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JPH11506901A - テトラサイクリン調節される転写モジュレーター - Google Patents

テトラサイクリン調節される転写モジュレーター

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JPH11506901A
JPH11506901A JP8503915A JP50391596A JPH11506901A JP H11506901 A JPH11506901 A JP H11506901A JP 8503915 A JP8503915 A JP 8503915A JP 50391596 A JP50391596 A JP 50391596A JP H11506901 A JPH11506901 A JP H11506901A
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JP
Japan
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fusion protein
polypeptide
tetracycline
transcription
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JP8503915A
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ブヤルト，ヘルマン
ゴセン，マンフレート
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ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト
クノル アクツィエンゲゼルシャフト
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Abstract

(57)【要約】 真核細胞及び生物における遺伝子の発現を調節するのに有用な核酸分子及び蛋白質を開示する。この発明は、テトラサイクリン（又はそのアナログ）の存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合してｔｅｔオペレーター結合された遺伝子の転写を刺激するが、不在時には結合等しない転写アクチベーター融合蛋白質を提供する。この発明は、更に、ｔｅｔオペレーター結合された遺伝子の転写を調節された様式で阻止する転写インヒビター融合蛋白質を提供する。一具体例において、このインヒビター融合蛋白質は、テトラサイクリン（又はアナログ）の不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが存在時には結合しない。他の具体例においては、このインヒビター融合蛋白質は、テトラサイクリン（又はアナログ）の存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが不在時には結合しない。この発明の転写アクチベーター及びインヒビター融合蛋白質を組み合わせて用いて、１つ以上のｔｅ ｔオペレーター結合した遺伝子の発現を調節することができる。この発明の転写モジュレーターによる２つ以上の遺伝子の統合的又は独立的なテトラサイクリン調節される発現を可能にする新規なｔｅｔオペレーター含有転写ユニットをも開示する。この調節系の成分を含むキットも又、この発明に包含される。

Description

【発明の詳細な説明】 テトラサイクリン調節される転写モジュレーター発明の背景 細胞蛋白質の機能の分析は、一般に、引き続く付随する表現型の分析に対応す る遺伝子の発現レベルの変化によって容易になる。このアプローチのためには、 外来の刺激により制御される誘導可能な発現系が望ましい。理想的には、かかる 系は、遺伝子発現に関して「オン／オフ」を媒介するだけでなく、限られたレベ ルでの遺伝子の限定的発現をも可能にする。 遺伝子活性を制御する試みが、種々の誘導可能な真核生物プロモーター例えば 重金属イオン（Mayo等(1982)Cell 29:99-108; Brinster等(1982)Nature 296:39- 42; Searle等(1985)Mol.Cell Biol.5:1480-1489）、熱ショック（Nouer 等(1991 )Heat Shock Response(Nouer,L.編)フロリダ、Boca Raton在、CRC、167-220 頁中） 又はホルモン（Lee 等(1981)Nature 294:228-232; Hynes 等(1981)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 78:2038-2042; Klock 等(1987)Nature 329:734-736; Israel&Kaufma n(1989)Nucl.Acids Res.17:2589-2604）に対して応答性のものを用いて為されて きた。