 시료에 대해 가장 반응성이 좋은 것을 알 수 있었다.
실시예 6. 뎅기 감염 진단에 대한 재조합 항원의 임상 평가능
binary 진단 과정을 위한 뎅기 감염에 대한 역치 컷-오프 값은, 모든 결과 값을 Graphpad Prism을 이용하여 시각화(plotting)한 후, ROC(receiver-operating characteristic) 곡선 분석을 통해 DV1-, DV2-, DV3- 및 DV4-rED Ⅲ 각각에 대해서 0.14, 0.15, 0.21 및 0.21로 결정되었다(각각의 컷-오프 값보다 흡광도가 높으면 양성으로, 낮으면 음성으로 판단하였다). ROC 곡선 분석에 따르면, DV1-rED Ⅲ이 가장 높은 임상적 민감도 및 특이도를 보여주었다(도 8). DV1-rED Ⅲ에 대한 ROC 곡선 분석은 0.9541(95% 신뢰구간: 0.9134 to 1.015)의 AUC(area under-the-curve) 값을 보여주었고(p<0.0001), 이는 DV1-rED Ⅲ 항원이 뎅기 감염 예측에 높은 정확도를 보임을 의미하였다. 지카 바이러스에 대한 IgM 양성 환자의 시료(n=4)에 대해 DV1- 및 DV3-rED Ⅲ 재조합 단백질은 ELISA 분석에서 반응성을 보이지 않았다(도 8b). 하기 표 4는 각각의 재조합 외막 도메인 Ⅲ 단백질을 항원으로 코팅하여 수행한 ELISA 결과를 정리한 것이다.
| DV1-rED Ⅲ | DV2-rED Ⅲ | DV3-rED Ⅲ | DV4-rED Ⅲ | Combined result of DV1- & DV3-rED Ⅲ |
|
| 민감도 | 69.23% (9/13) | 23.07% (3/13) | 53.84% (7/13) | 23.07% (3/13) | 84.61% (11/13) |
| 특이도 | 100 % (30/30) | 100 % (30/30) | 100 % (30/30) | 100 % (30/30) | 100 % (30/30) |
하기 표 5는 본 발명에서 사용된 임상 시료의 정보 및 실험 결과를 요약한 것이다.
질병 발병 후 일자와 재조합 항원의 진단 능력간의 관계를 확인해보았다. 발병 후 2일째, 11개의 뎅기 NS1-양성 시료가 확인되었고, DV1 및 DV2 바이러스는 혈청 내 IgM을 45.45%(5/11) 수준으로 검출할 수 있었다. DV1-rED Ⅲ 항원은 단독으로 바이러스에 의해 감염 양성으로 판정된 5개의 시료 중 4개의 시료(VN9, VN12, VN14, 및 VN20)에 대해 뎅기 IgM을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, DV1-rED Ⅲ는 DV1 바이러스가 아닌, DV2 바이러스에 의해 검출된 VN9 시료에 대해 양성 반응을 보여주었다.
발병 후 3일째에 14개의 시료가 뎅기 NS1-양성으로 확인되었고, DV1 및 DV3 바이러스 기반 ELISA에서 6개(VN10, VN17, VN19, VN21, VN24, 및 VN25)의 시료가 양성으로 확인되어 42.85%(6/14) 수준의 검출능을 보여주었고, DV2 바이러스는 상기 6개의 시료외에 추가로 VN8 시료를 검출할 수 있었다. DV1- 및 DV3-rED Ⅲ를 이용한 ELISA 분석에서는 상기 바이러스 기반 ELSIA에서 양성으로 확인된 6개의 시료 중 5개(VN10, VN17, VN19, VN21 및 VN24)에서 IgM을 검출하여 83.3%의 검출 수준을 보여주었다. 상기 시료 외에 2개(VN8 및 VN21)의 시료가 DV1-rED Ⅲ를 이용한 분석에서 추가로 검출되었으며, DV3-rED Ⅲ를 이용한 분석에서도 2개(VN10 및 VN17)의 시료가 추가로 검출되었다. DV1-, DV2- 및 DV3-rED Ⅲ를 이용한 분석에서 VN19와 VN24의 시료가 공통적으로 검출되었다.
4일째에는 단지 1개(VN6)의 시료만 뎅기 NS1-양성으로 확인되었고, 상기 시료는 모든 혈청형의 뎅기 바이러스 기반 ELISA 분석에서 양성으로 검출되었고, DV1- 및 DV3-rED Ⅲ를 이용한 ELISA 분석에서도 양성으로 확인되었으나, DV2- 및 DV4-rED Ⅲ를 이용한 ELISA 분석에서는 검출되지 않았다.
