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KR101801506B1 - ＡｃｔＲⅡＢ로부터 유도된 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

ＡｃｔＲⅡＢ로부터 유도된 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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KR101801506B1
KR101801506B1 KR1020167028978A KR20167028978A KR101801506B1 KR 101801506 B1 KR101801506 B1 KR 101801506B1 KR 1020167028978 A KR1020167028978 A KR 1020167028978A KR 20167028978 A KR20167028978 A KR 20167028978A KR 101801506 B1 KR101801506 B1 KR 101801506B1
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존 크노프
라빈드라 쿠마르
자스비아 시헤라
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악셀레론 파마 인코포레이티드
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Abstract

특정 측면에서, 본 발명은 골, 연골, 근육, 지방 및/또는 신경 조직과 같은 조직의 생장을 조절(촉진 또는 저해)시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또는 ActRⅡB 단백질 및/또는 ActRⅡB 리간드의 활성을 조절하는 화합물을 스크리닝하는 방법도 제공한다. 여기에 제공된 방법 및 조성물은 ActRⅡB 단백질 및/또는 ActRⅡB 리간드의 비정상적 활성과 연관된 질환 치료에 유용하다.

Description

ＡｃｔＲⅡＢ로부터 유도된 변이체 및 이의 용도{VARIANTS DERIVED FROM ACTRIIB AND USES THEREFOR}
관련된 출원
본 출원은 2007년 2월 2일 제출된 U.S. 가출원 No. 60/899,304; 2007년 5월1일에 제출된 U.S. 가출원 No.60/927,088; 2007년 5월 25일에 제출된 U.S. 가출원 No.60/931,880에 우선권을 주장하는데, 상기 출원은 본 명세서에 순전히 참조로서 편입된다.
전환 성장 인자(transforming growth factor)-베타(TGF-beta) 대과(superfamily)는 공통의 서열 요소(sequence element)와 구조 모티프(structural motif)를 공유하는 다양한 성장 인자를 포함한다. 이들 단백질은 척추동물과 무척추동물 모두에서 다양한 세포 유형에 대한 생물학적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 대과의 구성원은 배 발생(embryonic development) 동안 패턴 형성(pattern formation)과 조직 특정화(tissue specification)에서 중요한 기능을 수행하고, 지방생성(adipogenesis), 근육발생(myogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 심형성(cardiogenesis), 혈액생성(hematopoiesis), 신경생성(neurogenesis), 그리고 상피 세포 분화(differentiation)를 비롯한 다양한 분화 과정(differentiation process)에 영향을 줄 수 있다. 이러한 집단은 2가지 분과: BMP/GDF와 TGF-베타/액티빈/BMP10 분과로 분류되는데, 이들의 구성원은 다양하고, 종종 상보적인 효과를 나타낸다. TGF-베타 과의 구성원의 활성을 조종함으로써, 생물체 내에서 현저한 생리학적 변화를 유도하는 것이 종종 가능하다. 가령, 산록(piedmont)과 벨기에 블루 소(Belgian Blue cattle) 품종은 GDF8(일명, 미오스타틴(myostatin)) 유전자에서 기능 상실 돌연변이(loss-of-function mutation)를 보유하는데, 이는 근육량(muscle mass)에서 눈에 띄는 증가를 유도한다(Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4). 더 나아가, 인간에서, GDF8의 비활성 대립형질(allele)은 증가된 근육량과 보고된 바에 의하면, 특별한 체력(exceptional strength)에 연관된다(Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8).
적절한 TGF-베타과 구성원에 의해 중개되는 항진 또는 길항 시그날에 의해 근육, 뼈, 연골 및 다른 조직에 변화를 초래할 수 있다.
따라서, TGF-베타 시그날링의 가망 조절물질로써 기능을 하는 물질들이 요구된다.
발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 ActRⅡB 폴리펩티드, 특히 아미노 및 카르복시 말단 절두(truncations) 및 서열 교체(sequence alterations)를 포함한 ActRⅡB 변이체를 제공한다.
이와 같은 ActRⅡB 폴리펩티드는 다양한 질환 또는 이상, 특히 근육 및 신경근 질환(예를 들면, 근이영양증(muscular dystrophy), 근위축성측색경화증(ALS), 및 근위축), 지방 조직 질환(예를 들면, 비만), 대사질환(예를 들면, 타입 II 당뇨병), 신경퇴행성 질환 및 노화로 인한 근감소(근육감소증), 전립선 암 치료 및 암 악액질의 치료에 유용할 것이다. 특정 구체예에서, ActRⅡB 폴리펩티드(예를 들면, 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드)는 ActRⅡB 활성과 연관된 임의 공정에서 ActRⅡB 수용체를 길항할 수 있다. 선택적으로 본 발명의 ActRⅡB 폴리펩티드는 ActRⅡB 수용체의 하나 또는 그 이상의 리간드 예를 들면, GDF8 (미오스타틴이라고도 함), GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 노달(Nodal), BMP7 (OP-1이라고도 함)을 선호적으로 길항하도록 디자인할 수도 있어, 질환 치료에 추가적으로 유용할 수도 있다. ActRIIB 폴리펩티드에는 자연 생성 ActRIIB 폴리펩티드 뿐만아니라 이의 기능적 변이체들도 포함된다. 본 내용에서는 GDF11에 결합되면서 액티빈에 대한 활성이 상당히 감소된 ActRⅡB으로부터 유도된 일련의 변이체들을 제공한다. 이들 변이체들은 근육에서는 원하는 효과를 발휘하지만 다른 조직에서는 감소된 효과를 가진다.
특정 측면에서, 본 발명은 GDF8, GDFl 1, 액티빈, BMP7 또는 노달과 같은 ActRⅡB 리간드에 결합하는 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드와 약리학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 제약학적 조합제(pharmaceutical preparation)를 제공한다. 선택적으로, 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드는 10 마이크로몰(micromolar) 미만 또는 1 마이크로몰 미만, 100 나노몰(nanomolar), 10 나노몰 또는 1 나노몰의 KD로 액티빈리간드에 결합한다. 선택적으로 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRⅡB 리간드에 의해 촉발되는 세포내 시그날 변환 사건들과 같은 ActRⅡB 시그날링을 저해한다. 여기에서는 이와 같은 조합제에 사용할 수 있는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드가 여기에서 개진된 것들중 하나일 수 있는데, 예를 들면, SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 12에서 선택된 아미노산을 가지는 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 12에서 선택된 아미노산 서열에 최소 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 상동성인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 된다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에는 자연 ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 단편이 포함될 수 있는데, 예를 들면, SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 6, 12에서 선택된 최소 10개, 20개 또는 30개 아미노산 서열 또는 C-말단 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개 또는 15개 아미노산 및 N-말단에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 아미노산이 부족한 SEQ ID NO: 1의 아미노산을 포함할 수 있다. 적절한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 N-말단에 2 내지 5개 아미노산과 C-말단에 3개 정도의 절두를 포함할 수 있다. 또 다른 적절한 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12로 나타낸다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에는 자연 발생 ActRⅡB 폴리펩티드에 대해 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 변화(예를 들면 리간드-결합 도메인에서)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 아미노산 서열에 변화는 포유류, 곤충 또는 다른 진핵 세포에서 생성될 때 폴리펩티드의 글리코실화를 변화시키거나 또는 자연 생성 ActRⅡB 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드의 단백질 가수분해 절단을 변경시킬 수도 있다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 한 도메인으로써 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들면, ActRⅡB의 리간드-결합 도메인 또는 이의 변이체)를, 그리고 개선된 약동학, 더 손쉬운 정제, 특정 조직으로의 표적화 등 바람직한 성질을 제공할 수 있는 하나 또는 그 이상의 추가 도메인을 가지는 융합단백질이다. 가령, 융합 단백질의 도메인은 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡입/투여, 조직 국지화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 융합 단백질의 다중화(multimerization) 및/또는 정제 중에서 1가지 이상을 향상시킬 수 있다. 가용성 ActRⅡB 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인(야생형(wildtype) 또는 변이형(mutant)), 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, ActRII-Fc 융합체는 Fc 도메인과 세포외(extracellular) ActRII 도메인 사이에 배치된 상대적으로 체계화되지 않은(unstructured) 링커(linker)를 포함한다. 이러한 체계화되지 않은 링커는 ActRII의 세포외 도메인의 C-말단 단부(“꼬리”)에서 대략 15개의 아미노산 체계화되지 않은 영역에 상응하거나, 또는 이차 구조가 상대적으로 없는 5개 내지 15개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 길이의 아미노산으로된 인공 서열(artificial sequence)일 수 있다. 링커는 글리신(glycine)과 프롤린(proline) 잔기가 풍부하고, 예로써, 트레오닌/세린과 글리신의 단일 서열(single 서열) 또는 트레오닌/세린과 글리신의 반복 서열(repeating sequence)(가령, TG4(SEQ ID NO:22) 또는 SG4(SEQ ID NO:23) 반복)을 보유할 수 있다. 융합 단백질은 정제 하위서열(purification subsequence), 예를 들면, 에피토프 태그(epitope tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열(polyhistidine sequence), 그리고 GST 융합을 포함할 수 있다. 임의적으로, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에는 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 지질 모이어티(lipid moiety)에 공동된 아미노산, 그리고 유기 유도체화제(organic derivatizing agent)에 공동된 아미노산에서 선택되는 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기가 포함된다. 제약학적 조합제는 또한, 하나 이상의 추가 화합물, 예를 들면, ActRⅡB-연관 질환을 치료하는데 이용되는 화합물을 포함할 수 있다. 적절하게는, 제약학적 조합제는 실질적으로, 발열원(pyrogen)이 없다. 일반적으로, ActRIIB 단백질은 환자에서 부정적인 면역 반응(immune response)의 가능성을 낮추기 위하여 ActRIIB 단백질의 자연적인 글리코실화를 적절하게 매개하는 포유동물 세포주(mammalian cell line)에서 발현시키는 것이 바람직하다. 인간과 CHO 세포주(cell line)가 성공적으로 이용되고 있고, 다른 통상적인 포유동물 발현 시스템(expression system)이 유용할 것으로 기대된다.
한 측면에서, 인체에서 조직의 생장을 촉진시키거나 조직의 손실을 감소 또는 예방하는데 이용될 수 있는 여기에서 설명된 약학적 조합제를 포함하는 포장된 약학물질을 제공한다. 예시적인 조직에는 뼈, 연골, 근육, 지방, 신경 조직이 포함된다. 한 측면에서, 본 내용에서는 변형된 리간드-결합 (예를 들면, GDF8-결합) 도메인을 포함하는 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드를 제공한다. 이와 같은 ActRIIB 수용체의 변형된 리간드-결합 도메인은 사람의 ActRⅡB의 아미노산 잔기 예를 들면, E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 및 FlOl에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다(번호는 SEQ ED NO:2에 관계한다). 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인는 ActRⅡB 수용체의 야생형 리간드- 결합 도메인에 대해 GDF8/GDF11와 같은 리간드에 대한 선택성을 증가시킬 수 있다. 설명을 위하여, 이들 돌연변이는 액티빈(ActRIIB에 대해 제시된): K74Y, K74F, K74I 및 D80I에 대해 GDF11(따라서 아마도 GDF8)의 변형된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시키는 것으로 설명된다. 다음 돌연변이는 GDFl1: D54A, K55A, L79A 및 F82A에서 액티빈 결합 비율을 증가시키는 역효과를 가진다. 전반적인 (GDFl1 및 액티빈) 결합 활성은 “꼬리” 부분 또는 아마도, 체계화되지 않은 링커 부분 포함 및 K74A 돌연변이의 이용으로 증가될 수도 있다. 리간드 결합 친화력의 전반적 증가의 원인이 되는 다른 돌연변이에는 R40A, E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M 및 D80N가 포함된다. 원하는 효과를 얻기 위해 돌연변이를 복합시킬 수도 있다. 예를 들면, GDF11:액티빈 비율에 영향을 주는 많은 돌연변이는 리간드 결합에 전반적으로 네가티브 효과를 가지기 때문에, 따라서 리간드 선택성을 가진 개량된 결합 단백질을 만들기 위해 리간드 결합을 일반적으로 증가시키는 돌연변이와 복합될 수 있다.
선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 GDF8 결합에 대한 Kd에 대한 액티빈 결합에 대한 Kd 비율이 야생형 리간드-결합 도메인의 비율에 비교하여 최소 2배, 5배, 10배 또는 100배이상이다. 선택적으로, 야생형 리간드-결합 도메인의 비율에 비교하여, 변형된 리간드-결합 도메인은 GDF8/11을 저해하는 IC50에 대한 액티빈을 저해하는 IC50의 비율이 최소 2배, 5배, 10배 또는 100배이상이다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 액티빈을 저해하는 IC50보다 최소 2배, 5배, 10배 또는 100배 적은 IC50으로 GDF8/GDF11을 저해한다. 이와 같은 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 면역이뮤노글로블린 Fc 도메인 (야생형 또는 돌연변이형)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 특정 경우에, 본 발명의 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 GDF8/GDF11의 길항물질(저해물질)이다. 다음과 같이 다른 ActRIIB 변이체를 고려할 수도 있다. ActRIIB 변이체 융합 단백질은 SEQ ID NO:2의 ActRⅡB 서열에서 유도된 부분과, 제2폴리펩티드 부분을 포함하는데 이때, ActRIIB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-29중 임의에서 시작되고(선택적으로 SEQ ID NO:2의 22-25에서 시작하는), SEQ ID NO:2의 아미노산 109-134에서 종료되는 서열에 상응하며, ActRIIB 융합 단백질은 세포계 검사에서 액티빈, 미오스타틴 및/또는 GDFl1에 의한 시그날링을 저해한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-29중 임의에서 시작되고(선택적으로 SEQ ID NO:2의 22-25에서 시작하는), SEQ ID NO:2의 아미노산 109-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-24중 임의에서 시작되고(선택적으로 SEQ ID NO:2의 22-25에서 시작하는), SEQ ID NO:2의 아미노산 109-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-24중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 109-134에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-24중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 118-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-24중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 118-134에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-24중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 128-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-24중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 128-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-29중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 118-134에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-29중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 118-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 21-29중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 128-134에서 종료되는 서열에 상응한다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질, 이때 ActRⅡB에서 유도된 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-29중 임의에서 시작되고, SEQ ID NO:2의 아미노산 128-133에서 종료되는 서열에 상응한다. 놀랍게도, SEQ ID NO:2의 22-25에서 시작하는 구조는 사람 ActRⅡB의 온전한 세포외 도메인을 가지는 단백질보다 활성 수준이 더 크다. 상기 변이체 ActRⅡB 융합 단백질 어느 것이나 호모다이머(homodimer)로 만들어 질 수 있다. 상기 ActRIIB 융합단백질은 Fc 도메인와 같은 IgG 중쇄의 항상성 부분을 포함하는 이형 부분을 가질 수도 있다.
다음과 같이 다른 ActRIIB 변이체 단백질들을 고려한다. SEQ ID NO: 2의 아미노산 29-109의 서열에 최소 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 SEQ ID NO:2의 64에 상응하는 위치는 R 또는 K이며, ActRIIB 변이체 단백질은 세포계 검사에서 액티빈, 미오스타틴 및/또는 GDF11에 의해 시그날링을 저해한다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 SEQ ID NO:2 의 서열에 대해 최소 하나의 변이(alteration)는 리간드 결합 포켓의 외부에 위치한다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 SEQ ID NO:2 의 서열에 대해 최소 하나의 변이는 리간드 결합 포켓내에 위치한 보존성 변이(conservative alteration)이다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 SEQ ID NO:2 의 서열에 대해 최소 하나의 변이는 K74, R40, Q53, K55, F82, L79에서 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에 변이다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 단백질은 ActRⅡB의 내생 N-X-S/T 서열이 아닌 위치와, 리간드 결합 포켓 바깥 위치에 최소 한 가지 N-X-S/T 서열을 포함한다.
다음과 같은 다른 ActRIIB 변이체 단백질들을 고려한다.
ActRIIB 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 29-109의 아미노산 서열에 최소 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 이 단백질은 ActRⅡB의 내생 N-X-S/T 서열이 아닌 위치와, 리간드 결합 포켓 바깥 위치에 최소 한 가지 N-X-S/T 서열을 포함한다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 단백질은 SEQ ED NO:2의 위치 24에 상응하는 위치에 N이며, SEQ ID NO:2의 위치 26에 상응하는 위치에 S 또는 T가 되며, ActRIIB 변이체 단백질은 세포계 검사에서 액티빈, 미오스타틴 및/또는 GDFl1에 의해 시그날링을 저해한다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, SEQ ID NO:2의 위치 64에 상응하는 위치에 R 또는 K가 된다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, SEQ ID NO:2의 서열에 최소 한 가지 변이는 리간드 결합 포켓내에 위치한 보존성 변이다. 변이체 ActRⅡB 단백질, 이때 SEQ ID NO:2의 서열에 대해 최소 한 가지 변이는 K74, R40, Q53, K55, F82, L79에서 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에 변이다. 상기 ActRIIB 변이체 단백질, 이때 단백질은 이형 부분을 추가 포함하는 융합 단백질이다. 상기 ActRIIB 변이체 융합 단백질중 임의 것은 호모다이머로 만들어질 수 있다. 상기 ActRIIB 융합단백질은 Fc 도메인와 같은 IgG 중쇄의 항상성 부분을 포함하는 이형(heterologous) 부분을 가질 수도 있다.
특정 측면에서, 본 발명에서는 완전한 ActRⅡB 폴리펩티드를 인코드하지 않는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제시한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 앞서 기술된 바와 같이, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 가령, 분리된 핵산은 ActRIIB의 세포외 도메인(가령, 리간드-결합 도메인)을 코딩하는 서열과 ActRIIB의 막통과 도메인 및/또는 세포질 도메인의 일부 또는 전부를 코딩하지만 막통과 도메인 또는 세포질 도메인 내에 배치된, 또는 세포외 도메인과 막통과 도메인 또는 세포질 도메인 사이에 배치된 종결 코돈(stop codon)을 코딩하지 않는 서열을 보유할 수 있다. 가령, 분리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4 또는 부분적으로 절두된 형태와 같은 전장 ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 번역이 전장 ActRII의 절두된 일부분에 임의적으로 융합된 세포외 도메인을 발생시키기 위하여, 3'-말단 앞에 또는 달리 배치된 최소한 600개 뉴클레오티드(nucleotide)의 전사 종결 코돈(transcription termination codon)을 더욱 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 핵산은 발현을 위한 프로모터(promoter)에 작동가능하게 연결될 수 있고, 본 발명에서는 이런 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 제시한다. 적절하게는, 상기 세포는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이다.
특정 측면에서, 본 발명에서는 가용성, ActRⅡB 폴리펩티드를 만드는 방법을 제시한다. 이런 방법에는 적절한 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서 본 명세서에 개시된 임의의 핵산(가령, SEQ ID NO: 3)을 발현시키는 것이 포함될 수 있다. 이런 방법은 a) 가용성 ActRII 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고, 여기서 상기 세포는 가용성 ActRII 발현 구조체로 형질전환되고; b) 이렇게 발현된 가용성 ActRII 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 가용성 ActRII 폴리펩티드는 세포 배양물로부터 단백질을 수득하는 공지의 임의 기술을 이용하여 정제되지 않은, 부분적으로 정제된 또는 고도로 정제된 분취물(fraction)로서 회수될 수 있다.
특정 측면에서, 여기에 개시된 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드는 근손실 또는 불충분한 근육 생장과 연관된 질환을 가진 개체를 치료하는 방법에 이용될 수 있다. 이와 같은 질환에는 근이영양증, 근 위축증, 근위축성측색경화증(ALS), 및 근 소모성 질환(예를 들면, 악액질, 식욕감퇴, DMD 증후군, BMD 증후근, AIDS 소모성 증후군, 근위축증, 신경근 질환, 운동 신경 질환, 신경근연접 질환, 염증성 근육병증)이 포함된다. 이 방법은 효과량의 가용성 ActRUB 폴리펩티드를 필요로 하는 개체에 투여하는 것으로 구성된다.
특정 측면에서, 여기에서 개시하는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 신체 지방 함량을 감소시키거나 또는 신체 지방 함량의 증가 비율을 감소시키는 방법, 원하지 않는 체증 증가와 연관된 질환, 예를 들면, 비만과 관련된 질환, 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM), 심혈관 질환, 암, 고혈압, 골관절염, 발작, 호흡기 문제, 담낭질환을 치료하는 방법에 이용될 수도 있다. 이들 방법에는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 효과량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것이 포함될 수 있다. 특정 측면에서, 여기에서 개시하는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 GDF8의 비정상적 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법에 이용될 수 있다. 이와 같은 질환에는 타입 2 당뇨병, 내당능장애(impaired glucose tolerance), 대사증후군(예를 들면, 증후군X), 및 외상(예를 들면, 화상 또는 질소 불균형)에 의해 유도된 인슐린 저항성과 같은 대사성 질환; 지방 조직 질환(예를 들면, 비만); 근위축증(Duchenne 근육 위축증 포함); 근위축성측색경화증(ALS); 근육 위축; 기관 위축; 약함(frailty); 손저림증후군(carpal tunnel syndrome); 울혈성 폐색성 폐질환(congestive obstructive pulmonary disease); 근육감소증, 악액질 및 다른 근육 소모성 증후군; 골다공증; 글루코코르티코이드-유도된 골다공증; 골감약증(osteopenia); 골관절염(osteoarthritis); 골다공증-연관 골절; 만성 글루코코르티코이드 요법으로 인한 낮은 골량; 미숙 생식선 부전증(premature gonadal failure), 안드로겐 억제, 비타민 D 결핍, 2차 부갑상샘기능항진증, 영양 결핍 및 신경성 식욕부진 등이 포함된다. 상기 방법에는 효과량의 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것이 포함될 수도 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 뼈, 연골, 근육 및 지방의 생장을 촉진시키는 물질을 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드와 경쟁적으로 ActRIIB 폴리펩티드의 리간드-결합 도메인에 결합하는 테스트 물질을 확인하고; 그리고 조직의 생장에서 이 물질의 효과를 평가하는 것으로 구성된다.