しかしながら、これらの系は、一般に、次の問題の一方又は両方に悩まさ れてきた：即ち（１）インデューサー（例えば、重金属イオン、熱ショック又は ステロイドホルモン）が、分析を面倒にし得る多面発現性効果を引き起こし、（ ２）多くのプロモーター系が、非誘導状態において高レベルの基礎活性を示し、 これは、調節された遺伝子を阻止し又、控え目な誘導因子を生じる。 これらの制限を回避するためのアプローチは、進化的に離れた種例えば大腸菌 からの調節エレメントを、かかる調節サーキットを調節するエフェクターが真核 細胞の生理に対して不活発であり、その結果、真核細胞において多面発現性効果 を誘出しないことが期待されるもっと高等な真核細胞に導入することである。例 えば、大腸菌のＬａｃリプレッサー（ｌａｃＲ）／オペレーター／インデューサ ー系は、真核細胞内で機能し、次の３つの異なるアプローチにより、遺伝子発現 を調節するために用いられた：即ち（１）プロモーター部位に適当に置かれた ｌａｃオペレーターによる転写開始の阻止（Hu & Davidson(1987)Cell 48:555-5 66; Brown等(1987)Cell 49:603-612; Figge等(1988)Cell 52:713-722; Fuerst等 (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-2553: Deuschle 等(1989)Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 86:5400-5405）；（２）ＬａｃＲ／オペレーター複合体による伸長 中の転写するＲＮＡポリメラーゼIIの封鎖（Deuschle等(1990)Science 248:480- 483）；及び（３）ＬａｃＲと単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のビリオン蛋白 質１６（ＶＰ１６）の活性化ドメインとの融合の原因であるプロモーターの活性 化（Labow 等(1990)Mol.Cell Biol.10:3343-3356; Baim等(1991)Proc.Natl.Acad .Sci.USA 88:5072-5076）。 Ｌａｃ系の一つのバージョンにおいては、ｌａｃオペレーター結合した配列の 発現は、Ｌａｃ−ＶＰ１６融合蛋白質により構成的に活性化され、イソプロピル −β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下で停止される（Labow 等(1990)前出）。この系の他のバージョンにおいては、ＩＰＴＧの存在下でｌａ ｃオペレーターに結合する（細胞の温度を増すことにより促進される）ｌａｃＲ −ＶＰ１６が用いられる（Baim等(1991)前出）。これらのｌａｃ系の真核細胞に おける利用は、部分的に、ＩＰＴＧが真核細胞中でゆっくりと不十分に作用し、 細胞毒性レベルに達する濃度で使用しなければならないために限られている。或 は、遺伝子発現を誘導するための温度シフトの利用は、細胞における多面発現性 効果を誘出することはありそうである。従って、迅速で高レベルの遺伝子発現の 誘導を示し旦つインデューサーが細胞毒性又は多面発現性効果を伴わずに真核細 胞により許容される、もっと効果的な誘導可能な調節系が必要である。 大腸菌のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性の成分は、真核細胞中でも機能するこ とが見出され、遺伝子発現を調節するために利用されてきた。例えば、テトラサ イクリンの不在においてｔｅｔオペレーターに結合して遺伝子転写を抑制するＴ ｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、ｔｅｔオペレーター配列を含むプロモーター からの転写を抑制するのに十分な高濃度で植物細胞中で発現された（Gatz,C.等( 1992)Plant J.2:397-404）。しかしながら、細胞中での下方調節（down-regulat ed）された遺伝子発現を維持するためにはＴｅｔＲの非常に高い細胞内 濃度が必要であるが、それは、多くの状況において達成できず、従って、その系 における「漏れ」を生じる。 他の研究において、ＴｅｔＲは、テトラサイクリン制御される転写アクチベー ター（ｔＴＡ）を造るためにＶＰ１６の活性化ドメインと融合された（Gossen,M .及びBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551）。このｔＴＡ融 合蛋白質は、ＴｅｔＲと同じ様式でテトラサイクリンにより調節される（即ち、 ｔＴＡは、テトラサイクリンの不在時にはｔｅｔオペレーター配列に結合するが 、テトラサイクリン存在下では結合しない）。