JPH1198981A - 新規エステル加水分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 医薬原料として有用な光学活性6-アミノクロ
マン-3-酢酸類及びそのエステルを製造する触媒として
有用な光学選択的エステル加水分解酵素を提供するこ
と。 【解決手段】 シュウドノカルディア（Pseudonocardi
a）属に属する微生物から、6-アミノクロマン-3-酢酸エ
ステルに対して（Ｒ）体を優先的に加水分解する酵素活
性を有し、温度安定性及びｐＨ安定性に優れたエステル
粕分解酵素を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エステルを加水分
解する触媒として有用な新規エステル加水分解酵素に関
するものである。特に、医薬原料として有用な化合物で
ある光学活性な6-アミノクロマン-3-酢酸類を製造する
際の触媒として有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素を有機合成に応用する試みが
盛んに行われている。特に、高い基質選択能を有するエ
ステラーゼを用い、各種のエステル化合物を光学選択的
に加水分解し、光学活性化合物を取得することなどは工
業的に有用性が高い。

【０００３】このような目的に供されるエステラーゼと
しては、豚肝臓由来エステラーゼなどが一般的である
が、高価であり量的な供給にも制限があり工業的使用に
は不利である。豚肝臓エステラーゼの代わりに微生物起
源のエステラーゼを用いる方法も試みられている。生産
する生物の起源が異なる場合、各々特徴的な基質特異性
を有するため、適用する化合物によって選択性や反応速
度が大きく異なる。

【０００４】6-アミノクロマン-3-酢酸エステルはヨー
ロッパ公開特許公報ＥＰ０７０９３７０及びＥＰ０７６
０３６４において知られ、抗血小板薬の有用な中間体で
ある。しかしながら、6-アミノクロマン-3-酢酸エステ
ル化合物に対し高い光学選択性を示し且つ効率よく加水
分解するエステル加水分解酵素は知られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、医薬
原料として有用な光学活性6-アミノクロマン-3-酢酸類
及びそのエステルを製造する触媒として有用な光学選択
的エステル加水分解酵素を見い出すことである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、シュウドノカル
ディア属に属する微生物が（３Ｒ）6-アミノクロマン-3
-酢酸エステル化合物を光学選択的に且つ効率的に加水
分解することを見い出した。さらに、各種の精製技術を
利用して、この微生物から光学選択的加水分解能を示し
且つ熱安定性の高い新規なエステル加水分解酵素を単離
することに成功し、本発明を完成した。

【０００７】本発明のエステル加水分解酵素は、後述す
る理化学的特性を有することを特徴とする。本発明のエ
ステル加水分解酵素は、常温常圧の条件下で極めて微量
の触媒量でエステル加水分解反応を促進させることがで
きるものであり、温度安定性・ｐＨ安定性にも優れ、さ
らに医薬中間体として有用なクロマン-3-酢酸類及びそ
のエステル光学選択的に加水分解することができ、これ
らの化合物の製造に極めて有用である。

【０００８】

【発明の実施の形態】次に、本発明を詳細に説明する。 （１）酵素を含有する微生物及びこの培養方法 本発明のエステル加水分解酵素は、例えば、シュウドノ
カルディア属に属する微生物から得ることができる。本
発明のエステル加水分解酵素の取得に好適な菌株として
は、シュウドノカルディア・サーモフィラ（Pseudonoca
rdia thermophila）FERM BP-6275、ATCC 19285等を挙げ
ることができる。FERM BP-6275は、通産省工業技術院生
命工学工業研究所に、平成１０年２月２７日付でブタペ
スト条約下に国際寄託されている。また、ATCC 19285は
アメリカン タイプ カルチャーコレクションに寄託さ
れており、この菌株については公的に入手可能である。

【０００９】これらの微生物の培養は、公知の培養方法
に準じて行うことができる。使用する培地は、一般微生
物の栄養源として公知のものが使用でき、肉エキス、酵
母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン等の有機
栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、でんぷん、
有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アン
モニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウ
ム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて
使用できる。培地のｐＨは６〜９の範囲で選べばよく、
培養温度は３０〜６０℃、好ましくは４５〜５５℃であ
る。培養日数は１〜７の範囲で目的のエステル加水分解
酵素の含量が最大になるまで培養すればよい。

