JPH11500408A - 改良型▲ｖｉｉ▼因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 凝血カスケードを有効に妨害する化合物を製造するためにVII因子の触媒活性部位を改良する。この改良はVIIａ因子を、血漿Ｘ又はIX因子を実質的に活性化できないものにする。この改良型VII因子の薬理組成物は様々な凝固関連障害を処置するのに利用される。

Description

【発明の詳細な説明】 改良型VII因子 関連出願 本発明は、それぞれ引用することで本明細書に組入れる、1994年５月23日提出 のPCT/US94/05779号の一部継続出願である1994年10月24日提出出願第08/327,690 号、並びにPCT/US92/01636号及び放棄され、そして現在出願08/164,666号となっ た1991年２月28日提出の出願07/662,920号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は抗凝固剤として有用なタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は 血液凝固及び組織因子を阻害するVII因子の改良型に関する。 発明の背景 血液凝固は、フィブリン凝塊を最終的にもたらす様々な血液成分又は因子の複 雑な相互作用より成る過程である。一般に、凝固「カスケード」と呼ばれている ものに関与する血液成分はプロ酵素又はチモゲン即ち、それ自体が凝固因子であ るアクチベーターの作用によりタンパク質分解酵素へと変換される酵素的に不活 性なタンパク質である。かかる変換を経た凝固因子は一般的に「活性因子」と呼 ばれており、そして小文字「ａ」の接尾辞の付加により命名されている（例えば VIIａ因子）。 活性化Ｘ因子（「Ｘａ」）はプロトロンビンをトロンビンに変換せしめるのに 必要であり、このトロンビンは次にフィブリン凝塊を 形成する最終段階としてフィブリノーゲンをフィブリンに変換せしめる。Ｘ因子 の活性化を促進する２つの系又は経路がある。「内因性経路」とは、血漿の中に のみ存在している因子の利用を通じてトロンビン形成をもたらす反応を意味する 。一連のプロテアーゼ媒介型活性化は最終的にIXａ因子をもたらし、それはVIII ａ因子と協力して、Ｘ因子をＸａ因子へと解裂せしめる。同じタンパク質分解が VIIａ因子及びその補因子である組織因子により、血液凝固の「外因性経路」に おいて及ぼされる。組織因子は膜結合型タンパク質であり、そして通常は血漿の 中で循環していない。しかしながら、血管の崩壊により、それはVIIａ因子と複 合してＸ因子の活性化又はIX因子の活性化をCa⁺⁺及びリン脂質の存在下で触媒す る(Nemerson and Gentry, Biochem．25：4020−4033(1986))。これら２つの凝固 経路の止血における相対的な重要性は明らかにされていないが、近年VII因子及 び組織因子は血液凝固の調節において中枢的な役割を果たしていることが見い出 せた。 VII因子は一本鎖チモゲンとして血液の中で循環する微量血漿糖タンパク質で ある。チモゲンは触媒的には不活性である(Williamsら，J ．Biol．Chem. 264：7 536−7543(1989)；Rao ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA． 85 ：6687-6691(198 8))。一本鎖VII因子はＸａ因子、VIIａ因子、IXａ因子又はトロンビンによりイ ンビトロにおいて二本鎖のVIIａ因子へと変換されうる。Ｘａ因子はVII因子の主 要生理学的アクチベーターであると信じられている。止血に関与するその他のい くつかの血漿タンパク質と同様に、VII因子はその活性に関してビタミンＫに依 存している。その活性はタンパク質のアミノ末端において集合している複数のグ ルタミン酸のγ−カルボキシル化にとって必要である。このようなγ−カルボキ シル化グルタミン酸はVII因子とリン脂質との金属関与相互作用にとって必要で ある。 チモゲンVII因子の活性化二本鎖分子に至る変換はこの分子の中央にほぼ位置 している内部ペプチド結合の解裂により起こる。ヒトVII因子において、その活 性化解裂部位はArg₁₅₂−Ile₁₅₃である（Hagen ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 83：2412−2416（1986）；Thimら，Biochem. 27：7785−7793（1988）；共に 引用することで本明細書に組入れる）。ウシのVII因子は類似のArg₁₅₂−Ile₁₅₃ 結合においての解裂により活性化される(Takeyaら，J ．Biol．Chem．263：14868 −14877，1988)。組織因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下において 、この二本鎖VIIａ因子は直ちにＸ因子又はIX因子を限定されたタンパク質分解 により活性化する。 患者における凝血カスケードを選択的に阻止することが往々にして必要とされ る。抗凝固剤、例えばヘパリン、クマリン、クマリン誘導体、インダンジオン誘 導体又はその他の剤が、例えば腎臓透析の最中に、又は深遠静脈血栓、散在性血 管内凝固(DIC)、及びその他の数多くの医学的障害のホストの処置のために利用 されうる。例えば、ヘパリン処置又はクエン酸イオンによる体外処置（米国特許 第4,500,309 号）が、処置の際の凝固を防ぐために透析において利用されうる。 ヘパリンは手術を受けている患者における深遠静脈血栓を防ぐのにも利用されて いる。 しかしながら、ヘパリン及び抗凝固剤による処置は望ましくない副作用を有す る。有用な抗凝固剤は一般に凝塊部位において特異的に作用するよりも、全身に わたって作用する。ヘパリンは例えば大量出血をもたらしうる。更に、約80分の 半減期により、ヘパリンは血液から迅速に消失し、頻繁な投与を必要とする。ヘ パリンは抗トロンビンIII（ATIII）にとっての補因子として働くため、そしてAT IIIはDIC 処置においては迅速に枯渇するため、適正なヘパリン投与量を維持す ることは往々にして難しく、ATIII及びヘパリンレベルの連 続モニターを必要とする。また、ATIIIの枯渇が極端である場合、ヘパリンは有 効でない。更に、ヘパリンの長期利用は血小板の凝集を高めそして血小板計測数 を減らすこともあり、そして骨粗しょう症の発症に関与する。インダンジオン誘 導体も毒性副作用を有する。 上記に簡単に説明した抗凝固剤の他に、いくつかの天然タンパク質が抗凝固活 性を有することが見い出されている。例えば、Reutelingsperger（米国特許第 4 ,736,018号）はウシの大動脈及びヒトの臍静動脈から抗凝固性タンパク質を単離 した。Makiら（米国特許第 4,732,891号）はヒト胎盤由来の抗凝固性タンパク質 を開示している。更に、ATIIIは治療用抗凝固剤として提案されている（Schippe rら，Lancet １（8069）； 854−856(1978)；Jordan，米国特許第4,386,025 号 ；Bockら，米国特許第 4,517,294号）。 脈管壁における平滑筋細胞（SMCs）の増殖は、血管の再構成後の又はその他の 血管傷害に反応して、アテローム症における血管損傷の形成において重要な現象 である。例えば、アテローム症の処置はしばしば、血管形成術、動脈血管内膜切 除術もしくは整復アテローム切除術による閉塞血管の清掃又は、バイパス移植が 含まれ、それらの外科処置においては、アテローム症プラークをカテーテルによ り圧搾もしくは除去する（血管形成術）、切開を介して動脈壁から取り除く（動 脈血管内膜切除術）、又は天然もしくは合成移植体でバイパスを施している。こ れらの手順は血管の内皮を除去してしまい、下にある内膜を乱し、そして内側の SMCsを死に致らしめる。この傷害には内側SMC 増殖及び内膜へと進行し続け、こ れは傷害を受けて最初の数週間から６ケ月に至るまでに特徴的に生じ、そして上 をかぶさる内皮層が再樹立されたときに止まる。ヒトにおいては、このような損 傷は約20％の細胞と80％の細胞外マトリックスとより構成される。 血管形成術、動脈血管内膜切除術又はバイパス移植により処置した患者の約30 ％以上において、内膜における血栓及び／又はSMC 増殖は脈管の再閉塞を起こし 、従って再構成外科は失敗に至る。術後の脈管の閉塞は再狭窄（restenosis）と して知られている。 比較的低投与量において投与でき、そして伝統的な抗凝固性組成物に係る望ま れない副作用をもたらさない抗凝固活性を有する改良組成物が未だ当業界におい て要望されている。本発明は損傷部位において特異的に作用する抗凝固剤を提供 することによりこの要望を満足せしめ、そして更には関連の利点を提供する。 発明の概要 抗凝固活性を有する改良型VII因子を含んで成る新規組成物を提供する。この 改良型VII因子組成物は組織因子も阻害する。このVII因子配列は少なくとも１個 のアミノ酸改質を有し、ここでその改質は血漿Ｘ又はIX因子の活性化を触媒する 活性化VII因子の能力を実質的に低め、それ故凝塊活性を阻害できるように選ば れる。この新規のVII因子は少なくとも１個のアミノ酸置換により改質された活 性部位を有し、そしてその改良型は組織因子と結合することができる。この改良 型VII因子組成物は一般に実質的に純粋な形態である。 本発明の組成物は薬理組成物へと配合せしめたときに患者の処置のための方法 において極めて有用であり、ここでそれらは凝固関連症状を処置するために様々 な疾患状態に苦しむ個体に付与せしめることができる。組織因子に結合できるが 、凝塊カスケードにおけるその他の因子の活性化を触媒する実質的に低減された 能力を有するかかる改質型VII因子分子は、その他の抗凝固剤と比べたとき、長 めの血漿半減期を有し、それ故対応の長めの抗凝固活性期間を有しうる。課題の 組成物にとっての医学的用途には、抗凝固剤で一般的に 処置されるもの、例えば深遠静脈血栓、肺塞栓症、発作、散在性血管内凝固(DIC )グラム陰性内毒素血症の関与する肺及び腎臓におけるフィブリン沈着、並びに 心筋梗塞が挙げられる。この組成物はバルーン血管形成術、動脈血管内膜切除術 、整復アテローム切除術、ステント設置、レーザー治療もしくはロトブレーショ ンにより生ずる損傷の如き機械的血管損傷に引き続いて起こる、又は血管移植、 ステント、バイパス移植もしくは器官移植に二次的に起こる血管再狭窄を阻害す るのに利用できうる。かくして、かかる組成物は血小板沈着並びに関連の障害を 阻止するのに利用できうる。それ故に、凝固、血管再狭窄又は血小板沈着を阻止 する方法は、例えば改良型VII因子、例えばSer₃₄₄，Asp₂₄₂及びHis₁₉₃の触媒性 トリアドにおいて少なくとも１個のアミノ酸置換を有するものを、凝固、血管狭 窄又は血小板沈着のそれぞれを阻害するのに有効な量において含んで成る組成物 を患者に投与することを含んで成る。この方法はまた、個体の冠状動脈の急性閉 塞の処置において有用であり、その処置はDEGR−VII因子を含む改質VII因子を組 織プラスミノゲンアクチベーター又はストレプトキナーゼと一緒に投与すること を含んで成り、そしてtPA 誘導型血栓溶解を促進できる。 一般に、ヒトへの投与にとって、この薬理組成物は改良型ヒトVII因子タンパ ク質並びに薬理学的に許容される担体及びバッファーを含んで成るであろう。 ヒト及びウシVII因子の好適な態様において、その活性部位の残基Ser₃₄₄は改 質、即ちGly，Met，Thr 又はより好ましくはAla により置換されている。かかる 置換は独立になされているか、又はHis₁₉₃及びAsp₂₄₂を含む触媒性トリアドにお けるその他の部位においての（１又は複数の）置換との組合せにおいてなされて いてよい。 別の観点において、本発明は、ビタミンＫ依存性血漿タンパク質 のプレープロペプチド及びgla ドメイン並びにgla ドメインレスVII因子タンパ ク質をそれぞれコードする２本の作動連結した配列コード領域を含んで成るポリ ヌクレオチド分子に関連し、ここでその発現を経て、このポリヌクレオチドは血 漿Ｘ又はIX因子を有意に活性化せず、且つ組織因子に結合することのできる改良 型VII因子分子をコードする。このポリヌクレオチドにより発現される改良型VII 因子分子は生物学的に活性な抗凝固剤であり、即ち、それは凝固カスケードを阻 害でき、それ故フィブリン沈着物又は凝塊の形成を阻害できる。この改良型VII 因子を発現させるため、このポリヌクレオチド分子を哺乳動物細胞系、例えばBH K，BHK 570又は 293細胞系にトランスフェクトさせる。 図面の簡単な説明 図１はSer₃₄₄→Ala 改良型VII因子DNA 配列のための発現ベクターの構築を示 している。使用した記号は以下の通りである：０−１、アデノウィルス５由来の ０−１地図単位配列；E．SV 40エンハンサー；MLP、アデノウィルス２主要後期 プロモーター；SS、一式のスプライス部位；そしてPA，SV 40 由来のポリアデニ ル化シグナル（遅い順〔late orientation〕）。 図２は、食塩水処置したコントロールと比較した、動脈血管内膜切除術を施し たヒヒの大動脈に対する血栓形成（血小板沈着）に及ぼすDEGR−VIIａ因子のボ ーラス注射の効果を示す。動脈は60分間にわたり測定した。DEGR−VIIａ因子は この急性血管損傷の霊長類モデルの血小板に富む血栓の発生を有意に阻止した。 図３はヒヒの平滑筋細胞を、ＦVIIａ（白四角）とその濃度を上昇させながら 又は一定量のＦVIIａ（５nM）の存在下でDEGR−ＦVIIａ（黒四角）とその濃度を 上昇させながらインキュベートしたときに得 られた結果を示す。Fxの活性化のレベルは発色基質Ｓ−2222を用いてその後決定 した。データーは５nMのＦVIIａのみの存在下で生ずる活性のパーセンテージと してのアミド分解活性として示す。 図４は、コントロール動物と比較した、頸動脈血管内膜切除術及び７〜30日間 にわたるDEGR−VIIａ因子による処置を経たヒヒの内膜面積を示す。 図５はバルーン損傷及びDEGR−VIIａ因子による処置を経たヒヒ大腿動脈の内 膜面積、対、内膜＋中膜面積の比を示し、ここでコントロールグループは５本の 血管を含み、７日目の処置では11本の血管を調べ、そして30日目の処置では２本 の血管を調べた（ｎ＝調べた血管の本数）。 特定態様の詳細 抗凝固活性を有する新規の改良型VII因子を本発明により提供する。