従って、この系では、Ｔｃの連続 的存在において、遺伝子発現が停止され、Ｔｃが除去されると転写が誘導される 。発明の要約 この発明の一つの面は、真核細胞中での遺伝子発現を刺激するために原核生物 のＴｅｔリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の成分を利用する誘導 可能な調節系に関係する。この発明の系において、ｔｅｔオペレーター結合した ヌクレオチド配列の転写は、テトラサイクリンの不在時にはサイレントに維持さ れるが、テトラサイクリン（又はそのアナログ）の存在下では迅速且つ強力に誘 導され得る。転写は、少なくとも２つのポリペプチドよりなる融合蛋白質により 誘導される。それらのポリペプチドは、テトラサイクリン又はテトラサイクリン アナログの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合する第１のポリペプチド及び 真核細胞における転写を直接又は間接に活性化する第２のポリペプチドである。 好適具体例において、この融合蛋白質の第１のポリペプチドは、野生型リプレッ サーと逆の様式でＴｃにより調節される（即ち、Ｔｃの不在時ではなく存在時に ｔｅｔオペレーター配列に結合する）変異したＴｅｔリプレッサーである。従っ て、誘導剤（Ｔｃ又はＴｃアナログ）の不在時に、ｔｅｔオペレーター結合した ヌクレオチド配列の転写は、誘導されないままである。誘導剤の存在下では、ｔ ｅｔオペレーター結合したヌクレオチド配列は、この発明のトランスアクチベー ター融合蛋白質により刺激される。 この発明の誘導可能な調節系は、遺伝子発現の誘導が迅速で効率的且つ強力で あり（例えば、典型的には、１０００〜２０００倍の、最大で２０，０００倍の 発現の増大が認められた）、誘導剤が連続的に存在する必要がないという有利な 特性を有する。その上、誘導剤は、真核細胞において多面発現性効果又は細胞毒 性を引き起こさない。この発明の誘導可能な調節系は、イン・ビトロ又はイン・ ビボで、細胞中の遺伝子発現の調節に応用することができ、遺伝子治療応用又は トランスジェニック及び相同組換え生物（例えば、動物及び植物）における遺伝 子産物の発現に特に有用である。 この発明の誘導可能な調節系は、少なくとも２つの成分：テトラサイクリン誘 導可能な転写アクチベーター及び調節すべき標的の転写ユニットを含む。従って 、この発明の一つの面は、Ｔｃ誘導可能な転写アクチベーター（「トランスアク チベーター」）融合蛋白質及びこの融合蛋白質をコードする核酸（例えば、ＤＮ Ａ）に関係する。好適な融合蛋白質は、単純ヘルペスウイルスのビリオン蛋白質 １６（ＶＰ１６）の活性化ドメインと機能的に結合された、７１、９５、１０１ 及び／又は１０２位のアミノ酸から選択する少なくとも１つのアミノ酸の位置が 変異したＴｎ１０コードされたＴｅｔリプレッサーを含む（かかる融合蛋白質の ヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１及び２に示す）。一 具体例において、融合蛋白質の活性化ドメインは、ＶＰ１６の約１２７のＣ末端 アミノ酸を含む（例えば、SEQ ID NO:２の融合蛋白質）。他の具体例において、 活性化ドメインは、ＶＰ１６のＣ末端の約１１アミノ酸（そのアミノ酸配列は、 例えば、SEQ ID NO:４に示してある）の少なくとも１コピーを含む。必要な機能 的活性を有する他の変異したＴｅｔリプレッサー及び転写活性化ドメインは、こ の発明の範囲内にある。更に、トランスアクチベーター蛋白質は、この融合蛋白 質の細胞核への輸送を促進する第３のポリペプチドを含むことができる。例えば 、核への局在化のシグナル（例えば、SEQ ID NO:５に示したアミノ酸配列を有す る）を融合蛋白質に取り込むことができる。この発明は、更に、この発明のトラ ンスアクチベーター融合蛋白質をコードする核酸を含む組換えベクター及び宿主 細胞を提供する。この発明は又、更に、この発明のトランスアクチベーター融合 蛋白質をコードする核酸を含むトランスジェニック及び相同組換え生物を提供す る。 この発明のトランスアクチベーターを用いて、最小プロモーター配列及び少な くとも１つのｔｅｔオペレーター配列と機能的に結合された転写されるべきヌク レオチド配列よりなる標的転写ユニットの転写を調節する。転写されるべきヌク レオチド配列は、関心のある蛋白質又は活性なＲＮＡ分子（例えば、アンチセン スＲＮＡ分子又はリボザイム）をコードすることができ、外来性又は内在性のヌ クレオチド配列であってよい。この発明のトランスアクチベーターをコードする 第１の核酸及びそのトランスアクチベーターに対する標的転写ユニットを含む第 ２の核酸は、核酸組成物に取り込まれ得る。