JPH1189590A - 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質 の回収精製法 - Google Patents
上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質 の回収精製法Info
- Publication number
- JPH1189590A JPH1189590A JP9269206A JP26920697A JPH1189590A JP H1189590 A JPH1189590 A JP H1189590A JP 9269206 A JP9269206 A JP 9269206A JP 26920697 A JP26920697 A JP 26920697A JP H1189590 A JPH1189590 A JP H1189590A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- egf
- culture
- growth factor
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 86
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title claims description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title abstract description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title abstract 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title abstract 3
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 claims abstract description 30
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 8
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 claims description 6
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 4
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 4
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 101500025418 Mus musculus Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims 1
- 101500026390 Rattus norvegicus Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims 1
- WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N murodermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=2NC=NC=2)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N2)C(C)C)=O)CSSC1)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003699 antiulcer agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 50
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 23
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101001057593 Rattus norvegicus Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101000851196 Mus musculus Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010019837 Hepatocellular injury Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000767 anti-ulcer Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007567 mass-production technique Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）活性を有す
るタンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物
を、（ａ）ｐＨ調整によって該培養物中に含まれる大部
分の夾雑タンパク質を特異的に沈殿させ、これを除去し
た後、更に（ｂ）清澄画分に塩を加えてＥＧＦ活性を有
するタンパク質を沈殿させ、これを膜濾過又は遠心分離
によって、共存する夾雑物から分離回収する。 【効果】 簡便且つ効率的にＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質を培養物から分離回収できる。
るタンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物
を、（ａ）ｐＨ調整によって該培養物中に含まれる大部
分の夾雑タンパク質を特異的に沈殿させ、これを除去し
た後、更に（ｂ）清澄画分に塩を加えてＥＧＦ活性を有
するタンパク質を沈殿させ、これを膜濾過又は遠心分離
によって、共存する夾雑物から分離回収する。 【効果】 簡便且つ効率的にＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質を培養物から分離回収できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バチルス・ブレビ
スを宿主菌とする遺伝子組換体を培養することによって
生産された上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Facto
r: 以下ＥＧＦ）活性を有するタンパク質の回収精製法
に関するものである。更に、詳細には、本発明はＥＧＦ
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換
したバチルス・ブレビスを培養し、その培養物からＥＧ
Ｆ活性を有するタンパク質を回収精製する方法に関する
ものであって、特に工業的大量処理に適した簡便且つ効
率的なタンパク質の回収精製方法に関するものである。
スを宿主菌とする遺伝子組換体を培養することによって
生産された上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Facto
r: 以下ＥＧＦ）活性を有するタンパク質の回収精製法
に関するものである。更に、詳細には、本発明はＥＧＦ
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換