특정 측면에서, 본 발명은 세포에서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB 리간드 (예를 들면, GDF8, GDFl 1, 액티빈, BMP7, Nodal)의 활성을 길항하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 가용성 ActRIIB 폴리펩티드와 접촉시키는 것으로 구성된다. 선택적으로, ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB 리간드의 활성은 ActRIIB/ ActRIIB 리간드 복합체에 의해 매개되는 시그날링 변환으로 모니터되는데 예를 들면, 세포 증식을 모니터한다. 방법에서 세포는 뼈형성세포(osteoblast), 연골세포, 근세포(myocyte), 지방세포(adipocyte) 및 근육 세포가 포함된다.
특정 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명하는 질환 또는 이상의 치료를 위한 약물을 제조하는데 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 이용한다.
도 1은 사람 ActRIIB 가용성 (세포외) 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO: 1)을 나타낸다. C-말단 "꼬리"는 밑줄로 표시하였다.
도 2에서는 사람 ActRIIB 전구(precursor) 단백질 서열 (SEQ ID NO: 2)을 나타낸다. 시그날 펩티드를 밑줄로 표시하였다; 세포외 도메인은 굵은 부분내에 있다 (SEQ ID NO: 1 참고); 그리고 가망 N-연결된 글리코실화 부위는 박스로 표시하였다.
도 3에서는 사람 ActRIIB 가용성 (세포외) 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열, SEQ ID NO: 3을 나타낸다.
도 4는 사람 ActRIIB 전구 단백질을 인코드하는 핵산 서열, SEQ ID NO: 4를 나타낸다.
도 5는 비이클(◆), ActRIIB(R64 20-134)-mFc (■) 또는 반감기가 긴 형태, ActRIIB(R64 A24N 20- 134)(▲)로 처리된 생쥐에서 체중 증가를 보여준다.
도 6에서는 연구 종료시에 절단된 근육의 무게를 나타낸다. 비이클 각 그룹의 좌측 컬럼(밝은 음영); ActRIIB(R64 20-134)-mFc: 각 그룹의 중간 컬럼(중간 음영); ActRIIB(R64 A24N 20-134): 각 그룹의 우측 컬럼(짙은 음영).
도 7에서는 PBS 및 뮤린 ActRIIB (R64 K74A 20-134)-mFc (또는 "K74A+15 꼬리") 처리된 SOD 생쥐 (각각 흰색 막대 및 검정색 막대)에 대한 악력(grip strength) 측정을 나타낸 것이다. 도면에서 질병의 초기(117일) 및 후기(149일)에서 PBS 군과 비교하여 뮤린 ActRIIB (R64 K74A 20-134)-mFc 군의 강도 증가를 설명한다. * P<O.05, 양쪽 꼬리 검증 Student's t-test.
도 8에서는 PBS와 ActRIIB (R64 K74A 20-134)-mFc 처리된 SOD 생쥐(각각 흰색 막대 및 검정색 막대)의 Kaplan-Meier 생존 비교를 나타낸다. ActRIIB (R64 K74A 20-134)-mFc-처리된 군은 PBS 처리군보다 평균 생존 일수가 증가되었다.
도 9는 PBS 및ActRIIB(R64 20- 134)-mFc HFD-공급된 생쥐(각각 흰색 막대 및 검정색 막대)에서 신체 조성 변화 비율을 보여준다. 뮤린 ActRIIB(R64 20-134)-Fc 단백질으로 처리하면 지방량이 상당히 감소하며, 마른 조직이 증가되었다.
도 10에서는 늙은 쥐(A) 또는 ActRIIB(R64 20-134)-mFc (B) 처리된 늙은 쥐의 대퇴직근(4X 확대)의 근 단면을 보여준다.
도 11에서는 CT26 결장 암 세포를 이용한 암 악액질 실험에서 생쥐의 평균 체중을 나타낸다. ◆: 종양이 없는 염 처리된 동물; ■; 종양이 없는 ActRIIB(R64 20-134)-mFc 처리된 동물: "x": 종양이 있는, ActRIIB(R64 20-134)-mFc 처리된 생쥐(10mg/kg); "*": 종양이 있는, ActRIIB(R64 20-134)-mFc 처리된 생쥐(30mg/kg); ●: 종양이 있는, ActRIIB(R64 20-134)-mFc 처리된 생쥐(lOmg/kg), 예방적 차원(preventative modality)에서 종양 이식 시기에 치료를 시작한다.
도 12에서는 리간드 (리간드 결합 포켓-박스로 표시됨)에 바로 접촉시키기 위해 다중 ActRⅡB 및 ActRⅡA 결정 구조의 조성 분석에 근거하여 여기에서 유추된 잔기를 가진 사람 ActRIIA 및 ActRIIB의 배열을 나타낸다.
도 13에서는 다양한 척추동물의 ActRIIB 단백질 및 사람 ActRIIA의 다중 서열 배열을 나타낸다.
본 명세서에 이용되는 용어는 일반적으로, 본 발명의 배경 내에서 각 용어가 이용되는 특정 상황에서, 당분야의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물과 방법, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법을 기술함에 있어 실시자(practitioner)에게 부가적인 보도(guidance)를 제공하기 위하여 하기에, 또는 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 이용되는 용어의 범위 또는 의미는 이러한 용어가 이용되는 특정 상황으로부터 명백할 것이다.
일반적으로, “대략”은 측정의 특성 또는 정확도를 고려할 때, 측정된 양에 대한 허용 오차(acceptable degree of error)를 의미한다. 전형적으로, 예시적인 허용 오차는 일정한 수치 또는 수치 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 특히, 10% 이내, 더욱 바람직하게는, 5% 이내로 존재한다.
대안으로, 특히, 생물학적 시스템에서, “대략”은 일정한 수치의 1 크기 자릿수(order of magnitude) 이내, 바람직하게는, 5-배 이내, 더욱 바람직하게는, 2-배 이내의 수치를 의미한다. 본 명세서에 제공된 수치량(numerical quantity)은 달리 명시되지 않는 경우에 근사치(approximate)인데, 이는 “대략”이 명시되지 않는 경우에, 추론될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 방법은 서열을 서로 비교하는 단계, 예를 들면, 야생형 서열을 하나 이상의 돌연변이체(서열 변이체)와 비교하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 이런 비교는 예로써, 당분야에 널리 공지된 서열 정렬 프로그램 및/또는 알고리즘(가령, BLAST, FASTA와 MEGALIGN)을 이용한 고분자 서열의 정렬을 포함한다. 당업자는 이런 정렬에서, 돌연변이가 잔기 삽입 또는 결실을 내포하는 경우에, 서열 정렬이 삽입되거나 결실된 잔기를 보유하지 않는 고분자 서열 내에 “갭(gap)”(전형적으로, 대시(dash), 또는 "A"로 표시됨)을 도입할 것임을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.
“상동한(homologous)”은 모든 문법적 형태와 변화된 스펠링에서, 동일한 종의 생물체에서 대과로부터 단백질과 상이한 종의 생물체로부터 상동한 단백질을 비롯한, “공통의 진화적 기원(common evolutionary origin)”을 공유하는 두 단백질 사이의 상관관계를 지칭한다. 이들 단백질(또는 이들의 인코딩 핵산)은 동일성 비율(percent identity)의 관점에서 또는 특정 잔기 또는 모티프와 보존된 위치의 존재에 의해, 그들의 서열 유사성(sequence similarity)에 의해 반영되는 서열 상동성(sequence homology)을 갖는다.
“서열 유사성”은 모든 문법적 형태에서, 공통의 진화적 기원을 공유하거나 공유하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 또는 일치성의 정도를 지칭한다.
하지만, 통상적인 관례와 본 출원에서, “고도로”와 같은 부사로 수식될 때 “상동한”은 서열 유사성을 지칭하고, 공통의 진화적 기원에 관련되거나 관련되지 않는다.
2. ActRIIB 폴리펩티드
특정 측면에서, 본 발명은 ActRIIB 변이체 폴리펩티드 (예를 들면, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)에 관계한다. 선택적으로, 단편, 기능적 변이체, 및 변형된 형태는 이에 상응하는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 가진다. 예를 들면, 본 발명의 ActRIIB 변이체는 ActRIIB 리간드 (예를 들면, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, Nodal, GDF8, GDFl1 또는 BMP7)에 결합하고, 이의 기능을 방해할 수 있다. 선택적으로, ActRIIB 폴리펩티드는 골, 연골, 근육 또는 지방과 같은 조직의 생장을 조절한다. ActRIIB 폴리펩티드의 예로는 사람 ActRIIB 전구 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 2), 그리고 가용성 사람 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들면, SEQ ID NOs: 1, 5, 6, 12)가 포함된다.
명세서에서는 ActRⅡB의 기능적 활성 부분과 변이체를 동정한다. 출원인은 Hilden et al. (Blood. 1994 Apr 15;83(8):2163-70)에서 개재한 서열을 가지고, SEQ ID NO: 2 (A64)의 아미노산 64에 상응하는 위치에 알라닌을 가지는 Fc 융합 단백질은 액티빈 및GDF-11에 상대적으로 낮은 친화력을 가진다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 아미노산 64(R64)에 아르기닌을 가진 동일한 Fc 융합 단백질은 액티빈 및 GDF-11에 대한 낮은 나노몰에서 높은 피크몰 범위의 친화력을 가진다. 따라서, R64를 가진 서열은 본 명세서에서 사람 ActRIIB에 대한 야생형 기준 서열로 이용된다.
Attisano et al. (Cell. 1992 Jan 10;68(l):97-108)는 ActRⅡB의 세포외 도메인의 C-말단에 프롤린 노트의 결손으로 액티빈에 대한 친화력이 감소되었음을 보여주었다. 여기에서 제공된 데이터에서 SEQ ID NO:2의 아미노산 20-119를 보유하는 ActRⅡB-Fc 융합 단백질인, "ActRHB(20-l19)-Fc"은 프롤린 노트 지역과 완벽한 영역주변(juxtamembrane) 도메인을 포함하는 ActRHB(20-134)-Fc에 비교하여, GDF11 및 액티빈에 대한 결합이 감소되었다는 것을 보여준다. 그러나, ActRIIB(20-129)-Fc 단백질은 비록 프롤린 노트 지역이 파괴되었지만 야생형과 어느 정도 유사하나 다소 감소된 활성을 보유한다. 따라서, 아미노산 134, 133, 132, 131, 130, 129에서 중단되는 ActRIIB 세포외 도메인들은 모두 활성이 있는 것으로 기대되나, 아미노산 134 또는 133에서 중단되는 도메인들은 대부분 활성이 있다. 유사하게, 잔기 129-134중 임의 것은 큰 여백(margin)으로 인하여 리간드 결합 친화력을 변경시키는 것으로 보이지는 않는다. 이를 뒷받침하는 것으로, P129 및 P130 돌연변이는 실질적으로 리간드 결합이 감소되지 않는다. 따라서, ActRⅡB-Fc 융합 단백질은 아미노산 109(최종 시스테인)과 같이 조기에 종료될 수 있지만, 아미노산 109와 119사이에 또는 109, 119에서 종료되는 형태는 리간드 결합이 감소될 것으로 기대된다. 아미노산 119는 보존성이 약하여 바로 변형되거나 절두된 것이다. 아미노산 128 또는 그 이후에 끝나는 형태는 리간드 결합 활성을 보유한다. 아미노산 119와 127사이에 또는 119, 127에서 종료되는 형태는 중간정도의 결합 능력을 가질 것이다. 이들형태중 어느 것이라도 임상적 또는 실험 세팅에 따라 바람직하게 이용될 수 있을 것이다.
ActRⅡB의 N-말단에서, 아미노산 29 또는 그 전에 시작하는 단백질은 리간드 결합 활성을 보유할 것으로 예상된다. 아미노산 29는 최소 시스테인을 나타낸다. 위치 24에서 알라닌이 아스파라긴으로의 돌연변이는 실질적인 리간드 결합에 영향을 주지 않고, N-연결된 글리코실화된 서열을 도입시킨다. 이는 아미노산 20-29에 상응하는 시그날 절단 펩티드와 시스테인 가교 부위사이에 돌연변이가 허용된다는 것으로 확인된다. 특히, 위치 20, 21, 22, 23, 24에서 시작하는 구조들은 활성을 보유할 것이며, 위치 25, 26, 27, 28, 29에서 시작하는 구조도 활성을 보유할 것으로 기대된다. 실시예에서 보여준 데이터에서는 놀랍게도 위치 22, 23, 24 또는 25에서 시작하는 구조가 최대 활성을 가질 것이라는 것을 설명한다.
이와 함께, ActRⅡB의 활성 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 29-109를 포함하며, 예를 들면, 아미노산 20-29에 상응하는 잔기에서 시작되고, 아미노산 109-134에 상응하는 위치에서 종료되는 구조들이다. 다른 예로는 위치 20-29 또는 21-29에서 시작하고, 위치 119-134, 119-133 또는 129-134에서 종료되는 구조들이 포함된다. 다른 예로는 위치 20-24 (또는 21-24, 또는 22-25)에서 시작되고, 위치 109-134 (또는 109-133), 119-134 (또는 119-133) 또는 129-134 (또는 129-133)에서 종료되는 구조들도 포함된다. 이 범주내에 변이체들, 특히, SEQ ID NO:4의 상응하는 부분에 최소 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가지는 것들도 고려할 수 있다. 도 13에서 나타낸 바와 같이, 명세서에서는 복합 ActRIIB 구조의 분석 결과를 포함하는데, 리간드 결합 포켓은 잔기 Y31, N33, N35, L38~T41, E47, E50, Q53~ K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78~N83, Y85, R87, A92, 그리고 E94~FlOl에 의해 한정된다. 이들 위치에서, 보존성 돌연변이도 허용되는 것으로 예상되나 R40A, K55A, F82A 및 위치 L79에서 돌연변이와 같이, K74A 돌연변이가 잘 허용된다. 개구리(Xenopus)에서 R40은 K이고, 이는 이 위치에 염기성 아미노산이 허용된다는 것을 나타낸다. 소의 ActRⅡB에서 Q53은 R이고, 개구리 ActRⅡB에서는 K이며, 따라서, 이 위치에서 R, K, Q, N 및 H을 포함하는 아미노산이 허용될 것이다. 따라서, 활성 ActRIIB 변이체 단백질의 일반적인 형태는 아미노산 29-109을 포함하나, 선택적으로 위치 20-24 또는 22-25에서 시작하고, 위치 129-134에서 종료되며, 리간드 결합 포켓에는 1개, 2개, 5개, 10개 또는 15개의 보존성 아미노산 변화를 포함하고, 리간드 결합 포켓에서 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0개 또는 하나 또는 그 이상의 비-보존성 변화도 포함한다. 이와 같은 단백질은 SEQ ID NO:4의 아미노산 29-109의 서열에 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 보유할 것이다. 결합 포켓 바깥 부위, 특히 가변성이 잘 허용되는 부위에는 세포외 도메인 (상기 언급한 바와 같은)의 아미노 및 카르복시 말단과 위치 42-46 및 65-73가 포함된다. 위치 65에 아스파라진이 알라닌으로 변화(N65A)는 실질적으로 A64 배경에서 리간드 결합을 개선시키고, 따라서 R64 배경에서는 리간드 결합에 결정적인 영향을 주지는 않을 것으로 기대된다. 이와 같은 변화는 A64 배경에서 N65에서 글리코실화를 대개는 제거하여, 이 부위에 상당한 변화는 용인되는 것으로 설명된다. R64A 변화는 거의 용인되지 않으며, R64K는 용인되어, H와 같은 또 다른 염기성 잔기는 위치 64에서 용인될 것이다.
ActRIIB는 거의 모든 척추동물에서 완벽하게 보존된 세포외 도메인 스트레취와 함께 잘 보존되어 있다. ActRⅡB에 결합하는 리간드에 대부분이 상당히 보존되어 있다. 따라서, 다양한 척추동물 유기체로부터 ActRⅡB 서열을 비교하여 변형될 잔기에 대한 식견을 제공한다. 따라서, 활성, 사람 ActRIIB 변이체에는 또 다른 척추동물 ActRIIB의 서열에 상응하는 위치들에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함하거나 사람 또는 다른 척추동물 서열에 것과 유사한 잔기가 포함될 수 있다. 다음의 예시들은 활성 ActRⅡB 변이체를 한정하는데 있어 이와 같은 방법을 설명한다. L46는 개구리 ActRⅡB에서 발린이고, 이 위치는 변형될 수 있으며, 선택적으로 또 다른 소수성 잔기 예를 들면, V, I 또는 F 잔기로 변형되거나 또는 A와 같은 비-극성 잔기로 변형될 수도 있다. 개구리에서 E52는 K인데, 이 위치는 다양한 변형을 용인할 수 있으며, 예를 들면, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y와 같은 극성 잔기와 A를 포함한다. 개구리에서 T93는 K이며, 이 위치에서 다양한 구조적 변이가 용인되는데, S, K, R, E, D, H, G, P, G 및 Y와 같은 극성 잔기를 선호한다. 개구리에서 F108은 Y이며, 따라서, Y 또는 I, V 또는 L과 같은 다른 소수성 기가 용인되어야 한다. 개구리에서 E111은 K이며, D, R, K 및 H 뿐만 아니라 Q와 N을 포함하는 하전된 잔기가 이 위치에서 용인될 것이라는 것을 나타낸다. 개구리에서 Rl12는 K이며, R과 H를 포함하는 염기성 잔기가 용인된다는 것을 나타낸다. 위치 119에 A는 보존이 잘 안되는 것으로 설치류에서는 P, 개구리에서는 V로 나타나고, 따라서, 기본적으로 임의 아미노산이 이 위치에서 용인되어야 한다.
본 명세서에서는 추가 N-연결된 글리코실화부위(N-X-S/T)를 추가하면 ActRⅡB-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 ActRIIB(R64)-Fc 형태에 비하여 증가된다는 것을 설명한다. 위치 24에 아스파라긴(A24N 구조)를 도입함으로써, NXT 서열이 만들어지고, 이것이 더 긴 반감기를 부여한다. 다른 NX(T/S) 서열들은 42-44 (NQS) 및65-67 (NSS)에서 볼 수 있지만, 후자의 경우는 위치 64에서 R로 효과적으로 글리코실화되지는 못할 것이다. N-X-S/T 서열은 도 12에서 제시된 리간드 결합 포켓의 바깥 위치에 일반적으로 도입될 수 있다. 특히 비-내생성 N-X-S/T 서열들의 도입을 위한 적절한 부위에는 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134가 포함된다. N-X-S/T 서열들은 ActRIEB 서열과 Fc 또는 다른 융합 성분사이에 링커내로 도입될 수도 있다. 이와 같은 부위는 기존의 S 또는 T에 대해 정확한 위치에 N을 도입하여 또는 기존 N에 상응하는 위치에 S 또는 T를 도입함으로써 최소한의 노력으로 도입될 수 있을 것이다. 따라서, N-연결된 글리코실화 부위를 만들기 위한 바람직한 변화는 A24N, R64N, S67N (N65A 변형과 복합도 가능), E106N, Rl 12N, G120N, E123N, P129N, A132N, Rl 12S 및 Rl12T가 포함된다. 글리코실화될 것으로 예상되는 임의 S는 글리코실화에 의해 제공되는 보호 때문에 면역원성 부위를 만들지 않고 T로 변형될 수 있다. 유사하게, 글리코실화될 것으로 예상되는 임의 T는 S로 변형될 수 있다. 따라서, 변이 S67T 및 S44T도 고려한다. 유사하게, A24N 변이체에서, S26T 변이도 이용할 수 있다. 따라서, ActRIIB 변이체에는 하나 또는 그 이상의 추가적인, 비-내생성 N-연결된 글리코실화 컨센선스 서열을 포함할 수 있다. 위치 L79은 변형된 액티빈 - 미오스타틴 (GDF-11) 결합 성질을 부여하기 위해 변형될 수도 있다. L79A 또는 L79P는 액티빈 결합이상으로 더 크게 GDF11 결합을 감소시킨다. L79E 또는 L79D는 GDF-11 결합을 유지한다. 놀라운 것은, L79E 및 L79D 변이체는 상당히 감소된 액티빈 결합을 가진다. In vivo 실험에서, 이와 같은 비-액티빈 수용체들은 상당한 활성을 보유하여 근육량을 증가시키나 다른 조직에서는 효과가 감소된 것으로 나타났다. 이들 데이터에서 액티빈에 감소된 효과를 가지는 폴리펩티드를 수득하는 바람직함(desirability)과 실행가능성(feasibility)을 설명한다.