この核酸組成物を宿主細胞又は生物 （例えば、トランスジェニック及び相同組換え動物及び植物）に導入して、転写 されるべき標的ヌクレオチド配列のテトラサイクリン誘導可能な発現を与えるこ とができる。 転写されるべき単一ヌクレオチド配列の発現のための調節系の提供に加えて、 この発明は、転写されるべき２つ以上のヌクレオチド配列の統合的又は独立した 調節を可能にする新規な標的転写ユニットをも特徴とする。一具体例において、 転写されるべき２つのヌクレオチド配列の統合的調節は、転写されるべき第１の ヌクレオチド配列がｔｅｔオペレーター配列の５’末端に機能的に結合され、転 写されるべき第２のヌクレオチドが同じｔｅｔオペレーター配列の３’末端に機 能的に結合され、それにより、第１及び第２のヌクレオチド配列が発散様式で転 写される転写ユニットを用いて達成される。かかる二方向転写ユニットのための 適当な二方向プロモーターは、SEQ ID NO:６及び７に示してある。かかる転写ユ ニットは、同じ細胞中のヘテロダイマー蛋白質の２つのサブユニット（例えば、 抗体の鎖）の化学量論的量を生成するために又は関心のある遺伝子と同じ細胞内 の検出可能マーカーをコードする遺伝子とを同時発現させ、それにより、関心の ある遺伝子を発現する細胞の選択を可能にするために特に有用である。 他の具体例において、２つのヌクレオチド配列の独立の調節は、転写されるべ き第１のヌクレオチド配列が第１のクラスの型のｔｅｔオペレーターに機能的に 結合され、転写されるべき第２のヌクレオチド配列が第２の異なるクラスの型の ｔｅｔオペレーターに機能的に結合された転写ユニットを用いて達成される。２ つの異なる転写アクチベーター融合蛋白質を、次いで、２つのヌクレオチド配列 の転写を調節するために用いる：一つの融合蛋白質は、Ｔｃの存在下で第１のク ラスのｔｅｔオペレーター配列に結合するが、他の融合蛋白質は、Ｔｃの不在時 に第２のクラスのｔｅｔオペレーター配列に結合する（或は、第１の融合蛋白質 は、Ｔｃの不在時に第１のクラスのｔｅｔオペレーター配列に結合し、第２の融 合蛋白質は、Ｔｃの存在下で第２のクラスのｔｅｔオペレーター配列と結合する ）。この転写ユニットは、宿主中の治療遺伝子及び自殺遺伝子の発現を独立に調 節するために特に有用である。例えば、治療遺伝子の発現は、テトラサイクリン の存在において刺激され、次いで、治療が完了したときは、テトラサイクリンの 除去により自殺遺伝子の発現が刺激される。 この発明の他の面は、この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質を発現す る宿主細胞又は動物中の少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結 合されたヌクレオチド配列の転写を刺激する方法に関係する。宿主細胞において 、転写は、細胞をＴｃ又はＴｃアナログと接触させることにより刺激される。患 者（例えば、トランスジェニック又は相同組換え生物）において、転写は、Ｔｃ 又はＴｃアナログをその患者に投与することにより刺激される。種々のＴｃアナ ログを用いて及びこの誘導剤の濃度を変えて、遺伝子発現の誘導のレベルを調節 することができる。高レベルの遺伝子発現用の好適なＴｃアナログには、無水テ トラサイクリン及びドキシサイクリンが含まれる。この発明は、更に、この発明 の調節系を用いて関心のある蛋白質を製造し及び単離するための方法を提供する 。 この発明の他の面は、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列に結合された遺伝子 の発現を高度に制御された様式で阻止するのに有用なテトラサイクリン調節され る転写インヒビターに関係する。この発明の転写インヒビターは、少なくとも２ つのポリペプチド（ｔｅｔオペレーター配列と結合する第１のポリペプチド及び 真核細胞における転写を直接又は間接に阻止する第２の異種ポリペプチド）から なる融合蛋白質を含む。この第２の異種ポリペプチドは、第１のポリペプチドと は異なる蛋白質から誘導される。この発明の融合蛋白質は真核生物の転写的サイ レンサードメインを含むので、それらは、ＴｅｔＲリプレッサー単独よりも真核 細胞における転写の抑制に有効であることが予想される。 この発明の一具体例において、インヒビター融合蛋白質の第１のポリペプチド は、テトラサイクリン（Ｔｃ）又はそのアナログの不在時にｔｅｔオペレーター 配列に結合するが、存在時には結合しない（例えば、この第１のポリペプチドは 、好ましくは、Ｔｅｔリプレッサー、例えばSEQ ID NO:１７に示したアミノ酸配 列を有するＴｎ１０誘導されたＴｅｔリプレッサーである）。テトラサイクリン （又はＴｃアナログ）の不在時に、この融合蛋白質は、関心のある遺伝子に機能 的に結合されたｔｅｔオペレーター配列に結合し、それにより、関心ある遺伝子 の転写を阻止する。