この改良 型VII因子はチモゲンの形態（即ち、一本鎖分子）であるか、又はその活性部位 において解裂されていてよい。従って、「改良型VII因子」とは、組織因子に結 合し、そしてIXａに至るIX因子の及びＸａにＸ因子の活性化を阻害する改良型VI I因子及び改良型VIIａ因子分子をいう。この改良型VII因子の組成物は様々な哺 乳類、特にヒトに凝固カスケードを阻害するために投与するのに適する。改良型 VII因子は他の抗凝固性化合物と一緒に、又はそれらの代わりに患者に投与して よい。 VII因子は凝固カスケード、特に外因性経路に関与するものにおいて重要な役 割を果たす。不活性の一本鎖チモゲンタンパク質として循環血漿の中に存在して いるVIIａ因子が組織因子及びカルシウムイオンとの組合せで活性化されると、 Ｘ因子をＸａ因子に活性化し、そしてIX因子をIXａ因子に活性化し、フィブリン 凝塊の最終的形成 が伴う。 本発明は、VIIａ因子によりＸ及びIX因子の活性化を阻止又はそうでなければ 阻害することによりこの凝固カスケードにおけるこの一連の現象を阻害する能力 を提供する。本発明のVII因子タンパク質のVIIａ因子の触媒活性を低め、同時に その分子が組織因子に対する結合能力を保持するように改質された触媒性部位を 有する。この改良型VII因子分子は組織因子に対する結合に関して天然のVII因子 及び／又はVIIａ因子と競合する。その結果、Ｘ及びIX因子の活性化は阻害され る。 本発明の一の観点において、VIIａ因子の触媒活性は触媒中枢又はトリアドの 化学的誘導化により阻害される。誘導化はVII因子を不可逆性インヒビター、例 えば有機燐化合物、スルホニルフルオリド、ペプチドハロメチルケトン又はアザ ペプチドとの反応により、又は例えばアシル化により成し遂げられうる。好適な ペプチドハロメチルケトンにはPPACK（D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン；米国 特許第 4,318,904号；引用することで本明細書に組入れる）、D-Phe-Phe-Arg 及 びPhe-Phe-Arg クロロメチルケトン；並びにDEGRcK（ダンシル−Glu-Gly-Arg ク ロロメチルケトン）が含まれる。 別の観点において、VIIａ因子の触媒活性はアミノ酸を置換、挿入又は欠失す ることによっても阻害できる。好適な態様において、アミノ酸置換は、VIIａ因 子触媒性部位に寄与するアミノ酸を含む領域として本明細書において定義するVI I因子触媒性トリアドのアミノ酸配列において施す。触媒性トリアドにおける置 換、挿入又は欠失は、この触媒性部位を構成するアミノ酸、又はその隣りに施す 。ヒト及びウシのVII因子タンパク質において、触媒性「トリアド」を構成する アミノ酸はSer₃₄₄，Asp₂₄₂及びHis₁₉₃である（添数字は配列における位置を表示 している）。その他の哺乳類に由来するVII因子に おける触媒性部位は現状有用な技術、とりわけタンパク質単離及びアミノ酸配列 分析を利用して決定されうる。触媒性部位は配列を他のセリンプロテアーゼ、特 にキモトリプシンであってその活性部位が既に決定されているもの（Siglerら，J ．Mol．Biol .，35 : 143−164(1968)；引用することで本明細書に組入れる）と 整合させ、その整合から類似である活性部位残基を決定することによっても決定 することができうる。 アミノ酸の置換、挿入又は欠失はＸ及び／又はIX因子のVIIａ因子による活性 化を阻止又はそうでなければ阻害するように施す。しかしながら、VII因子は凝 固カスケードにおける組織因子に対する結合について真性のVII因子及び／又はV IIａ因子と競合する能力も保持するように改質されているべきである。かかる競 合は例えば本明細書に記載の凝塊アッセイにより、又は例えばヒトの膀胱癌細胞 系Ｊ28の如くの細胞表層組織因子を有する細胞系（Sakai ら，J ．Biol．Chem. 2 64：9980−9988(1989)：引用することで本明細書に組入れる）を用いる競合結合 アッセイにより、簡単に決定できうる。 VII因子における触媒性部位を構成するアミノ酸、例えばヒト及びウシのVII因 子におけるSer₃₄₄，Asp₂₄₂及びHis₁₉₃は置換又は欠失のいづれかを行ってよい。 本発明においては、１個のアミノ酸のみを変え、それ故分子の抗原性の増強する 傾向を最少限にする、又は組織因子に結合するその能力を阻害する傾向を最少限 にすることが好ましいが、２個以上のアミノ酸の変化（置換、付加又は欠失）を 施してもよく、そして置換、付加及び欠失の組合せを施してもよい。ヒト及びウ シのVII因子にとっての好適な態様において、Ser₃₄₄はAla により置換すること が好ましいが、Gly，Met，Thr 又はその他のアミノ酸で置換してもよい。Asp を Glu に置き換え、そしてHis をLys 又はArg で置き換えることが好ましい。一般 に、置換は三次タ ンパク質構造の破綻を最少限にするように選ぶ。本明細書に引用することで組入 れるDayhoff らのモデル(Atlas of Protein Structure 1978 ，Nat'l Biomed．R es．Found.，Washington，D.C.)はその他のアミノ酸置換を選ぶうえでの指針と して用いられうる。ヒト、ウシ又はその他の種の適当なVII因子配列の触媒性部 位において上記の残基変化を導入し、そして得られるタンパク質を本明細書に記 載の通りにして所望の触媒活性阻害レベルについて及びその結果としての抗凝固 活性について試験することができうる。改良型VII因子にとって、この触媒活性 は実質的に阻害され、対応の種の野生型VII因子の触媒活性の一般に約５％未満 、より好ましくは約１％未満となるであろう。 本発明のタンパク質は組換DNA 技術の利用を介して製造することができうる。 一般に、クローンした野生型VII因子DNA 配列は所望のタンパク質をコードする ように改良されている。この改良型配列を次に発現ベクターに挿入し、それを次 に宿主細胞の中に形質転換又はトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培養 哺乳動物細胞が宿主細胞として好ましい。ヒトVII因子にとっての完全なヌクレ オチド及びアミノ配列が公知である。引用することで本明細書に組入れる米国特 許第 4,784,950号を参照のこと。それにおいては、組換ヒトVII因子のクローニ ング及び発現が記載されている。ウシのVII因子配列は、引用することで本明細 書に組入れるTnkeyaらのJ ．Biol．Chem. 263 : 14868−14872(1988)に記載され ている。 アミノ酸配列の改変は様々な技術によって成し遂げられうる。DNA 配列の改良 は部位特異的突然変異誘発によって施してよい。部位特異的突然変異誘発にとっ ての技術は当業界に公知であり、そして例えばZoller and Smith(DNA 3 : 479 −488，1984)に記載されている。即ち、VII因子のヌクレオチド及びアミノ酸配 列を利用するこ とにより、選り抜きの改変を導入することができうる。 本発明に従って改良されたVII因子には、そのアミノ末端領域（gla ドメイン ）がビタミンＫ依存性血漿タンパク質IX因子、Ｘ因子、プロトロンビン、プロテ インＣ、プロテインＳ又はプロテインＺのいづれかのgla ドメインで置換されて いるものが含まれる。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のgla ドメインは、ガン マーカルボキシグルタミン酸残基の存在を特徴とし、そして一般に長さが約30〜 約40個のアミノ酸であり、Ｃ末端は関連遺伝子におけるエクソン−イントロン境 界の位置に対応している。異種gla ドメインを有するVII因子の製造のための方 法は引用することで本明細書に組入れる米国特許第 4,784,950号に開示されてい る。 本発明において使用するためのDNA 配列は一般に、宿主細胞による適正な後翻 訳プロセス（例えば、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化）及び分泌を 得るため、VII因子タンパク質のアミノ末端にあるプレープロペプチドをコード するであろう。このプレープロペプチドはVII因子又はその他のビタミンＫ依存 性血漿タンパク質、例えばIX因子、Ｘ因子、プロトロンビン、プロテインＣもし くはプロテインＳのそれであってよい。当業者にとって明らかな通り、この改良 型VII因子のアミノ酸配列において追加の改質を施してよく、この場合その改質 は抗凝固剤として働くそのタンパク質の能力を有意に損わないものとする。例え ば、触媒性トリアドにおいて改質されたVII因子はチモゲンVII因子からその活性 化された二本鎖形態に至る変換を阻害するようにその活性化解裂部位において改 質されていてもよい（これは一般に、引用することで本明細書に組入れる米国特 許第 5,288,629号に記載されている）。 本発明の実施において利用する発現ベクターはクローン化遺伝子又はcDNAの転 写を指令できるプロモーターを含んで成るであろう。 培養哺乳動物細胞において利用するために好適なプロモーターにはウィルス性プ ロモーター及び細胞性プロモーターが含まれる。ウィルス性プロモーターにはSV 40 プロモーター(Subramani ら，Mol ．Cell．Biol. 1 : 854−864，1981)及びC MV プロモーター(Boshart らCell 41 ：521 −530，1985)が含まれる。特に好適 なウィルス性プロモーターはアデノウィルス由来の主要後期プロモーターである (Kanfman and Sharp, Mol ．Cell．Biol．2 : 1304−1319，1982)。細胞性プロモ ーターにはマウスカッパー遺伝子プロモーター（Bergman ら，Proc ．Natl．Acad ．Sci．USA 81 : 7041−7045，1983）及びマウスＶ_Hプロモーター（Loh ら，Cel l 33 : 85−73，1983）が含まれる。特に好適な細胞性プロモーターはマウスの メタロチオネイン−Ｉプロモーターである(Palmiterら，Science 222 : 809 −8 14，1983)。発現ベクターは、プロモーターの下流、且つVII因子配列自体にとっ ての挿入部位の上流に位置する一式のRNA スプライス部位も含みうる。好適なRN A スプライス部位はアデノウィルス及び／又はイムノグロブリン遺伝子から獲得 できうる。発現ベクターの中に更に含まれているのは挿入部位の下流に位置する ポリアデニル化シグナルである。特に好適なポリアデニル化シグナルには、SV 4 0 由来の初期もしくは後期ポリアデニル化シグナル（Kanfman and Sharp, 前掲 ）、アデノウィルス５Elb 領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモ ン遺伝子ターミネーター（DeNotoら，Nuc ．Acids Res，9 : 3719−3730，1981） 又はヒトVII因子遺伝子もしくはウシVII因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナ ルが含まれる。この発現ベクターは更に非コードウィルスリーダー配列、例えば このプロモーターとこのRNA スプライス部位との間に位置するアデノウィルス２ 三分節系リーダー；及びエンハンサー配列、例えばSV 40 エンハンサーを含みう る。 クローン化DNA 配列を培養哺乳動物細胞に、例えばリン酸カルシウム媒介トラ ンスフェクションにより(Wiglerら，Cell 14 : 725−732，1978 ; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 ：603 −616，1981 ; Graham and Van der Eb, Virology 5201 : 456 −467，1973)又はエレクトロポレーションにより（N eumann ら，EMBO J ．1 : 841 −845，1982)導入する。外生DNA を発現する細胞 を同定及び選別するため、選択性表現型（選択マーカー）を授ける遺伝子を一般 に課題の遺伝子又はcDNAと一緒に細胞に導入する。好適な選択マーカーにはネオ マイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキセートの如くの薬剤に対する耐性を授 ける遺伝子が含まれる。この選択マーカーは増幅性選択マーカーであってよい。 好適な増幅性選択マーカーはジヒドロフォレートリダクターゼ（DHFR）配列であ る。選択マーカーはThilly（Mammalian Cell Technology, Butterworth Publish ers，Stoneham，MA ; 引用することで本明細書に組入れる）により論じられてい る。選択マーカーの選択は当業者においてよく知られている。 選択マーカーは課題の遺伝子と同時に独立のプラスミド上で細胞の中に導入す るか、又はそれらは同一のプラスミド上で導入することができうる。同一のプラ スミド上のとき、選択マーカー及び課題の遺伝子は異なるプロモーター又は同一 のプロモーターのコントロール下にあってよく、後者の配備は二重シストロン系 情報をもたらす（例えば、Levinson and Simonsen，米国特許第 4,713,339号） 。「キャリヤーDNA」として知られる追加のDNA を、細胞に導入する混合物に加 えることが好都合であることもある。 細胞がDNA を取り込んだ後、それらを適当な増殖培地の中で一般に１〜２日間 増殖させて課題の遺伝子の発現を開始させる。本明細書で用いている「適当な増 殖培地」は栄養物並びに細胞の増殖及び 改良型VII因子遺伝子の発現にとって必要とされるその他の成分を含む培地を意 味する。培地は一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、 リン脂質、タンパク質及び増殖因子を含む。ガンマーカルボキシル化改良型VII 因子の製造のためには、その培地はビタミンＫを、好ましくは約 0.1μｇ／ml〜 約５μｇ／mlの濃度において含むであろう。次いで安定な状態で選択マーカーを 発現する細胞の増殖のために薬剤選択を利用する。増殖性選択マーカーでトラン スフェクトされた細胞にとっては、その薬剤濃度は、増加したコピー数のクロー ン化配列を選択するため、それ故発現レベルを高めるために増大させてよい。