したバチルス・ブレビスを培養し、その培養物からＥＧ
Ｆ活性を有するタンパク質を回収精製する方法に関する
ものであって、特に工業的大量処理に適した簡便且つ効
率的なタンパク質の回収精製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＥＧＦは、ヒトや馬の尿中やウサギ、ラ
ットおよびマウスの顎下腺から単離されており、哺乳動
物の種々の組織中に存在していることが知られている
（Adv. Metab. Dis., 8, 265(1975))。ヒト上皮細胞増
殖因子(human Epidermal Growth Factor: 以下ｈ−ＥＧ
Ｆ）は、５３個のアミノ酸からなる分子量約６，０００
のペプチドで、分子内に３ケ所のジスルフィド結合を持
ち、配列番号１に示されるアミノ酸配列であることが知
られている（H.Gregory, Nature, 257, 325(1975))。
ットおよびマウスの顎下腺から単離されており、哺乳動
物の種々の組織中に存在していることが知られている
（Adv. Metab. Dis., 8, 265(1975))。ヒト上皮細胞増
殖因子(human Epidermal Growth Factor: 以下ｈ−ＥＧ
Ｆ）は、５３個のアミノ酸からなる分子量約６，０００
のペプチドで、分子内に３ケ所のジスルフィド結合を持
ち、配列番号１に示されるアミノ酸配列であることが知
られている（H.Gregory, Nature, 257, 325(1975))。
【０００３】ＥＧＦの生理作用は、細胞増殖作用、胃酸
分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化管粘膜保護作用、ＤＮ
Ａ合成促進作用、角膜修復作用、カルシウム遊離促進作
用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用、肝細胞
障害抑制作用及び毛胞退縮作用などが報告されている
（日本組織培養学会編、細胞成長因子、２０頁、朝倉書
店１９８４年）。ＥＧＦはこのような作用を有すること
から創傷治癒薬、抗潰瘍剤、抗癌剤補助剤など様々の分
野で応用が試みられている（BIO INDUSTRY, 8, 275(199
1))。
分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化管粘膜保護作用、ＤＮ
Ａ合成促進作用、角膜修復作用、カルシウム遊離促進作
用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用、肝細胞
障害抑制作用及び毛胞退縮作用などが報告されている
（日本組織培養学会編、細胞成長因子、２０頁、朝倉書
店１９８４年）。ＥＧＦはこのような作用を有すること
から創傷治癒薬、抗潰瘍剤、抗癌剤補助剤など様々の分
野で応用が試みられている（BIO INDUSTRY, 8, 275(199
1))。
【０００４】このようにＥＧＦについて種々の応用研究
が進められている一方、ＥＧＦを安定に供給可能とする
生産方法についても種々検討が加えられている。
が進められている一方、ＥＧＦを安定に供給可能とする
生産方法についても種々検討が加えられている。
【０００５】例えば、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１
（Bacillus brevis HPD31: なお、この菌株はバチルス
・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同
一菌株である）はタンパク質を菌体外に分泌生産し、培
養液中にタンパク質分解酵素を生産しない菌株であり
（特公平４−７４９９７）、遺伝子組換えの宿主菌とし
て様々なタンパク質の生産に利用されている。恵比須ら
は、このバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主菌として
ｈ−ＥＧＦの大量生産技術を確立し、ｈ−ＥＧＦを培養
液中に約３ｇ／Ｌ分泌生産させることに成功している
（特開平６−１３３７８２）。また高木らは、ＥＧＦ活
性を有する新規なタンパク質を創製し、バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１を用いその高生産に成功している（特願
平８−１２３９７０）。
（Bacillus brevis HPD31: なお、この菌株はバチルス
・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同
一菌株である）はタンパク質を菌体外に分泌生産し、培
養液中にタンパク質分解酵素を生産しない菌株であり
（特公平４−７４９９７）、遺伝子組換えの宿主菌とし
て様々なタンパク質の生産に利用されている。恵比須ら
は、このバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主菌として
ｈ−ＥＧＦの大量生産技術を確立し、ｈ−ＥＧＦを培養
液中に約３ｇ／Ｌ分泌生産させることに成功している
（特開平６−１３３７８２）。また高木らは、ＥＧＦ活
性を有する新規なタンパク質を創製し、バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１を用いその高生産に成功している（特願
平８−１２３９７０）。
【０００６】しかし、遺伝子組換え技術を適用し培養液
中に分泌生産されたＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタ
ンパク質を医薬品などに開発するには、培養物中に混在
している菌体、培地由来の成分や同時に分泌生産される
夾雑タンパク質やその他の代謝産物などの夾雑物を除去
し、目的とするＥＧＦ活性を有するタンパク質のみを回
収精製する必要がある。この精製工程は簡便でかつ工程
数も少ない方がよく、特に精製を工業規模で行う場合に
は精製工程が複雑であると多大な設備投資が必要であ
り、その為生産コストも高くなってしまうという問題が
生じる。
中に分泌生産されたＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタ
ンパク質を医薬品などに開発するには、培養物中に混在
している菌体、培地由来の成分や同時に分泌生産される
夾雑タンパク質やその他の代謝産物などの夾雑物を除去
し、目的とするＥＧＦ活性を有するタンパク質のみを回
収精製する必要がある。この精製工程は簡便でかつ工程
数も少ない方がよく、特に精製を工業規模で行う場合に
は精製工程が複雑であると多大な設備投資が必要であ
り、その為生産コストも高くなってしまうという問題が
生じる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
技術上ないし工業上の必要性に鑑みてなされたものであ
って、バチルス・ブレビスを宿主菌とする異種遺伝子産
物の生産において、菌体を含む培養物中からの効率的な
回収精製技術を提供することにある。即ち、本発明は、
バチルス・ブレビスの培養物中に分泌生産されたＥＧＦ
活性を有するタンパク質を共存する成分から分離し、簡
便かつ高収率に回収精製する方法を提供するものであっ
て、特に工業的な見地から、本発明は、ＥＧＦ活性を有
するタンパク質の回収精製に特に適した簡便且つ効率的
な大量処理システムを新たに開発し、これを提供する目
的でなされたものである。
技術上ないし工業上の必要性に鑑みてなされたものであ
って、バチルス・ブレビスを宿主菌とする異種遺伝子産