최종적으로 바이러스 기반 ELISA는 NS1-양성 시료에 대해 50%(13/26)의 민감도를 보여주었으며, 상기 13개의 시료에 대해서 DV1-rED Ⅲ는 9개를, DV3-rED Ⅲ는 2개를 검출할 수 있어, 84.61%(11/13)의 민감도를 나타냈다.
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation
<120> Composition for early diagnosis of dengue virus infection
comprising peptide derived from envelope domain III of four
serotype dengue virus as effective component and uses thereof
<130> PN19034
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 291
<212> DNA
<213> Dengue virus
<400> 1
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ggaactgttc tggtgcaggt taaatatgaa ggaacagacg caccatgcaa gattcccttt 120
tcgacccaag atgagaaagg agcaacccag aatgggagat taataacagc caaccccata 180
gtcactgaca aagaaaaacc agtcaatatt gaggcagaac caccctttgg tgagagctac 240
atcgtggtag gagcaggtga aaaagctttg aaactaagct ggttcaagaa a 291
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<212> DNA
<213> Dengue virus
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atgtgtacag ggaagtttaa agtcgtgaag gaaatagcag aaacacaaca tggaacaata 120
gtcattagag tacaatatga aggagacggc tctccatgca agatcccttt tgagataatg 180
gatctggaaa aaagacatgt cttaggtcgt ctgattacag tcaacccaat tgtaacagaa 240
aaggacaggc cagtcaacat agaagcagaa cctccattcg gagacagcta cattatcata 300
ggagtggagc cgggacaact gaagcttaac tggttcaaga aaggaagttc tatcggtcaa 360
atgtttgaga caacaatgag aggagcgaaa agaatggcca ttttaggtga cacagcctgg 420
420
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<212> DNA
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gggacaatac tcattaaggt tgagtacaaa ggggaagatg caccctgcaa gattcctttc 120
tccacggagg atggacaagg aaaagctcac aatggcagac tgatcacagc caatccagtg 180
gtgaccaaga aggaggagcc tgtcaacatt gaggctgaac ctccttttgg agaaagtaac 240
atagtaattg gaattggaga caaagccctg aaaatcaact ggtataagaa a 291
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<212> DNA
<213> Dengue virus
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accaacatag agttagaacc cccctttggg gacagctaca tagtgatagg cgttggaaac 240
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<213> Dengue virus
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Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Ala
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Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys
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Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr
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Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys
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Lys
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<213> Dengue virus
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Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys
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Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu
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Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe
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Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys
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Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly
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Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val
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<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV1-EDIII_epitope
<400> 22
Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV2-EDIII_epitope
<400> 23
Glu Gly Asp Gly Ser Pro
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV2-EDIII_epitope
<400> 24
Thr Glu Lys Asp Arg Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly
1 5 10 15
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV3-EDIII_epitope
<400> 25
Lys Gly Glu Asp Ala Pro
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV3-EDIII_epitope
<400> 26
Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro
1 5 10 15
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV4-EDIII_epitope
<400> 27
Glu Gly Ala Gly Ala Pro
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DV4-EDIII_epitope
<400> 28
Glu Pro Pro Phe Gly
1 5
Claims (6)
- 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 뎅기 바이러스 혈청형 1의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 뎅기 바이러스 혈청형 3의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료 내의 IgM을 검출하는 것을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 키트는 ELISA인 것을 특징으로 하는 키트.
- 뎅기 바이러스 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 뎅기 바이러스 혈청형 1의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 펩타이드 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 뎅기 바이러스 혈청형 3의 외막 단백질 도메인 Ⅲ 유래의 펩타이드와 반응시키는 단계를 포함하는, 뎅기 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190017689A KR102169928B1 (ko) | 2019-02-15 | 2019-02-15 | 뎅기 바이러스 외막 단백질 도메인 ⅲ 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 감염증의 조기 진단용 조성물 및 이의 용도 |
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| EP2980099A1 (en) | 2014-07-31 | 2016-02-03 | Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin | Compositions and methods for detecting flaviviridae infections |
| KR101763745B1 (ko) | 2016-01-08 | 2017-08-01 | 전북대학교산학협력단 | 뎅기 바이러스 4가지 혈청형의 외막 도메인 ⅲ에 대한 단일클론 항체 및 이의 용도 |
-
2019
- 2019-02-15 KR KR1020190017689A patent/KR102169928B1/ko active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101308138A (zh) * | 2007-05-15 | 2008-11-19 | 广东省疾病预防控制中心 | 登革病毒IgM抗体酶联免疫诊断试剂盒 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WHO Report (2009), Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, pp 1-47. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200099732A (ko) | 2020-08-25 |
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