他の具体例において、この第１のポリペプチドは、テトラサ イクリンの存在下ではｔｅｔオペレーター配列に結合するが、不在時には結合し ない（例えば、第１のポリペプチドは、好ましくは、変異したＴｅｔリプレッサ ー、例えば７１、９５、１０１及び／又は１０２位にアミノ酸置換を有するＴｎ １０誘導されたＴｅｔリプレッサーである）。好ましくは、この第１のポリペプ チドは、SEQ ID NO:１９に示したアミノ酸配列を有する。テトラサイクリン（又 はＴｃアナログ）の存在下では、この融合蛋白質は、関心ある遺伝子に機能的に 結合したｔｅｔオペレーター配列に結合し、それにより、関心ある遺伝子の転写 を阻止する。 第２のポリペプチドは、蛋白質例えばｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物、Drosop hila Krueppel 蛋白質、レチノイン酸レセプターα、甲状腺ホルモンレセプター α、酵母Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１蛋白質複合体、偶数スキップDrosophila蛋白質、Ｓ ＩＲ１、ＮｅＰ１、Drosophila dorsal 蛋白質、ＴＳＦ３、ＳＦＩ、Drosophila hunchback蛋白質、Drosophila Knirps 蛋白質、ＷＴ１、Ｏｃｔ−２．１、Dros ophila engrailed蛋白質、Ｅ４ＢＰ４又はＺＦ５からの転写的「サイレンサー」 ドメインであってよい。好適なサイレンサードメインは、Kruppelのアミノ酸残 基４０６〜４６６（SEQ ID NO:２１に示してある）及びｖ−ｅｒｂＡのアミノ酸 残基３６４〜６３５（SEQ ID NO:２３に示してある）を含む。 この発明の融合蛋白質は、更なるポリペプチド例えば、融合蛋白質の細胞核へ の油相を促進する第３のポリペプチド（即ち、核への輸送用アミノ酸配列）を、 更に含んでよい。 この発明は、更に、この発明の転写インヒビター融合蛋白質をコードする単離 した核酸分子及び、これらの核酸分子を、コードされた転写インヒビター融合蛋 白質の宿主細胞での発現に適した形態で含む組換え発現ベクターを提供する。こ の発明は、尚更に、この発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供 する。従って、転写インヒビター融合蛋白質は、これらの宿主細胞において発現 される。宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、酵母細胞、 カビ細胞又は昆虫細胞であってよい。更に、宿主細胞は、受精した非ヒト卵母細 胞であってよく、この場合、宿主細胞を用いて、転写インヒビター融合蛋白質を 発現する細胞を有するトランスジェニック生物を造ることができる。尚、更に、 融合蛋白質をコードする核酸と宿主細胞内の標的遺伝子との間での相同組換えを 与える組換え発現ベクターをデザインすることができる。かかる相同組換えベク ターを用いて、この発明の融合蛋白質を発現する相同組換え動物を造ることがで きる。 好適組換えにおいて、宿主細胞（又は宿主生物の細胞）は又、少なくとも１つ のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写されるべきヌクレオチド配 列をも含む（例えば、発現がＴｃ又はそのアナログにより調節され得る関心ある 遺伝子）。これらの宿主細胞中のｔｅｔオペレーター結合された関心ある遺伝子 の転写を調節するために、宿主細胞と接触するＴｃ（又はそのアナログ）の濃度 を変える。例えば、転写インヒビター融合蛋白質がＴｃの不在時にｔｅｔオペレ ーターに結合するときは、細胞に接触するＴｃの濃度を減らして、それにより、 関心あるｔｅｔオペレーター結合した遺伝子の転写を阻止する（例えば、もし細 胞を先ずＴｃの存在下で培養するならば、次いで、培養培地からＴｃを除去して 関心ある遺伝子の転写を阻止することができる）。或は、転写インヒビター融合 蛋白質がＴｃの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するときは、細胞と接触 するＴｃの濃度を増して、それにより、関心あるｔｅｔオペレーター結合した遺 伝子の転写を阻止する（例えば、もし細胞を先ずＴｃの不在にて培養するならば 、次いで、Ｔｃを培養培地に加えて関心ある遺伝子の転写を阻止することができ る）。 この発明の転写インヒビター融合蛋白質は、更にここに記載した様々な状況に おいて遺伝子発現を阻止するのに有用である。特に好適な具体例においては、 同じ宿主細胞中のテトラサイクリン調節される転写インヒビターとアクチベータ ー融合蛋白質との組合せにより、関心あるｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）結合 された遺伝子の転写を調節して、その関心ある遺伝子の発現レベルの正確な制御 を与える。