JPH1156361A - 変異酵母、その育種法およびそれを用いた発酵食品の製造方法 - Google Patents
変異酵母、その育種法およびそれを用いた発酵食品の製造方法Info
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- JPH1156361A JPH1156361A JP21852497A JP21852497A JPH1156361A JP H1156361 A JPH1156361 A JP H1156361A JP 21852497 A JP21852497 A JP 21852497A JP 21852497 A JP21852497 A JP 21852497A JP H1156361 A JPH1156361 A JP H1156361A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 単独の技術で幅広い範囲でリンゴ酸の生産量
を自由に変化せしめた変異酵母を作出し、食品や酒類の
製造に利用する。 【解決手段】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイ
ムをコードする遺伝子を破壊または増幅させた変異酵母
およびそれを用いる発酵食品、酒類の製造方法。
を自由に変化せしめた変異酵母を作出し、食品や酒類の
製造に利用する。 【解決手段】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイ
ムをコードする遺伝子を破壊または増幅させた変異酵母
およびそれを用いる発酵食品、酒類の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は発酵食品の製造に用
いられている酵母の生産するリンゴ酸量を自由に変化せ
しめた変異酵母、その育種方法およびそれを用いた発酵
食品の製造方法に関する。
いられている酵母の生産するリンゴ酸量を自由に変化せ
しめた変異酵母、その育種方法およびそれを用いた発酵
食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵食品中の有機酸はそれらに酸味を与
え、品質に大きく影響する重要な成分であり、有機酸の
組成や濃度が異なると全く異なった風味を与えることが
知られている。有機酸の中でもリンゴ酸の味の特徴とし
て、爽快な酸味を呈することが知られている。近年発酵
食品の多様化に対する消費者の要望の高まりと共に、発
酵に用いる微生物の生産する有機酸の組成や濃度に着目
した微生物の育種技術が開発されている。例えば、特開
平３−１７５９７５号公報では酵母のコハク酸デヒドロ
ゲナーゼの阻害剤を用いたリンゴ酸生産能の高い酵母の
育種方法および酒類の製造方法が、また、特開平６−１
７８６８２号公報では脱共役剤耐性を用いた寡酸性清酒
酵母の育種方法とそれを用いた清酒の製造方法がある。
しかしながら、いずれの従来の技術も単独では、特定の
有機酸のみを意図する濃度に自由に増加または減少させ
た酵母の育種は不可能であり、また、増加または減少さ
せることが可能な有機酸量も少ない範囲であった。さら
に、いずれの従来の技術でも分子レベルでの解析は十分
ではなく、どのような遺伝子が酵母の有機酸生産にどの
ように関与しているのかは未だ明らかではない。
え、品質に大きく影響する重要な成分であり、有機酸の
組成や濃度が異なると全く異なった風味を与えることが
知られている。有機酸の中でもリンゴ酸の味の特徴とし
て、爽快な酸味を呈することが知られている。近年発酵
食品の多様化に対する消費者の要望の高まりと共に、発
酵に用いる微生物の生産する有機酸の組成や濃度に着目
した微生物の育種技術が開発されている。例えば、特開
平３−１７５９７５号公報では酵母のコハク酸デヒドロ
ゲナーゼの阻害剤を用いたリンゴ酸生産能の高い酵母の
育種方法および酒類の製造方法が、また、特開平６−１
７８６８２号公報では脱共役剤耐性を用いた寡酸性清酒
酵母の育種方法とそれを用いた清酒の製造方法がある。
しかしながら、いずれの従来の技術も単独では、特定の
有機酸のみを意図する濃度に自由に増加または減少させ
た酵母の育種は不可能であり、また、増加または減少さ
せることが可能な有機酸量も少ない範囲であった。さら
に、いずれの従来の技術でも分子レベルでの解析は十分
ではなく、どのような遺伝子が酵母の有機酸生産にどの
ように関与しているのかは未だ明らかではない。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】このような事情に鑑
み、本発明は、酵母の有機酸生産に関与する遺伝子につ
いて分子レベルで検討し、単独の技術で幅広い範囲で特
定の有機酸のみの生産量を自由に変化せしめた変異酵母
と、その育種方法およびそれを用いた発酵食品の製造方
法を提供することを目的とする。
み、本発明は、酵母の有機酸生産に関与する遺伝子につ
いて分子レベルで検討し、単独の技術で幅広い範囲で特
定の有機酸のみの生産量を自由に変化せしめた変異酵母
と、その育種方法およびそれを用いた発酵食品の製造方
法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく酵母の有機酸生産機構について鋭意研究
を重ねた結果、酵母のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイ
ソザイムをコードしている遺伝子を破壊することによ
り、その酵母の生産するリンゴ酸を特異的に著しく減少
させることができることを見いだした。また、逆に、本
発明者らはリンゴ酸デヒトロゲナーゼのアイソザイムを
コードしている遺伝子を酵母中で高発現させることによ
り酵母の生産するリンゴ酸を特異的に増加させることに
成功し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至
った。すなわち、本発明は、生産するリンゴ酸量を自由
に変化せしめた変異酵母を提供するものであり、かかる
酵母には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの一部もしくは全
部が欠損しているか、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子が破壊されている変異酵母と、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼが増大されているか、またはリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子が増幅されている変異酵母、特に、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭＤＨ２）を増幅または
破壊した変異酵母が包含される。
的を達成すべく酵母の有機酸生産機構について鋭意研究
を重ねた結果、酵母のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイ
ソザイムをコードしている遺伝子を破壊することによ
り、その酵母の生産するリンゴ酸を特異的に著しく減少
させることができることを見いだした。また、逆に、本
発明者らはリンゴ酸デヒトロゲナーゼのアイソザイムを
コードしている遺伝子を酵母中で高発現させることによ
り酵母の生産するリンゴ酸を特異的に増加させることに
成功し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至
った。すなわち、本発明は、生産するリンゴ酸量を自由
に変化せしめた変異酵母を提供するものであり、かかる
酵母には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの一部もしくは全
部が欠損しているか、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
遺伝子が破壊されている変異酵母と、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼが増大されているか、またはリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子が増幅されている変異酵母、特に、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭＤＨ２）を増幅または
破壊した変異酵母が包含される。
【０００５】また、本発明は、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼの一部もしくは全部が欠損またはリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を破壊することにより生産するリンゴ酸量
を自由に変化せしめた変異酵母の育種方法、およびリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼを増大またはリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を増幅することにより生産するリンゴ酸量
を自由に変化せしめた変異酵母の育種方法、特に、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭＤＨ２）を増幅または
破壊することにより生産するリンゴ酸量を自由に変化せ
しめた変異酵母の育種方法を提供する。さらに、本発明
は、本発明の変異酵母を用いることを特徴とする発酵食
品の製造方法および酒類の製造方法を提供するものであ
る。
ゼの一部もしくは全部が欠損またはリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を破壊することにより生産するリンゴ酸量
を自由に変化せしめた変異酵母の育種方法、およびリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼを増大またはリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を増幅することにより生産するリンゴ酸量
を自由に変化せしめた変異酵母の育種方法、特に、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭＤＨ２）を増幅または
破壊することにより生産するリンゴ酸量を自由に変化せ
しめた変異酵母の育種方法を提供する。さらに、本発明
は、本発明の変異酵母を用いることを特徴とする発酵食
品の製造方法および酒類の製造方法を提供するものであ
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の酵母は、分類学的に酵母
の範疇にある任意のものでよいが、好ましくは、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviciae）
に属する酵母で、本発明の目的からすれば実際の発酵食
品の製造に用いられている酵母、例えば、清酒酵母、ビ
ール酵母、ワイン酵母、パン酵母等であり、これらから
取得される一倍体株や変異株も包含する。本発明の酵母
におけるリンゴ酸の生産量変化に関係するリンゴ酸デヒ
ドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子とは、
酵母のＭＤＨ１（Biochemistry27，8393（1988））、Ｍ
ＤＨ２（Mol．Cell．Biol．11，370（1991））、ＭＤＨ
３（J．Biol．Chem．267，24708（1992））遺伝子等
の、酵母のリンゴ酸生産に関与する酵素の遺伝子であ
る。
の範疇にある任意のものでよいが、好ましくは、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviciae）
に属する酵母で、本発明の目的からすれば実際の発酵食
品の製造に用いられている酵母、例えば、清酒酵母、ビ
ール酵母、ワイン酵母、パン酵母等であり、これらから
取得される一倍体株や変異株も包含する。本発明の酵母
におけるリンゴ酸の生産量変化に関係するリンゴ酸デヒ
ドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子とは、
酵母のＭＤＨ１（Biochemistry27，8393（1988））、Ｍ
ＤＨ２（Mol．Cell．Biol．11，370（1991））、ＭＤＨ
３（J．Biol．Chem．267，24708（1992））遺伝子等
の、酵母のリンゴ酸生産に関与する酵素の遺伝子であ
る。
【０００７】本発明によれば、酵母のリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子を破壊する
ことにより、酵母のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを減少ま
たは欠損させることができ、リンゴ酸生産能がなくなっ
たか、または減少した酵母の育種が可能である。酵母の
リンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする
遺伝子の破壊は、自体公知の方法で行うことができ、例
えば、その遺伝子のプロモーター領域や、コード領域の
内部に塩基を付加または欠失させたり、それらの領域全
体を欠失させることにより行うことができる。このよう
にしてリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコー
ドする遺伝子を破壊することにより、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムを発現させる能力が欠損または
減少した遺伝子は、通常の遺伝子工学的な遺伝子導入法
により酵母の染色体に導入することができる。その導入
により酵母の染色体上のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのア
イソザイムをコードする遺伝子と、導入した遺伝子の間
で組換えが起こり、遺伝子を導入された酵母のリンゴ酸
デヒドロゲナーゼを減少または欠損させることができ、
リンゴ酸生産能がなくなったかまたは低下した酵母の育
種が可能である。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを減
少または欠損させた酵母であれば、リンゴ酸生産能がな
くなったかまたは減少した酵母の育種が可能であるの
で、上記の遺伝子工学的な手法に限らず、自然変異、エ
チルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等の化学的変異、紫
外線などの物理的変異等の酵母のリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼのアイソザイムを減少または欠損させることができ
る手法ならばいずれの方法でも良い。
ゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子を破壊する
ことにより、酵母のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを減少ま
たは欠損させることができ、リンゴ酸生産能がなくなっ
たか、または減少した酵母の育種が可能である。酵母の
リンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする
遺伝子の破壊は、自体公知の方法で行うことができ、例
えば、その遺伝子のプロモーター領域や、コード領域の
内部に塩基を付加または欠失させたり、それらの領域全
体を欠失させることにより行うことができる。このよう
にしてリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコー
ドする遺伝子を破壊することにより、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムを発現させる能力が欠損または
減少した遺伝子は、通常の遺伝子工学的な遺伝子導入法
により酵母の染色体に導入することができる。その導入
により酵母の染色体上のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのア
イソザイムをコードする遺伝子と、導入した遺伝子の間
で組換えが起こり、遺伝子を導入された酵母のリンゴ酸
デヒドロゲナーゼを減少または欠損させることができ、
リンゴ酸生産能がなくなったかまたは低下した酵母の育
種が可能である。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを減
少または欠損させた酵母であれば、リンゴ酸生産能がな
くなったかまたは減少した酵母の育種が可能であるの
で、上記の遺伝子工学的な手法に限らず、自然変異、エ
チルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等の化学的変異、紫
外線などの物理的変異等の酵母のリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼのアイソザイムを減少または欠損させることができ
る手法ならばいずれの方法でも良い。
【０００８】酵母のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソ
ザイムをコードする遺伝子の増幅は上記の遺伝子を所望
のベクターに組込んでこれを酵母に導入する。この際に
使用可能なベクターとしては、例えば、ＹＲｐ系、ＹＥ
ｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系等種々の既知のものをすべて
用いることができる。また、酵母中でリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子を増幅させ
るためには、転写・翻訳を制御するユニットであるプロ
モーターを上記の遺伝子の５'−上流域に、また、ター
ミネーターを３’−下流域にそれぞれ組込めばよい。こ
のプロモーターおよびターミネーターとしては、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子
それ自身に由来するものの他、酵母のアルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ）、ホス
ファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、エノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ）、
トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）等のプロモー
ターやターミネーターを使用することができる。さら
に、適当なプロモーターを選択することによりリンゴ酸
デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子を
制御させて発現させることが可能であり、この場合、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺
伝子の発現量に比例して酵母の生産するリンゴ酸量を増
加させることができる。また、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼを増加させた酵母であればリンゴ酸生産能が増加した
酵母の育種が可能であるので、上記の遺伝子工学的な手
法に限らず、自然変異、エチルメタンスルホネート等の
化学的変異、紫外線などの物理的変異等の酵母のリンゴ
酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムを増加させることが
できるいずれの手法でも良い。
ザイムをコードする遺伝子の増幅は上記の遺伝子を所望
のベクターに組込んでこれを酵母に導入する。この際に
使用可能なベクターとしては、例えば、ＹＲｐ系、ＹＥ
ｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系等種々の既知のものをすべて
用いることができる。また、酵母中でリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子を増幅させ
るためには、転写・翻訳を制御するユニットであるプロ
モーターを上記の遺伝子の５'−上流域に、また、ター
ミネーターを３’−下流域にそれぞれ組込めばよい。こ
