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KR101667169B1 - 암 치료제 - Google Patents

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KR101667169B1
KR101667169B1 KR1020157002891A KR20157002891A KR101667169B1 KR 101667169 B1 KR101667169 B1 KR 101667169B1 KR 1020157002891 A KR1020157002891 A KR 1020157002891A KR 20157002891 A KR20157002891 A KR 20157002891A KR 101667169 B1 KR101667169 B1 KR 101667169B1
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seq
mir582
cancer
bladder cancer
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다카히로 오치야
후미타카 다케시타
Original Assignee
국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터
아사히 가세이 파마 가부시키가이샤
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Abstract

[과제] 암 치료제, 특히 암 세포 증식 억제제, 암 전이 억제 또는 예방제, 상기 제제를 이용한 의약, 암 치료의 효과를 판정하는 방법, 암 치료의 예후를 예측하는 방법, 암의 증식 억제 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법, 및 암의 전이 저해 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법의 제공.
[해결수단] 적어도 서열번호 1 또는 2와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산으로서, 단백질 발현 억제 활성을 보이는 핵산을 함유하는 의약.

Description

암 치료제{AGENT FOR TREATING CANCER}
본 발명은, 암 치료제, 특히 암 세포 증식 억제제, 암 전이 억제 또는 예방제 등에 관한 것이다.
RNA 간섭
RNA 간섭(RNA interference: RNAi) 기술은, 생명과학 연구에 빈번하게 이용되어, 그 유용성은 널리 확인되어 오고 있다. RNAi란, 이중쇄 RNA에 의해서 서열 특이적으로 mRNA가 분해되어, 그 결과 유전자의 발현이 억제되는 현상을 말한다. 2001년에 21 염기의 저분자 이중쇄 RNA가 포유동물 세포 내에서 RNAi를 매개할 수 있다는 것이 보고되고 나서(비특허문헌 1), siRNA(small interference RNA)는, 표적 유전자의 발현 억제 방법으로서 빈번히 이용되고 있다. 또한, siRNA는, 의약품에의 응용이나, 암을 포함하는 여러 가지 난치성 질환의 치료에의 응용이 기대되고 있다.
miRNA
miRNA(마이크로 RNA)는, 게놈 상에 코드된 내재성의 20~25 염기 정도의 비코드(non-coding) RNA이다. miRNA는, 게놈 DNA 상의 miRNA 유전자로부터, 우선 수백~수천 염기 정도 길이의 일차 전사물(Primary miRNA: 이하, 「Pri-miRNA」라고 부르는 경우가 있음)로서 전사되고, 이어서 프로세싱을 받아 약 60~70 염기 정도의 헤어핀 구조를 갖는 pre-miRNA(전구체(precursor) miRNA)가 된다. 그 후, 핵에서 세포질 내로 이동하고, 또한 프로세싱을 받아 20~25 염기 정도의 이중쇄 성숙 miRNA가 된다. 이중쇄 성숙 miRNA는, 그 중 단일쇄가 RISC(RNA-Induced Silencing Complex; RNA-유도 침묵 복합체)라고 불리는 단백질과의 복합체를 형성하여, 표적 유전자의 mRNA에 작용함으로써, 표적 유전자의 번역을 저해하는 기능을 하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). miRNA는, 인간이나 마우스 등에서 1000 종류 이상이 알려져 있으며, 각각이 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하여, 세포의 증식이나 분화 등, 여러 가지 생명 현상에 관여하는 것이 시사되고 있다. 예컨대, 조혈 세포나 신경 세포의 분화 등에 관여하는 miRNA에 관한 보고가 있다(비특허문헌 2). 또한, 암 세포의 증식에 관여하는 miRNA에 관해서도 보고가 있으며, miRNA의 발현 패턴을 암의 임상 진단에 이용하거나, miRNA의 발현을 억제함으로써 암 세포의 증식을 억제하는 암의 치료법에 관해서, 제안되어 있다(특허문헌 1, 2). mir582는 miRNA의 하나로서 알려져 있다(비특허문헌 3).
방광암
방광의 암은 전암성 병변으로서 일반적으로 일어나, 침윤성 암으로 변화할 수 있다. 일부는 전이하여 증식하는 경우도 있다. 가장 일반적인 방광암은 상피 기원의 이행 상피암이며, 모든 방광암의 90%를 차지하고 있다. 표재성 방광 악성 종양 환자는 외과적으로 제거할 수 있지만 재발되는 경향이 크다. 또한, 하부 근육 조직에 깊게 침윤하는 방광 악성 종양의 경우는, 5년 생존율이 약 50%까지 줄어든다.
어떻든 간에, 외과 수술이 이들 방광암의 주요한 치료법이다. 수술의 범위는 질환의 병기에 따라 결정되는데, 조기 질환은, 일반적으로 방광내 화학 요법 및 경요도적 절제에 의해 치료 가능하다. 방광벽과 같은 부위 또는 다른 부위에서의 암의 발현 및 재발의 중증도를 줄이기 위해서, 외과 수술은 화학 요법약 또는 면역 요법약의 보조적 방광내 주입과 조합되는 경우가 많다. 외과 수술에 적합하지 않은 방광암 환자를 위해서는 일반적으로 결정적(근치적) 방사선 요법이 이용된다. 표면적, 저악성도 질환의 경우에는 화학 요법을 방광 내에 직접 실시하여 종양 부위에 약물을 집적시키고, 절제 후의 임의의 잔존 종양 덩어리를 제거한다. 진행성 방광암에 대응하기 위해서는 전신적 화학 요법도 사용된다.
독소루비신 및 에피루비신과 같은 안트라사이클린은 방광암을 치료하는 것으로 알려져 있다. 안트라사이클린의 투여는 수술후의 재발 리스크를 저하시키는 것으로 생각되고 있지만, 이들 화합물은 전신 독성을 갖는다. 이 독성은, 약물을 방광에 직접 주입함으로써 저하시킬 수 있지만, 방광이 수술에 의해 어떠한 손상을 받고 있는 경우에는 약물이 다른 기관계에 침입할 수 있다. 또한 이들 화합물은, 투여 경로와는 무관하게, 잠재적으로 발암성이라고 생각되고 있다. 따라서 침습성 질환의 진행을 예방하는, 보다 안전한 치료 방법의 개발이 중요하다. 또한, 방광암은 외과적 수술, 화학 요법을 행하더라도 비교적 재발율이 높은 것이 특징이다. 이 때문에, 재발율을 내리는 치료법의 개발이 요구되고 있다.
특허문헌 1: 일본 특허공개 2008-86201호 공보 특허문헌 2: 일본 특허공개 2006-506469호 공보
비특허문헌 1: Elbashir SM et al., Nature, 411:494-498(2001) 비특허문헌 2: Science, 303:83-86(2004) 비특허문헌 3: Proc. Natl. Acad. Sci., 103:3687-3692(2006)
본 발명의 과제는 보다 효과적인 암의 치료법을 제공하는 데에 있다. 예컨대, 암 치료제, 특히, 암 세포 증식 억제제나 암 전이 억제 또는 예방제, 상기 각 제제를 이용한 의약, 암 치료의 효과를 판정하는 방법, 암 치료의 예후를 예측하는 방법, 암의 증식을 억제하는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법, 또는 암의 전이를 저해하는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법의 적어도 하나가 의도된다.
지금까지 「mir582」와 암 세포의 증식이나 전이와의 관련성은 전혀 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은, 놀랍게도 방광암 세포에 있어서, miRNA의 일종인 「miR582」의 발현이 현저히 감소하고 있음을 처음으로 알아냈다. 더욱 중요한 것은, 방광암 세포에 miR582를 항상 발현시키면, 그 암 세포의 증식이 억제되는 것, 그리고 암 세포의 침윤성이 억제되는 것을 처음으로 알아냈다. 아울러, miR582를 도입한 암 세포에서는, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1, RAB27A 등의 특정 RNA의 발현이 억제되고 있는 것도 알아냈다.
발현이 억제된 상기한 RNA 중, KCNC1을 제외한 4 유전자는, 모두 암이나 세포 증식과의 관련성이 시사되었다. 즉, PGGT1B는 암의 침윤에 관여하는 것이 보고되었다(Cell Biol. Int., 34:815-826(2010)). LRRK2는 세포의 증식에 관여하는 Akt 등의 단백질을 인산화하는 것이 보고되었다(FEBS Lett., 585:2165-2170(2011)). 또한, DIXDC1도 세포의 증식에 관여하는 것이 보고되었고 (Cancer Sci., 100:1801-1808(2009)), RAB27A에 관해서는, 증식 인자의 분비에 관여하는 것이 보고되었다(Mol. Cancer. Res., 6:372-382(2008)). 이론에 구속되는 것은 바람직하지 않지만, 이들 RNA의 기능이 억제됨으로써 암 세포의 증식이나 침윤성이 영향을 받고 있는 것일지도 모른다.
또한, 본 발명자들은, 인간 방광암의 임상 검체를 이용한 해석으로부터, 방광암의 악성도(등급)에 따라서 miR582의 발현이 저하된 환자의 비율이 증가하고 있는 것도 알아냈다.
따라서, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 적어도 이하를 함유하는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 의약:
(1) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산,
(2) 서열번호 1 또는 서열번호 2와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, 단백질 발현 억제 활성을 보이는 핵산, 또는
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 뉴클레오티드 서열 및 이 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 이에 따라 쇄 중의 전부 또는 일부에 이중쇄 구조를 형성하는 단일쇄 또는 이중쇄의 핵산.
[1-2] 상기 핵산이, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 RNA와 하이브리드를 형성할 수 있는 핵산인 상기 [1]에 기재한 의약.
[1-3] 상기 핵산이, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현을 억제할 수 있는 핵산인 상기 [1]에 기재한 의약.
[2] 상기 핵산이 이중쇄의 핵산인 상기 [1]에 기재한 의약.
한편, 상기한 것과 같이 [1]을 인용하는 항은, [1]의 지번으로 나타낸 [1-2] 등이 존재하는 경우, 그 항도 동시에 인용한다. 이하 동일하다.
[3] 핵산이 서열번호 1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[3-2] 핵산이 서열번호 1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[4] 핵산이 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[4-2] 핵산이 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[5] 핵산이 miR582의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또 단백질 발현 억제 활성을 보이는 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[6] 핵산이 miR582 및 그 전구체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 핵산인 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[6-2] miR58의 전구체가 pri-miR582 또는 pre-miR582인 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[7] 핵산이 miR582인 상기 [1]~[2] 중 어느 것에 기재한 의약.
[8] 핵산이 수식된 핵산인 상기 [1]~[7] 중 어느 것에 기재한 의약.
[9] 암이, miR582의 발현이 감소하고 있는 암인 상기 [1]~[8] 중 어느 것에 기재한 의약.
[10] 암이 방광암인 상기 [1]~[8] 중 어느 것에 기재한 의약.
[11] 암이 등급 2 이상의 방광암인 상기 [1]~[8] 중 어느 것에 기재한 의약.
[12] 상기 [1]~[8] 중 어느 것에 기재한 핵산을 함유하는, 암의 전이를 억제 또는 예방하기 위한 의약.
[13] 경요도적으로 포유동물에게 투여되는 상기 [1]~[12] 중 어느 것에 기재한 의약.
[14] 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 치료 효과를 예측하는 방법 또는 그 예측을 보조하기 위한 방법으로서, 암에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
[14-2] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 상기 [14]에 기재한 방법:
(1) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 정상 조직 또는 정상 세포 및 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정,
(2) 정상 조직 또는 정상 세포와 암 조직 또는 암 세포와의 사이에서 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 비교하는 공정, 및
(3) 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도가, 정상 조직 또는 정상 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도보다도 낮은 경우에, 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약이 치료 효과가 있다고 예측하는 공정.
[15] 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 치료 효과를 예측하는 방법 또는 그 예측을 보조하기 위한 방법으로서, 암에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
[15-2] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 상기 [15]에 기재한 방법:
(1) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 정상 조직 또는 정상 세포 및 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정,
(2) 정상 조직 또는 정상 세포와 암 조직 또는 암 세포와의 사이에서 miR582의 게놈의 카피수를 비교하는 공정, 및
(3) 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수가, 정상 조직 또는 정상 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수보다도 낮은 경우에, 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약이 치료 효과가 있다고 예측하는 공정.
[16] 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 치료 효과를 판정하는 방법 또는 그 판정을 보조하기 위한 방법으로서, 암에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
[16-2] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 상기 [16]에 기재한 방법:
(1) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포 및 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 후에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정,
(2) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포와 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 후에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포와의 사이에서 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 비교하는 공정, 및
(3) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 후에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도가, 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도보다도 높은 경우에, 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약이 치료 효과가 있다고 판정하는 공정.
[17] 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 치료 효과를 판정하는 방법 또는 그 판정을 보조하기 위한 방법으로서, 암에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
[17-2] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 상기 [17]에 기재한 방법:
(1) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포 및 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 후에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정,
(2) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포와 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 후에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포와의 사이에서 miR582의 게놈의 카피수를 비교하는 공정, 및
(3) 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 후에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수가, 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 투여 전에 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수보다도 높은 경우에, 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약이 치료 효과가 있다고 판정하는 공정.
[18] 암 치료의 예후를 판정하는 방법 또는 그 판정을 보조하기 위한 방법으로서, 암에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
[18-2] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 상기 [18]에 기재한 방법:
(1) 환자로부터 적출된 정상 조직 또는 정상 세포 및 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정,
(2) 정상 조직 또는 정상 세포와 암 조직 또는 암 세포와의 사이에서 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 비교하는 공정, 및
(3) 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도가, 정상 조직 또는 정상 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도보다도 낮은 경우에, 암 치료의 예후가 나쁘다고 판정하는 공정.
[19] 암 치료의 예후를 판정하는 방법 또는 그 판정을 보조하기 위한 방법으로서, 암에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
[19-2] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는 상기 [19]에 기재한 방법:
(1) 환자로부터 적출된 정상 조직 또는 정상 세포 및 환자로부터 적출된 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정,
(2) 정상 조직 또는 정상 세포와 암 조직 또는 암 세포와의 사이에서 miR582의 게놈의 카피수를 비교하는 공정, 및
(3) 암 조직 또는 암 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수가, 정상 조직 또는 정상 세포에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수보다도 낮은 경우에, 암 치료의 예후가 나쁘다고 판정하는 공정.