여기에서 설명하는 변이는 다양한 방식으로 복합될 수 있다. 추가로, 여기에서 설명하는 돌연변이생성 프로그램 결과에서 ActRⅡb에서 보존하는 것이 유익한 아미노산 위치가 있다는 것을 나타낸다. 이들 위치에는 위치 64 (염기성 아미노산), 위치 80 (산성 또는 소수성 아미노산), 위치 78 (소수성, 특히 트립토판), 위치 37 (산성, 특히 아스파르트산 또는 글루타민산), 위치 56 (염기성 아미노산), 위치 60 (소수성 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 티로신)이 포함된다. 따라서, 여기에서 설명하는 각 변이체에서, 명세서는 보존될 수도 있는 아미노산 프레임워크를 제공한다. 보존되는 것이 바람직할 수 있는 다른 위치에는 다음의 것들이 포함된다: 위치 52 (산성 아미노산), 위치 55 (염기성 아미노산), 위치 81 (산성), 98 (극성 또는 하전된, 특히 E, D, R 또는 K).
특정 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드의 분리된 단편들은 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들면, SEQ ID NOs: 3 및 4)를 인코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 만들어진 폴리펩티드를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 이에 더하여, 단편은 전통적인 Merrifield 고형상(solid phase) f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이들 단편은 생산되고(재조합 방식으로 또는 화학적 합성에 의해),ActRII 단백질 또는 ActRⅡB 리간드의 길항물질(저해물질) 또는 항진물질(활성물질)로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편을 확인하기 위하여 검사될 수 있다.
특정 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 3, 4 또는 10에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 사례에서, 이러한 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 3, 4 또는 10에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 보유한다.
특정 구체예에서, 기능적 변이체는 치료 효능(therapeutic efficacy), 또는 안정성(가령, 체외 반감기(ex vivo shelf life)와 생체내에서 단백분해(proteolytic degradation)에 대한 내성)을 강화시키는 것과 같은 목적을 위하여 ActRII 폴리펩티드의 구조를 변형함으로써 산출될 수도 있다. 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 예로써, 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 생산될 수 있다. 가령, 이소루이신 또는 발린으로 루이신의 분리된 치환, 글루타민산염으로 아스파라진산염의 분리된 치환, 세린으로 트레오닌의 분리된 치환, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 치환(가령, 보존성 돌연변이)은 결과의 분자의 생물학적 활성에 주요한 효과를 나타내지 않을 것으로 예상하는 것은 합당하다. 보존성 치환은 측쇄에 관련된 아미노산 집단 내에서 발생하는 치환이다. ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 변화가 기능적 동족체(functional homolog)를 결과하는 지의 여부는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드에서와 유사한 방식으로 세포 내에서 반응을 유도하는지 또는 야생형과 유사한 방식으로 액티빈, GDF-11 또는 미오스타틴과 같은 하나 또는 그 이상의 리간드에 결합하는지에 대해 변이 ActRII 폴리펩티드의 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 변이체(또는 돌연변이체) ActRⅡB 폴리펩티드가 변형된 리간드 결합 활성(예를 들면, 결합 친화력 또는 결합 특이성)을 가지도록 ActRⅡB 폴리펩티드의 세포외 도메인(리간드-결합 도메인이라고도 함)에 돌연변이을 만드는 것도 고려한다. 특정 경우에, 이와 같은 ActRIIB 변이체폴리펩티드는 특정 리간드에 대해 변형된 (상승된 또는 감소된) 결합 친화력을 가진다. 다른 경우에, ActRIIB 변이체폴리펩티드는 이들 리간드에 변형된 결합 특이성을 가진다.
예를 들면, 명세서에서는 액티빈과 비교하여 GDF8/GDF11에 선호적으로 결합하는 변이체 ActRⅡB 폴리펩티드를 제공한다. 명세서에서는 또한 이와 같은 선택성 변이체가 심각한 질환 치료(치료효과를 위해 매우 상당한 양의 증가를 요하는 그리고 어느 정도의 오프-타겟 효과를 수용하는)에는 다소 덜 바람직할 수 있지만 오프-타겟 효과(off-target effect)를 감소시키는데 이와 같은 폴리펩티드의 바람직함을 설명한다. 예를 들면, ActRⅡB 단백질의 아미노산 잔기 예를 들면, E39, K55, Y60, K74, W78, D80, 및 FlOl는 리간드-결합 포켓 내에 있으며, 액티빈 및 GDF8와 같은 이들 리간드에 결합을 중개한다. 따라서, 본 발명은 아미노산 잔기에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 ActRⅡB 수용체의 변형된 리간드-결합 도메인 (예를 들면, GDF8- 결합 도메인)을 제공한다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 ActRⅡB 수용체의 야생형 리간드-결합 도메인에 대해 GDF8와 같은 리간드의 증가된 선택성을 가질 수 있다. 설명을 위해, 이들 돌연변이는 액티빈이상으로 GDF8의 변형된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시킨다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 GDF8 결합에 대한 Kd와 액티빈 결합에 대한 Kd 비율이 야생형 리간드-결합 도메인에 대한 비율과 비교하여 최소 2배, 5배, 10배 또는 100배 이상의 큰 값을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 GDF8을 저해하는 IC50에 대해 액티빈을 저해하는 IC50의 비율이 야생형 리간드-결합 도메인과 비교하여 최소 2배, 5배, 10배 또는 100배 이상의 큰 값을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 액티빈을 저해하는 IC50값보다 2배, 5배, 10배 또는 100배 이상 적은 값을 가진다.
특이적 예시로써, ActRⅡB의 리간드-결합 도메인의 양전하를 띈 아미노산 잔기 Asp (D80)는 변이체 ActRⅡB 폴리펩티드가 선호적으로 GDF8에 결합하지만 액티빈에는 결합하지 않도록 하는 상이한 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는 D80 잔기는 다음에서 선택된 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다: 전하를 띄지 않는 아미노산 잔기, 음전하 아미노산 잔기, 및 소수성 아미노산 잔기. 추가적인 특이적 예시로써, 소수성 잔기, L79는 산성 아미노산으로 변형될 수 있다. 아스파르트산 또는 글루타민산은 GDF11 결합은 유지하면서 액티빈 결합은 상당히 감소시킨다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 설명된 돌연변이, 변이체 또는 변형의 대부분은 햇산 수준에서 만들어질 수 있지만, 일부 경우에는 전사후 변형 또는 화학적 합성에 의해 만들어질 수도 있다. 이와 같은 기술은 당분야에 공지된 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 펩티드의 글리코실화반응을 변경시키기 위하여 ActRⅡB 폴리펩티드의 특이적 돌연변이를 고려할 수 있다. ActRⅡB 폴리펩티드에서 예시적인 글리코실화 부위는 도 2에서 설명하고 있다. O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화부위와 같은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하기 위해 이와 같은 돌연변이가 선택될 수도 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인지 부위는 적정 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인지되는 트리펩티드 서열, 아스파라진-X-트레오닌(이때 “X"는 임의 아미노산임)을 일반적으로 포함한다. 이와 같은 변형은 야생형 ActRIIB 폴리펩티드 (O-연결된 글리코실화 부위를 위한)의 서열로 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 추가 또는 치환으로 만들어질 수도 있다. 글리코실화 인지 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치중 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실로 인하여A variety of 아미노산(및/또는 제2위치에서 아미노산 결실) 변형된 트리펩티드 서열에 비-글리코실화를 결과한다. ActRⅡB 폴리펩티드상에 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 또 다른 수단은 ActRⅡB 폴리펩티드에 화학적 또는 효소적 결합(coupling)을 시키는 것이다. 이용되는 결합 방식에 따라, 당(sugar)이 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 자유 카르복실 기; (c) 시스테인에서 볼 수 있는 것과 같은 자유 SH 기; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프로린과 같은 것에서 볼 수 있는 자유 하이드록실 기; (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 결합될 수 있다. 이들 방법은 WO 87/05330 (Sep. 11, 1987 공개) 및 ApHn and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에서 설명되어 있으며, 이를 참고문헌으로 첨부한다. ActRIIB 폴리펩티드에 존재하는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 실시할 수 있다. 화학적 글리코실화 반응은 예를 들면, 화합물 트리플로오르메탄술폰산(trifluoromethanesulfonic acid) 또는 이의 등가 화합물에 ActRⅡB 폴리펩티드를 노출시키는 것과 관련될 수 있다. 이와 같은 처리로 인하여 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 슈가들이 절단되나 아미노산 서열은 고유하게 남아있다. 화학적 디글리코실화(deglycosylation)는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에서 설명된다. ActRⅡB 폴리펩티드상에 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에서 설명하는 것과 같이 다양한 엔도 및 엑소 글리코시다제를 이용하여 이루어진다. 포유류, 이스트, 곤충 및 식물 세포 모두 상이한 글리코실화 패턴을 도입하고 이는 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받기 때문에 이용되는 발현 시스템의 타입에 따라 ActRIIB 폴리펩티드의 서열을 적절하게 조정할 수 있다. 일반적으로 사람에 이용되는 ActRIEB 단백질은 적절한 글리코실화를 제공하는 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은 포유류 세포주에서 발현될 수 있지만 다른 포유류 발현 세포주도 유용할 것으로 보인다.
본 명세서에서는 변이체를 만드는 방법을 추가로 고려하는데, 선택적으로 절두 변이체를 포함하는 복합 ActRⅡB 폴리펩티드 변이체 세트; 복합 변이체 풀(pools)은 기능적 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 이와 같은 복합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은 예를 들면, 변형된 약동학 또는 변형된 리간드 결합과 같은 변형된 성질을 가지는 ActRⅡB 폴리펩티드 변이체를 만드는 것이 될 수도 있다. 하기에는 다양한 스크리닝 방법을 제공하는데, 이와 같은 검사를 이용하여 변이체들을 평가할 수도 있다. 예를 들면, ActRIIB 폴리펩티드에 결합하는 능력, ActRIIB 폴리펩티드에 ActRⅡB 리간드가 결합하는 것을 방해하는 능력에 대해 ActRIIB 폴리펩티드 변이체를 스크리닝할 수도 있다.
ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 능력은 세포계 또는 in vivo 검사로 테스트될 수도 있다. 예를 들면 골아세포 또는 전구체에서 뼈 생산과 연관된 유전자의 발현시에 ActRIIB 폴리펩티드 변이체의 효과를 평가할 수도 있다. 필요한 경우, 하나 또는 그 이상의 재조합 ActRIIB 리간드 단백질 (예를 들면, BMP7) 존재하에 실행할 수도 있고, 세포는 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체들 그리고 선택적으로 ActRⅡB 리간드를 만들기 위해 형질감염시킬 수도 있다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드를 생쥐 또는 다른 동물에 투여하여, 밀도와 용적과 같은 하나 또는 그 이상의 뼈 성질을 평가할 수도 있다. 뼈 골절의 치료 속도도 평가할 수 있다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 활성을 근육 세포, 지방세포, 신경 세포에서 이들 세포의 생장에 임의 효과를 테스트할 수 있는데, 예를 들면 하기에서 설명하는 검사를 통하여 테스트한다. 이와 같은 검사들은 당분야에 공지된 것들이다. SMAD-반응성 리포터 유전자를 이와 같은 세포주에 이용하여 하류 시그날링(downstream signaling)에 효과를 모니터할 수 있다.
자연 발생 ActRⅡB 폴리펩티드에 대한 선택성을 가진 복합-유도된 변이체가 만들어질 수도 있다. 재조합 DNA 구조에서 발현될 경우 변이체 단백질들은 유전자 요법 프로토콜에 이용될 수도 있다. 유사하게, 돌연변이생성으로 상응하는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드보다는 상당히 상이한 세포내 반감기를 가지는 변이체를 만들 수도 있다. 예를 들면, 변형된 단백질은 단백질 분해 또는 다른 공정에 더 안정적인 또는 덜 안정적이어서 고유 ActRⅡB 폴리펩티드를 파괴하거나 비활성화를 결과할 수도 있다. 이와 같은 변이체 및 이를 인코드하는 유전자는 ActRⅡB 폴리펩티드의 반감기를 조절하여 ActRⅡB 폴리펩티드 수준을 변화시키는데 이용될 수도 있다. 예를 들면, 반감기는 좀더 일과적인 생물학적 효과를 일으키고, 유도성 발현 시스템의 일부인 경우, 세포내에 재조합 ActRⅡB 폴리펩티드를 좀더 긴밀하게 제어할 수 있도록 한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRⅡB 폴리펩티드에 자연상태로 존재하는 것에 추가로, 전사후 변형을 추가로 포함할 수도 있다. 이와 같은 변형에는 아세틸화(acetylation), 카르복실화(carboxylation), 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 지질화(lipidation)와 아실화(acylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 결과로써, 이러한 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 지질(lipid), 폴리사카라이드(polysaccharide) 또는 모노사카라이드(monosaccharide), 그리고 인산염(phosphate)을 포함할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드의 기능성(functionality)에 대한 이런 비-아미노산 요소의 효과는 다른 ActRII 폴리펩티드 변이체에 대하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이 검사될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드가 ActRII 폴리펩티드의 초기 형태(nascent form)를 절단함으로써 세포 내에서 생산될 때, 번역후 처리(post-translational processing) 역시 단백질의 정확한 접힘(folding) 및/또는 기능에 중요하다. ActRIIB 폴리펩티드의 정확한 변형과 처리를 담보하기 위하여, 이런 번역후 활성을 위한 특이적인 세포 기구와 특징적인 기전을 보유하는 상이한 세포(가령, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)가 선택될 수 있다.
특정 측면에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태에는 ActRIIB 폴리펩티드의 최소한 일부분과 하나 이상의 융합 도메인을 보유하는 융합 단백질이 포함된다. 이런 융합 도메인의 널리 공지된 실례에는 폴리히스티딘(polyhistidine), Glu-Glu, 글루타티온 S 전이효소(glutathione S transferase, GST), 티오레독신(thioredoxin), 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP), 또는 인간 혈청 알부민이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 공여하도록 선택된다. 가령, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 융합 단백질의 분리에 특히 유용하다. 친화성 정제를 위하여, 친화성 크로마토그래피에 적합한 기반(matrix), 예를 들면, 글루타티온-, 아밀라아제-, 그리고 니켈- 또는 코발트-공동된 수지가 이용된다. 이들 기반 중에서 대부분은 “키트” 형태, 예를 들면, Pharmacia GST 정제 시스템과 (HIS6) 융합 상대와 함께 이용되는 QIAexpress™ 시스템(Qiagen)으로 가용하다. 다른 실례로서, 융합 도메인은 ActRIIB 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택된다. 이런 검출 도메인의 실례에는 다양한 형광 단백질(가령, GFP)과 “에피토프 태그(epitope tag)”가 포함되는데, 이들 태그는 통상적으로, 특이적인 항체가 가용한 짧은 펩티드 서열이다. 특이적인 단클론 항체가 용이하게 가용한 널리 공지된 에피토프 태그에는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(influenza virus haemagglutinin, HA)과 c-myc 태그가 포함된다. 일부 사례에서, 융합 도메인은 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site), 예를 들면, 인자 Xa 또는 트롬빈(thrombin)에 대한 프로테아제 절단 부위를 보유하는데, 상기 부위는 관련된 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 절단하여, 이로부터 재조합 단백질이 유리될 수 있도록 한다. 유리된 단백질은 이후, 차후의 크로마토그래피 분리(chromatographic separation)에 의해 융합 도메인으로부터 분리될 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드는 생체내에서 ActRII 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인(“안정화” 도메인)과 융합된다. “안정화”는 이러한 안정화가 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 소거, 또는 다른 약동학적 효과에 기인하는 지에 상관없이, 혈청 반감기를 증가시키는 무언가를 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위한 범위의 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 공여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 융합은 바람직한 특성을 공여할 수 있다. 선택되는 다른 유형의 융합 도메인에는 다중화(multimerizing)(가령, 이합화(dimerizing), 사합화(tetramerizing)) 도메인과 기능성 도메인(추가적인 생물학적 기능, 예를 들면, 근육 성장의 추가적인 자극 공여)이 포함된다.
특정 실례로서, 본 발명에서는 Fc 도메인에 융합된 세포외(GDF8-결합) 도메인을 포함하는 GDF8 길항물질로써의 융합 단백질(가령, SEQ ID NO: 13)을 제시한다.
Figure 112016100939351-pat00001
적절하게는, Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322와 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 잔기를 보유한다. 특정 사례에서, 이들 돌연변이 중에서 하나 이상(가령, Asp-265 돌연변이)을 보유하는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 능력을 갖는다. 다른 사례에서, 이들 돌연변이 중에서 하나 이상(가령, Asn-434 돌연변이)을 보유하는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 MHC 클래스 I-관련된 Fc-수용체(FcRN)에 대한 증가된 결합 능력을 갖는다.
융합 단백질의 상이한 요소는 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 정렬될 수 있다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드가 이질성 도메인의 C-말단에 배치되거나, 또는 대안으로, 이질성 도메인이 ActRIIB 폴리펩티드의 C-말단에 배치될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드 도메인과 이질성 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 추가적인 도메인 또는 아미노산 서열이 한쪽 도메인의 C- 또는 N-말단에 또는 이들 도메인 사이에 포함될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 보유한다. 가령, 이들 변형은 ActRIIB 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 강화시키거나, ActRIIB 폴리펩티드의 순환 반감기(circulatory half life)를 강화시키거나, 또는 ActRIIB 폴리펩티드의 단백분해 변성을 감소시킨다. 이와 같은 안정화 변형에는 융합 단백질(예로써, ActRIIB 폴리펩티드와 안정화 도메인을 포함하는 융합 단백질 포함), 글리코실화 부위의 변형(예로써, ActRIIB 폴리펩티드에 글리코실화 부위의 추가 포함), 그리고 탄수화물 모이어티의 변형(예로써, ActRIIB 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거 포함)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서, “안정화 도메인”은 융합 단백질의 경우에서처럼 융합 도메인(가령, Fc)을 지칭할 뿐만 아니라 비-단백질성 변형(nonproteinaceous modification), 예를 들면, 탄수화물 모이어티, 또는 비-단백질성 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 포괄한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드의 분리된 및/또는 정제된 형태를 가능하게 하는데, 이들은 다른 단백질로부터 분리되거나, 또는 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.
특정 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 (변형안된 또는 변형된)는 당분야에 공지된 다양한 기술을 통하여 생산될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 ActRIIB 폴리펩티드는 Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) and Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에서 설명하는 표준 단백질 화학 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 도한, 자동화된 펩티드 합성기도 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안으로, ActRIIB 폴리펩티드, 이의 단편들 또는 변이체들은 당분야에 공지된 다양한 발현계(예를 들면, 대장균, CHO 세포, COS 세포, 베큘로바이러스)를 이용하여 재조합적으로 만들어질 수도 있다. 추가 구체예에서, 변형된 또는 변형안된 ActRⅡB 폴리펩티드는 자연 발생 또는 재조합에 의해 만들어진 전장 ActRⅡB 폴리펩티드를 트립신, 터모리신, 키모트립신, 펩신 또는 쌍을 이룬 염기성 아미노산 전환 효소(PACE)와 같은 프로테아제를 이용하여 절단시켜 만들 수 있을 것이다. 컴퓨터 분석(상업적으로 이용할 수 있는 소프트웨어, 가령, Mac Vector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.)을 이용하여 단백질가수분해 절단 부위를 확인할 수 있을 것이다. 대안으로, 이와 같은 ActRIIB 폴리펩티드는 당분야에 공지된 표준 기술 예를 들면, 화학적 절단(예를 들면, 시아노겐 브롬화물, 하이드록실아민)자연 생성 또는 재조합적으로 생산된 전장 ActRⅡB 폴리펩티드로부터 만들어질 수 있다.
3. ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산
특정 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에 개시된 단편, 기능적 변이체와 융합 단백질을 비롯한 임의의 ActRIIB 폴리펩티드(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)를 인코딩하는 분리된 및/또는 재조합 핵산을 제시한다. 가령, SEQ ID NO: 4는 자연 발생 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 인코딩하는 반면, SEQ ID NO: 3은 가용성 ActRIIB을 인코딩한다. 본 발명의 핵산은 단일 가닥(single-strand) 또는 이중 가닥(double strand)이다. 이들 핵산은 DNA 또는 RNA 분자이다. 이들 핵산은 예로써, ActRIIB 폴리펩티드를 제조하는 방법에, 또는 직접적인 치료제(가령, 유전자 치료법에서)로서 이용될 수 있다.
