JPWO2005033324A1 - Ｄ−乳酸生産用生体触媒 - Google Patents

Abstract

本発明の課題はＤ−乳酸の高生産方法を提供し、また、光学純度が高く、副生有機酸が少ない高選択的なＤ−乳酸の生産方法を提供することにある。ピルベートホルメートリアーゼ活性が不活化或いは低減化され、且つエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強された微生物、ＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼが不活化或いは低減化された微生物、または上記微生物であって、ＴＣＡ回路を有し、且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が不活化或いは低減化され、且つアスパラギン酸アンモニアリアーゼ活性が不活化或いは低減化された微生物を培養しＤ−乳酸を生産する。ｌｄｈＡ活性は、ｌｄｈＡをコードする遺伝子をゲノム上において、解糖系、核酸生合成系またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結することにより増強させる。

Description

本発明は、Ｄ−乳酸を高選択的に高生産する微生物と、それを用いたＤ−乳酸の生産方法に関するものである。詳しくは純度が高い乳酸を効率良く生産する方法、特にピルビン酸の生成蓄積量が少ないＤ−乳酸の効率的な製造法に関わる。
また、本発明は、ＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼが不活化あるいは低減されている微生物を用いることを特徴とするＤ−乳酸の生産方法に関する。
また、本発明は、不純物であるコハク酸やフマル酸を生産せずにＤ−乳酸を生産する微生物と、それを用いたＤ−乳酸の生産方法に関するものである。