[20] 암이 방광암인 상기 [14]~[19] 중 어느 것에 기재한 방법.
[21] 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는 상기 [1]~[13] 중 어느 것에 기재한 의약의 효과를 판정하기 위한 조성물.
[22] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는, 암의 증식을 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 방법:
(1) 피검 물질과 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 공정,
(2) 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 측정하여, 그 발현량을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량과 비교하는 공정, 및
(3) 상기 (2)의 비교 결과에 기초하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 상승 제어하는 피검 물질을, 암의 증식을 저해할 수 있는 물질로서 선택하는 공정.
[23] 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는 방법:
(1) 피검 물질과 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 공정,
(2) 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 측정하여, 그 발현량을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산 발현량과 비교하는 공정, 및
(3) 상기 (2)의 비교 결과에 기초하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 상승 제어하는 피검 물질을, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질로서 선택하는 공정.
[24] 적어도 이하를 함유하는 것을 특징으로 하는, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현 억제제:
(1) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산,
(2) 서열번호 1 또는 서열번호 2와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로서, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질의 발현 억제 활성을 보이는 핵산, 또는
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 뉴클레오티드 서열 및 그 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 이에 따라 쇄 중의 전부 또는 일부에 이중쇄 구조를 형성하는 단일쇄 또는 이중쇄의 핵산.
본 발명에 의해, 암 치료제, 특히 방광암 치료제, 암의 전이를 억제 또는 예방하는 제제, 또는 상기 제제를 이용한 의약 중 적어도 하나를 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 의해, 암의 치료 효과를 판정하는 방법, 암 치료의 예후를 예측하는 방법, 암의 증식을 억제하는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법, 또는 암의 전이를 저해하는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법 중 적어도 하나를 제공할 수 있다.
도 1은 각종 방광암 세포에 있어서의 miR582의 발현량을 도시하는 도면이다. 도면에서, 「노멀(Normal)」은 정상 세포를 나타내고, 종축의 값은 노멀에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 2는 각종 방광암 세포에 있어서의 miR582의 염색체 영역의 카피수를 도시하는 도면이다. 종축의 값은 HT1376 세포에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 3은 miR582에 의한 인간 방광암 세포주의 증식 억제를 도시하는 도면이다. 도면에서, 「NC」는 음성 대조를 나타내고, 종축의 값은 NC에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 4는 miR582에 의한 인간 방광암 세포주의 침윤능의 억제를 도시하는 도면이다. 도면에서, 「NC」는 음성 대조를 나타내고, 종축의 값은 NC에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 5는 마우스 방광암 모델에서의 miR582 투여에 의한 치료 효과를 도시하는 도면이다. 도면에서, 스크램블(Scramble)은 음성 대조이다.
도 6은 마우스 방광암 모델에서의 miR582 투여에 의한 암 전이 억제 효과를 도시하는 도면이다. 도면에서, 스크램블은 음성 대조이다.
도 7은 miR582에 의해 KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1, RAB27A의 유전자 발현이 억제되는 것을 도시하는 도면이다. 도면에서, 「NC」는 음성 대조를 나타내고, 종축의 값은 NC에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 8은 PGGT1B, LRRK2, DIXDC1, RAB27A가 miR582의 직접적인 표적 분자이고, KCNC1이 간접적인 표적 분자임을 나타내는 도면이다. 도면에서, 「NC」는 음성 대조를 나타내고, 종축의 값은 NC에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 9는 miR582에 의한 KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1, RAB27A의 단백질 발현 억제를 도시하는 도면이다. 도면에서 「NC」는 음성 대조를 나타낸다.
도 10은 miR582의 상기 표적 유전자에 대한 siRNA를 도입함으로써, 인간 방광암 세포주의 증식 억제를 도시하는 도면이다. 도면에서, 「NC」는 음성 대조를 나타내고, 종축의 값은 NC에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 11은 miR582의 상기 표적 유전자에 대한 siRNA를 도입함으로써, 인간 방광암 세포주의 침윤 억제를 도시하는 도면이다. 도면에서, 「NC」는 음성 대조를 나타내고, 종축의 값은 NC에 대한 비로서 나타내고 있다.
도 12는 방광암의 인간 임상 검체에 있어서의 miR582의 발현량을 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시양태(이하, 「본 실시형태」라고 약칭하는 경우가 있음)에 기초하여 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기에 설명하는 특정 양태에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서 및 서열표에서, 뉴클레오티드 서열을 편의적으로 RNA의 서열을 이용하여 기재했지만, 이것은, 그 서열 내지 대응하는 서열번호에 의해 특정된 핵산이 RNA만을 나타내는 것을 의미하는 것은 아니며, 적절하게 U(우라실)을 T(티민)으로 고쳐 읽음으로써, DNA나 키메라 핵산의 뉴클레오티드 서열도 나타내는 것임을 이해해야 한다.
본 발명은, 후기 실시예에서 나타내는 것과 같이, 「miR582」가, (1) 암 세포, 특히 방광암 세포의 증식을 억제하는 기능을 갖는 것, (2) 암 세포, 특히 방광암 세포의 침윤 또는 전이를 억제하는 기능을 갖는 것, (3) 인간 방광암 환자의 암 조직에서 발현이 저하하고 있음의 발견 및 실증에 기초하여, 「miR582」 및 그 기능적 유사물을, 암 치료제의 유효 성분으로서 이용하는 것을 의도한다.
1. 유효 성분
a. 서열번호 1 또는 2로 나타내어지는 핵산 및 기능적 유사물
유효 성분에 관한 본 실시형태로서는, 우선, 서열번호 1(이하 「miR582-5p」라고 부르는 경우가 있음) 또는 서열번호 2(이하 「miR582-3p」라고 부르는 경우가 있음)로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다. 이들 핵산은 본 발명의 가장 전형적인 유효 성분이다. 아울러, 상기 핵산의 기능적 유사물도 또한 본 발명의 유효 성분으로서 사용 가능하다.
즉, 본 명세서에서, 「기능적 유사물」의 용어는, 뉴클레오티드 서열, 고차구조 또는 화학 구조 중 어느 것 또는 그 조합에 있어서 천연형 서열과는 완전히 일치하지 않지만, 이하에 설명하는 본 발명의 원하는 생리 활성의 적어도 어느 하나를 나타낼 수 있는 핵산을 가리킨다. 예컨대, 본 실시양태에서의 기능적 유사물은, 상기 서열번호 1 또는 2 중 어느 것과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산을 포함한다.
한편, 뉴클레오티드 서열의 「동일성」이란, 그 기술분야에서 공지된 수학적 알고리즘을 이용하여 2개의 뉴클레오티드 서열을 얼라인시킨 경우의, 최적의 얼라인먼트(바람직하게는, 그 알고리즘은 최적의 얼라인먼트를 위해 서열의 한쪽 혹은 양쪽에의 갭의 도입을 고려할 수 있는 것임)에 있어서의, 오버랩하는 전체 뉴클레오티드 잔기에 대한, 동일 뉴클레오티드 잔기의 비율(%)을 의미한다. 예컨대, 뉴클레오티드 서열의 동일성은, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST-2(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여, (갭 오픈=5 패널티; 갭 익스텐션=2 패널티; x_드롭오프=50; 기대치=10; 필터링=ON)의 조건으로 2개의 뉴클레오티드 서열을 얼라인함으로써 계산할 수 있다.
본 실시양태에서의 다른 적합한 기능적 유사물은, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 대하여 1 혹은 복수의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다. 그와 같은 뉴클레오티드 서열로서는, 예컨대, 다음을 들 수 있다.
(1) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 중의 1~6개(바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개)의 뉴클레오티드가 결실된 뉴클레오티드 서열,
(2) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 1~6개(바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개)의 뉴클레오티드가 부가된 뉴클레오티드 서열,
(3) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 1~6개(바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개)의 뉴클레오티드가 삽입된 뉴클레오티드 서열,
(4) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 중의 1~6개(바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개)의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 뉴클레오티드 서열, 또는
(5) 상기 (1)~(4)의 변이가 조합된 뉴클레오티드 서열(이 경우, 변이된 뉴클레오티드의 총합이 1~6개(바람직하게는 1~3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개)).
b. 부분 서열
본 실시양태에서의 기능적 유사물은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 「부분 서열」로 이루어지는 것이 바람직하다. 본 실시형태에 관련된 「부분 서열」이란, miRNA가 표적 유전자를 인식하는 데 필요한 최소한의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 의미한다. 이 최소한의 뉴클레오티드 서열은 시드 서열로서 그 존재가 잘 알려져 있다(Proc. Natl. Acad.Sci., 104:19291-6(2007)). 즉, miRNA에서는 시드 서열이라고 불리는 5' 말단에서부터 2~8번째의 염기 서열이 매우 중요하고, miRNA의 표적이 되는 mRNA의 대부분은 그 3' 비번역 영역에 이 시드 서열과 상보적인 서열을 가지고 있다. 이에 따라, miRNA는 그 시드 서열과 상보적인 서열을 가지고 있는 특정 mRNA를 인식하여 그 기능을 억제한다. 또한, 시드 서열은 7 염기라는 짧은 서열로 구성되어 있기 때문에, 하나의 miRNA가 시드 서열과 상보적인 서열을 가지고 있는 복수의 mRNA를 표적으로 하여, 원래의 miRNA 활성을 발휘할 수 있게 된다. 예컨대, 서열번호 1의 시드 서열로서는 5'-UGACAUU-3'을 들 수 있다. 또한, 서열번호 2의 시드 서열로서는 5'-GGUCAAU-3'을 들 수 있다. 따라서, 본 실시형태에서의 유효 성분은, 서열번호 1 또는 2의 상기 시드 서열로 이루어지거나, 혹은 그 시드 서열을 포함하는 연속되는 15 염기 이상, 보다 바람직하게는 17 염기 이상, 보다 한층 더 바람직하게는 19 염기 이상, 가장 바람직하게는 20 염기를 갖더라도 좋다.
c. 핵산의 길이 및 구조
한편, 본 실시형태에서의 핵산 및 기능적 유사물(이하, 상기 핵산과 기능적 유사물을 통합하여 「본 발명의 핵산」 또는 「본 실시형태에서의 핵산」 등이라고 하는 경우가 있음)은, 후술하는 본 발명의 원하는 활성 중의 적어도 하나 이상을 보이는 한, 그 길이에 상한은 없다. 그러나, 합성의 용이성이나 항원성의 문제 등을 고려하면, 본 실시형태에서의 핵산의 길이는, 상한은, 예컨대 200 염기 이하, 바람직하게는 130 염기 이하, 보다 바람직하게는 50 염기 이하이며, 가장 바람직하게는 30 염기 이하이다. 하한은, 예컨대 7 염기 이상, 전형적으로는 15 염기 이상, 바람직하게는 17 염기 이상이다. 한편, 본 명세서에서, 핵산이 헤어핀 루프형의 구조를 취함으로써 부분적으로 이중쇄 구조를 형성하는 경우라도, 그 핵산의 길이는 단일쇄의 길이로서 계산하는 것으로 한다.
즉, 본 실시형태에서의 핵산은 단일쇄 핵산에 한정되지 않고, 이중쇄의 형태라도 좋다. 이중쇄의 양태에는, 이중쇄 RNA, 이중쇄 키메라 핵산, RNA/DNA 하이브리드, RNA/키메라 핵산 하이브리드, 키메라 핵산/키메라 핵산 하이브리드 및 키메라 핵산/DNA 하이브리드가 포함된다. 한편, 키메라 핵산이란, 단일쇄 또는 이중쇄의 핵산에 있어서 한 가닥의 핵산 속에 RNA와 DNA를 포함하는 것을 말하고, 하이브리드 핵산이란, 이중쇄에 있어서, 한쪽의 쇄가 RNA 또는 키메라 핵산이고 또 한쪽의 쇄가 DNA 또는 키메라 핵산인 핵산을 말한다. 대체로, 본 실시형태에서의 핵산은, 바람직하게는 단일쇄 RNA, 단일쇄 키메라 핵산, 이중쇄 RNA, 이중쇄 키메라 핵산, RNA/DNA 하이브리드, RNA/키메라 핵산 하이브리드, 키메라 핵산/키메라 핵산 하이브리드 또는 키메라 핵산/DNA 하이브리드이며, 보다 바람직하게는 단일쇄 RNA, 단일쇄 키메라 핵산, 이중쇄 RNA, 이중쇄 키메라 핵산, RNA/DNA 하이브리드, 키메라 핵산/키메라 핵산 하이브리드 또는 RNA/키메라 핵산 하이브리드이고, 더욱 바람직하게는 이중쇄 RNA, 이중쇄 키메라 핵산, RNA/DNA 하이브리드, RNA/키메라 핵산 하이브리드, 키메라 핵산/키메라 핵산 하이브리드 또는 키메라 핵산/DNA 하이브리드이고, 특히 바람직하게는 이중쇄 RNA이다.
d. 「 miR582 」 분자
상기 서열번호 1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 구성되는 이중쇄 형태의 RNA(식(I))는 「성숙형 miR582」로서 공지되어 있다(비특허문헌 3).
Figure 112015011436364-pct00001
따라서, 본 실시형태의 유효 성분은 상기 성숙형 miR582라도 좋다.
e. 「 miR582 」의 전구체
본 실시형태의 유효 성분은 miR582의 전구체일 수도 있다. miR582의 전구체란, 세포 내의 프로세싱이나 이중쇄 핵산의 개열(開裂) 결과로서, 세포 내에서 성숙형 miR582을 생기게 할 수 있는 핵산을 의미한다. 구체적으로는, miR582의 pri-miRNA나 pre-miRNA 등을 예로 들 수 있다. pri-miRNA는 miRNA 유전자의 일차 전사 산물(단일쇄 RNA)이며, 통상 수백~수천 염기 정도의 길이를 갖는다. pre-miRNA는, pri-miRNA가 세포내 프로세싱을 받음으로써 생기는 헤어핀 구조를 갖는 단일쇄 RNA이며, 통상 90~110 염기의 길이를 갖는다. miR582의 pri-miRNA나 pre-miRNA는 공지된 분자이며, 예컨대 상거연구소(Sanger Institute)가 작성하고 있는 miRBase 데이터베이스: http://microrna.sanger.ac.uk/ 등에 개시되어 있다. miR582의 적합한 pre-miRNA로서는, 「MI0003589」로서 알려진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일쇄 RNA를 예로 들 수 있다.