安 定的にトランスフェクトされた細胞のクローンを次に改良型VII因子の発現につ いてスクリーンにかける。 本発明における使用にとって好適な細胞系には COS−１(ATCC CRL 1650)、ベ ビーハムスター腎臓(BHK)及び293（ATCC CRL 1573；Grahamら，J ．Gen．Virol. 36 : 59−72，1977）細胞系が含まれる。好適なBHK 細胞系はtk^- ts 13 BHK 細 胞系である（Waechter and Baserga，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 79 : 1106− 1110，1982，引用することで本明細書に組入れる）。以降、これをBHK 570 細胞 と呼ぶ。BHK 570 細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，12 301 Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852 に、ATCC受託番号第CRL 10314 で寄託 されている。tk^- ts 13 BHK 細胞系もATCCから受託番号CRL 1632として入手でき る。更に、数多くのその他の細胞系も本発明において利用でき、それには以下の ものが含まれる。 ラットHep Ｉ(ラットの肝癌；ATCC CRL 1600)、ラットHep II(ラットの肝癌； ATCC CRL 1548)、TCMK（ATCC CCL 139）、ヒト肺（ATCC HB 8065）、NCTC 1469( ATCC CCL 9.1)、CHO（ATCC CCL 61） 及びDUKX細胞（Urlaub and Chasin, Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 77：4216−42 20，1980）。 本発明において、改良型VII因子を作るために遺伝子導入動物技術を利用して よい。該タンパク質を雌のホスト哺乳動物の乳腺内で作るのが好ましい。乳腺内 での発現及び乳への注目のタンパク質のその後の分泌はタンパク質をその他の起 源から単離するうえで遭遇する数多くの困難性を解消する。乳は既に集められて おり、大量に入手でき、そして生化学的によく特性決定されている。更に、主要 乳タンパク質は乳の中の高濃度で存在する（一般に約１〜15ｇ／ｌ）。商業的観 点から、ホストとして大量の乳を産生する種を利用することが明らかに好ましい 。マウス及びラットの如き小型の動物が利用できるが（そして原理的な段階の証 明として好適であるが）、本発明においては、家畜哺乳動物、例えば限定するこ となくブタ、ヤギ、ヒツジ及びウシが好ましい。ヒツジが特に好ましく、その理 由はこの種における遺伝子導入の今までの歴史、乳生産、費用、及びヒツジ乳を 回収するための装置の既存の如き要因にある。ホストの種の選定に影響を及ぼす 要因の比較についてはWIPO公開WO 88/00239 号を参照のこと。一般に、乳製品の 用途のために繁殖させたホスト動物の品種、例えばイースト・フリースランド・ ヒツジを選定するか、又は遺伝子導入系の繁殖を介して乳製品ストックに後に導 入することが一般に所望される。いづれにせよ、既知であり、良好な健康状態の 動物を利用すべきである。 乳腺内での発現を得るため、乳タンパク質遺伝子由来の転写プロモーターを利 用する。乳タンパク質遺伝子には、カゼイン（引用することで本明細書に組入れ る米国特許第 5,309,489号）、ベーター・ラクトグロブリン、ａ−ラクトアルブ ミン及び乳漿酸性タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。ベーター・ラクト グロブリン( BLG)プロモーターが好ましい。ヒツジのベーター・ラクトグロブリン遺伝子の場 合、この遺伝子の５′隣接配列の少なくとも近位 406bp領域が一般に利用される であろうが、約５kbp に至るまでの５′隣接配列のより大きな部分、例えばベー ター・ラクトグロブリン遺伝子の５′隣接プロモーター及び非コード領域を包括 する約4.25kbp のDNA セグメントが好ましい。Whitelawら、 Biochem J ．286 : 31−39（1992）を参照のこと。その他の種由来の類似のフラグメントも適当であ る。 ベーター・ラクトグロブリン遺伝子のその他の領域も、発現すべき遺伝子のゲ ノム領域と同様に構築体に組込んでよい。イントロンを欠く構築体は、例えば、 かかるDNA 配列を含むものと比べて弱く発現することが一般的に認識されている （Brinsterら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85 : 836−840（1988）；Palmite r ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88 : 478−482（1991）；Whitelaw ら，Tr ansgenic Res ． 1 : 3−13（1991）；WO 89/01343 ; 及び WO 91/02318を参照の こと；それぞれ引用することで本明細書に組入れる）。これに関連して、可能で あれば、注目のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の天然イントロ ン全体又はその一部を含むゲノム配列の利用が一般に好ましく、即ち、例えばベ ーター・ラクトグロブリン遺伝子由来の少なくともいくつかのイントロンの更な る組込みが好ましい。一のかかる領域はヒツジのベーター・ラクトグロブリン遺 伝子の３′非コード領域に由来するイントロンのスプライシング及びRNA ポリア デニル化を担うものである。遺伝子の天然３′非コード配列を置換した場合、こ のヒツジベーター・ラクトグロブリンセグメントは注目のタンパク質又はポリペ プチドの発現レベルを高め、且つ安定化させる。その他の態様において、改良型 VII因子配列の開始ATG を囲む領域を乳特異的タンパク質遺伝子由来 の対応の配列と置換してよい。かかる交換は発現性を高めるための推定の組織特 異的開始環境を供する。改良型VII因子のプレプロ及び５′非コード配列全体を 例えばBLG 遺伝子で置換することが好都合であるが、より小さい領域を置換して もよい。 遺伝子導入動物における改良型VII因子の発現のため、改良型VII因子をコード するDNA セグメントを、その発現に必要な追加のDNA セグメントに作動連結させ 、発現ユニットを作り上げるかかる追加のセグメントには、上記のプロモーター 、並びにmRNAの転写及びポリアデニル化の終結を担う配列が含まれる。この発現 ユニットは更に、改良型VII因子をコードするセグメントに作動連結した分泌シ グナル配列をコードするDNA セグメントを含むであろう。この分泌シグナル配列 は天然VII因子分泌シグナル配列であるか、又はその他のタンパク質、例えば乳 タンパク質のそれであってよい。例えば、Von Heinje，Nuc ．Acids Res． 14 : 4683-4690（1986）；及びMeadeら、米国特許第 4,873,316号を参照のこと。これ は引用することで本明細書に組入れる。 遺伝子導入動物において利用するための発現ユニットの構築は好都合には改良 型VII因子配列を、追加のDNA セグメントを含むプラスミド又はファージベクタ ーに挿入することにより好適に実施されるが、この発現ユニットは本質的に任意 の配列のライゲーションによっても構築してよい。乳タンパク質をコードするDN A セグメントを含むベクターを用意し、そしてその乳タンパク質をコードする配 列を改良型VII因子ポリペプチドと交換し、これにより乳タンパク質遺伝子の発 現コントロール配列を含む遺伝子融合体を作成することが特に好都合である。い づれにせよ、プラスミド又はその他のベクターにおける発現ユニットのクローニ ングは改良型VII因子配列の増幅を助長する。増幅は好都合には細菌（例えばＥ ．コリ）宿主細胞で 好適に実施し、かくしてベクターは細菌宿主細胞の中で機能する複製起点及び選 択マーカーを一般に含むであろう。 次にこの発現ユニットを選定のホスト種の受精卵（初期段階の胎芽を含む）に 導入する。異種DNA の導入は一又は複数のルート、例えばマイクロインジェクシ ョン（例えば、米国特許第 4,873,191号）、レトロウィルス感染(Jaenisch，Sci ence 240：1468−1474(1988))又は胎芽幹（ES）細胞を利用する部位特異的組換 （Bradleyら， Bio/Technology 10 : 534−539(1992)により再考）により成し遂 げられうる。次にその卵を偽似妊娠した雌の卵管又は子宮に移植し、そして出産 させる。生殖系において導入DNA を担持する子孫は通常のメンデル方式でその子 孫へとDNA を渡すことができ、遺伝子導入群の作成を可能にする。 遺伝子導入動物を作るための一般手順は当業界において公知である。例えば、 Hogan ら Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986; Simonsら Bio/Technology 6 : 179−183(1988); W allら Biol ．Reprod. 32: 645−651(1985); Buhlerら Bio/Technology 8 : 140 −143(1990); Ebert ら Bio/Technology 9 : 835-838(1991); Krimpenfort ら Bio/Technology 9 : 844−847(1991); Wallら J ．Cell．Biochem. 49: 113-120 (1992); 米国特許第 4,873,191号及び 4,873,316号; WIPO公開WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757;及びGB 87/00458 を参照のこと。これらは引用すること で本明細書に組入れる。哺乳動物及びその生殖細胞への外来DNA 配列の導入のた めの技術はマウスにおいて元来開発されている。例えばGordonら Proc. Natl ．A cad．Sci．USA 77 : 7380−7384（1980）; Gordon and Ruddle, Science 214： 1244−1246(1981); Palmiter and Brinster，Cell 41 : 343 −345(1985); Brin sterら Proc ．Natl．Acad．S ci ．USA 82 : 4438−4442(1985);及びHogan ら（前掲）を参照のこと。これら の技術はその後、家畜の種を含むより大型の動物への利用に応用されている（例 えばWIPO公開WO 88/00239，WO 90/05188及びWO 92/11757 ; 並びに Simons らBi o/Technology 6 : 179−183(1988)を参照のこと）。まとめると、遺伝子導入マ ウス又は家畜の作成に今日まで利用されている最も効率的なルートにおいては、 注目のDNA の数百本の線形分子を確立された技術に従って受精卵の前核に注入す る。接合体の細胞質へのDNA の注入も利用できうる。遺伝子導入植物における生 産も利用されうる。発現は全身系とするか、又は特定の器官、例えば結節へと特 定してよい。Hiatt，Nature 344 : 469−479(1990); Edelbaumら J ．Interferon Res． 12 : 449−453(1992); Sijmons ら Bio/Technology 8 : 217-221(1990); 及びヨーロッパ特許庁公開 EP 255,378 を参照のこと。 本発明に従って製造した改良型VII因子は抗VII因子抗体カラム上でのアフィニ ティークロマトグラフィーにより精製できうる。引用することで本明細書に組入 れるWakabayashi ら J ．Biol．Chem．261 : 11097−11108(1986)及びThimらBio chem. 27 : 7785−7793（1988）に記載のカルシウム依存性モノクローナル抗体 の利用が特に好ましい。追加の精製は慣用の化学精製手段、例えば高性能液体ク ロマトグラフィーにより行われうる。その他の精製方法、例えばクエン酸バリウ ム沈殿が当業界に知られ、そして本明細書に記載の新規の改良型VII因子の精製 に適用することができうる（一般的には、Scopes，R.，Protein Purification， Springer，Verlag，N．Y．1982を参照のこと）。少なくとも約90〜95％の均質性 の、そして最も好ましくは98〜99％又はそれより高い均質性の実質的に純粋な改 良型VII因子が薬理学的用途にとって好ましい。部分的に、又は所望の均質性に まで精製できたら、その改良型VII因子は治療的に利用できう る。 本発明の一の態様において、その改良型VII因子はその活性部位において解裂 されてその二本鎖形態へと変換する。活性化は当業界に公知の手順に従って行わ れることができ、その手順は例えば引用することで本明細書に組入れる、Osteru d,らBiochemistry 11 : 2853−2857（1972）；Thomasの米国特許第 4,456,591号 ；Hedner and Kisiel, J ．Clin．Invest．71：1836−1841（1983）；又はKisiel and Fujikawa, Behring Inst ．Mitt. 73 : 29−42（1983）に記載されている。 得られる改良型「VIIａ因子」を以下の通りに配合して投与する。 本発明の改良型VII因子又はVIIａ因子分子及びその薬理組成物は血管内凝固に 係る様々な症状を処置するためにヒトに投与するのに極めて有用である。例えば 、深遠血栓及び肺塞栓は慣用の抗凝固剤によって処置できうるが、本明細書に記 載の改良型VII因子は危険性が高いと認められた患者、例えば手術を受ける者又 はうっ血性心不全を有する者におけるトロンボ塞栓合併症の発症を予防するのに 利用できうる。更に、改良型VII因子は凝固の組織因子媒介誘発にとっての拮抗 薬として働き、それ故トロンビンの生成及びその後のフィブリンの沈着を阻止す ることができる。従って、改良型VII因子は組織因子活性を阻害するのに有用で あり得、凝血、血栓又は血小板沈着の阻害の如くの阻害をもたらす。 