특정 측면에서, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO: 3의 변이체 핵산을 포괄하는 것으로 간주된다. 변이체 뉴클레오티드 서열에는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 구별되는 서열, 예를 들면, 대립형질 변이체(allelic variant)이 포함되고, 그리고 SEQ ID NO: 4의 코딩 서열의 핵산 서열과는 상이한 코딩 서열을 포함할 수도 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 SEQ ID NO: 3에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 분리된 또는 재조합 핵산 서열을 제시한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, SEQ ID NO: 3에 상보적인 핵산 서열, 그리고 SEQ ID NO: 3의 변이체 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 분리되고, 재조합되고 및/또는 이질성 뉴클레오티드 서열과 융합되거나 DNA 라이브러리 내에 융합될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산에는 SEQ ID NO: 3에 열거된 뉴클레오티드 서열에 고도로 엄밀한 조건 하에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 3의 보체 서열, 또는 이들의 단편 역시 포함된다. 앞서 언급된 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화(hybridization)를 촉진하는 적절한 엄밀도(stringency) 조건이 변화될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화(hybridization)를 촉진하는 적절한 엄밀도(stringency) 조건이 변화될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 가령, 대략 45℃에서 6.0 x 염화나트륨(sodium chloride)/시트르산나트륨(sodium citrate)(SSC)에서 혼성화, 이후 50℃에서 2.0 x SSC의 세척을 수행할 수 있다. 가령, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 대략 2.0 x SSC의 낮은 엄밀도 내지 50℃에서 대략 0.2 x SSC의 높은 엄밀도에서 선택될 수 있다. 이에 더하여, 세척 단계에서 온도는 실온(대략 22℃)에서 낮은 엄밀도 조건에서 대략 65℃에서 높은 엄밀도 조건으로 증가될 수 있다. 온도와 염 모두 변화되거나, 또는 다른 변수가 변하는 반면에 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄밀도 조건하에 혼성화되고, 이후 실온에서 2 x SSC에서 세척되는 핵산을 제시한다.
유전자 코드(genetic code)에서 축퇴(degeneracy)로 인하여 SEQ ID NO: 3에 열거된 핵산과 차별되는 분리된 핵산 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 가령, 다수의 아미노산이 하나 이상의 삼중항(triplet)에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 명기하는 코돈, 또는 동종이명(synonym)(가령, CAU와 CAC는 히스티딘에 대한 동종이명(synonym)이다)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 “침묵” 돌연변이를 유도한다. 하지만, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하는 DNA 서열 다형성(polymorphism)이 포유동물 세포 사이에 존재할 것으로 예상된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 특정 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드에서 이들 변이(뉴클레오티드의 최대 3-5%)가 자연적인 대립형질 변이(allelic variation)로 인하여 특정한 종의 개체 사이에 존재할 수 있다. 이와 같은 모든 뉴클레오티드 변이 및 결과의 아미노산 다형성은 본 발명의 범위 내에 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체(expression construct) 내에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 발현에 이용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대한 다양한 유형의 적합한 발현 벡터와 조절 서열이 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에는 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작과 종결 서열, 번역 시작과 종결 서열, 인핸서 또는 활성인자 서열 등이 포함된다. 당분야에 공지된 구조성 또는 유도성 프로모터가 본 발명에 의해 고려된다. 이들 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소를 통합하는 하이브리드 프로모터이다. 발현 구조체는 세포 내에서 에피솜(episome), 예를 들면, 플라스미드(plasmid) 상에 존재하거나, 또는 발현 구조체는 염색체 내로 삽입된다. 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 형질전화된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 선택가능 마커 유전자를 포함한다. 선택가능 마커 유전자는 당분야에 널리 공지되어 있고, 이용된 숙주 세포에 따라 변한다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 핵산은 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 최소한 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터(expression vector)에 담겨 제공된다. 조절 서열은 당분야에서 인지되고, ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 관리하도록 선택된다. 따라서 조절 서열에는 프로모터, 인핸서와 다른 발현 제어 요소가 포함된다. 전형적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 기술된다. 가령, 작동가능하게 연결되면 DNA 서열의 발현을 제어하는 다양한 발현 제어 서열은 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하기 위하여 이들 벡터에 이용된다. 이런 유용한 발현 제어 서열에는 예로써, SV40의 초기와 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 프로모터(이의 발현은 T7 RNA 중합효소에 의해 관리된다), 파지 람다(phage lambda)의 주요 오퍼레이터와 프로모터 영역, fd 외피 단백질에 대한 제어 영역, 3-글리세르산인산 키나아제(phosphoglycerate kinase) 또는 다른 당분해(glycolytic) 효소에 대한 프로모터, 산성 인산가수분해효소(acid phosphatase)의 프로모터(가령, Pho5), 효모 α-교미 인자(mating factor)의 프로모터, 배큘로바이러스(baculovirus) 시스템의 다면체(polyhedron) 프로모터, 원핵이나 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려져 있는 다른 서열, 이들의 다양한 조합 등이 포함된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되는 원하는 단백질의 타입과 같은 인자에 좌우된다. 게다가, 벡터의 사본수(copy number), 사본수를 제어하는 능력과 상기 벡터에 의해 인코딩되는 임의의 다른 단백질, 예를 들면, 항생제 마커(antibiotic marker)의 발현 역시 숙고되어야 한다.
본 발명의 재조합 핵산은 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 둘 모두에서 발현에 적합한 벡터 내로, 클론된 유전자 또는 이의 일부분을 결찰함으로써 산출될 수 있다. 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 벡터에는 플라스미드 및 다른 벡터가 포함된다. 가령, 원핵 세포, 예를 들면, 대장균(E. coli)에서 발현에 적합한 벡터에는 아래 유형의 플라스미드가 포함된다: pBR322-유래된 플라스미드, pEMBL-유래된 플라스미드, pEX-유래된 플라스미드, pBTac-유래된 플라스미드와 pUC-유래된 플라스미드.
일부 포유동물 발현 벡터는 세균 내에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열, 그리고 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위(transcription unit)를 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo와 pHyg 유래된 벡터는 진핵 세포의 형질감염(transfection)에 적합한 포유동물 발현 벡터의 실례이다. 이들 벡터 중에서 일부는 원핵과 진핵 세포 모두에서 복제와 내약성(drug resistance) 선택을 용이하게 하는 세균 플라스미드, 예를 들면, pBR322로부터 서열로 변형된다. 대안으로, 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus)(BPV-I), 또는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(pHEBo, pREP-유래된, p205)와 같은 바이러스의 유도체가 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스(레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 실례는 하기, 유전자 치료 전달 시스템의 설명에서 확인할 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 생물체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법이 당분야에 널리 공지되어 있다. 원핵과 진핵 세포 둘 모두에 적합한 다른 발현 시스템 및 전반적인 재조합 절차는 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001을 참조한다. 일부 사례에서, 배큘로바이러스 발현 시스템의 이용으로 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직하다. 이런 배큘로바이러스 발현 시스템의 실례에는 pVL-유래된 벡터(가령, pVL1392, pVL1393과 pVL941), pAcUW-유래된 벡터(가령, pAcUWl), 그리고 pBlueBac-유래된 벡터(가령, β-gal 보유 pBlueBac III)가 포함된다.
바람직한 구체예에서, CHO 세포에서 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 벡터, 예를 들면, Pcmv-Script 벡터(Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)와 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wise)가 설계된다. 확인되는 바와 같이, 본 발명의 유전자 구조체는 예로써, 정제를 위한, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 생산하기 위하여 배양으로 증식된 세포에서 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 유도하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 코딩 서열(가령, SEQ ID NO: 4)을 비롯한 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관계한다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포이다. 가령, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 세균 세포(가령, 대장균(E. coli)), 곤충 세포(가령, 배큘로바이러스 발현 시스템 이용), 효모, 또는 포유동물 세포에서 발현된다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관계한다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRIIB 폴리펩티드의 발현이 진행되도록 하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 세포와 배지의 혼합물로부터 분비되고 분리될 수 있다. 대안으로, ActRIIB 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획(membrane fraction) 내에 유지되고, 세포는 수거되고 용해되며, 상기 단백질은 분리된다. 세포 배양액은 숙주 세포, 배지와 다른 부산물을 함유한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과(ultrafiltration), 전기영동(electrophoresis) 및 ActRIIB 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화성(immunoaffinity) 정제 를 이용한 친화성 정제를 비롯한, 단백질을 정제하기 위한 당분야에 공지된 기술을 이용하여, 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 모두로부터 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
다른 구체예에서, 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에서 정제 리더 서열, 예를 들면, 폴리-(His)/엔테로키나아제(enterokinase) 절단 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2 + 금속 수지(metal resin)를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한, 발현된 융합 단백질의 정제를 가능하게 할 수 있다. 정제 리더 서열은 이후, 정제된 ActRIIB 폴리펩티드를 제공하기 위하여 엔테로키나아제 처리에 의해 차후에 제거될 수 있다(참조: Hochuli et al., (1987) J Chromatography 411:177; Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
융합 유전자를 만드는 기술은 널리 공지되어 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 결합은 통상적인 기술에 따라, 결찰을 위한 평활-말단(blunt-ended termini) 또는 갈지자-말단(stagger-ended termini), 적절한 말단을 제공하는 제한 효소 절단(restriction enzyme digestion), 점착 말단(cohesive end)의 채움(filling-in), 원치 않는 결합을 차단하는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 처리, 그리고 효소 결찰(enzymatic ligation)을 이용하여 수행된다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성장치를 비롯한 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속하는 유전자 단편 사이에 상보성 오버행(overhang)을 산출하는 앵커 프라이머(anchor primer)를 이용하여 수행될 수 있는데, 이들 유전자 단편은 차후에 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 산출할 수 있다(참조: Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).4. 항체
본 발명의 또 다른 측면에는 항체가 포함된다. ActRIIB 폴리펩티드(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)와 특이적으로 반응하고, ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 리간드에 경쟁적으로 결합하는 항체는 ActRIIB 폴리펩티드 활성의 길항물질로서 이용될 수 있다. 예를 들면, ActRIIB 폴리펩티드로부터 유래된 면역원(immunogen)을 이용함으로써, 항-단백질/항-펩티드 항혈청(antisera) 또는 단클론 항체가 표준 프로토콜(standard protocol)에 의해 제조될 수 있다(참조: Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). 포유동물, 예를 들면, 생쥐, 햄스터 또는 토끼는 액티빈, ActRIIB 폴리펩티드의 면역원성 형태(immunogenic form), 항체 반응(antibody response)을 유도할 수 있는 항원 단편, 또는 융합 단백질로 면역될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성(immunogenicity)을 공여하는 기술에는 담체(carrier)에 배합(conjugation) 또는 당분야에 널리 공지된 다른 기술이 포함된다. ActRIIB 폴리펩티드의 면역원성 부분이 어쥬번트(adjuvant)의 존재 하에 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가(antibody titer)의 검출에 의해 모니터될 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역분석은 상기 면역원을 항원으로 하여 항체 수준을 평가하는데 이용될 수 있다.
ActRIIB 폴리펩티드의 항원성 조합제로 동물의 면역이후, 항혈청이 수득될 수 있고, 원하는 경우에, 다클론 항체가 혈청으로부터 분리될 수 있다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 항체-생산 세포(림프구)를 면역된 동물로부터 수거하고 표준 체세포 융합 절차에 의해 영속 세포(immortalizing cell), 예를 들면, 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마(hybridoma) 세포를 산출할 수 있다. 이런 기술은 당분야에 널리 공지되어 있는데, 여기에는 예로써, 하이브리도마 기술(Kohler와 Milstein에 의해 최초로 개발됨((1975) Nature, 256: 495-497)), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), 인간 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) 등이 포함된다. 하이브리도마 세포는 ActRIIB 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체 및 이런 하이브리도마 세포를 포함하는 배양액으로부터 분리된 단클론 항체의 생산을 위하여 면역화학적으로 선별될 수 있다.
본 명세서에서, “항체”는 본 ActRⅡB 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 이의 단편을 포함한다. 항체는 상적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고, 단편은 상기 완전 항체(whole antibody)와 동일한 방법으로 유용성에 대해 선별될 수 있다. 예를 들면, F(ab)2 단편은 펩신을 항체로 처리하면 만들 수 있다. 생성된 F(ab)2 단편을 이황화결합을 환원시키기 위해 추가 처리하며 Fab 단편을 만들 수도 있다. 본 발명의 항체는 이중특이성, 단일-쇄 및 항체의 최소 한 개 CDR 부분에 의해 부여되는 ActRⅡB 폴리펩티드에 대한 친화성을 가지는 키메라 및 인화 항체를 포함한다. 적절한 구체예에서, 항체는 추가로 이에 부착된 라벨을 포함하여, 감지가능할 수 있다(예를 들면, 라벨은 방사능동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소-공인자가 될 수 있다).
특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 단클론 항체이고, 특정 구체예에서, 본 발명은 신규한 항체를 산출하는 방법을 제시한다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 산출하는 방법은 검출가능한 면역 반응을 자극하는데 효과적인 항원 폴리펩티드를 함유하는 면역 조성물(immunogenic composition)의 일정량을 생쥐에 투여하는 단계, 생쥐로부터 항체-생산 세포(가령, 비장으로부터 유래된 세포)를 수득하는 단계, 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합하여 항체-생산 하이브리도마를 수득하는 단계, 그리고 항체-생산 하이브리도마를 검사하여 ActRⅡB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함한다. 일단 수득된 하이브리도마는 임의적으로, 하이브리도마-유래된 세포가 ActRⅡB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 배양 조건 하에 세포 배양액에서 증식될 수 있다. 단클론 항체는 세포 배양액으로부터 정제될 수 있다.
항체와 관련하여 이용된 형용사 “특이적으로 반응하는”은 당분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 상기 항체가 목적 항원(가령, ActRIIB 폴리펩티드)과 목적하지 않는 다른 항원 사이에 충분히 선택적이고, 상기 항체가 최소한, 특정 타입의 생물학적 시료의 내에서 목적 항원의 존재를 검출하는데 유용하다는 것을 의미한다. 치료 적용과 같은 상기 항체를 이용하는 특정 방법에서, 더욱 높은 수준의 결합 특이성이 바람직하다. 단클론 항체는 일반적으로, 원하는 항원과 교차-반응성(cross-reacting) 폴리펩티드를 효과적으로 구별하는데 더욱 높은 추세(다클론 항체와 비교하여)를 갖는다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 주는 한 가지 특징은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 원하는 특이성이 일정한 범위의 상이한 친화성으로 달성될 수도 있지만, 일반적으로 선호되는 항체는 대략 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 그 이하의 친화성(해리 상수)을 갖는다.
이에 더하여, 바람직한 항체를 확인하기 위하여 항체를 선별하는데 이용되는 기술은 수득된 항체의 특성에 영향을 줄 수 있다. 가령, 항체가 용해 상태에서 항원에 결합하는데 이용된다면, 용액 결합(solution binding)을 검사하는 것이 바람직하다. 항체와 항원 사이에 상호작용을 검사하여 특히 바람직한 항체를 확인하기 위하여 여러 다양한 기술이 가용하다. 이런 기술에는 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 결합 검사(가령, Biacore™ 결합 검사, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 검사(sandwich assay)(가령, 상자성 비드(paramagnetic bead) 시스템, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), 웨스턴 블랏(western blot), 면역침전 검사(immunoprecipitation assay), 면역조직화학법(immunohistochemistry) 등이 포함된다.
특정 측면에서, 명세서에서는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 이와 같은 항체는 상기에서 설명하는 것과 같이 항원으로 가용성 ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용하여 생산할 수 있을 것이다. 이와 같은 타입의 항체들은 생물학적 샘플에서 ActRⅡB 폴리펩티드를 감지하거나, 개체에서 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드 수준을 모니터하는데 이용할 수 있다. 특정 경우에, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 ActRIIB 리간드의 활성을 조절하여, 뼈, 연골, 근육, 지방 및 신경과 같은 조직의 생장을 조절(촉진 또는 저해)할 수 있을 것이다.
5. 선별 검사
특정 측면에서, 본 발명은 액티빈-ActRIIB 폴리펩티드의 항진물질 또는 길항물질인 화합물(작용제)을 확인하기 위한 ActRIIB 폴리펩티드(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)의 용도에 관계한다. 이러한 선별을 통하여 확인된 화합물은 생체내에서 조직 생장을 조절하는 능력을 평가하기 위해, 뼈, 연골, 근육, 지방 및/또는 신경과 같은 조직에서 테스트할 수 있다.
ActRIIB 폴리펩티드를 표적함으로써 조직 생장을 조절하는 치료제의 선별을 위한 다수의 접근법이 존재한다. 특정 구체예에서, 화합물의 고속 선별(high-throughput screening)은 뼈, 연골, 근육, 지방 및/또는 신경과 같은 조직에서 ActRIIB-매개된 효과를 교란시키는 작용제를 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 검사는 ActRⅡB 리간드(예를 들면, 액티빈, Nodal, GDF8, GDF11 또는 BMP7)와 같은 결합 짝에 ActRⅡB 폴리펩티드의 결합을 특이적으로 저해하거나 감소시키는 화합물을 선별하고 확인하기 위하여 수행된다. 대안으로, 상기 검사는 ActRⅡB 리간드와 같은 이의 결합 단백질에 폴리펩티드의 결합을 강화시키는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 화합물은 ActRIIB 폴리펩티드와 상호작용하는 능력으로 확인될 수 있다.
다양한 검사 양식(assay format)이 만족스럽지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명의 개시에 비추어, 본 명세서에서 명시되지 않은 것들 역시 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 검사 화합물(작용제)은 임의의 조합 화학 방법(combinatorial chemical method)으로 산출될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 화합물은 생체내에서 또는 시험관내에서 합성된 자연 발생 생물분자이다. 조직 성장의 조절인자(modulator)로서 기능하는 능력에 대하여 검사되는 화합물(작용제)은 예로써, 세균, 효모, 식물 또는 다른 생물체에 의해 생산되거나(가령, 자연 산물), 화학적으로 생산되거나(가령, 펩티드모방체(peptidomimetic)를 비롯한 소형 분자), 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 본 발명에서 고려되는 검사 화합물에는 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬, 핵산 분자 등이 포함된다. 특정 구체예에서, 검사 작용제는 대략 2,000 달톤(dalton) 이하의 분자량(molecular weight)을 보유하는 소형 유기 분자다.
본 발명의 검사 화합물은 단일의 구별된 존재로서 제공되거나, 또는 예로써, 조합 화학(combinatorial chemistry)으로 만들어진 더욱 복잡한 라이브러리에 담겨 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예로써, 알코올, 알킬 할라이드, 아민, 아마이드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 종류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 검사 시스템에 검사 화합물의 제공은 특히, 최초 선별 단계에서 분리된 형태로 또는 화합물의 혼합물로서 달성될 수 있다. 임의적으로, 화합물은 다른 화합물로 임의적으로 유도체화되고, 화합물의 분리를 용이하게 하는 유도체화 기(derivatizing group)를 보유한다. 유도체화 기의 무제한적 실례에는 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디곡시제닌(digoxygenin), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 동위원소(isotope), 폴리히스티딘(polyhistidine), 자성 비드(magnetic beads), 글루타티온 S 전달효소(glutathione S transferase, GST), 광활성화가능 가교제(photoactivatable crosslinker) 또는 이들의 조합이 포함된다.
화합물과 천연 추출물의 라이브러리를 검사하는 많은 약물 선별 프로그램에서, 정해진 기간 내에 조사되는 화합물의 수를 극대화사키기 위하여 고속 분석법이 바람직하다. 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유도된 것과 같은 세포-없는 시스템에서 수행되는 분석법은 종종, “일차” 스크린으로서 선호되는데, 그 이유는 이들이 검사 화합물에 의해 매개되는 분자 표적(molecular target) 내에서 변형의 신속한 발생과 상대적으로 용이한 검출을 가능하도록 산출될 수 있기 때문이다. 게다가, 검사 화합물의 세포 독성 또는 생체이용효율(bioavailability)의 효과는 시험관내 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있는데, 이러한 분석법은 그 대신에, ActRIIB와 이의 결합 단백질(가령, ActRⅡB 리간드) 사이에 결합 친화성의 변형으로 확인되는, 분자 표적에 대한 약제의 효과에 일차적으로 집중한다.
설명을 목적으로, 본 발명의 전형적인 선별 검사에서, 목적 화합물은 ActRⅡB 리간드에 통상적으로 결합할 수 있는 분리되고 정제된 ActRIIB 폴리펩티드와 접촉한다. 이후, 상기 화합물과 ActRIIB 폴리펩티드의 혼합물에 ActRIIB 리간드를 함유하는 조성물이 추가된다. ActRIIB/ActRⅡB 리간드 복합체의 검출과 정량은 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성을 저해하는(또는 강화하는) 화합물의 효능을 결정하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 검사 화합물을 이용하여 획득된 데이터로부터 용량 반응 곡선(dose response curve)을 산출함으로써 평가할 수 있다. 게다가, 비교를 위한 기준선(baseline)을 제공하기 위하여 대조 분석(control assay) 역시 수행될 수 있다. 가령, 대조 분석에서, 분리되고 정제된 ActRⅡB 리간드를 ActRIIB 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 추가되고, ActRIIB/ActRⅡB 리간드 복합체의 형성이 검사 화합물의 부재 하에 정량된다. 일반적으로, 반응물이 혼합되는 순서는 변경될 수 있고, 동시에 혼합될 수 있다. 게다가, 적절한 세포-없는 분석 시스템을 제공하기 위하여 정제된 단백질 대신에, 세포 추출물과 용해물(lysate)이 이용될 수도 있다.
ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성은 다양한 기술로 검출될 수 있다. 가령, 복합체 형성의 조절은 예로써, 검출가능하게 표지된 단백질, 예를 들면, 방사성표지된(가령, 32P, 35S, 14C 또는 3H), 형광 표지된(가령, FITC), 또는 효소 표지된 ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 결합 단백질을 이용하여, 면역분석(immunoassay)에 의해, 또는 크로마토그래피 검출(chromatographic detection)에 의해 정량될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 상호작용 정도를 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는데 있어 형광 편광(fluorescence polarization) 분석 및 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석의 이용을 고려한다. 더 나아가, 광도파(optical waveguide)(PCT Publication WO 96/26432; U.S. Pat. No. 5,677,196), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR), 표면 전하 센서(surface charge sensor), 그리고 표면 포스 센서(surface force sensor)에 기초한 것들과 같은 다른 검출 양식이 본 발명의 다수 구체예에 적합하다.
게다가, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이의 상호작용을 파괴하거나 강화시키는 작용제를 확인하기 위한, “이중 하이브리드 분석(two hybrid assay)”으로 알려져 있는 상호작용 트랩 분석(interaction trap assay)의 이용을 고려한다(참조: U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). 특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 상호작용을 분리시키는 화합물(가령, 소형 분자 또는 펩티드)을 확인하는 역 이중 하이브리드 시스템(reverse two hybrid system)의 이용을 고려한다(참조: Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; U.S. Pat. No. 5,525,490; 5,955,280; 5,965,368).
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드와 상호작용하는 능력으로 확인된다. 상기 화합물과 ActRIIB 폴리펩티드 사이에 상호작용은 공유 또는 비-공유이다. 가령, 이런 상호작용은 광-가교연결(photo-crosslinking), 방사성표지된 리간드 결합, 그리고 친화성 크로마토그래피를 비롯한 시험관내 생화학적 방법을 이용하여 단백질 수준에서 확인될 수 있다(Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). 특정 사례에서, 이들 화합물은 기전 기초된 분석(mechanism based assay), 예를 들면, 액티빈 또는 ActRII 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 검출하는 분석에서 선별된다. 이는 고체상(solid phase) 또는 액체상(fluid phase) 결합 현상을 포함할 수 있다. 대안으로, 액티빈 또는 ActRIIa 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 리포터 시스템(가령, β-갈락토시다아제, 루시페라제, 또는 녹색 형광 단백질)으로 세포 내로 형질감염되고, 임의적으로 고속 선별에 의해 라이브러리에 대하여 또는 상기 라이브러리의 개별 구성원으로 선별된다. 다른 기전 기초된 결합 분석, 예를 들면, 자유 에너지(free energy)에서 변화를 검출하는 결합 분석이 이용될 수도 있다. 결합 분석은 웰, 비드 또는 칩에 고정되거나, 고정된 항체에 의해 포획되거나, 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)에 의해 분해된 표적으로 수행될 수 있다. 결합된 화합물은 통상적으로, 비색(colorimetric) 또는 형광 또는 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 검출된다.
특정 측면에서, 본 발명은 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 ActRIIB 리간드의 기능을 길항시켜 근육 생장을 자극하고 근육량을 증가시키는 물질 및 방법을 제공한다. 따라서, 확인된 임의 화합물을 in vitro 또는 in vivo에서 전체 세포 또는 조직에서 테스트하여 근육 생장을 조절하는 능력을 확인할 수 있다. 이 목적을 위해 당분야에 공지된 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 ActRⅡB 리간드(예를 들면, GDF8)에 결합하여 활성화된 ActRⅡB 단백질을 통한 시그날 변환이 감소되거나 저해되도록 실행된다. 유기체에서 근육 조직의 생장은 ActRⅡB 단백질을 통한 시그날 변환이 영향을 받지 않은 상응하는 유기체(또는 유기체 군)의 근육량과 비교하여 유기체에서 근육량의 증가를 결과할 것이라는 것을 인지할 수 있을 것이다.
예를 들면, 근육 세포 생장/증식에 ActRⅡB 폴리펩티드 또는 테스트 화합물들의 효과는 근세표의 증식과 연관된 Pax-3 및 Myf-5의 유전자 발현과 근육 분화와 연관된 MyoD 유전자 발현의 측정으로 결정할 수 있을 것이다(e.g., Amthor et al., Dev Biol. 2002, 251:241-57). GDF8가 Pax-3 및 Myf-5의 유전자 발현을 하향 조절하고, MyoD의 유전자 발현은 저해한다는 것은 공지의 사실이다. ActRIIB 폴리펩티드 또는 테스트 화합물은 GDF8의 이와 같은 활성을 길항하는 것으로 기대된다. 세포계 검사의 또 다른 예로는 ActRIIB 폴리펩티드 또는 테스트 화합물 존재하에 C(2)C(12) 근아세포와 같은 근아세포 증식을 측정하는 것이 포함된다(가령, Thomas et al., J Biol Chem. 2000, 275:40235-43).
본 발명은 또한 근육량 및 강도를 측정하는 in vivo 검사를 고려한다. 예를 들면, Whittemore et al. (Biochem Biophys Res Commun. 2003, 300:965-71)에서는 생쥐에서 증가된 골근육량 및 증가된 그립(grip) 강도를 측정하는 방법을 개시한다. 선택적으로, 이 방법은 근육 질환 또는 이상 예를 들면, 근육량이 제한되는 질환에서 테스트 화합물(예를 들면, ActRⅡB 폴리펩티드)의 치료요법적 효과를 결정하는데 이용될 수 있다.
한 측면에서 본 발명은 뼈 형성을 조절(자극 또는 저해) 및 골량 증가를 위한 방법 및 물질을 제공한다. 따라서, 확인된 임의 화합물을 in vivo 또는 in vitro에서 전체 세포에 테스트되어 골 또는 연골 생장을 조절하는 이들의 능력을 확인할 수 있다. 이와 같은 목적을 위해 다양한 공지의 방법들이 이용될 수 있다.
예를 들면, 뼈 또는 연골 생장에서 ActRⅡB 폴리펩티드 또는 테스트 화합물의 효과는 세포계 검사에서 골형성세포로 골-전구세포(osteoprogenitor cell)의 분화 Msx2의 유도를 측정함으로써 결정될 수 있다(see, e.g., Daluiski et al., Nat Genet. 2001, 27(l):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). 세포계 검사의 또 다른 예로는 당해 간엽전구세포 및 골형성 세포에서 ActRⅡB 폴리펩티드와 테스트 화합물의 골형성 활성을 분석하는 것이 포함된다. 설명을 위해, ActRⅡB 폴리펩티드를 발현시키는 재조합 아데노바이러스를 작제하여 만능(pluripotent) 간엽 전구세포 C3H10T1/2 세포, 전골형성세포 C2C12, 및 골형성세포 TE-85 세포를 감염시켰다. 골형성 활성은 알카리 포스포타제, 오스테오칼신 및 매트릭스 미네랄화의 유도를 측정함으로써 결정된다(see, e.g., Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8): 1544-52).
본 발명은 또한 뼈 또는 연골 생장을 측정하는 in vivo 검사를 고려한다. 예를 들면, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001)는 골절후 초기 기간 동안 뼈 재생을 연구한 쥐 골다공증 모델을 설명한다. Kubo et al., Steroid Biochemistry &Molecular Biology, 68:197-202 (1999)는 또한 골절후 후기 동안 뼈 재생을 연구한 생쥐 골다공증 모델을 설명한다. 이들 문헌은 골다공증 뼈 골절 연구를 위한 생쥐 모델의 개시에 대한 참고문헌으로 첨부된다. 특정 측면에서, 본 발명은 당업자에 공지된 골절 치유 검사를 이용한다. 이들 검사에는 골절 기술, 조직학적 검사 및 생역학 분석 등이 포함되는데, 예를 들면, U.S. Pat. No. 6,521,750에서는 골절의 원인 뿐만 아니라 그 정도, 재생 과정에 관한 실험 프로토콜을 설명한다.
특정 측면에서, 본 발명은 체중 증가 및 비만을 조절하는 방법 및 물질을 제공한다. 세포 수준에서, 지방세포 증식 및 분화는 비만 발생에 중요하며, 이는 추가적인 지방세포(adipocytes)의 생성을 유도한다. 따라서, in vitro 또는 in vivo에서 전체 세포 또는 조직에서 지방세포 증식 또는 분화를 측정함으로써, 확인된 임의 화합물의 지방세포분화(adipogenesis)을 조절하는 이들의 능력을 한다. 당분야에 공지된 다양한 방법을 이와 같은 목적에 이용할 수 있다. 예를 들면, ActRⅡB 폴리펩티드(예를 들면, 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드) 또는 테스트 화합물의 지방세포분화에 효과는 세포계 검사에서 3T3-L1 전지방세포(preadipocyte)가 성숙한 지방세포로의 분화를 측정함으로써 결정될 수 있는데, 검사로는 예를 들면, Oil Red O 착색 소포에서 트리아실글리세롤의 축적을 관찰하거나 FABP (aP2/422) 및 PPARγ2와 같은 특정 지방세포 마커의 출현을 관찰함하는 것등이 포함된다. (Reusch et al., 2000, MoI Cell Biol. 20:1008-20; Deng et al., 2000, Endocrinology. 141:2370-6; Bell et al., 2000, Obes Res. 8:249-54.) 세포계 검사의 또 다른 예로는 브로모데옥시우리딘(BrdU)-포지티브 세포의 모니터링을 하는 것과 같이 지방세포 또는 지방세포 전구세포(가령 3T3-L1)의 증식에 ActRⅡB 폴리펩티드 및 테스트 화합물의 역할을 분석하는 것도 포함된다(Pico et al., 1998, MoI Cell Biochem. 189:1-7; Masuno et al., 2003, Toxicol Sci. 75:314-20.)
본 발명의 스크리닝 검사는 ActRⅡB 폴리펩티드 및 이의 분이체 뿐만 아니라 ActRⅡB 폴리펩티드의 항진물질 및 길항물질을 포함하는 임의 테스트 화합물에도 적용될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 이와 같은 스크리닝 검사는 약물 표적 확인 및 품질 조절 공정에도 유용하다.
서 GDF8 기능을 저해함으로써 최소한 ADIS 의 특정 증후는 완전하게 제거되지는 못하더라도 완화될 수 있고, AIDS 환자의 삶의 질이 상당히 개선될 것이다.
GDF8 (ActRIIB 리간드) 기능 상실이 영양 섭취감소없이도 지방 손실과 연관이 있기 때문에(Zimmers et al., supra; McPherron and Lee, supra), 당해 ActRIIB 폴리펩티드를 비만 발생 및 타입 II 당뇨병의 발생을 늦추거나 저해시키는 치료제로 추가 이용할 수도 있을 것이다. 이와 같은 방식은 여기에서 보여주는 데이터에 의해 확인되고 지지되는데, 이때 데이터에서는 ActRIIB-Fc 단백질이 비만 생쥐 모델의 대사 상태를 개선시키는 것으로 나타났다.
암 식욕감퇴-악액질 증후군는 암의 가장 쇠약하고 생명을 위협하는 측면중에 하나이다. 암 식욕감퇴-악액질 증후군에서 진행성 체중 감소는 많은 타입의 암에서 공통적인 특징이며, 열악한 삶의 질 뿐만 아니라 화학요법에 반응이 나쁜 것 뿐만 아니라 체중 감소가 없으면서 필적할 정도의 종양을 가진 환자와 비교할 때 생존 기간이 더 짧아지는 원인이 된다. 식욕감퇴, 지방 및 근육 조직 소모, 정신적 스트레스, 낮은 삶의 질과 연관하여, 악액질은 암과 숙주간에 복합 작용으로 발생된다. 암 환자의 사망원인중 가장 흔한 것으로 80%에서 악액질이 있다. 이는 단백질, 탄수화물 및 지방 대사에 영향을 주는 대사 혼란의 복합 예시이다. 종양은 직간접적으로 이상을 유발하여, 식욕감퇴 및 체중 손실을 결과한다. 현재, 이 과정을 제어하거나 역전시키는 치료는 없다. 암 식욕부진-악액질 증후군은 사이토킨 생산, 지질-대사 및 단백질가수분해-유도 인자들의 방출 및 중간 매사의 변경등에 영향을 준다. 식욕부진은 흔한 것이기는 하나 음식 섭취 감소만으로는 암 환자에서 볼 수 있는 신체 조성의 변화를 설명할 수 없고, 영양 섭취 증가는 소모성 증후군을 역전시킬 수 없다. 질병이전 체중의 5%이상이 6개월이내에 비자발적으로 감소되는 경우, 암환자에서 악액질을 의심해야 한다.
성쥐(adult mouse)에서 GDF8의 전신 과다발현으로 악액질 증후군 사람 환자에서 볼 수 있는 것과 유사한 상당한 근육 및 지방 손실을 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에(Zimmers et al., supra), 약학 조성물로써 당해 ActRIIB 폴리펩티드는 근육 생장을 시켜야 하는 악액질 증후군의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키는데 유익하게 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 골 및/또는 연골 형성을 유도, 골 손실 예방, 골 미네랄화의 증가 또는 골의 탈미네랄화의 예방 방법을 제공한다. 예를 들면, 당해 ActRIIB 폴리펩티드 및 확인된 화합물은 사람 및 다른 동물에서 골다공증 치료, 골절의 치료 및 연골 결함 치료에 이용된다. ActRIIB 폴리펩티드는 골다공증 발생에 대응하는 보호 수단으로써 준임상적 낮은 골밀도로 진단을 받은 환자들에 유용할 수도 있다.
한 가지 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 사람 및 다른 동물들에서 뼈 골절 및 연골 결함을 치료하는데 의학적 유용성을 가진다. 당해 방법 및 조성물은 단순 골절 뿐만 아니라 개방골절 감소에 예방학적 용도를 가지며, 인공 관절의 고정을 개선시키는데에도 유용할 것이다. 골형성 물질에 의해 유도된 처음 골 형성은 본태성, 외상에 의해 유도된 또는 종양 절단에 의해 유도된 두개안면(craniofacial) 결함의 치료에도 기여하며, 또한 미용성형에도 유용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법 및 조성물은 치주질환 치료 및 다른 치아 치료 과정에도 이용될 수 있을 것이다. 특정 경우에, 당해 ActRIIB 폴리펩티드는 뼈-형성 세포를 끌어들이는 환경 또는 뼈-형성 세포의 전구세포 분화를 유도하는 환경을 제공할 수도 있다. 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 골다공증 치료에도 유용할 것이다. 추가로, ActRIIB 폴리펩티드는 골관절염 예방/역전 및 연골 결함 치료에도 이용될 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 골절과 연골 및/또는 골 결함 또는 치주염 질환과 연관된 다른 질환의 치료를 위한 치료 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상처 치유 및 조직 재생을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상처 다임에는 화상, 자상 및 궤양이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. PCT Publication No. WO84/01106. 이와 같은 조성물은 본 발명의 최소 한 가지 ActRⅡB 폴리펩티드의 치료요법적 효과량과 약학적으로 수용가능한 비이클, 캐리어 또는 매트릭스와 혼합된 것으로 구성된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법과 조성물은 골다공증, 부감상선기능항진증(hyperparathyroidism), Cushing 질환, 갑상샘중독증(thyrotoxicosis), 만성 설사 상태 또는 흡수불량(malabsorption), 신세뇨관성 산증(renal tubular acidosis), 또는 신경성 식욕감퇴와 같은 골 손실의 원인이 되는 이상에 이용될 수 있을 것이다. 많은 사람들은 저체중을 가진 그리고 앉아서 생활을 하는 여성은 골다공증(골 미네랄 밀도 감소는 골절 위험을 증가시킴)에 위험을 가진다는 것으로 알고 있다. 그러나, 골다공증은 특정 약물의 장기간 복용으로부터도 발생될 수 있다. 약물 또는 다른 의학적 이상으로 인한 골다공증을 이차성 골다공증이라 한다. Cushing 질환으로 알려진 상태에서, 신체에 의해 생산되는 코르티졸의 과량이 골다공증 및 골절을 결과한다. 이차 골다공증과 연관된 가장 흔한 약물이 코르티코스테로이드로써, 아드레날린에 의해 자연적으로 생산되는 호르몬인 코르티졸과 같은 작용을 하는 약물류이다. 적절한 수준의 갑상선 호르몬(갑상선에 의해 생산됨)은 골근육 발생에 필수적이나, 과량의 갑상선 호르몬은 시간이 경과함에 따라 골량을 감소시킬 수 있다. 신장에 문제가 있는 사람, 특히 투석을 하는 사람이 알루미늄을 포함하는 제산제를 과량으로 복용하면 골량이 감소된다. 2차성 골다공증의 원인이 되는 다른 약물에는 발작을 예방하는데 이용되는 페니토인(Dilantin)과 바르비튜레이트; 관절염, 암 및 면역 질환용 약물인 메토트렉세이트(methotrexate)(Rheumatrex, Immunex, Fo lex PFS); 일부 자가면역 질환 치료 및 기관 이식 환자에서 면역계를 억제하는데 이용되는 약물인 사이클로스포린(cyclosporine)(Sandimmune, Neoral); 전립선 암 및 자궁내막증을 치료하는데 이용되는 황체화호르몬-방출 호르몬 항진제(Lupron, Zoladex); 항-응혈 약물인 헤파린(Calciparine, Liquaemin); 그리고 고콜레스테롤을 치료하는데 이용되는 콜레스티라민(Questran) 및 콜레스티폴(Colestid)이 포함된다. 치주농주(Gum disease)는 구강에서 유해한 박테리아가 우리 몸이 이 박테리아들에 대항하도록 하여 골 손실의 원인이 된다. 세균은 잇몸에서 독소와 효소를 생산하여 만성 감염의 원인이 된다. 추가 구체예에서, 본 발명은 비정상적인 또는 원하지 않는 뼈 생장과 연관된 질환 또는 질병을 치료하는 방법 및 치료제를 제공한다. 예를 들면, 진행성 골화성 섬유형성이상(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP))으로 알려진 질환을 가진 환자는 어떠한 움직임도 못하게 하는 비정상적인 “제2골격(second skeleton)”이 자란다. 추가로, 비정상적인 골 생장이 엉덩이 대체 수술후에 발생되어 외과적 결과를 파괴한다. 본 발명의 방법 및 조성물이 치료요법적으로 유용할 수 있는 상황 및 병리학적 빼 생장의 가장 흔한 예가 된다. 동일한 방법 및 조성물은 비정상적인 뼈 생장(예를 들면, 외상, 화상 또는 척수 손상후 뼈의 병인적 생장)을 치료하는데도 유용할 수 있고, 전이성 전립선 암 또는 골육종과 연관된 비정상적 골 생장과 연관된 바람직하지 못한 상태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 이와 같은 치료제의 예시로는 ActRⅡB 리간드(가령, BMP7)의 기능을 길항하는 ActRIIB 폴리펩티드, ActRIIB와 이의 리간드 (예를 들면, BMP7) 사이에 상호작용을 파괴하는 화합물, ActRⅡB 수용체에 결합할 수 없는 ActRⅡB 리간드(예를 들면, BMP7)와 같은 ActRIIB 수용체에 특이적으로 결합하는 항체가 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 동물에서 신체 지방 함량을 조절하고, 이와 관련된 이상을 치료 또는 예방, 특히, 이와 연관된 건강을 손상시키는 이상을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 체중 조절(제어)는 체중의 증가 또는 감소, 체중증가률의 증가 또는 감소, 또는 제중 손실율의 증가 또는 감소 및 체중을 활동적으로 유지 또는 급격하게 변하지 않게 하는 것(가령, (외부 또는 내부 영향에 대항하여, 그렇지 않으면 체중이 증가 또는 감소될 수 있는)이 포함된다. 본 발명의 한 구체예는 ActRⅡB 폴리펩티드를 필요로 하는 동물(가령, 사람)에게 이를 투여함으로써 체중을 조절하는 것에 관계한다.
한 특정 구체예에서, 본 발명은 동물에서 체중 감소 또는 제중 증가를 감소시키는 조성물 및 방법에 관계하는데, 특히 비만 또는 비만 위험이 있는 환자에 이를 치료 또는 경감시키는 방법 및 조성물에 관계한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 체중 증가 또는 유지가 불가능한 동물(가령, 소모성 질환을 가진 동물)을 치료하기 위한 방법 및 화합물에 관계한다. 이와 같은 방법은 체중 및 체질량을 증가 또는 체중 감소 또는 체질량 감소 또는 원하는 않게 낮은(건강하지 못한) 체중 및 또는 체질량으로 인한 또는 이와 연관된 상태를 개선시키는데 효과적이다.
ActRⅡB 단백질로 치료될 수 있는 고 콜레스테롤을 포함하는 다른 질환도 실시예에서 설명한다.