또한, pre-miRNA와 유사한 구조를 취하는 것으로서, 예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열(제1 서열)과 그 상보 서열(제2 서열)이 연결된 단일쇄 핵산이 헤어핀 루프형의 구조를 취함으로써, 제1 서열이 제2 서열과 이중쇄 구조형의 형상을 갖는 핵산도 본 실시형태에서의 핵산의 바람직한 양태의 하나이다. 상기 「MI0003589」를 예로 들어 설명하면, 본 실시형태에서의 바람직한 핵산은, 하기의 식(II)(서열번호 3)으로 나타내어지는 구조를 취하더라도 좋다.
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본 실시형태에서의 핵산은, 종래 공지된 수법을 이용하여, 포유동물 세포(인간 세포 등)로부터 단리함으로써 또는 화학적으로 합성함으로써 또는 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생함으로써 얻을 수 있다. 또한 적절하게 시판되고 있는 핵산을 이용할 수도 있다. 그와 같은 시판 제품의 하나는 「Human miRIDIAN microRNA Mimic」(제품명, Dharmacon사)로서 입수할 수 있다.
f. 수식된 핵산
천연형의 핵산은, 세포 중에 존재하는 핵산 분해 효소에 의해서 용이하게 분해되는 경우가 있다. 따라서, 본 실시형태에서의 핵산에는, 각종 분해 효소에 대하여 저항성이 되도록 수식된 핵산(이하, 「수식체」라고 부르는 경우가 있음)도 포함된다(예컨대, Curr. Top. Med. Chem., 6:913-25(2006) 및 Mol. Biosyst., 6:862-70(2010) 참조). 구체적으로는, 상기한 핵산 중 어느 것을, 후술하는 본 발명의 원하는 생리 활성 모두가 손상되는 일이 없도록 수식한 것이 본 실시형태에서의 핵산에 포함된다. 상기 수식체의 예로서는, 당쇄 부분이 수식되어 있는 것(예컨대, 2'-0메틸화), 염기 부분이 수식되어 있는 것, 인산 부분이나 히드록실 부분이 수식되어 있는 것(예컨대, 비오틴, 아미노기, 저급 알킬아민기, 아세틸기 등)을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 핵산 자체를 수식하여도 좋다. 핵산 자체를 수식한다는 것은, 예컨대, 그 5' 말단 또는 3' 말단에 콜레스테롤, 비타민 등의 지질성 물질이나 형광 물질을 부가하는 것을 들 수 있다. 또한, 예컨대, miR582와 동일한 영역과, 그 서열과 60%~100% 미만 상보적인 상보 영역을 포함하는 합성 핵산이라도 좋다. 혹은, 국제공개 제W02006/627171호 팜플렛에 기재된 것과 같은 합성 RNA 분자로 하여도 좋다.
또한, 본 실시형태에서의 핵산은, 5' 또는 3' 말단에 부가적인 염기를 갖고 있어도 좋다. 이 부가적 염기의 길이는 통상 5 염기 이하이다. 이 부가적 염기는, DNA라도 RNA라도 좋지만, DNA를 이용하면 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있는 경우가 있다. 이러한 부가적 염기의 서열로서는, 예컨대 ug-3', uu-3', tg-3', tt-3', ggg-3', guuu-3', gttt-3', ttttt-3', uuuuu-3' 등의 서열을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 실시형태에서의 핵산의 바람직한 양태로서는, 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 핵산, 성숙형 miR582, 그 전구체 등의 핵산을 들 수 있다. 본 실시형태에서의 핵산의 바람직한 다른 양태로서는, 성숙형 miR582 활성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 예컨대, 내재성의 성숙형 miR582를 모방하도록 합성된, 「miR582 mimicHuman miRIDIAN microRNA Mimic」(제품명, Dharmacon사) 등을 사용할 수 있다. 또한, 그 밖의 예로서, Pre-miRTM miRNA 전구체 분자(Life Technologies사 제조)를 들 수 있다.
g. 핵산의 활성
본 실시형태에서의 핵산은, 암 세포 내에 받아들여지면, 암 세포의 침윤 증식 억제 활성, 암 세포의 전이를 억제하는 작용을 보일 수 있다. 또한, 그 작용은, 본 실시형태에서의 핵산이 단백질 발현 억제 활성을 갖는 데에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 실시형태에서의 핵산은, 적어도 단백질 발현 억제 활성을 가질 필요가 있다. 단백질 발현 억제에는, 표적 mRNA의 발현을 억제하는 것(이 작용을 RNA 발현 억제 활성이라고 부르는 경우가 있음) 및 표적 mRNA의 번역을 저해하는 것이 포함된다. 상기 표적 mRNA의 발현을 억제하는 것에는, 전사되어 생성된 표적 mRNA를 분해하여, 결과적으로 표적 mRNA의 발현량을 감소시키는 것이 포함된다. 보다 특정적으로는, 본 실시형태에서, 「miR582 활성을 갖는 핵산」을 본 실시형태에서의 의약에 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 「miR582 활성」이란, 어느 한 천연형 「miR582」 분자의 표적이 될 수 있는 mRNA에 관련된 단백질 중 적어도 하나의 발현을 억제하는 활성이며, 전형적인 예로서는 그 mRNA 중 적어도 하나의 발현을 억제하는 활성을 말한다. 그리고, 본 실시형태의 「miR582 활성을 갖는 핵산」은, 천연형 「miR582」 분자의 표적 mRNA에 관련된 단백질 중 적어도 하나의 발현을 억제하거나, 혹은 그 mRNA 중 적어도 하나의 발현을 억제하는 핵산이면 된다. 천연형 「miR582」가 발현을 억제하는 표적 mRNA로서는, 예컨대 PGGT1B(유전자 ID 5229), LRRK2(유전자 ID 120892), DIXDC1(유전자 ID 85458), RAB27A(유전자 ID 5873), KCNC1(유전자 ID 3746), TEX19(유전자 ID 400629) 또는 ASGR1(유전자 ID 432)을 들 수 있다.
따라서, 본 실시형태에서의 「miR582 활성을 갖는 핵산」의 구체예는, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1나 RAB27A 등을 표적 mRNA로 하여, 그 발현을 억제하는 핵산일 수 있다. 상기 「miR582 활성을 갖는 핵산」이, LRRK2의 발현을 억제하는 것이 바람직하고, LRRK2 및 DIXDC1의 발현을 억제하는 것이 보다 바람직하고, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A의 발현을 억제하는 것이 더욱 바람직하고, LRRK2, DIXDC1, RAB27A 및 PGGT1B의 발현을 억제하는 것이 더욱 바람직하고, LRRK2, DIXDC1, RAB27A, PGGT1B 및 KCNC1의 발현을 억제하는 것이 가장 바람직하다.
보다 특정한 양태를 언급하면, 본 실시형태에서는, 핵산이 miR582이며, 이에 따라 PGGT1B의 발현을 억제하는 것이 바람직하다. 또한, miR582를 이용하여 PGGT1B 및 LRRK2의 발현을 억제하는 것이 보다 바람직하고, PGGT1B, LRRK2 및 DIXDC1의 발현을 억제하는 것이 더욱 바람직하고, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A의 발현을 억제하는 것이 한층 더 바람직하고, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1, RAB27A, KCNC1의 발현을 억제하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 다른 특정한 양태에서는, 핵산으로서 miR582-5p를 이용하여, LRRK2의 발현을 억제하는 것이 바람직하고, LRRK2 및 DIXDC1의 발현을 억제하는 것이 보다 바람직하고, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A의 발현을 억제하는 것이 더욱 바람직하고, LRRK2, DIXDC1, RAB27A 및 KCNC1의 발현을 억제하는 것이 특히 바람직하다. 또 다른 특정한 양태에서는, 핵산으로서 miR582-3p를 이용하여, LRRK2의 발현을 억제하는 것이 바람직하고, LRRK2 및 DIXDC1의 발현을 억제하는 것이 보다 바람직하고, LRRK2, DIXDC1 및 KCNC1의 발현을 억제하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 실시형태에서의 「miR582 활성을 갖는 핵산」이, miR582의 표적 mRNA에 관련된 단백질 중 적어도 하나의 발현을 억제하는 기전으로서는, 표적 mRNA의 발현을 억제하는 것, 표적 mRNA의 번역을 억제하는 것 이외에, miR582의 표적 단백의 기능을 억제하는 것이라도 좋다. 요컨대, 본 실시형태에서의 핵산이, miR582의 표적 mRNA에 관련된 단백질 또는 그 mRNA의 발현 등을 실질적으로 억제하면 된다. 예컨대, 본 실시형태에서의 핵산이, 표적 mRNA에 관련된 단백질 또는 그 mRNA의 발현을 적어도 10% 이상 억제하면, 그 핵산이 표적 mRNA에 관련된 단백질 또는 그 mRNA의 발현을 실질적으로 억제했다고 간주할 수 있다. 본 실시형태에서의 핵산이 miR582의 표적 mRNA에 관련된 단백질 또는 그 mRNA의 발현을 20% 이상 억제하는 것이 바람직하고, 30% 이상 억제하는 것이 보다 바람직하고, 40% 이상 억제하는 것이 더욱 바람직하고, 50% 이상 억제하는 것이 특히 바람직하고, 60% 이상 억제하는 것이 가장 바람직하다. 발현 억제능은, 예컨대 본 명세서의 실시예 7 내지 9 중 어느 것에 기재한 방법에 의해 확인할 수 있다.
한편, 본 실시형태에서의 「miR582 활성을 갖는 핵산」이, 천연형 miR582의 표적 mRNA 중 적어도 하나와 실질적으로 하이브리드를 형성하는 것이 필요충분 조건이라고도 말할 수 있다 예컨대, 본 실시형태에서의 「miR582 활성을 갖는 핵산」이, 그 표적 mRNA 중 적어도 하나와, 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0) 중, 25℃의 조건 하에서 하이브리드를 형성할 수 있으면, 그 핵산은 그 표적 mRNA 중 적어도 하나와 실질적으로 하이브리드를 형성했다고 간주할 수 있다. 천연형 miR582가 하이브리드를 형성하는 표적 mRNA로서는, 예컨대 PGGT1B, LRRK2, DIXDC1이나 RAB27A를 들 수 있다.
따라서, 본 실시형태에서의 「miR582 활성을 갖는 핵산」이, PGGT1B와 하이브리드를 형성하는 것이 바람직하고, PGGT1B 및 DIXDC1과 하이브리드를 형성하는 것이 보다 바람직하고, PGGT1B, DIXDC1 및 LRRK2와 하이브리드를 형성하는 것이 더욱 바람직하고, PGGT1B, DIXDC1, LRRK2 및 RAB27A와 하이브리드를 형성하는 것이 가장 바람직하다.
보다 특정한 양태를 언급하면, 본 실시형태에서는, 핵산이 miR582-5p 또는 miR582이며, 이들이 PGGT1B와 하이브리드를 형성하는 것이 바람직하고, PGGT1B 및 DIXDC1과 하이브리드를 형성하는 것이 보다 바람직하고, PGGT1B, DIXDC1 및 LRRK2와 하이브리드를 형성하는 것이 더욱 바람직하고, PGGT1B, DIXDC1, LRRK2 및 RAB27A와 하이브리드를 형성하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 별도의 특정한 양태에서는, 핵산이 miR582-3p이며, 그것이 PGGT1B와 하이브리드를 형성하는 것이 바람직하고, PGGT1B 및 DIXDC1과 하이브리드를 형성하는 것이 보다 바람직하고, PGGT1B, DIXDC1및 LRRK2와 하이브리드를 형성하는 것이 더욱 바람직하다. 한편, 하이브리드 형성능은, 예컨대 본 명세서의 실시예 6 내지 8에 기재한 방법에 의해 확인할 수 있다.
h. 치료/예방 대상
본 실시형태에서의 치료 대상의 암 세포는, 통상 포유동물(예컨대, 래트, 마우스, 몰모트, 토끼, 양, 말, 돼지, 소, 원숭이, 인간, 바람직하게는 인간)의 암 세포이다. 그와 같은 암의 종류는, miR582의 발현이 감소하고 있는 암이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 방광암, 유방암, 폐암, 폐장암, 전립선암, 골육종, 식도암, 간암, 위암, 대장암, 직장암, 결장암, 요관종양, 뇌종양, 담낭암, 담관암, 담도암, 신장암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 고환종양, 카포시육종, 상악암, 설암, 구순암, 구강암, 인두암, 후두암, 근육종, 피부암 등의 고형암, 골수종 또는 백혈병 등이 예시된다. 치료 대상이 되는 암으로서는, 방광암이 바람직하고, 전이성의 방광암이 보다 바람직하다. 또한, 치료 대상이 되는 방광암으로서는, 등급 2 또는 등급 3의 방광암인 것이 바람직하고, 등급 2의 방광암인 것이 보다 바람직하다. 또한, 일 양태로서, 등급 3의 방광암을 적합하게 치료할 수 있다.
보다 특정한 양태에 관해서 언급하면, 본 실시형태에서의 의약이 암 세포증식을 저해하는 활성을 갖는지 여부는, 상기 치료/예방 대상의 암 세포주를 이용함으로써 확인하여도 좋다. 특히, 본 실시형태에서의 의약이 방광암 세포 증식을 저해하는 활성을 갖는지 여부는, 본 명세서의 실시예 3이나 실시예 5에 기재한, UM-UC-3 세포와 같은 방광암 세포주를 이용함으로써 확인하여도 좋다. 또한, 본 실시형태에서의 의약이 암 세포의 침윤능을 저해하는 활성을 갖는지 여부에 관해서도, 본 명세서의 실시예 4나 실시예 5에 기재한 UM-UC-3 세포와 같은 침윤성이 높은 방광암 세포주를 이용함으로써 확인하여도 좋다.
i. 의약
본 실시형태에서의 의약은, 유효량의 본 실시형태에서의 핵산에 더하여, 임의의 담체, 예컨대 의약상 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 의약 조성물의 형태로 의약으로서 적용된다.