本発明の改良型VII因子は急性血管傷害に基づく内膜過形成及び再狭窄の処置 において極めて有用でありうる。急性血管傷害は、生活時にわたって発症する慢 性血管傷害（例えばアテローム症）とは対照的に、急速（即ち、数日から数ケ月 ）に起こる。急性血管傷害は往々にして外科処置、例えば血管形成術、動脈血管 内膜切除術、アテローム切除術、血管移植すえ付等を採用する技術である血管再 構 成に由来する。過形成は例えば移植すえ付又は器官移植に応答する遅延型反応と しても生じうる。改良型VII因子はヘパリンよりも選択性であり、一般に傷害部 において露出している組織因子のみに結合し、そして改良型VII因子はその他の 凝固タンパク質を破壊しないため、それを深遠静脈血栓の予防のために予防的に 使用する際、ヘパリンよりも有効、且つ出血の合併症を引き起こす傾向が低いで あろう。深遠静脈血栓の予防のための改良型VII因子の投与量は70kgの患者にと っては約50μｇ〜500mg ／日、より一般的には１mg〜200mg／日、そしてより好 ましくは10〜175mg ／日の範囲とし、そして投与は手術の少なくとも約６時間前 から始め、そして少なくともその患者が動き回れるようになるまで続けるべきで ある。再狭窄にとっての処置における改良型VII因子の投与量は患者毎に変わる であろうが、一般に上記に提案した範囲であろう。 冠状血管障害の処置における近年の進歩には、冠状動脈を通って流れる適度な 血流を再樹立するために邪魔なプラーク物質を排除又は除去する機械的介入の利 用が含まれる。バルーン血管形成術、整復アテロール切除、血管ステントの設置 、レーザー療法又はロトブレーターを含む様々な形式の機械的介入の利用にもか かわらず、これらの技術の有用性は、処置後６ケ月以内における約40％の再狭窄 率により制約され続けている。 再狭窄は、血小板沈着及び血栓形成、化学走性及びミトゲン因子の放出、並び に血管平滑筋細胞の拡張動脈セグメントの内膜に至る移動及び増殖を含む生物学 的過程の複雑な相互作用に由来するものと考えられている。 機械的傷害部位においての血小板蓄積の阻害はヒト対象体における再狭窄率を 抑えることができうる。血小板GpIIb ／IIIａに対するモノクローナル抗体の治 療的利用はヒト対象体における再狭窄のレ ベルを抑えることができる（Califfら，N ．Engl．J．Mcd. 330 : 956−961(1994 )）。この抗体は血小板の表層上のGpIIb ／IIIａレセプターに結合することがで き、それ故血小板の蓄積を阻害する。このデーターは、ヒト冠状動脈における機 械傷害の部位での血小板の蓄積の阻害が、最終的な治癒応答が起こるのに有利で あることを示唆する。血小板蓄積は急性血管傷害部位において起こるが、これら の部位での血栓の発生は血小板の活性化及びその後の蓄積にとっての原因となり うる。 以下の実施例において示している通り、本発明の改良型VII因子は細胞表層組 織因子に結合することができる。例えば、DEGR−VIIａ因子は細胞表層組織因子 に、野生型VIIａ因子と同等又は強い親和力で結合することができる。ところで 、DEGR−VIIａ因子は酵素活性を有さないが、それは組織因子に結合して野生型V IIａ因子にとっての競合拮抗剤として作用し、それ故トロンビンの発生を招く凝 固の外因性経路におけるその後の段階を阻害する。 組織因子を維持する本発明の改良型VII因子分子は、トロンビンの生成及びそ の後のフィブリンの沈着を阻止することにより、血管傷害部位での血小板蓄積を 阻害する。 急性血管傷害部位においてトロンビン生成を阻止し、そして血小板沈着を抑え るDEGR−VII因子の能力に基づき、組織因子結合活性は維持しているが、VIIａ因 子の酵素活性は失われている改良型VII因子は血管再狭窄を阻止するのに利用で きる。 かくして、本発明の組成物及び方法は多種多様な用途を有する。例えば、これ らは治療、典型的にはバルーン血管形成術、整復アテローム切除術、血管ステン トの設置、レーザー治療、ロトブレーション等と一緒に及び／又はそれらに後続 して施す。冠状又は末梢血管障害の処置において妨害性のプラーク物質を除去又 は排除する機 械的治療後の再狭窄を予防又は抑制するうえで有用である。この化合物は一般に 治療を行う約24時間前以内に、そして少なくともその７日後まで投与されるであ ろう。投与は本明細書に更に記載の様々なルートを介しうる。本発明の化合物は 全身的に、又は移植血管の設置のために局所的に（例えば、合成又は改良天然移 植動脈血管のコーティングにより）、吻合部位、動脈血管内脈切除部位（一般に は頸動脈内膜切除部位）、バイパス移植部位等に投与してもよい。この改良型VI I及びVIIａ因子は例えば骨髄移植を経た器官移植に係る内膜過形成、加速型アテ ローム症及び静脈塞栓症を抑制するうえでも有用である。 確立された深遠静脈血栓及び／又は肺塞栓症において、患者の体重及び症状の 重度に依存して、負荷投与及び維持投与して、70kgの患者当り改良型VII因子の 投与量は約50μｇ〜500mg、より一般には１mg〜200mg ／日、そしてより好まし くは10mg〜約175mg ／日に範囲する。改良型VII因子点滴に由来する出血合併症 の傾向の低さを理由に、血栓症又は塞栓症に係る手術の最中又は後において改良 型VII因子はヘパリンにとって代わるか又はヘパリンの投与量を下げることがで きる。 本発明の改良型VII因子組成物は心臓の塞栓の予防及び血栓発作の処置におい てもかなりの有用性を有するであろう。出血合併症を起こす可能性の低さ及びそ の選択性を理由に、改良型VII因子は発作の患者に与えることができ、そして閉 塞性の動脈血栓の継続を阻止することができる。投与する改良型VII因子の量は 発作の性質及び重度に依存して患者毎に変わるであろうが、しかしその投与量は 一般に以下に提唱する範囲であろう。 DEGR VII因子を含むここに提供する改良型VII因子の薬理組成物はその改良型V II因子のインビボ凝固を阻害する能力を理由に急性心筋 梗塞における有用な処置をなすであろう。改良型VII因子は急性心筋梗塞期の最 中に組織プラスミノゲンアクチベーター又はストレプトキナーゼと一緒に与えて よく、そしてTPA 誘導型血栓溶解を促進しうる。急性心筋梗塞において、その患 者には70kgの患者当り、負荷及び維持投与として少なくとも約50μｇ〜500mg ／ 日、より一般には１mg〜200mg ／日、そしてより好ましくは10mg〜約175mg ／日 の負荷投与量を与えてよい。改良型VII因子は、組織プラスミノゲンアクチベー ターの如き血栓溶解剤の投与の前、それと一緒、又はすぐ後に与える。 本発明の改良型VII因子は散在性血管内凝固(DIC)及びグラム陰性菌血症の関与 するその他の症状の処置において有用である。DIC の特徴をもつ患者は広がり渡 った微小循環血栓を有し、そして往々にして必須の凝塊因子の消費をもたらす重 度な出血の問題を有する。その選択性を理由に、改良型VII因子は慣用の抗凝固 剤のようにDIC に係る出血の問題を悪化させず、しかも更なる微小血管フィブリ ン沈着の形成を抑える又は阻害するであろう。従って、DEGR−VII因子及びDEGR −VIIａ因子を含む本発明の改良型VII因子は内毒血症及び内毒素ショックに結び つくフィブリン沈着の抑制において有用であり、それ故グラム陰性菌血症に係る 作用を緩和もする。DEGR−VIIａ因子はウサギで腎臓及び肺におけるフィブリン 沈着を阻止する用量反応性効果を発揮し、そしてヒヒにおいては処置動物の延命 効果を発揮した。急性菌血症、内毒血症又はDIC の場合、70kgの患者当り、患者 に少なくとも約50μｇ〜500mg ／日、より一般には１mg〜200mg ／日、そしてよ り好ましくは10mg〜約175mg ／日の負荷投与量を与え、それに70kgの患者当り50 μｇ〜500mg ／日、一般には１mg〜200mg ／日の範囲の維持投与を続ける。 この薬理組成物は予防的及び／又は治癒的処置のための非経口的 、局所的又は局在的投与を意図する。好ましくは、この薬理組成物は非経口的に 、即ち、静脈内的に皮下的に、又は筋肉内的に投与する。即ち、本発明は許容の 担体、好ましくは水性担体の中に溶解された改良型VII因子分子の溶液を含んで 成る非経口投与用の組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、0. 4％の食塩水、0.3％のグリシン等を使用してよい。この改良型VII因子分子は傷 害部位に輸送又はそれを標的化するためにリポソーム製剤へと処方してよい。リ ポソーム製剤は一般に例えば引用することで本明細書に組入れる米国特許第 4,8 37,028号、米国特許第 4,501,728号及び米国特許第 4,975,282号に記載されてい る。この組成物は慣用のよく知られた滅菌技術によって滅菌してよい。得られる 水性溶液を使用のために包装するか、又は無菌条件下で濾過し、次いで凍結乾燥 してよく、その凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性溶液と混合する。この組成物は 生理学的状態に近づけるのに必要な薬理学的に許容されている補助剤、例えばpH 調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、 塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含んでよい。これらの製剤 中の改良型VII因子の濃度は幅広く変えてよく、即ち約 0.5重量％の低さから、 通常は約１重量％以上から、15又は20重量％の高さに至ってよく、そしてそれは 主に選定した投与の特定態様に従って流体容積、粘度等により選定されるであろ う。 従って、静脈内点滴のための典型的な薬理組成物は 250mlの滅菌Ringer溶液と 、10mgの改良型VII因子とを含むように調製してよい。非経口投与用化合物を調 製するための実際の方法は当業者に公知又は自明であり、そして例えば引用する ことで本明細書に組入れるRemington's Plarmaceuticul Science 第16版，Mack Publishing Company −Easton，PA（1982）に詳細されている。 改良型VII因子分子を含む組成物は予防的及び／又は治療的処置のために投与 してよい。治療的用途においては、既に障害に苦しんでいる患者に組成物を前記 の通りにして、その障害及び合併症を治癒又は少なくとも緩和するのに足りる量 で投与する。これを成し遂げるのに適当な量を「治療的に有効な投与量」と定義 する。この用途にとって効果的な量は障害又は傷害の重度、並びに患者の体重及 び健康状態に依存するであろうが、しかし一般には70kgの患者にとっては１日当 り約0.05mg〜約500mg の改良型VII因子に範囲し、１日当り約 1.0mg〜約200mg の改良型VII因子の投与量がより一般的に利用される。本発明の材料は一般に重 症な障害又は傷害状況、即ち、生命が脅かされている又は潜在的に生命を脅かし ている状況において採用されうることを念頭に置かねばならない。かかるケース において、外因性物質の最少限化及びヒトにおける改良型ヒトVII因子の免疫原 性の一般的な欠如の観点から、処置医師は実質的に過剰な量のこれらの改良型VI I因子組成物を投与することが可能であり、そして所望しうる。 予防的用途においては、この改良型VII因子を含む組成物を障害又は傷害にか かり易い又はその危険性にある患者に、その患者自身の抗凝固能を高めるように 投与する。かかる量は「予防的に有効な投与量」と定義する。この用途において は、ここでもその正確な量は患者の健康状態及び体重に依存するが、しかし一般 には70kgの患者当り約0.05mg〜500mg に範囲し、より一般的には70kgの体重当り 約1.0mg 〜約200mg であろう。 一回又は数回にわたるこの組成物の投与を、処置医師により選定される投与レ ベル及びパターンで実施することができる。毎日の維持レベルを必要とする動き まわれる患者にとっては、例えばこの改良型VII因子はポータブル式ポンプシス テルの如くを用いる連続点滴 により投与してよい。 改良型VII因子の局所導入は、例えばパーフュージョン、ダブルバルーンカテ ーテル、ステント又はその他のよく樹立された方法により実施できうる。いかな る状況においても、この薬理製剤は患者を効果的に処置するのに足りる量の本発 明の改良型VII因子を供するべきであろう。 以下の実施例を、限定することなく例示のために提供する。 実施例Ｉ Ser₃₄₄ →Ala₃₄₄VII因子の発現 Ser₃₄₄→Ala VII因子活性部位突然変異体を作るため、プラスミドFVII（565 ＋2463）／pDX （引用することで本明細書に組入れる米国特許第 4,784,950号； アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号 40205で寄託）を X baＩ及び KpnＩで消化し、そして得られるセリン344 についてのコード領域を含 んで成る 0.6kbのフラグメントを回収した。このフラグメントを図に示している XbaＩ，KpnＩ−消化Ｍ13mp19にクローンした。この操作及び以下に説明するそ の後の工程は一般に標準のプロトコールに従って行った（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning ，A Laboratory Mannal ，Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess，Cold Spring Harbor，N．Y.（1982）；引用することで本明細書に組入れる ；に記載の通り）。 突然変異誘発はＭ13鋳型に基づき、Zoller and Smith前掲の方法に従い、突然 変異用オリゴヌクレオチドZC 1656 （５′TGG GCC TCC GGC GTC CCC CTT ３′） 及び「万能」第二プライマーZC 87（５′ TCC CAG TCA CGA CGT ３′）を用いて 行った。反応生成物をキナーゼ処理したZC 1656 を用いてスクリーンした。陽性 プラークを拾 い、そして鋳型DNA を用意し、そして1077にある PstＩ部位から1213にある Kpn Ｉ部位に至るまで配列決定した。配列分析は所望の突然変異の存在を確証せしめ た。この突然変異クローンを1656と命名した。 次いで発現ベクターを1656クローンを用いて構築した。この突然変異配列をＭ 13ベクターから、〜0.14kbの PstＩ− KpnＩフラグメントとして単離した。