例えば、Ｔｃの存在下でのみｔｅｔＯに結合するアクチベーター融合 蛋白質及びＴｃの不在時にのみｔｅｔＯに結合するインヒビター融合蛋白質が、 関心あるｔｅｔＯ結合した遺伝子を含む宿主細胞において発現される。Ｔｃの不 在時には、関心ある遺伝子の転写の基礎レベルは、インヒビター融合蛋白質によ り阻止される。細胞とＴｃ（又はアナログ）との接触に際して、関心ある遺伝子 の転写は、アクチベーター融合蛋白質により刺激される。この発明のアクチベー ター及びインヒビター融合蛋白質を組み合わせて用いて、関心ある多数のｔｅｔ Ｏ結合した遺伝子の発現を調節することもできる。 この発明の遺伝子の発現を調節するための新規なキットも又、この発明の範囲 内にある。一具体例において、この発明のキットは、この発明のトランスアクチ ベーター融合蛋白質をコードする少なくとも１つの核酸分子及び、関心ある遺伝 子をｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合するようにクローン化することので きる標的転写ユニットを含むことができる。或は、又は更に、これらのキットは 、この発明の転写インヒビター融合蛋白質をコードする核酸分子を含むことがで きる。関心ある多数の遺伝子を、例えば統合的又は独立的調節のためにクローン 化することのできる標的転写ユニットも又、この発明のキットに含まれ得る。更 に、少なくとも１つのテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを、これ らのキットに含めることができる。図面の簡単な説明 図１は、テトラサイクリン及び種々のテトラサイクリンアナログ（１μｇ／ｍ ｌ ｆ．ｃ．）による、ＨＲ５−Ｃ１１細胞におけるルシフェラーセ活性の刺激 を示す棒グラフである。ルシフェラーセ活性の測定前３日間、細胞を、示したテ トラサイクリン類の不在（−）又は存在下で生育させた。各無地及び平行線を引 いた棒は、単一の培養皿のルシフェラーゼ活性を表している。 図２は、種々の濃度のドキシサイクリンとインキュベートしたときのＨＲ５− Ｃ１１細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。３つの独立 の実験の結果を示してある。 図３は、ドキシサイクリンによる、ＨＲ５−Ｃ１１細胞におけるルシフェラー ゼ活性の誘導の動力学を示すグラフである。ＨＲ５−Ｃ１１培養物を、１μｇ／ ｍｌのドシキサイクリンにさらして、ルシフェラーゼ活性を種々の間隔で測定し た；（●）ドキシサイクリンを含む培養物、（○）抗生物質の不在において生育 させた培養物。 図４は、種々のクラスのＴｅｔリプレッサーのアミノ酸配列を示しており、ク ラスＢの（例えば、Ｔｎ１０誘導の）Ｔｅｔリプレッサーと比較した種々のクラ スのＴｅｔリプレッサーのアミノ酸配列間の相同性を示している。クラスＢと同 一である他のクラスのＴｅｔリプレッサー中のアミノ酸位置をダッシュで示して ある。 図５は、種々のクラスのｔｅｔオペレーターのヌクレオチド配列を示している ：クラスＡ（SEQ ID NO:１１）、クラスＢ（SEQ ID NO:１２）、クラスＣ（SEQ ID NO:１３）、クラスＤ（SEQ ID NO:１４）及びクラスＥ（SEQ ID NO:１５）。 図６は、テトラサイクリン調節される転写アクチベーターによる調節のための ものと同じｔｅｔオペレーターに機能的に結合された関心ある２つの遺伝子の統 合的調節のための二方向性プロモーター構築物の図式ダイヤグラムである。 図７Ａ（SEQ ID NO:６）は、テトラサイクリン調節される転写アクチベーター による関心ある２つの遺伝子の統合的調節のための二方向性プロモーター領域の ヌクレオチド配列を示している。 図７Ｂ（SEQ ID NO:７）は、テトラサイクリン調節される転写アクチベーター による関心ある２つの遺伝子の統合的調節のための二方向性プロモーター領域の ヌクレオチド配列を示している。 図８は、テトラサイクリン調節される転写アクチベーターによるルシフェラー ゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性の統合的発現を示すグラフである。 図９Ａ〜Ｂは、テトラサイクリン調節される転写アクチベーター（ｔＴＡ）の 発現に対する自己調節的プロモーターの図式ダイヤグラムである。パネルＡは、 Ｔｃの不在時にｔｅｔオペレーターに結合する野生型Ｔｅｔリプレッサー含有ト ランスアクチベーター融合蛋白質の発現の自己調節を示している。パネルＢは、 Ｔｃの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する変異したＴｅｔリプレッサー含有 トランスアクチベーター融合蛋白質の発現の自己調節を示している。 