의약상 허용되는 담체로서는, 예컨대, 자당, 전분 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 에어로질 등의 윤활제, 시트르산, 멘톨 등의 방향제, 안식향산나트륨, 아황산수소나트륨 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수 등의 희석제, 비즈(beeswax) 왁스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 실시형태에서의 핵산의 암 세포 내에의 도입을 촉진하기 위해서, 본 실시형태에서의 의약은 핵산 도입용 시약을 더 포함할 수 있다. 이 핵산 도입용 시약으로서는, 아텔로콜라겐, 리보솜, 나노파티클, 리포펙틴, 리포펙타민, DOGS(트랜스펙탐), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, 폴리브렌 혹은 폴리에틸렌이민 등의 양이온성 지질 등을 이용할 수 있다.
본 실시형태에서의 의약을 아텔로콜라겐에 포함시킴으로써, 표적이 되는 암 세포에 본 실시형태에서의 핵산을 효율적으로 송달하여, 그 세포에 효율적으로 받아들이게 할 수 있다.
본 실시형태에서의 의약은, 경구적으로 또는 비경구적으로 포유동물에 대하여 투여할 수 있지만, 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다.
비경구적인 투여(예컨대, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입, 복강내 투여 등)에 적합한 제제로서는, 수성 및 비수성의 등장의 무균의 주사액제가 있고, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함되어 있어도 좋다. 또한, 수성 및 비수성의 무균의 현탁액제를 들 수 있으며, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함되어 있어도 좋다. 상기 제제는, 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 혹은 복수 회 투여량씩 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 의약상 허용되는 담체를 동결 건조하여, 사용 직전에 적당한 무균의 비히클에 용해 또는 현탁하면 좋은 상태로 보존할 수도 있다. 비경구적인 투여에 적합한 다른 제제로서는, 분무제 등을 예로 들 수 있다. 또한, 방광암의 치료에 이용하기 위한 제제는, 경요도적으로 투여되는 국소 주입제로 하는 것도 바람직하다.
본 실시형태에서의 의약 조성물 중의 핵산 함유량은, 예컨대, 의약 조성물 전체의 약 0.1 내지 100 중량%가 예시된다.
본 실시형태에서의 의약의 투여량은, 투여 목적, 투여 방법, 암의 종류, 크기, 투여 대상자의 상황(성별, 연령, 체중 등)에 따라 다르지만, 성인에게 주사에 의해 국소 투여하는 경우, 통상, 핵산의 양으로서 1 pmol/kg 이상 10 nmol/kg 이하, 전신 투여라면 2 nmol/kg 이상 200 nmol/kg 이하가 바람직하다. 이러한 투여량을 1~10회, 보다 바람직하게는 5~10회 투여하는 것이 바람직하다.
본 실시형태에서의 의약은, 그 유효 성분인 본 실시형태에서의 핵산이 암 조직(암 세포)에 송달되도록, 포유동물(예컨대, 래트, 마우스, 몰모트, 토끼, 양, 말, 돼지, 소, 원숭이, 인간)에 대하여 안전하게 투여된다.
본 실시형태에서의 핵산은 암 세포 증식을 억제하는 활성을 갖는다. 본 실시형태에서의 의약을, 암 환자 등에 대하여 투여함으로써, 암 질환을 치료할 수 있다. 또한, 본 실시형태에서의 핵산이, 암 세포의 침윤능을 저해하는 활성을 갖는 것도 바람직하다. 본 실시형태에서의 의약을, 암 환자나 전이 리스크를 갖는 암 치료 후의 환자 등에 대하여 투여함으로써, 암의 침윤, 전이를 억제하여, 암의 침윤, 전이에 기인하는 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 실시형태에서의 의약은 암 치료제로서 매우 유용하다
한편, 본 명세서에서 말하는 「전이 억제」란, 암 세포가 원발소로부터 다른 부위에 도달하여, 그 부위에서 암을 이차적으로 생기게 하는 것을 억제하는 것을 의미한다.
상기한 것과 같이, 본 실시형태에서의 의약을 적용할 수 있는 암으로서는, miR582의 발현이 감소하고 있는 암이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 유방암, 폐암, 폐장암, 전립선암, 골육종, 식도암, 간암, 위암, 대장암, 직장암, 결장암, 요관종양, 뇌종양, 담낭암, 담관암, 담도암, 신장암, 방광암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 고환종양, 카포시육종, 상악암, 설암, 구순암, 구강암, 인두암, 후두암, 근육종, 피부암, 망막아종 등의 고형암, 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 골수종, 악성흑색종, 혈관종, 진성다혈증, 신경아종 등을 예시할 수 있다. 방광암이나 전이성 암에 대하여 본 실시형태에서의 의약을 적용하는 것을 바람직한 예로서 들 수 있다.
전이성 암으로서는, 예컨대, 유방암, 폐암, 폐장암, 전립선암, 신장암, 다발성 골수종, 갑상선암, 선암, 백혈병 및 림프종을 포함하는 혈액 세포 악성종양, 두경부암, 위암, 결장암, 결장직장암, 간암을 포함하는 소화관암, 난소암, 자궁내막암 및 자궁경부암을 포함하는 여성 생식관의 악성종양, 방광암, 신경아세포종을 포함하는 뇌종양, 육종, 골육종 및 악성흑색종, 그리고 편평상피암을 포함하는 피부암 등의 전이성 암을 예시할 수 있다. 방광암의 전이성 암에 대하여 본 실시형태에서의 의약을 적용하는 것을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 암의 전이에 기인하는 질환으로서는, 예컨대, 전이성 암, 암의 증대나 암성흉막염에 의한 호흡 부전 등을 들 수 있다.
본 실시형태에서의 의약은, 다른 항암제와 병용할 수 있다. 다른 항암제로서는, 예컨대, 탁산류 등의 미소관 작용제뿐만 아니라, 대사길항제, DNA 알킬화제, DNA 결합제(백금 제제), 항암성 항생 물질 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 염산 암루비신, 염산 이리노테칸, 이포스파미드, 에토포시드 라스테트, 게피니팁, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 트라스투주맙, 플루오로우라실, 마이토마이신 C, 메실산 이마티닙, 메토트렉세이트, 리툭산, 아드리아마이신 등을 들 수 있다.
2. 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 예측하는 방법
본 실시형태에서는, 암에 있어서의 miR582의 발현 레벨을 측정하는 것, 그리고 그 발현 레벨이 암에서는 정상 조직과 비교하여 저하하는 것에 기초하여, 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 예측하는 방법 내지 의사가 그 예측을 하는 것을 보조하는 방법(이하, 이들 양 방법을 통합하여 「예측 방법」 등이라고 약칭하는 경우가 있음)을 들 수 있다.
본 실시형태에서의 예측 방법에서는, 본 실시형태에서의 의약 투여 전에 측정 대상 환자로부터 적출된 암 조직 혹은 암 세포에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 측정된다. 또한, 본 명세서의 실시예 2에 있는 것과 같이 miR582의 염색체 영역의 카피수를 측정함으로써, miR582의 발현 레벨을 추정하는 것도 가능하다. 본 실시형태에서의 예측 방법을 적용할 수 있는 암의 종류로서는, 상기 「h. 치료/예방 대상」 항에서 상세히 기재되어 있는 암을 예로 들 수 있다. 본 실시형태에서의 예측 방법은 바람직하게는 방광암에 대하여 적용할 수 있다.
본 실시형태에서의 예측 방법에 있어서 발현 레벨이 측정되는 miR582에는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열, 성숙형 miR582, pri-miRNA 및 pre-miRNA가 포함되는데, 바람직하게는, 이들 모든 형의 발현 레벨의 합계 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 또는 성숙형의 발현 레벨, 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열의 발현 레벨이 측정된다.
예컨대, miR582의 발현 레벨은, 그 miRNA를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 이용하여, 자체 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 그 측정 방법으로서는, 예컨대, RT-PCR, 노던 블로팅, 인시츄(in situ) 하이브리다이제이션, 핵산 어레이 등을 들 수 있다. 또는, 시판되는 키트(예컨대, TaqMan(등록상표) MicroRNA Cells-to-CT Kit)에 의해서도 측정할 수 있다.
miR582를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브로서는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 포함되는, 15 염기 이상, 바람직하게는 18 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상, 가장 바람직하게는 그 전체 길이의 연속된 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 마찬가지로, miR582 활성을 갖는 핵산을 검출할 수 있는 핵산 프로브로서도, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들과 상보적인 서열로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 포함되는, 15 염기 이상, 바람직하게는 18 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상, 가장 바람직하게는 그 전체 길이의 연속된 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다.
핵산 프로브는, 특이적 검출에 지장을 일으키지 않는 범위에서 부가적 서열(검출 대상의 폴리뉴클레오티드와 상보적이 아닌 뉴클레오티드 서열)을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 핵산 프로브는, 적당한 표지제, 예컨대, 방사성 동위 원소(예: 125I, 131I, 3H, 14C 등), 효소(예: β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소 효소 등), 형광 물질(예: 플루오레스카민, 플루오레세인이소티오시아네이트 등), 발광 물질(예: 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등) 등으로 표지되어 있더라도 좋다. 혹은, 형광 물질(예: FAM, VIC 등)의 근방에 상기 형광 물질이 발하는 형광 에너지를 흡수하는 켄처(quencher)(소광 물질)가 더욱 결합되어 있어도 좋다. 이러한 실시양태에서는, 검출 반응할 때에 형광 물질과 켄처가 분리되어 형광이 검출된다.
핵산 프로브는, DNA, RNA, 키메라 핵산의 어느 것이라도 좋고, 또한, 단일쇄라도 이중쇄라도 좋다. 핵산 프로브 또는 프라이머는, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들과 상보적인 서열로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열의 정보에 기초하여, DNA/RNA 자동 합성기를 이용하여 통상의 방법에 따라서 합성할 수 있다.
상기한 것과 같이 하여 측정된 miR582의 발현 레벨에 기초하여, 암의 치료 효과가 예측된다. 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 방광암에서는 정상 방광 조직과 비교하여 miR582의 발현 레벨이 저하된다. 따라서, 상기 예측은 방광암과 정상 조직에 있어서의 miR582의 발현 레벨의 차이에 기초하여 행해진다.
예컨대, 본 실시형태에서의 예측은, 방광암 환자로부터 항암 치료를 하기 전에 암 조직을 적출하여(또는 암 세포를 얻어), 암 조직 주변의 암이 아닌 조직과 암 조직에서의 miR582의 발현 레벨을 비교함으로써 예측할 수 있다. 발현 레벨의 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 그리고, miR582의 발현 레벨의 비교 결과로부터, 암 조직에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 상대적으로 낮은 경우는, miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산을 항암제로서 이용하는 암 치료 혹은 miR582의 발현 레벨을 상승시키는 항암 치료가 유효하다고 예측할 수 있다. 반대로, 측정 대상의 miR582의 발현 레벨이 상대적으로 높은 경우에는 miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산을 항암제로서 이용하는 암 치료 혹은 miR582의 발현 레벨을 상승시키는 항암 치료가 유효하지 않다고 예측할 수 있다.
본 실시형태에서의 의약의 치료 대상으로서는, 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 저하된 방광암 환자가 바람직하기 때문에, 본 실시형태에서의 예측 방법은, 본 실시형태에서의 의약에 의한 치료 효과를 기대할 수 있는 환자, 특히 상기 방광암 환자의 선별에 유용하다. 구체적으로는, 본 실시형태에서의 예측 방법으로 선별되는 환자로서는, 그 환자의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이, 정상 세포에서의 miR582의 발현 레벨에 비해, 75% 이하인 것이 예시되며, 50% 이하인 것이 바람직하고, 25% 이하인 것이 보다 바람직하다.
또한, 마찬가지로, 방광암 환자로부터 적출된 암 조직 및 그 주변의 암이 아닌 정상 조직에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수를 비교하여, miR582의 발현 레벨을 추정함으로써, 본 실시형태에서의 예측 방법을 실시할 수 있다. miR582의 게놈 영역의 카피수의 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 그리고, miR582의 게놈 영역의 카피수의 비교 결과로부터, 측정 대상의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 정상 조직에 대하여, 암 조직에 있어서 상대적으로 적어지는 경우에는, 치료 효과가 높은 암 조직이라고 예측할 수 있다. 반대로, 측정 대상의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 암 조직에 있어서도 정상 조직과 동등 이상인 경우에는, 치료 효과가 낮은 암 조직이라고 예측할 수 있다.
구체적으로는, 본 실시형태에서의 의약의 치료 대상으로서는, 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 정상 세포에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수에 비하여, 75% 이하인 것이 예시되며, 50% 이하인 것이 바람직하고, 25% 이하인 것이 보다 바람직하다.
상기한 설명으로부터 분명한 것과 같이 본 실시형태는, 전술한 miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는, 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 예측하기 위한 조성물(이하, 「본 실시형태에서의 조성물」이라고 부르는 경우가 있음)을 제공하는 것이다. 본 실시형태에서의 조성물은, 항암제의 치료 효과를 예측하기 위한 키트일 수 있다. 본 실시형태에서의 조성물을 이용함으로써, 전술한 예측 방법에 의해 용이하게 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과에 관해서 예측할 수 있다.
핵산 프로브는, 통상 물 혹은 적당한 완충액(예: TE 버퍼, PBS 등) 속에 적당한 농도가 되도록 용해된 수용액의 양태로, 혹은 상기 핵산 프로브가 고상 담체 상에 고정된 핵산 어레이의 양태로, 본 실시형태에서의 조성물에 포함된다.
본 실시형태에서의 조성물은 또한, miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산의 측정 방법에 따라서, 그 방법의 실시에 필요한 다른 성분을 구성으로서 더욱 포함하고 있어도 좋다. 예컨대, 노던 블로팅이나 핵산 어레이를 측정에 이용하는 경우에는, 본 실시형태에서의 조성물은, 블로팅 완충액, 표지화 시약, 블로팅막 등을 더욱 포함할 수 있다. 인시츄 하이브리다이제이션을 측정에 이용하는 경우에는, 본 실시형태에서의 조성물은 표지화 시약, 발색 기질 등을 더 포함할 수 있다.
3. 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 판정하는 방법
본 실시형태로서는, 암에 있어서의 miR582의 발현 레벨을 측정하는 것, 그리고 그 발현 레벨이 암에서는 정상 조직과 비교하여 저하되는 것에 기초하여, 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 판정하는 방법 내지 의사가 상기 판정을 하는 것을 보조하는 방법(이하, 이들 양 방법을 통합하여 「판정 방법」 등이라고 약칭하는 경우가 있음)을 들 수 있다.
본 실시형태에서의 판정 방법에서는, 측정 대상 환자로부터 적출된 암의 암 조직 혹은 암 세포에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 측정된다. 또한, 후기 실시예 2에 있는 것과 같이 miR582의 염색체 영역의 카피수를 측정함으로써 miR582의 발현 레벨을 추정하는 것도 가능하다. 본 실시형태에서의 판정 방법을 적용할 수 있는 암의 종류로서는, 「h. 치료/예방 대상」의 항에서 상세히 기재되어 있는 암을 예로 들 수 있다. 본 실시형태에서의 판정 방법은 바람직하게는 방광암에 대하여 적용할 수 있다.
본 실시형태에서의 판정 방법에서 발현 레벨이 측정되는 miR582에는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열, 성숙형 miR582, pri-miRNA 및 pre-miRNA가 포함되는데, 바람직하게는, 이들 모든 형의 발현 레벨의 합계 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 또는 성숙형의 발현 레벨, 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열의 발현 레벨이 측정된다.
예컨대, miR582의 발현 레벨은, 그 miRNA를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 이용하여, 자체 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 상기 측정 방법으로서는, 예컨대, RT-PCR, 노던 블로팅, 인시츄 하이브리다이제이션, 핵산 어레이 등을 들 수 있다. 또는, 시판되는 키트(예컨대, TaqMan(등록상표) MicroRNA Cells-to-CT Kit)에 의해서도 측정할 수 있다.
miR582를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브로서는, 서열번호 1, 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 포함되는, 15 염기 이상, 바람직하게는 18 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상, 가장 바람직하게는 그 전체 길이의 연속된 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 마찬가지로, miR582 활성을 갖는 핵산을 검출할 수 있는 핵산 프로브로서도, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들과 상보적인 서열로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 포함되는, 15 염기 이상, 바람직하게는 18 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상, 가장 바람직하게는 그 전체 길이의 연속된 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다.
핵산 프로브는, 특이적 검출에 지장을 일으키지 않는 범위에서 부가적 서열(검출 대상의 폴리뉴클레오티드와 상보적이 아닌 뉴클레오티드 서열)을 포함하고 있더라도 좋다. 또한, 핵산 프로브는, 적당한 표지제, 예컨대, 방사성 동위 원소(예: 125I, 131I, 3H, 14C 등), 효소(예: β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소 효소 등), 형광 물질(예: 플루오레스카민, 플루오레세인이소티오시아네이트 등), 발광 물질(예: 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등) 등으로 표지되어 있어도 좋다. 혹은, 형광 물질(예: FAM, VIC 등)의 근방에 그 형광 물질이 발하는 형광 에너지를 흡수하는 켄처(소광 물질)가 더욱 결합되어 있어도 좋다. 이러한 실시양태에서는, 검출 반응을 할 때에 형광 물질과 켄처가 분리되어 형광이 검출된다.
핵산 프로브는, DNA, RNA, 키메라 핵산의 어느 것이라도 좋고, 또한, 단일쇄라도 이중쇄라도 좋다. 핵산 프로브 또는 프라이머는, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 이들과 상보적인 서열로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열의 정보에 기초하여, DNA/RNA 자동 합성기를 이용하여 통상의 방법에 따라서 합성할 수 있다.
상기한 것과 같이 하여 측정된 miR582의 발현 레벨에 기초하여, 항암제의 치료 효과가 판정된다. 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 방광암에서는 정상 방광 조직과 비교하여 miR582의 발현 레벨이 저하된다. 따라서, 상기 판정은 방광암과 정상 조직에 있어서의 miR582의 발현 레벨의 차이에 기초하여 행해진다.
예컨대, 방광암 환자로부터 항암 치료를 하기 전에 암 조직을 적출하여(또는 암 세포를 얻어), 암 조직 주변의 암이 아닌 조직(네거티브 컨트롤) 및 암 조직(포지티브 컨트롤)과, 동일 환자의 항암 치료를 행한 후에 적출한 암 조직에 있어서의 miR582의 발현 레벨을 비교함으로써 본 실시형태에서의 판정 방법을 실시할 수 있다. 발현 레벨의 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 그리고, miR582의 발현 레벨의 비교 결과로부터, 측정 대상의 miR582의 발현 레벨이 치료를 함으로써 치료 전과 비교하여 상대적으로 높아지고 있었던 경우에는, 행했던 항암 치료가 유효하다고 판정할 수 있다. 반대로, 측정 대상의 miR582의 발현 레벨이 상대적으로 낮아지는 경우에는, 행했던 항암 치료가 유효하지 않다고 판정할 수 있다.
구체적으로는, 행했던 항암 치료가 유효하다고 판정하는 경우, 항암 치료 전의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이, 정상 세포에 있어서의 miR582의 발현 레벨에 비하여, 75% 이하인 것이 예시되며, 50% 이하인 것이 바람직하고, 25% 이하인 것이 보다 바람직하다. 또한, 암 치료 후의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이, 암 치료 전의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨에 비하여, 125% 이상인 것이 예시되며, 150% 이상인 것이 바람직하고, 200% 이상인 것이 보다 바람직하다.
또한, 마찬가지로, 방광암 환자로부터 적출된 항암 치료를 하기 전의 암 조직 및 항암 치료를 한 후의 암 조직에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수를 비교하여, 발현 레벨을 추정함으로써, 본 실시형태에서의 예측 방법을 실시할 수 있다. miR582의 게놈 영역의 카피수의 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 그리고, miR582의 게놈 영역의 카피수의 비교 결과로부터, 측정 대상의 miR582의 게놈 영역의 카피수가 항암 치료를 하기 전의 암 조직에 대하여 항암 치료를 한 후의 암 조직에 있어서 상대적으로 적어지는 경우에는, 치료 효과가 낮은 암 조직이라고 판정할 수 있다. 반대로, 측정 대상의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 항암 치료를 하기 전의 암 조직에 대하여 항암 치료를 한 후의 암 조직에 있어서 동등 이상인 경우에는, 치료 효과가 높은 암 조직이라고 판정할 수 있다.
구체적으로는, 행했던 항암 치료가 유효하다고 판정하는 경우, 항암 치료 전의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 정상 세포에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수에 비하여, 75% 이하인 것이 예시되며, 50% 이하인 것이 바람직하고, 25% 이하인 것이 보다 바람직하다. 또한, 암 치료 후의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 암 치료 전의 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 게놈 영역의 카피수에 비하여, 125% 이상인 것이 예시되며, 150% 이상인 것이 바람직하고, 200% 이상인 것이 보다 바람직하다.
또한, miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산이 항암제로서 투여된 경우, 투여된 암 조직에 있어서 마찬가지로 miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산의 양을 측정하고, 투여 전의 암 조직에 있어서의 miR582의 발현과 비교하여 치료 효과를 판정하는 것이 가능하다. 즉, miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산의 투여 후, 암 조직에 있어서, miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산의 양의 증가가 인정된 경우, 행했던 항암 치료가 유효하다고 판정할 수 있다.
본 실시형태에서의 의약의 치료 대상으로서는, 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 저하된 방광암 환자가 바람직하기 때문에, 본 실시형태에서의 판정 방법은, 본 실시형태에서의 의약에 의한 치료 효과를 얻은 환자, 특히 상기 방광암 환자의 판단에 유용하다.
상기한 설명으로부터 분명한 것과 같이, 본 실시형태는, 전술한 miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는, 항암제의 치료 효과를 판정하기 위한 조성물(이하, 「본 실시형태에서의 조성물」이라고 부르는 경우가 있음)을 제공하는 것이다. 본 실시형태에서의 조성물은, 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 판정하기 위한 키트일 수 있다. 본 실시형태에서의 조성물을 이용함으로써, 전술한 판정 방법에 의해 용이하게 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과에 관해서 판정할 수 있다.
핵산 프로브는, 통상, 물 혹은 적당한 완충액(예: TE 버퍼, PBS 등) 속에 적당한 농도가 되도록 용해된 수용액의 양태로, 혹은 상기 핵산 프로브가 고상 담체 상에 고정된 핵산 어레이의 양태로, 본 실시형태에서의 조성물에 포함된다.
본 실시형태에서의 조성물은, miR582 또는 miR582 활성을 갖는 핵산의 측정방법에 따라서, 그 방법의 실시에 필요한 다른 성분을 구성으로서 더 포함하고 있어도 좋다. 예컨대, 노던 블로팅이나 핵산 어레이를 측정에 이용하는 경우에는, 본 실시형태에서의 조성물은, 블로팅 완충액, 표지화 시약, 블로팅막 등을 더 포함할 수 있다. 인시츄 하이브리다이제이션을 측정에 이용하는 경우에는, 본 실시형태에서의 조성물은 표지화 시약, 발색 기질 등을 더 포함할 수 있다.
4. 암 치료의 예후를 판정하는 방법
본 실시형태로서는, 암에 있어서의 miR582의 발현 레벨을 측정하는 것, 그리고 그 발현 레벨이 암에서는 정상 조직과 비교하여 저하되는 것, 혹은 miR582의 게놈 영역의 카피수를 측정하여, miR582의 발현량을 예측하는 것에 기초하여, 암 치료의 예후를 판정하는 방법 내지 의사가 그 예후를 판정하는 것을 보조하는 방법(이하, 이들 양 방법을 통합하여 「예후 판정 방법」 등이라고 약칭하는 경우가 있음)을 들 수 있다.
본 실시형태에서의 예후 판정 방법에서는, 측정 대상 환자로부터 적출된 암의 암 조직 혹은 암 세포에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 측정된다. 또한, miR582의 염색체 영역의 카피수를 측정함으로써 miR582의 발현 레벨을 추정하는 것도 가능하다. 본 실시형태에서의 예후 판정 방법을 적용할 수 있는 암의 종류로서는, 상기 「h. 치료/예방 대상」의 항에서 상세히 기재되어 있는 암을 예로 들 수 있다. 본 실시형태에서의 예후 판정 방법은, 바람직하게는 방광암에 대하여 적용할 수 있다.
본 실시형태에서의 예후 판정 방법에서 발현 레벨이 측정되는 miR582에는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열, 성숙형 miR582, pri-miRNA 및 pre-miRNA가 포함되는데, 바람직하게는, 이들 모든 형의 발현 레벨의 합계 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 또는 성숙형의 발현 레벨, 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열의 발현 레벨이 측정된다.
예컨대, miR582의 발현 레벨은, 상기 miRNA를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 이용하여, 자체 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 상기 측정 방법으로서는, 예컨대, RT-PCR, 노던 블로팅, 인시츄 하이브리다이제이션, 핵산 어레이 등을 들 수 있다. 또는, 시판되는 키트(예컨대, TaqMan(등록상표) MicroRNA Cells-to-CT Kit)에 의해서도 측정할 수 있다.
miR582를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브로서는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 포함되는, 15 염기 이상, 바람직하게는 18 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상, 가장 바람직하게는 그 전체 길이의 연속된 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다.
또한, miR582의 발현 레벨은 그 miRNA가 코드되는 게놈 영역의 카피수를 측정함으로써 추정할 수 있다.
miR582가 코드되는 게놈 영역을 특이적으로 검출하여, 카피수를 측정할 수 있는 핵산 프로브로서는, 예컨대, 후기하는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 포함되는, 15 염기 이상, 바람직하게는 18 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상, 가장 바람직하게는 그 전체 길이의 연속된 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다.
핵산 프로브는, 특이적 검출에 지장을 일으키지 않는 범위에서 부가적 서열(검출 대상의 폴리뉴클레오티드와 상보적이 아닌 뉴클레오티드 서열)을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 핵산 프로브는, 적당한 표지제, 예컨대, 방사성 동위 원소(예: 125I, 131I, 3H, 14C 등), 효소(예: β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소 효소 등), 형광 물질(예: 플루오레스카민, 플루오레세인이소티오시아네이트 등), 발광 물질(예: 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등) 등으로 표지되어 있어도 좋다. 혹은, 형광 물질(예: FAM, VIC 등)의 근방에 그 형광 물질이 발하는 형광 에너지를 흡수하는 켄처(소광 물질)가 더욱 결합되어 있어도 좋다. 이러한 실시양태에서는, 검출 반응을 할 때에 형광 물질과 켄처가 분리되어 형광이 검출된다.
핵산 프로브는, DNA, RNA, 키메라 핵산의 어느 것이라도 좋고, 또한, 단일쇄라도 이중쇄라도 좋다. 핵산 프로브 또는 프라이머는, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열의 정보에 기초하여, DNA/RNA 자동 합성기를 이용하여 통상의 방법에 따라서 합성할 수 있다.
상기한 것과 같이 하여 측정된 miR582의 발현 레벨에 기초하여, 암 치료의 예후가 판정된다. 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 방광암에서는 정상 방광 조직과 비교하여 miR582의 발현 레벨이 저하한다. 따라서, 상기 예측은 방광암과 정상 조직에 있어서의 miR582의 발현 레벨의 차이, 혹은 miR582의 게놈 영역의 카피수를 측정하여, miR582의 발현량을 추정하는 것에 기초하여 행해진다.
예컨대, 방광암 환자로부터 암 조직을 적출하여(또는 암 세포를 얻어), 암 조직 주변의 암이 아닌 정상 조직 및 암 조직에 있어서의 miR582의 발현 레벨을 비교함으로써 본 실시형태에서의 예후 판정 방법을 실시할 수 있다. 발현 레벨의 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 그리고, miR582의 발현 레벨의 비교 결과로부터, 측정 대상의 miR582의 발현 레벨이, 정상 조직에 대하여, 암 조직에 있어서 상대적으로 높아지는 경우에는, 예후가 좋은 암 조직이라고 판정할 수 있다. 반대로, 측정 대상의 miR582의 발현 레벨이 상대적으로 낮아지는 경우에는, 예후가 나쁜 암 조직이라고 판정할 수 있다.
구체적으로는, 예후가 나쁘다고 판정하는 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이, 정상 세포에 있어서의 miR582의 발현 레벨에 비하여, 75% 이하인 것이 예시되며, 50% 이하인 것이 바람직하고, 25% 이하인 것이 보다 바람직하다.
또한, 마찬가지로, 방광암 환자로부터 적출된 암 조직 및 그 주변의 암이 아닌 정상 조직에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수를 비교하여 발현 레벨을 추정함으로써, 본 실시형태에서의 예후 판정 방법을 실시할 수 있다. miR582의 게놈 영역의 카피수의 비교는, 바람직하게는 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 그리고, miR582의 게놈 영역의 카피수의 비교 결과로부터, 측정 대상의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 정상 조직에 대하여, 암 조직에 있어서 상대적으로 적어지는 경우에는, 낮은 miR582의 발현 레벨이 예측되어, 예후가 나쁜 암 조직이라고 판정할 수 있다. 반대로, 측정 대상의 miR582의 게놈 영역의 카피수가 정상 조직과 동등 이상인 경우에는, 높은 miR582의 발현 레벨이 예측되어, 예후가 좋은 암 조직이라고 판정할 수 있다.
구체적으로는, 예후가 나쁘다고 판정하는 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수가, 정상 세포에 있어서의 miR582의 게놈 영역의 카피수에 비하여, 75% 이하인 것이 예시되며, 50% 이하인 것이 바람직하고, 25% 이하인 것이 보다 바람직하다.
본 실시형태에서의 의약의 치료 대상으로서는, 암 조직(또는 암 세포)에 있어서의 miR582의 발현 레벨이 저하된 방광암 환자가 바람직하기 때문에, 본 실시형태에서의 예후 판정 방법은, 본 실시형태에서의 의약에 의한 치료의 예후가 양호한 환자, 특히 상기 방광암 환자의 판정에 유용하다.
상기한 설명으로부터 분명한 것과 같이, 본 실시형태는, 전술한 miR582를 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브, 혹은 miR582의 게놈 영역을 특이적으로 검출하여 그 카피수를 측정할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는, 암 치료의 예후를 판정하기 위한 조성물(이하, 「본 실시형태에서의 조성물」이라고 부르는 경우가 있음)을 제공하는 것이다. 본 실시형태에서의 조성물은, 암 치료의 예후를 판정하기 위한 키트일 수 있다. 본 실시형태에서의 조성물을 이용함으로써, 전술한 판정방법에 의해 용이하게 암 치료의 예후에 관해서 판정할 수 있다.
핵산 프로브는, 통상 물 혹은 적당한 완충액(예: TE 버퍼, PBS 등) 속에 적당한 농도가 되도록 용해된 수용액의 양태로, 혹은 상기 핵산 프로브가 고상 담체 상에 고정된 핵산 어레이의 양태로, 본 실시형태에서의 조성물에 포함된다.
본 실시형태에서의 조성물은, miR582의 측정 방법, 혹은 miR582의 게놈 영역의 카피수의 측정 방법에 따라서, 그 방법의 실시에 필요한 다른 성분을 구성으로서 더 포함하고 있어도 좋다. 예컨대, 노던 블로팅이나 핵산 어레이를 측정에 이용하는 경우에는, 본 실시형태에서의 조성물은, 블로팅 완충액, 표지화 시약, 블로팅막 등을 더 포함할 수 있다. 인시츄 하이브리다이제이션을 측정에 이용하는 경우에는, 본 실시형태에서의 조성물은 표지화 시약, 발색 기질 등을 더 포함할 수 있다.
5. 방광암의 증식을 억제할 수 있는 물질, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질 등을 탐색하는 방법
본 실시형태로서는, 피검 물질이 miR582의 발현을 증강하는지 여부를 평가하는 것을 포함하는, 암의 증식을 억제하는 물질을 탐색하는 방법, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는 방법, 그리고 그 방법에 의해 얻을 수 있는 물질을 들 수 있다. 본 실시형태에서의 탐색 방법에서는, miR582의 발현을 상승 제어하는 물질이, 암의 증식을 억제할 수 있는 물질, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질로서 선택된다.
본 실시형태에서의 탐색 방법에 제공되는 피검 물질은, 어떠한 공지 화합물 및 신규 화합물이라도 좋으며, 예컨대, 핵산, 당질, 지질, 단백질, 펩티드, 유기 저분자 화합물, 조합 화학(combinatorial chemistry) 기술을 이용하여 제작된 화합물 라이브러리, 랜덤 펩티드 라이브러리, 혹은 미생물, 동식물, 해양생물 등에서 유래하는 천연 성분 등을 들 수 있다.
본 실시형태에서의, 암의 증식을 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 방법은 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함한다:
(1) 피검 물질과 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 공정,
(2) 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 측정하여, 그 발현량을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량과 비교하는 공정, 및
(3) 상기 (2)의 비교 결과에 기초하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 상승 제어하는 피검 물질을, 암의 증식을 저해할 수 있는 물질로서 선택하는 공정.
또한, 본 실시형태에서의, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는 방법은 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함한다:
(1) 피검 물질과 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 공정,
(2) 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 측정하여, 그 발현량을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량과 비교하는 공정, 및
(3) 상기 (2)의 비교 결과에 기초하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 상승 제어하는 피검 물질을, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질로서 선택하는 공정.
본 실시형태에서의 탐색 방법에서, 발현 레벨이 측정되는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산에는, 성숙형 miR582, pri-miRNA 및 pre-miRNA가 포함되는데, 바람직하게는, 이들 모든 형의 발현 레벨의 합계 또는 성숙형의 발현 레벨, 보다 바람직하게는 성숙형의 발현 레벨이 측정된다.
「발현을 측정할 수 있는 세포」란, 측정 대상의 miRNA의 발현 레벨을 평가할 수 있는 세포를 말한다. 그 세포로서는, 측정 대상의 miRNA를 천연으로 발현할 수 있는 세포를 들 수 있다.
측정 대상, 즉 miR582를 천연으로 발현할 수 있는 세포는, miR582를 잠재적으로 발현하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 그 세포로서, 포유동물(예컨대 인간, 마우스 등)의 초대 배양 세포, 이 초대 배양 세포로부터 유도된 세포주 등을 이용할 수 있다. miR582를 천연으로 발현할 수 있는 세포로서는, 예컨대 상기 「h. 치료/예방 대상」의 항에서 상세히 기재되어 있는 암 세포를 들 수 있다. 바람직하게는 방광암 세포이며, 보다 바람직하게는 전이성 또는 침윤능이 높은 방광암 세포이다.
피검 물질과 miR582의 발현을 측정할 수 있는 세포와의 접촉은 배양 배지 속에서 이루어진다. 배양 배지는, miR582의 발현을 측정할 수 있는 세포에 따라서 적절하게 선택되는데, 예컨대, 약 5~20%의 소 태아 혈청을 포함하는 최소 필수 배지(MEM), 둘베코 개변 이글 배지(DMEM) 등이다. 배양 조건도 마찬가지로 적절하게 결정되는데, 예컨대, 배지의 pH는 약 6~약 8이며, 배양 온도는 통상 약 30~약 40℃이고, 배양 시간은 약 12~약 72 시간이다.
miR582의 발현량의 측정은, 「2. 본 실시형태에서의 의약의 치료 효과를 예측하는 방법」의 항에서 설명한 방법에 따라서 행할 수 있다.
발현량의 비교는, 바람직하게는, 유의차의 유무에 기초하여 행해질 수 있다. 한편, 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 miR582의 발현량은, 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 miR582의 발현량의 측정에 대하여, 사전에 측정한 발현량이라도, 동시에 측정한 발현량이라도 좋지만, 실험의 정밀도, 재현성의 관점에서 동시에 측정한 발현량인 것이 바람직하다.
그리고, 비교 결과 얻어진, miR582의 발현량을 상승 제어하는 물질이, 암 세포의 증식을 억제할 수 있는 물질, 암의 전이 또는 암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질로서 선택된다.
본 실시형태에서의 탐색 방법으로 얻어지는 화합물은 새로운 암 치료제의 개발을 위한 후보 물질로서 유용하다.
실시예
이하에 본 발명의 실시예를 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 한편, 본 명세서에서, 특별히 양해를 구하지 않는 한 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 향해 기재된다. 또한, 이하의 실시예에서는, 서열번호 1과 서열번호 2가 이중쇄를 형성한 RNA(식(■) 참조)를 「miR582」라고 약기한다. 또한, 서열번호 1과 그 상보쇄로 이중쇄를 형성하고, 또한 양 쇄의 3' 말단에 염기 「aa」가 부가된 이중쇄의 RNA를 「miR582-5p」라고 약기한다. 또한, 서열번호 2와 그 상보쇄로 이중쇄를 형성하고, 또한 양 쇄의 3' 말단에 염기 「aa」가 부가된 이중쇄의 RNA를 「miR582-3p」라고 약기한다.
[실시예 1] 방광암 세포에 있어서의 miR582의 발현
인간 방광암 세포주 UM-UC-3, 5637, T24 및 HT1376, 그리고 인간 방광 이행 상피성 유두종 세포주 RT4 및 마우스 방광암 세포 MBT2 세포로부터, RNA를, QIAzol(제품명, Invitrogen사)과 miRNeasy 미니 키트(제품명, Qiagen)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 정제했다. 인간 방광암 세포의 RNA는 Ambion사의 인간 방광 총 RNA를 이용했다. miR582-5p와 miR582-3p의 발현은 TaqMan MicroRNA 어세이(분석)(제품명, Applied Biosystems사)를 이용하여 정량했다. 정량 PCR 반응은 ABI7300(제품명, Applied Biosystems사)를 이용하고, 내부 표준에는 인간 RNU6B(4373381, Applied Biosystems사) 혹은 has-miR-103(Applied Biosystems사)을 이용했다. 인간 방광 이행 상피성 유두종 세포주 RT4 및 정상 방광 세포에서는, miR582-5p 및 miR582-3p의 발현은 높았다. 방광암 세포 UM-UC-3, 5637, HT1376 및 MBT2에서는, 전체적으로 miR582-5p 및 miR582-3p의 발현은 저하하고 있고, 침윤능이 높은 방광암 세포주인 UM-UC-3, HT1376 및 MBT2에서는 분명히 발현이 저하되었다(도 1). T24는 침윤능이 높은 방광암 세포주이지만, 이 세포주에서는 miR582-5p 및 miR582-3p의 발현의 현저한 저하는 인정되지 않았다.
이상의 결과로부터, 방광암 세포에서는, miR582-5p 및 miR582-3p의 발현이 저하하고 있는 비율이 높을 가능성이 시사되었다.
[실시예 2] miR582의 염색체 영역의 카피수의 검토
인간 방광암 세포 UM-UC-3, T24 및 HT1376으로부터 게놈 DNA를, GenElute 포유동물용 게놈 DNA 미니프렙 키트(Sigma-Aldrich사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 추출했다. 염색체 5q12 상의 miR582 영역의 정량 PCR은, 백금 SYBR 그린(Green) qPCR SuperMix-UDG(제품명, Invitrogen사)를 이용하여 행했다. 정량 PCR에 이용한 프라이머 서열을 서열번호 4와 서열번호 5에 나타낸다.
Figure 112015011436364-pct00003
내부 표준에는 RNase P를 이용하여, TaqMan 카피수 기준 분석 RNase P(4403326, Applied Biosystems사)와 백금 정량 PCR SuperMix-UDG(제품명, Invitrogen)로 정량을 행하여, 앞의 miR582 영역의 정량 PCR 데이터의 보정을 시행했다. 정량을 행한 결과, T24 및 HT1376과 비교하여, 전이능 및 침윤능이 높은 방광암 세포인 UM-UC-3에서는, miR582의 염색체 영역의 카피수는 약 반으로 감소하고 있었다(도 2). 이상의 결과로부터, miR582의 발현 저하에는 miR582의 게놈의 카피수가 관여하고 있을 가능성이 시사되었다.
[실시예 3] miR582에 의한 인간 방광암 세포주 UM-UC-3의 증식 억제 활성
인간 방광암 세포주 UM-UC-3의 증식 억제 활성의 확인에는, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p을 이용했다. 이들은 모두 BONAC사로부터 구입했다. 네거티브 컨트롤에는 Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA(Qiagen)를 이용했다. UM-UC-3 세포주에 상기한 각 miRNA를, 각각 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입했다. 그 세포를, 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, 3,000 세포/웰로 96 웰 플레이트에 다시 파종했다. 더 3일간 배양 후, 생세포수를, 테트라 컬러 원 어세이 키트(제품명, 세이가가쿠고교사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 450 nm의 흡광도를 Envision(PerkinElmer사)으로 측정함으로써 평가했다.
그 결과, 네거티브 컨트롤에 비하여, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p를 도입한 UM-UC-3 세포주에서는, 그 세포 증식이 유의하게 억제되었다(도 3, p<0.01). 이 결과로부터, miR582 등은, 방광암 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 것이 명백해 졌다.