この フラグメントをＦVII（565 ＋2463）／pDX 由来の 1.7kbのHindIII− XbaＩフラ グメント、ＦVII（565 ＋2463）／pDX 由来の 0.5kbの XbaＩ− PstＩフラグメ ント及びＦVII（565 ＋2463）／pDX 由来の 4.3kbの KpnＩ−HindIIIフラグメン トに、図に示している通りにリゲートさせた。所望の突然変異配列の存在は突然 変異体及び野生型クローンを PstＩで消化し、そして突然変異VII因子をＭ13の 中に KpnＩ及び XbaＩを用いて挿入し、消化DNAのサザンブロットを用意し、次 いでそのブロットをラジオラベル化ZC 1656 でプローブすることによって確認し た。 ベビーハムスター腎細胞系BHK 570 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションに受託番号10314 で寄託）に1656発現ベクターの２つの単離物（＃544 及び＃545 と命名）をトランスフェクトした。この細胞はBHK 570 細胞の集密10 cmプレートを非選択培地（10％の胎児牛血清及び１％のPSN 抗生物質ミックス〔 GIBCO Life Technologies，Gaithersburg，MD〕を含むDulbeccoの改良Eagle 培 地〔DMEM〕）の中に５枚の10cmプレートに１：10で希釈することにより用意した 。24時間後、細胞が20〜30％の集密度に達したとき、それらを1656突然変異をコ ードする発現ベクターの一種の単離体プラスミドp486（アデノウィルス５ori，S V 40エンハンサー、アデノウィルス２主要後期プロモーター、アデノウィルス２ 三分節系リーダー、５′及び３′スプライス部位、DHFR^r cDNA及びSV 40 ポリア デニル化シグナル（pML −１〔Lusky and Botchan, Natnre, 293：79−81（198 1）〕中）を含んで成る）並びに10μｇのキャリヤーDNA （音波処理したサケ精 子DNA）により、表１に示す通りに同時トランスフェクトした。DNA を15mlのチ ューブに入れ、次いで 0.5mlの２ＸHepes （25ｇのHepes，40ｇのNaCl，1.8ｇの KCl，0.75ｇのNa₂HPO₄・２H₂O，５ｇのデキストロース；蒸留水で 2.5ｌにまで 希釈し、そしてpH6.95〜7.0 に調整）を加え、そしてそのチューブを混合した。 各チューブ中のDNA を0.25Ｍの CaCl₂ 0.5mlの添加、それと同時にその DNA／He pes 溶液にパスツールピペットを用いて空気を吹き込むことにより沈殿させた。 そのチューブをボルテックスにかけ、室温で15分インキュベートし、そして再び ボルテックスにかけた。そのDNA 混合物を次にピペットで細胞のプレート上に滴 下した。そのプレートをゆらし、そして37℃で４〜６時間インキュベートした。 インキュベーション後、トリス−食塩水（0.375ｇのKCl，0.71ｇのNa₂HPO₄，8.1 ｇのNaCl， 3.0ｇのトリス−HCl，0.5ｇのスクロース；全部で１リットルに希釈 し、そしてpHをpH7.9 に調整）の中に希釈した20％のグリセロール２mlを各プレ ートに加えた。このプレートをゆらし、そして室温に２分放置した。次いでその プレートから培地を除き、そしてトリス−食塩水２mlに置き換えた。そのプレー トを室温で２分放置し、次いでトリス食塩水を除去し、そして10mlの非選択培地 に置き換えた。そのプレートを37℃で２日間インキュベートした。 ２日間のインキュベーション後、この細胞を選択培地（10％の透析胎児牛血清 、１％のPSN 抗生物質ミックス及び 150nMのメトトレキセートを含むDMEM）の中 に希釈し、そしてmaxiプレートの中に１：100，１：250 及び１：500 の希釈率 でプレートした。これらのプレートを37℃で１週間インキュベートした。１週間 後、その培地を選択培地に交換し、そしてそのプレートをコロニー形成について チェックした。 ８日後、コロニー形成を経て、12のコロニーを＃544 及び＃545 トランスフェ クションプレートの１：500 の希釈プレートからランダムに選択した。各クロー ンを６穴プレートの１のウェルの中に入れ、そして選択培地の中で増殖させた。 ７日後、それらのプレートは集密となり、そしてそれらのプレートを選択培地に おいて10cmのプレートにそれぞれ分割した。 上記のクローン及び野生型VII因子を発現するようにトランスフェクトされた コントロール細胞を³⁵Ｓ−メチオニン−システインタンパク質ラベル用混合物(N EN Dupont Biotechnology Systems，Wilmington DE)で代謝ラベルした。これら のクローンを選択培地の中で のパルスラベル実験のために増殖させて用意した。その細胞をリン酸緩衝食塩水 （Sigma，St．Louis，MO）ですすぎ、そして20μCi／mlの³⁵Ｓ-Cys- ³⁵Ｓ-Metの 中で４時間パルスに付した。４時間後、上清液及び細胞を回収した。その細胞を Lenk and Penman(Cell 16 ：289 −302，(1979))に本質的に記載の通りに溶解し 、そして 400μｌづつのリゼートを50μｌのstaph Ａ（Sigma，St．Louis，MO） で予備清浄した。 代謝ラベルした細胞由来のサンプルを、まずそのサンプルを６μｌの抗−VII 因子ポリクローナル抗血清と４時間インキュベートすることによりラジオ免疫沈 殿(RIP)させた。60μｌの洗浄スタフィロコッカス・プロテインＡを各サンプル に加え、そしてそのサンプルを４℃で 1.5時間ゆらした。このサンプルを遠心し 、そしてその上清液を除去した。このペレットを 0.7ＭのRIPAバッファー（10mM のトリス、pH7.4、１％のデオキシコール酸〔Calbiochem Corp.，La Jolla，CA 〕、１％のトリトンＸ−100，0.1％のSDS，５mMのEDTA, 0.7ＭのNaCl）で２回 、そして0.15ＭのRIPAバッファー（10mMのトリス、pH7.4、１％のデオキシコー ル酸〔Calbiochem Corp.，La Jolla，CA〕、１％のトリトンＸ−100，0.1％のSD S，５mMのEDTA，0.15ＭのNaCl）で１回洗った。100μｌの１ＸのSDS 染料（50mM のトリス−HCl，pH6.8，100mMのジチオスレイトール，２％のSDS，0.1％のブロ モフェノールブルー、10％のグリセロール）を各サンプルに加え、そしてそのサ ンプルを５分煮沸し、そして遠心してプロテインＡを除いた。50μｌづつの各サ ンプルを10％のポリアクリルアミドゲルで泳動させた。結果は、10クローンのう ち９クローンが改良型VII因子を分泌することを示した。 実施例II 改良型VII因子の抗凝固活性 改良型VII因子タンパク質の凝塊を阻害する能力をコントロールとして野生型V II因子を用いる一段凝塊アッセイで測定した。組換タンパク質は５μｇ／mlのビ タミンＫを含む培地の中で培養した細胞から本質的に上記の通りに調製した。様 々な量の改良型VII因子（クローン544 由来）又は組換野生型VII因子を50mMのト リスpH7.5，0.1％のBSA の中で 100μｌとなるように希釈した。その混合物を 1 00μｌのVII因子欠損血漿(George King Bio-Medical Inc.，Overland Park，KS) 及び 200μｌのトロンボプラスチンＣ（Dade，Miami，FL；ウサギ脳トロンボプ ラスチン及び11.8mMのCa⁺⁺を含む）とインキュベートした。凝塊アッセイは自動 凝塊タイマー（MLA Electra 800，Medical Laborator，Automation Inc.，Pleas antville，NY）で行い、そして凝塊時間を１：５〜１：640 の希釈率の正常プー ルヒト血漿（１単位／mlのVII因子活性を確実に含むようにしてある；健康なド ナー由来のクエン酸処理血清をプールすることにより調製）で作製した。標準曲 線を用いてVII因子活性単位に変換させた。このアッセイを利用すると、改良型V II因子の調製品は検出可能な凝固活性を示さなかった。表２はコントロール（未 トランスフェクト）BHK 細胞コンデイション化培地（＋／−ビタミンＫ）、野生 型VII因子及び改良型VIII因子を発現する２種の細胞単離体についての凝塊時間 についてのアッセイ結果を示す。VII因子活性はコントロールサンプルに比べて 凝塊時間を短縮するようである。 血漿因子基質に及ぼす改良型VII因子の効果を調べるため、改良型VII因子及び 組換野生型又は天然VII因子の調製品をＸ因子又はIX因子のいづれかとインキュ ベートし、そしてその活性化を凝塊アッセイ又はポリアクリルアミドゲル電気泳 動によりモニターした。 実施例III 組織因子に結合する改良型VII因子の能力 改良型VII因子の、組織因子に対しての野生型VII因子と競合する能力及びその 凝塊活性を阻害する能力を規定量の組織因子（トロンボプラスチン）の存在下で の一段凝塊アッセイで評価した。 凝塊時間は実施例IIに記載と類似の一段アッセイにおいて決定した。規定量の 組織因子、一定量の野生型VII因子及び上昇していく量のVII因子変異体を混合実 験において用いた。VII／VIIａ因子プロ凝固 活性の阻害は、上昇していく量のVII因子変異体を含むアッセイにおいて、凝塊 時間の増大として認められるであろう。 試験サンプル中のVII因子活性の値は、正常プール血漿中のVII因子活性を測定 せしめる標準曲線のパーセンテージとして計算した。VII因子活性についての標 準曲線は、１：５から１：640 に範囲するリン酸緩衝溶液(PBS)中での正常プー ル血漿の希釈系列を用いて作製した。この目的のため、正常血漿が約 500ng／ml のVII因子を含むことを確実にしておき、そしてこれを１単位の活性と考慮した 。100μｌのVII因子欠損血漿、100μｌの血漿希釈品及び 200μｌのトロンボプ ラスチン−Ｃ(Dade，Miami，FL)の混合物をMLA Electra 800 自動タイマーで凝 塊時間を測定するために用いた。標準曲線を樹立するため、この結果を活性のパ ーセンテージ（１：５＝ 100％活性）対、秒における凝塊時間としてグラフにし た。 このアッセイは、野生型及びVII因子変異体を含む培地が１％未満の血清より 成ることを必要とする。希釈をPBS で行い、これによりその凝塊時間が標準曲線 に載るようにした。１：２の最少希釈率が一般的である。最終容量は 100μｌと した。クローン「＃10」及び「＃６」と命名する２種類のヒトVII因子Ser₃₄₄→A la 変異体をこの実験において試験した。以下の表に記載のその結果は、VII因子 の量が増大すると、VIIａ因子の活性のパーセンテージが低下することも示した 。 これらの実験は、Ser₃₄₄→Ala 置換を有するVII因子の変異体が、投与量依存 性状況で天然VII因子と競合し、そして天然VII／VIIａ因子のプロ凝固活性を阻 害することを示した。従って、Ser₃₄₄→Ala ヒトVII因子変異体は天然ヒトVIIａ 因子と競合し、そして結果としてヒト血漿中のＸ及び／又はIX因子の活性化を阻 害するものと考えられ うる。 実施例IV PPACK とのVII因子の反応 組換VII因子をトランスフェクトベビーハムスター腎細胞の中で製造させた。 このタンパク質を引用することで本明細書に組入れるThimら（Biochemistry 27 : 7785−7793，1988）、Brinkousら（Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86 ：1382− 1386，1989）及びBjoern and Thim(Res ．Discl．No．269，564，1986)に記載の 通りにして精製及び活性化させた。その細胞培養培地を回収し、濾過し、そして 希釈して販売時の濃度を下げた。この希釈培地を次にCaCl₂含有溶離用バッファ ーを用い、アニオン交換クロマトグラフィーにより分画した。VII因子画分を回 収し、そしてカルシウム依存性抗−VII因子モノクローナル抗体を用いるイムノ クロマトグラフィーにより更に精製した。更なる精製を２段式アニオン交換クロ マトグラフィー工程を利用して実施し、ここでVII因子をCaCl₂及びNaClのそれぞ れを用いて溶離させた。VIIａ因子を最終溶離液から回収した。 50mMのトリス−HCl，100mMのNaCl，５mMのCaCl₂，pH7.4中の組換VIIａ因子（ １μＭ）を20μＭの PPack（Ｄ−フュニルアラニル−プロリル−アルギニルクロ ロメチルケトン；Calbiochem，La Jolla，CA）と５，20及び60分インキュベート した。次に発色原基質Ｓ2288(Ｈ−Ｄ−イソロイシン−Ｌ−プロリル−Ｌ−アル ギニンＰ−ニトロアニリド；Kabi Vitrum AB，Molndal，Sweden)を含むバッファ ーを加えて 2.5倍の希釈率及び 0.3mMのＳ2288の最終濃度とした。ｐ−ニトロア ニリンの生成を測定し、そしてコントロールとして未処理VIIａ因子を用いた結 果と比較した。その結果は、VIIａ因子がこれらの反応条件下で60分後に完全に 失活することも示した。 実施例Ｖ DEGR −VIIａ因子の生成 組換ヒトVIIａ因子を実施例IVに記載の通りにして調製した。10mMのグリシン バッファー、pH8.0，10mM のCaCl₂，50mM のNaCl中の組換VIIａ因子を 1.5mg／m lの濃度に希釈した。蒸留H₂O に溶解しておいた10倍過剰モル量のダンシル−Ｌ −Glu-Gly-Arg-クロロメチルケトン、DEGRcK（Calbiochem．La Jolla，CA 92037 ）をVIIａ因子は加えた。37℃で２ｈのインキュベーション後、第２の10倍過剰 モル量のDEGRcKをこの混合物に加え、そして37℃で更に２時間インキュベートし た。第３の10倍過剰モル量のDEGRcKをVIIａ因子に加え、そして４℃で約16時間 インキュベートした。次にDEGR−VIIａ因子サンプルをトリス緩衝食塩水(0.05Ｍ のトリス−HCl，0.1ＭのNaCl，pH7.5)に対して４℃で十分に透析した遊離のDEGR cKを全て除いた。 この最終DEGR−VIIａ因子混合物をＸａ因子発色原基質アッセイにおいて遊離D EGRcKの存在について試験した。このDEGR−VIIａ因子混合物を精製ヒトＸａ因子 に、発色原基質Ｓ−2222と一緒に加えた。