物の生産において、菌体を含む培養物中からの効率的な
回収精製技術を提供することにある。即ち、本発明は、
バチルス・ブレビスの培養物中に分泌生産されたＥＧＦ
活性を有するタンパク質を共存する成分から分離し、簡
便かつ高収率に回収精製する方法を提供するものであっ
て、特に工業的な見地から、本発明は、ＥＧＦ活性を有
するタンパク質の回収精製に特に適した簡便且つ効率的
な大量処理システムを新たに開発し、これを提供する目
的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＥＧＦ活
性を有するタンパク質をバチルス・ブレビスの培養物中
から効率よく回収精製する方法について鋭意研究を重ね
た結果、培養物のｐＨを特定の範囲に調整すると、バチ
ルス・ブレビスの培養物中に含まれる夾雑タンパク質の
大部分が特異的に凝集沈殿し、凝集沈殿画分及び菌体を
効率よく除くことが可能であること、更に、清澄画分に
塩を加えることによりＥＧＦ活性を有するタンパク質を
特異的に凝集沈殿させ膜濾過または遠心分離することに
より非常に簡便かつ効率よくＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質を回収精製できるという有用な新知見を得た。本発
明は、この有用新知見に基き更に研究の結果、遂に完成
されたものである。
性を有するタンパク質をバチルス・ブレビスの培養物中
から効率よく回収精製する方法について鋭意研究を重ね
た結果、培養物のｐＨを特定の範囲に調整すると、バチ
ルス・ブレビスの培養物中に含まれる夾雑タンパク質の
大部分が特異的に凝集沈殿し、凝集沈殿画分及び菌体を
効率よく除くことが可能であること、更に、清澄画分に
塩を加えることによりＥＧＦ活性を有するタンパク質を
特異的に凝集沈殿させ膜濾過または遠心分離することに
より非常に簡便かつ効率よくＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質を回収精製できるという有用な新知見を得た。本発
明は、この有用新知見に基き更に研究の結果、遂に完成
されたものである。
【０００９】すなわち本発明は、ＥＧＦ活性を有するタ
ンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物をｐＨ
調整によって該培養物中に含まれる大部分の夾雑タンパ
ク質を特異的に沈殿させ、これを除去した後、更に、清
澄画分に塩を加えてＥＧＦ活性を有するタンパク質を沈
殿させこれを膜濾過または遠心分離によって、共存する
夾雑物から分離回収することを特徴とするＥＧＦ活性を
有するタンパク質の回収精製法に関するものである。
ンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物をｐＨ
調整によって該培養物中に含まれる大部分の夾雑タンパ
ク質を特異的に沈殿させ、これを除去した後、更に、清
澄画分に塩を加えてＥＧＦ活性を有するタンパク質を沈
殿させこれを膜濾過または遠心分離によって、共存する
夾雑物から分離回収することを特徴とするＥＧＦ活性を
有するタンパク質の回収精製法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、ＥＧＦ活性を有するタ
ンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物を、下
記工程（ａ）〜（ｂ）により共存する夾雑タンパク質や
その他の夾雑物よりＥＧＦ活性を有するタンパク質を回
収精製する方法に関するものである。
ンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物を、下
記工程（ａ）〜（ｂ）により共存する夾雑タンパク質や
その他の夾雑物よりＥＧＦ活性を有するタンパク質を回
収精製する方法に関するものである。
【００１１】すなわち本発明を実施するには、該培養物
について、下記工程（ａ）〜（ｂ）にしたがって処理す
ればよく、これらの処理により、該タンパク質を効率的
に回収精製することができる。 （ａ）−１：該培養物のｐＨを３．０〜４．５（好適に
は３．５〜３．９）に調整して、該培養物に含まれる夾
雑タンパク質を沈殿させ； （ａ）−２：（ａ）−１で生じた沈殿及び菌体を分離除
去し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を含有する清澄画
分を得； （ｂ）−１：（ａ）−２で得た清澄画分に塩を加えて、
ＥＧＦ活性を有するタンパク質を沈殿させ； （ｂ）−２：（ｂ）−１で生じた沈殿を回収する。
について、下記工程（ａ）〜（ｂ）にしたがって処理す
ればよく、これらの処理により、該タンパク質を効率的
に回収精製することができる。 （ａ）−１：該培養物のｐＨを３．０〜４．５（好適に
は３．５〜３．９）に調整して、該培養物に含まれる夾
雑タンパク質を沈殿させ； （ａ）−２：（ａ）−１で生じた沈殿及び菌体を分離除
去し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を含有する清澄画
分を得； （ｂ）−１：（ａ）−２で得た清澄画分に塩を加えて、
ＥＧＦ活性を有するタンパク質を沈殿させ； （ｂ）−２：（ｂ）−１で生じた沈殿を回収する。
【００１２】本発明の回収精製方法は、ＥＧＦ活性を有
するタンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物
に対して適用できる。具体的には、バチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１はｈ−ＥＧＦやＥＧＦ活性を有するタンパク
質を菌体外に高生産するので該菌株の該培養物に本発明
の回収精製法が有効に適用できる。
するタンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物
に対して適用できる。具体的には、バチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１はｈ−ＥＧＦやＥＧＦ活性を有するタンパク
質を菌体外に高生産するので該菌株の該培養物に本発明
の回収精製法が有効に適用できる。
【００１３】本発明方法で回収精製されるＥＧＦ活性を
有するタンパク質を具体的に列挙すると、配列番号１の
ヒトＥＧＦ、配列番号２のマウスＥＧＦ、配列番号３の
ラットＥＧＦや配列番号４〜７のタンパク質（特願平８
−１２３９７０）などが挙げられる。また、これらのＥ
ＧＦ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子は、ＥＧＦ生産能を有する細胞から単離した遺
伝子でもよいし、化学的に合成した遺伝子を用いてもよ
い。例えば合成遺伝子を用いる場合は、バチルス・ブレ
ビスにおいて最も容認されたコドンでなる遺伝子が好適
である。
有するタンパク質を具体的に列挙すると、配列番号１の
ヒトＥＧＦ、配列番号２のマウスＥＧＦ、配列番号３の
ラットＥＧＦや配列番号４〜７のタンパク質（特願平８
−１２３９７０）などが挙げられる。また、これらのＥ
ＧＦ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子は、ＥＧＦ生産能を有する細胞から単離した遺
伝子でもよいし、化学的に合成した遺伝子を用いてもよ
い。例えば合成遺伝子を用いる場合は、バチルス・ブレ
ビスにおいて最も容認されたコドンでなる遺伝子が好適
である。
【００１４】ＥＧＦ活性を有するタンパク質遺伝子は、