のプロモーターおよびターミネーターとしては、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子
それ自身に由来するものの他、酵母のアルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ）、ホス
ファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、エノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ）、
トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）等のプロモー
ターやターミネーターを使用することができる。さら
に、適当なプロモーターを選択することによりリンゴ酸
デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子を
制御させて発現させることが可能であり、この場合、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺
伝子の発現量に比例して酵母の生産するリンゴ酸量を増
加させることができる。また、リンゴ酸デヒドロゲナー
ゼを増加させた酵母であればリンゴ酸生産能が増加した
酵母の育種が可能であるので、上記の遺伝子工学的な手
法に限らず、自然変異、エチルメタンスルホネート等の
化学的変異、紫外線などの物理的変異等の酵母のリンゴ
酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムを増加させることが
できるいずれの手法でも良い。
【０００９】本発明の発酵食品の製造方法および酒類の
製造方法は、本発明の変異酵母を使用する以外は、従来
の発酵食品および酒類の製造と同様に行うことができ
る。製造する発酵食品や酒類の種類は特に限定するもの
ではなく、清酒、ビール、ワイン、パン、醤油、味噌等
であって良い。得られる発酵食品や酒類は、リンゴ酸が
特異的に増加または減少し、従来のものとは風味が異な
った製品となり、商品の多様化を可能にするものであ
る。
製造方法は、本発明の変異酵母を使用する以外は、従来
の発酵食品および酒類の製造と同様に行うことができ
る。製造する発酵食品や酒類の種類は特に限定するもの
ではなく、清酒、ビール、ワイン、パン、醤油、味噌等
であって良い。得られる発酵食品や酒類は、リンゴ酸が
特異的に増加または減少し、従来のものとは風味が異な
った製品となり、商品の多様化を可能にするものであ
る。
【００１０】
【実施例】つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ 酵母サッカロマイセス・セレビシエのリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子のクローニ
ング 清酒酵母協会７号の染色体ＤＮＡをテンプレートとし
て、Mol．Cell．Biol．11，370（1991）に報告されてい
るサッカロマイセス・セレビシエの塩基配列を元に、つ
ぎに示すプライマーを用いてＰＣＲ法によりリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子のう
ち、ＭＤＨ２をクローニングした。 ＭＤＨ２Ｆ ５’ＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＣＴ ３’ ＭＤＨ２Ｒ ５’ＴＧＣＴＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＣＧ ３’ クローニングしたＭＤＨ２遺伝子は種々の制限酵素で消
化後、電気泳動を行い、そのパターンが報告されている
ものと同一であることを確認した。
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ 酵母サッカロマイセス・セレビシエのリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子のクローニ
ング 清酒酵母協会７号の染色体ＤＮＡをテンプレートとし
て、Mol．Cell．Biol．11，370（1991）に報告されてい
るサッカロマイセス・セレビシエの塩基配列を元に、つ
ぎに示すプライマーを用いてＰＣＲ法によりリンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼのアイソザイムをコードする遺伝子のう
ち、ＭＤＨ２をクローニングした。 ＭＤＨ２Ｆ ５’ＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＣＴ ３’ ＭＤＨ２Ｒ ５’ＴＧＣＴＧＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＣＧ ３’ クローニングしたＭＤＨ２遺伝子は種々の制限酵素で消
化後、電気泳動を行い、そのパターンが報告されている
ものと同一であることを確認した。
【００１１】実施例２ ＭＤＨ２遺伝子破壊用プラスミドの構築 実施例１でクローニングしたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
のアイソザイムをコードする遺伝子ＭＤＨ２から、Ｐst
１とＥcoR１で切り出される０．８ｋbpのＤＮＡ断片を
pＵＣ１８にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、pＵＣ
１８ＭＤ２を作成した。これに選択マーカーを付与する
ために、pＵＣ１８ＭＤ２のＴthIII１とＨincIIで切り
出される６２bpの断片を切り出し平滑末端化した後に、
ＹＥｐ２４からＨindIIIで切り出される ０．７５ｋbp
のＵＲＡ３をコードするＤＮＡ断片を平滑末端化し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、図１に示すＭＤＨ２
破壊用プラスミド pＵＣ１８ＭＤ２Ｕを作成した。
のアイソザイムをコードする遺伝子ＭＤＨ２から、Ｐst
１とＥcoR１で切り出される０．８ｋbpのＤＮＡ断片を
pＵＣ１８にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、pＵＣ
１８ＭＤ２を作成した。これに選択マーカーを付与する
ために、pＵＣ１８ＭＤ２のＴthIII１とＨincIIで切り
出される６２bpの断片を切り出し平滑末端化した後に、
ＹＥｐ２４からＨindIIIで切り出される ０．７５ｋbp
のＵＲＡ３をコードするＤＮＡ断片を平滑末端化し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、図１に示すＭＤＨ２
破壊用プラスミド pＵＣ１８ＭＤ２Ｕを作成した。