図１０は、増大する濃度のテトラサイクリンアナログ、ドキシサイクリンの存 在下における、それぞれ、テトラサイクリン調節される転写インヒビター蛋白質 （ｔＳＤ）及びテトラサイクリン誘導可能な転写アクチベーター融合蛋白質（ｒ ｔＴＡ）による、関心あるｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯｗｔ）結合した遺伝子 の負の及び正の調節の図式ダイヤグラムである。 図１１は、Krueppel又はｖ−ｅｒｂＡサイレンサードメインの何れかをコード する核酸のＴｅｔリプレッサーをコードする核酸（ｔｅｔＲ遺伝子）の３’末端 へのイン・フレーム融合による、ＴｅｔＲ−サイレンサードメイン融合構築物の 構築の図式ダイヤグラムである。 図１２は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子だけについてのトランスジェニッ クマウス（右のチェックのカラム）又はルシフェラーゼレポーター遺伝子とｔＴ ＡRトランスジーンを有する二重トランスジェニック動物におけるルシフェラー ゼ活性の、ドキシサイクリンの不在（中央の暗いカラム）又は存在下（左の明る いカラム）での発現のグラフ表示である。発明の詳細な説明 この発明は、真核細胞又は動物における遺伝子発現を高度に制御された様式で 調節するために用いることのできる核酸分子及び蛋白質に関係する。この発明の 系による遺伝子発現の調節は、少なくとも次の２つの成分を含む：調節配列に機 能的に結合された遺伝子及び、誘導性薬剤の存在又は不在時に調節配列に結合し て遺伝子の転写を活性化し又は阻止する蛋白質。この発明の系は、原核生物のＴ ｅｔリプレッサー／オペレーター／インデューサー系の成分を利用して真核細胞 における遺伝子発現を刺激する。 この発明の種々の面は、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列に結合したとき に遺伝子転写を活性化し又は阻止することができるが、テトラサイクリン又はそ のアナログが存在するとき又は不在のときにのみｔｅｔオペレーター配列に結合 する融合蛋白質に関係する。従って、宿主細胞において、ｔｅｔオペレーター配 列に機能的に結合された遺伝子の転写を、この発明の融合蛋白質により、宿主細 胞に接触しているテトラサイクリン（又はアナログ）の濃度を変える（例えば、 テトラサイクリンを培養培地に加え又は該培地から除去し、或は、テトラサイク リンを宿主生物に投与し又は該投与を止める）ことにより刺激し又は阻止する。 この発明は、更に、この発明の融合蛋白質による調節のための標的転写ユニッ トに関係する。関心ある単一のｔｅｔオペレーター結合した遺伝子の調節を可能 にすることに加えて、この発明は又、この発明のトランスアクチベーター融合蛋 白質により、統合的又は独立的様式にて調節され得る、転写されるべき２つ以上 の遺伝子を含む新規な転写ユニットをも提供する。テトラサイクリン（又はその アナログ）を用いる遺伝子転写の刺激又は阻止の方法；及びここに記載した調節 系の成分を含むキットも又、この発明に含まれる。 下記のサブセクションにおいて、この発明の誘導可能な調節系の成分を含む核 酸及び蛋白質、及びそれらの相互関係をもっと詳細に検討する。それらのサブセ クションは、下記の通りである： Ｉ．テトラサイクリン誘導可能な転写アクチベーター Ａ．トランスアクチベーター融合蛋白質の第１のポリペプチド Ｂ．トランスアクチベーター融合蛋白質の第２のポリペプチド Ｃ．トランスアクチベーター融合蛋白質の第３のポリペプチド II．トランスアクチベーター融合蛋白質の発現 Ａ．発現ベクター Ｂ．宿主細胞 Ｃ．宿主細胞中への核酸の導入 Ｄ．トランスジェニック生物 Ｅ．相同組換え生物 III．テトラサイクリン誘導可能なトランスアクチベーターにより調節される標 的転写ユニット Ａ．ｔｅｔオペレーター結合したヌクレオチド配列の発現の調節 Ｂ．２つのヌクレオチド配列の統合的調節 Ｃ．多数のヌクレオチド配列の独立的調節 Ｄ．多数のヌクレオチド配列の組み合わせた統合的及び独立的調節 IV．テトラサイクリン調節される転写インヒビター Ａ．転写インヒビター融合蛋白質の第１のポリペプチド Ｂ．転写インヒビター融合蛋白質の第２のポリペプチド Ｃ．転写インヒビター融合蛋白質の第３のポリペプチド Ｄ．転写インヒビター融合蛋白質の発現 Ｖ．この発明のキット VI．テトラサイクリン又はそのアナログによる遺伝子発現の調節 Ａ．トランスアクチベーター融合蛋白質による遺伝子発現の刺激 Ｂ．転写インヒビター融合蛋白質による遺伝子発現の阻止 Ｃ．遺伝子発現の組み合わせた正及び負の調節 VII．この発明の応用 Ａ．遺伝子治療 Ｂ．イン・ビトロでの蛋白質の生成 Ｃ．イン・ビボでの蛋白質の生成 Ｄ．ヒトの病気の動物モデル Ｅ．クローニング用の安定な細胞系統の生成Ｉ．テトラサイクリン誘導可能な転写アクチベーター この発明の誘導可能な調節系において、遺伝子の転写は、転写アクチベーター 蛋白質（本明細書においては、単にトランスアクチベーターとも呼ぶ）により活 性化される。