公知の方法でバチルス・ブレビスに組み込めばよく、例
えばモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマ
ニュアル第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Molecular Cloning2nd ed, A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記載
の方法で行えばよい。
公知の方法でバチルス・ブレビスに組み込めばよく、例
えばモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマ
ニュアル第2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Molecular Cloning2nd ed, A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記載
の方法で行えばよい。
【００１５】このようにＥＧＦ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子で形質転換したバチルス・ブレビス
を通気攪拌培養することによって、ＥＧＦ活性を有する
タンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物を得
ることが出来る。
をコードする遺伝子で形質転換したバチルス・ブレビス
を通気攪拌培養することによって、ＥＧＦ活性を有する
タンパク質を含有するバチルス・ブレビスの培養物を得
ることが出来る。
【００１６】こうして得たバチルス・ブレビスの培養物
は菌体を含有したまま工程（ａ）〜（ｂ）で処理するこ
とを基本とするが、予め培養物を膜処理するか遠心分離
する前処理で菌体を除いた後に工程（ａ）〜（ｂ）で処
理してもよい。即ち、本発明は、該培養物の（ａ）ｐＨ
を３．０〜４．５に調整して、培養物に含まれる夾雑タ
ンパク質を特異的に沈殿させ、この沈殿タンパク質及び
菌体を除去して清澄画分を得る工程、更に、（ｂ）、
（ａ）で得た清澄画分に塩を加えて、ＥＧＦ活性を有す
るタンパク質を沈殿させ、この沈殿したタンパク質画分
を共存していた夾雑成分から分離回収するＥＧＦ活性を
有するタンパク質の回収精製法である。以下、本発明の
工程（ａ）〜（ｂ）についてさらに詳しく説明する。
は菌体を含有したまま工程（ａ）〜（ｂ）で処理するこ
とを基本とするが、予め培養物を膜処理するか遠心分離
する前処理で菌体を除いた後に工程（ａ）〜（ｂ）で処
理してもよい。即ち、本発明は、該培養物の（ａ）ｐＨ
を３．０〜４．５に調整して、培養物に含まれる夾雑タ
ンパク質を特異的に沈殿させ、この沈殿タンパク質及び
菌体を除去して清澄画分を得る工程、更に、（ｂ）、
（ａ）で得た清澄画分に塩を加えて、ＥＧＦ活性を有す
るタンパク質を沈殿させ、この沈殿したタンパク質画分
を共存していた夾雑成分から分離回収するＥＧＦ活性を
有するタンパク質の回収精製法である。以下、本発明の
工程（ａ）〜（ｂ）についてさらに詳しく説明する。
【００１７】先ず、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を含
有するバチルス・ブレビスの培養物をそのまま、また
は、遠心分離や膜濾過によって予じめ菌体を除去した培
養物を、次の工程にしたがって処理する。
有するバチルス・ブレビスの培養物をそのまま、また
は、遠心分離や膜濾過によって予じめ菌体を除去した培
養物を、次の工程にしたがって処理する。
【００１８】（ａ）−１：該培養物のｐＨを調整するこ
とによって、夾雑タンパク質を沈殿させる。ｐＨは、培
養物に含まれる夾雑タンパク質が特異的に沈殿し、ＥＧ
Ｆ活性を有するタンパク質が沈殿しない範囲に調整す
る。夾雑タンパク質の主たるものは、バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１を宿主菌に用いた場合、この菌株が菌体外
に生産する細胞表層タンパク質が主たるもので（ＨＷ
Ｐ；J.Bacteriol., 172, 1312-1320(1990))、ｐＨを
３．０〜４．５の範囲、更に好ましくは３．５〜３．９
の範囲に調整することで特異的に沈殿させることができ
る。このｐＨの調整に用いる酸は、塩酸、硝酸、硫酸な
どの酸を用いることでよい。
とによって、夾雑タンパク質を沈殿させる。ｐＨは、培
養物に含まれる夾雑タンパク質が特異的に沈殿し、ＥＧ
Ｆ活性を有するタンパク質が沈殿しない範囲に調整す
る。夾雑タンパク質の主たるものは、バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１を宿主菌に用いた場合、この菌株が菌体外
に生産する細胞表層タンパク質が主たるもので（ＨＷ
Ｐ；J.Bacteriol., 172, 1312-1320(1990))、ｐＨを
３．０〜４．５の範囲、更に好ましくは３．５〜３．９
の範囲に調整することで特異的に沈殿させることができ
る。このｐＨの調整に用いる酸は、塩酸、硝酸、硫酸な
どの酸を用いることでよい。
【００１９】（ａ）−２：（ａ）−１工程で沈殿した夾
雑タンパク質を除去する工程で、沈殿は遠心分離や膜濾
過によって系外に除去することができる。膜濾過によっ
て除く場合には、ＥＧＦ活性を有するタンパク質が濾過
され、沈殿したＨＷＰを含む夾雑タンパク質が濃縮され
るポアサイズを有する濾過膜を使用すればよい。例え
ば、０．４５μｍのポアサイズの濾過膜を用いて精密濾
過を行えば、沈殿は膜上に濃縮され、除去することがで
きる。このとき更に、ｐＨ３．０〜４．５の緩衝液を用
いて沈殿を洗浄すれば、ＥＧＦ活性を有するタンパク質
をより効率よく濾過液に回収することができる。このと
き用いる緩衝液は、ＥＧＦ活性を有するタンパク質が活
性を失うことのない緩衝液、例えば酢酸緩衝液やリン酸
緩衝液等を用いればよい。こうして、バチルス・ブレビ
スの培養物から夾雑タンパク質が除去され、精製度の高
まったＥＧＦ活性を有するタンパク質溶液を得ることが
できる。
雑タンパク質を除去する工程で、沈殿は遠心分離や膜濾
過によって系外に除去することができる。膜濾過によっ
て除く場合には、ＥＧＦ活性を有するタンパク質が濾過
され、沈殿したＨＷＰを含む夾雑タンパク質が濃縮され
るポアサイズを有する濾過膜を使用すればよい。例え
ば、０．４５μｍのポアサイズの濾過膜を用いて精密濾
過を行えば、沈殿は膜上に濃縮され、除去することがで
きる。このとき更に、ｐＨ３．０〜４．５の緩衝液を用
いて沈殿を洗浄すれば、ＥＧＦ活性を有するタンパク質
をより効率よく濾過液に回収することができる。このと
き用いる緩衝液は、ＥＧＦ活性を有するタンパク質が活
性を失うことのない緩衝液、例えば酢酸緩衝液やリン酸
緩衝液等を用いればよい。こうして、バチルス・ブレビ
スの培養物から夾雑タンパク質が除去され、精製度の高
まったＥＧＦ活性を有するタンパク質溶液を得ることが
できる。
【００２０】（ｂ）−１：（ａ）−２工程で回収した濾
過液に塩を添加して、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を
特異的に沈殿させる。添加する塩は、ＥＧＦ活性を有す
るタンパク質の凝集性がよく且つ活性を失うことのない
塩であればよく、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナ
トリウム、塩化ナトリウムなどが好適に用いることがで
きる。塩濃度はＥＧＦ活性を有するタンパク質が沈殿す