この混合物中の未結合DEGRcKはＸａ因 子に結合することができ、それ故Ｘａ因子の発色活性を阻害できる。遊離DEGRcK をＸａ因子混合物にスパイクすることは、溶液中の遊離DEGRcKのレベル、対、Ｘ ａ因子発色活性の阻害を測定するための標準曲線をもたらす。DEGR−VIIａ因子 混合物の分析は、遊離DEGRcK：DEGR−VIIａ因子の比が長期透析を経て 0.5％未 満となることを示し、それ故以下に記載の様々なアッセイ系におけるDEGR−VII ａ因子により認められる阻害は遊離DEGRcKの存在に基づくものでないことを保障 する。 実施例VI ラットの平滑筋細胞上でのＸａ因子の作製 血管の平滑筋細胞を細胞表層組織因子の存在について、Ｘ因子のＸａ因子への 変換を刺激するその細胞の能力をＸａ因子に特異的な 発色原基質を用いて測定することによって分析した。 ラットの血管平滑筋細胞（Clowesら，J．Clin．Invest，93 : 644 −651(1994 )）を96穴培養ディッシュ(American Scientific Products，Chicago，IL)に、増 殖培地（表４）においてウェル当り 8,000細胞でプレートした。 37℃で48時間のインキュベーション後、その培地を無血清培地と交換した（表 ５）。 これらの細胞を37℃で７時間インキュベートした。インキュベー ション後、PDGF−BB（10ng／ml）又は10％の胎児牛血清を細胞に加えて組織因子 発現を刺激した(Taubman ら，J ．Clin．Invest．91：547 −552，1993)。一組の 平行セットの細胞には、未刺激細胞の固有活性についてモニターするため、PDGF 又は血清のいづれも与えなかった。６時間のインキュベーション後、組換ヒトVI Iａ因子を細胞に10nMの最終濃度で加えた。一セットの細胞は陰性コントロール として、VIIａ因子は加えていない。この細胞を37℃で２時間インキュベートし 、そしてHEPES バッファー(10mMのHEPES，137mMのNaCl，４mMのKCl，５mMのCaCl₂ ，11mMのグルコース、0.1％のBSA)で洗った。洗浄後、細胞を５mMのCaCl₂の添 加したトリス緩衝食塩水中の50ml／ウェルの 200nMの血漿精製ヒトＸ因子とイン キュベートした。25μｌの 0.5ＭのEDTA及び25μｌの 800μＭのＳ−2222発色原 基質溶液（Kabi Pharmacia，Franklin，OH）を各ウェルに加えた。これらのプレ ートを室温で40分インキュベートし、次いでTHERMO MAX Microplate Reader（Mo lecular Devices，Menlo Park,（Ａ）を用い 405nmで分析した。 表６はVIIａ因子処理ウェルの、コントロールウェル（VIIａ因子を添加してい ない）に比しての吸収の上昇を示す。吸収の上昇はウェルの中で生成したＸａ因 子のレベル及び発色団を放出せしめる発色原基質のその後の解裂の測定値である 。このデーターは、PDGF−BB又は10％の胎児牛血清のいづれかに処理した細胞に おける発色活性のレベルが未刺激細胞より高いことも示している。 これらの結果は、ラットの血管平滑筋細胞の細胞表層上でＸ因子からＸａ因子 に至るVIIａ因子存在性活性化があることを明確に示している。 実施例VII DEGR −VIIａ因子による細胞表層発色活性の阻害 ラットの血管平滑筋細胞を上記の通りにして96穴培養ディッシュにプレートし た。これらの細胞を上記の無血清培地の中で72時間培養し、そして10％の胎児牛 血清を添加して６時間処理し、組織因子発現を刺激した。刺激後、バッファーの み（コントロール）、10nMのVIIａ因子又は10nMのVIIａ因子＋ 100nMのDEGR−VI Iａ因子を各ウェルに加えた。この細胞を37℃で２時間インキュベートし、次い でHEPES バッファーで洗った。洗浄後、これらの細胞を50μｌ／ウェルの 200nM のＸ因子（５mMのCaCl₂の添加されたトリス緩衝食塩水中）と５分間インキュベ ートした。25μｌの 0.5ＭのEDTA及び25μｌのＳ−2222(800μＭ)発色原基質（K abi Pharmacia）を各ウェルに加えた。この細胞を室温で40分インキュベートし た。発色活性を上記の通りにして 405nmで分析した。 表７は、VIIａ因子のみで処理したウェルにおける発色活性の刺激、及びDEGR −VIIａ因子をVIIａ因子と一緒にインキュベートしたときの刺激の阻害を示す。 これらの結果は、DEGR−VIIａ因子がVIIａ因子結合にとっての競合的拮抗剤とし て働き、それ故Ｘ因子のＸａ因子 に至る活性化を阻害し、その後のＳ−2222発色現の解裂を阻害することを示して いる。 実施例VIII ラットの平滑筋細胞上での細胞表層発色活性のDEGR−VIIａ因子による投与量 依存性阻害 ラットの血管平滑筋細胞を96穴培養皿の中に 4,000細胞／ウェルにおいて、１ ％の胎児牛血清の添加した増殖培地の中でプレートした（表４に記載の10％の胎 児牛血清でなく）、５日後、その培地を除去し、そして上昇していく濃度のVII ａ因子のみ、又は10nMのVIIａ因子と上昇していく濃度のDEGR−VIIａ因子を細胞 に加えた。この細胞をVII因子混合物と37℃で２時間インキュベートした。イン キュベーション後、その細胞を洗い、そしてトリス緩衝食塩水中の 200nMのＸ因 子50μｌと室温で５分インキュベートした。各ウェルに 0.5ＭのEDTA 25μｌ及 び 800μＭのＳ−2222（Kabi Pharmacia）25μｌを加え、そしてそのプレートを 室温で40分インキュベートした。発色活性を上記の通りにしてマイクロタイター プレートリーダーで 405nmで分析した。 表８は、ウェルに加えるVIIａ因子の量の上昇に伴う発色活性の投与量依存性 上昇を示す。DEGR−VIIａ因子と 100nMのVIIａ因子との混合物を細胞に加えると （表９）、発色活性における投与量依存性阻害が起こる。１：１のモル比のDEGR −VIIａ因子：VIIａ因子は約95％の発色活性を阻害した。これらのデーターは、 DEGR−VIIａ因子が天 然VIIａ因子よりも細胞表層組織因子に対する。有意に高い親和力を有している ことを示している。もしDEGR−VIIａ因子及びVIIａ因子が組織因子に対して同等 の親和力を有するなら、これらの２種の分子を等モル比で加えたときに観察され る阻害レベルはそれほど高くないであろう。 表９はDEGE−VIIａ因子によるラットの平滑筋細胞上でのＸａ因子発色活性の 投与量依存性阻害を示す。上昇していく濃度のDEGR−VIIａ因子を 100nMのVIIａ 因子と一緒にインキュベートし、そしてＸａ因子発色活性を発色原基質Ｓ−2222 を用いて決定した。 実施例IX 可溶性組織因子アッセイでのDEGR−VIIａ因子によるＸａ因子生成 の阻害 精製組換可溶性組織因子を用いるＸ因子のＸａ因子に至る変換を発色アッセイ を用いて確立した。組織因子をサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces c erevisiae )(Shigematsnら，J．Biol．Chem．267 : 21329−21337，1992)から発 現及び精製した。可溶性組織因子はDr．Walt Kisiel(New Mexico 大学、Albeque rque，NM)により精製及び特性化されている、65.9μｌの可溶性組織因子(2.2μ ｍ)、29.0μｌのPCPS（１mM，Sigma，St．Louis，MO）、29.5μｌのヒトＸ因子( 4.1μＭ)、2.77mlのHankバッファー（25mMのトリス、pH7.4，150mMのNaCl, 2.7 mMのKCl，５mMのCaCl₂，0.1％のBSA）を含む反応混合物を調製した。40μｌの組 織因子／Ｘ因子混合物、TBS で希釈した25μｌのVIIａ因子、及びTBS で希釈し た25μｌのDEGR−VIIａ因子の96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加え た。10μｌのＳ−2222（４mM）発色原基質をウェル中の反応混合物に加え、そし て室温で２〜10分インキュベートした。結果は上記の通りにしてマイクロタイタ ープレートリーダーで 405nmで分析した。 Ｘ因子のVIIａ因子活性化についての標準曲線の決定を、DEGR−VIIａ因子の非 存在下で加える上昇していく濃度のVIIａ因子を用いて行った。表10に示す結果 は、反応混合物に加えるVIIａ因子の量の増大に伴い、発色活性の投与量依存性 上昇があることを示す。様々な量のDEGR−VIIａ因子及び 100nMのVIIａ因子の同 時添加は発色活性における投与量依存性低下を招いた（表11）。これらのデータ ーは、DEGR−VIIａ因子が可溶性組織因子に対する天然VIIａ因子の結合にとって の競合的拮抗剤として働き、それ故発色原基質Ｓ−2222に対する発色活性におけ る低下により測定される通り、Ｘａ因子の生成を阻害することを示す。 実施例Ｘ DEGR −VIIａ因子による凝固の阻害 凝塊時間に及ぼすDEGR−VIIａ因子の効果をモニターする標準凝塊アッセイを 下記の通りに準備した： 抗凝固剤としてのクエン酸ナトリウムにより集めた 100μｌの正常ヒヒ血漿を TBS （20mMのトリス、pH7.4 : 150mM のNaCl）に希釈してある様々な濃度のDEGR −VIIａ因子 100μｌに加えた。このサンプルを混合し、そして37℃で簡単にイ ンキュベートした。このサンプルをElectra 800 自動Coagnlation Timer（Medic al Laboratorics Automation，Pleasantiville，NY）に加えた。インキュベーシ ョン後、25mMのCaCl₂を含む 200μｌ組織因子調製品をDEGR−VIIａ因子調製に加 えた。組織因子調製品は新鮮な凍結脳組織由来のヒヒ脳の食塩水抽出物として作 り、そしてヒヒ血漿における凝固を開始する能力について特性化した。約40秒の 凝塊時間を付与する組織因子の濃度を選んだ。 表12に示すデーターは、DEGR−VIIａ因子の添加に基づく凝塊時間の投与量依 存性増大を示す。血漿中の１μｇ／mlほど低いDEGR−VIIａ因子の投与量が凝塊 時間の有意な増大をもたらした。 実施例ＸＩ DEGR −VIIａ因子による血小板蓄積の阻害 DEGR−VIIａ因子を、非ヒト霊長類における機械的傷害に基づく動脈血栓部位 での血小板蓄積を阻害する能力について分析した。動脈血管内膜切除術のモデル を本質的にLumsden ら（Blood 81：1762−1770，1993）に記載の通りにしてヒヒ において利用した。長さ１〜２cmのヒヒの動脈区域を取り出し、ひっくり返し、 そして動脈の内膜及び約50％の媒質を取り除くためにひっかいた。その動脈をそ の正しい向きに戻し、両端にカヌーレを施し、そしてヒヒの体外シャントに設置 し、これによりその機械的に傷害を受けた動脈をそのシャントを介してヒヒの血 液にさらされるようにした。シャントを循環血液に通じさせる直前に、¹¹¹In− ラベル化自己血小板をその動物に静脈内注射した。傷害を受けた動脈部位での血 小板の蓄積レベルをリアルタイム・ガンマーカメライメージングにより決定した 。 血小板蓄積の阻害についてのDEGR−VIIａ因子の評価はDEGR−VIIａ因子又は食 塩水コントロールのボーラス注射を利用して行い、そしてシャントを通じさせる 直前に与えた。傷害を受けた動脈を60分間連続測定した。0.005mg／kgのDEGR−V IIａ因子投与量が血小板蓄積を阻害した。1.0mg／kgのボーラス注射では、約90 ％の血小板蓄積が薬剤投与の１時間後において阻害された。 これらのデーターは、DEGR−VIIａ因子による組織因子の阻害が、急性血管傷 害の非ヒト霊長類モデルにおける血小板に富む血栓の発症を有意に阻害すること を示す。 実施例ＸII DEGR −ＦVIIａはバルーン血管形成術を経たアテローム症のウサギの血管再狭 窄を阻害する DEGR−ＦVIIａを、バルーン血管形成術を経たニュージーランドホ ワイト(NZW)アテローム症ウサギにおける損傷発症を軽減するその能力について 評価した。この動物モデルはよく特性決定されており、そして血管損傷発症に対 する抗血栓性化合物の評価のための良好なモデルであることが実証されている(G impleら，Circulation 86 : 1536−1546（1992）及びRogostaら， Circulation 89 : 1262−1271(1994))。DEGR−ＦVIIａを評価するために用いる動物モデルは 本質的にRagosta 前掲に述べられている。 ウサギを筋肉内注射により５mg／kgのキシラジン及び35mg／kgのケタミンで麻 酔した。近位大腿動脈を近位及び末梢結紮して鼠径靭帯を下を切ることにより曝 露させた。取り出したセグメントに27ゲージ針をカヌーレ挿入した。針穿刺によ り穴を開けた。取り出したセグメントに食塩水をフラッシングして残留血液を除 去し、そしてエアーを80ml／min の速度で８分注入することにより乾燥させた。 エアー乾燥後、取り出したセグメントに再度食塩水をフラッシングし、そして結 紮糸を除去した。非閉塞性局部加圧により止血を維持した。このセグメントを金 属クリップで分界した。局部痙攣は１％のキシロカインで局部処置した。手術の 後、動物をバルーン血管形成術まで１ケ月にわたり１％のコレステロール及び６ ％のピーナッツオイル食に付した。術後の痛みの緩和のためにタイレノールを10 mg／kgで経口付与した。術後３〜５日目にはアンビペンを１cc与えた。 動物に対する試験薬導入は、バルーン血管形成術直前の初期ボーラス注射、そ れに次ぐ内頸静脈を介する浸透ポンプによる連続全身点滴より成る。薬剤点滴期 間は３日とした。コントロール動物には、バルーン血管形成術の前に 150Ｕ／kg IVボーラスのヘパリンを与え、次いで食塩水点滴した。DEGR−ＦVIIａ処置し た動物には１mg／kgのボーラス注射、次いで50μｇ／kg／hrの点滴を与えた。 連続全身点滴のための浸透ポンプの設置のため、動物を上記の通りに麻酔し、 そしてその処置の間ケタミン及びキシラジンの追加のIM注射を維持しておいた。 中線頸部切開を介して、右内頸静脈をブラント切開により取り出し、そして末端 を結紮した。右内頸静脈にシラスチックチューブ(PE−160)を導入した。シラス チックチューブを返すために皮下トンネルを設けた。このチューブを浸透ポンプ に接続した。この浸透ポンプをウサギの背中に皮下移植した。