【００１０】（２）酵素の精製 酵素の精製は、通常の酵素精製法を用いることができ
る。培養終了液より遠心分離等により菌体を集め、超音
波処理、フレンチプレス、ダイノミル等の機械的方法に
よって菌体を破砕する。細胞片等の固形物を遠心分離に
よって除き、粗酵素液を得る。次に硫酸アンモニウム等
による塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、結晶化等を行うことによ
り精製される。これについては実施例にて１例を記載す
る。

【００１１】（３）酵素活性の測定法 （ＲＳ）6-アミノクロマン-3-酢酸メチルエステル１０
μｍｏｌ、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）０．１
ｍｍｏｌ、及び適当量の酵素液を加え１．０ｍｌになる
よう混合して、５５℃で３０分反応する。反応終了後、
反応液の一部を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）−３０％アセトニトリル溶液で希釈し、高速液
体クロマトグラフィーで6-アミノクロマン-3-酢酸メチ
ルエステル及び6-アミノクロマン-3-酢酸をそれぞれ定
量した。分析条件としては、イナートシルＯＤＳ−２
（ＧＬサイエンス製）のカラムで、１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．０）−３０％アセトニトリルを
キャリアとして、流速を１分間に０．７ｍｌで溶出し、
２５４ｎｍの吸光度にて検出した。さらに残りの反応液
に等量のクロロホルムを加え、残存する6-アミノクロマ
ン-3-酢酸メチルエステルを抽出する。次に、減圧下ク
ロロホルムを留去し、残さをエタノールに溶解し、さら
にヘキサン／エタノール＝３：２（容量比）で希釈し、
高速液体クロマトグラフィーで（３Ｓ）-6-アミノクロ
マン-3-酢酸メチルエステル及び（３Ｒ）-6-アミノクロ
マン-3-酢酸メチルエステルをそれぞれ定量した。分析
条件としては、キラルセルＯＤ−Ｈ（ダイセル（株））
の光学分割カラムで、ヘキサン／エタノール＝３：２
（容量比）をキャリアとして、流速を１分間に０．５ｍ
ｌで溶出し、２５４ｎｍの吸光度にて検出した。

【００１２】加水分解によって生成した6-アミノクロマ
ン-3-酢酸量または残存する6-アミノクロマン-3-酢酸メ
チルエステル量から算出された6-アミノクロマン-3-酢
酸メチルエステル加水分解量から、単位時間、単位酵素
量当たりの活性を算出した。

【００１３】１分間に１μｍｏｌの6-アミノクロマン-3
-酢酸メチルエステルを加水分解する酵素量を１単位と
した。

【００１４】（４）酵素の均一性 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をトリス−グ
リシン緩衝液を用い１０−２０％ゲルにて、Ｊ.Ｂｉｏ
ｌ.Ｃｈｅｍ.２４４.４４０６.（１９６９）の方法で行
った。均一な１本のタンパクバンドが見られ、公知の標
準タンパクとの比較から、このタンパクの分子量は、５
００００±２０００となった。

【００１５】（５）酵素の性質 本発明のエステル加水分解酵素は次の性質を有すること
が解った。 酵素作用 エステル化合物をカルボン酸基とアルコールに加水分解
する反応およびエステル化合物とアルコールとのエステ
ル交換反応の触媒としての機能を示す。 基質特異性 6-アミノクロマン-3-酢酸エステルに対しては、（Ｒ）
体を優先的に加水分解する。直鎖状脂肪酸とP-ニトロフ
ェノールのエステルに対しては、脂肪酸の炭素数が少な
いものほど強く作用する。p-ニトロフェニルラウリン酸
エステルに対する加水分解活性は、p-ニトロフェニル酢
酸エステルに対する加水分解活性の１％以下である。 分子量 分子量は５００００±２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で
ある。 至適ｐＨ ｐＨ７〜ｐＨ１０で加水分解作用は至適である。 至適温度 ５５〜６０℃が加水分解作用の至適温度である。 温度安定性 ｐＨ７．２で６０℃以下の温度においては、３０分間放
置しても加水分解活性は９５％以上残存している。 ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１０が安定領域である。 阻害剤 ０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で、３０℃、３
０分間処理すると、硫酸銅（１ｍＭ）で３０％、フェニ
ルメチルスルホニル・フルオリド（０．１ｍＭ）で８５
％、イソプロピルフルオロリン酸（０．５ｍＭ）で１５
％に活性が低下する。ラウリル硫酸ナトリウム（５ｍ
Ｍ）、デオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭ）では活性
低下しない。これについては実施例に記載する。