る濃度であればよく、９％以上の濃度であればよい。例
えば塩化ナトリウムを用いた場合には９％以上、より好
ましくは１２％以上の濃度でよい。
過液に塩を添加して、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を
特異的に沈殿させる。添加する塩は、ＥＧＦ活性を有す
るタンパク質の凝集性がよく且つ活性を失うことのない
塩であればよく、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナ
トリウム、塩化ナトリウムなどが好適に用いることがで
きる。塩濃度はＥＧＦ活性を有するタンパク質が沈殿す
る濃度であればよく、９％以上の濃度であればよい。例
えば塩化ナトリウムを用いた場合には９％以上、より好
ましくは１２％以上の濃度でよい。
【００２１】（ｂ）−２：（ｂ）−１工程で沈殿したＥ
ＧＦ活性を有するタンパク質を回収するには、（ａ）−
２と同じく遠心分離や膜濾過によって沈殿を回収するこ
とができる。膜濾過によって回収する場合には、沈殿が
膜上に濃縮されるポアサイズを有する膜を使用すればよ
い。例えば、０．４５μｍのポアサイズの濾過膜を用い
て精密濾過を行い沈殿を濃縮、回収することができる。
このとき加えた塩濃度と同じ塩濃度の緩衝液で沈殿を洗
浄し夾雑物を洗い流すことが出来る。このようにして回
収したＥＧＦ活性を有するタンパク質を緩衝液に溶解さ
せた後、透析や膜濾過によって脱塩する。膜濾過で脱塩
を行う場合には、例えば分画分子量５，０００の限外濾
過膜を用いて濾過を行い、濃縮が進んだ段階で適量の純
水を加えて十分に塩を除去すればよい。また膜濾過によ
る脱塩は、目的とするＥＧＦ活性を有するタンパク質の
濃縮も同時に行えるので、液量をコンパクトにでき、以
降凍結乾燥を行う場合に効果的である。以上のようにし
て、高純度にまで精製されたＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質を得ることができる。
ＧＦ活性を有するタンパク質を回収するには、（ａ）−
２と同じく遠心分離や膜濾過によって沈殿を回収するこ
とができる。膜濾過によって回収する場合には、沈殿が
膜上に濃縮されるポアサイズを有する膜を使用すればよ
い。例えば、０．４５μｍのポアサイズの濾過膜を用い
て精密濾過を行い沈殿を濃縮、回収することができる。
このとき加えた塩濃度と同じ塩濃度の緩衝液で沈殿を洗
浄し夾雑物を洗い流すことが出来る。このようにして回
収したＥＧＦ活性を有するタンパク質を緩衝液に溶解さ
せた後、透析や膜濾過によって脱塩する。膜濾過で脱塩
を行う場合には、例えば分画分子量５，０００の限外濾
過膜を用いて濾過を行い、濃縮が進んだ段階で適量の純
水を加えて十分に塩を除去すればよい。また膜濾過によ
る脱塩は、目的とするＥＧＦ活性を有するタンパク質の
濃縮も同時に行えるので、液量をコンパクトにでき、以
降凍結乾燥を行う場合に効果的である。以上のようにし
て、高純度にまで精製されたＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質を得ることができる。
【００２２】本発明の回収精製法により、非常に簡便
に、バチルス・ブレビスの培養物からＥＧＦ活性を有す
るタンパク質を８５％以上の回収率で、９０〜９５％以
上の純度にまで精製できる。本発明方法で得たＥＧＦ活
性を有するタンパク質を各種用途に適用することもでき
るが、さらに純度を上げる必要がある場合には、更に、
クロマトグラフィーなど公知の方法で処理すればさらに
高純度のＥＧＦ活性を有するタンパク質を得ることが出
来る。
に、バチルス・ブレビスの培養物からＥＧＦ活性を有す
るタンパク質を８５％以上の回収率で、９０〜９５％以
上の純度にまで精製できる。本発明方法で得たＥＧＦ活
性を有するタンパク質を各種用途に適用することもでき
るが、さらに純度を上げる必要がある場合には、更に、
クロマトグラフィーなど公知の方法で処理すればさらに
高純度のＥＧＦ活性を有するタンパク質を得ることが出
来る。
【００２３】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに
限定されるものではない。
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに
限定されるものではない。
【００２４】
【実施例１】バチルス・ブレビスＨＰ９２６（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３８２）が保有するプラスミドｐＨＴ９２６
から調製したｈ−ＥＧＦ高分泌生産プラスミドｐＨＴ１
１０ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）でバチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢＰ−１０８９）をエレク
トロポレーション法（H.Takagi et al. Agric. Biol. C
hem., 53, 3099-3100(1989))で形質転換し、ｈ−ＥＧＦ
を分泌生産する形質転換体を得た。ここで得た菌株をペ
プトン４％、酵母エキス０．５％、ＭｇＳＯ4 ５ｍＭ、
ＭｎＳＯ4 １ｍＭ、ＦｅＳＯ4 ３６μＭ、グルコース２
％、寒天１．５％、ｐＨ７．２の寒天培地にて３０℃で
一昼夜培養した。これを前記と同じ組成の液体培地１Ｌ
に植菌して３０℃で一晩振とう培養を行ったものを前培
養液とした。
ＢＰ−５３８２）が保有するプラスミドｐＨＴ９２６
から調製したｈ−ＥＧＦ高分泌生産プラスミドｐＨＴ１
１０ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）でバチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭＢＰ−１０８９）をエレク
トロポレーション法（H.Takagi et al. Agric. Biol. C
hem., 53, 3099-3100(1989))で形質転換し、ｈ−ＥＧＦ
を分泌生産する形質転換体を得た。ここで得た菌株をペ
プトン４％、酵母エキス０．５％、ＭｇＳＯ4 ５ｍＭ、
ＭｎＳＯ4 １ｍＭ、ＦｅＳＯ4 ３６μＭ、グルコース２
％、寒天１．５％、ｐＨ７．２の寒天培地にて３０℃で
一昼夜培養した。これを前記と同じ組成の液体培地１Ｌ
に植菌して３０℃で一晩振とう培養を行ったものを前培
養液とした。
【００２５】３０Ｌジャーファーメンターに前培養と同
じ組成の生産培地１７Ｌ分注した後、１２０℃で１５分
間滅菌し、冷却後、前培養液２００ｍｌを接種し、攪拌
数２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、３０℃で３日間培養
を行った。
じ組成の生産培地１７Ｌ分注した後、１２０℃で１５分
間滅菌し、冷却後、前培養液２００ｍｌを接種し、攪拌
数２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、３０℃で３日間培養
を行った。
【００２６】培養物中のｈ−ＥＧＦ量をＨＰＬＣ（カラ
ム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バ
ッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2
Ｏ、０．１％ ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニア
グラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）で分析し、市販
ｈ−ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条
件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量
を求めた結果、培養物中に１．０ｇ／Ｌのｈ−ＥＧＦが
生産されていた。
ム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バ
ッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2
Ｏ、０．１％ ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニア
グラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）で分析し、市販
ｈ−ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条
件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量
を求めた結果、培養物中に１．０ｇ／Ｌのｈ−ＥＧＦが
生産されていた。
【００２７】培養物１７Ｌを０．４５μｍの濾過膜（ペ
リコンカセットシステム（ミリポア社製））を用いて菌
体を除去し、濾過画分にｈ−ＥＧＦを含む培養上清を回
収した。この培養上清のｐＨを、６Ｎ塩酸を用いて３．
８に調整し、ＨＷＰを含む夾雑タンパク質を沈殿させ、
前記と同じ濾過膜を用いて濾過を行ってｈ−ＥＧＦを濾
過画分に回収した。また、膜上の夾雑タンパク質を２０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）１Ｌで洗浄し、膜上に残
っていたｈ−ＥＧＦを濾過画分に回収した。
リコンカセットシステム（ミリポア社製））を用いて菌
体を除去し、濾過画分にｈ−ＥＧＦを含む培養上清を回
収した。この培養上清のｐＨを、６Ｎ塩酸を用いて３．
８に調整し、ＨＷＰを含む夾雑タンパク質を沈殿させ、
前記と同じ濾過膜を用いて濾過を行ってｈ−ＥＧＦを濾
過画分に回収した。また、膜上の夾雑タンパク質を２０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）１Ｌで洗浄し、膜上に残
っていたｈ−ＥＧＦを濾過画分に回収した。
【００２８】次に、ｈ−ＥＧＦを含む濾過画分にＮａＣ
ｌを１２％濃度になるように加え、ｈ−ＥＧＦを沈殿さ
せた。これを０．４５μｍの濾過膜（ペリコンカセット
システム（ミリポア社製））を用いて濾過し、ｈ−ＥＧ
Ｆを膜上に回収した。回収したｈ−ＥＧＦを１２％ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）１Ｌで
洗浄濾過を行い不純物を濾過液中に除去した後、膜上の
ｈ−ＥＧＦ画分を２００ｍｌまで濃縮した。こうして回
収したｈ−ＥＧＦを０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）で溶解した。
ｌを１２％濃度になるように加え、ｈ−ＥＧＦを沈殿さ
せた。これを０．４５μｍの濾過膜（ペリコンカセット
システム（ミリポア社製））を用いて濾過し、ｈ−ＥＧ
Ｆを膜上に回収した。回収したｈ−ＥＧＦを１２％ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）１Ｌで
洗浄濾過を行い不純物を濾過液中に除去した後、膜上の
ｈ−ＥＧＦ画分を２００ｍｌまで濃縮した。こうして回
収したｈ−ＥＧＦを０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．
０）で溶解した。
【００２９】このｈ−ＥＧＦ含有液を、分画分子量５，
０００の限外濾過膜（ペリコンカセットBiomax５（ミリ
ポア社製））を用い、限外濾過して脱塩を行った。５０
０ｍｌ程度まで濃縮後、塩類を完全に除くために、純水
１０Ｌを徐々に加えながら濾過した。最終的に回収した
ｈ−ＥＧＦの回収率および純度を求めた結果、培養物か
らのｈ−ＥＧＦの回収率は９０％でその純度は９５％で
あった。
０００の限外濾過膜（ペリコンカセットBiomax５（ミリ
ポア社製））を用い、限外濾過して脱塩を行った。５０
０ｍｌ程度まで濃縮後、塩類を完全に除くために、純水
１０Ｌを徐々に加えながら濾過した。最終的に回収した
ｈ−ＥＧＦの回収率および純度を求めた結果、培養物か
らのｈ−ＥＧＦの回収率は９０％でその純度は９５％で
あった。
【００３０】
【実施例２】配列番号７に示すＥＧＦ活性を有するタン
パク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を保有するプ
ラスミドｐＨＴ−ＡＢＣ（特願平８−１２３９７０）
で、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０８９）をエレクトロポレーション法（（H.Takagi e
t al. Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989))によ
って形質転換し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＢＣ
を分泌生産する形質転換体を得た。
パク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を保有するプ
ラスミドｐＨＴ−ＡＢＣ（特願平８−１２３９７０）
で、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０８９）をエレクトロポレーション法（（H.Takagi e
t al. Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989))によ
って形質転換し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＢＣ
を分泌生産する形質転換体を得た。
【００３１】ここで得た菌株を、ペプトン４％、酵母エ
キス０．５％、ＭｇＳＯ4 ５ｍＭ、ＭｎＳＯ4 １ｍＭ、
ＦｅＳＯ4 ３６μＭ、グルコース２％、寒天１．５％、
ｐＨ７．２の寒天培地にて３０℃で一昼夜培養した。こ
れを前記と同じ組成の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ
三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌し、冷
却後に接種して３０℃で一晩振とう培養を行ったものを
前培養液とした。
キス０．５％、ＭｇＳＯ4 ５ｍＭ、ＭｎＳＯ4 １ｍＭ、
ＦｅＳＯ4 ３６μＭ、グルコース２％、寒天１．５％、
ｐＨ７．２の寒天培地にて３０℃で一昼夜培養した。こ
れを前記と同じ組成の液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ
三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌し、冷
却後に接種して３０℃で一晩振とう培養を行ったものを
前培養液とした。
【００３２】２Ｌジャーファーメンター２本各々に前培
養と同じ組成の生産培地１Ｌ分注した後、１２０℃で１
５分間滅菌し、冷却後、前培養液２０ｍｌを接種し、攪