右共通頸動脈をブ ラント切開により取り出し、そして末端を結紮した。動脈切開術を介して、５Ｆ 導入器を設置し、そして大動脈弓の接合部にまで進めた。止血パラメーター、薬 剤及びコレステロールレベルの決定のために採血した。20mgのキシロカインを動 脈内注射した。コントロールの腸骨・大腿大動脈血管撮映を、手により３秒間に わたり注射する３〜４mlのノレグラフィンを利用して大動脈分岐の上に配置した ５Ｆ Berman カテーテルを介して行った。 Bermanカテーテルの除去の後、0.014 インチのガイドワイヤーを下向性大動脈 に導入し、そして大動脈分岐の上方に配置した。フルオロスコープガイドものと で、2.0〜2.5mm の適当なサイズのバルーン血管形成カテーテルを導入し、そし てガイドワイヤーを超えて狭窄にわたって配置した。バルーンを手動インフレー ターにより６大気圧に60秒間ふくらました。３回のふくらましを、ふくらましの 間60秒の間隔をおいて実施した。この処置を各動物における双方の大腿動脈に施 した。 バルーン拡張の後、血管形成カテーテルを抜き取り、そしてBermanカテーテル を大動脈分岐の３cm上の位置に再導入した。痙攣を最小限にするため、20ｇのリ ドカインを動脈内付与した。大腿動脈のレベルに１cmのグリッドを配置し、実際 の直径を計算した。次いでカテーテルを取り除いた。右頸動脈を３−０絹により 層状で巻状縫 合することにより結紮した。アンビペン及びアセタミノフェンを上記の通りに与 えた。 血液中でのDEGR−ＦVIIａのプロトロンビン時間及び濃度を試験化合物のボー ラス注射の直前、ボーラス注射の１hr後、及び連続点滴の終了３日後に決定した 。１〜２mlのクエン酸処理血漿を獲得し、そしてプロトロンビン時間及び抗原レ ベルを決定した。 コントロール及びDEGR−ＦVIIａ処置動物におけるプロトロンビン時間をモニ ターするために以下の通りの標準凝塊アッセイを利用した。抗凝血剤としてのク エン酸ナトリウムと一緒に集めた25μｌの試験ウサギ血漿を 150μｌのTBS（20m Mのトリス、pH7.4, 150mMのNaCl）に加えた。このサンプルを混合し、そしてEl ectra 800 自動凝塊タイマー(Medical Laboratories Automation，Pleasantivil le，NY)に入れた。インキュベーション後、25mMのCaCl₂を含む 200μｌのトロン ボプラスチン調製品（Sigma Chemical）を血漿調製品に加えた。コントロールの ウサギ血漿において約20秒の凝塊時間をもたらすトロンボプラスチン濃度を選定 した。 コントロール及びDEGR−ＦVIIａ処置したウサギ由来の血漿サンプル中のDEGR −ＦVIIａの濃度を決定するためにELISA アッセイを利用した。このアッセイは 抗−ヒトＦVIIモノクローナル抗体(New Mexico大学のDr．W．Kisiel)の 0.1Ｍの 炭酸バッファー pH9.6への 2.0μｇ／mlに至る第１希釈、及び96穴プレートへの 100μｌ／ウェルでの添加を含む。次いでプレートを４℃で一夜インキュベート し、次いで洗浄バッファー（PBS，pH7.4，0.05％のTween 20含有）を利用して２ 回洗浄した。非特異的結合部位のブロッキングはウェル当り 200μｌのブロッキ ングバッファー（PBS，pH7.4，0.05％のTween 20及び１％のBSA 含有）との37℃ で２hrにわたるインキュベーション、それに続く洗浄バッファーを利用する洗浄 により成し遂げた 。 ブロッキング後、20〜0.027 ng／mlに範囲するDEGR−ＦVIIａの標準希釈系列 を、100μｌ／ウェルで適用した試験ウサギ血漿の希釈系列（ブロッキングバッ ファー中で１：100 〜１：4000）と一緒に加えた。ネガティブコントロールとし て非免疫ウサギ血漿を用いた。次いでプレートを37℃で１ｈインキュベーション し、そして洗浄バッファーで４回洗浄した。 DEGR−ＦVIIａはブロッキングバッファー中の１：1,000 希釈率のウサギ抗ヒ トＦVIIポリクローナル抗体（New Mexico大学のDr．Kisiel）の 100μｌ／ウェ ルでの添加により検出した。プレートを37℃で１ｈインキュベーションし、次い で洗浄バッファーで５回洗浄した。特異的な抗体結合は１：2,000 希釈率のヤギ 抗−ウサギIgG 抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Tago，Inc.）100 μｌ ／ウェルを用いて検出した。プレートを37℃で１ｈインキュベーションし、そし て洗浄バッファーで６回洗浄した。最後に、100μｌの基質溶液(0.2Ｍのクエン 酸バッファー pH5.0中の0.42mg／mlのＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩〔OPD〕 、0.3％のH₂O₂含有)を加えた。室温で１〜３分後、発色反応を 100μｌ／ウェル の１ＮのH₂SO₄を加えることにより停止させ、次いでプレートをマイクロプレー ト光度計で 490nmにおいて読み取った。血漿サンプル中のDEGR−ＦVIIａの濃度 は、未知のもののＡ₄₉₀値をDEGR−ＦVIIａ標準曲線のそれと対比させることによ り決定した。 プロトロンビン時間及びDEGR−ＦVIIａ抗原レベルについての血漿サンプルの 分析を表13及び14のそれぞれに示す。データーは個別の動物について示す。表15 は平均凝塊時間のまとめを示す。全てのケースにおいて、DEGR−ＦVIIａ処置し た動物はボーラス注射１時間後の時点で高いプロトロンビン時間を有し、これは ３日目においてほ ぼ処置前のレベルにもどった。DEGR−ＦVIIａ抗原レベルの分析は１hrの時間に おいて高い血漿中のDEGR−ＦVIIａレベルを示し、血漿中で２〜６μｇ／mlに範 囲し、３日目でははるかに低い循環レベルとなった。１hr目で測定したDEGR−Ｆ VIIａのレベルはプロトロンビン時間の推定上昇と一致し、それは正常ウサギ血 漿をDEGR−ＦVIIａでin vitroでスパイキングし、そして標準希釈トロンボプラ スチンアッセイにおいてプロトロンビン時間を測定することにより測定した。 血管形成術の３週間後、犠牲にする直前に左頸動脈を介して上記の通りにフォ ローアップ血管撮映を繰り返した。垂直下方腹部切開を介し、遠位大動脈を取り 出し、その近位をくくり、そしてパーフュージョンカヌーレを大動脈分岐の上に 挿入した。遠位大動脈に50 mlの食塩水をフラッシュし、次いで 500mlのHistochoice(AMRESCO，Solon，Oh) 溶液を 120mmHgで15分注入することで in vivo固定した。パーフュージョンを開 始したら、動物を過剰用量のネムブタール（３mlのナトリウムペントバルビター ルIV，65mg／ml）で犠牲にした。５cmの大腿動脈セグメントを左右から切り出し た。この組織を光学顕微鏡観察のためにHistochoice 溶液の中に保存した。 バルーン血管形成部位での内膜損傷発生を調べるため、切除した大腿動脈を３ mmのセクションに切り、パラフィンの中に包埋し、そして各動脈について多数の 領域から切片を切り出した。この切片をガラススライドの上に載せ、そしてその スライドをヘマトキシリン及びエオシン、並びにVan Giemson 染色液で染色した 。形態分析をBioquant Programにより実施し、管腔、内膜及び中膜の面積を得た 。負傷した動脈由来の組織セクションの形態分析は、全管腔面積；内部弾性層内 の面積を測定し、それから各組織区分由来の対応の管腔面積を差し引くことによ り決定した内膜の面積；及び外部弾性層の内側の面積を測定し、それから内部弾 性層の内側の面積を差し引くことにより決定した中膜の面積を測定して行った。 コントロール及びDEGR−ＦVIIａ処置した動物における大腿動脈の内膜損傷につ いての測定は、DEGR−ＦVIIａ処置した動物における内膜のサイズの有意な減少 を示した（表16）。反対に、中膜領域の測定は２つの群の間での有意な差を示さ なかった。 血管撮映測定由来のデーターを表17に、コントロール及びDEGR−ＦVIIａ処置 した動物の血管形成術直前、血管形成術直後及び血管形成術の21日後の３つの時 点全てについての平均管腔直径(MLD)±標準偏差として紹介する。血管形成術直 前及び直後のいづれにおいても、コントロール動物とDEGR−VIIａ処置動物との 間でMLD の有意な差はなかった。しかしながら、DEGR−ＦVIIａ処置した動物に おいては血管形成術の21日後の測定においてMLD の有意な上昇が認められた。 実施例ＸIII DEGR −ＦVIIａによるヒヒのSMC 上での細胞表層Ｘａ因子の発生の抑制 細胞表層組織因子に対するＦVIIａ結合を阻害する、及びそれに引き続くヒヒ の平滑筋細胞(SMC)の単層上でのＸ因子からＸａ因子に至る変換を阻害するDEGR −ＦVIIａの効能を測定するために細胞表層発色アッセイを本質的に上記の実施 例VIIIに記載の通りに開発した。この方法はSakai ら，J ．Biol．Chem. 264：99 80−9988（1989）及びWildogooseら Proc ．Natl．Acad．Sci．USA. 87 ：7290− 7294（1990）に記載の方法の改良である。ヒヒのSMC はワシントン大学Seattle ，WA より入手し、そして大動脈外植から培養した。ヒヒのSMC を96穴培養皿の 中で、10％の胎児牛血清の添加された 200μｌ／ウェルのDMEM培地の中で 8,000 細胞／ウェルの濃度でプレート培養 し、そして５％のCO₂の中で37℃で４日間この培地の中に維持した。アッセイ時 、110μｌの培養培地を除去し、そして上昇していく濃度のＦVIIａ又はDEGR−Ｆ VIIａの組合せとなったＦVIIａをウェルに加えた。５nMから0.04nMに範囲するＦ VIIａ濃度の標準曲線を作った。ＦVIIａ活性に対するDEGR−ＦVIIａの阻害活性 を測定するため、上昇していく濃度のDEGR−ＦVIIａを一定量のＦVIIａ（５nM） の存在下で試験ウェルに加えた。ＦVIIａ及びDEGR−ＦVIIａの双方をHEPES バッ ファー(10nMのHEPES，137mMのNaCl，４mMのKCl，５mMのCaCl₂，11mMのグルコー ス、0.1％のBSA)で希釈し、そして10μｌの10×ストック溶液を細胞に加えた。 この細胞を試験化合物と37℃で２ｈインキュベーションし、次いでHEPES バッフ ァーで３回洗った。トリスバッファー(25mMのトリス、pH7.4，150mMのNaCl，2.7 mMのKCl，５mMのCaCl₂，0.1％のBSA)中の 200nMのＸ因子溶液50μｌを各ウェル に加えた。室温で４分後、25μｌの 0.5ＭのEDTAを加えてＸ因子からＸａ因子に 至る変換を停止させた。ウェル当りトリスバッファー中の25μｌの 0.8mMのＳ− 2222、即ちＸａ因子特異的発色基質を加え、そして 405nmでの吸収を60分後にTh ermomax マイクロプレートリーダー(Molecular Devices Corp.，Menlo Park，CA )で測定した。 図３に示す結果は、ＦVIIａ処理ウェル（白四角）についての用量依存性アミ ド分解活性の上昇を示す。吸収の上昇はウェルの中で生じたＸａ因子のレベル及 び発色基質のその後の分解の直接的な尺度である。添加するDEGR−ＦVIIａの量 を増やし、ＦVIIａの量を一定にすると（５nM）、DEGR−ＦVIIａのレベルの上昇 に伴いアミド分解活性の用量依存性低下が示された（黒四角）。DEGR−ＦVIIａ 、対、ＦVIIａの等モル比は発色活性を＞90％阻害できた。10分の１のレベルのD EGR−ＦVIIａでさえも、Ｘａ因子発色活性の発生の40％阻害があ った。これらの結果は、DEGR−ＦVIIａが、SMC の無傷な細胞単層の表層に対す るＦVIIａによるＸ因子からＸａ因子に至る活性化の非常に有能な拮抗因子であ る所見を裏付けする。 実施例ＸIV ヒヒの血管血栓形成及び血管損傷形成に対するDEGR−VIIａ因子の効果 ヒトDEGR−VIIａ因子を、非ヒト霊長類における機械的血管損傷により誘導さ れる血管損傷形成(VLF)の組織因子（TF）及び活性化VII因子（ＦVIIａ）媒介を 阻害する能力について試験した。 ヒヒにおいて機械的血管損傷を作り上げる直前から始めて、DEGR−VIIａ因子 を７日間（５匹の動物）又は30日間（１匹の動物）静脈内点滴した。30日目に血 管損傷形成についての測定を行った。５匹の処置動物の結果を、同時進行させた ５匹のビヒクルバッファー点滴コントロールにおける結果と比較した。 以下についての基底測定値を試験動物について得た；ａ）血小板数、好中球数 、単球数及び赤血球数；ｂ）血漿フィブリノーゲンレベル；ｃ）抗原レベルのＦ VIIとのVII，VIIａ，Ｘ及びＶ血漿凝固因子の活性レベル；並びにｄ）抗VIIａ因 子抗体についての基底血漿サンプルレベル。 ハロタン麻酔及び無菌作業条件下で、自系¹¹¹In−血小板でラベルした動物に 、連続静脈内投与のためのテザー（tether）系を用いてDEGR−ＦVIIａの静脈点 滴を与えた（最初は１mg／kgのボーラス注射、続いて50μｇ／kg／hrの連続静脈 内点滴）。動物を外科的頸動脈血管内膜切除術、左右上腕動脈又は左右大腿動脈 Fogarty バルーンカテーテル血管形成術にかけた。 DEGR−ＦVIIａをテザー系を用い、静脈内カテーテルを介する連続点滴により ７又は30日間投与した。手術の30日後、動物をハロタン で麻酔し、そして 0.1％のグルタルアルデヒドを含む４％のパラホルムアルデヒ ドで30分 in situ加圧パーフュージョン固定にかけた。その際、血管セグメント （予め損傷した部位を含む）をHarkerらCirculation 83:41−44（1991）及びHan sonらHypertension 18 ：1170−1176（1991）の手順を利用して回収した。検体 をin vitroで後固定し（0.1 ％のグルタルアルデヒドを含む４％のパラホルムア ルデヒド）、低温保存し、そして損傷程度の形態分析を行った。 11匹の正常な成熟ヒヒ(Paio anubis)を試験した。６匹の動物にDEGR−ＦVIIａ 点滴（50μｇ／kg／hr）を与え、そして残りの５匹はDEGR−ＦVIIａを与えない コントロール動物とした。動物を寄生虫駆除にかけ、そして利用するまで３ケ月 にわたり病気がないものと観察された。