7. 제약학적 조성물
특정 구체예에서, 본 발명의 화합물(가령, ActRIIB 폴리펩티드)은 제약학적으로 허용되는 담체로 제제화된다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드는 단독으로, 또는 제약학적 제형(치료 조성물)의 한 성분으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 의학 또는 수의학에 이용하기 편의한 방식으로 투여를 위하여 제제화된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 이식물(implant) 또는 장치로서 전신적으로 또는 국소적으로 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 투여될 때, 본 발명에 이용되는 치료 조성물은 당연히, 발열원-없는, 생리학적으로 허용되는 형태를 취한다. 추가로, 본 발명의 조성물은 조직 손상을 가진 부위와 같은 표적 조직 부위(가령, 뼈, 연골, 근육, 지방 또는 뉴우런)으로 운반하기 위해 캡슐화 또는 점성형으로 주사될 수도 있다. 국소 투여는 상처 치료 및 조직 재생에 적절하다. 앞서 기술된 바와 같은 조성물에 임의적으로 포함되는, ActRIIB 폴리펩티드 이외의 치료제는 본 발명의 방법에서, 본 발명의 화합물(가령, ActRIIB 폴리펩티드)과 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 표적 조직 부위(가령, 골수)로의 하나 또는 그 이상의 치료 조성물(예를 들면 ActRⅡB 폴리펩티드)를 운반할 수 있는 기반(matrix)을 포함하며, 이는 발달중인 조직에 대한 구조물을 제공하고 최적으로, 체내 재흡수될 수 있다. 가령, 기반은 ActRIIB 폴리펩티드의 느린 방출(slow release)을 제공한다. 이런 기반은 다른 이식된 의학 적용에 현재 이용되고 있는 물질로 형성될 수 있다.
기반 물질의 선택은 생체적합성(bibcompatibility), 생물분해성(biodegradability), 기계적 특성, 미용적 외관(cosmetic appearance) 및 접촉면 특성(interface property)에 기초한다. 본 발명의 조성물의 특정 적용은 적절한 제형을 정의할 것이다. 이들 조성물에 적합한 잠재적인 기반은 생물분해가능하고 화학적으로 정의된 황산칼슘(calcium sulfate), 트리칼슘포스페이트(tricalciumphosphate), 수산화인회석(hydroxyapatite), 폴리락트산(polylactic acid)과 폴리안하이드라이드(polyanhydride)이다. 다른 잠재적인 물질은 생물분해가능하고 생물학적으로 충분히 정의된 물질, 예를 들면, 골 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 기반은 순수한 단백질 또는 세포외 기반 성분으로 구성된다. 다른 잠재적인 기반은 생물분해불가능하고 화학적으로 정의된 물질, 예를 들면, 소결된 수산화인회석(sintered hydroxyapatite), 생체유리(bioglass), 알루민산염(aluminate), 또는 다른 세라믹이다. 기반은 앞서 언급된 유형의 물질의 조합, 예를 들면, 폴리락트산과 수산화인회석, 또는 콜라겐과 트리칼슘포스페이트로 구성될 수도 있다. 생체세라믹(bioceramic)은 칼슘-알루민산염-인산염(calcium-aluminate-phosphate)에서처럼 조성(composition), 그리고 구멍 크기, 입자 크기, 입자 형태와 생물분해성(biodegradability)을 변경하는 가공(processing)에서 변경될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 예로써, 캡슐, 교갑(cachet), 알약(pill), 정제(tablet), 마름모꼴 정제(lozenge)(방향성 기부(flavored basis), 통상적으로, 수크로오스(sucrose)와 아카시아(acacia) 또는 트랜거캔스(tragacanth) 이용), 분말, 과립, 또는 수용성이나 비-수용성 액체에 녹인 용액이나 현탁액, 또는 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 향정(pastille)(불활성 기부(inert base), 예를 들면, 젤라틴(gelatin)과 글리세린(glycerin), 또는 수크로오스와 아카시아 이용) 및/또는 구강세정제(mouth wash) 등의 형태로 경구 투여될 수 있는데, 이들 각각은 미리 결정된 양의 작용제를 활성 성분으로 함유한다. 작용제는 거환약(bolus), 연질약(electuary) 또는 페이스트(paste)로 투여될 수도 있다.
경구 투여용 고형 약형(캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 본 발명의 하나 이상의 치료 화합물은 한가지이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 구연산나트륨 또는 이인산칼슘 및/또는 (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 또는 규산; (2) 접착제, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스, 또는 아카시아; (3) 습윤제, 예를 들면, 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들면, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자나 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 또는 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀; (6) 흡수 가속화제, 예를 들면, 4급 암모늄 화합물; (7) 보습제, 예를 들면, 세틸 알코올과 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들면, 고령토와 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들면, 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 라우릴 설페이트, 또는 이들의 혼합물; (10) 착색제와 혼합된다. 캡슐, 정제와 알약의 경우에, 제약학적 조성물은 완충제를 함유할 수도 있다. 유사한 유형의 고형 조성물은 또한, 락토오스 또는 유당과 같은 부형제 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용한 연성과 경성-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로 사용될 수 있다.
경구 투여용 액체 제형에는 제약학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽과 엘릭시르가 포함된다. 활성 성분 이외에, 액체 제형은 당분야에 통상적으로 이용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 다른 용매, 용해제(solubilizing agent)와 유화제(emulsifier), 예를 들면, 에틸 알코올(ethyl alcohol), 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol), 에틸 카보네이트(ethyl carbonate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 점(germ), 올리브, 피마자와 참깨 기름), 글리세롤(glycerol), 테트라하이드로푸릴 알코올(tetrahydrofuryl alcohol), 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 지방산 에스테르(fatty acid ester), 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제와 현탁제, 감미료, 조미료, 착색제, 방향제, 보존제 등과 같은 어쥬번트를 함유할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물 이외에, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올(ethoxylated isostearyl alcohol), 폴리옥시에틸렌 소르비톨(polyoxyethylene sorbitol)과 소르비탄 에스테르(sorbitan ester), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타하이드록시드(aluminum metahydroxide), 벤토나이트(bentonite), 아가-아가(agar-agar)와 트랜거캔스(tragacanth), 이들의 혼합물 등과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
여기에서 설명되는 특정 조성물은 국소적으로 피부 또는 점막으로 투여될 수 있다. 국조 제제물에는 피부 또는 각질층 침투 강화제로 효과가 있는 것으로 알려진 다양한 물질 하나 또는 그 이상이 추가 포함될 수 있다. 이들 예로는 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세타미드, 디메틸포름아미드, 프로필렌 글리콜, 메틸 또는 이소프로필 알코올, 디메틸 설폭시드 및 아존등이 포함된다. 미용적으로 수용가능하도록 조제물을 만들기 위해 추가 물질이 포함될 수도 있다. 이의 예로는 지방, 왁스, 오일, 염료, 향료, 보존제, 안정화제 및 표면 활성제가 있다. 당분야에 공지된 케라틴 용해물질도 포함될 수 있다. 예로 살리실산 및 황이다.
국소 또는 경피 투여를 위한 약형에는 분말, 분무, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 패취, 용액 및 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은 약학적으로 수용가능한 캐리어와 함께 멸균 상태에서 혼합될 수 있고, 필요한 경우, 임의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합될 수도 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔에는 본 발명의 당해 화합물(예를 들면, ActRⅡB 폴리펩티드)이외에 부형제, 예를 들면, 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트랜거캔스, 셀룰로오즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석, 산화아연 또는 이의 혼합물이 추가 포함될 수 있다.
분말 및 분무에는 당해 화합물에 추가로 락토즈, 활석, 유산 수산화 알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이의 혼합물과 같은 부형제가 포함될 수 있다. 분무에는 추가로 클로로플로오르탄화수소와 같은 통상의 추진제, 휘발성 비치환된 탄화수소 예를 들면 부탄 및 프로판이 포함될 수 있다.
특정 구체예에서, 비경구(parental) 투여에 적합한 제약학적 조성물은 하나 이상의 제약으로 허용되는 무균 등장성 수용액이나 비-수용액, 분산액(dispersion), 현탁액(suspension)이나 에멀젼(emulsion), 또는 사용 직전에 무균 주사가능 용액이나 분산액으로 재구성되는 무균 분말(sterile powder)과의 조합으로 하나 이상의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하고, 항산화제(antioxidant), 완충제(buffer), 정균제(bacteriostat), 의도된 수용자의 혈액과 제형이 등장성이 되도록 하는 용질, 현탁제, 또는 농후제(thickening agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물에 이용될 수 있는 적절한 수성과 비-수성 담체의 실례에는 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일(vegetable oil)(가령, 올리브 오일(olive oil)), 그리고 주사가능 유기 에스테르(injectable organic ester)(가령, 올레인산에틸(ethyl oleate))가 포함된다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅 물질의 이용에 의하여, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의하여, 그리고 계면활성제의 이용에 의하여 유지될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 어쥬번트를 포함할 수 있다. 미생물의 작용을 방지하기 위해 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 및 이와 유사한 것을 포함시킬 수 있다. 또한 설탕, 염화나트륨 및 이와 유사한 등장성 물질을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사용 약학 형태의 연장된 흡수를 위해 지연 흡수제 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 물질을 포함시킬 수도 있다.
투약 섭생은 본 발명의 당해 화합물(가령, ActRⅡB 폴리펩티드)의 작용을 수정시킬 수 있는 다양한 인자를 고려하여 결정될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 다양한 인자들은 치료될 질환에 따라 달라질 수 있을 것이다. 근육 질환의 경우에는 형성되는 근육의 양, 질병에 의해 영향을 받은 근육, 퇴화된 근육의 상태, 환자의 나이, 성별, 식이, 투여 시간 및 다른 임상 인자들을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 최종 조성물에 다른 공지의 생장인자의 추가가 약량에 영향을 줄 수 있다. 진행 과정은 강도 테스트, MRI를 통한 근육 크기 평가 및 근육 생검 분석과 같은 근육 생장 및/또는 재생의 주기적 평가로 모니터될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 ActRⅡB 폴리펩티드는 상이한 시간대에(연속적으로 또는 겹치게) 또는 동시(함께) 투여될 수 있다. 또한, ActRⅡB 폴리펩티드는 다른 타입의 치료요법제, 예를 들면, 연골-유도 물질, 골-유도 물질, 근육-유도 물질, 지방-감소 또는 신경-유도물질과 함께 투여될 수 있다. 두 가지 타입의 화합물이 동시에 또는 다른 시간대에 투여될 수도 있다. 본 발명의 ActRⅡB 폴리펩티드는 다른 치료제와 조화롭게 또는 시너지 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대한다.
특정 구체예에서, 다양한 골생성, 연골-유도 및 뼈 유도 인자들을 설명하고 있는데, 특히 비스포스포네이트를 설명한다. 유럽 특허 출원 Nos. 148,155 및 169,016. 예를 들면, 당해 ActRⅡB 폴리펩티드와 복합될 수 있는 다른 인자들에는 상피 생장 인자(EGF), 혈소판 유도된 생장인자(PDGF), 형질변환 생장 인자(TGF-α 및 TGF-β) 및 인슐린-유사 인자(IGF)와 같은 다양한 생장 인자를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 제시한다. 이런 요법은 앞서 열거된 바와 같은 질환을 나타내는 세포 또는 조직 내로 ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열의 도입에 의해 치료 효과를 달성하게 된다. ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산 시스템과 같은 재조합 발현 벡터를 이용하여 달성될 수 있다. ActRII 폴리뉴클레오티드 서열의 치료적 전달(therapeutic delivery)에는 표적된 리포좀(liposome)의 이용이 바람직하다.
본 명세서에 교시된 바와 같이 유전자 요법에 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스(adenovirus), 포진 바이러스(herpes virus), 우두(vaccinia), 또는 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 RNA 바이러스가 포함된다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 실례에는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV), Harvey 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 그리고 Rous 육종 바이러스(RSV)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다수의 부가적인 레트로바이러스 벡터는 복수 유전자를 통합할 수 있다. 이들 모든 벡터는 형질도입된 세포가 확인되고 산출될 수 있도록 선택가능 마커에 대한 유전자를 전달하거나 통합할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예로써, 당, 당지질(glycolipid), 또는 단백질을 부착함으로써 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용함으로써 달성된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열은 레트로바이러스 게놈 내로 삽입되거나, 또는 ActRIIB 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적인 전달을 가능하게 하는 바이러스 외피(viral envelope)에 부착될 수 있다. 한 적절한 구체예에서, 벡터는 뼈, 연골, 근육 또는 뉴우런 세포/조직으로 표적화된다.
대안으로, 조직 배양 세포는 통상적인 인산칼슘(calcium phosphate) 형질감염(transfection)에 의해, 레트로바이러스 구조 유전자 gag, pol과 env를 인코딩하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염될 수 있다. 이들 세포는 이후, 목적 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 생성된 세포는 배양 배지 내로 레트로바이러스 벡터를 방출한다.
ActRIIB 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 표적된 전달 시스템은 콜로이드성 분산 시스템이다. 콜로이드성 분산 시스템에는 거대분자 복합체, 나노캡슐(nanocapsule), 마이크로캡슐(microsphere), 비드(bead), 그리고 지질-기초된 시스템(가령, 수중유 에멀젼, 미셀(micell), 혼합된 미셀, 리포좀 등)이 포함된다. 본 발명에서 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 시험관내와 생체내에서 전달 운반체(delivery veheicle)로서 유용한 인공 막 소포(membrane vesicle)이다. RNA, DNA와 원형 비리온(virion)은 수성 내부에 내포될 수 있고, 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(참조: Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). 리포좀 소포를 이용한 효율적인 유전자 전달 방법은 당분야에 공지되어 있다(참조: Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). 리포좀의 조성은 통상적으로, 스테로이드(steroid), 특히, 콜레스테롤(cholesterol)과 조합된 인지질(phospholipid)의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질 역시 이용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도(ionic strength)와 이가 양이온(divalent cation)의 존재에 좌우된다.
리포좀 생산에 유용한 지질의 실례에는 포스파티딜(phosphatidyl) 화합물, 예를 들면, 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 스핑고지질(sphingolipid), 세레브로시드(cerebroside) 및 강글리오시드(ganglioside)가 포함된다. 예시적인 인지질에는 난 포스파티딜콜린(egg phosphatidylcholine), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 그리고 디스테아로일포스파디틸콜린(distearoylphosphatidylcholine)이 포함된다. 또한, 리포좀의 표적화는 예로써, 장기-특이성(organ-specificity), 세포-특이성(cell-specificity), 그리고 세포소기관-특이성(organelle-specificity)에 기초하고, 당분야에 공지되어 있다.
실시예
본 발명은 앞서 전반적으로 기술되었고, 아래의 실시예를 참조하면 더욱 용이하게 이해될 수 있는데, 이들 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예시하는 목적으로 포함되고 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1: ActRIIb-Fc 융합 단백질
본 발명자들은 사이에 위치하는 최소 링커로 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에 최소 링커(중간에 세 개 글리신 아미노산)와 함께 융합된 인간 ActRIIb의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 ActRIIa 융합 단백질을 작제하였다. 이들 구조체는 각각, ActRIIb-hFc와 ActRIIb-mFc로 지칭된다.
CHO 세포주로부터 정제된 ActRIIb-hFc는 하기에 도시된다(SEQ ID NO: 5):
Figure 112016100939351-pat00002
ActRIIb-hFc와 ActRIIb-mFc 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3가지 상이한 리더(leader) 서열이 고려되었다:
(i) 꿀벌 멜리틴(mellitin)(HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 7)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA):
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 8)
(iii) 고유: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 9).
선택된 형태는 TPA 리더를 이용하고, 아래의 가공되지 않은 아미노산 서열을 보유한다:
Figure 112016100939351-pat00003
상기 폴리펩티드는 아래의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:(SEQ ID NO: 10).
Figure 112016100939351-pat00004
Figure 112016100939351-pat00005
CHO-세포 생산된 물질의 N-말단 염기서열분석에서, -GRGEAE의 주요 서열(SEQ ID NO: 11)이 밝혀졌다. 문헌에서는 보고된 다른 구조체는 -SGR...서열로 시작된다.
정제는 예로써, 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피 중에서 임의의 순서로, 3가지 또는 그 이상을 비롯한 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다. 정제는 바이러스 여과(viral filtration)와 완충액 교환(buffer exchange)으로 완결될 수 있다.
ActRIIb-Fc 융합 단백질은 HEK293 세포 및 COS 세포에서도 발현된다. 모든 세포주로부터 얻은 재료 및 적당한 배양 조건으로 in vivo에서 근육-생성 활성을 가진 단백질을 제공할 수 있자만, 세포주 선택 및/또는 배양 조건과 연관하여 다양한 가능성이 관측되었다.
실시예 2: ActRIIb-Fc 돌연변이체 생성
출원인은 ActRIIB의 세포외 도메인에 일련의 돌연변이을 생성하여, 세포외 ActRIIB 와 Fc 도메인 사이에 가용성 융합 단백질로써 이들 돌연변이 단백질들을 생산하였다. 배경 ActRIIB-Fc 융합은 다음 서열을 가진다(밑줄은 Fc 부분)(SEQ ID NO: 12):
Figure 112016100939351-pat00006
배경 ActRIIB-Fc 단백질로 N- 및 C-말단 절두를 포함하는 다양한 돌연변이를 도입시켰다. 실시예 1에서 제시하는 데이터에 근거하여, TPA 리더와 발현되는 경우, 이들 구조체는 N-말단세린이 부족할 것으로 기대된다. 돌연변이는 PCR 돌연변이생성에 의해 ActRⅡB 세포외 도메인에서 생성된다. PCR 후에, Qiagen 컬럼을 통하여 단편들이 정제되고, SfoI 및 AgeI으로 절단하고, 겔 정제하였다. 이들 단편들은 발현벡터 pAID4 (WO2006/012627 참조)에 결찰시켜, 사람 IgGI와 융합 키메라가 만들어지도록 한다. 대장균(E. coli) DH5 알파로 형질도입시에 콜로니를 찍어내고 DNA를 분리하였다. 뮤린 구조체(mFc)의 경우, 뮤린 IgG2a을 사람 IgGI에 대체한다. 모든 돌연변이는 서열로 확인되었다.
일과성 형질감염을 통하여 HEK293T 세포에서 모든 돌연변이를 만들었다. 요약하면, 500ml 스피너(spinner)에서, HEK293T 세포는 250㎖ 용적의 Freestyle(Invitrogen)에 6x105 세포/㎖가 되도록 하여, 하룻밤동안 생장시켰다. 그 다음날, 세포를 DNA:PEI (1:1) 복합체로 최종 농도가 0.5㎍/㎖이 되도록 처리하였다. 4시간 후에, 250㎖ 배지를 추가하고, 세포를 7일간 생장시켰다. 조건화 배지는 세포를 스핀 다운시켜 수거한 후 농축시켰다. 돌연변이체는 다양한 기술을 이용하여 정제하는데, 예를 들면, 단백질 A 컬럼과 낮은 pH(3.0) 글리신 완충액으로 용출시켜 정제할 수 있다. 중화후에, PBS에 대해 투석하였다.
유사한 방법을 이용하여 CHO 세포에서도 돌연변이체를 만들 수 있다.
하기에서 설명하는 결합 검사 및/또는 생검에서 돌연변이체를 테스트하였다. 일부 경우에, 정제된 단백질보다는 조건화 배지로 검사를 실행하였다.
실시예 3. GDF-1l 및 액티빈-중개된 시그날링
A-204 리포터 유전자 검사를 이용하여 GDF-11 및 액티빈 A에 의한 시그날링에 ActRⅡB-Fc 단백질의 효과를 평가하였다. 세포주: 사람 Rhabdomyosarcoma (근육으로부터 유도). 리포터 벡터: pGL3(CAGA)12 (Described in Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091- 3100.) 도 5 참고. CAGA12 모티프는 TGF-Beta 반응성 유전자에 존재하여(PAI-I 유전자), 이와 같은 벡터는 일반적으로 Smad2와 3을 통한 시그날링 인자로 일반적으로 이용된다.
Day 1: 48-웰 플레이트상으로 A-204 세포를 나눔(split).
Day 2: 10㎍ pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA) 12(10㎍)+ pRLCMV (1㎍) 및 Fugene으로 A-204 세포를 형질 감염시킴.
Day 3: 인자 추가(배지+ 0.1 % BSA로 희석됨). 세포에 첨가하기 전 1시간 동안 인자들로 저해물질을 사전 항온처리함. 6시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, 세포를 용해시킴.
그 다음 루시페라제 검사를 한다. 임의 저해물질 없이, 액티빈A는 리포터 유전자 발현을 10배 자극하는 것으로 나타났고, ED50 ~ 2 ng/㎖이다. GDF-11: 16배 자극, ED50: ~ 1.5 ng/㎖.
ActRIIB(R64, 20-134)는 이 검사에서 액티빈, GDF-8 및 GDF-11 활성의 강력한 저해물질이다. 이 검사에서는 물론 다양한 변이체를 테스트하였다.