拌数２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、３０℃で３日間培
養を行った。
養と同じ組成の生産培地１Ｌ分注した後、１２０℃で１
５分間滅菌し、冷却後、前培養液２０ｍｌを接種し、攪
拌数２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、３０℃で３日間培
養を行った。
【００３３】培養物中のタンパク質ＡＢＣの量をＨＰＬ
Ｃ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０
ｍｍ、バッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）／Ｈ2Ｏ、０．１％ ＴＦＡ／５０％アセトニトリ
ル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）で分
析し、市販ｈ−ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品
として同条件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較
して生産量を推定した結果、培養物中に約０．８ｇ／Ｌ
のタンパク質が生産されていた。
Ｃ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０
ｍｍ、バッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）／Ｈ2Ｏ、０．１％ ＴＦＡ／５０％アセトニトリ
ル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）で分
析し、市販ｈ−ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品
として同条件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較
して生産量を推定した結果、培養物中に約０．８ｇ／Ｌ
のタンパク質が生産されていた。
【００３４】この培養物のｐＨを６Ｎ塩酸を用いて３．
８に調整し、ＨＷＰを含む夾雑タンパク質を沈殿させ、
濾過膜（ミニタンカセットシステム（ミリポア社製））
を用いて濾過を行ってタンパク質ＡＢＣを濾過画分に回
収した。また膜上の夾雑タンパク質及び菌体を２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）５００ｍｌで洗浄し、更に、
膜上に残っていた少量のタンパク質ＡＢＣを濾過画分に
回収した。
８に調整し、ＨＷＰを含む夾雑タンパク質を沈殿させ、
濾過膜（ミニタンカセットシステム（ミリポア社製））
を用いて濾過を行ってタンパク質ＡＢＣを濾過画分に回
収した。また膜上の夾雑タンパク質及び菌体を２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）５００ｍｌで洗浄し、更に、
膜上に残っていた少量のタンパク質ＡＢＣを濾過画分に
回収した。
【００３５】次に、ｈ−ＥＧＦを含む濾過画分に硫酸ア
ンモニウムを１５％濃度になるように加え、ｈ−ＥＧＦ
を沈殿させた。これを０．４５μｍの濾過膜（ミニタン
カセットシステム（ミリポア社製））を用いて濾過し、
タンパク質ＡＢＣを膜上に回収した。回収したタンパク
質ＡＢＣを、１５％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ３．８）５００ｍｌで洗浄し、不純物を
除去した後、膜上のタンパク質ＡＢＣ画分を２００ｍｌ
まで濃縮した。こうして回収したタンパク質ＡＢＣを
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した。
ンモニウムを１５％濃度になるように加え、ｈ−ＥＧＦ
を沈殿させた。これを０．４５μｍの濾過膜（ミニタン
カセットシステム（ミリポア社製））を用いて濾過し、
タンパク質ＡＢＣを膜上に回収した。回収したタンパク
質ＡＢＣを、１５％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ３．８）５００ｍｌで洗浄し、不純物を
除去した後、膜上のタンパク質ＡＢＣ画分を２００ｍｌ
まで濃縮した。こうして回収したタンパク質ＡＢＣを
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した。
【００３６】このタンパク質ＡＢＣ含有液を、分画分子
量５，０００の限外濾過膜（ペリコンカセットBiomax５
（ミリポア社製））を用いて限外濾過して脱塩を行っ
た。５００ｍｌ程度まで濃縮後、塩類を完全に除くため
に、純水１０Ｌを徐々に加えながら濾過した。最終的に
回収したＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＢＣの純度お
よび回収率を求めた結果、培養物からのＥＧＦ活性を有
するタンパク質ＡＢＣの回収率は推測値８５％でその純
度は９３％であった。
量５，０００の限外濾過膜（ペリコンカセットBiomax５
（ミリポア社製））を用いて限外濾過して脱塩を行っ
た。５００ｍｌ程度まで濃縮後、塩類を完全に除くため
に、純水１０Ｌを徐々に加えながら濾過した。最終的に
回収したＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＢＣの純度お
よび回収率を求めた結果、培養物からのＥＧＦ活性を有
するタンパク質ＡＢＣの回収率は推測値８５％でその純
度は９３％であった。
【００３７】
【発明の効果】本発明は、培養物からＥＧＦ活性を有す
るタンパク質を非常に簡便且つ効率的に回収精製する方
法を提供するものであって、特に工業的規模で該タンパ
ク質を回収精製するのに有効である。
るタンパク質を非常に簡便且つ効率的に回収精製する方
法を提供するものであって、特に工業的規模で該タンパ
ク質を回収精製するのに有効である。
【００３８】
【配列表】ヒトＥＧＦ、マウスＥＧＦ、ラットＥＧＦの
アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１、２、３に示
し、４種の関連タンパク質を、それぞれ、配列番号４、
５、６、７に示す。下記表１〜７に、配列番号１〜７で
示される各配列を示す。
アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１、２、３に示
し、４種の関連タンパク質を、それぞれ、配列番号４、
５、６、７に示す。下記表１〜７に、配列番号１〜７で
示される各配列を示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
【００４５】
【表７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08）
Claims (4)
- 【請求項１】 バチルス・ブレビスを宿主菌として培養
し、生産された上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク
質を含有する培養物について、 （ａ）そのｐＨを調整して、培養物に含まれる夾雑タン
パク質を特異的に沈殿させ、この沈殿タンパク質及び菌
体を除去して清澄画分を得る工程； （ｂ）得られた清澄画分に塩を加えて、上皮細胞増殖因
子活性を有するタンパク質を沈殿させ、この沈殿したタ
ンパク質画分を回収し、共存していた夾雑成分を分離除
去する工程；の各工程からなること、を特徴とする上皮