手順は全てInstitutional Animal Care and Use Commitecにより認定され、そしてCare and Use of Laboratory Animals 及びAnimal Welfare Act及び関連の機関により指針された手順及び方法に合致す る。侵入性手順はケタミン（10mg／kg筋肉内）及びバリウム(0.5mg／kg静脈内) により誘導した後のハロタン麻酔のもとで実施した。術後の実験手順の実施にお けるその後の短時間固定のため、ケタミン塩酸塩（５〜20mg／kg：筋肉内）を利 用した。 頸動脈血管内膜切除術を、引用することで本明細書に組入れるHansonらHypert ension 18 ：1170−1176（1991）及びKrupski ら、Circulation 84：1749−1757 （1991）の技術を利用する中線頸部切開を介して実施した。動脈血管内膜切除術 を血管損傷モデルとして利用した。その理由はその臨床的適正、及び正常な動脈 の血管内膜切除術により誘導されるVLF が再現性を有することにある。簡単に述 べると、共通頸動脈の近位鎖骨から遠位頸部分岐にかけての周囲組織を切除した 。共通頸動脈を硫酸ヘパリンのボーラス注射(静脈内で 100Ｕ／kg；Elkins-Simm Inc.，Cherry Hill，NJ)の３分後に露 出脈管の各端に配置した外傷性血管クランプを用い交差クランプし、そして遠位 交差クランプの１cm近傍で分割した。近位動脈セグメントを湾曲したメスの上に めくり返した。最大のめくりとなったら、管腔露出セグメントにおいて、一対の ポリプロピレン支持縫合糸（７−０）をいづれかの側に近傍的に、そして第二対 を遠位的に配置した。次に動脈内膜切除術をめくり返した血管セグメントの分割 した先端から１cmの箇所で始め、そして１cmの測定距離にわたって続けた。この 手順は、メス及び外科用顕微鏡（倍率32倍）を利用する、正常な内膜及び中膜の 部分的な厚みの機械的除去含む。動脈内膜切除術の後、血管をその正常な形態に もどし、そして７−０ポリプロピレン縫合糸及び 2.5の倍率での連続技術並びに 層状での巻状閉鎖により先端吻合を実施した。 VLF の形態分析のため、セクションをパラフィンに包埋し、そして接続組織成 分（コラーゲン、エラスチン）について染色し、そしてヘマトキシリン−エオシ ンにより、高解像(700ライン)モニターに装着された高解像(580ライン)CCD マイ クロスコープカメラ、IBM 386 チップ、イメージ獲得及び保存のための高解像グ ラフィックデシタブルの装着された80MBコンピューターより成るイメージ分析系 （Thomas Optical Measurement Systems，Columbus，GA）の付いたZeiss フォト スコープを用いて評価した。定量イメージ分析は形態ソフトウェアドライバー(O ptimas，Bioscan，Inc.，Edmonds，WA)を利用して実施した。動脈横断面は新生 内膜増殖損傷と対応の動脈中膜領域の総面積に関連して分析した。統計学的分析 のため、グループ間の対比を対合及び不対合データーに関してStudent t 検定（ ２テール）を利用して行った。 結果は、内膜面積が、７日間にわたりDEGR−VIIａ因子により処置し、そして3 0日目に試験した動物において、同じ血管損傷を有する がDEGR−VIIａ因子を全く獲得していないコントロール動物と比べて有意に縮小 されたことを示した（図４）。類似の結果が30日間DEGR−VIIａ因子で処置し、 そして30日目に調べた動物において見い出された。 バルーン血管撮映した上腕動脈モデルによる予備試験は、DEGR−VIIａ因子療 法の有意義な長所を示唆しなかった。しかしながら、このモデルは、組織因子が 重要な役割を担っている血栓形成前のモデルであるヒヒで実証されていない。 ヒヒでの大腿動脈バルーン損傷による試験は、図５に示す通り、コントロール と比べてDEGR−VIIａ因子に由来する統計学的に有意な長所を示した。 実施例ＸＶ tPA 誘導型血栓溶解に対するDEGR−VIIａ因子の効果 急性心筋梗塞の際の進行中の冠状血栓形成は主として外生凝塊経路を通じてVI Iａ因子と複合した組織因子（TF）により媒介される。組織プラスミノーゲンア クチベーター(TPA)血栓溶解の効率に及ぼす内因性経路における様々な時点での 付随的な凝固カスケードの効果を決定した。 tPA による血栓溶解（20分にわたり１mg／kg）にかけている電気誘導式冠状血 栓を有する36匹のイヌに４通りの付随処置の１つを付与した：９匹に選択的Ｘａ 因子インヒビターであるチック抗凝固ペプチド(TAP)を30μｇ／kg／min で90分 与えた。TF−VIIａ因子複合体を９匹のイヌにおいて組換組織因子経路インヒビ ター(TFPI)（100〜150 μｇ／kg／min で90分）により阻害し、そして９匹のイ ヌにおいて活性化VIIａ因子の競合拮抗因子としてのDEGR−VIIａ（１〜２mg／kg のボーラス）により阻害した。９匹のイヌに食塩水コントロールを与えた。イヌ を血栓溶解後 120分にわたって再閉塞につい て観察した。血栓溶解に及ぼす効率性に対するこれらの因子の効果を以下の表18 に示す（データーは平均±SDとして表示）。 これらのデーターは、DEGF−VIIａ又はTFPIによるＸａ因子又はTF−VIIａ因子 遮断のいづれかを介する外因性経路阻害が tPA−誘導式血栓溶解を加速すること を示唆した。Ｘａ因子の選択阻害は有効な再濯流を経て動脈通気性をより効率的 に維持した。 実施例ＸVI 全身系凝塊に影響することなく血管内血栓形成を阻害する改良型VIIａ因子 TFに対するVII因子の結合の阻害が抗血栓効果をもたらすかどうかを調べるた め、再発血栓形成に基づく循環流変動(CFV)を内皮損傷ウサギ頸動脈（Fotts モ デル）のまわりに外部圧迫器を設置することにより開始させた。頸部血流を圧迫 器の近くにドップラーフロープローブを配置することにより連続的に測定した。 圧迫器を動脈のまわりに配置した後、６羽のウサギのうちの６羽においては平均 11±２サイクル／hrの周波でCFV が発生し、一方頸部血流速はCFV の底期におい て平均５±２％の基底値であった。CFV を30分観察後、動物にヒト組換活性部位 ブロックされた（Phe-Phe-Arg-クロロメチルケトン）VIIａ因子(ＦVIIai)（0.1m g／kg／min で10分）の点滴を付与した。VIIai因子は６羽の動物のうちの６羽に おいてCFV を完全 に消失させた(CFV周波＝０サイクル／hr；ｐ＜0.05；頸部血流速＝基底値の 106 .9％；ｐ＝NS vs.基底値)。CFV の阻害の30分後、ヒト組換ＦVIIａを10分にわた り 0.1mg／kg／min の用量で点滴した。VIIａ因子の点滴は全ての動物においてC FV を復帰させ、それ故TFに対するVIIａ因子の結合が競合的であることを示唆す る。プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、並びにADP 及び トロンビンに応答する ex vivo血小板凝集は基底値と比較して、ＦVIIai点滴を 経ても相違がなかった。即ち、ＦVII−VIIａは in vivoでの血栓形成の開始にお いて重要な役割を果たす。VIIai因子の投与は全身凝固に影響することなくこの モデルにおいて有能な抗血栓作用を及ぼした。 以上より、改質された触媒部位を有し、組織因子に結合し、しかもＸ及びIX因 子を実質的に活性化できないVII因子又はVIIａ因子の組成物が提供されることが 明らかである。改良型VII因子は凝塊因子を分解又は消費することなく凝塊カス ケードを妨害できるため、改良型VII因子調製品の投与は現状の療法で経験する よりも少ない望ましくない副作用が伴うであろう。更に、本明細書に記載のこの 改良型VII因子は組換手段により簡単に作られうる。その薬効、慣用さ、並びに 低投与量及び少ない投与頻度の経済性、更には毒性の相対的欠如が本発明の組成 物により供される利点である。 以上で本発明を例示の目的でかなり詳しく説明してきたが、本発明はその範囲 を逸脱すること変更及び改良されうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バークナー，カスリーン，エル. アメリカ合衆国，オハイオ 44106，クリ ーブランド ハイツ，チャットフィールド 2194 (72)発明者 ピーターセン，ラルス，クリスチャン デンマーク国，デーコー−ホールソルム, ハベバイ ４ (72)発明者 ハート，チャールズ，イー. アメリカ合衆国，ワシントン 98036，ブ リエール，トゥエンティーファースト ア ベニュ ウェスト 21502 (72)発明者 ヘドナー，ウラ スウェーデン国，エス−21 618 マルモ ー，カリタスガートン 19 (72)発明者 ブレゲンガルド，クラウス. デンマーク国，デーコー−2900 ヘルラッ プ，ホースガルズ アレ 72

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の組織因子活性を阻害するための方法であって、この患者に、触媒中 枢において少なくとも一つの改良を有するVII因子を含んで成る治療的に有効な 投与量の組成物を投与することを含んで成り、ここでこの改良は血漿Ｘ又はIX因 子を活性化するこの改良型VII因子の能力を実質的に阻害するものである、方法 。 ２．前記改良が、VII因子とセリンプロテアーゼインヒビターとの反応を含ん で成る、請求項１記載の方法。 ３．前記プロテアーゼインヒビターが有機燐化合物、スルファニルフルオリド 、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドである、請求項２記載の方法。 ４．前記プロテアーゼインヒビターがダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケト ン、ダンシル-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメ チルケトン及びPhe-Phe-Arg クロロメチルケトンから選ばれるペプチドハロメチ ルケトンである、請求項３記載の方法。 ５．患者の血小板沈着を阻害するための方法であって、この患者に、触媒中枢 において少なくとも一つの改良を有するVII因子を含んで成る治療的に有効な投 与量の組成物を投与することを含んで成り、ここでこの改良は血漿Ｘ又はIX因子 を活性化するこの改良型VII因子の能力を実質的に阻害するものである、方法。 ６．前記改良が、VII因子とセリンプロテアーゼインヒビターとの反応を含ん で成る、請求項５記載の方法。 ７．前記プロテアーゼインヒビターが有機燐化合物、スルファニルフルオリド 、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドである、請求項５記載の方法。 ８．前記プロテアーゼインヒビターがダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケト ン、ダンシル-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメ チルケトン及びPhe-Phe-Arg クロロメチルケトンから選ばれるペプチドハロメチ ルケトンである、請求項７記載の方法。 ９．前記VII因子の改良が、Ser，Asp及びHis の触媒性トリアドにおける少な くとも１個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含んで成る、請求項５記載の方法 。 10．患者の血管再狭窄を阻害するための方法であって、この患者に、触媒中枢 において少なくとも一つの改良を有する薬理学的に許容されるVII因子を含んで 成る治療的に有効な投与量の組成物を投与することを含んで成り、ここでこの改 良は血漿Ｘ又はIX因子を活性化するこの改良型VII因子の能力を実質的に阻害す るものである、方法。 11．前記改良が、VII因子とセリンプロテアーゼインヒビターとの反応により 施されるものである、請求項10記載の方法。 12．前記プロテアーゼインヒビターが有機燐化合物、スルファニルフルオリド 、ペプチドハロメチルケトン又はアザペプチドである、請求項11記載の方法。 13．前記プロテアーゼインヒビターがダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケト ン、ダンシル-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメ チルケトン及びPhe-Phe-Arg クロロメチルケトンから選ばれるペプチドハロメチ ルケトンである、請求項12記載の方法。 14．前記VII因子の改良が、Ser，Asp及びHis の触媒性トリアドにおける少な くとも１個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含んで成る、請求項10記載の方法 。 15．前記血管再狭窄が動脈に対する機械的損傷の二次的なものである、請求項 10記載の方法。 16．前記機械的損傷がバルーン血管形成術、動脈血管内膜切除術、整復アテロ ーム切除術、ステント設置、レーザー治療又はロトブレーションにより生じたも のである、請求項15記載の方法。 17．前記組成物を、前記動脈に機械的損傷を与える24時間前以内に個体に投与 する、請求項15記載の方法。 18．前記組成物を、前記動脈に機械的損傷を与えた後に個体に更に投与する、 請求項15記載の方法。 19．前記血管再狭窄が血管移植片、ステント、バイパス移植片又は器官移植片 の中で生じたものである、請求項10記載の方法。 20．前記組成物を、前記移植片、ステント、バイパス移植片又は器官移植片の 設置の24時間前以内に個体に投与する、請求項19記載の方法。 21．前記組成物を、前記移植片、ステント、バイパス移植片又は器官移植片の 設置の後に個体に投与する、請求項19記載の方法。 22．前記個体に組織プラスミノゲンアクチベーター又はストレプトキナーゼを 更に投与することを含んで成る、請求項10記載の方法。 23．個体における冠状動脈の急性閉塞を処置するための方法であって、触媒中 枢において少なくとも一つの改良を有する薬理学的に許容されるVII因子を含ん で成る組成物をこの個体に組織プラスミノゲンアクチベーター又はストレプトキ ナーゼと一緒に投与することを含んで成り、ここでこの改良は血漿Ｘ又はIX因子 を活性化するこの改良型VII因子の能力を阻害するものである、方法。