生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、ＣＯ_２問題・エネルギー問題の顕在化とともにサスティナビリティー（持続可能性）、ＬＣＡ（ライフサイクルアセスメント）対応型製品として強い注目を浴びており、その原料である乳酸には効率的で安価な製造法が求められている。
ちなみに現在工業生産されているポリ乳酸はＬ−乳酸ポリマーであるが、乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸があり、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。但しいずれの用途においても、原料たる乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。
自然界には乳酸菌や糸状菌など乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化済みのものもある。例えば、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる微生物としてＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ等、またＤ−乳酸を効率良く生産させる微生物としてＳｐｏｒｏｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物等が知られている。どの場合も乳酸の蓄積量は高いレベルに達しているが、培養液中に含まれる乳酸以外の副生物、例えば酢酸、エタノール、アセトイン、ピルビン酸といった化合物が精製過程で除けきれないことが、最終産物である乳酸の品質低下につながることがある。また光学異性体の混入が原因で、光学純度の低下をきたす事も重大な問題となる。
そのような乳酸の純度低下を回避するには、微生物によって生産される副生物の量を低減化させることが効果的な手段である。近年発展してきた遺伝子組換え技術を利用して微生物の特定遺伝子を破壊すれば、狙った副生物の生産を特異的に阻害することが可能となってきた。ただ現状的には、遺伝子破壊法がどのような微生物にでも容易に適用できる訳ではなく、乳酸菌や糸状菌など元来乳酸を高生産できる微生物での適用は容易ではない。なぜならこれらの微生物はゲノム情報が必ずしも十分とは言えず、かつ遺伝子組換えの宿主としても汎用されていないからである。
それに対しゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にあるエシェリヒア・コリ、酵母、ヒト培養細胞等では、比較的容易に遺伝子破壊を行うことが可能である。特に増殖の速さや培養の容易さの点ではエシェリヒア・コリが最も好ましい。さらにエシェリヒア・コリが生産する乳酸はＤ体のみであるため、光学純度の高いＤ−乳酸を得る目的では好都合な宿主である。しかし野生型のエシェリヒア・コリは、Ｄ−乳酸生産性が低く、Ｄ−乳酸以外にも種々の副生有機酸を生産する。この問題を解決するために、遺伝子組換えによってエシェリヒア・コリの代謝経路を改変し、Ｄ−乳酸を選択的に高生産させる試みが過去になされている。
Ｃｈａｎｇら（Ｃｈａｎｇ，Ｄ．−Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６５（４），ｐｐ１３８４−１３８９（１９９９））は、エシェリヒア・コリのホスホトランスアセチラーゼ（以下ｐｔａと略することがある）、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下ｐｐｃと略することがある）の２重変異株を５％のグルコース、及びアミノ酸を含む培地を用いて、さらに予め通気培養で菌体を増加させた後、嫌気培養を行い、培地中のグルコースが５％を超えないようにグルコースを追添加し培養することにより６２．２ｇ／ＬのＤ−乳酸を６０時間で生産させている。この時のグルコースからＤ−乳酸への転換率は７６％であった。
Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６９（１），ｐｐ３９９−４０７（２００３））は、ピルベートホルメートリアーゼ（以下ｐｆｌと略すことがある）、フマル酸レダクターゼ（以下ｆｒｄと略すことがある）、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下ａｄｅＥと略すことがある）、およびアセテートキナーゼ（以下ａｃｋＡと略すことがある）の４重破壊エシェリヒア・コリを作製し、これを５％のグルコースを含む無機塩培地で嫌気条件下にて１６８時間培養することによって、ギ酸、コハク酸、エタノールおよび酢酸の副生なしに４８．５ｇ／ＬのＤ−乳酸が生産されたと報告している。しかしこの試みは、Ｄ−乳酸を高選択的に生産させることには成功しているが、生産性は０．２９ｇ／Ｌ／ｈｒとかなり低く、選択率と生産性の両方を満足させたとは言えない。また副生物のピルビン酸についての言及がなく、その低減化効果については不明である。ピルビン酸はＤ−乳酸の代謝反応基質であるため、他の副生有機酸とは異なり、むやみに生成を抑えるとＤ−乳酸そのものの生成も抑えられてしまう。その点でピルビン酸の副生を最小限に抑えることは容易なことではない。一般にピルビン酸が乳酸モノマー原料に不純物として含まれた場合には、ポリマー重合率が低下する等の好ましからざる問題が生じることは当業者には良く知られた事実であり、その意味からもピルビン酸はぜひとも低減化すべき副生物の一つである。にも拘わらずＤ乳酸生産性を高く維持しながら、ピルビン酸副生を抑えることに成功したという報告は過去になされていない。
以上まとめると、現在までに知られているエシェリヒア・コリでのＤ−乳酸最大蓄積量６２．２ｇ／Ｌであり、その生産時間は６０時間であった。一方、Ｌ−乳酸の工業化生産に用いられている乳酸菌または糸状菌のＬ−乳酸生産性が蓄積量１００ｇ／Ｌ以上かつ生産時間２４時間以内であることを考慮すれば、エシェリヒア・コリのＤ−乳酸蓄積量と生産時間は依然として低いレベルにあると言わざるを得ない。エシェリヒア・コリが乳酸菌や糸状菌なみの乳酸生産性を達成したという報告は過去になく、それどころかそもそもエシェリヒア・コリを用いて１００ｇ／Ｌを越えるＤ−乳酸を蓄積生産させることができるのか否かについても、それを示唆するようなデータは過去に存在しなかった。
大腸菌を用いてＤ−乳酸発酵させる場合、一般には酸素の存在は好ましくないと考えられている。なぜなら酸素のような電子受容体が存在すると、大腸菌は発酵ではなく呼吸を行うからである。酸素のような電子受容体が無い場合に限り、大腸菌は基質レベルのリン酸化のみによりエネルギー（ＡＴＰ）を得、解糖系で得られた還元力（ＮＡＤＨ）を用いて乳酸などの還元性有機酸を生産する。そのような理由から、従来の大腸菌によるＤ−乳酸発酵は殆ど嫌気培養で行われている。まれに培養の前半を通気し、後半を嫌気培養するという二相培養が行われる場合もあるが、これは前半の通気培養によって十分な菌体量を確保するのが目的であり、最終的な乳酸発酵はやはり嫌気で行っている訳である。しかし実際の工業生産を想定した場合、培地に添加する安価なアミノ酸源であるコーンスティープリカー（以下ＣＳＬと略すことがある）等の中には不純物となる有機酸だけでなく、Ｄ体、Ｌ体両方の乳酸が含まれるが、嫌気培養だとＬ−乳酸が資化されず、培地中に残存したままとなる。Ｌ体からピルビン酸を生成する反応の触媒酵素であるＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下ｌｌｄと略すことがある）は通気条件下で発現することが知られているので、もし通気条件下でも効率良く乳酸発酵させる方法があれば、その方法を用いることで培地中に含まれるＬ体を菌体に資化させ、光学的にも高い純度のＤ体を生産させることが可能となるものと期待されるが、これまでそれを実現する技術は存在しなかった。
ｐｆｌ破壊株を用いた乳酸生産に関してはＺｈｏｕらの報告に先立ち、以下のような報告がなされている。すなわちＣｏｎｔａｇら（Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５６（１２），ｐｐ３７６０−３７６５（１９９０））は、ｐｆｌ非変異エシェリヒア・コリ株が３５ｍＭの乳酸を生成するのに対して、ｐｆｌ変異株では乳酸の生産性は向上し、４５ｍＭの乳酸を生成することを示している。すなわちエシェリヒア・コリにおいてｐｆｌ活性の不活化によりＤ−乳酸の生産性が向上することはＣｏｎｔａｇらのデータ開示により既に公知となっている。
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼは、補酵素に対する依存性の違いによって、ＮＡＤＨ依存性とＦＡＤ依存性に区別される。ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼは、生体内でピルビン酸からＤ−乳酸への反応を触媒している。特に大腸菌由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼはｌｄｈＡと呼ばれる。
Ｙａｎｇら（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．１（２），ｐｐ１４１−１５２（１９９９））はｌｄｈＡ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをエシェリヒア・コリに導入することで、Ｄ−乳酸蓄積量が８ｇ／Ｌ程度と低いながらも向上することを報告している。すなわちエシェリヒア・コリにおいてｌｄｈＡ活性の強化により、Ｄ−乳酸の生産性が向上することはＹａｎｇらのデータ開示により公知となっている。
一方で、バンチら〔Ｂｕｎｃｈ，ＰＫ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４３（Ｐｔ１），１８７−１９５（１９９７）〕の報告によれば、エシェリヒア・コリ由来ｌｄｈＡ遺伝子の発現ベクターを導入したエシェリヒア・コリは、発現ベクターの導入によりその増殖が阻害されることが報告されている。
また大腸菌以外の細菌由来Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ｌｄｈと呼ぶことがある）を大腸菌に過剰発現させた例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ｌｄｈの発現例としてコッカーら〔Ｋｏｃｈｈａｒ，Ｓ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９２）２０８，７９９−８０５〕やＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来ｌｄｈの発現例としてコッカーら〔Ｋｏｃｈｈａｒ，Ｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９９２）１８５，７０５−７１２〕の報告が挙げられるが、いずれの例も発現させた酵素の物理化学的性質を調べたものであって、Ｄ体やピルビン酸の蓄積量についての言及は皆無である。
しかしながらｐｆｌ活性を不活化または低減化させ、且つｌｄｈＡ活性を強化させた微生物のＤ−乳酸生産性については、依然として良く知られてはいなかった。
一般に発現ベクターを用いた遺伝子強化方法では、ベクターの脱落が生じ、目的遺伝子の発現量が低下し、さらには目的物質の生産性が低下するという不具合が生じ得る。こうしたことからＤ−乳酸工業生産への応用に際し、発現ベクターを用いたｌｄｈ遺伝子の強化方法には幾つかの解決すべき課題が存在し、それに代わる遺伝子強化方法が望まれる。しかしながらそうした取り組みの報告はなされていない。
発現ベクターに代わる遺伝子強化方法として、Ｓｏｌｅｍら（Ｓｏｌｅｍ，Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６８（５），ｐｐ２３９７−２４０３（２００２））が報告したようにゲノム上のある遺伝子のプロモーター領域を任意のプロモーターに置換することで、該遺伝子を強化する方法があげられる。しかし、本技術を上記のｌｄｈＡ遺伝子を用いたＤ−乳酸製造に応用した場合を考えると、この方法では強化されるｌｄｈＡ遺伝子はゲノム上の遺伝子１コピーのみであり、多コピーの遺伝子が発現する発現ベクターによる強化方法に比べ、ｌｄｈＡ活性の向上は小さなものであると予測され、Ｄ−乳酸生産性が発現ベクターを用いた場合に比べ向上すると予想することは当業者といえども困難であった。
一方、ＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下ｄｌｄと略すことがある）については、大腸菌から精製された酵素の解析によりＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼとは逆の反応、すなわちＤ−乳酸からピルビン酸への反応を主として触媒することが開示されている。過去において、Ｓｈａｗらはｄｌｄが破壊された大腸菌株ＪＳ１５０とＪＳ１５１を取得しているが、それらの株におけるＤ−乳酸生産性やピルビン酸生産性については言及していない（Ｓｈａｗ，Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２１（３），ｐｐ１０４７−１０５５（１９７５））。またＢａｒｎｅｓらは、ｄｌｄが種々のアミノ酸や糖類の取りこみに関わっていると報告しているが（Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４６（１７），ｐｐ５５１８−５５２２（１９７１）〕、Ｄ−乳酸やピルビン酸の生産への関わりについては言及していない。
尚、大腸菌株の分譲機関の一つであるＹａｌｅ大学付属のＥ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）のデータベースでｄｌｄとｐｆｌの２重変異株の検索を行うと、Ｍａｔ−Ｊａｎらの論文（Ｍａｔ−Ｊａｎ，Ｆ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１７１（１），ｐｐ３４２−３４８（１９８９）〕が該当案件として出力されるが、実際に精査した結果、この論文にはｄｌｄとｐｆｌの２重破壊株に関する記述は見られなかった。
先にも述べたがＤ−乳酸に関しては、微生物による発酵生産で工業化レベルに見合う生産性と選択性を同時に達成したという報告は無く、例えば主たる副生有機酸であるコハク酸やフマル酸を、高いＤ−乳酸生産性を維持しながら低減化させた前例もない。
そこで我々はＤ−乳酸の生産性を損なうことなくコハク酸生産を抑制することを目標にして鋭意検討を重ね、その結果、嫌気条件下でオキサロ酢酸からリンゴ酸への反応を触媒する酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（以下ｍｄｈと呼ぶことがある）の遺伝子を破壊することによって、Ｄ−乳酸の生産性を損なうこと無しにコハク酸の生成を完全に抑えることが可能であることを見出した。しかし依然としてフマル酸が副生されていたため、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（以下ａｓｐＡと呼ぶことがある）の遺伝子を破壊することによって、フマル酸の副生量をも低減化することが可能であることを見出した。
ｍｄｈ活性不活化の効果に関しては、１９７０年のＣｏｕｒｔｒｉｇｈｔらの論文に開示されている（Ｃｏｕｒｔｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１０２（３），ｐｐ７２２−７２８（１９７０））。その開示内容は、ｍｄｈ活性が不活化されたエシェリヒア・コリでは、嫌気条件下でのオキサロ酢酸からリンゴ酸への反応活性がゼロになっているものの、アスパラギン酸からフマル酸への反応活性が逆に向上しているというものであった。つまり嫌気条件下でコハク酸を生成する経路には、オキサロ酢酸からリンゴ酸を経由してフマル酸、コハク酸に流れる経路と、オキサロ酢酸からアスパラギン酸を経由してフマル酸、コハク酸に流れる経路の２種類があり、ｍｄｈ活性を不活化すると前者の経路は止まるが、後者の経路はむしろ活性化されることを説明している。よってＣｏｕｒｔｒｉｇｈｔらの論文は、ｍｄｈ活性不活化によってコハク酸が生成しなくなることを開示したものではない。
ｍｄｈ活性不活化の効果に関するもう一つの先行技術は、ｍｄｈ遺伝子が破壊された酵母に関するものである（特開平１１−０５６３６１号公報）。本特許は酵母のｍｄｈ遺伝子を破壊することによって、生産されるリンゴ酸量を変化させるというものであり、その結果がコハク酸の生産量にどのような影響をもたらすかについて言及したものではない。
つまるところ過去の知見からは、微生物のｍｄｈを不活化することによってコハク酸の生産が完全に抑制され得ることを想定することは、当業者といえども困難であった。
またａｓｐＡ活性不活化の効果については、過去において唯一、エルシニア ペスティスでの知見が開示されている（Ｄｒｅｙｆｕｓ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３６（２），ｐｐ７５７−７６４（１９７８））。しかしながら、本論文の主旨は、ａｓｐＡ活性の不活化によってアスパラギン酸やグルタミンが細胞内で分解されにくくなることであって、フマル酸生成量についての考察はなされてはいない。
特開平１１−０５６３６１号公報 Ｃｈａｎｇ，Ｄ．−Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６５（４），ｐｐ１３８４−１３８９（１９９９） Ｚｈｏｕ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６９（１），ｐｐ３９９−４０７（２００３） Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５６（１２），ｐｐ３７６０−３７６５（１９９０） Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．１（２），ｐｐ１４１−１５２（１９９９） Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４３（Ｐｔ１），ｐｐ１８７−１９５（１９９７） Ｋｏｃｈｈａｒ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０８（３），ｐｐ７９９−８０５（１９９２） Ｋｏｃｈｈａｒ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１８５（２），ｐｐ７０５−７１２（１９９２） Ｓｏｌｅｍ，Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６８（５），ｐｐ２３９７−２４０３（２００２） Ｓｈａｗ，Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２１（３），ｐｐ１０４７−１０５５（１９７５） Ｂａｒｎｅｓ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４６（１７），ｐｐ５５１８−５５２２（１９７１） Ｍａｔ−Ｊａｎ，Ｆ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１７１（１），ｐｐ３４２−３４８（１９８９） Ｃｏｕｒｔｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１０２（３），ｐｐ７２２−７２８（１９７０） Ｄｒｅｙｆｕｓ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３６（２），ｐｐ７５７−７６４（１９７８）