【００１２】実施例３ ＭＤＨ２遺伝子を破壊したサッカロマイセス・セレビシ
エの作成 サッカロマイセス・セレビシエ清酒用酵母協会７号の１
倍体株Ｋ−７Ｈ６−１に常法に従ってウラシル要求性を
付与した７Ｈ６−ura３−２株（α，ura３）を作成し
た。ＭＤＨ２破壊用プラスミド pＵＣ１８ＭＤ２ＵをＳ
ph１とＥcoR１で消化し、得られた断片で７Ｈ６−ura３
−２株を酢酸リチウム法により形質転換し、ウラシル非
要求性をマーカーとして、形質転換体７Ｈ６−md２−１
を取得し、ＭＤＨ２遺伝子が破壊されていることをサザ
ンブロッティング法により確認した。
エの作成 サッカロマイセス・セレビシエ清酒用酵母協会７号の１
倍体株Ｋ−７Ｈ６−１に常法に従ってウラシル要求性を
付与した７Ｈ６−ura３−２株（α，ura３）を作成し
た。ＭＤＨ２破壊用プラスミド pＵＣ１８ＭＤ２ＵをＳ
ph１とＥcoR１で消化し、得られた断片で７Ｈ６−ura３
−２株を酢酸リチウム法により形質転換し、ウラシル非
要求性をマーカーとして、形質転換体７Ｈ６−md２−１
を取得し、ＭＤＨ２遺伝子が破壊されていることをサザ
ンブロッティング法により確認した。
【００１３】実施例４ ＭＤＨ２遺伝子高発現用プラスミドの構築 実施例（１）でクローニングしたリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼのアイソザイムをコードする遺伝子ＭＤＨ２を平滑
末端化後、リン酸化した。また、pＡＡＨ５のＡＤＨ１
のプロモーターとターミネーターとの間のＨindIIIサイ
トを平滑末端化後、脱リン酸化した。上記で得られた遺
伝子を、この脱リン酸化したところにＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、pＡＡＨ５ＭＤ２を作成した。このp
ＡＡＨ５ＭＤ２のＭＤＨ２のコード領域の上流と下流
に、それぞれＡＤＨ１のプロモーターとターミネーター
を連結した部分を、ＢamＨ１で切り出して３.２ｋbpの
断片を得た。これをpＲＳ４０６のマルチクローニング
サイトのＢamＨ１サイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、図２に示すＭＤＨ２遺伝子高発現用プラスミド
pＲＳ４０６ＡＭＤ２Ｕを作成した。
ーゼのアイソザイムをコードする遺伝子ＭＤＨ２を平滑
末端化後、リン酸化した。また、pＡＡＨ５のＡＤＨ１
のプロモーターとターミネーターとの間のＨindIIIサイ
トを平滑末端化後、脱リン酸化した。上記で得られた遺
伝子を、この脱リン酸化したところにＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、pＡＡＨ５ＭＤ２を作成した。このp
ＡＡＨ５ＭＤ２のＭＤＨ２のコード領域の上流と下流
に、それぞれＡＤＨ１のプロモーターとターミネーター
を連結した部分を、ＢamＨ１で切り出して３.２ｋbpの
断片を得た。これをpＲＳ４０６のマルチクローニング
サイトのＢamＨ１サイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、図２に示すＭＤＨ２遺伝子高発現用プラスミド
pＲＳ４０６ＡＭＤ２Ｕを作成した。
【００１４】実施例５ ＭＤＨ２遺伝子を高発現させたサッカロマイセス・セレ
ビシエの作成 実施例３で用いた７Ｈ６−ura３−２株（α，ura３）
を、Ｓtu１で消化したpＲＳ４０６ＡＭＤ２Ｕで酢酸リ
チウム法により形質転換し、ウラシル非要求性をマーカ
ーとして形質転換体７Ｈ６−ＭＤ２−１を取得した。p
ＲＳ４０６ＡＭＤ２Ｕが染色体上のＵＲＡ３遺伝子中に
組込まれていることをサザンブロッティング法により確
認した。また，ＭＤＨ２遺伝子が高発現されていること
をリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性測定により確認した。
この７Ｈ６−ＭＤ２−１株はＦＥＲＭ Ｐ−１６３４８
の受託番号の下、平成９年７月２４日より工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。
ビシエの作成 実施例３で用いた７Ｈ６−ura３−２株（α，ura３）
を、Ｓtu１で消化したpＲＳ４０６ＡＭＤ２Ｕで酢酸リ
チウム法により形質転換し、ウラシル非要求性をマーカ
ーとして形質転換体７Ｈ６−ＭＤ２−１を取得した。p
ＲＳ４０６ＡＭＤ２Ｕが染色体上のＵＲＡ３遺伝子中に
組込まれていることをサザンブロッティング法により確
認した。また，ＭＤＨ２遺伝子が高発現されていること
をリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性測定により確認した。
この７Ｈ６−ＭＤ２−１株はＦＥＲＭ Ｐ−１６３４８
の受託番号の下、平成９年７月２４日より工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１５】実施例６ ＭＤＨ１遺伝子、ＭＤＨ３遺伝子を破壊したサッカロマ
イセス・セレビシエの作成 実施例１〜３と同様に、Biochemistry 27，8393（198
8）、J．Biol．Chem.，267 24708（1992）に報告されて
いるサッカロマイセス・セレビシエの塩基配列を元に、
ＰＣＲ法によりリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイ
ムをコードする遺伝子のうち、ＭＤＨ１およびＭＤＨ３
をそれぞれクローニングし、図３および図４に示す遺伝
子破壊用プラスミドを構築した。このプラスミドで、サ
ッカロマイセス・セレビシエ清酒用酵母協会７号の一倍
体株を同様に形質転換して、ＭＤＨ１とＭＤＨ３の遺伝
子破壊株７Ｈ６−md１−１と７Ｈ６−md３−１をそれぞ
れ取得した。
イセス・セレビシエの作成 実施例１〜３と同様に、Biochemistry 27，8393（198
8）、J．Biol．Chem.，267 24708（1992）に報告されて
いるサッカロマイセス・セレビシエの塩基配列を元に、
ＰＣＲ法によりリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイ
ムをコードする遺伝子のうち、ＭＤＨ１およびＭＤＨ３
をそれぞれクローニングし、図３および図４に示す遺伝
子破壊用プラスミドを構築した。このプラスミドで、サ
ッカロマイセス・セレビシエ清酒用酵母協会７号の一倍
体株を同様に形質転換して、ＭＤＨ１とＭＤＨ３の遺伝
子破壊株７Ｈ６−md１−１と７Ｈ６−md３−１をそれぞ
れ取得した。
【００１６】実施例７ 合成培地での有機酸の生産 上記取得株７Ｈ６−md２−１、７Ｈ６−ＭＤ２−１（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１６３４８）、７Ｈ６−md１−１および７
Ｈ６−md３−１を用いＹＰＤ１５培地（グルコース１５