細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法。 - 【請求項２】 工程（ａ）において、ｐＨを３．０〜
４．５、更に好適には３．５〜３．９に調整すること、
を特徴とする請求項１に記載の回収精製法。 - 【請求項３】 工程（ｂ）において、塩としては、塩化
ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン
酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウムか
ら選ばれる少なくともひとつを使用し、添加濃度を９％
以上、更に好適には１２％以上とすること、を特徴とす
る請求項１又は２に記載の回収精製法。 - 【請求項４】 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク
質が、配列番号１に示したヒト上皮細胞増殖因子、配列
番号２に示したマウス上皮細胞増殖因子、配列番号３に
示したラット上皮細胞増殖因子または配列番号４〜７で
示した何れかのタンパク質の少なくともひとつであるこ
と、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の
回収精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26920697A JP3737252B2 (ja) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26920697A JP3737252B2 (ja) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189590A true JPH1189590A (ja) | 1999-04-06 |
| JP3737252B2 JP3737252B2 (ja) | 2006-01-18 |
Family
ID=17469158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26920697A Expired - Fee Related JP3737252B2 (ja) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3737252B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018164195A1 (ja) * | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 精製されたタンパク質を製造する方法 |
-
1997
- 1997-09-17 JP JP26920697A patent/JP3737252B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018164195A1 (ja) * | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 精製されたタンパク質を製造する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3737252B2 (ja) | 2006-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5951490B2 (ja) | 非複合ボツリヌス神経毒素を精製するための方法およびシステム | |
| EP0691982B2 (en) | Separation of proteins | |
| JPS63501471A (ja) | インタ−フェロンの精製方法 | |
| CN112746091B (zh) | 一种能提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备与应用 | |
| KR101025617B1 (ko) | 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법 | |
| JPH06192296A (ja) | 治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。 | |
| JP3737252B2 (ja) | 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法 | |
| JP3218193B2 (ja) | ペプチドまたは蛋白質を含む生物基質の限外濾過のための方法 | |
| JP2001525672A (ja) | 組換えタンパク質の収率を増大させるための方法 | |
| JP3036009B2 (ja) | ピロロキノリンキノン類の回収・精製方法 | |
| JPH04341193A (ja) | ペプチド又はその塩の取得方法 | |
| TW201723174A (zh) | 重組蛋白質的製造方法 | |
| JPH1042892A (ja) | タンパク質の回収精製法 | |
| JPS60133887A (ja) | エラスタ−ゼの製法 | |
| JP2927927B2 (ja) | 分泌蛋白質のリフォールディング法 | |
| JPH0244510B2 (ja) | ||
| JPH1066572A (ja) | 高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法 | |
| EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
| JPH0413698A (ja) | 生理活性ペプチド | |
| JPH0361440B2 (ja) | ||
| JP4564791B2 (ja) | スタテリン融合タンパク質 | |
| WO2000034312A1 (en) | Method of separating basic peptide or basic protein | |
| JP2899402B2 (ja) | 動物細胞増殖促進剤 | |
| JPH02276578A (ja) | ネオプルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター並びにネオプルラナーゼ | |
| KR0140263B1 (ko) | 재조합 인간 인터페론 베타의 정제방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041214 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050329 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050524 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050712 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050905 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051025 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051026 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |