JPH119291A - 迅速な作用発現を示す新規インスリン誘導体 - Google Patents
迅速な作用発現を示す新規インスリン誘導体Info
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- JPH119291A JPH119291A JP10172379A JP17237998A JPH119291A JP H119291 A JPH119291 A JP H119291A JP 10172379 A JP10172379 A JP 10172379A JP 17237998 A JP17237998 A JP 17237998A JP H119291 A JPH119291 A JP H119291A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 投与後、ヒトインスリンに比較して加速され
た作用発現を示すインスリン誘導体の提供。 【解決手段】 Ｂ鎖位置Ｂ３のアスパラギン（Asn）が
天然に存在する塩基性アミノ酸残基によって置換され、
Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28またはＢ29のアミノ酸残基の少なく
とも１種が他の天然に存在する中性または酸性アミノ酸
残基によって置換され、所望によりＡ鎖位置21のアスパ
ラギン（Asn）がAsp、Gly、Ser、ThrまたはAlaに置換さ
れ、またＢ鎖位置Ｂ１のフェニルアラニン（Phe）およ
びＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸残基は存在しなくてもよいイ
ンスリン誘導体またはその生理的に許容されうる塩。
た作用発現を示すインスリン誘導体の提供。 【解決手段】 Ｂ鎖位置Ｂ３のアスパラギン（Asn）が
天然に存在する塩基性アミノ酸残基によって置換され、
Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28またはＢ29のアミノ酸残基の少なく
とも１種が他の天然に存在する中性または酸性アミノ酸
残基によって置換され、所望によりＡ鎖位置21のアスパ
ラギン（Asn）がAsp、Gly、Ser、ThrまたはAlaに置換さ
れ、またＢ鎖位置Ｂ１のフェニルアラニン（Phe）およ
びＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸残基は存在しなくてもよいイ
ンスリン誘導体またはその生理的に許容されうる塩。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトインスリンに
比較して作用の発現が加速されたインスリン誘導体、そ
れらの製造方法、およびそれらの使用、とくに糖尿病の
処置のための医薬製剤における使用に関する。
比較して作用の発現が加速されたインスリン誘導体、そ
れらの製造方法、およびそれらの使用、とくに糖尿病の
処置のための医薬製剤における使用に関する。
【０００２】
【従来技術】世界で約１億２千万人が糖尿病に罹患して
いる。これらのうち約１千２百万人はI型糖尿病であっ
て、インスリンの投与が現在可能な唯一の治療方法であ
る。罹患患者には一般に生涯、１日数回のインスリン注
射が行われる。約１億人の患者がいるII型糖尿病は、基
本的にインスリンの欠乏を伴うものではないが、しかし
ながら、多くの症例でインスリンによる処置が最も好ま
しい治療法または唯一可能な治療と考えられる。
いる。これらのうち約１千２百万人はI型糖尿病であっ
て、インスリンの投与が現在可能な唯一の治療方法であ
る。罹患患者には一般に生涯、１日数回のインスリン注
射が行われる。約１億人の患者がいるII型糖尿病は、基
本的にインスリンの欠乏を伴うものではないが、しかし
ながら、多くの症例でインスリンによる処置が最も好ま
しい治療法または唯一可能な治療と考えられる。
【０００３】疾患が長期に及ぶと、大多数の患者がいわ
ゆる糖尿病後期合併症を併発する。これらは主として微
小血管および大血管の障害であり、それは種類および程
度に応じて腎不全、失明、四肢の喪失または心臓／循環
障害の危険の増大である。
ゆる糖尿病後期合併症を併発する。これらは主として微
小血管および大血管の障害であり、それは種類および程
度に応じて腎不全、失明、四肢の喪失または心臓／循環
障害の危険の増大である。
【０００４】原因は、インスリン療法の注意深い調整に
よっても生理的な調節に相当するような正常の血中グル
コース像は達成されないことから、一義的に、慢性的な
血中グルコースレベルの上昇にある（Ward, J.D.ら, Br
itish Medical Bulletin 45,111-126, 1989; Druy, P.
L.ら, British Medical Bulletin 45, 127-147, 1989;K
ohner, E.M.ら, British Medical Bulletin 45, 148-17
3, 1989）。
よっても生理的な調節に相当するような正常の血中グル
コース像は達成されないことから、一義的に、慢性的な
血中グルコースレベルの上昇にある（Ward, J.D.ら, Br
itish Medical Bulletin 45,111-126, 1989; Druy, P.
L.ら, British Medical Bulletin 45, 127-147, 1989;K
ohner, E.M.ら, British Medical Bulletin 45, 148-17
3, 1989）。
【０００５】健康人ではインスリンの分泌は血中のグル
コース濃度に密接に依存する。食後に起こるようなグル
コースレベルの上昇はインスリンの放出の上昇によって
迅速に相殺される。絶食状態では、血漿のインスリンレ
ベルは基底値に低下するが、これはインスリン感受性臓
器および組織へのグルコースの連続的な供給を保証する
のに十分である。治療の至適化いわゆる強化インスリン
療法は、今日では、血中グルコース濃度の変動とくに上
方へのかたよりを可能な限り低く維持することを一義的
な目的としている（Bolli, G.B., Diabetes Res.Clin.
Pract. 6, p.3-p.16, 1989; Berger, M., Diabetes Re
s.Clin. Pract. 6, p.25-p.32, 1989）。これは糖尿病
後期障害の発症および進行の有意な低下を招来する（Th
e DiabetesControl and Complications Trial Research
Group, N. Eng.J.Med., 329, 977-986, 1993）。
コース濃度に密接に依存する。食後に起こるようなグル
コースレベルの上昇はインスリンの放出の上昇によって
迅速に相殺される。絶食状態では、血漿のインスリンレ
ベルは基底値に低下するが、これはインスリン感受性臓
器および組織へのグルコースの連続的な供給を保証する
のに十分である。治療の至適化いわゆる強化インスリン
療法は、今日では、血中グルコース濃度の変動とくに上
方へのかたよりを可能な限り低く維持することを一義的
な目的としている（Bolli, G.B., Diabetes Res.Clin.
Pract. 6, p.3-p.16, 1989; Berger, M., Diabetes Re
s.Clin. Pract. 6, p.25-p.32, 1989）。これは糖尿病
後期障害の発症および進行の有意な低下を招来する（Th
e DiabetesControl and Complications Trial Research
Group, N. Eng.J.Med., 329, 977-986, 1993）。
【０００６】インスリン分泌の生理学から、皮下投与用
製剤を用いる改良された強化インスリン療法のために
は、異なる薬物動態を有する２種のインスリン製剤が必
要であることが推定できる。食後の血中グルコースの上
昇を相殺するためには、インスリンは迅速に放出され、
数時間のみ作用するものでなければならない。基底の、
とくに夜間の供給には、長期に作用し、著しい最大値を
示さず、極めて緩徐に放出される製剤を利用しなければ
ならない。
製剤を用いる改良された強化インスリン療法のために
は、異なる薬物動態を有する２種のインスリン製剤が必
要であることが推定できる。食後の血中グルコースの上
昇を相殺するためには、インスリンは迅速に放出され、
数時間のみ作用するものでなければならない。基底の、
とくに夜間の供給には、長期に作用し、著しい最大値を
示さず、極めて緩徐に放出される製剤を利用しなければ
ならない。
【０００７】しかしながらヒトおよび動物インスリンに
基づく製剤は、強化インスリン療法の要求を限定された
様式でしか満足しない。皮下投与後、迅速に作用するイ
ンスリン（非修飾インスリン）はあまりにも緩徐に血中
にそして作用部位に到達し、総作用持続が長すぎる。そ
の結果、夕食後のグルコースレベルは高すぎて、血中グ
ルコースレベルは食後数時間して著しい低下を始める
（Kang, S.ら, DiabetesCare 14, 142-148, 1991; Hom
e, P.ら, British Medical Bulletin 45, 92-110,1989;
Bolli, G.B., Diabetes Res.Clin. Pract. 6, p.3-p.1
6, 1989）。一方、利用できる基底インスリン、とくに
ＮＰＨインスリンは、作用持続が短すぎて、しかも極め
て著しい最大値を示す。
基づく製剤は、強化インスリン療法の要求を限定された
様式でしか満足しない。皮下投与後、迅速に作用するイ
ンスリン（非修飾インスリン）はあまりにも緩徐に血中
にそして作用部位に到達し、総作用持続が長すぎる。そ
の結果、夕食後のグルコースレベルは高すぎて、血中グ
ルコースレベルは食後数時間して著しい低下を始める
（Kang, S.ら, DiabetesCare 14, 142-148, 1991; Hom
e, P.ら, British Medical Bulletin 45, 92-110,1989;
Bolli, G.B., Diabetes Res.Clin. Pract. 6, p.3-p.1
6, 1989）。一方、利用できる基底インスリン、とくに
ＮＰＨインスリンは、作用持続が短すぎて、しかも極め
て著しい最大値を示す。
【０００８】製剤学的性質による作用像への影響の可能
性のほかに、現在では、特定の性質たとえば作用の発現
および持続をもっぱらそれらの構造的性質によって達成
するインスリン誘導体自体を、遺伝子操作を用いて設計
する別法がある。すなわち、適当なインスリン誘導体の
使用によって、自然条件にさらに密接に適合した血中グ
ルコースレベルの有意に優れた調整が達成できる。
性のほかに、現在では、特定の性質たとえば作用の発現
および持続をもっぱらそれらの構造的性質によって達成
するインスリン誘導体自体を、遺伝子操作を用いて設計
する別法がある。すなわち、適当なインスリン誘導体の
使用によって、自然条件にさらに密接に適合した血中グ
ルコースレベルの有意に優れた調整が達成できる。
【０００９】ＥＰ 0 214 826号、ＥＰ 0 375 437号およ
びＥＰ 0 678 522号には加速された作用発現を示すイン
スリン誘導体が記載されている。ＥＰ 0 214 826号はと
くにＢ27およびＢ28の置換に関するが、Ｂ３の置換との
組合せは記載されていない。ＥＰ 0 678 522号には位置
Ｂ29に様々なアミノ酸、好ましくはプロリンを有するイ
ンスリン誘導体が記載されているが、グルタミン酸につ
いては触れていない。ＥＰ 0 375 437号には、Ｂ28にリ
ジンまたはアルギニンを有し、さらにＢ３および／また
はＡ21が修飾されていてもよいインスリン誘導体が記載
されている。
びＥＰ 0 678 522号には加速された作用発現を示すイン
スリン誘導体が記載されている。ＥＰ 0 214 826号はと
くにＢ27およびＢ28の置換に関するが、Ｂ３の置換との
組合せは記載されていない。ＥＰ 0 678 522号には位置
Ｂ29に様々なアミノ酸、好ましくはプロリンを有するイ
ンスリン誘導体が記載されているが、グルタミン酸につ
いては触れていない。ＥＰ 0 375 437号には、Ｂ28にリ
ジンまたはアルギニンを有し、さらにＢ３および／また
はＡ21が修飾されていてもよいインスリン誘導体が記載
されている。
【００１０】ＥＰ 0 419 504号には、Ｂ３のアルギニン
および位置Ａ５、Ａ15、Ａ18またはＡ21のさらに少なく
とも１種のアミノ酸を変化させて化学的修飾に対して保
護されたインスリン誘導体が記載されている。しかしな
がら、位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29における修飾との組合
せは記載されていない。これらの化合物が修飾された薬
物動態を有し、その結果、作用のより迅速な発現を生じ
るとの指摘はない。
および位置Ａ５、Ａ15、Ａ18またはＡ21のさらに少なく
とも１種のアミノ酸を変化させて化学的修飾に対して保
護されたインスリン誘導体が記載されている。しかしな
がら、位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29における修飾との組合
せは記載されていない。これらの化合物が修飾された薬
物動態を有し、その結果、作用のより迅速な発現を生じ
るとの指摘はない。
【００１１】WO 92／00321号には、位置Ｂ１〜Ｂ６の少
なくとも１種のアミノ酸がリジンまたはアルギニンで置
換されたインスリン誘導体が記載されている。WO 92／0
0321号によれば、この種のインスリンは長期持続作用を
有すという。しかしながら、位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29
の修飾との組合せは開示されていない。
なくとも１種のアミノ酸がリジンまたはアルギニンで置
換されたインスリン誘導体が記載されている。WO 92／0
0321号によれば、この種のインスリンは長期持続作用を
有すという。しかしながら、位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29
の修飾との組合せは開示されていない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、投与
後とくに皮下投与後に、ヒトインスリンに比較して加速
された作用発現を示すインスリン誘導体を製造すること
にある。インスリン誘導体は、天然に存在するインスリ
ン、すなわち、ヒトインスリン（配列表の配列番号：１
＝ヒトインスリンＡ鎖および配列番号：２＝ヒトインス
リンＢ鎖参照）または動物インスリンの誘導体であり、
少なくとも１種の天然に存在するアミノ酸残基の置換お
よび／または少なくとも１種のアミノ酸残基および／ま
たは有機残基の付加により、相当する他の点では同一の
天然に存在するインスリンとは異なる。本発明の目的は
さらに、上述の性質を有するインスリン誘導体の製造方
法、相当する中間体およびそれらの前駆体を提供するこ
とにある。
後とくに皮下投与後に、ヒトインスリンに比較して加速
された作用発現を示すインスリン誘導体を製造すること
にある。インスリン誘導体は、天然に存在するインスリ
ン、すなわち、ヒトインスリン（配列表の配列番号：１
＝ヒトインスリンＡ鎖および配列番号：２＝ヒトインス
リンＢ鎖参照）または動物インスリンの誘導体であり、
少なくとも１種の天然に存在するアミノ酸残基の置換お
よび／または少なくとも１種のアミノ酸残基および／ま
たは有機残基の付加により、相当する他の点では同一の
天然に存在するインスリンとは異なる。本発明の目的は
さらに、上述の性質を有するインスリン誘導体の製造方
法、相当する中間体およびそれらの前駆体を提供するこ
とにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、Ｂ鎖の
位置Ｂ３におけるアスパラギン（Asn）が天然に存在す
る塩基性アミノ酸残基で置換され、Ｂ鎖の位置Ｂ27、Ｂ
28またはＢ29はのアミノ酸残基の少なくとも１種が他の
天然に存在するアミノ酸残基で置換され、所望によりＡ
鎖の位置２１におけるアスパラギン（Asn）は、Asp、Gl
y、Ser、ThrまたはAlaで置換され、Ｂ鎖の位置Ｂ１にお
けるフェニルアラニン（Phe）およびＢ鎖位置Ｂ30にお
けるアミノ酸残基は存在しなくてもよいインスリン誘導
体またはその生理的に耐容性のある塩によって達成され
る。
位置Ｂ３におけるアスパラギン（Asn）が天然に存在す
る塩基性アミノ酸残基で置換され、Ｂ鎖の位置Ｂ27、Ｂ
28またはＢ29はのアミノ酸残基の少なくとも１種が他の
天然に存在するアミノ酸残基で置換され、所望によりＡ
鎖の位置２１におけるアスパラギン（Asn）は、Asp、Gl
y、Ser、ThrまたはAlaで置換され、Ｂ鎖の位置Ｂ１にお
けるフェニルアラニン（Phe）およびＢ鎖位置Ｂ30にお
けるアミノ酸残基は存在しなくてもよいインスリン誘導
体またはその生理的に耐容性のある塩によって達成され
る。
【００１４】インスリン誘導体またはその生理的に許容
されうる塩は好ましくは、式Ｉ
されうる塩は好ましくは、式Ｉ
【化２】 〔式中、（Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリン（配列番号：
１参照）または動物インスリンのＡ鎖位置Ａ１〜Ａ５の
アミノ酸残基であり、（Ａ12〜Ａ19）はヒトインスリン
（配列番号：１参照）または動物インスリンのＡ鎖位置
Ａ12〜Ａ19のアミノ酸残基であり、（Ｂ８〜Ｂ18）はヒ
トインスリン（配列番号：２参照）または動物インスリ
ンのＢ鎖位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、（Ｂ20
〜Ｂ26）はヒトインスリン（配列番号：２参照）または
動物インスリンのＢ鎖位置Ｂ20〜Ｂ26のアミノ酸残基で
あり、Ａ８、Ａ９、Ａ10は、ヒトインスリン（配列番
号：１参照）または動物インスリンのＡ鎖位置Ａ８、Ａ
９およびＡ10のアミノ酸残基であり、Ａ21はAsn、Asp、
Gly、Ser、ThrまたはAlaであり、Ｂ30は、−OHまたはヒ
トインスリン（配列番号：２参照）もしくは動物インス
リンのＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸残基であり、Ｂ１はフェ
ニルアラニン残基（Phe）または水素原子であり、Ｂ３
は天然に存在する塩基性アミノ酸残基であり、Ｂ27、Ｂ
28およびＢ29は、ヒトインスリン（配列番号：２参照）
もしくは動物インスリンのＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ
29のアミノ酸残基であるか、またはそれぞれ他の天然に
存在するアミノ酸残基であり、この場合、Ｂ鎖位置Ｂ2
7、Ｂ28およびＢ29のアミノ酸残基の少なくとも１種は
他の天然に存在するアミノ酸残基で置換されている〕に
よって表される。
１参照）または動物インスリンのＡ鎖位置Ａ１〜Ａ５の
アミノ酸残基であり、（Ａ12〜Ａ19）はヒトインスリン
（配列番号：１参照）または動物インスリンのＡ鎖位置
Ａ12〜Ａ19のアミノ酸残基であり、（Ｂ８〜Ｂ18）はヒ
トインスリン（配列番号：２参照）または動物インスリ
ンのＢ鎖位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、（Ｂ20
〜Ｂ26）はヒトインスリン（配列番号：２参照）または
動物インスリンのＢ鎖位置Ｂ20〜Ｂ26のアミノ酸残基で
あり、Ａ８、Ａ９、Ａ10は、ヒトインスリン（配列番
号：１参照）または動物インスリンのＡ鎖位置Ａ８、Ａ
９およびＡ10のアミノ酸残基であり、Ａ21はAsn、Asp、
Gly、Ser、ThrまたはAlaであり、Ｂ30は、−OHまたはヒ
トインスリン（配列番号：２参照）もしくは動物インス
リンのＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸残基であり、Ｂ１はフェ
ニルアラニン残基（Phe）または水素原子であり、Ｂ３
は天然に存在する塩基性アミノ酸残基であり、Ｂ27、Ｂ
28およびＢ29は、ヒトインスリン（配列番号：２参照）
もしくは動物インスリンのＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ
29のアミノ酸残基であるか、またはそれぞれ他の天然に
存在するアミノ酸残基であり、この場合、Ｂ鎖位置Ｂ2
7、Ｂ28およびＢ29のアミノ酸残基の少なくとも１種は
他の天然に存在するアミノ酸残基で置換されている〕に
よって表される。
【００１５】
【発明の実施の形態】遺伝子によってコード可能な２０
種の天然に存在するアミノ酸中、本明細書においてはア
ミノ酸のグリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン
（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、セ
リン（Ser）、スレオニン（Thr）、システイン（Cy
s）、メチオニン（Met）、アスパラギン（Asp）、グル
タミン（Glu）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン
（Tyr）、トリプトファン（Try）およびプロリン（Pr
o）は中性アミノ酸、アミノ酸のアルギニン（Arg）、リ
ジン（Lys）およびヒスチジン（His）は塩基性アミノ
酸、アミノ酸のアスパラギン酸（Asn）およびグルタミ
ン酸（Gln）は酸性アミノ酸と呼ばれる。
種の天然に存在するアミノ酸中、本明細書においてはア
ミノ酸のグリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン
（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、セ
リン（Ser）、スレオニン（Thr）、システイン（Cy
s）、メチオニン（Met）、アスパラギン（Asp）、グル
タミン（Glu）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン
（Tyr）、トリプトファン（Try）およびプロリン（Pr
o）は中性アミノ酸、アミノ酸のアルギニン（Arg）、リ
ジン（Lys）およびヒスチジン（His）は塩基性アミノ
酸、アミノ酸のアスパラギン酸（Asn）およびグルタミ
ン酸（Gln）は酸性アミノ酸と呼ばれる。
【００１６】本発明のインスリン誘導体またはその生理
的に許容されうる塩は好ましくは、ウシインスリン、ブ
タインスリン、またはヒトインスリン、すなわち式Ｉに
おいて、とくにＡ８はアラニン（Ala）であり、Ａ９は
セリン（Ser）であり、Ａ10はバリン（Val）であり、Ｂ
30はアラニン（Ala）である（ウシインスリンのアミノ
酸残基Ａ８〜Ａ10およびＢ30）か、Ａ８はスレオニン
（Thr）であり、Ａ９はセリン（Ser）であり、Ａ10はイ
ソロイシン（Ile）であり（ヒトまたはブタインスリン
のアミノ酸残基Ａ８〜Ａ10）、Ｂ30はアラニン（Ala）
(ブタインスリンのアミノ酸残基Ｂ30）であるかもしく
はスレオニン（Thr）(ヒトインスリンのアミノ酸残基Ｂ
30、配列番号：２参照）であるインスリン誘導体または
その生理的に許容されうる塩である。
的に許容されうる塩は好ましくは、ウシインスリン、ブ
タインスリン、またはヒトインスリン、すなわち式Ｉに
おいて、とくにＡ８はアラニン（Ala）であり、Ａ９は
セリン（Ser）であり、Ａ10はバリン（Val）であり、Ｂ
30はアラニン（Ala）である（ウシインスリンのアミノ
酸残基Ａ８〜Ａ10およびＢ30）か、Ａ８はスレオニン
（Thr）であり、Ａ９はセリン（Ser）であり、Ａ10はイ
ソロイシン（Ile）であり（ヒトまたはブタインスリン
のアミノ酸残基Ａ８〜Ａ10）、Ｂ30はアラニン（Ala）
(ブタインスリンのアミノ酸残基Ｂ30）であるかもしく
はスレオニン（Thr）(ヒトインスリンのアミノ酸残基Ｂ
30、配列番号：２参照）であるインスリン誘導体または
その生理的に許容されうる塩である。
【００１７】式Ｉにおいてアミノ酸残基Ａ８〜Ａ10およ
びＢ30がヒトインスリンのアミノ酸残基であるインスリ
ン誘導体またはその生理的に許容されうる塩は、とくに
好ましくは、さらに、（Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリン
（配列番号：１参照）のＡ鎖位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸
残基であり、（Ａ12〜Ａ19）はヒトインスリン（配列番
号：１参照）のＡ鎖位置Ａ12〜Ａ19のアミノ酸残基であ
り、（Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリン（配列番号：２参
照）のＢ鎖位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、（Ｂ
20〜Ｂ26）はヒトインスリン（配列番号：２参照）のＢ
鎖位置Ｂ20〜Ｂ26のアミノ酸残基であるインスリン誘導
体またはその生理的に許容されうる塩である。
びＢ30がヒトインスリンのアミノ酸残基であるインスリ
ン誘導体またはその生理的に許容されうる塩は、とくに
好ましくは、さらに、（Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリン
（配列番号：１参照）のＡ鎖位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸
残基であり、（Ａ12〜Ａ19）はヒトインスリン（配列番
号：１参照）のＡ鎖位置Ａ12〜Ａ19のアミノ酸残基であ
り、（Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリン（配列番号：２参
照）のＢ鎖位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、（Ｂ
20〜Ｂ26）はヒトインスリン（配列番号：２参照）のＢ
鎖位置Ｂ20〜Ｂ26のアミノ酸残基であるインスリン誘導
体またはその生理的に許容されうる塩である。
【００１８】本発明のさらに好ましい実施態様は、式Ｉ
においてＢ鎖の位置Ｂ１におけるアミノ酸残基がフェニ
ルアラニン（Phe）であるインスリン誘導体またはその
生理的に耐容性のある塩、または式IにおいてＢ鎖の位
置Ｂ３におけるアミノ酸残基がヒスチジン（His）、リ
ジン（Lys）もしくはアルギニン（Arg）であるインスリ
ン誘導体またはその生理的に許容されうる塩である。
においてＢ鎖の位置Ｂ１におけるアミノ酸残基がフェニ
ルアラニン（Phe）であるインスリン誘導体またはその
生理的に耐容性のある塩、または式IにおいてＢ鎖の位
置Ｂ３におけるアミノ酸残基がヒスチジン（His）、リ
ジン（Lys）もしくはアルギニン（Arg）であるインスリ
ン誘導体またはその生理的に許容されうる塩である。
【００１９】本発明のさらに好ましい実施態様は、式Ｉ
においてＢ鎖の位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけるアミ
ノ酸残基の少なくとも１種が中性アミノ酸または酸性ア
ミノ酸からなる群より選択される天然に存在するアミノ
酸残基によって置換されているインスリン誘導体または
その生理的に許容されうる塩、または式ＩにおいてＢ鎖
位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけるアミノ酸残基の少な
くとも１種は、イソロイシン（Ile）、アスパラギン酸
（Asp）およびグルタミン酸（Glu）からなる群より選択
される天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは
Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけるアミノ酸残基の
少なくとも１種は中性アミノ酸からなる群より選択され
る天然に存在するアミノ酸残基によって置換されてい
て、とくに好ましくはＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29に
おけるアミノ酸残基の少なくとも１種はイソロイシン
（Ile）であるインスリン誘導体またはその生理的に許
容されうる塩、または式ＩにおいてＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28
およびＢ29におけるアミノ酸残基の少なくとも１種は酸
性アミノ酸からなる群より選択される天然に存在するア
ミノ酸残基であり、とくに好ましくはＢ鎖位置Ｂ27もし
くはＢ28におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸（As
p）残基であるかまたはＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29
におけるアミノ酸残基の少なくとも１種はグルタミン酸
（Glu）であるインスリン誘導体またはその生理的に許
容されうる塩である。
においてＢ鎖の位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけるアミ
ノ酸残基の少なくとも１種が中性アミノ酸または酸性ア
ミノ酸からなる群より選択される天然に存在するアミノ
酸残基によって置換されているインスリン誘導体または
その生理的に許容されうる塩、または式ＩにおいてＢ鎖
位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけるアミノ酸残基の少な
くとも１種は、イソロイシン（Ile）、アスパラギン酸
（Asp）およびグルタミン酸（Glu）からなる群より選択
される天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは
Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけるアミノ酸残基の
少なくとも１種は中性アミノ酸からなる群より選択され
る天然に存在するアミノ酸残基によって置換されてい
て、とくに好ましくはＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29に
おけるアミノ酸残基の少なくとも１種はイソロイシン
（Ile）であるインスリン誘導体またはその生理的に許
容されうる塩、または式ＩにおいてＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28
およびＢ29におけるアミノ酸残基の少なくとも１種は酸
性アミノ酸からなる群より選択される天然に存在するア
ミノ酸残基であり、とくに好ましくはＢ鎖位置Ｂ27もし
くはＢ28におけるアミノ酸残基はアスパラギン酸（As
p）残基であるかまたはＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29
におけるアミノ酸残基の少なくとも１種はグルタミン酸
（Glu）であるインスリン誘導体またはその生理的に許
容されうる塩である。
【００２０】本発明のさらに好ましい実施態様は、式Ｉ
においてＢ鎖位置Ｂ29のアミノ酸残基はアスパラギン酸
（Asp）残基であるインスリン誘導体またはその生理的
に許容されうる塩である。
においてＢ鎖位置Ｂ29のアミノ酸残基はアスパラギン酸
（Asp）残基であるインスリン誘導体またはその生理的
に許容されうる塩である。
【００２１】さらに好ましい実施態様は、式Ｉにおいて
Ｂ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基はグルタミン酸（Glu）残
基であるインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、または式ＩにおいてＢ鎖位置Ｂ28のアミノ酸残
基はグルタミン酸（Glu）残基であるインスリン誘導体
またはその生理的に許容されうる塩、または式Ｉにおい
てＢ鎖位置Ｂ29のアミノ酸残基はグルタミン酸（Glu）
残基であるインスリン誘導体またはその生理的に許容さ
れうる塩である。
Ｂ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基はグルタミン酸（Glu）残
基であるインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、または式ＩにおいてＢ鎖位置Ｂ28のアミノ酸残
基はグルタミン酸（Glu）残基であるインスリン誘導体
またはその生理的に許容されうる塩、または式Ｉにおい
てＢ鎖位置Ｂ29のアミノ酸残基はグルタミン酸（Glu）
残基であるインスリン誘導体またはその生理的に許容さ
れうる塩である。
【００２２】とくに極めて好ましいインスリン誘導体ま
たはその生理的に許容されうる塩はＢ鎖がとくに配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr（配列番号：３） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−ヒト
インスリン、またはＢ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基がとく
にイソロイシン（Ile）であるインスリン誘導体または
その生理的に許容されうる塩、好ましくはＢ鎖がとくに
配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr（配列番号：５） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−ヒト
インスリン、または式ＩにおいてＢ鎖位置Ｂ28のアミノ
酸残基がイソロイシン（Ile）であるインスリン誘導体
またはその生理的に許容されうる塩、好ましくはＢ鎖が
特に配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr（配列番号：４） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28)−ヒト
インスリンである。
たはその生理的に許容されうる塩はＢ鎖がとくに配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr（配列番号：３） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−ヒト
インスリン、またはＢ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基がとく
にイソロイシン（Ile）であるインスリン誘導体または
その生理的に許容されうる塩、好ましくはＢ鎖がとくに
配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr（配列番号：５） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−ヒト
インスリン、または式ＩにおいてＢ鎖位置Ｂ28のアミノ
酸残基がイソロイシン（Ile）であるインスリン誘導体
またはその生理的に許容されうる塩、好ましくはＢ鎖が
特に配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr（配列番号：４） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28)−ヒト
インスリンである。
【００２３】とくに好ましくは、式ＩにおいてＢ鎖位置
Ｂ28のアミノ酸残基がイソロイシン(Ile）残基であり、
位置Ａ21におけるアミノ酸残基がアスパラギン（Asp）
残基であるインスリン誘導体またはその生理的に許容さ
れうる塩であって、とくにＡ鎖が配列 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp（配列番号：９） を有し、Ｂ鎖が配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr（配列番号：10） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28),Ａｓｐ
(Ａ21)−ヒトインスリンが好ましい。式Ｉのインスリン
誘導体は、遺伝子操作によって製造することができる。
Ｂ28のアミノ酸残基がイソロイシン(Ile）残基であり、
位置Ａ21におけるアミノ酸残基がアスパラギン（Asp）
残基であるインスリン誘導体またはその生理的に許容さ
れうる塩であって、とくにＡ鎖が配列 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp（配列番号：９） を有し、Ｂ鎖が配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr（配列番号：10） を有するインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩、たとえば、Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28),Ａｓｐ
(Ａ21)−ヒトインスリンが好ましい。式Ｉのインスリン
誘導体は、遺伝子操作によって製造することができる。
【００２４】最初に掲げた目的はしたがって、さらに、
Ａ鎖位置Ａ１のアミノ酸残基がＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸
残基に式II −Ｒ1 n−Arg− II （式中、Ｒ1 nはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖
であり、ｎは０〜34の整数である）を介して連結し、Ｂ
鎖は位置Ｂ１において式III Met−Ｒ2 m−(Arg)p− III （式中、Ｒ2 mはｍ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖
であり、ｍは０〜40、好ましくは０〜９の整数であり、
ｐは０、１または２であり、ｐ＝０の場合にはペプチド
鎖Ｒ2 mはＬｙｓで終わる）のペプチド鎖によって延長さ
れているインスリン誘導体の前駆体をコードするＤＮＡ
配列を含有する複製可能な発現ビヒクルの構築、宿主細
胞における発現ならびにその前駆体から化学的および／
または酵素的方法を用いるインスリン誘導体の遊離から
なる式Ｉのインスリン誘導体またはその生理的に耐容性
のある塩の製造方法によって達成される。
Ａ鎖位置Ａ１のアミノ酸残基がＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸
残基に式II −Ｒ1 n−Arg− II （式中、Ｒ1 nはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖
であり、ｎは０〜34の整数である）を介して連結し、Ｂ
鎖は位置Ｂ１において式III Met−Ｒ2 m−(Arg)p− III （式中、Ｒ2 mはｍ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖
であり、ｍは０〜40、好ましくは０〜９の整数であり、
ｐは０、１または２であり、ｐ＝０の場合にはペプチド
鎖Ｒ2 mはＬｙｓで終わる）のペプチド鎖によって延長さ
れているインスリン誘導体の前駆体をコードするＤＮＡ
配列を含有する複製可能な発現ビヒクルの構築、宿主細
胞における発現ならびにその前駆体から化学的および／
または酵素的方法を用いるインスリン誘導体の遊離から
なる式Ｉのインスリン誘導体またはその生理的に耐容性
のある塩の製造方法によって達成される。
【００２５】この方法は好ましくは、宿主細胞が細菌、
とくに好ましくは細菌が大腸菌である方法である。この
方法は好ましくは宿主細胞が酵母とくに好ましくは酵母
が Saccharomycescerevisiae である方法である。
とくに好ましくは細菌が大腸菌である方法である。この
方法は好ましくは宿主細胞が酵母とくに好ましくは酵母
が Saccharomycescerevisiae である方法である。
【００２６】配列番号：９（Ａ鎖）および配列番号：10
（Ｂ鎖）のアミノ酸配列を有するインスリン誘導体の製
造では、このインスリン誘導体の前駆体は好ましくは配
列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp（配列番号：11） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28),Ａｓｐ(Ａ21)−プ
レプロインスリンである。
（Ｂ鎖）のアミノ酸配列を有するインスリン誘導体の製
造では、このインスリン誘導体の前駆体は好ましくは配
列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp（配列番号：11） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28),Ａｓｐ(Ａ21)−プ
レプロインスリンである。
【００２７】配列番号：３のアミノ酸配列を有するイン
スリン誘導体の製造では、このインスリン誘導体の前駆
体は好ましくは配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：６） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−プレプロインス
リンである。
スリン誘導体の製造では、このインスリン誘導体の前駆
体は好ましくは配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：６） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−プレプロインス
リンである。
【００２８】配列番号：５のアミノ酸配列を有するイン
スリン誘導体の製造では、このインスリン誘導体の前駆
体は好ましくは配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：８） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−プレプロインス
リンである。
スリン誘導体の製造では、このインスリン誘導体の前駆
体は好ましくは配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：８） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−プレプロインス
リンである。
【００２９】配列番号：４のアミノ酸配列を有するイン
スリン誘導体の製造では、このインスリン誘導体の前駆
体は好ましくは配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：７） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28)−プレプロインス
リンである。
スリン誘導体の製造では、このインスリン誘導体の前駆
体は好ましくは配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：７） を有するＬｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28)−プレプロインス
リンである。
【００３０】本発明はまた、したがって、好ましいイン
スリン誘導体の上記前駆体すなわち配列番号：１１、配
列番号：６、配列番号：７および配列番号：８を有する
ペプチド、上記前駆体をコードするＤＮＡ配列、これら
のＤＮＡ配列からなる発現ビヒクルならびにこれらの発
現ビヒクルを用いてトランスフォームされた宿主細胞に
関する。
スリン誘導体の上記前駆体すなわち配列番号：１１、配
列番号：６、配列番号：７および配列番号：８を有する
ペプチド、上記前駆体をコードするＤＮＡ配列、これら
のＤＮＡ配列からなる発現ビヒクルならびにこれらの発
現ビヒクルを用いてトランスフォームされた宿主細胞に
関する。
【００３１】式Ｉのインスリン誘導体は主として、標準
方法による部位特異的突然変異誘発を用い遺伝子操作に
よって調製される。この実施には、式Ｉの所望のインス
リン誘導体をコードする遺伝子構造を構築し、宿主細胞
−好ましくは細菌たとえば大腸菌または酵母とくに Sac
charomycescerevisiae において発現させ、ついで遺伝
子構造体が融合タンパク質をコードしている場合には、
融合タンパク質から式Iのインスリン誘導体を遊離させ
る。類似の方法はたとえば、EP-A-0 211 299号、EP-A-0
227 938号、EP-A-0 229 998号、EP-A-0 286 956号およ
びＤＥ特許出願Ｐ38 21 159号に記載されている。
方法による部位特異的突然変異誘発を用い遺伝子操作に
よって調製される。この実施には、式Ｉの所望のインス
リン誘導体をコードする遺伝子構造を構築し、宿主細胞
−好ましくは細菌たとえば大腸菌または酵母とくに Sac
charomycescerevisiae において発現させ、ついで遺伝
子構造体が融合タンパク質をコードしている場合には、
融合タンパク質から式Iのインスリン誘導体を遊離させ
る。類似の方法はたとえば、EP-A-0 211 299号、EP-A-0
227 938号、EP-A-0 229 998号、EP-A-0 286 956号およ
びＤＥ特許出願Ｐ38 21 159号に記載されている。
【００３２】融合タンパク質成分の除去はシアノーゲン
ハライドを用い化学的細胞破壊によって実施できる（EP
-A-0 180 920号参照）。ＵＳ5,358,857号による融合タ
ンパク質成分（プレ配列）を有するプレプロインスリン
前駆体を用いる製造では、融合タンパク質成分の除去は
Ｃペプチドの除去とともに遅い段階に行われる。
ハライドを用い化学的細胞破壊によって実施できる（EP
-A-0 180 920号参照）。ＵＳ5,358,857号による融合タ
ンパク質成分（プレ配列）を有するプレプロインスリン
前駆体を用いる製造では、融合タンパク質成分の除去は
Ｃペプチドの除去とともに遅い段階に行われる。
【００３３】インスリンはついで、たとえば R.C.Marsh
all & A.S.Inglis, in "PracticalProtein Chemistry
− A Handbook", Publisher A.Darbre, 1986, 49-53頁
に記載の方法に従って酸化的スルフィトリシスに付し、
ついでチオールの存在下に、たとえば G.H.Dixon & A.
C.Wardlow, Nature, 721-724, 1960 によって報告され
た方法に従ってタンパク質を復元して正しいジスルフィ
ド橋を形成させる。しかしながら、インスリン前駆体は
直接フォールディングすることもできる（EP-A-0600 37
2号；EP-A-0 668 292号）。
all & A.S.Inglis, in "PracticalProtein Chemistry
− A Handbook", Publisher A.Darbre, 1986, 49-53頁
に記載の方法に従って酸化的スルフィトリシスに付し、
ついでチオールの存在下に、たとえば G.H.Dixon & A.
C.Wardlow, Nature, 721-724, 1960 によって報告され
た方法に従ってタンパク質を復元して正しいジスルフィ
ド橋を形成させる。しかしながら、インスリン前駆体は
直接フォールディングすることもできる（EP-A-0600 37
2号；EP-A-0 668 292号）。
【００３４】Ｃペプチドは、たとえば Kemmlerら, J.B.
C., 6786-6791, 1971 の方法に従ってトリプシン切断に
より除去することが可能で、式Ｉのインスリン誘導体は
既知の方法、たとえばクロマトグラフィー（EP-A-0 305
760号）および結晶化によって精製される。
C., 6786-6791, 1971 の方法に従ってトリプシン切断に
より除去することが可能で、式Ｉのインスリン誘導体は
既知の方法、たとえばクロマトグラフィー（EP-A-0 305
760号）および結晶化によって精製される。
【００３５】式IIにおけるｎが０の場合には、トリプシ
ン切断はＡおよびＢ鎖の間のペプチド結合を切り取る働
きもする。この方法では、Ｂ鎖のＣ末端はアルギニンま
たは２個のアルギニン残基によって終わる。これらは、
カルボキシペプチダーゼＢを用いて酵素的に除去するこ
とができる。
ン切断はＡおよびＢ鎖の間のペプチド結合を切り取る働
きもする。この方法では、Ｂ鎖のＣ末端はアルギニンま
たは２個のアルギニン残基によって終わる。これらは、
カルボキシペプチダーゼＢを用いて酵素的に除去するこ
とができる。
【００３６】本発明によるインスリン誘導体は完全な生
物学的活性を有する。これはウサギへの静脈内注射によ
って示され、それにより血中グルコースは低下する（実
施例５および６）。
物学的活性を有する。これはウサギへの静脈内注射によ
って示され、それにより血中グルコースは低下する（実
施例５および６）。
【００３７】皮下投与後のより迅速な作用の発現は、絶
食させたイヌにおいて正常血糖クランプ法を用いて示し
た（実施例７)。0.3 IU/kgを投与した。対照製剤はヒト
インスリンとした。クランプ法では、血中グルコース値
をインスリン注射後短時間間隔で測定し、正確に低下を
補償するグルコース量を注入する。これは、インスリン
の投与後に血中グルコースの著しい低下を伴う場合のよ
うなカウンター調節が動物に起こらないという利点があ
る。注入されるグルコース量およびその時間経過がイン
スリンの作用を特徴づける。Lys(B3),Glu(B29)−（配列
番号３）およびLys(B3),Ile(B28)−（配列番号４）イン
スリンはヒトインスリンより明らかに迅速な作用発現を
示す。最大の作用（グルコース注入速度）はヒトインス
リンでは100分後に達成されたが、Lys(B3),Glu(B29)−
インスリン（配列番号３）では８０分後、Lys(B3),Ile
(B28)−インスリン（配列番号４）では６０分後にすで
に最大作用が達成される。したがって、これらの類縁体
は食事の直前に注射すれば血中グルコースの食後の上昇
をヒトインスリンよりも良好に相殺できるものと考えら
れる。
食させたイヌにおいて正常血糖クランプ法を用いて示し
た（実施例７)。0.3 IU/kgを投与した。対照製剤はヒト
インスリンとした。クランプ法では、血中グルコース値
をインスリン注射後短時間間隔で測定し、正確に低下を
補償するグルコース量を注入する。これは、インスリン
の投与後に血中グルコースの著しい低下を伴う場合のよ
うなカウンター調節が動物に起こらないという利点があ
る。注入されるグルコース量およびその時間経過がイン
スリンの作用を特徴づける。Lys(B3),Glu(B29)−（配列
番号３）およびLys(B3),Ile(B28)−（配列番号４）イン
スリンはヒトインスリンより明らかに迅速な作用発現を
示す。最大の作用（グルコース注入速度）はヒトインス
リンでは100分後に達成されたが、Lys(B3),Glu(B29)−
インスリン（配列番号３）では８０分後、Lys(B3),Ile
(B28)−インスリン（配列番号４）では６０分後にすで
に最大作用が達成される。したがって、これらの類縁体
は食事の直前に注射すれば血中グルコースの食後の上昇
をヒトインスリンよりも良好に相殺できるものと考えら
れる。
【００３８】記載されたインスリン誘導体は、したがっ
て、Ｉ型およびII型糖尿病の治療の両者に、基底のイン
スリンと組合せて使用するのに適している。したがっ
て、本発明はまた、式Ｉのインスリン誘導体および／ま
たはその生理的に耐容性のある塩の、迅速な作用発現を
示すインスリン活性を有する医薬製剤の製造のための使
用に関する。
て、Ｉ型およびII型糖尿病の治療の両者に、基底のイン
スリンと組合せて使用するのに適している。したがっ
て、本発明はまた、式Ｉのインスリン誘導体および／ま
たはその生理的に耐容性のある塩の、迅速な作用発現を
示すインスリン活性を有する医薬製剤の製造のための使
用に関する。
【００３９】生理的に許容されインスリン誘導体と適合
性の適当な担体メジウムは、たとえばグリセロール、食
塩、グルコースを用いて慣用方法により血液と等張性に
し、さらに１種または２種以上の防腐剤たとえばフェノ
ール、ｍ−クレゾールまたはｐ-ヒドロキシ安息香酸エ
ステルを含有する滅菌水溶液である。担体メジウムはさ
らに、緩衝物質たとえば酢酸ナトリウム、クエン酸ナト
リウム、リン酸ナトリウムを含有させることもできる。
ｐＨの調整には希酸（通常ＨＣｌ）またはアルカリ（通
常ＮａＯＨ）が使用される。製剤にはさらに亜鉛イオン
を含有させることもできる。
性の適当な担体メジウムは、たとえばグリセロール、食
塩、グルコースを用いて慣用方法により血液と等張性に
し、さらに１種または２種以上の防腐剤たとえばフェノ
ール、ｍ−クレゾールまたはｐ-ヒドロキシ安息香酸エ
ステルを含有する滅菌水溶液である。担体メジウムはさ
らに、緩衝物質たとえば酢酸ナトリウム、クエン酸ナト
リウム、リン酸ナトリウムを含有させることもできる。
ｐＨの調整には希酸（通常ＨＣｌ）またはアルカリ（通
常ＮａＯＨ）が使用される。製剤にはさらに亜鉛イオン
を含有させることもできる。
【００４０】インスリン誘導体は医薬製剤中に、それら
の生理的に耐容性のある塩の型でも使用できる。任意の
所望の比率の１種もしくは２種以上の式Ｉのインスリン
誘導体または１種の式Ｉのインスリン誘導体をそれぞれ
溶解、無定形および／または結晶型で互いに独立にこれ
らのインスリン誘導体の他の混合物中に添加することが
できる。
の生理的に耐容性のある塩の型でも使用できる。任意の
所望の比率の１種もしくは２種以上の式Ｉのインスリン
誘導体または１種の式Ｉのインスリン誘導体をそれぞれ
溶解、無定形および／または結晶型で互いに独立にこれ
らのインスリン誘導体の他の混合物中に添加することが
できる。
【００４１】本発明の製剤には、様々な材料との接触時
に熱機械的ストレス下における蛋白質の沈殿を防止する
適当な安定剤の適当量を添加することが有利な場合があ
る。このような安定剤は、たとえば、EP-A-18609号、DE
-A-32 40 177号または WO 83／00288号に記載されてい
る。
に熱機械的ストレス下における蛋白質の沈殿を防止する
適当な安定剤の適当量を添加することが有利な場合があ
る。このような安定剤は、たとえば、EP-A-18609号、DE
-A-32 40 177号または WO 83／00288号に記載されてい
る。
【００４２】本発明はさらに、少なくとも１種の式Ｉの
インスリン誘導体および／またはその生理的に許容され
うる塩の好ましくは溶解、無定形および／または結晶型
からなる医薬製剤に関する。
インスリン誘導体および／またはその生理的に許容され
うる塩の好ましくは溶解、無定形および／または結晶型
からなる医薬製剤に関する。
【００４３】本発明のインスリン誘導体は、迅速な作用
発現を示す。実際のインスリン療法においては、迅速作
用型のインスリンをデポ補助剤を含有するプレパレーシ
ョン（たとえばＮＰＨインスリン）と混合することがあ
る種の環境下に慣用される。組成に応じて、混合物中の
個々の成分が安定で、相互に影響されないことを条件
に、製剤は個々の成分の作用像が重ね合わせに相当する
作用像を生じる。インスリン誘導体をヒトＮＰＨインス
リンと混合した場合には、しかしながら、とくに長期に
保存すると溶解された誘導体と結晶ＮＰＨインスリンの
間に交換が起こることが期待される。この結果として、
デポインスリンの薬物動態および溶解型の即時作用性イ
ンスリンの薬物動態の両者は予測できない様式で変化す
る。これを回避するためには、即時作用性の誘導体をデ
ポ補助剤−たとえばＮＰＨインスリンを用いて製造する
のが賢明である。インスリン誘導体のこのデポ型は、つ
いで溶解された即時作用型と所望のように混合すると、
そのまたは他方の型の組成が交換により貯蔵の過程で変
化することはない。
発現を示す。実際のインスリン療法においては、迅速作
用型のインスリンをデポ補助剤を含有するプレパレーシ
ョン（たとえばＮＰＨインスリン）と混合することがあ
る種の環境下に慣用される。組成に応じて、混合物中の
個々の成分が安定で、相互に影響されないことを条件
に、製剤は個々の成分の作用像が重ね合わせに相当する
作用像を生じる。インスリン誘導体をヒトＮＰＨインス
リンと混合した場合には、しかしながら、とくに長期に
保存すると溶解された誘導体と結晶ＮＰＨインスリンの
間に交換が起こることが期待される。この結果として、
デポインスリンの薬物動態および溶解型の即時作用性イ
ンスリンの薬物動態の両者は予測できない様式で変化す
る。これを回避するためには、即時作用性の誘導体をデ
ポ補助剤−たとえばＮＰＨインスリンを用いて製造する
のが賢明である。インスリン誘導体のこのデポ型は、つ
いで溶解された即時作用型と所望のように混合すると、
そのまたは他方の型の組成が交換により貯蔵の過程で変
化することはない。
【００４４】本発明は本質的には迅速作用性のインスリ
ン誘導体に関するものであるが、しかすながら、この種
類の誘導体を適宜、混和性の目的でデポ型として調製す
る可能性もあり、この場合、デポ補助剤は好ましくはプ
ロタミン硫酸塩であり、インスリン誘導体および／また
はその生理的に耐容性のある塩はプロタミン硫酸塩との
結晶型で存在させる。本発明はさらに、溶解型の上記医
薬製剤からなる注射用溶液に関する。
ン誘導体に関するものであるが、しかすながら、この種
類の誘導体を適宜、混和性の目的でデポ型として調製す
る可能性もあり、この場合、デポ補助剤は好ましくはプ
ロタミン硫酸塩であり、インスリン誘導体および／また
はその生理的に耐容性のある塩はプロタミン硫酸塩との
結晶型で存在させる。本発明はさらに、溶解型の上記医
薬製剤からなる注射用溶液に関する。
【００４５】
【実施例】 実施例１：実施例２〜４に相当する本発明関連プラスミ
ドの出発原料としてのＬｙｓ(Ｂ３)−プロインスリンの
構築 ＵＳ5,358,857号にはベクター pINT 90ｄならびにＰＣ
ＲプライマーＴｉｒおよびInsu 11 が記載されている。
これらの成分は、所望のＬｙｓ(Ｂ３)−プロインスリン
をコードするプラスミド pINT 125ｄの構築の出発原料
となる。さらに、配列 ５′ ＴＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧ ３′ を有するプライマーＩnsu35、および配列 ５′ ＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＡ ３′ を有するプライマーＩnsu36 を合成する。
ドの出発原料としてのＬｙｓ(Ｂ３)−プロインスリンの
構築 ＵＳ5,358,857号にはベクター pINT 90ｄならびにＰＣ
ＲプライマーＴｉｒおよびInsu 11 が記載されている。
これらの成分は、所望のＬｙｓ(Ｂ３)−プロインスリン
をコードするプラスミド pINT 125ｄの構築の出発原料
となる。さらに、配列 ５′ ＴＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧ ３′ を有するプライマーＩnsu35、および配列 ５′ ＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＡ ３′ を有するプライマーＩnsu36 を合成する。
【００４６】ＰＣＲ反応は、プライマーＴirと Insu 36
を用いて行い、第二の反応はプライマー Insu 11 とIn
su 35 を用いて実施する。この場合に使用した鋳型はpI
NT90ｄ DNAである。２回のＰＣＲ反応の産物は、それら
が第三のＰＣＲ反応でプライマーＴｉｒおよび Insu 11
と混合された場合に、Ｂ鎖の位置３にリジンを含有す
るプロインスリン変異体をコードするフラグメントを与
えるように、一部が相補性である。このＰＣＲフラグメ
ントを精製するため、エタノールに溶解し、乾燥し、つ
いで製造業者の説明書に従い制限酵素 Nco１ および Sa
l１で消化する。反応混合物をゲル電気泳動で分離し、
所望の Nco１／Sal１ フラグメントを単離する。
を用いて行い、第二の反応はプライマー Insu 11 とIn
su 35 を用いて実施する。この場合に使用した鋳型はpI
NT90ｄ DNAである。２回のＰＣＲ反応の産物は、それら
が第三のＰＣＲ反応でプライマーＴｉｒおよび Insu 11
と混合された場合に、Ｂ鎖の位置３にリジンを含有す
るプロインスリン変異体をコードするフラグメントを与
えるように、一部が相補性である。このＰＣＲフラグメ
ントを精製するため、エタノールに溶解し、乾燥し、つ
いで製造業者の説明書に従い制限酵素 Nco１ および Sa
l１で消化する。反応混合物をゲル電気泳動で分離し、
所望の Nco１／Sal１ フラグメントを単離する。
【００４７】引用出願には、ミニ−プロインスリンをコ
ードするプラスミド pINT 91ｄが記載されている。ミニ
−プロインスリンをコードする配列が Nco１および Sal
１で切断され、残余のプラスミドＤＮＡが単離される場
合は、この残余プラスミドＤＮＡは、示したNco１／Sal
１ ＰＣＲフラグメントとＴ４リガーゼ反応中で反応さ
せてプラスミド pINT 125ｄを与えることができる。こ
れを大腸菌Ｋ12にトランスフォームし、そこで複製さ
せ、再び単離する。ＤＮＡ配列決定および制限分析によ
りプラスミドの構造の確証後に、pINT 125ｄ DNAを鋳型
ＤＮＡとして用いてこのプロインスリン変異体にさらに
突然変異を導入する。
ードするプラスミド pINT 91ｄが記載されている。ミニ
−プロインスリンをコードする配列が Nco１および Sal
１で切断され、残余のプラスミドＤＮＡが単離される場
合は、この残余プラスミドＤＮＡは、示したNco１／Sal
１ ＰＣＲフラグメントとＴ４リガーゼ反応中で反応さ
せてプラスミド pINT 125ｄを与えることができる。こ
れを大腸菌Ｋ12にトランスフォームし、そこで複製さ
せ、再び単離する。ＤＮＡ配列決定および制限分析によ
りプラスミドの構造の確証後に、pINT 125ｄ DNAを鋳型
ＤＮＡとして用いてこのプロインスリン変異体にさらに
突然変異を導入する。
【００４８】実施例２：Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−
プロインスリンの構築 ムテインの調製のために、配列 ５′ ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＣＧ ３′ を有するプライマー329ａ、および配列 ５′ ＧＣＣＧＣＧＧＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣ ３′ を有するプライマー329ｂを合成する。
プロインスリンの構築 ムテインの調製のために、配列 ５′ ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＣＧ ３′ を有するプライマー329ａ、および配列 ５′ ＧＣＣＧＣＧＧＧＴＣＴＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣ ３′ を有するプライマー329ｂを合成する。
【００４９】使用される鋳型は、プラスミド pINT 125
ｄ および pINT 91ｄのＤＮＡである。ＰＣＲ反応にお
いて、プライマー329ａは鋳型 pINT 91ｄ上でプライマ
ー Insu11 と、プライマー329ｂは鋳型 pINT 125ｄ上で
Ｔｉｒ（上記実施例参照）と反応させる。ＰＣＲ産物の
両者は部分的に相補性であるので、それらは直接、ＰＣ
Ｒ反応において結合することが可能で、プライマーＴｉ
ｒおよび Insu 11 と再び反応する。所望のムテインを
コードするＤＮＡフラグメントが生じる。このフラグメ
ントを、制限酵素 Nco１および Sal１を使用して二重消
化して、得られたNco１／Sal１フラグメントを、Ｔ４リ
ガーゼ反応において pINT 91ｄ残余プラスミドＤＮＡ中
に挿入する。
ｄ および pINT 91ｄのＤＮＡである。ＰＣＲ反応にお
いて、プライマー329ａは鋳型 pINT 91ｄ上でプライマ
ー Insu11 と、プライマー329ｂは鋳型 pINT 125ｄ上で
Ｔｉｒ（上記実施例参照）と反応させる。ＰＣＲ産物の
両者は部分的に相補性であるので、それらは直接、ＰＣ
Ｒ反応において結合することが可能で、プライマーＴｉ
ｒおよび Insu 11 と再び反応する。所望のムテインを
コードするＤＮＡフラグメントが生じる。このフラグメ
ントを、制限酵素 Nco１および Sal１を使用して二重消
化して、得られたNco１／Sal１フラグメントを、Ｔ４リ
ガーゼ反応において pINT 91ｄ残余プラスミドＤＮＡ中
に挿入する。
【００５０】大腸菌Ｋ12内で増幅したのち得られたプラ
スミド pINT 329 を所望の構造に関して、制限およびＤ
ＮＡ分析により確証する。このプラスミドによってコー
ドされるプロインスリン誘導体は、２個のアミノ酸置換
と、アミノ酸アルギニンからなるＣ−結合メンバーが特
徴的である。
スミド pINT 329 を所望の構造に関して、制限およびＤ
ＮＡ分析により確証する。このプラスミドによってコー
ドされるプロインスリン誘導体は、２個のアミノ酸置換
と、アミノ酸アルギニンからなるＣ−結合メンバーが特
徴的である。
【００５１】実施例３：Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−
プロインスリンの構築 この構築は前実施例に従い、プライマー対 ＫＢ３ ＪＢ27Ａ ５′ ＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＧ ３′ と Insu 11 および ＫＢ３ Ｊ27Ｂ ５′ ＴＴＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＧ ３′ と Ｔｉｒ を用いて実施する。
プロインスリンの構築 この構築は前実施例に従い、プライマー対 ＫＢ３ ＪＢ27Ａ ５′ ＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＧ ３′ と Insu 11 および ＫＢ３ Ｊ27Ｂ ５′ ＴＴＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＧ ３′ と Ｔｉｒ を用いて実施する。
【００５２】両ＰＣＲ反応に使用される鋳型はプラスミ
ドpINT 125ｄのＤＮＡである。両反応のＰＣＲ産物は実
施例１に記載のように、第三の反応に混合し、生成物は
その実施例と同様にクローン化する。プラスミドpINT 3
32 が得られる。
ドpINT 125ｄのＤＮＡである。両反応のＰＣＲ産物は実
施例１に記載のように、第三の反応に混合し、生成物は
その実施例と同様にクローン化する。プラスミドpINT 3
32 が得られる。
【００５３】実施例４：Ｌｙｓ(Ｂ３),Ｉｌｅ(Ｂ28)−
プロインスリンの構築 この構築は実施例３に従い、プライマー対 ＫＢ３ ＪＢ28Ａ ５′ ＴＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧ ３′ と Insu 11 および ＫＢ３ ＪＢ28Ｂ ５′ ＧＧＴＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＧ ３′ と Ｔｉｒ を用いて実施する。プラスミド pINT 333 が得られる。
プロインスリンの構築 この構築は実施例３に従い、プライマー対 ＫＢ３ ＪＢ28Ａ ５′ ＴＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧ ３′ と Insu 11 および ＫＢ３ ＪＢ28Ｂ ５′ ＧＧＴＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＧ ３′ と Ｔｉｒ を用いて実施する。プラスミド pINT 333 が得られる。
【００５４】構築されたインスリン変異体の発現 プラスミド pINT 329、pINT 332 および pINT 333 をそ
れぞれ、たとえば大腸菌Ｋ12 Ｗ3110にトランスフォー
ムする。各変異体をコードするプラスミドを含有する組
換え細菌をついで、登録番号第5,227,293号の米国特許
の実施例４従って発酵させると、各インスリン変異体の
製造のための所望の粗製原料が生成する。
れぞれ、たとえば大腸菌Ｋ12 Ｗ3110にトランスフォー
ムする。各変異体をコードするプラスミドを含有する組
換え細菌をついで、登録番号第5,227,293号の米国特許
の実施例４従って発酵させると、各インスリン変異体の
製造のための所望の粗製原料が生成する。
【００５５】実施例５：Lys(B3),Ile(B28),Asp(A21)−
プロインスリンの構築 構築は実施例３の場合のように実施する。しかしなが
ら、pINT 125ｄに代えてＰＣＲ反応のための鋳型は、実
施例４で構築されたプラスミド pINT 333 とする。この
場合は以下のプライマー対 P−pint 365 5′TTTTTTGTCGACTATTAGTCGCAGTAGTTCTACCAGCTG3′と Ｔｉｒ を使用する。プラスミド pINT 365 が得られる。
プロインスリンの構築 構築は実施例３の場合のように実施する。しかしなが
ら、pINT 125ｄに代えてＰＣＲ反応のための鋳型は、実
施例４で構築されたプラスミド pINT 333 とする。この
場合は以下のプライマー対 P−pint 365 5′TTTTTTGTCGACTATTAGTCGCAGTAGTTCTACCAGCTG3′と Ｔｉｒ を使用する。プラスミド pINT 365 が得られる。
【００５６】実施例６：ウサギへの静脈内投与後のLys
(B３),Glu(B29)−インスリンの生物活性
(B３),Glu(B29)−インスリンの生物活性
【００５７】
【表１】
【００５８】８羽のウサギに指示したインスリン（0.2
IU/kg）を静脈内に投与した。以後４時間にわたって、
血中グルコース濃度を指示した時間に測定し、時間０に
おける開始値の％を計算した。平均値はヒトインスリン
とＬｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−インスリンの間に生物
活性の有意な差を示さない。
IU/kg）を静脈内に投与した。以後４時間にわたって、
血中グルコース濃度を指示した時間に測定し、時間０に
おける開始値の％を計算した。平均値はヒトインスリン
とＬｙｓ(Ｂ３),Ｇｌｕ(Ｂ29)−インスリンの間に生物
活性の有意な差を示さない。
【００５９】実施例７：ウサギへの静脈内投与後のLys
(B3),Ile(B27)−ならびにIle(B28)−インスリンの生物
活性 ８羽のウサギに指示したインスリン（0.2 IU/kg）を静
脈内に投与した。以後４時間にわたって、血中グルコー
ス濃度を指示した時間に測定し、時間０における開始値
の％を計算した。平均値はヒトインスリン、Ｌｙｓ(Ｂ
３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−ならびにＩｌｅ(Ｂ28)−インスリン
の間に生物活性の有意な差を示さない。
(B3),Ile(B27)−ならびにIle(B28)−インスリンの生物
活性 ８羽のウサギに指示したインスリン（0.2 IU/kg）を静
脈内に投与した。以後４時間にわたって、血中グルコー
ス濃度を指示した時間に測定し、時間０における開始値
の％を計算した。平均値はヒトインスリン、Ｌｙｓ(Ｂ
３),Ｉｌｅ(Ｂ27)−ならびにＩｌｅ(Ｂ28)−インスリン
の間に生物活性の有意な差を示さない。
【００６０】
【表２】
【００６１】実施例８：イヌへの皮下投与後のLys(B3),
Glu(B29)−インスリンならびにLys(B3),Ile(B28)−イン
スリンの薬物動態 ４匹のイヌに指示したインスリン（0.3 IU/kg）を静脈
内投与した。グルコースを連続的に注入し血中グルコー
スを 3.7〜4 mmol/l に維持した。注射時（ｔ＝０）か
ら 240分にわたっての平均グルコース注入速度±ＳＥＭ
を示す。
Glu(B29)−インスリンならびにLys(B3),Ile(B28)−イン
スリンの薬物動態 ４匹のイヌに指示したインスリン（0.3 IU/kg）を静脈
内投与した。グルコースを連続的に注入し血中グルコー
スを 3.7〜4 mmol/l に維持した。注射時（ｔ＝０）か
ら 240分にわたっての平均グルコース注入速度±ＳＥＭ
を示す。
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..21 配列： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20
【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を示す記号：タンパク質 存在位置：１..30 配列： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
【００６７】配列番号：３ 配列の長さ:３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を示す記号：タンパク質 存在位置：１..30 配列： Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 30
【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..30 配列： Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr 20 25 30
【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を示す記号：タンパク質 存在位置：１..30 配列： Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr 20 25 30
【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：９７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を示す記号：タンパク質 存在位置：１..97 配列： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 40 45 Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 75 80 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Asn
【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：９７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..97 配列： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 40 45 Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 75 80 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Asn
【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：９７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..97 配列： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 40 45 Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 75 80 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Asn
【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..21 配列： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asp 20
【００７４】配列番号：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..30 配列： Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr 20 25 30
【００７５】配列番号：１１ 配列の長さ：９７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：１..97 配列： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro 35 40 45 Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 75 80 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Asp
【図１】絶食させたイヌへの迅速作用型インスリン誘導
体のグルコースクランプ（平均±ｓｅｍ，ｎ＝４）を示
す。
体のグルコースクランプ（平均±ｓｅｍ，ｎ＝４）を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/26 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 パウル・ハーバーマン ドイツ連邦共和国65817エプシユタイン. ローセルトシユトラーセ35 (72)発明者 カール・ガイゼン ドイツ連邦共和国60318フランクフルト. ヤーンシユトラーセ43 (72)発明者 ゲーアハルト・ザイプケ ドイツ連邦共和国65719ホーフハイム．ヴ イーゼンシユトラーセ44
Claims (59)
- 【請求項１】 Ｂ鎖位置Ｂ３のアスパラギン（Asn）が
天然に存在する塩基性アミノ酸残基によって置換され、
Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28またはＢ29のアミノ酸残基の少なく
とも１種が他の天然に存在する中性または酸性アミノ酸
残基によって置換され、所望によりＡ鎖位置21のアスパ
ラギン（Asn）がAsp、Gly、Ser、ThrまたはAlaに置換さ
れ、またＢ鎖位置Ｂ１のフェニルアラニン（Phe）およ
びＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸残基は存在しなくてもよいイ
ンスリン誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２】 式Ｉ 【化１】 〔式中、 （Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリンまたは動物インスリン
のＡ鎖位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基であり、 （Ａ12〜Ａ19）はヒトインスリンまたは動物インスリン
のＡ鎖位置Ａ12〜Ａ19のアミノ酸残基であり、 Ａ21は、Asn、Asp、Gly、Ser、ThrまたはAlaであり、 （Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリンまたは動物インスリン
のＢ鎖位置Ｂ８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、 （Ｂ20〜Ｂ26）はヒトインスリンまたは動物インスリン
のＢ鎖位置Ｂ20〜Ｂ26のアミノ酸残基であり、 Ａ８、Ａ９、Ａ10は、ヒトインスリンまたは動物インス
リンのＡ鎖位置Ａ８、Ａ９およびＡ10のアミノ酸残基で
あり、 Ｂ30は、−OHまたはヒトインスリンもしくは動物インス
リンのＢ鎖位置Ｂ30のアミノ酸残基であり、 Ｂ１はフェニルアラニン残基（Phe）または水素原子で
あり、 Ｂ３は天然に存在する塩基性アミノ酸残基であり、 Ｂ27、Ｂ28およびＢ29は、ヒトインスリンもしくは動物
インスリンのＢ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29のアミノ酸
残基であるか、またはそれぞれ他の天然に存在するアミ
ノ酸残基であり、この場合、Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28および
Ｂ29のアミノ酸残基の少なくとも１種は中性または酸性
アミノ酸からなる群より選択される他の天然に存在する
アミノ酸残基で置換されている〕によって表される請求
項１記載のインスリン誘導体またはその生理的に許容さ
れうる塩。 - 【請求項３】 Ａ８はアラニン（Ala）であり、Ａ９は
セリン（Ser）であり、Ａ10はバリン（Val）であり、Ｂ
30はアラニン（Ala）である請求項２記載のインスリン
誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項４】 Ａ８はスレオニン（Thr）であり、Ａ９
はセリン（Ser）であり、Ａ10はイソロイシン（Ile）で
ある請求項２記載のインスリン誘導体またはその生理的
に許容されうる塩。 - 【請求項５】 Ｂ30はアラニン（Ala）である請求項４
記載のインスリン誘導体またはその生理的に許容されう
る塩。 - 【請求項６】 Ｂ30はスレオニン（Thr）である請求項
４記載のインスリン誘導体またはその生理的に許容され
うる塩。 - 【請求項７】 （Ａ１〜Ａ５）はヒトインスリンのＡ鎖
位置Ａ１〜Ａ５のアミノ酸残基であり、（Ａ12〜Ａ19）
はヒトインスリンのＡ鎖位置Ａ12〜Ａ19のアミノ酸残基
であり、（Ｂ８〜Ｂ18）はヒトインスリンのＢ鎖位置Ｂ
８〜Ｂ18のアミノ酸残基であり、（Ｂ20〜Ｂ26）はヒト
インスリンのＢ鎖位置Ｂ20〜Ｂ26のアミノ酸残基である
請求項６記載のインスリン誘導体またはその生理的に許
容されうる塩。 - 【請求項８】 Ｂ鎖位置Ｂ１におけるアミノ酸残基はフ
ェニルアラニン残基(Phe）である請求項１〜７のいずれ
かに記載のインスリン誘導体またはその生理的に許容さ
れうる塩。 - 【請求項９】 Ｂ鎖位置Ｂ３におけるアミノ酸残基はヒ
スチジン（His)、リジン（Lys）またはアルギニン（Ar
g）残基である請求項１〜８のいずれかに記載のインス
リン誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１０】 Ｂ鎖位置Ｂ３におけるアミノ酸残基は
ヒスチジン(His）残基である請求項９記載のインスリン
誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１１】 Ｂ鎖位置Ｂ３におけるアミノ酸残基は