％、ペプトン２％、酵母エキス１％）で２５℃、６日間
静置培養を行い、培養上澄の成分分析を行った。対照と
して親株である７Ｈ６−ura３−２をpＲＳ４０６で形質
転換してウラシル非要求性とした７Ｈ６−ＵＲＡ３−１
も同様に静置培養を行い、培養上澄の分析を行った。分
析結果を表１に示す。酵素活性はＹＰＤ１５培地で２５
℃、２日間静置培養し、得られた酵母菌体をガラスビー
ズで破砕し、その無細胞抽出液のリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性をＬeeらの方法（J．Bacteriol．169，5157（1
987））に従い測定した。
ＥＲＭ Ｐ−１６３４８）、７Ｈ６−md１−１および７
Ｈ６−md３−１を用いＹＰＤ１５培地（グルコース１５
％、ペプトン２％、酵母エキス１％）で２５℃、６日間
静置培養を行い、培養上澄の成分分析を行った。対照と
して親株である７Ｈ６−ura３−２をpＲＳ４０６で形質
転換してウラシル非要求性とした７Ｈ６−ＵＲＡ３−１
も同様に静置培養を行い、培養上澄の分析を行った。分
析結果を表１に示す。酵素活性はＹＰＤ１５培地で２５
℃、２日間静置培養し、得られた酵母菌体をガラスビー
ズで破砕し、その無細胞抽出液のリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性をＬeeらの方法（J．Bacteriol．169，5157（1
987））に従い測定した。
【００１７】
【表１】
【００１８】表１よりＭＤＨ２破壊株である７Ｈ６−md
２−１の酵素活性は親株に比較してほとんど低下してい
なかったが、そのリンゴ酸生産量は親株の約１／６まで
減少した。これに対してＭＤＨ１破壊株である７Ｈ６−
md１−１の酵素活性は親株の１／１０以下まで低下した
にもかかわらず、リンゴ酸生産量は減少せず、逆に増加
していた。また、ＭＤＨ３破壊株である７Ｈ６−md３−
１の酵素活性は親株と同一でありリンゴ酸生産に関して
も増減が認められなかった。一方、ＭＤＨ２増幅株であ
る７Ｈ６−ＭＤ２−１の酵素活性は親株の１.５倍に上
昇し、そのリンゴ酸生産量は親株の３.７倍以上であっ
た。以上のことから、酵母による有機酸生産には、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼアイソザイムのうち、ＭＤＨ２が
リンゴ酸生産に大きく寄与しており、所望のリンゴ酸生
産量を得るには、ＭＤＨ２遺伝子を破壊ないし増幅すれ
ばよいことが遺伝子レベルで初めて明らかとなった。
２−１の酵素活性は親株に比較してほとんど低下してい
なかったが、そのリンゴ酸生産量は親株の約１／６まで
減少した。これに対してＭＤＨ１破壊株である７Ｈ６−
md１−１の酵素活性は親株の１／１０以下まで低下した
にもかかわらず、リンゴ酸生産量は減少せず、逆に増加
していた。また、ＭＤＨ３破壊株である７Ｈ６−md３−
１の酵素活性は親株と同一でありリンゴ酸生産に関して
も増減が認められなかった。一方、ＭＤＨ２増幅株であ
る７Ｈ６−ＭＤ２−１の酵素活性は親株の１.５倍に上
昇し、そのリンゴ酸生産量は親株の３.７倍以上であっ
た。以上のことから、酵母による有機酸生産には、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼアイソザイムのうち、ＭＤＨ２が
リンゴ酸生産に大きく寄与しており、所望のリンゴ酸生
産量を得るには、ＭＤＨ２遺伝子を破壊ないし増幅すれ
ばよいことが遺伝子レベルで初めて明らかとなった。
【００１９】実施例８ 清酒の醸造 表２に示すような仕込配合で、上記分離株７Ｈ６−md２
−１、７Ｈ６−ＭＤ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３４
８）、７Ｈ６−md１−１および７Ｈ６−md３−１を用い
て総米４０ｇの清酒醸造試験を行った。仕込品温は１５
℃の一定とし、留後１６日目にもろみを濾過し、成分分
析を行った。対照として親株である７Ｈ６−ura３−２
をpＲＳ４０６で形質転換し、ウラシル非要求性とした
７Ｈ６−ＵＲＡ３−１も同様に醸造し、成分分析を行っ
た。分析結果を表３に、また、主要な有機酸の組成比を
表４に示す。
−１、７Ｈ６−ＭＤ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３４
８）、７Ｈ６−md１−１および７Ｈ６−md３−１を用い
て総米４０ｇの清酒醸造試験を行った。仕込品温は１５
℃の一定とし、留後１６日目にもろみを濾過し、成分分
析を行った。対照として親株である７Ｈ６−ura３−２
をpＲＳ４０６で形質転換し、ウラシル非要求性とした
７Ｈ６−ＵＲＡ３−１も同様に醸造し、成分分析を行っ
た。分析結果を表３に、また、主要な有機酸の組成比を
表４に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】表３、４より、合成培地での結果と同様な
傾向でありＭＤＨ２破壊株である７Ｈ６−md２−１のリ
ンゴ酸生産量は組成比で親株の半分程度まで減少でき、
乳酸量比が多い柔らかみのある温和な酸味を特徴とする
清酒が得られることがわかった。これに対してＭＤＨ１
破壊株である７Ｈ６−md１−１とＭＤＨ３破壊株である
７Ｈ６−md３−１のリンゴ酸生産量は組成比で共に親株
に比べ増加する傾向にあり、滴定酸度では親株とほぼ同
一の清酒であった。一方、ＭＤＨ２増幅株である７Ｈ６
−ＭＤ２−１のリンゴ酸生産量は組成比で親株の２.４
倍近く上げることができ、滴定酸度も１.５倍上昇させ
ることができ、リンゴ酸の爽快な酸味を特徴とする清酒
の醸造が可能であることがわかった。
傾向でありＭＤＨ２破壊株である７Ｈ６−md２−１のリ
ンゴ酸生産量は組成比で親株の半分程度まで減少でき、
乳酸量比が多い柔らかみのある温和な酸味を特徴とする
清酒が得られることがわかった。これに対してＭＤＨ１
破壊株である７Ｈ６−md１−１とＭＤＨ３破壊株である
７Ｈ６−md３−１のリンゴ酸生産量は組成比で共に親株
に比べ増加する傾向にあり、滴定酸度では親株とほぼ同
一の清酒であった。一方、ＭＤＨ２増幅株である７Ｈ６
−ＭＤ２−１のリンゴ酸生産量は組成比で親株の２.４
倍近く上げることができ、滴定酸度も１.５倍上昇させ
ることができ、リンゴ酸の爽快な酸味を特徴とする清酒
の醸造が可能であることがわかった。
【００２４】実施例９ 酢酸資化能欠損株よりＭＤＨ２が欠損したサッカロマイ
セス・セレビシエの変異株の取得と清酒の醸造 ＭＤＨ２がコードするリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイ
ソザイムは、酢酸を単一炭素源として生育させると、グ
リオキサル酸サイクルの一部として機能し、それゆえＭ
ＤＨ２破壊株は表現型として酢酸資化能がなくなること
が報告されている（Mol．Cel． Biol. 11，370（199
1））。そこで、サッカロマイセス・セレビシエ清酒用
酵母協会７号の１倍体株である Ｋ−７Ｈ６−１株から
酢酸資化能欠損変異とリンゴ酸生産能の低下を指標にＭ
ＤＨ２が欠損したサッカロマイセス・セレビシエの変異
株の取得を行った。すなわち、０.１Ｍリン酸緩衝液（p
Ｈ８.０）４.６ml、４０％グルコース溶液０.２５ml、
ＥＭＳ０.１５mlを混合した溶液に細胞（約１０9個）を
懸濁し、３０℃で３０分処理した。ＥＭＳを中和するた
めに５％チオ硫酸ナトリウム溶液中で１０分反応させた
後、滅菌水で２回洗浄した。ついで、酢酸を炭素源とし
てナイスタチン濃縮後、適宜希釈し、ＹＰＤプレートに
約２万個のコロニーをつくらせた。その後、グルコース
または酢酸を単一炭素源とする最少培地プレート（Difc
o社製イースト・ナイトロゲン・ベース０.６７％、グル
コース２％または酢酸ナトリウム２％、寒天２％、ｐＨ
５.５）にレプリカし、３０℃・６日間培養後、酢酸資
化能欠損株を１７６株分離した。分離された１７６株に
ついて実施例７と同様にして培養を行い、その上澄につ
いて有機酸分析を行い、リンゴ酸生産量のみが低下した
変異株 ７Ｈ６−ad１−１と７Ｈ６−ad１−２の２株を
分離した。７Ｈ６−ad１−１と７Ｈ６−ad１−２につい
て、実施例８と同様に清酒醸造試験を行い、成分分析を
行った。分析結果を表５に示す。
セス・セレビシエの変異株の取得と清酒の醸造 ＭＤＨ２がコードするリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイ
ソザイムは、酢酸を単一炭素源として生育させると、グ
リオキサル酸サイクルの一部として機能し、それゆえＭ
ＤＨ２破壊株は表現型として酢酸資化能がなくなること
が報告されている（Mol．Cel． Biol. 11，370（199
1））。そこで、サッカロマイセス・セレビシエ清酒用
酵母協会７号の１倍体株である Ｋ−７Ｈ６−１株から
酢酸資化能欠損変異とリンゴ酸生産能の低下を指標にＭ
ＤＨ２が欠損したサッカロマイセス・セレビシエの変異
株の取得を行った。すなわち、０.１Ｍリン酸緩衝液（p
Ｈ８.０）４.６ml、４０％グルコース溶液０.２５ml、
ＥＭＳ０.１５mlを混合した溶液に細胞（約１０9個）を
懸濁し、３０℃で３０分処理した。ＥＭＳを中和するた
めに５％チオ硫酸ナトリウム溶液中で１０分反応させた
後、滅菌水で２回洗浄した。ついで、酢酸を炭素源とし
てナイスタチン濃縮後、適宜希釈し、ＹＰＤプレートに
約２万個のコロニーをつくらせた。その後、グルコース
または酢酸を単一炭素源とする最少培地プレート（Difc
o社製イースト・ナイトロゲン・ベース０.６７％、グル
コース２％または酢酸ナトリウム２％、寒天２％、ｐＨ
５.５）にレプリカし、３０℃・６日間培養後、酢酸資
化能欠損株を１７６株分離した。分離された１７６株に
ついて実施例７と同様にして培養を行い、その上澄につ
いて有機酸分析を行い、リンゴ酸生産量のみが低下した
変異株 ７Ｈ６−ad１−１と７Ｈ６−ad１−２の２株を
分離した。７Ｈ６−ad１−１と７Ｈ６−ad１−２につい
て、実施例８と同様に清酒醸造試験を行い、成分分析を
行った。分析結果を表５に示す。
【００２５】
【表５】
【００２６】表５より、酢酸資化能欠損とリンゴ酸生産
量を指標としてスクリーニングを行って取得された７Ｈ
６−ad１−１株と７Ｈ６−ad１−２株は、実施例８の遺
伝子工学的手法により取得されたＭＤＨ２破壊株である
７Ｈ６−md２−１株と同様に清酒の醸造試験で親株に対
してリンゴ酸生産量が１／３程度に減少しており、変異
処理によってもリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイ
ムの欠損株であるリンゴ酸生産能が低く、滴定酸度も低
い酵母は取得可能であった。これらの取得された酵母に
より醸造された清酒の官能検査の結果も良好であり、柔
らかみのある温和な酸味を特徴とする清酒の醸造が可能
であることがわかった。
量を指標としてスクリーニングを行って取得された７Ｈ
６−ad１−１株と７Ｈ６−ad１−２株は、実施例８の遺
伝子工学的手法により取得されたＭＤＨ２破壊株である
７Ｈ６−md２−１株と同様に清酒の醸造試験で親株に対
してリンゴ酸生産量が１／３程度に減少しており、変異
処理によってもリンゴ酸デヒドロゲナーゼのアイソザイ
ムの欠損株であるリンゴ酸生産能が低く、滴定酸度も低
い酵母は取得可能であった。これらの取得された酵母に
より醸造された清酒の官能検査の結果も良好であり、柔
らかみのある温和な酸味を特徴とする清酒の醸造が可能
であることがわかった。
【００２７】
【発明の効果】本発明により発酵期間中の酵母の有機酸
生産に関与する酵素のうち、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
のアイソザイムをコードする遺伝子の中のＭＤＨ２遺伝
子を破壊することおよび変異処理により本酵素の欠損株
を取得することによりリンゴ酸の生産量が少ない、例え
ば、清酒醸造に使用した場合は、総酸量が減少できた、
リンゴ酸が減少した分乳酸量を増加させることができる
清酒が得られる。反対にＭＤＨ２遺伝子を増幅させるこ
とにより、リンゴ酸量を２倍以上増加させることができ
る清酒醸造が可能となる。以上のことより、所望のリン
ゴ酸量をコントロールできる酵母の育種技術を開発する
ことができ、これらの酵母を使用することにより、発酵
食品中の有機酸生産量比のバラエティー化が可能とな
り、新たな発酵食品の味の多様化が可能となった。
生産に関与する酵素のうち、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
のアイソザイムをコードする遺伝子の中のＭＤＨ２遺伝
子を破壊することおよび変異処理により本酵素の欠損株
を取得することによりリンゴ酸の生産量が少ない、例え
ば、清酒醸造に使用した場合は、総酸量が減少できた、
リンゴ酸が減少した分乳酸量を増加させることができる
清酒が得られる。反対にＭＤＨ２遺伝子を増幅させるこ
とにより、リンゴ酸量を２倍以上増加させることができ
る清酒醸造が可能となる。以上のことより、所望のリン
ゴ酸量をコントロールできる酵母の育種技術を開発する
ことができ、これらの酵母を使用することにより、発酵
食品中の有機酸生産量比のバラエティー化が可能とな
り、新たな発酵食品の味の多様化が可能となった。
【図１】 実施例２におけるプラスミド作成過程を示
す。
す。
【図２】 実施例４におけるプラスミド作成過程を示
す。
す。
【図３】 実施例６における作成したプラスミドを示
す。
す。
【図４】 実施例６における作成したプラスミドを示
す。
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｇ 1/02 Ｃ１２Ｇ 1/02 3/02 １１９ 3/02 １１９Ｇ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｐ 7/46 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 熊谷 知栄子 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大関 株式会社総合研究所内
Claims (11)
- 【請求項１】 生産するリンゴ酸量を自由に変化せしめ
た変異酵母。 - 【請求項２】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼの一部もしく
は全部が欠損しているか、またはリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子が破壊されている請求項１記載の変異酵母。 - 【請求項３】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼが増大されて
いるか、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が増幅
されている請求項１記載の変異酵母。 - 【請求項４】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭＤ
Ｈ２）を増幅または破壊した請求項２または３記載の変
異酵母。 - 【請求項５】 サッカロマイセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）である請求項１〜４いずれか１項
記載の変異酵母。 - 【請求項６】 サッカロマイセス・セレビシエ ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６３４８である請求項４記載の変異酵母。 - 【請求項７】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼの一部もしく
は全部が欠損またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を
破壊することにより生産するリンゴ酸量を自由に変化せ
しめた変異酵母の育種方法。 - 【請求項８】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼを増大または
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅することにより
生産するリンゴ酸量を自由に変化せしめた変異酵母の育
種方法。 - 【請求項９】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＭＤ
Ｈ２）を増幅または破壊することにより生産するリンゴ
酸量を自由に変化せしめた変異酵母の育種方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜６いずれか１項記載の変異
酵母を用いることを特徴とする発酵食品の製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜６いずれか１項記載の変異
酵母を用いることを特徴とする酒類の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21852497A JPH1156361A (ja) | 1997-08-13 | 1997-08-13 | 変異酵母、その育種法およびそれを用いた発酵食品の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21852497A JPH1156361A (ja) | 1997-08-13 | 1997-08-13 | 変異酵母、その育種法およびそれを用いた発酵食品の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1156361A true JPH1156361A (ja) | 1999-03-02 |
Family
ID=16721289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21852497A Pending JPH1156361A (ja) | 1997-08-13 | 1997-08-13 | 変異酵母、その育種法およびそれを用いた発酵食品の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1156361A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8669093B2 (en) | 2003-09-30 | 2014-03-11 | Mitsui Chemicals, Inc. | Biocatalyst for production of D-lactic acid |
| JP2020103049A (ja) * | 2018-12-26 | 2020-07-09 | 月桂冠株式会社 | 酵母の醸造特性を判定する方法、及び酵母の育種方法 |
| CN114854612A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-08-05 | 江南大学 | 一株产l-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用 |
-
1997
- 1997-08-13 JP JP21852497A patent/JPH1156361A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8669093B2 (en) | 2003-09-30 | 2014-03-11 | Mitsui Chemicals, Inc. | Biocatalyst for production of D-lactic acid |
| JP2020103049A (ja) * | 2018-12-26 | 2020-07-09 | 月桂冠株式会社 | 酵母の醸造特性を判定する方法、及び酵母の育種方法 |
| CN114854612A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-08-05 | 江南大学 | 一株产l-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用 |
| CN114854612B (zh) * | 2022-03-25 | 2024-02-27 | 江南大学 | 一株产l-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用 |
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