[실시예 4] miR582에 의한 인간 방광암 세포주 UM-UC-3의 침윤 억제 활성
UM-UC-3 세포주에, 실시예 3에서 이용한 것과 같은, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p 혹은 Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA(Qiagen)를, 각각 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입했다. 그 세포를, 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, 세포 침윤 분석에 제공했다. 이 분석은, 24-웰 바이오코트 마트리겔 침윤 챔버(8 ㎛, Becton Dickinson사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 행했다. 상세하게는, 세포를 100,000 세포/웰로 24 웰 플레이트의 상부 챔버에 파종하고, 하부 챔버의 배양액에는 최종농도 10%로 FBS를 첨가했다. 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, 투과막의 상부 챔버 측에 부착된 세포를 닦아내고, 하부 챔버 측에 침윤된 세포를 딥퀵(시스멕스사)으로 고정, 염색했다. 현미경 하에서 랜덤한 3 시야에서의 침윤된 세포수를 카운트하여, 각 실험군에 있어서의 침윤 세포수를 구했다.
그 결과, 컨트롤에 비하여, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p를 도입한 UM-UC-3 세포주에서는, 그 세포 침윤이 유의하게 억제되었다(도 4, p<0.01). 이 결과로부터, miR582 등은, 방광암 세포의 침윤을 억제하는 활성을 갖는 것이 명백해 졌다.
[실시예 5] miR582에 의한 마우스 방광암 모델의 치료 효과
마우스에 대하여, 루시퍼라제 유전자를 발현하는 UM-UC-3 세포(UM-UC-3-LUC)의 5,000,000 세포개를 방광내 투여하여 암 이식을 행했다. 암의 증식과 전이는 주에 1회의 빈도로 생체내 이미징(imaging)에 의해 관찰했다. 즉, D-루시페린(Promega사)을 150 mg/kg으로 복강내 투여하여 10분간 방치한 후, 암 조직에 있어서의 생물 발광을 IVIS 이미징 시스템(Xenogen사)을 이용하여, 제품에 첨부된 방법에 따라서 광자 계수로 검출하여, 암의 증식을 측정했다. 데이터 해석은 LivingImage 소프트웨어(버젼 2.5, Xenogen사)로 행했다. 암 이식 후 4일째에 이식한 암의 크기를 생물 발광으로 측정하여, 군 사이에서 발광량이 가지런하도록 마우스를 2군으로 나누었다.
실시예 3에서 이용한 것과 같은 miR-582, 혹은 miR582-스크램블(scramble) 컨트롤(서열번호 6과 서열번호 7)과 LIC101(닛폰신야쿠)을 1:16(w/w)의 비로 이용하여 복합체를 형성했다. 이 복합체를, 암 이식 후, 5, 7, 9, 11, 13, 15일째에, 경요도적으로 10 μg(핵산량)/70 μl로 투여했다. 생물 발광 관찰은 암 이식 후 1, 2, 3, 4주째에 행하여, 암의 크기를 측정했다.
Figure 112015011436364-pct00004
그 결과, 3주째부터 miR-582 투여군에서 암 조직의 증식 억제가 관찰되고, 4주째에는 스크램블 컨트롤 투여군과 비교하여 유의한 암 증식 억제가 관찰되었다(도 5, p<0.05). 또한, 암 이식 후 28일째에 마우스를 도살하여, 폐에 전이된 UM-UC-3-LUC의 검출을, 생물 발광을 지표로 행했다. 그 결과, 스크램블 컨트롤 투여군에서는 8 마리 중 5 마리의 마우스에서 전이(metastasis)가 확인되었지만, miR582 투여군에서는 10 마리 중 1 마리의 마우스에서만 전이가 확인되었다(표 1).
Figure 112015011436364-pct00005
또한, 폐에 전이된 UM-UC-3-LUC의 정량을, 생물 발광을 지표로 행한 결과, 스크램블 컨트롤 투여군과 비교하여 miR582 투여군에서 유의한 발광 저하가 관찰되었다(도 6, p<0.05).
이상의 결과로부터, miR582는 동물 모델에 있어서도 방광암 세포의 증식과 전이를 억제하는 활성을 갖는 것이 명백해 졌다.
[실시예 6] miR582의 표적 유전자의 예측
miR582의 표적 유전자를 동정하기 위해서, 이하의 실험을 하여, 각 실험에서 표적 후보 유전자를 추출했다.
1) 하기 실험에 이용하는 안정 발현 세포를 다음과 같이 수립했다. pHA-hAGO2-Puro(RA703A-1, SBI)를 ViraPower 패키징 믹스(K4975-00, Invitrogen)와 함께, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 L293T 세포에 트랜스펙트했다. 그 세포를 37℃, 5% CO2로 48시간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 바이러스 용액으로 했다. 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 바이러스를 UM-UC-3 세포에 감염시키고, 2 μg/ml의 퓨로마이신 존재 하에서, 37℃, 5% CO2로 2주간 배양하여, HA-AGO2를 안정적으로 발현하는 UM-UC-3/HA-AGO2를 얻었다. Pre-miR582 서열은 서열번호 8과 서열번호 9를 프라이머에 이용하여, HT1376 세포주의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켜, pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA 클로닝 및 발현 벡터(CD513B-1, SBI)의 EcoRI와 BamHI 사이트에 클로닝했다.
Figure 112015011436364-pct00006
이 플라스미드를 ViraPower 패키징 믹스(K4975-00, Invitrogen)와 함께, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 L293T 세포에 트랜스펙트했다. 그 세포를 37℃, 5% CO2로 48시간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 바이러스 용액으로 했다. 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 바이러스를 UM-UC-3 세포에 감염시키고, 2 μg/ml의 퓨로마이신 존재 하에서, 37℃, 5% CO2로 2주간 배양하여, miR582를 안정적으로 발현하는 UM-UC-3/miR582를 얻었다. Lenti-scramble shRNA(MZIP000PA-1, SBI)는 ViraPower 패키징 믹스(K4975-00, Invitrogen)와 함께, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 L293T 세포에 트랜스펙트했다. 그 세포를 37℃, 5% CO2로 48시간 배양 후, 배양 상청을 회수하여 바이러스 용액으로 했다. 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 바이러스를 UM-UC-3 세포에 감염시키고, 2 μg/ml의 퓨로마이신 존재 하에서, 37℃, 5% CO2로 2주간 배양하여, 스크램블 컨트롤의 shRNA를 안정적으로 발현하는 UM-UC-3/shNC를 얻었다.
2) HA-AGO2를 발현하는 UM-UC-3 세포에 miR582 혹은 컨트롤 siRNA(Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA, Qiagen)를, 각각 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입하고, 37℃, 5% CO2로 48시간 배양했다. 그 후에 microRNA를 위한 RIP-분석 키트(MBL사)와 항HA 아가로스 비드(와코쥰야쿠사)를 이용하여 RNA-결합 단백질 면역 침강(RIP)을 행했다. AGO2에 결합한 RNA를 HA펩티드(와코쥰야쿠사)로 용출하고, QIAzol(Invitrogen사)과 miRNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 추출, 정제했다. 얻어진 RNA는 저입력 퀵 앰프 라벨링 키트, 원 컬러(Low Input Quick Amp Labeling Kit, one color)(Agilent사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 Cy3으로 표지하고, SurePrint G3 인간 GE 마이크로어레이 키트 8x60K(제품명, Agilent사)에 하이브리다이즈시켜, 마이크로어레이 데이터를 취득했다. 얻어진 마이크로어레이 데이터는 GeneSpring GX11.5(토미디지탈)로 해석을 했다. 그 결과, AGO2와 miR582와 복합체를 형성한 miR582의 표적 후보 유전자를 9,266 유전자를 동정했다.
3) UM-UC-3 세포에 miR582 혹은 Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA를, 각각 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입했다. 그 세포를, 37℃, 5% CO2로 48시간 배양 후, 각각의 세포로부터 RNA를, QIAzol(Invitrogen 사)과 miRNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 추출, 정제했다. 얻어진 RNA는, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서, 저입력 퀵 앰프 라벨링 키트, 원 컬러(제품명, Agilent사)를 이용하여 Cy3으로 표지하고, SurePrint G3 인간 GE 마이크로어레이 키트 8x60K(제품명, Agilent사)에 하이브리다이즈시켜, 마이크로어레이 데이터를 취득했다. 얻어진 마이크로어레이 데이터는 GeneSpring GX11.5(토미디지탈)로 해석을 했다. miR582를 트랜스펙트한 UM-UC-3 세포와 Allstars siRNA를 트랜스펙트한 UM-UC-3 세포의 발현 데이터를 비교하여, miR582를 도입한 UM-UC-3 세포에서 발현 저하된 유전자를 miR582의 표적 후보 유전자로서 7,399 유전자를 동정했다.
4) UM-UC-3/miR582와 UM-UC-3/shNC의 각각으로부터 RNA를, QIAzol(Invitrogen 사)와 miRNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 추출, 정제했다. 얻어진 RNA는, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서, 저입력 퀵 앰프 라벨링 키트, 원 컬러(제품명, Agilent)를 이용하여 Cy3으로 표지하고, SurePrint G3 인간 GE 마이크로어레이 키트 8x60K(제품명, Agilent)에 하이브리다이즈시켜, 마이크로어레이 데이터를 취득했다. 얻어진 마이크로어레이 데이터는 GeneSpring GX11.5(토미디지탈)로 해석을 했다. UM-UC-3 miR582 세포와 UM-UC-3 shNC 세포의 발현 데이터를 비교하여, UM-UC-3 miR582 세포에서 발현 저하하고 있는 유전자를 miR582의 표적 후보 유전자로서 10,203 유전자를 동정했다.
5) miR582의 직접 표적이 되는 후보 유전자군으로서, 상기 2), 3)과 4)의 군 사이에서 중복된 259 유전자(직접 표적 후보 유전자군 I)를 추출했다. 그 중에서 암과의 관련성이 문헌 등에서 시사되어 있는 유전자는 38 유전자 존재하고, 또한 암의 증식, 침윤, 전이와의 관련성이 문헌 등에서 시사되어 있는 유전자를 19 유전자 추출했다.
6) miR582의 간접적인 표적이 되는 후보 유전자군으로서, 상기 3)과 4)의 군 사이에서 중복되면서 상기 2)와는 중복되지 않는 유전자를 1,559 유전자 추출했다(간접 표적 후보 유전자군 I). 또한 상기 3)의 실험에서 발현 변동량이 2배 이상이고 P 값<0.05이면서 상기 4)의 실험에서 발현 변동량이 1.7배 이상이고 p 값<0.05이었던 유전자를 7 유전자 추출했다.
7) TargetScan(http://www.targetscan.org/)을 하여, miR582-5p의 예상 표적 유전자, 스코어 상위 50 유전자와 miR582-3p의 예상 표적 유전자, 스코어 상위 50 유전자, 계 100 유전자를 추출하고, 암의 증식, 침윤, 전이와의 관련성이 문헌 등에서 시사되어 있는 유전자를 35 유전자 추출하고, 상기 5)의 직접 표적 유전자군 I 혹은 6)의 간접 표적 유전자군 I과 중복되는 유전자를 20 유전자 추출했다.
8) 상기 5), 6), 7)에서 최종적으로 추출된 46 유전자를 miR582의 표적 유전자라고 예측했다.
[실시예 7] miR582의 표적 유전자의 동정
실시예 6에서 miR582의 표적 유전자라고 예측한 46 유전자 중, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A 유전자 5종에 관해서, 그 유전자 발현을 miR582가 도입된 UM-UC-3 세포로 검토했다. 실시예 3에서 이용한 것과 같은 miR582, miR582-5p 및 miR582-3p 혹은 컨트롤 siRNA(Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA, Qiagen)를, 각각 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입했다. 그 후, 37℃, 5% CO2로 24시간 배양한 UM-UC-3 세포로부터 RNA를, QIAzol(Invitrogen사)과 miRNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 추출, 정제했다. 얻어진 RNA로부터, 고역량 cDNA 역전사 키트(제품명, Applied Biosystems사)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 cDNA를 합성했다. cDNA에 관해서, 백금 SYBR 그린 qPCR SuperMix-UDG(앞에 나옴)를 이용하여 정량 PCR를 하여 각 유전자의 정량을 실시했다. 내부 표준에는 β 액틴을 이용하여, 각 유전자의 발현 데이터의 표준화를 실시했다. 정량 PCR에 이용한 각 프라이머 서열은, KCNC1에 관해서는 서열번호 10과 서열번호 11, PGGT1B에 관해서는 서열번호 12와 서열번호 13, LRRK2에 관해서는 서열번호 14와 서열번호 15, RAB27A에 관해서는 서열번호 16과 서열번호 17, DIXDC1에 관해서는 서열번호 18과 서열번호 19, 그리고 β 액틴에 관해서는 서열번호 20과 서열번호 21에 나타낸다.
Figure 112015011436364-pct00007
그 결과, KCNC1, LRRK2, DIXDC1은, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p를 UM-UC-3 세포에 트랜스펙트함으로써 그 발현이 유의하게 감소했다(도 7, p<0.01). RAB27A는 miR582 및 miR582-5p를 UM-UC-3 세포에 트랜스펙트함으로써 그 발현이 유의하게 감소했다(p<0.01)(도 7). PGGT1B는, miR582를 UM-UC-3 세포에 트랜스펙트함으로써 그 발현이 유의하게 감소했다(도 8, p<0.01). 또한, miR582-5p에서는 발현을 억제하는 경향이 있었다(도 7).
이상의 결과로부터, KCNC1, LRRK2, DIXDC1은, miR582를 구성하는 miR582-5p 및 miR582-3p의 양 서열의 표적 유전자이지만, RAB27A는 miR582를 구성하는 miR582-5p의 표적 유전자임이 드러났다. PGGT1B는 miR582를 구성하는 miR582-5p의 표적 유전자일 가능성이 드러났다.
[실시예 8] miR582의 표적 유전자의 발현 억제 기전의 해석
KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A 유전자의 3'-UTR 영역을, 인간 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭하여, psiCHECK-2 플라스미드(Promega사)의 NotI와 XhoI 사이트에 클로닝했다. KCNC1의 3'-UTR 영역(KCNC1-#1; KCNC1 mRNA 내의 위치, 3,955-5,450 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 22와 서열번호 23에, KCNC1의 3'-UTR 영역(KCNC1-#2; KCNC1 mRNA 내의 위치, 5,712-6,698 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 24와 서열번호 25에 나타낸다. PGGT1B의 3'-UTR 영역(PGGT1B mRNA 내의 위치, 1,178-2,713 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 26과 서열번호 27에, LRRK2의 3'-UTR 영역(LRRK2 mRNA 내의 위치, 7,777-9,130 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 28과 서열번호 29에, RAB27A의 3'-UTR 영역(RAB27A mRNA 내의 위치, 1,988-2,533 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 30과 서열번호 31에 나타낸다. DIXDC1의 3'-UTR 영역(DIXDC1-#1; DIXDC1 mRNA 내의 위치, 2,908-4,420 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 32와 서열번호 33에, DIXDC1의 3'-UTR 영역(DIXDC1-#2; DIXDC1 mRNA 내의 위치, 5,465-5,890 bp)의 증폭에 이용한 PCR 프라이머는 서열번호 34와 서열번호 35에 나타낸다.
Figure 112015011436364-pct00008
이들 리포터 플라스미드 100 ng과, 각 25 nM의, 실시예 3에서 이용한 것과 같은 miR582, miR582-5p 및 miR582-3p 혹은 컨트롤 siRNA(Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA, Qiagen)를 UM-UC-3 세포에, DharmFECT Duo transfection 시약(Thermo Fisher Scientific사)을 이용하여, 96 웰 플레이트 상에서 트랜스펙트했다. 세포를 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, Dual-Glo 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)을 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 듀얼 루시퍼라제 분석을 시행했다. 레닐라 루시퍼라제의 값을 반딧불이 루시퍼라제의 값으로 보정하여, 리포터 활성을 구했다.
그 결과, PGGT1B, LRRK2 및 DIXDC1-#1은, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p로 루시페레아제 활성이 유의하게 감소했다(도 8, p<0.01). RAB27A는, miR582 및 miR582-5p로 루시퍼라제 활성이 유의하게 감소했다(도 8, p<0.01). 또한, KCNC1-#1과 KCNC1-#2는 어느 miRNA 서열을 이용하더라도 루시퍼라제 활성의 감소는 확인되지 않았다.
이상의 결과로부터, PGGT1B, LRRK2 및 DIXDC1의 3'-UTR에는, miR582, miR582-5p 및 miR582-3p의 타겟 서열이 존재하는 것이 분명해졌다. RAB27A의 3'-UTR에는, miR582-5p의 타겟 서열이 존재하는 것이 분명해졌다. 또한, KCNC1의 3'-UTR에는, 어느 miRNA의 타겟 서열도 존재하지 않으며, 이 유전자는 간접적으로 miR582에 의해 발현 억제를 받는 것이 분명해졌다. DIXDC1#2에는, miR582-3p의 타겟 서열의 존재가 예측되었지만, 이 서열은 기능하지 않았음이 분명해졌다.
[실시예 9] miR582에 의한 표적 유전자의 단백 발현 억제
UM-UC-3 세포에, miR582 혹은 컨트롤 siRNA(Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA, Qiagen)를, 각각 25 nM의 농도로 DharmFECT1(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 트랜스펙션했다. 37℃, 5% CO2로 48시간 배양 후, 세포를 회수하여, M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(제품명, Pierce사)을 이용하여 세포 라이세이트를 조제했다. 라이세이트 중의 세포 단백을 SDS-PAGE로 전기 영동하고, 정해진 방법에 따라서 웨스턴 블로팅을 행했다. 블로킹(Bloking ONE, 03953-95, 나카라이테스크사)을 행한 후, 항KCNC1 항체(1:500 희석, ab84823, Abcam), 항PGGT1B 항체(1:500 희석, ab55615, Abcam), 항LRRK2 항체(1:500 희석, ab57329, Abcam), 항DIXDC1 항체(1:500 희석, ab67763, Abcam) 및 항RAB27A 항체(1:200 희석, ab55667, Abcam)를 일차 항체에 사용했다. HRP-결합 항마우스 이차 항체(NA931V, GE Healthcare)는 1:5000의 희석으로 이차 항체에 이용했다. 목적 단백질의 검출은 ECL 플러스 웨스턴 블로팅 시스템(제품명, GE헬스케어사)을 이용하여, LuminoImager(LAS-3000, 후지샤신필름사)로 행했다. 그 결과, miR582를 트랜스펙트한 UM-UC-3 세포에서는, 컨트롤과 비교하여 KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A의 단백량의 감소가 확인되었다(도 9).
이상으로부터, miR582는, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A를 표적 유전자로 하여, 이들 단백질의 발현을 억제하는 활성이 있음이 분명해졌다.
[실시예 10] miR582 표적 유전자의 넉다운과 방광암 세포의 증식 억제 효과
하기, 시험에 이용한 KCNC1의 siRNA의 서열을 서열번호 36과 서열번호 37에, PGGT1B의 siRNA 서열을 서열번호 38과 서열번호 39에, LRRK2의 siRNA 서열을 서열번호 40과 서열번호 41에, RAB27A의 siRNA 서열을 서열번호 42와 서열번호 43에, DIXDC1의 siRNA 서열을 서열번호 44와 서열번호 45에 나타낸다.
Figure 112015011436364-pct00009
UM-UC-3 세포주에, 각 siRNA 혹은 Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA(Qiagen)를 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입했다. 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, 세포를 3,000 세포/웰로 96 웰 플레이트에 다시 파종했다. 그 세포를 더 3일간 배양한 후, 생세포수를, 테트라 컬러 원 어세이 키트(세이가가쿠고교사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 450 nm의 흡광도를 Envision(PerkinElmer사)로 측정함으로써 평가했다. 그 결과, 컨트롤에 비하여, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 혹은 RAB27A의 siRNA를 도입한 UM-UC-3 세포주에서는, 모두 그 세포 증식이 유의하게 억제되었다(도 10, p<0.01). 이 결과로부터, miR582의 표적 유전자인 KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A에는 방광암 세포의 증식을 유도하는 활성이 있다는 것이 분명해졌다.
[실시예 11] miR582 표적 유전자의 넉다운과 방광암 세포의 침윤 억제 효과
UM-UC-3 세포주에, KCNC1의 siRNA(서열번호 36과 서열번호 37), PGGT1B의 siRNA(서열번호 38와 서열번호 39), LRRK2의 siRNA(서열번호 40과 서열번호 41), RAB27A의 siRNA(서열번호 42와 서열번호 43), DIXDC1의 siRNA(서열번호 44와 서열번호 45) 혹은 Allstars 네거티브 컨트롤 siRNA(Qiagen)를 25 nM의 농도로, DharmaFECT1(Dharmacon사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 도입했다. 그 세포를 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, 세포 침윤 분석을 행했다. 이 분석은, 24-웰 바이오코트 마트리겔 침윤 챔버(8 ㎛, Becton Dickinson사)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 행했다. 상세하게는, 세포를 100,000 세포/웰로 24 웰 플레이트의 상부 챔버에 파종했다. 하부 챔버의 배양액에는 최종농도 10%로 FBS를 첨가했다. 37℃, 5% CO2로 24시간 배양 후, 투과막의 상부 챔버 측에 부착된 세포를 닦아내고, 하부 챔버 측에 침윤된 세포를 딥퀵(시스멕스사)으로 고정, 염색했다. 현미경 하에서 랜덤한 3 시야에서의 침윤된 세포수를 카운트하여, 각 실험군에 있어서의 침윤 세포수를 구했다.
그 결과, 컨트롤에 비하여, KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 혹은 RAB27A의 siRNA를 도입한 UM-UC-3 세포주에서는 어느 것에서나 그 세포 침윤이 유의하게 억제되었다(도 11, p<0.01). 이 결과로부터, miR582의 표적 유전자인 KCNC1, PGGT1B, LRRK2, DIXDC1 및 RAB27A는, 방광암 세포의 침윤을 유도하는 활성이 있다는 것이 분명해졌다.
[실시예 12] 인간 방광암 검체에 있어서의 miR582의 발현
29명의 방광암 환자로부터 경요도적 절제 혹은 근치적 방광 절제술에 의해서 인간 방광 조직을 적출하여, 검체로 했다. 암 조직과 정상 상피 조직은 포르말린으로 고정하여, 파라핀 포매 후, 조직 절편을 작성하고, 현미경 관찰을 하여, 레이저 캡쳐 다이섹션으로 목적으로 하는 세포를 얻었다. 얻어진 세포로부터 RNA를, QIAzol(Invitrogen)과 miRNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라서 정제했다. miR582-5p와 miR582-3p의 발현은, miRNA 분석(Applied Biosystems사)을 이용하여 정량했다. 정량 PCR 반응은 ABI7300(Applied Biosystems 사)를 이용하고, 내부 표준에는 as-miR-103(Applied Biosystems사)을 이용했다. 그 결과, 동일 환자의 비암 세포와 암 세포에서 miR582-5p와 miR582-3p의 발현을 비교하면, 모두 암 세포에서는 유의하게 이들의 발현이 저하하고 있었다(도 12에서의 그래프 A, miR582-5p는 p<0.0001, miR582-3p는 p=0.0003). 또한, miR582-5p 혹은 miR582-3p의 암 세포에서의 발현 저하가 2.5배 이상인 환자의 수를 방광암의 등급별로 구분하면, 어느 것이나 암의 등급에 따라, 발현이 저하하는 환자의 수가 증가해 가는 경향이 있다는 것이 판명되었다(도 12에서 그래프 B, 표 2).
Figure 112015011436364-pct00010
이상의 결과로부터, 인간 방광암 조직에 있어서, miR582-5p와 miR582-3p는 정상 조직과 비교하여 그 발현이 저하하는 것이 분명해졌다. 또한, 암의 진행과 이들의 miRNA의 발현이 마이너스 상관하고 있는 경향이 있다는 것이 분명해졌다.
본 발명의 암 치료를 위한 의약은, 암, 암의 전이에 기인하는 질환에 대한 치료나 예방에 유용하다. 본 발명의 방법에 의해, 암이나 방광암 또는 이들 암의 침윤능 또는 전이능을 판정할 수 있어, 암이나 방광암의 치료 효과나 예후를 판정하기 위한 제제 및 암의 증식을 억제하는 작용을 갖는 물질이나, 암의 전이를 저해하는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> National Cancer Center <120> Therapeutic Agent for Cancer <130> F113100-WO <150> JP 2012-181915 <151> 2012-08-20 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uuacaguugu ucaaccaguu acu 23 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uaacugguug aacaacugaa cc 22 <210> 3 <211> 98 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aucugugcuc uuugauuaca guuguucaac caguuacuaa ucuaacuaau uguaacuggu 60 ugaacaacug aacccaaagg gugcaaagua gaaacauu 98 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ccacaacaag tcaatctgtg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tattgaaggg ggttctggtg 20 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control sequence <400> 6 uacguacguc gucuaauuaa ucu 23 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control sequence <400> 7 auuaauuaga cgacguacga cc 22 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial 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gctcgagtaa ccacaggtaa tgaccaagca 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 gcggccgcaa tgcaaacccc attttattca 30 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 36 ccaacaaggu agaguucaut t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 37 augaacucua ccuuguuggt t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 38 gagacaagca gguugacaat t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 39 uugucaaccu gcuugucuct t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> RNA <400> 40 gcaaaugaac uaagagauat t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Claims (27)

  1. 적어도 이하를 함유하는 것을 특징으로 하는 방광암 치료를 위한 의약:
    (1) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는
    (2) 상기 (1)의 뉴클레오티드 서열 및 이 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 이에 따라 쇄 중의 전부 또는 일부에 이중쇄 구조를 형성하는 단일쇄 또는 이중쇄의 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 이중쇄의 핵산인 의약.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 서열번호 1로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 의약.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 서열번호 2로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 의약.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 miR582의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또 단백질 발현 억제 활성을 나타내는 의약.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 miR582 및 그 전구체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 핵산이며, 상기 전구체는 pri-miR582 또는 pre-miR582인 의약.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 miR582인 의약.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이 수식된 핵산인 의약.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방광암이, miR582의 발현이 감소하고 있는 방광암인 의약.
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방광암이 등급 2 이상의 방광암인 의약.
  12. 제1항 또는 제2항에 기재한 핵산을 함유하는, 방광암의 전이를 억제 또는 예방하기 위한 의약.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경요도적으로 포유동물에게 투여되는 의약.
  14. 제1항 또는 제2항에 기재한 의약의 치료 효과를 예측하는 방법으로서, 제1항 또는 제2항에 기재한 의약의 투여 전에 방광암에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 기재한 의약의 치료 효과를 예측하는 방법으로서, 방광암에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 기재한 의약의 치료 효과를 판정하는 방법으로서, 방광암에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 기재한 의약의 치료 효과를 판정하는 방법으로서, 방광암에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  18. 방광암 치료의 예후를 판정하는 방법으로서, 방광암에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현 레벨 또는 농도를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  19. 방광암 치료의 예후를 판정하는 방법으로서, 방광암에 있어서의 miR582의 게놈의 카피수를 측정하는 공정을 포함하는 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 기재한 의약의 효과를 판정하기 위한 조성물.
  24. 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는, 방광암의 증식을 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 방법:
    (1) 피검 물질과 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 공정,
    (2) 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 측정하여, 그 발현량을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량과 비교하는 공정, 및
    (3) 상기 (2)의 비교 결과에 기초하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 상승 제어하는 피검 물질을, 방광암의 증식을 저해할 수 있는 물질로서 선택하는 공정.
  25. 이하의 (1)~(3)의 공정을 포함하는, 방광암의 전이 또는 방광암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는 방법:
    (1) 피검 물질과 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 공정,
    (2) 피검 물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 측정하여, 그 발현량을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조 세포에 있어서의 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산 발현량과 비교하는 공정, 및
    (3) 상기 (2)의 비교 결과에 기초하여, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재한 핵산의 발현량을 상승 제어하는 피검 물질을, 방광암의 전이 또는 방광암 세포의 침윤능을 저해할 수 있는 물질로서 선택하는 공정.
  26. 삭제
  27. 삭제
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