アルギニン(Arg）残基である請求項９記載のインスリン
誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１２】 Ｂ鎖位置Ｂ３におけるアミノ酸残基は
リジン（Lys）残基である請求項９記載のインスリン誘
導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１３】 Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけ
るアミノ酸残基の少なくとも１種はイソロイシン（Il
e）、アスパラギン酸（Asp）およびグルタミン酸（Gl
u）からなる群より選択される天然に存在するアミノ酸
残基である請求項１〜１２のいずれかに記載のインスリ
ン誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１４】 Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけ
るアミノ酸残基の少なくとも１種は酸性アミノ酸からな
る群より選択される天然に存在するアミノ酸残基である
請求項１〜１３のいずれかに記載のインスリン誘導体ま
たはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１５】 Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけ
るアミノ酸残基の少なくとも１種はアスパラギン酸（As
p）残基である請求項１４記載のインスリン誘導体また
はその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１６】 Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけ
るアミノ酸残基の少なくとも１種はグルタミン酸（Gl
u）残基である請求項１４記載のインスリン誘導体また
はその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１７】 Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけ
るアミノ酸残基の少なくとも１種は中性アミノ酸からな
る群より選択される天然に存在するアミノ酸残基によっ
て置換されている請求項１〜１３のいずれかに記載のイ
ンスリン誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１８】 Ｂ鎖位置Ｂ27、Ｂ28およびＢ29におけ
るアミノ酸残基の少なくとも１種はイソロイシン（Il
e）残基である請求項１７記載のインスリン誘導体また
はその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項１９】 Ｂ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基はアスパ
ラギン酸(Asp）残基である請求項１５記載のインスリン
誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２０】 Ｂ鎖位置Ｂ28のアミノ酸残基はアスパ
ラギン酸(Asp）残基である請求項１５記載のインスリン
誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２１】 Ｂ鎖位置Ｂ29のアミノ酸残基はアスパ
ラギン酸(Asp）残基である請求項１５記載のインスリン
誘導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２２】 Ｂ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基はグルタ
ミン酸(Glu）残基である請求項１６記載のインスリン誘
導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２３】 Ｂ鎖位置Ｂ28のアミノ酸残基はグルタ
ミン酸(Glu）残基である請求項１６記載のインスリン誘
導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２４】 Ｂ鎖位置Ｂ29のアミノ酸残基はグルタ
ミン酸(Glu）残基である請求項１６記載のインスリン誘
導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２５】 Ｂ鎖位置Ｂ28のアミノ酸残基はイソロ
イシン(Ile）残基である請求項１８記載のインスリン誘
導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２６】 Ａ鎖位置Ａ21のアミノ酸残基はアスパ
ラギン(Asp）残基である請求項１〜２５のいずれかに記
載のインスリン誘導体またはその生理的に許容されうる
塩。 - 【請求項２７】 Ａ鎖は配列 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp（配列番号：９） を有し、Ｂ鎖は配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr（配列番号：10） を有する請求項２６記載のインスリン誘導体またはその
生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２８】 Ｂ鎖は配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr（配列番号：３） を有する請求項２４記載のインスリン誘導体またはその
生理的に許容されうる塩。 - 【請求項２９】 Ｂ鎖位置Ｂ27のアミノ酸残基はイソロ
イシン(Ile）残基である請求項１８記載のインスリン誘
導体またはその生理的に許容されうる塩。 - 【請求項３０】 Ｂ鎖は配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr（配列番号：５） を有する請求項２９記載のインスリン誘導体またはその
生理的に許容されうる塩。 - 【請求項３１】 Ｂ鎖は配列 Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr（配列番号：４） を有する請求項２５記載のインスリン誘導体またはその
生理的に許容されうる塩。 - 【請求項３２】 Ａ鎖位置Ａ１のアミノ酸残基がＢ鎖位
置Ｂ30のアミノ酸残基に式II −Ｒ1 n−Arg− II （式中、Ｒ1 nはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖
であり、ｎは０〜３４の整数である）を介して連結し、
Ｂ鎖は位置Ｂ１において式III Met−Ｒ2 m−(Arg)p− III （式中、Ｒ2 mはｍ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖
であり、ｍは０〜４０の整数であり、ｐは０、１または
２である）のペプチド鎖によって延長されているインス
リン誘導体の前駆体をコードするＤＮＡ配列を含有する
複製可能な発現ビヒクルの構築、宿主細胞における発現
ならびにその前駆体から化学的および／または酵素的方
法を用いるインスリン誘導体の遊離からなる請求項１〜
３０のいずれかに記載のインスリン誘導体またはその生
理的に耐容性のある塩の製造方法。 - 【請求項３３】 宿主細胞は細菌である請求項３２記載
の方法。 - 【請求項３４】 細菌は大腸菌である請求項３３記載の
方法。 - 【請求項３５】 宿主細胞は酵母である請求項３２記載
の方法。 - 【請求項３６】 酵母は Saccharomyces cerevisiae で
ある請求項３５記載の方法。 - 【請求項３７】 インスリン誘導体の前駆体は配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asp（配列番号：１１） を有する請求項２６記載のインスリン誘導体の製造のた
めの請求項３２〜３６いずれかに記載の方法。 - 【請求項３８】 インスリン誘導体の前駆体は配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：６） を有する請求項２８記載のインスリン誘導体の製造のた
めの請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３９】 インスリン誘導体の前駆体は配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ile Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：８） を有する請求項３０記載のインスリン誘導体の製造のた
めの請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４０】 インスリン誘導体の前駆体は配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ile Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn（配列番号：７） を有する請求項３１記載のインスリン誘導体の製造のた
めの請求項３２〜３６いずれかに記載の方法。 - 【請求項４１】 請求項３７記載のインスリン誘導体の
前駆体。 - 【請求項４２】 請求項３８記載のインスリン誘導体の
前駆体。 - 【請求項４３】 請求項３９記載のインスリン誘導体の
前駆体。 - 【請求項４４】 請求項４０記載のインスリン誘導体の
前駆体。 - 【請求項４５】 請求項４１記載のインスリン誘導体の
前駆体をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項４６】 請求項４２記載のインスリン誘導体の
前駆体をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項４７】 請求項４３記載のインスリン誘導体の
前駆体をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項４８】 請求項４４記載のインスリン誘導体の
前駆体をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項４９】 請求項４５記載のＤＮＡ配列からなる
発現ビヒクル。 - 【請求項５０】 請求項４６記載のＤＮＡ配列からなる
発現ビヒクル。 - 【請求項５１】 請求項４７記載のＤＮＡ配列からなる
発現ビヒクル。 - 【請求項５２】 請求項４８記載のＤＮＡ配列からなる
発現ビヒクル。 - 【請求項５３】 請求項４９〜５２のいずれかに記載の
発現ビヒクルを用いてトランスフォームされた宿主細
胞。 - 【請求項５４】 請求項１〜３０のいずれかに記載のイ
ンスリン誘導体および／またはその生理的に許容されう
る塩少なくとも１種からなる医薬製剤。 - 【請求項５５】 溶解、無定形および／または結晶型の
インスリン誘導体および／またはその生理的に許容され
うる塩からなる請求項５４記載の医薬製剤。 - 【請求項５６】 さらにデポ補助剤からなる請求項５４
記載の医薬製剤。 - 【請求項５７】 インスリン誘導体および／またはその
生理的に許容されうる塩がプロタミン硫酸塩と共結晶と
して存在するデポ補助剤はプロタミン硫酸塩である請求
項５６記載の医薬製剤。 - 【請求項５８】 請求項５４〜５６のいずれかに記載の
医薬製剤の溶解型からなるインスリン活性を有する注射
用溶液。 - 【請求項５９】 迅速な作用発現を示すインスリン活性
を有する医薬製剤の製造のための請求項１〜３１のいず
れかに記載のインスリン誘導体および／またはその生理
的に許容されうる塩の使用。
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