【００１６】以上のように、本酵素は6-アミノクロマン
-3-酢酸エステルに光学選択的に作用するエステル加水
分解酵素であり、さらに耐熱性、ｐＨ安定性に優れた酵
素である。

【００１７】

【実施例】次に、実施例により本発明を詳細に説明す
る。ただし、これら実施例は本発明の範囲を限定するも
のではない。

【００１８】実施例１（エステル加水分解酵素含有菌体
の培養法） 酵母エキス０．１％、肉エキス（エルリッヒ）０．１
％、ＮＺアミン（ＴＹＰＥ１）０．２％、塩化ナトリウ
ム０．５％、リン酸１カリウム０．０５％、リン酸２カ
リウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０１％、溶性で
んぷん１．０％を含み、ｐＨを７．４とした殺菌培地１
Ｌに、上記培地で培養したシュードノカルディア・サー
モフィラ（Pseudonocardia thermophila）FERM-BP-6275
を５％植菌し、５２℃で９６時間培養した。遠心分離で
湿菌体を１０ｇ得た。

【００１９】実施例２（エステル加水分解酵素の精製） 実施例１で得た菌体を、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．２）｛以後バッファーと略す｝１００ｍｌ
に懸濁した。超音波処理で菌体を分散させた後、フレン
チプレスで菌体を破砕した。破砕菌体は１５０００×
ｇ，２０分間遠心分離で除去し、無細胞抽出液を得た。
これに硫酸アンモニウムが６０％になるよう添加し、遠
心分離により活性画分である沈殿物を取得した。この沈
殿を、１０ｍｌのバッファーに溶解し、ウルトロゲルＡ
ＣＡ５４（ファルマシア製）を担体としたゲル濾過にか
けた。活性画分を集め、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ
（東ソー製）カラムに通過させ、バッファーと０．６Ｍ
ＮａＣｌを含むバッファーの直線的な濃度勾配で溶出さ
せた。活性画分をフェニルトヨパール６５０Ｍ（東ソー
製）カラムに通過させ、０．８Ｍ硫酸アンモニウムを含
むバッファーとバッファーの直線的な濃度勾配で溶出さ
せた。活性画分を限外濾過により濃縮し、バッファーで
透析した。このようにして、エステル加水分解酵素を均
一に精製した。この精製過程を表１に示す。

【００２０】

【表１】 実施例３ （ラセミ体6-アミノクロマン-3-酢酸メチルエステルの
光学選択的加水分解）実施例２で均一に精製されたエス
テル加水分解酵素を用いて、以下の条件でラセミ体6-ア
ミノクロマン-3-酢酸メチルエステルの加水分解を行っ
た。０．１ｍｍｏｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）、１０μｍｏｌラセミ体6-アミノクロマン-3-酢酸
メチルエステル、及び適量のエステル加水分解酵素を含
む反応液１ｍｌを５５℃で３０分間反応した。反応終了
後１ｍｌのトルエンを添加し、残存するエステルを抽出
した。抽出液を減圧乾燥し、（３Ｓ）6-アミノクロマン
-3-酢酸メチルエステルを得た。（３Ｓ）6-アミノクロ
マン-3-酢酸メチルエステルの光学純度は９９％ｅｅ、
収率は４０％であった。

【００２１】実施例４ （ラセミ体6-アミノクロマン-3-酢酸エチルエステルの
光学選択的加水分解）実施例２で均一に精製されたエス
テル加水分解酵素を用いて、以下の条件でラセミ体6-ア
ミノクロマン-3-酢酸エチルエステルの加水分解を行っ
た。０．１ｍｍｏｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）、１０μｍｏｌラセミ体6-アミノクロマン-3-酢酸
エチルエステル、及び適量のエステル加水分解酵素を含
む反応液１ｍｌを５５℃で３０分間反応した。反応終了
後１ｍｌのトルエンを添加し、残存するエステルを抽出
した。抽出液を減圧乾燥し、（３Ｓ）6-アミノクロマン
-3-酢酸エチルエステルを得た。（３Ｓ）6-アミノクロ
マン-3-酢酸エチルエステルの光学純度は９９％ｅｅ、
収率は３８％であった。