실시예 4. N-말단 및 C-말단 절두의 GDF-11 저해
ActRⅡB 부분 ActRⅡB-Fc(R64, 20-134)의 N-말단 및 C-말단에 절두를 만들고, GDF-11 및 액티빈의 저해물질로써의 활성을 테스트하였다. 활성은 다음과 같이 나타났다(조건화배지에서 측정됨)
C-말단 ActRIIb-hFc 절두:
IC50(ng/㎖)
GDF-11 액티빈
ActRⅡB-hFc(R64, 20-134) 45 22
ActRⅡB-hFc(R64, 20-132) 87 32
ActRⅡB-hFc(R64, 20-131) 120 44
ActRⅡB-hFc(R64, 20-128) 130 158
볼 수 있는 바와 같이, C-말단에서 세 개 절두(....PPT로 끝남), 6개(...로 끝남) 또는 그 이상의 아미노산의 절두로 분자의 활성에 세배 또는 그 이상의 감소를 결과한다. ActRⅡB 부분의 최종 15개 아미노산의 절두는 상당한 활성을 상실한다(WO2006/012627 참고).
아미노 말단 절두를 ActRIIb-hFc (R64 20- 131) 단백질의 배경에도 만들었다. 활성은 하기와 같이 나타낸다(조건화 배지에서 측정함):
N-말단 ActRIIb-hFc 절두:
IC50(ng/㎖)
GDF-11 액티빈
ActRⅡB-hFc(R64, 20-131)
(GRG...)		 183 201
ActRⅡB-hFc(R64, 21-131)
(RGE...)		 121 325
ActRⅡB-hFc(R64, 22-131)
(GEA...)		 71 100
ActRⅡB-hFc(R64, 23-131)
(EAE...)		 60 43
ActRⅡB-hFc(R64, 24-131)
(AET...)		 69 105
따라서, N-말단으로부터 2개, 3개 또는 4개 아미노산의 절두(truncations)되면 전장 세포외 도메인보다 더 활성이 큰 단백질을 생산하게 된다. 추가 실험에서 5개 아미노산 절두, ActRIIb-hFc (R64, 25-131)는 절두 안된 형과 등가의 활성을 가지며, N-말단에 추가 결손은 단백질의 활성을 지속하여 떨어뜨린다. 따라서, 최적의 구조체는 SEQ ID NO:4의 아미노산 133-134에서 종료되는 C-말단과 SEQ ED NO:4의 아미노산 22-24에서 시작되는 N-말단을 가지는 것일 것이다. 아미노산 21 또는 25에 상응하는 N-말단은 ActRIIb-hFc (R64, 20-134) 구조체와 유사한 활성을 제공할 것이다.
실시예 5. ActRIIb-Fc 변이체, 세포계 활성.
ActRIIB-Fc 단백질의 활성을 상기에서 설명하는 것과 같이 세포계 검사로 테스트하였다. 그 결과는 하기 표 3에 요약하였다. 일부 변이체는 상이한 C-말단 절두 구조체에서 테스트된다. 상기에서 논의한 바와 같이, 5개 또는 15개 아미노산 절두는 활성의 감소 원인이 된다. 놀라운 것은 L79D 및 L79E 변이체는 실질적인 액티빈 결합 상실을 보이지만, GDF-11의 야생형 저해는 거의 유지하고 있었다.
GDF11 및 액티빈A에 대한 가용성 ActRIIB-Fc 결합:
ActRⅡB-Fc
변이		 ActRⅡB의 일부
(SEQ ID NO:4의 아미노
산에 상응)		 GDF11 저해
활성		 액티빈 저해
활성
64R 20-134
 +++
(approx.10-8M KI)		 +++
(approx.10-8M KI)
64A 20-134
 +
(approx.10-6M KI)		 +
(approx.10-6M KI)
64R 20-129 +++ +++
64R K74A 20-134 ++++ ++++
64R A24N 20-134 +++ +++
64R A24N 20-119 ++ ++
64R A24N K74A 20-119 + +
R64 L79P 20-134 + +
R64 L79P K74A 20-134 + +
R64 L79D 20-134 +++ +
R64 L79E 20-134 +++ +
R64K 20-134 +++ +++
R64K 20-129 +++ +++
R64 P129S P130A 20-134 +++ +++
R64N 20-134 + +
+ 활성이 약함(거의 1 x 10-6 KI)
++ 중간 활성(거의 1 x 10-7 KI)
+++양호한(야생형) 활성(거의 1 x 10-8 KI)
++++ 야생형 활성보다 큰 활성
쥐에서 혈청 반감기에 대해 몇 가지 변이체를 평가하였다. ActRIIB(R64 20-134)-Fc는 약 70시간의 혈청 반감기를 가진다. ActRIIB(R64 A24N 20-134)-Fc는 약 100-150시간의 혈청 반감기를 가진다. A24N 변이체는 세포계 검사(위)에서 활성을 가지며, in vivo 검사(아래)에서 야생형 분자에 상응하는 활성을 가진다. 더 긴 반감기와 결합되어, 이는 시간이 경과함에 따라, A24N 변이체는 야생형 분자보다 단백질 단위당 더 큰 효과를 제공한다는 것을 의미한다.
놀라운 것은 위치 79에 산성 아미노산(아스파르트산 또는 글루타민산)을 도입시키면 GDF11/GDF8 결합은 유지되면서 선택적으로 액티빈 결합이 감소된다. 하기에서 논의하는 바와 같이, 야생형 ActRIIB-Fc 단백질는 근육이외의 조직에서 효과가 있는 것으로 나타났는데, 이 효과중 일부는 바람직하지 않을 수도 있다. 여기에서 논의된 바와 같이, 이와 같은 효과들은 아마도 액티빈을 포함하는 ActRⅡB-Fc에 결합되고, 이에 의해 저해되는 다양한 상이한 리간드와 연관이 있는 것으로 예측된다. 초기 데이터에서, 생쥐에서, L79E 및 L79D 변이체들은 근육에서는 이들의 효과를 유지시하면서 근육이외의 다른 조직에서는 효과가 감소된 것으로 나타났다. 이와 같은 변이는 ActRⅡB의 변이체로 볼 수 있기는 하지만, 이들 단백질은 더 이상 액티빈 수용체로 기능을 하지 않고, "ActRIIB" 이름은 이들 폴리펩티드의 유도체 개시물질로써만 적절하다. 위치 79에 산성 잔기는 GDF11 결합을 유지시키면서 액티빈 결합은 감소시키고, 이 위치에서 다른 변화는 이와 같은 효과를 가지지 않는다. L79A 변화는 GDF11 결합에 대해 액티빈 결합을 증가시킨다. L79P 변화는 액티빈과 GDFl1 결합 모두를 감소시킨다.
실시예 6. GDF-1l 및 액티빈 A 결합.
리간드에 대한 특정 ActRⅡb-Fc 결합을 BioCoreTM 검사에서 테스트하였다.
ActRIIB-Fc 변이체 또는 야생형 단백질은 항-hFc 항체를 이용하는 시스템상에서 포집되었다. 리간드를 주입하고 포집된 수용체 단백질 상으로 흘려보냈다. 결과는 하기 표에 요약하였다.
L79D 변이체 (감소된 액티빈 A 결합)은 근육 생장을 촉진시키는데 in vivo에서 활성이 있지만, 근육 생장량은 야생형 ActRⅡB의 것보다는 적었다는 것이 설명된다. 이와 같은 감소된 효과는 미오스타틴 결합에서 약간의 감소 또는 추가적으로 아직 알려지지 않은 근육 생장 네가티브 조절물질에 의한 결합 상실로 인한 부분적 원인이 될 수 있을 것이다. 액티빈이 생식계, 뼈, 간 및 많은 다른 조직상에 효과를 가지는 것으로 공지된 조절 분자로 널리 알려져 있기 때문에 액티빈 A 시그날링에 영향을 주지 않으면서 근육 생장을 자극하는 능력은 매우 바람직하다. 생쥐에서, ActRIIB-mFc (R64 20-134)는 생식계에 실질적인 효과의 원인이 되며, 그리고 일부 경우, 비장 크기 증가의 원인이 된다. ActRIIB-mFc (R64, L79D 20-134) 분자는 생식계 조직 및 비장에 모두 상당히 감쇠된 효과를 가지는데, 이는 이 분자가 생식적으로 활성이 있는 환자 또는 생식계에 효과를 최소화하는 바람을 가진 환자에서 근육 생장을 촉진시키는데 특히 적절할 것임을 나타낸다.
실시예 10: Mdx 생쥐에서 근육량과 강도에 ActRIIB-Fc 단백질
질병 상태에서 뮤린 ActRIIB (WT, 20-134)-Fc 단백질에 의한 근육량을 증가시키는 능력을 측정하기 위해, 출원인은 근이영양증 mdx 생쥐 모델에서 ActRIIB-Fc 단백질이 근육량을 증가시키는 능력을 측정하였다.
성쥐 Mdx를 뮤린 ActRIIB (WT, 20-134)-Fc 단백질 (1mg/kg, 3mg/kg, 또는 lOmg/kg; 복막) 또는 PBS 비이클 대조군으로 처리하였다. 생쥐가 힘변환기(force transducer)를 끄는 힘들 측정하여 앞다리 악력을 측정하였다. 5회의 당김 시도의 평균힘을 군간에 악력을 비교하는데 이용하였다. 연구 종료시 대퇴근, 비복근, 흉근 및 호흡근을 절개하여 무게를 측정하였다. 악력 측정에서 상당히 증가되었음을 알 수 있었다. 근육량 결과는 하기 표에 요약하였다.
비이클 및 뮤린 ActRIIB (WT, 20-134)-Fc-처리된 mdx 생쥐의 조직 중량
비이클-처리 비복근(L+R) 대퇴근(L+R) 흉근(L+R) 호흡근
평균(g)±Std 0.413±0.040 0.296±0.019 0.437±0.060 0.111±0.030
muActRIIB
(WT,20-134)-Fc
(10mg/kg)		 비복근(L+R) 대퇴근(L+R) 흉근(L+R) 호흡근
평균(g)±Std 0.52±0.050 0.39±0.05 0.807±0.21 0.149±0.020
테스트 p-값 0.0006 0.0006 0.002 0.05
상기 표에서 볼 수 있는 것과 같이, 뮤린 ActRIIB (WT, 20-134)-Fc 융합 단백질은 PBS-처리된 생쥐와 비교하였을 때, mdx 생쥐의 제지방중량이 증가된 것으로 나타났다. ActRIIB-Fc 처리로 비이클 대조군과 비교하였을 때, 비복근이 25.9% 증가되었고, 흉근이 85.4% 증가되었다. 임상적으로 중요한 것은 대조군과 비교하였을 때, 생쥐 ActRⅡB(WT,20-134)-Fc-처리된 생쥐의 호흡근이 34.2% 증가되었다. 이 데이터로 근이영양증 질병에 ActRⅡB-Fc 단백질의 효과가 설명된다.
추가로, ActRIIB-Fc 단백질로 처리된 mdx 생쥐는 비이클-처리된 대조군과 비요하면 증가된 악력을 나타낸다. 16주에, 1mg/kg, 3mg/kg 및 lOmg/kg ActRIIB 군은 악력이 비이클 대조군과 비교하였을 때, 각각 31.4%, 32.3%, 64.4% 증가되었다. 뮤린 ActRIIB (WT, 20-134)-Fc 처리된 군의 개선된 악력은 처리군에서 볼 수 있는 증가된 근육이 생리학적으로 관련있다는 사상을 뒷받침한다. Mdx 생쥐는 수축성 유도된 손상에 민감하고, 야생형보다는 퇴행과 재생의 사이클이 더 심각하다. 이들 근육 표현형에도 불구하고, 뮤린 ActRIIB (WT, 20-134)-Fc 처리로 mdx 생쥐에서 악력이 증가되었다.
Duchenne 근이영양증에서, 질병 개시는 어린이, 흔히 5살 정도로 상당히 일찍 개시된다. 따라서, 성쥐에 대해 제시한 데이터가 DMD를 가진 어린이에 ActRⅡB 분자의 효과를 반드시 반영하는 것은 아니다. 이를 설명하기 위하여, 생장기(juvenile) mdx 생쥐로 연구를 실시하였다.
ActRIIB-mFc (R64, 20-134) 처리로 생장기(4주령) C57BL/10 mdx 생쥐에 체중이 상당히 증가되었다. in vivo NMR 스펙트로스코피를 이용한 신체 성분 분석에서 상당한 체중 증가와 수반하여 제지방체중이 증가된 것으로 나타났다.
ActRIIB-mFc (R64, 20-134) 처리된 C57BL/10 생쥐는 35.2% 제지방체중이 증가되었고, 처리된 mdx 군은 이들 대조군보다 48.3%이상의 제지방체중이 증가되었다. 또한, 강도에 대한 ActRHB-mFc (R64, 20-134) 처리 효과를 평가하였다. 비이클 처리된 mdx 생쥐 악력은 비이클 C57BL/10 군보다는 15.7% 더 낮고, 이는 디스트로핀 결핍과 연관된 근육 쇠약을 설명한다. 대조적으로, ActRIIB-mFc (R64, 20-134) 처리된 mdx 생쥐는 mdx 비이클 군과 비교하였을 때 악력이 개선되었고, C57BL/10 비이클 생쥐를 억제하는 악력 측정을 하였는데, 처리된 C57BL/10 악력 수치 수준에 도달하였다(비이클 mdx: 0.140 ± 0.01 KgF; 처리된 mdx: 0.199 ± 0.02 KgF; 비이클 C57BL/10: 0.166 ± 0.03; 0.205 ± 0.02 KgF). 놀라운 것은 처리로 인하여 생장기 mdx 생쥐를 야생형 악력 수준으로 복귀시켰다. 따라서, ActRIIB-mFc (R64, 20-134) 분자는 Duchenne 근이영양증, 특히 질병 개시에 근접한 연령대의 청소년 환자에 임상학적으로 중요한 용도를 가질 것이다. 실시예 11: SOD1 생쥐에서 강도 및 생존에 있어서 ActRIIB - Fc 단백질의 효과
ALS 생쥐 모델에서 강도 및 생존 증가에 대한 ActRIIB 폴리펩티드 능력을 평가하기 위하여, SOD1 생쥐에서 ActRIIB-Fc 단백질을 테스트하였다.
B6.Cg-Tg(SODl-G93A)lGur/J, 또는 SODl, 생쥐는 사람 슈퍼옥시드 디스무타제 전이유전자의 돌연변이 대립형질 수를 많이 가지고 있다. 이와 같은 단백질을 높은 수준으로 보유하면 사람 질환 ALS와 필적되는 표현형을 생쥐에 제공한다. SODl 생쥐는 상행마비(ascending paralysis)가 일어나며 91일경에 질병의 조기 징후가 나타난다. 이 질환으로 19-23주령 나이에 요절한다.
SODl 생쥐에 10주령시점에서 비이클 대조군 또는 ActRIIB-mFc (K74A 20-134) (i.p., 5mg/kg, twice/week)을 제공한다. 생쥐가 힘변환기(force transducer)를 끄는 힘들 측정하여 앞다리 악력을 측정하였다. 5회의 당김 시도의 평균힘을 군간에 악력을 비교하는데 이용하였다. 생존은 생쥐의 출생일과 측면으로 눕힌 후 30초 이내에 스스로 바로 일어날 수 없는 날의 수로 계산된다. 도 7에서는 악력 측정을 보여주고, 도 8에서는 생존 데이터를 설명한다. 질병의 말단 단계에 생쥐는 마비가 진행되고, 빗질하지 않은 것처럼 털을 깔끔하게 하는 것이 어렵게 된다. 생쥐 관찰로, PBS 군과 비교하였을 때, 질병의 마지막 단계에서 조차도 뮤린 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc 처리군은 깔끔하게 정리가 잘된 외양을 나타낸다. 이와 같은 관찰로 처리된 생쥐는 대조군보다는 건강과 더 나은 삶의 질을 유지하는데 더 우위에 있다는 것을 말해준다.
도 7에서 볼 수 있는 것과 같이, 뮤린 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc 처리를 받은 SODl 생쥐는 PBS 대조군과 비교하여 상당히 더 큰 악력을 보인다. 이는 질병의 초기 단계인 117일째와 질병이 진행된 149일째에도 볼 수 있다. 도 8에서는 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc 처리된 생쥐는 비이클 대조군보다 상당히 오래 생존하였다. 본 연구는 생쥐의 강도 및 생존을 개선시키는데 있어서 ALS 생쥐 모델에서 뮤린 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc의 용도를 설명한다.
SODl 생쥐에서 유사한 실험을 실행하였으나, 전체적으로 질병 개시를 감지가능할 때까지 처리를 지연하여(130일) 심각한 질병 징후가 개시된 후에 사람 ALS 치료와 더 유사하게 하였다. 130일째, SODl 생쥐를 비이클 (변형된 TBS) 또는 ActRIIB (R64 20-134)-mFc (10mg/kg) 처리군으로 나눈다. 생쥐의 피하로 주당 1회씩 투여하였다. 생쥐를 -1일과 27일(각 129일과 157일령)에 NMR 스캔하였다. 악력 측정은 연구 0일과 20일에 실행하였다. 연구 종료시에, 수컷 대조군은 연구 0일에 4.3% 체중이 감소되었으나, 처리군은 0일에 7.8% 체중 증가가 있었다. 암컷 대조군은 1.5% 감소가 있었고, 처리군은 0일에 15% 증가가 있었다.
SODl 악력 측정
0일 20일
수컷 대조군 0.149±0.02 0.097±0.02a
수컷 ActRIIB
(R64 20-134)-mFc		 0.147±0.02 0.128±0.02a,b
암컷 대조군 0.130±0.02 0.091±0.02a
암컷 ActRIIB
(R64 20-134)-mFc		 0.128±0.01 0.11±0.02b
암수 SODl 생쥐에서 0일과 20일에 악력 측정. 윗첨자 "a"는 0일 측정과 비교하였을 때 상당한 차이를 나타낸다(p <0.05). 윗첨자 "b"는 20일날 PBS (Group 1) 와 ActRIIB (R64 20- 134)-mFc (Group 2)사이에 상당한 차이를 나타낸다(p <0.05).
생쥐는 처리로 인한 신체 조성에서 변화를 결정하기 위해 NMR 스캔하였다. 수컷 대조군 생쥐는 연구 과정동안에 이들의 제지방체중 6.0%를 상실하였고 (day -1: 18.2 g ± 1.28; day 27: 17.1 g ± 1.10), 수컷 처리된 생쥐는 연구 0일의 제지방체중의 9.1% 가 증가되었다(day -1: 19.17 g ± 0.77; day 27: 20.92 g ± 0.74). 암컷 대조군 생쥐는 연구 시작시보다 제지방체중이 0.83% 감소되었고(day -1: 13.18 g ± 0.84; day 27: 13.08 g ± 0.71), 암컷 처리된 생쥐는 연구 0일의 체중에 10.7% 증가되었다(day -1 : 13.66 g ± 0.83; day 27: 15.12 g ± 1.21). 수컷과 암컷 처리된 군은 이들의 각 PBS 대조군과 비교하였을 때 제지방체중이 상당히 증가되었다(p <0.001).
ActRIIB (R64 20-134)-mFc의 SODl 근육 효과
비복근(L+R) 대퇴근(L+R) 흉근(L+R)
수컷 대조군 0.18±0.03 0.12±0.03 0.20±0.04
수컷 ActRIIB
(R64 20-134)-mFc		 0.22±0.04 0.15±0.02 0.30±0.04
암컷 대조군 0.13±0.02 0.089±0.016 0.11±0.01
암컷 ActRIIB
(R64 20-134)-mFc		 0.17±0.01 0.01±0.02 0.15±0.05
이들 데이터로부터 ActRIIB-Fc 처리는 근육 기능 개선과 삶의 질을 개선시키는데 있어서, 활성 ALS를 가진 환자 치료에 유익할 것이다는 것이 설명된다.
실시예 12: 비만 생쥐에서 지방세포 및 당뇨에 ActRIIB - Fc 단백질 효과
출원인은 비만 생쥐 모델에서 지방세포를 감소시키는데 ActRⅡB-Fc의 능력을 측정하기 위해 고지방식이(HFD)-공급된 생쥐에서 ActRⅡB-mFc 단백질을 테스트하였다.
타입 II 당뇨병은 비만의 주요 합병증으로 인슐린 저항성을 특징으로 한다. 공복의 상승된 인슐린 수준이 인슐린 저항성의 지표이며, 동물이 인슐린 저항성 상태인지를 테스트하는 수단을 제공한다. 출원인은 비만 생쥐 모델에서 공복시 인슐린 수준을 표준화시키는데 있어서 뮤린 ActRⅡB (R64 K74A 20-134)-Fc의 효과를 테스트하였다.
HFD-공급된 C57BL/6 생쥐는 35% 지방으로 구성된 식이를 유지하였고, 이들의 체중이 표준 식이(4.5% 지방)를 제공받은 동일한 나이대 생쥐 체중보다 약 50%더 많을 경우 비만으로 간주하였다. 비만 생쥐에 비이클 대조군 또는 사람 ActRIIB (R64 K74A 20-134)-Fc (lOmg/kg; i.p.)을 주당 2회씩 제공하였다. 투약시작 및 3주후에 신체 조성의 변화를 결정하기 위해 비만 생쥐를 NMR 스캔하였다. 도 9에서 기저 수준으로부터 신체 조성의 변화를 요약하였다.