本発明の課題の一つは、Ｄ−乳酸の高生産方法を提供することであり、本発明の別な課題は光学純度が高く、副生有機酸が少ない高選択的なＤ−乳酸の生産方法を提供することにある。
本発明の他の課題は、不純物有機酸として従来より微生物により乳酸を生成蓄積させた培地中からの除去が簡単ではなかったピルビン酸の蓄積量を低減化させたＤ−乳酸生産法を提供することにある。
本発明の他の課題は、ヘテロ乳酸醗酵細菌を用いて乳酸を効率的に生産する乳酸の生産方法を提供することである。本発明の別な課題は、ヘテロ乳酸醗酵細菌を用いて光学純度の高い乳酸を効率的に生産する乳酸の生産方法を提供することである。
本発明の他の課題は、目的物質の生産性を低下させることなく、副生物であるコハク酸及び／又はフマル酸の生産を抑制するＤ−乳酸の生産方法を提供するものである。
本発明の他の課題は、発現ベクターを用いた強化方法に代わる、安定なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の強化方法を提供し、また、Ｄ−乳酸をより高生産する方法を提供することである。
本発明者らは、これら上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化され、かつエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強された細菌が従来よりも短時間でＤ−乳酸を生産し、これまでになく高い蓄積量を達成することを見いだした。特にｌｄｈＡ活性の増強方法に関しては、ｌｄｈＡをコードする遺伝子をゲノム上において、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結することで発現させた微生物を用いることにより、発現ベクターを用いた遺伝子発現強化方法に比して短時間で著量のＤ−乳酸を生産させることが可能であることを見いだした。発現ベクターを用いた方法では本発明の方法よりもＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの細胞内発現量は多いが何らかの理由によりこの高い酵素量がＤ−乳酸の高生産には直接結びついておらず、むしろ、本発明のように細胞内での酵素の発現量はそれほど高くなくとも結果的にＤ−乳酸の生産性が飛躍的に向上することは極めて驚くべきことである。
次に発明者らは、微生物培養液中に存在するピルビン酸の一部が、実際にｄｌｄによってＤ−乳酸から生成されていることを見出し、さらにｄｌｄ遺伝子が実質的に不活化された、あるいは低減された微生物を育種し培養することによって、当該微生物の増殖が宿主と比較して抑制されないこと、および培地中のピルビン酸含有濃度が低下した高品質のＤ−乳酸を含む培養液が得られることを見出した。さらに、ｐｆｌ活性が不活化あるいは低減化され、且つ／またはｌｄｈＡ活性が増強され、且つｄｌｄ遺伝子が実質的に不活化あるいは低減された微生物を育種し培養することによって、培地中のピルビン酸が低下した高品質のＤ−乳酸が得られることを見出した。
さらに本発明者らは、ＴＣＡ回路を有し、且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性が不活化または低減され、且つアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ａｓｐＡ）活性が不活化または低減化されている上記微生物を用いることによって、Ｄ−乳酸の生産性を高く維持したままでコハク酸とフマル酸の副生を抑えうることを見出すことによって本発明に到達した。
即ち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ乳酸発酵細菌を２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養し、得られた培養物から乳酸を回収することを特徴とする、乳酸の生産方法。
〔２〕ヘテロ乳酸発酵細菌がエシェリヒア・コリであることを特徴とする〔１〕に記載の乳酸の生産方法。
〔３〕エシェリヒア・コリがＭＴ−１０９３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５７）株であることを特徴とする〔２〕に記載の乳酸の生産方法。
〔４〕エシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強され、かつピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化された細菌を培養し、得られた培養物からＤ−乳酸を回収することを特徴とする、Ｄ−乳酸の生産方法。
〔５〕細菌がエシェリヒア・コリである〔４〕に記載のＤ−乳酸の生産方法。
〔６〕２種類以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、〔４〕又は〔５〕に記載のＤ−乳酸の生産方法。
〔７〕該微生物が本来有しているＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化された微生物であって、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強されていることを特徴とする微生物。
〔８〕微生物が細菌である〔７〕に記載の微生物。
〔９〕細菌がエシェリヒア・コリである〔８〕に記載の微生物。
〔１０〕〔７〕〜〔９〕の何れか一項に記載の微生物を液体培地で培養し、培養液中にＤ−乳酸を生成蓄積せしめ、培養液からＤ−乳酸を分離することを特徴とするＤ−乳酸の生産方法。
〔１１〕２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、請求項１０に記載のＤ−乳酸の製造方法。
〔１２〕ＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されている微生物を液体培地で培養し、培養液中にＤ−乳酸を生成蓄積せしめ、培養液からＤ−乳酸を分離することを特徴とするＤ−乳酸の生産方法。
〔１３〕微生物が細菌である〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕細菌がエシェリヒア・コリである〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕微生物のゲノム上において、エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を発現する微生物。
〔１６〕微生物がエシェリヒア・コリである〔１５〕に記載の微生物。
〔１７〕該微生物が本来有しているピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする〔１５〕又は〔１６〕に記載の微生物。
〔１８〕エシェリヒア・コリのゲノム上において、エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードする遺伝子のプロモーターに代えて、エシェリヒア・コリ由来の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を発現するエシェリヒア・コリ。
〔１９〕エシェリヒア・コリの解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターが、エシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである〔１８〕記載のエシェリヒア・コリ。
〔２０〕該エシェリヒア・コリが本来有しているピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする〔１８〕又は〔１９〕に記載のエシェリヒア・コリ。
〔２１〕〔１５〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の微生物を培地を用いて培養することによりＤ−乳酸を生産する方法。
〔２２〕ＴＣＡ回路を有し、且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性が不活化あるいは低減化されている微生物であって、更にピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする微生物。
〔２３〕該微生物が本来有しているアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ａｓｐＡ）活性が不活化または低減化されている〔２２〕に記載の微生物。
〔２４〕微生物が細菌である〔２２〕又は〔２３〕に記載の微生物。
〔２５〕細菌がエシェリヒア・コリである〔２４〕に記載の微生物。
〔２６〕エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強されている〔２５〕に記載の微生物。
〔２７〕〔２２〕〜〔２６〕の何れか一項に記載の微生物を培地を用いて培養することにより、ＴＣＡ回路上で生産される有機酸以外の化合物を生産させる方法。
〔２８〕有機酸以外の化合物がＤ−乳酸である〔２７〕に記載の生産方法。
〔２９〕通気条件下で培養することを特徴とする〔１〕〜〔６〕、〔１０〕〜〔１４〕、〔２１〕、〔２８〕の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。
〔３０〕通気条件が温度３０℃の水を対象とした場合、常圧で酸素移動容量係数Ｋ_Ｌａが１ｈ^−１以上４００ｈ^−１以下となるような条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件であることを特徴とする〔２９〕に記載の乳酸の生産方法。
〔３１〕培養ｐＨが６〜８であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕、〔１０〕〜〔１４〕、〔２１〕、〔２８〕〜〔３０〕の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。
本発明により、高いＤ−乳酸生産性とＤ−乳酸選択性を有する微生物が提供される。そして、本発明により作製された微生物を培養し、Ｄ−乳酸を生産することにより既存の方法に比較してより経済的に高純度なＤ−乳酸を生産することが可能となる。
また、本発明により、ピルビン酸の生成量が少ないＤ−乳酸を生成する細菌が提供される。そして、本発明により作成された菌株を培養し、Ｄ−乳酸を生産することにより既存の方法に比較してより経済的に化学的純度及び光学純度の高いＤ−乳酸を生産することが可能となる。
また、本発明により作製された菌体を使用しＤ−乳酸を生産することにより、既存の方法に比較して不純物であるピルビン酸含量の低下した、精製負荷の少ない高品質のＤ−乳酸発酵液を製造できるようになる。
また、本発明により、ＴＣＡ回路上で生産される有機酸以外の化合物の生産性低下を招くことなく、コハク酸及び／又はフマル酸の副生を抑えることが可能となる。特にＴＣＡ回路上で生産される有機酸以外の化合物を工業的に生産することを目的とする場合、副生物の種類と量を低減化することで目的物質の精製コストの低減化が可能となる。

図１は、実施例２０における培養液中のＤ−乳酸蓄積量の経時変化を示したグラフである。図中、三角はＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株（実施例１５）の結果を、四角はＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧＡＰｌｄｈＡ株（実施例１８）の結果を、丸はＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ＧＡＰｐｌｄｈゲノム挿入株（実施例１９）の結果を示す。
図２は、実施例２４における培養液中乳酸蓄積濃度の経時変化を示したグラフである。図中、十字はΔｐｆｌΔｄｌｄ株の結果を、丸はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の結果を、三角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｐｐｃ株の結果を、四角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｆｒｄ株の結果を示す。
図３は、実施例２４における培養液中コハク酸蓄積濃度の経時変化を示したグラフである。図中、十字はΔｐｆｌΔｄｌｄ株の結果を、丸はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の結果を、三角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｐｐｃ株の結果を、四角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｆｒｄ株の結果を示す。
図４は、実施例２５における培養液中乳酸蓄積濃度の経時変化を示したグラフである。図中、丸はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株の結果を、三角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株の結果を、四角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の結果を示す。
図５は、実施例２５における培養液中フマル酸蓄積濃度の経時変化を示したグラフである。図中、丸はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株の結果を、三角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株の結果を、四角はΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の結果を示す。

以下に本発明を詳しく説明する。
本発明におけるピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．５４に分類され、ホルメートアセチルトランスフェラーゼとも呼ばれる酵素である。本酵素はピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味する。
本発明における不活化とは、既存の測定系によって測定された当該酵素の活性が検出限界以下である状態を指す。
本発明における低減化とは、当該酵素をコードする遺伝子の突然変異及び／または遺伝子組み換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素活性が低下している状態を指す。
本発明におけるヘテロ発酵細菌とは、糖を発酵的に分解して乳酸以外にギ酸、酢酸、コハク酸、エタノールより選ばれる物質のうち少なくとも１種類以上を生産する能力をもつ細菌を意味する。具体的に本発明のヘテロ醗酵性細菌としてはエシェリヒア・コリが好適であり、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ発酵細菌としては、本発明の実施例で示した方法などで作製できる任意のエシェリヒア・コリ野生株のｐｆｌ遺伝子の破壊株やエシェリヒア・コリＭＴ−１０９３４が例示できる。
上記ＭＴ−１０９３４はすでにｐｆｌは活性が低下していることが確認されている株であり、容易に本発明を実施することが可能である。本菌株は、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５７として、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、平成１４年１１月８日より寄託されている。
またｐｆｌの単独変異株は、ＭＴ−１０９３４にはＨｆｒＣの性質があるため任意のＦ−の性質をもつ野生株、例えばＭＧ１６５５、Ｗ３１１０などとＬＢ培地中で２時間混合後、希釈してシングルコロニーを取得し、所望の変異株を選択すればよい。ｐｆｌ変異株は嫌気培養において、野生株と比較してギ酸の生成量が低下しているのでそれらを指標に選択することでも取得できる。
本発明の培養とは、培地を用いて本発明に係る微生物を培養することである。その際、使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた培地であれば特に制限はない。
本発明における２種以上のアミノ酸が添加された培地とは、天然に存在する各種アミノ酸の中から少なくとも２種以上を含有する培地を意味し、酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカーなどの天然物や天然物抽出物の加水分解物を含有する培地も含む。より好ましい結果を得るためには酵母エキス、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカーより選ばれる少なくとも１種類、もしくはそれらの混合物が０．５％から２０％含む培地が好ましく、２％から１５％ではさらに好ましい。特にコーンスティープリカー添加は大きな効果が得られ、このとき硫酸アンモニウムなどの塩は添加しないほうがむしろよい結果となる。培地は通常液体培地である。
培養条件としては作成された菌体、培養装置により変動するが、例えばｐｆｌ活性が低減化されたＭＴ−１０９３４を使用する場合は、培養温度は２０℃から４０℃、より好ましくは２５℃から３５℃で培養することが好ましく、ｐＨはＮａＯＨ、ＮＨ_３等で６．０から７．２、より好ましくは６．５から６．９で調整し、培養することが好ましい。培養時間は得に限定されないが、菌体が十分に増殖し、且つ乳酸が生成するに必要な時間である。
また、ｐｆｌ活性が不活化されたエシェリヒア・コリ野生株ＭＧ１６５５のｐｆｌ遺伝子破壊株を用いた場合には、中性もしくは中性よりややアルカリ性側のｐＨで最大の生産性を得られ、培養ｐＨは６．９から７．４、より好ましくは７．１から７．３である。培養温度はＭＴ−１０９３４より高温で培養することが可能となり３３℃から４２℃で培養することで最大の生産性を得ることができる。
培養に際しては通常は温度、ｐＨ、通気条件、攪拌速度を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本発明の培養に際しては培養槽を使用することに限定されない。培養槽を用いて培養する場合には、必要により、予め前培養として種培養を行いこれを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。
ＭＴ−１０９３４は、ｐＨ７〜７．５のｐＨ領域でギ酸が生成することがあるのに対してＭＧ１６５５のｐｆｌ遺伝子破壊株では、本発明の培養方法ではギ酸の生成は確認されない。よって、ヘテロ醗酵性細菌としてエシェリヒア・コリを用いる場合は、採用した菌体で中性付近のｐＨの培地を用いて乳酸を生産させた場合にＭＴ−１０９３４のようにギ酸の生成が観察されたときは、実際の乳酸の製造に際しては培地のｐＨを中性よりやや酸性側で制御し、ＭＧ１６５５のｐｆｌ遺伝子破壊株のようにギ酸の生成が観察されない場合は実際の乳酸の製造に際しては培地のｐＨを中性もしくはややアルカリ性側に制御することで最大生産性が得られる。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。
以上のようにして得られた培養液等の培養物から乳酸を回収する方法は、例えば培養液からならば通常知られた方法が利用でき、例えば酸性化した後直接蒸留する方法、ラクチドを形成させて蒸留する方法、アルコールと触媒を加えエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に抽出する方法、イオン交換カラムで分離する方法、電気透析により濃縮分離する方法などやそれらを組み合わせた方法が採用できる。また、本発明の方法により生産された菌体は、乳酸の生産に適した酵素群を生産していることから、これを利用してさらに乳酸を生産し、回収することも培養物から乳酸を回収する方法の一部とみなされる。
本発明におけるエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）とは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＤ−乳酸とＮＡＤを生成するエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、具体的にはＢｕｎｃｈら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４３（Ｐｔ１），１８７−１９５（１９９７））が取得した遺伝子、またはエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号３および配列番号４よりＰＣＲにより増幅されるＤＮＡフラグメントに含まれる配列をもつ遺伝子より生産される酵素を例示できる。
本発明においてｌｄｈＡ活性が増強されたとは、ｌｄｈＡをコードする遺伝子の突然変異及び／または遺伝子組み換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意にｌｄｈＡをコードする遺伝子より生産される酵素の活性が増加した状態を指す。
本発明における細菌とは一般の原核細胞の微生物である。
本発明においてｌｄｈＡ活性が増強され、かつｐｆｌ活性が不活化あるいは低減化された細菌の例として、本発明実施例記載のＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡを例示できる。本菌株は上記〔１〕に記載した、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ乳酸発酵細菌を２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養し、得られた培養物から乳酸を回収することを特徴とする乳酸の生産方法に好適に利用することが出来る。
本発明におけるｌｄｈＡ活性を増強する方策の一つとして、ｌｄｈＡをコードする遺伝子を、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、それを所望の細菌へ導入する方法が有効である。その場合の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に細菌内、好ましくはエシェリヒア・コリ内で機能する強力なプロモーターで、且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指し、具体的にはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）プロモーターが例示できる。このようにして得られた細菌は、通気条件下でＤ−乳酸を生産させる時にｌｄｈＡの発現が増強されていないものと比較してＤ−乳酸の蓄積量が向上し、不純物のピルビン酸濃度が減少すると共にＤ−乳酸の光学純度が向上させることが可能となる。
本発明におけるＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）とは、Ｄ−乳酸から、補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。
本発明における微生物とは、Ｄ−乳酸生産能を有する微生物であれば特に制限はなく、Ｄ−乳酸生産能を有さない微生物であっても、何らかの改変を加えることによってＤ−乳酸生産能を有するようになった微生物をも含む。
本発明におけるｄｌｄ活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはｐｆｌ活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはｌｄｈＡ活性が増強されていることを特徴とする微生物として、エシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８）株が例示できる。
本発明における解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターで、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７−４４０に記されている。
本発明におけるｌｄｈＡをコードする遺伝子がゲノム上において、解糖系、核酸生合成系、またはアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ｌｄｈＡを発現し、ｐｆｌ活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはｄｌｄ活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする微生物としては、エシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８）株を例示することができる。
エシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４株は、ｌｄｈＡ遺伝子をゲノム上においてＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結することで発現させており、また遺伝子破壊によりｐｆｌＢ、ｄｌｄが不活化しているため、これを用いて容易に本発明を実施することが可能である。本菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８の寄託番号で、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基いて、平成１６年３月１９日より寄託されている。
本発明においてＴＣＡ回路とは、糖・脂肪酸・多くのアミノ酸などの炭素骨格を最終的に完全酸化するための代謝経路であり、クエン酸回路、トリカルボン酸回路、クレブス回路とも呼ばれる。
本発明におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．３７に分類され、リンゴ酸から、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でオキサロ酢酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
本発明におけるｍｄｈ活性が不活化または低減されている微生物であって、ｐｆｌ活性が不活化または低減されている、且つ／またはｄｌｄ活性が不活化または低減されている微生物としては、エシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４株を例示できる。本菌株は上記〔１〕に記載した、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ乳酸発酵細菌を２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養し、得られた培養物から乳酸を回収することを特徴とする乳酸の生産方法に好適に利用することが出来る。
本発明におけるアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ａｓｐＡ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．３．１．１に分類され、アスパルターゼとも呼ばれる酵素である。本酵素はＬ−アスパラギン酸からフマル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味する。
本発明で得られた微生物を培養して乳酸を生産させる際には、通気を全く行わなくとも良いが、より好ましい結果を得るためには通気を行った方がよい。ここで言う通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより溶存酸素濃度が変化するために乳酸の生産性および乳酸以外の有機酸量などを指標に次のように最適条件を求めることができる。例えばエシェリヒア・コリＭＴ−１０９３４株をＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、５００ｇの培養液を使用した際、空気を常圧で０．０１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、撹拌速度５０ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、より好ましくは、常圧で０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、撹拌速度１００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。この条件は通気撹拌条件が温度３０℃の水を対象とした場合常圧で酸素移動速度係数ｋ_Ｌａが１ｈ−１以上４００ｈ−１となる条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件である。
また、最適な通気条件の別の指標としてはＭＴ−１０９３４株が嫌気培養で生産するギ酸、酢酸、コハク酸、エタノールが５．０ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以下になり且つ、乳酸が生産されるような通気量、撹拌速度により達成される通気条件である。
また、最適な通気条件の別の指標としては０．３％の光学異性体であるＬ−乳酸を含む培地でＭＴ−１０９３４株を培養した際に１０〜１００時間以内にＬ−乳酸の濃度が０．０２％以下に低下するような通気量、攪拌速度である。
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。
また、上記のように通気を行うことで乳酸の生産性の向上、光学異性体の削減を達成することができる。
以下に実施例により本発明の一例を示すが、これらは本発明をなんら制限するものではない。
［実施例１］ ＭＴ−１０９３４株による乳酸生産
培養に使用する培地の組成を下記表１に記載する。

本培地にはコーンスティープリカー由来の酸加水分解後の還元糖０．３４％、Ｄ−乳酸０．３１％、Ｌ−乳酸０．３１％、遊離アミノ酸０．３３％及び微量の各種有機酸が含まれている。
前培養として三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ， Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌにエシェリヒア・コリＭＴ−１０９３４株を植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に上記組成の培地４７５ｇを入れたものに全量植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度１５０ｒｐｍ、培養温度３１℃、ｐＨ６．７（ＮａＯＨで調整）でグルコースが完全に消費されるまで行った。
培養終了後、得られた培養液中の有機酸の定量および光学純度の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表２に示す。

上記結果において、総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわっている原因はコーンスティープリカー中の炭素源を利用したためと考えられる。しかしながら、コーンスティープリカー中の還元糖、有機酸、アミノ酸をすべて使用したとしても９０％以上の変換率を達成した。また、培地中に不純物である有機酸や乳酸の光学異性体の含まれる培養液を使用しても不純物である有機酸が減少し、光学純度が高い乳酸が製造された。
なお、ＭＧ１６５５はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）よりＡＴＣＣ４７０７６として入手した。
［実施例２］ ｌｄｈＡ発現ベクターおよび乳酸生産菌の構築
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ｇｌｙＡ）プロモーターを取得するため大腸菌ゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号１、及び配列番号２をプローブとして用いることによりＰＣＲ法で増幅し、得られたフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約８５０ｂｐのｇｌｙＡプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにｌｄｈＡの構造遺伝子を取得するためにエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号３、及び配列番号４をプローブとして用いることによりＰＣＲ法で増幅し、得られたフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．０ｋｂｐのｌｄｈＡ構造遺伝子フラグメントを得た。上記の２つのフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、ＤＮＡリガーゼを用いて結合した後、大腸菌に形質転換することによりプラスミドｐＧｌｙｌｄｈＡを得た。
得られたプラスミドｐＧｌｙｌｄｈＡをエシェリヒア・コリＭＴ−１０９３４株に形質転換することにより乳酸生産菌ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株を得た。
尚、ｐＵＣ１８はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手できるＡＴＣＣ３７２５３から定法により抽出することにより得られる。また、ＭＴ−１０９３４株は、上記寄託番号により、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成１４年１１月８日より寄託されている。
［実施例３］ 乳酸生産菌ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株による乳酸生産
前培養として三角フラスコにいれたＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌに実施例２で得られた乳酸生産菌ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株を植菌し、実施例１に記載の方法で培養を行った。培養終了後、乳酸の定量および光学純度の測定はＨＰＬＣで定法にしたがって測定した。結果を表３に示す。

上記結果において、総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわっている原因はコーンスティープリカー中の炭素源を利用したためと考えられる。しかしながら、コーンスティープリカー中の還元糖、有機酸、アミノ酸をすべて使用したとしても９０％以上の変換率を達成した。
［実施例４］ エシェリヒア・コリｐｆｌ遺伝子の近傍領域のクローニング
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６），エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（以下ｐｆｌと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００１９２）。ｐｆｌをコードする遺伝子（２，２８３ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号５、６、７及び８に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号６、７のプライマーは５´末端側にＳｐｈＩ認識部位を有している。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡ １μｇと、配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマー、配列番号７の塩基配列を有するプライマーと配列番号８の塩基配列を有するプライマーの組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．８ｋｂ（以下ｐｆｌＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１．３ｋｐ（以下ｐｆｌＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｆｌＢ−Ｌ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで、ｐｆｌＢ−Ｒ断片をＳｐｈＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２４１（１），ｐｐ１８５−１９１（２０００））のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（宝バイオ）に形質転換して、ｐｆｌＢをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、ｐＴＨΔｐｆｌと命名した。
［実施例５］ エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ｐｆｌ遺伝子破壊株の作製
実施例４で得たプラスミドｐＴＨΔｐｆｌをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地で３０℃で３時間から一晩培養後、ＬＢ液体培地または生理食塩水で適当に希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このＬＢ寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４２℃で培養し、生育した形質転換体をゲノム外−ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株として得た。
この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子がゲノム上に存在すること、およびｐｆｌＢをコードする遺伝子の５´側近傍領域、及び３´側近傍領域のそれぞれと相同な領域がゲノム上に存在することをもってプラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株であることを確認した。
プラスミド全長がエシェリヒア・コリゲノムに組み込まれた株を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌのバッフル付きフラスコに植え、これを３０℃で４時間振とう培養した。この培養液を適当にクロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で希釈し、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上に塗布する。これを４２℃で培養して生育したコロニーを無作為に９６個選抜し、それぞれをクロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上と、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育させ、クロラムフェニコール感受性の株を選抜した。
さらに選抜された株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施してｐｆｌをコードする遺伝子が欠損した株を選抜し、これをＭＧ１６５５ΔｐｆｌＢ株と命名した。
［実施例６］ カザミノ酸を用いたＭＧ１６５５Δｐｆｌ株による乳酸の生産
前培養として三角フラスコにＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｇを入れたものを複数用意した。これに乳酸生産菌ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株、およびＭＧ１６５５Δｐｆｌ株に実施例２に記載のプラスミドｐＧｌｙｌｄｈＡを定法により組み換えたＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧｌｙｌｄｈＡの３種類の菌株を別々に植菌し、一晩、３０℃、１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に表４に示す培地４７５ｇを入れたものにそれぞれ全量植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３１℃、ｐＨ６．７（ＮａＯＨで調整）で５０時間行った。培養終了後、得られた培養液中の乳酸の定量および光学純度の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表５に示す。

［実施例７］ コーンスティープリカーを用いたＭＧ１６５５Δｐｆｌによる乳酸の生産
前培養として三角フラスコに入れた培養液２５ｇにＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ、およびＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧｌｙｌｄｈＡを別々に植菌し、一晩３０℃、１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に表６に示す培地４７５ｇを入れたものに別々に全量植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。培養終了後、得られた培養液中の乳酸およびピルビン酸の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表７に示す。

上記結果において、総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわっている原因はコーンスティープリカー中の炭素源を利用したためと考えられる。しかしながら、コーンスティープリカー中の還元糖、有機酸、アミノ酸を全て使用したとしても９０％以上の変換率を達成した。
［実施例８］ 高グルコース濃度下でのＭＧ１６５５Δｐｆｌ株による乳酸の高蓄積生産
前培養として三角フラスコにいれた培養液２５ｇにＭＧ１６５５Δｐｆｌを植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に表８に示すグルコース濃度を１０％〜１５％まで変化させた培地４７５ｇを入れたものに全量植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）でグルコースが枯渇するまで行った。培養終了後、乳酸の測定はＨＰＬＣで定法にしたがって測定した。結果を表９に示す。

総乳酸量が培養開始時に加えたグルコース量を上まわる原因はコーンスティープリカー中の炭素源を利用したためと考えられる。しかしながら、コーンスティープリカー中の還元糖、有機酸、アミノ酸をすべて使用したとしても９０％以上の変換率を達成し、かつ１３０ｇ／Ｌというこれまでにない高い蓄積量を達成した。
［実施例９］ ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株によるコーンスティープリカー添加量の検討
前培養として三角フラスコにいれた培養液２５ｇにＭＧ１６５５Δｐｆｌを植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に表１０に示すコーンスティープリカー濃度を１〜１０％まで変化させた培地４７５ｇを入れたものに全量植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。培養終了後、乳酸の測定はＨＰＬＣで定法にしたがって測定した。結果を表１１に示す。

１％のコーンスティープリカー添加区では生産速度の低下が観察されたものの２４時間で５５ｇ／Ｌとこれまでにない生産速度である。また、使用したグルコースに対する乳酸への変換率は９０％以上を維持していた。
［実施例１０］ ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株による通気条件による解糖速度への影響
前培養として三角フラスコにいれた培養液２５ｇにＭＧ１６５５Δｐｆｌ株を植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に表１２に示す培地４７５ｇを入れたものに全量植菌した。培養は大気圧下、通気条件は表１３に示す条件、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。残存グルコース量はグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業）により測定した。

この試験により通気条件が向上するに従い解糖速度が向上し、通気条件を向上させすぎると解糖速度が低下することがわかる。
［実施例１１］ ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株によるコーンスティープリカー添加量の検討
前培養として三角フラスコにいれた培養液２５ｇにＭＧ１６５５ΔｐｆｌＢ／ｐＧｌｙｌｄｈＡを植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に表１５に示すコーンスティープリカー濃度を１〜１０％まで変化させた培地４７５ｇを入れたものに全量植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。培養終了後、Ｄ−乳酸の測定はＨＰＬＣで定法にしたがって測定した。結果を表１６に示す。

１％のコーンスティープリカー添加区はこの中では最も低い生産性であるが、２４時間で５８ｇ／Ｌと従来にない生産速度である。また、使用したグルコースに対するＤ−乳酸への変換率は９０％以上を維持していた。
［実施例１２］ ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株による通気条件による解糖速度への影響
前培養として三角フラスコにいれた培養液２５ｇにＭＧ１６５５ΔｐｆｌＢ／ｐＧｌｙｌｄｈＡを植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行った後、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に表１７に示す培地４７５ｇを入れたものに全量植菌した。培養は大気圧下、通気条件は表１８に示す条件、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。残存グルコース量はグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業）により測定した。

この試験により通気条件が向上するに従い解糖速度が向上し、通気条件を向上させすぎると解糖速度が低下することがわかる。
［実施例１３］ エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ｄｌｄ遺伝子欠失株の作製
ＭＧ１６５５株由来ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、ＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧ（配列番号９）とＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ（配列番号１０）、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号１１）とＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣ（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行った。得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ、ＰｓｔＩとＸｂａＩで消化することにより、それぞれ約１１４０ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２４１（１），ｐｐ１８５−１９１（２０００））をＨｉｎｄＩＩＩ，、ＸｂａＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をが得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。
次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈（１０^−２〜１０^−６程度）し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｄｌｄを含む約２．０ｋｂ断片を増幅させ、ｄｌｄ遺伝子領域が欠失している株を選抜し、以上を満足するクローンをｄｌｄ欠失株とし、得られた株をＭＧ１６５５Δｄｌｄ株と命名した。
［実施例１４］ ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株によるＤ−乳酸生産
前培養として三角フラスコにいれたＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌにＭＧ１６５５株、またはＭＧ１６５５Δｄｌｄ株を植菌し、一晩、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。各々の前培養液全量を、表２０に示す組成の培地４７５ｇの入ったＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３１℃、ｐＨ６．７（ＮａＯＨで調整）で９６時間行った。４８時間後、および培養終了後、ＨＰＬＣで乳酸、ピルビン酸、ギ酸および酢酸の定量を定法にしたがって測定した。ＭＧ１６５５株、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株それぞれをＷｉｌｄ、Δｄｌｄと表記して４８時間後の結果を表２１に、培養終了時の結果を表２２に示す。

［実施例１５］ エシェリヒア・コリＭｄ１６５５ｐｆｌ、ｄｌｄ遺伝子欠失株作製
実施例４で得たプラスミドｐＴＨΔｐｆｌを、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたクローンから、実施例５と同様に行うことによりＭＧ１６５５ｄｌｄ、ｐｆｌ遺伝子欠失株を取得し、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株と命名した。
［実施例１６］ ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株へのｌｄｈＡ発現ベクターの導入
実施例２で得たプラスミドｐＧｌｙｌｄｈＡを、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株にそれぞれ形質転換することにより、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株を得た。
［実施例１７］ ＭＧ１６５５株、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株によるＤ−乳酸生産
前培養として三角フラスコにいれたＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液２５ｍｌにＭＧ１６５５株、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株をそれぞれ植菌し、一晩、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。各々の前培養液全量を、表２０に示す組成の培地４７５ｇの入ったＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３１℃、ｐＨ６．７（ＮａＯＨで調整）で９６時間行った。培養終了後、ＨＰＬＣで乳酸、ピルビン酸、ギ酸および酢酸の定量を定法にしたがって測定した。９６時間後の結果を表２３に示す。菌株名はそれぞれ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆと表記した。

［実施例１８］ ＧＡＰＤＨプロモーター制御下ｌｄｈＡ発現ベクターおよびｌｄｈＡ発現ベクター形質転換体の構築
エシェリヒア・コリのｌｄｈＡ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ３６９２８）。グリセルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号１３）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号１４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｌｄｈＡ）を取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴ（配列番号１５）、及びＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＣ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｌｄｈ）フラグメントを得た。上記の２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地でＬＢ培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰｌｄｈＡを回収した。このプラスミドｐＧＡＰｌｄｈＡをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、アンピシリン１μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃一晩することによりＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧＡＰｌｄｈＡ株を得た。
［実施例１９］ エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株のゲノム上ｌｄｈＡプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｌｄｈＡ遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ３６９２８）。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来ｌｄｈＡ遺伝子の５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号１７）とＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号１８）を用いて、エシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のグリセルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号１９）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｌｄｈＡ遺伝子の配列情報に基づいて作製されたＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＣＣ（配列番号２０）を用いて、実施例１８で作製した発現ベクターｐＧＡＰｌｄｈＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子の開始コドン近傍領域からなる約８５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡと命名した。ｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子を含む約８００ｂｐ断片を増幅させ、ｌｄｈＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。
［実施例２０］ ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧＡＰｌｄｈＡ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株によるＤ−乳酸生産
前培養として三角フラスコにいれたＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬにＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧＡＰｌｄｈＡ株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ＆ｐｆｌＢ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株をそれぞれ植菌し、一晩、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。各々の前培養液全量を、グルコース１２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー（日本食品化工製）５％よりなる培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）でグルコースが枯渇するまで行った。培養終了後、得られた培養液中のＤ−乳酸蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を図１に示す。それぞれのＤ−乳酸蓄生産性は、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株が４８時間で１０９．０ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ｐＧＡＰｌｄｈＡ株が４８時間で１１５．６ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株が３０時間で１１３．５ｇ／Ｌであった。
［実施例２１］ エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｍｄｈ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００４０３）。ｍｄｈをコードする遺伝子（９３９ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号２１、２２、２３及び２４に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２１の塩基配列を有するプライマーは５´末端側にＫｐｎＩ認識部位を、配列番号２２、２３の塩基配列を有するプライマーは５´末端側にＢａｍＨＩ認識部位を、配列番号２４の塩基配列を有するプライマーは５´末端側にＸｂａＩ認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡ１μｇと、配列番号２１と配列番号２２、配列番号２３と配列番号２４の組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約８００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１，０００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｍｄｈ−Ｌ断片をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで、ｍｄｈ−Ｒ断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２４１（１），ｐｐ１８５−１９１（２０００））のＫｐｎＩ及びＸｂａＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（宝バイオ）に形質転換して、ｍｄｈをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをｐＴＨΔｍｄｈと命名した。
プラスミドｐＴＨΔｍｄｈをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、実施例５と同様の方法に従って、ｍｄｈ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株と命名した。
［比較例１］エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌＢΔｄｌｄΔｐｐｃ株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｐｐｃ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００４６９）。ｐｐｃをコードする遺伝子（２，６５２ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号２５、２６、２７及び２８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２６、２７のプライマーは５´末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号２８のプライマーは５´末端側にＳａｃＩ認識部位ををそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡ１μｇと、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２７と配列番号２８の組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１，４５０ｂｐ（以下ｐｐｃ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約７５０ｂｐ（以下ｐｐｃ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｐｃ−Ｌ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで、ｐｐｃ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＳａｃＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（宝バイオ）に形質転換して、ｐｐｃをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得て、このプラスミドをｐＴＨΔｐｐｃと命名した。
プラスミドｐＴＨΔｐｐｃをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、最終的にｐｐｃ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５株ΔｐｆｌΔｄｌｄ株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌＢΔｄｌｄΔｐｐｃ株と命名した。なお本株を得る詳細な方法は、本発明の実施例５に記載された方法に準じた。
［比較例２］
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｆｒｄ株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｆｒｄ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００４８７）。本実施例で欠失を試みるｆｒｄ遺伝子は、ｆｒｄＡをコードする遺伝子（１，８０９ｂｐ）、ｆｒｄＢをコードする遺伝子（７３５ｂｐ）、ｆｒｄＣをコードする遺伝子（３９６ｂｐ）、及びｆｒｄＤをコードする遺伝子（３６０ｂｐ）の４種類の遺伝子を含む遺伝子である。ｆｒｄ遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号２９、３０、３１及び３２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２９のプライマーは５´末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号３０、３１のプライマーは５´末端側にＢａｍＨＩ認識部位を、配列番号３２のプライマーはその内部にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡ１μｇと、配列番号２９と配列番号３０、配列番号３１と配列番号３２の組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約６００ｂｐ（以下ｆｒｄ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約８００ｂｐ（以下ｆｒｄ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｆｒｄ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで、ｆｒｄ−Ｒ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（宝バイオ）に形質転換して、ｆｒｄをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得て、このプラスミドをｐＴＨΔｆｒｄと命名した。
プラスミドｐＴＨΔｆｒｄをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、最終的にｆｒｄ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株を得、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｆｒｄ株と命名した。本株を得る詳細な方法は、本発明の実施例５に記載された方法に準じた。
［実施例２２］ エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株の作製
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのａｓｐＡ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００４８６）。ａｓｐＡをコードする遺伝子（１，４８２ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号３３、３４、３５及び３６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡ１μｇと、配列番号３３と配列番号３４、配列番号３５と配列番号３６の組み合わせで、上記プライマーＤＮＡ各々１００ｐｍｏｌとを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約９１０ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１，１００ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＡｓｐＡ−Ｌ断片とＡｓｐＡ−Ｒ断片の両者ともにＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝バイオ）で末端を平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にて５´末端をリン酸化した。一方温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１は、ＳｍａＩ消化後、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸化処理を行った。上記のリン酸化した２種類の断片と、脱リン酸化したプラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（宝バイオ）に形質転換して、ａｓｐＡをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得て、このプラスミドをｐＴＨΔａｓｐと命名した。
プラスミドｐＴＨΔａｓｐをエシェリヒア コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株に形質転換し、最終的にａｓｐＡ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株を得、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株と命名した。本株を得る詳細な方法は、本発明の実施例５に記載された方法に準じた。
［実施例２３］ エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株の作製
実施例１９で得たプラスミドｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡを、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを薬剤を含まないＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、さらに薬剤を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを薬剤を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子を含む約８００ｂｐ断片を増幅させ、ｌｄｈＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株によるＤ−乳酸、及びコハク酸の生産
前培養として４本の三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ、Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌに、実施例１５で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株、実施例２１で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株、比較例１で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｐｐｃ株、比較例２で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｆｒｄ株を別々に植菌し、一晩３０℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。その後、４台の１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に、表２４に示す培地４７５ｇを入れたものに、別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で３２時間行った。培養終了後、得られた培養液中の乳酸、及びコハク酸濃度をＨＰＬＣで定法に従って測定した。乳酸蓄積の結果を図２に、コハク酸蓄積の結果を図３に示す。
乳酸については、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株が３２時間で８９ｇ／Ｌ蓄積し、ΔｐｆｌΔｄｌｄ株と同等の蓄積を示したのに対して、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｐｐｃ株、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｆｒｄ株ではそれぞれ５６ｇ／Ｌ、７１ｇ／Ｌであった。
コハク酸については、ΔｐｆｌΔｄｌｄ株が３２時間で３．８ｇ／Ｌ蓄積したのに対して、残る３株はいずれも蓄積が見られなかった。

［実施例２５］エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株およびＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株によるＤ−乳酸、及びフマル酸の生産
前培養として３本の三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ、Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌに、実施例２２で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株と、実施例２３で得たエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株、および実施例２１で得たΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株を別々に植菌し、一晩３０℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。その後、３台の１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に、表２４に示す培地４７５ｇを入れたものに、別々に上記フラスコ内容物全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮａＯＨで調整）で４８時間行った。培養終了後、得られた培養液中の乳酸、及びフマル酸の濃度をＨＰＬＣで定法に従って測定した。乳酸蓄積の結果を図４に、フマル酸蓄積の結果を図５に示す。
乳酸については、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株が４８時間で９１ｇ／Ｌ、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株が４８時間で９０ｇ／Ｌと同等の蓄積を示したのに対して、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株では２４時間で９８ｇ／Ｌの蓄積を示した。
フマル酸については、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株が４８時間で０．０３７ｇ／Ｌの蓄積を示したのに対して、ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株とΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株では４８時間で０．０１ｇ／Ｌの蓄積を示した。

【配列表】

Claims (31)

1. ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）の活性が不活化あるいは低減化されたヘテロ乳酸発酵細菌を２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養し、得られた培養物から乳酸を回収することを特徴とする、乳酸の生産方法。
2. ヘテロ乳酸発酵細菌がエシェリヒア・コリであることを特徴とする請求項１に記載の乳酸の生産方法。
3. エシェリヒア・コリがＭＴ−１０９３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５７）株であることを特徴とする請求項２に記載の乳酸の生産方法。
4. エシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強され、かつピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化された細菌を培養し、得られた培養物からＤ−乳酸を回収することを特徴とする、Ｄ−乳酸の生産方法。
5. 細菌がエシェリヒア・コリである請求項４に記載のＤ−乳酸の生産方法。
6. ２種類以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、請求項４又は５に記載のＤ−乳酸の生産方法。
7. 該微生物が本来有しているＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化された微生物であって、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはエシェリヒア・コリ由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強されていることを特徴とする微生物。
8. 微生物が細菌である請求項７に記載の微生物。
9. 細菌がエシェリヒア・コリである請求項８に記載の微生物。
10. 請求項７〜９の何れか一項に記載の微生物を液体培地で培養し、培養液中にＤ−乳酸を生成蓄積せしめ、培養液からＤ−乳酸を分離することを特徴とするＤ−乳酸の生産方法。
11. ２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養することを特徴とする、請求項１０に記載のＤ−乳酸の生産方法。
12. ＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されている微生物を液体培地で培養し、培養液中にＤ−乳酸を生成蓄積せしめ、培養液からＤ−乳酸を分離することを特徴とするＤ−乳酸の生産方法。
13. 微生物が細菌である請求項１２に記載の方法。
14. 細菌がエシェリヒア・コリである請求項１３に記載の方法。
15. 微生物のゲノム上において、エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードする遺伝子が、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を発現する微生物。
16. 微生物がエシェリヒア・コリである請求項１５に記載の微生物。
17. 該微生物が本来有しているピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする請求項１５又は請求項１６に記載の微生物。
18. エシェリヒア・コリのゲノム上において、エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードする遺伝子のプロモーターに代えて、エシェリヒア・コリ由来の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することで該ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を発現するエシェリヒア・コリ。
19. エシェリヒア・コリの解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターが、エシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである請求項１８記載のエシェリヒア・コリ。
20. 該エシェリヒア・コリが本来有しているピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする請求項１８又は請求項１９に記載のエシェリヒア・コリ。
21. 請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の微生物を培地を用いて培養することによりＤ−乳酸を生産する方法。
22. ＴＣＡ回路を有し、且つリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性が不活化あるいは低減化されている微生物であって、更にピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）活性が不活化あるいは低減化されている、且つ／またはＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）活性が不活化あるいは低減化されていることを特徴とする微生物。
23. 該微生物が本来有しているアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ａｓｐＡ）活性が不活化または低減化されている請求項２２に記載の微生物。
24. 微生物が細菌である請求項２２又は２３に記載の微生物。
25. 細菌がエシェリヒア・コリである請求項２４に記載の微生物。
26. エシェリヒア・コリ由来のＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性が増強されている請求項２５に記載の微生物。
27. 請求項２２〜２６の何れか一項に記載の微生物を培地を用いて培養することにより、ＴＣＡ回路上で生産される有機酸以外の化合物を生産させる方法。
28. 有機酸以外の化合物がＤ−乳酸である請求項２７に記載の生産方法。
29. 通気条件下で培養することを特徴とする請求項１〜６、１０〜１４、２１、２８の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。
30. 通気条件が温度３０℃の水を対象とした場合、常圧で酸素移動容量係数Ｋ_Ｌａが１ｈ^−１以上４００ｈ^−１以下となるような条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件であることを特徴とする請求項２９に記載の乳酸の生産方法。
31. 培養ｐＨが６〜８であることを特徴とする請求項１〜６、１０〜１４、２１、２８〜３０の何れか一項に記載の乳酸の生産方法。

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