【００２２】実施例５（至適ｐＨの検討） 実施例２で均一に精製されたエステル加水分解酵素を用
いて、至適ｐＨを検討した。

【００２３】（ＲＳ）6-アミノ-クロマン-3-酢酸メチル
エステル１０μｍｏｌ、各種緩衝液０．１ｍｍｏｌ、及
びエステル加水分解酵素０．１単位を加え１．０ｍｌに
なるよう混合して、５５℃で３０分反応した。反応後等
量のクロロホルムで残存する（ＲＳ）6-アミノクロマン
-3-酢酸メチルエステルを抽出した。次に、減圧下クロ
ロホルムを留去し、残さをエタノールに溶解し、さらに
ヘキサン／エタノール＝３：２（容量比）で希釈し、高
速液体クロマトグラフィーで（３Ｓ）-6-アミノクロマ
ン-3-酢酸メチルエステル及び（３Ｒ）-6-アミノクロマ
ン-3-酢酸メチルエステルをそれぞれ定量し、6-アミノ-
クロマン-3-酢酸メチルエステルの減少量から活性を求
めた。

【００２４】ｐＨ５．０〜７．２はリン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０〜９．５はトリス塩酸緩衝液、ｐＨ１
０．０はＣＡＰＳ緩衝液（Ｇｏｏｄバッファー）を用い
た。結果は、表２に示すとおりで、至適ｐＨは８．０〜
１０．０であった。

【００２５】実施例６（ｐＨ安定性の検討） 実施例２で均一に精製されたエステル加水分解酵素を用
いて、ｐＨ安定性を検討した。

【００２６】エステル加水分解酵素０．５単位を０．１
Ｍの実施例５で用いた各種緩衝液に入れ、３０℃、３０
分間放置した後、０．１単位分を０．１ｍｍｏｌリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１０μｍｏｌラセミ体
6-アミノクロマン-3-酢酸メチルエステルを含む反応液
１ｍｌに混合して、５５℃で３０分反応した。実施例５
と同様に高速液体クロマトグラフィーで（３Ｓ）-6-ア
ミノクロマン-3-酢酸メチルエステル及び（３Ｒ）-6-ア
ミノクロマン-3-酢酸メチルエステルをそれぞれ定量
し、6-アミノ-クロマン-3-酢酸メチルエステルの減少量
から活性を求めた。ｐＨ処理をしない際のエステル加水
分解活性を１００として相対活性値を表２に示した。そ
の結果ｐＨ５．０〜１０．０でほとんど活性が変化しな
かった。

【００２７】

【表２】 ＃：ｐＨ１０での活性を１００とした時の相対活性を表す。 ＊：活性測定のための反応は、各ｐＨで３０分間保温した後ｐＨ７．２で行い、 ｐＨ８．０処理での活性を１００とした時の相対活性を表す。

【００２８】実施例７（至適温度の検討） ０．１ｍｍｏｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、
１０μｍｏｌラセミ体6-アミノクロマン-3-酢酸メチル
エステル、及び適量のエステル加水分解酵素を含む反応
液１ｍｌを、反応温度３０、４０、５０、５５、６０、
７０℃で３０分間反応を行った。実施例５と同様に高速
液体クロマトグラフィーで（３Ｓ）-6-アミノクロマン-
3-酢酸メチルエステル及び（３Ｒ）-6-アミノクロマン-
3-酢酸メチルエステルをそれぞれ定量し、6-アミノ-ク
ロマン-3-酢酸メチルエステルの減少量から活性を求め
た。その結果６０℃で最も高い活性値を示した。結果
は、６０℃の活性値を１００として相対活性値で示した
（表３）。

【００２９】実施例８（温度安定性の検討） 実施例２で均一に精製されたエステル加水分解酵素を用
いて、温度安定性を検討した。０．１ｍｍｏｌリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）、及びエステル加水分解酵
素０．１単位を加え０．９５ｍｌになるよう混合して、
３０、４０、５０、５５、６０または７０℃で３０分放
置した。この溶液に０．０５ｍｌの０．２Ｍラセミ体6-
アミノクロマン-3-酢酸メチルエステルを添加し、５５
℃で３０分間反応を行い、実施例５と同様に高速液体ク
ロマトグラフィーで（３Ｓ）-6-アミノクロマン-3-酢酸
メチルエステル及び（３Ｒ）-6-アミノクロマン-3-酢酸
メチルエステルをそれぞれ定量し、6-アミノ-クロマン-
3-酢酸メチルエステルの減少量から活性を求めた。熱処
理をしない際のエステル加水分解活性を１００として相
対活性値で表３に結果を示した。その結果６０℃までの
熱処理では９０％以上活性を保持した。

【００３０】

【表３】 ＃：６０℃での活性を１００とした時の相対活性を表す。 ＊：活性測定のための反応は各温度で３０分間保温した後５５℃で行い、３０℃ 処理での活性を１００とした時の相対活性を表す。

【００３１】実施例９（阻害剤の検討） 実施例２で均一に精製されたエステル加水分解酵素を用
いて、各種阻害剤の影響を検討した。０．１ｍｍｏｌリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、エステル加水分解
酵素０．１単位、及び各種阻害剤を加え０．９５ｍｌに
なるよう混合して、３０℃，３０分間放置した。この溶
液に０．０５ｍｌの０．２Ｍラセミ体6-アミノクロマン
-3-酢酸メチルエステルを添加し、５５℃で３０分間反
応を行い、実施例５と同様に高速液体クロマトグラフィ
ーで（３Ｓ）-6-アミノクロマン-3-酢酸メチルエステル
及び（３Ｒ）-6-アミノクロマン-3-酢酸メチルエステル
をそれぞれ定量し、6-アミノ-クロマン-3-酢酸メチルエ
ステルの減少量から活性を求めた。阻害剤を添加しない
際のエステル加水分解活性を１００として相対活性値で
結果を表４に示した。硫酸銅（１ｍＭ）で３０％、フェ
ニルメチルスルホニル・フルオリド（０．１ｍＭ）で８
５％、イソプロピルフルオロリン酸（０．５ｍＭ）で１
５％に活性が低下した。ラウリル硫酸ナトリウム（５ｍ
Ｍ）、デオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭ）では活性
が低下しなかった。

【００３２】

【表４】 １）PMSF：フェニルメチルスルホニル・フルオリド ２）DFP：イソプロピルフルオロリン酸 ３）DTT：ジチオスレイトール ４）SDS：ラウリル硫酸ナトリウム

【００３３】

【発明の効果】常温常圧の条件下で極めて微量の触媒量
でエステル加水分解反応を促進させることができ、温度
安定性・ｐＨ安定性に優れ、さらに医薬中間体として有
用なクロマン-3-酢酸類及びそのエステル光学選択的に
加水分解することができる新規なエステル加水分解酵素
を見いだすに至った。このエステル加水分解酵素を用い
ることにより、医薬中間体として有用な光学活性クロマ
ン-3-酢酸類及びそのエステルを簡便且つ効率的に製造
することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するエステル加
   水分解酵素 （１）酵素作用 エステル化合物をカルボン酸基を有する化合物とアルコ
   ール化合物に加水分解する反応およびエステル化合物と
   アルコール化合物とのエステル交換反応の触媒としての
   機能を示す。 （２）基質特異性 6-アミノクロマン-3-酢酸エステルに対しては、（Ｒ）
   体を優先的に加水分解する。直鎖状脂肪酸とP-ニトロフ
   ェノールのエステルに対しては、脂肪酸の炭素数が少な
   いものほど強く作用する。 （３）分子量 分子量は５００００±２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で
   ある。 （４）至適ｐＨ ｐＨ７〜ｐＨ１０で加水分解作用は至適である。 （５）至適温度 ５５〜６０℃が加水分解作用の至適温度である。 （６）温度安定性 ｐＨ７．２で６０℃以下の温度においては、３０分間放
   置しても加水分解活性は９０％以上保持している。 （７）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１０が安定領域である。 （８）阻害剤 ０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で、３０℃、３
   ０分間処理すると、硫酸銅（１ｍＭ）で３０％、フェニ
   ルメチルスルホニル・フルオリド（０．１ｍＭ）で８５
   ％、イソプロピルフルオロリン酸（０．５ｍＭ）で１５
   ％に活性が低下する。ラウリル硫酸ナトリウム（５ｍ
   Ｍ）、デオキシコール酸ナトリウム（５ｍＭ）では活性
   低下しない。
2. 【請求項２】 シュウドノカルディア（Pseudonocardi
   a）属に属する微生物から調製される請求項１記載のエ
   ステル加水分解酵素。
3. 【請求項３】 シュウドノカルディア（Pseudonocardi
   a）属に属する微生物がシュウドノカルディア・サーモ
   フィラ（Pseudonocardia thermophila）FERM-BP-6275で
   ある請求項２記載のエステル加水分解酵素。