HFD-공급된 생쥐는 이들의 체중이 표준 식이를 제공받은 동일한 나이대 생쥐 체중보다 약 50%더 많을 경우 비만으로 간주하였다. HFD-공급된 생쥐에 비이클 대조군 또는 뮤린 ActRIIB (R64 K74A 20-134)-Fc (5mg/kg; i.p.)을 35주간 주당 2회씩 제공하였다. 연구 종료시에 생쥐를 하룻밤 굶긴다. 굶김 종료시점에서, 혈액을 수거하고, 혈청 처리한다. 혈청을 이용하여 두 집단에서 공복시 인슐린 수준을 측정하였다. 비만 생쥐의 공복 인슐린 수준에 뮤린 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc의 효과를 하기 표에 요약하였다.
비이클- 및 뮤린 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc -처리된 생쥐의 공복 인슐린 수준
HFD
PBS		 HFD
뮤린 ActRIIB
(K74A 20-134)-mFc
평균(ng/㎖)±Std. dev. 2.27±1.64 0.78±0.40
ttest N/A 0.012
도 9에서는 비이클-처리된 대조군과 비교하였을 때, 뮤린 ActRIIB (R64 K74A 20-134)-Fc 군의 지방과다가 감소되었음을 보여준다. 처리된 생쥐는 이들 기저 수준과 비교하였을 때 지방이 25.9% 감소되었다. 추가로, 처리군은 이들의 기저수준이상으로 약 10.1% 제지방중량이 증가되었다. ActRIIB (R64 K74A 20-134)-mFc 지방 조직 및 제지방체중에서 변화% 는 PBS-처리군의 변화%보다 상당히 더 높았다.
이 모델에서, 생쥐는 정상 공급 대조군보다 >50%이상 과체중이 될 때까지 고지방 식이를 유지하였다. 이와 같은 체중 및 지방과다에 상당한 증가에 근거하여 이 모델은 병적으로 비만인 사람에 상응하다. 따라서, 사람 ActRIIB (R64 K74A 20- 134)-Fc 단백질로 처리하면 병적으로 비만인 사람을 치료하는데 임상적으로 상당한 연관이 있다는 것이다.
표 11에 요약된 결과에서 뮤린 ActRIIB (K74A 20-134)-Fc 단백질로 처리하면 비만과 연관된 공복시 상승된 인슐린 수준을 상당히 감소될 수 있다는 것을 제시한다. 이와 같은 발현은 타입 II 당뇨병 치료에서 ActRⅡB 폴리펩티드의 임상적 이용 가능성을 지원한다.
비만 및 당뇨병의 HFD 모델에서 ActRIIB-mFc (R64 20-134)로 추가 실험을 실행하였다. 30주령 HFD-공급된 C57BL/6 생쥐를 두 군으로 나눈다(PBS 및 lOmg/kg ActRIIB-mFc (R64 20-134)). 생쥐의 체중을 재고, 12주간 주당 2회씩 복막으로 투여하였다. 연구 0일과 94일에 NMR로 생쥐를 평가하였다.
처리된 생쥐는 0일의 체중의 1.9%를 상실하나, PBS 처리된 생쥐는 연구동안 이들 출발 BW의 6.7%가 증가되었다. 처리된 생쥐는 또한 연구 동안 PBS 군보다 제지방체중이 상당히 증가되었다 (21.1% ± 6.28 versus 3.7% ±4.08). 처리된 생쥐는 PBS 군과 비교하였을 때(+10.2 ± 10.18), 지방 조직이 상당히 상실되었다(-34% ± 10.95).
개별 근육량도 ActRIIB-mFc (R64 20-134) 처리군에서 증가되었다.
비복근(L+R) 대퇴근(L+R) 흉근(L+R)
PBS
0.33±0.05
 0.18±0.03 0.31±0.05
ActRIIB-mFc
(R64 20-134)		 0.44±0.08* 0.25±0.02* 0.44±0.13*
*p<0.05
이들 생쥐에서 ActRⅡB-Fc 처리와 관련된 지방 및 근육에서 유익한 효과에 추가하여, 혈청 지질에서도 포지티브 효과가 관찰되었다. 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준이 상당히 감소되었는데, 이는 ActRIIB-Fc 융합 단백질이 환자에서 이와 같은 지질 수준을 감소시키는데 이용될 수 있는 것으로 제안된다.
실시예 13: 악액질( Cachectic ) 생쥐의 근육량에 ActRIIB - Fc 단백질 효과
글루코코르티코이드(glucocorticoid)-유도된 근소모 생쥐 모델에서 근소모를 감쇠시키는 ActRIIB (R64 20-134)-mFc의 능력을 테스트하였다.
생쥐의 피하로 13일간 PBS 또는 덱사메타손(2mg/kg)을 매일 투여하여 근소모를 유도하였다. 동일한 13일에 걸쳐, PBS- 및 덱사메타손 처리된 군에는 비이클 또는 ActRIIB (R64 20-134)-mFc (10mg/kg; i.p.; twice/week)를 제공하여 모든 처리의 복합이 제시되도록 하였다. 0일과 13일에 군간에 제지방체중에 변화를 확인하기 위해 NMR 스캔하였다. NMR 결과는 표 13에 제시한다.
비이클- 및 뮤린 ActRIIB (R64 20-134)-Fc -처리된 생쥐에서 제지방체중
군
(sc:ip 처리)		 Ave. lean day 13-
Avg lean day 0
(g)±std dev
PBS:PBS 0.83±0.94
덱사메타손:PBS 0.47±0.34a
덱사메타손:ActRIIB 2.56±0.37a,b
PBS:ActRIIB 3.63±0.62a
a. p<0.05에서 PBS:PBS와 비교하였을 때 유의적 차이
b. p<0.05에서 덱사메타손:PBS와 비교하였을 때 유의적 차이
NMR 스캐닝에서 PBS:PBS 군과 비교하였을 때, 덱사메타손:PBS 군에서 제지방체중이 2.5% 감소되는 것을 확인하였다. 대조적으로, 덱사메타손: ActRIIB (R64 20-134)-mFc 군은 PBS:PBS 군과 덱사메타손:PBS 군과 비교하였을 때 제지방체중이 13.5% 상당히 증가되었다. 악액질은 만성 글루코코르티코이드 요법을 포함하는 다양한 치료에 상당한 부작용이다. 따라서, 사람 ActRIIB (R64 20-134)-mFc 단백질을 이용한 처리는 악액질과 연관된 근소모를 감소시키는 임상적 중요성이 있다.
실시예 14: 난소절제한 생쥐 또는 나이든 생쥐에서 근육량과 비만에 ActR ⅡB-Fc 효과
근육감소증(Sarcopenia)은 건강한 사람에서 노화에 따른 근육 상실의 형태이다. 이 질환은 골근육량의 점진적 상실, 손상된 강도 및 운동성과 연관된다. 근육감소증의 원인은 잘 알려지지 않고 있다. 여성의 경우, 폐경이 근육 손실을 가속화시키고, 이는 골 손실 만큼 발생된다. 따라서, ActRIIB (R64, 20-134)-mFc을 상당히 나이든 (2년령) 생쥐와 난소제거 생쥐 (폐경후 모델)에서 테스트하였다.
8-주령 C57BL/6 암컷 생쥐를 연구 시작 전에 난소제거하거나(OVX) 허위(sham) 수술한 후 16주령까지 키운다. 연구 시작 시에, 허위 및 OVX 생쥐를 각각 처리군과 비이클 군으로 나눈다. 모든 군의 체중을 재고, 11주 동안 ActRIIB (R64, 20-134)-mFc 또는 완충액 대조군으로 처리한다. 신체 조성을 측정하기 위해 연구 0일과 83일에 NMR 스캔을 한다.
연구 종료시에, PBS 처리된 허위 수술 생쥐는 고유 제지방체중의 4.7%를 상실하였고, 처리군 허위 수술 생쥐는 연구 동안에 제지방체중의 21%가 증가되었다. OVX 대조군은 이들의 고유 제지방체중의 12.1% (허위 비이클보다 더 많음)를 상실하였고, 처리군 OVX 생쥐는 연구 종료시 12.9% 증가되었다.
이러한 데이터로부터 폐경 여성의 통상적인 근육 상실을 대비하는데 ActRIIB-Fc 융합 단백질이 이용될 수 있음을 나타낸다.
자연 노령 집단에서 ActRIIB-Fc 효과를 평가하기 위해, 수컷 C57BL/6 생쥐를 처리 시작전에 70주령까지 나이를 먹게 둔다. 생쥐를 두 군으로 나눈다(PBS와10mg/kg ActRIIB (R64, 20-134)-mFc. 각 군의 체중을 측정하고, 10주간 2X/week 투여한다. 연구 과정 동안 처리된 군은 PBS 군보다 제지방체중이 상당히 증가되었다.
제지방체중의 변화% PBS 10mg/kg
평균(기저수준으로부터 %) 101.76 117.27
Std dev 3.83 3.91
PBS의 P 값 <0.001
처리된 군 또한 PBS 생쥐와 비교하였을 때 개별 근육량이 상당히 높았다.
근육량 비복근(L+R) 대퇴근(L+R) 흉근(L+R)
PBS
0.283±0.07
 0.156±0.01 0.241±0.07
ActRIIB-mFc
(R64 20-134)		 0.371±0.03* 0.192±0.021* 0.330±0.05*
*p<0.05
처리군에서 근육 통합성(Muscle integrity)은 PBS 군의 것보다 더 큰 것으로 나타나는데, 외견상 근육내 지방이 감소되고, 세포구축(cytoarchitecture)도 개선된다(도 10 참고).
이와 같은 데이터로 ActRⅡB-Fc 융합 단백질은 남성과 여성에서 노화에 따른 근 소모를 치료하는데 이용될 수 있을 것이라는 것을 설명한다.
실시예 15: 거세와 관련된 근손실에서 ActRIIB - Fc의 효과
전립선 암은 통상 항-안드로겐 요법으로 치료된다. 이와 같은 치료의 부작용은 근육 상실과 비만 증가를 포함한다. 거세된 생쥐도 유사한 변화를 겪는데, 이것은 이와 같은 임상 세팅에 ActRⅡB-Fc의 잠재력은 연구하는데 좋은 모델이 된다.
8주령의 수컷 C57BL/6 생쥐를 거세하거나 허위 수술후 3주간의 회복기를 거친후 연구를 시작하였다. 허위 수술 및 거세된 군을 추가로 PBS 및 ActRIIB (R64, 20-134)-mFc (lOmg/kg) 군으로 하위 분류하였다. 생쥐의 체중을 측정하고, 12주간 피하 투여하였다(주당 1회). 연구 0일과 83일에 생쥐를 NMR 스캔하였다.
연구 과정동안, 허위 수술 PBS 생쥐는 연구 0일의 제지방체중의 9.72% ± 3.67가 증가되었고, 허위 수술 ActRIIB (R64, 20-134)-mFc 생쥐는 연구 0일의 제지방체중의 35.79% ± 3.1가 증가되었다. 거새된 PBS 처리된 생쥐는 연구 0일의 제지방체중의 8.1% ± 4.22를 상실하였고, 처리된, 거세 생쥐는 17.77% ± 3.86가 증가되었다. 추가적으로, 거세는 지방 과다를 증가시켰지만, ActRIIB (R64, 20-134)-mFc 처리로 지방 증가량 정도를 감소시키는데 도움이 되었다.
거세된 비이클 생쥐의 비복근 및 흉근은 허위 수술된 PBS 생쥐보다 적었다(거세 비복근: 0.275 ± 0.03g, 거세 흉근: 0.196±0.06g; 허위 비복근: 0.313±0.02g, 허위 흉근: 0.254±0.03g). ActRIIB (R64, 20-134)-mFc 처리로 근육량에서 거세로 인하여 유도된 감소를 상당히 감쇠시켰다(거세 비복근: 0.421 ± 0.03g, 거세 흉근: 0.296±0.06g).
실시예 16: 암 악액질에 ActRIIB - Fc 효과
대부분 종양은 식욕 상실 및 심각한 근 손실과 연관된다. 악액질을 보이는 환자는 비-악액질 환자보다 예후가 더 나쁘다. 결장 암 세포주 CT26는 생쥐에서 심각한 악액질을 유도한다. 이종이식-유도된 악액질(xenograft-induced cachexia)에서 효과를 위해 이 모델에서 ActRIIB(R64 20-134)를 테스트하였다.
실험에는 다음과 같이 6군의 생쥐를 이용하였다:
군 종양 처리 약량 범례
1 N VEH v/v 치료
2 N ActRIIB-Fc 10mg/kg 치료
3 Y VEH v/v 치료
4 Y ActRIIB-Fc 10mg/kg 치료
5 Y ActRIIB-Fc 30mg/kg 치료
6 Y ActRIIB-Fc 10,g/kg 예방
3-6군은 피하로 5 x 106 종양 세포를 제공받았다. 6군은 주당 ActRIIB-Fc로 즉시 치료를 시작하였다. 1-5군은 종양 크기가 300-500㎣에 다다를때인 28일 경부터 투여를 시작하였다. 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, ActRⅡB-Fc는 CT26 종양과 연관된 근 손실을 상당히 감소시켰는데, 종양이 이미 자리잡은 생쥐와 종양 도입전 예방 모델에 이용하였을 때 모두에서 감소가 있었다.
실시예 17: 야생형 생쥐에서 근육량에 ActRIIB - Fc 변이체들의 효과
본 연구에서는 6 주령의 C57BL/6 수컷 생쥐에서 근육량과 다른 조직에 ActRⅡB-관련 Fc 구조체의 효과를 보여준다. 생쥐의 체중을 재고 복막으로 2주에 1번씩 PBS 또는 ActRIIB-관련 Fc 구조체(10 mg/kg)를 투여하였다:
ActRIIB (R64 20-134)-Fc
ActRIIB (L79D 20-134)-Fc
ActRIIB (L79E 20-134)-Fc
ActRIIB (A24N 20- 134)-Fc
ActRIIB (R64K 20-134)-Fc
연구 시작, 중간, 종료시에 생쥐를 NMR 스캔하였다. 대퇴근, 흉근, 비복근, 간, 신장, 비장의 중량을 측정하고 포르말린에 보관한다.
초기 데이터 분석에서, ActRIIB (R64 20-134)-Fc는 근육량 및 제지방체중의 최대 증가 원인이 되지만 다른 조직에서도 최대 효과를 가진다. L79D 및 L79E 변이체는 근육량을 다소 적게 증가시키지만 다른 조직에서는 거의 효과가 없었다. A24N 및 R64K 구조는 근육 및 다른 조직에서 중간 정도의 효과를 가진다. 이들 데이터로부터 액티빈 결합이 감소된 ActRⅡB 변이체는 바람직한 성질, 특히 근육 조직에 선택성 효과를 가진다는 것이 확인된다.
참조로서 편입
본 명세서에 언급된 모든 간행물과 특허는 순전히 참조로서 편입된다. 요부(subject matter)의 특정 구체예가 논의되긴 했지만, 상기 명세서는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 한정하지 않는다. 상기 명세서와 하기 특허청구범위를 검토한 이후에, 다수의 변이는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 특허청구범위와 이의 균등한 범위, 그리고 명세서와 이의 변이에 기준하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. <120> VARIANTS DERIVED FROM ACTRIIB AND USES THEREFOR <130> PHPH-024-WO1 <140> PCT/US2008/001506 <141> 2008-02-04 <150> 60/899,304 <151> 2007-02-02 <150> 60/927,088 <151> 2007-05-01 <150> 60/931,880 <151> 2007-05-25 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr 115 <210> 2 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser 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Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tctgggcgtg gggaggctga gacacgggag tgcatctact acaacgccaa ctgggagctg 60 gagcgcacca accagagcgg cctggagcgc tgcgaaggcg agcaggacaa gcggctgcac 120 tgctacgcct cctggcgcaa cagctctggc accatcgagc tcgtgaagaa gggctgctgg 180 ctagatgact tcaactgcta cgataggcag gagtgtgtgg ccactgagga gaacccccag 240 gtgtacttct gctgctgtga aggcaacttc tgcaacgagc gcttcactca tttgccagag 300 gctgggggcc cggaagtcac gtacgagcca cccccgacag cccccacc 348 <210> 4 <211> 1539 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtggcc cggctctggg 60 cgtggggagg ctgagacacg 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gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960 gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020 ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080 acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140 ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200 aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260 cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320 aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380 tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440 attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500 accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539 <210> 5 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 5 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 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Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 145 150 155 160 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 195 200 205 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 210 215 220 Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 245 250 255 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 300 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 305 310 315 320 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 325 330 335 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 <210> 13 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (43) <223> Asp or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (100) <223> Lys or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (212) <223> Asn or Ala <400> 13 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Xaa Val Ser His Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Xaa Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175 Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 Lys 225 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 15 His His His His His His 1 5 <210> 16 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 16 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr 20 25 30 Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn 35 40 45 Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His 50 55 60 Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys 65 70 75 80 Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys 85 90 95 Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly 100 105 110 Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro 115 120 125 Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr 130 135 140 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 145 150 155 160 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 165 170 175 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 180 185 190 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 195 200 205 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 210 215 220 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 225 230 235 240 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr 245 250 255 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 260 265 270 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 275 280 285 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 290 295 300 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 305 310 315 320 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 325 330 335 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 340 345 350 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 365 <210> 17 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro Thr 115 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 110 Ala Pro Thr 115 <210> 19 <211> 150 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 19 Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Pro 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser 145 150 <210> 20 <211> 150 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 20 Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Val Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser 145 150 <210> 21 <211> 150 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 21 Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 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Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Val Gly Gly Leu Ser 145 150 <210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Xenopus sp. <400> 24 Met Gly Ala Ser Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ala Thr Phe 1 5 10 15 Arg Ala Gly Ser Gly His Asp Glu Val Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Lys Thr Asn Gln Ser Gly Val Glu 35 40 45 Arg Leu Val Glu Gly Lys Lys Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Arg Asn Asn Ser Gly Phe Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp 65 70 75 80 Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Ile Ala Lys Glu 85 90 95 Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 Lys Lys Phe Thr His Leu Pro Glu Val Glu Thr Phe Asp Pro Lys Pro 115 120 125 Gln Pro Ser Ala Ser Val Leu Asn Ile Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Pro 130 135 140 Ile Val Gly Leu Ser Met 145 150 <210> 25 <211> 150 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110 Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile 145 150 Page 16

Claims (26)

  1. 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소한 90% 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 변이체 ActRIIB 단백질을 인코드하는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 있어서, 이때 상기 단백질은 서열 번호:2의 위치 79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산을 포함하며, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 세포-기반 분석에서 미오스태틴 및/또는 GDF11에 의한 신호생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB는 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소한 95% 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은
    a) 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소한 97% 동일성인 아미노산 서열; 또는
    b) 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소한 99% 동일성인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 ActRIIB의 내생성 N-X-S/T 서열이외 위치에서 최소한 하나의 N-X-S/T 서열을 포함하며, 이때 상기 위치는 리간드-결합 주머니 밖에 위치하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 서열 번호:2의 위치 24에 상응하는 위치에서 N을 포함하며, 서열 번호:2의 위치 26에 상응하는 위치에서 S 또는 T를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 서열 번호:2의 위치 64에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 서열 번호:2의 위치 64에 상응하는 위치에서 K를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 서열 번호:2의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경을 포함하며, 이는 리간드-결합 주머니 안에 위치한 보존성 변경인 것을 특징으로 하는 핵산.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 서열 번호:2의 서열에 대하여 최소한 하나의 변경을 포함하며, 이 변경은 K74, R40, Q53, K55 및 F82로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 변경인 것을 특징으로 하는 핵산.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 서열 번호:2의 아미노산 21-29중 임의의 것에 상응하는 아미노산에서 시작하고, 서열 번호:2의 아미노산 128-134중 임의의 것에 상응하는 아미노산에서 종료되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 이형(heterologous) 영역이 더 포함된 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 핵산.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 동종이량체인 것을 특징으로 하는 핵산.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 이형 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 이형 영역은 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 ActRIIB 단백질과 이형 영역 사이에 위치한 링커 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 변이체 ActRIIB 단백질은 에피토프 테그, FLAG 테그, 폴리히스티딘 서열 및 GST 융합으로부터 선택된 정제 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 청구항 1에 있어서, 서열 번호:2의 위치 79의 아미노산은 D인 것을 특징으로 하는 핵산.
  18. 청구항 1에 있어서, 서열 번호:2의 위치 79의 아미노산은 E인 것을 특징으로 하는 핵산.
  19. 청구항 1-18중 임의의 한 항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  20. 청구항 19에 따른 벡터를 포함하며, 인간 안에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  22. 변이체 ActRII 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 청구항 20에 따른 세포를 배양하고, 변이체 ActRII 단백질을 발현시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 변이체 ActRII 단백질은 TPA 리더 서열을 이용하여 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 상기 방법은 상기 세포에 의해 발현된 ActRIIB 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 삭제
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