この発明のトランスアクチベーターは、融合蛋白質である。この発 明の一つの面は、従って、融合蛋白質及び融合蛋白質をコードする核酸（例えば 、ＤＮＡ）に関係する。用語「融合蛋白質」は、典型的には異なる源に由来する 、機能的に結合された少なくとも２つのポリペプチドを記述することを意図する ものである。これらのポリペプチドに関して、用語「機能的に結合された」は、 ２つのポリペプチドが、各ポリペプチドがその意図される機能を発揮し得る様式 で結合されることを意味することを意図している。典型的には、これらの２つの ポリペプチドは、ペプチド結合を介して結合される。この融合蛋白質は、好まし くは、標準的なＤＮＡ技術により生成される。例えば、第１のポリペプチドをコ ードするＤＮＡ分子を、第２のポリペプチドをコードする他のＤＮＡ分子にライ ゲートし、その結果生成したハイブリッドＤＮＡ分子を宿主細胞中で発現させて 融合蛋白質を生成する。これらのＤＮＡ分子は、ライゲーション後に、コードさ れたポリペプチドの翻訳フレームが変化しないように、互いに５’から３’の方 向でライゲートする（即ち、ＤＮＡ分子を、互いにイン・フレームにライゲート する）。 Ａ．トランスアクチベーター融合蛋白質の第１のポリペプチド この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質は、部分的に、テトラサイクリ ン（Ｔｃ）又はそのアナログの存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合する第１ のポリペプチドよりなる。この融合蛋白質の第１のポリペプチドは、好ましくは 、変異したＴｅｔリプレッサーである。用語「変異したＴｅｔリプレッサー」は 、野生型Ｔｅｔリプレッサーに類似するが少なくとも１つのアミノ酸が野生型Ｔ ｅｔリプレッサーと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを意図 するものである。用語「野生型Ｔｅｔリプレッサー」は、Ｔｃの不在時に原核細 胞中のｔｅｔオペレーター配列からの転写を抑制する天然の蛋白質を記述するこ とを意図するものである。変異したＴｅｔリプレッサーと野生型のＴｅｔリプレ ッサーとの間のアミノ酸の違いは、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミ ノ酸の欠失、又は１つ以上のアミノ酸の付加であってよい。この発明の変異し たＴｅｔリプレッサーは、次の機能的特性を有する：１）このポリペプチドは、 ｔｅｔオペレーター配列に結合することができ（即ち、それは、野生型Ｔｅｔリ プレッサーのＤＮＡ結合特異性を保持している）；そして、それは、野生型Ｔｅ ｔリプレッサーとは逆の様式でテトラサイクリンにより調節される（即ち、変異 したＴｅｔリプレッサーはＴｃの不在時ではなくＴｃ（又はＴｃアナログ）の存 在時にのみｔｅｔオペレーター配列に結合する）。 好適具体例において、上記の機能的特性を有する変異したＴｅｔリプレッサー は、野生型リプレッサーの配列におけるアミノ酸残基の置換により造られる。例 えば、実施例１に記載したように、７１、９５、１０１及び１０２位にアミノ酸 置換を有するＴｎ１０誘導されたＴｅｔリプレッサーは、所望の機能的特性を有 し、従って、この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質において第１のポリ ペプチドとして用いることができる。この変異したＴｅｔリプレッサーのアミノ 酸配列をSEQ ID NO:２（１〜２０７位）に示す。この発明は、特定の変異に限定 されるものではないが、この変異したＴｅｔリプレッサーの一具体例において、 ７１位は、グルタミン酸からリジンに、９５位は、アスパラギン酸からアスパラ ギンに、１０１位は、ロイシンからセリンに、そして１０２位は、グリシンから アスパラギン酸に変異される。これらのアミノ酸の位置の４つ全部より少ない変 異は、所望の機能的特性を有するＴｅｔリプレッサーを達成するのに十分であり 得る。従って、Ｔｅｔリプレッサーは、好ましくは、これらの位置の少なくとも １つにおいて変異される。この変異したＴｅｔリプレッサーの所望の機能的特性 を保持するこれらの又は他のアミノ酸位置における他のアミノ酸置換、欠失又は 付加は、この発明の範囲内にある。Hinrichs，W 等(1994)Science 264:418-420 に記載のように、Ｔｅｔリプレッサー−テトラサイクリン複合体の結晶構造は、 変異したＴｅｔリプレッサーの合理的デザインのために利用することができる。 この構造に基づいて、アミノ酸７１位は、テトラサイクリン結合ポケットの外側 に位置し、これは、この部位における変異が、この発明の変異したＴｅｔリプレ ッサーの所望の機能的特性を達成するのに必要でないことを示唆している。対照 的に、アミノ酸９５、１０１及び１０２位は、保存されたテトラサイクリン結合 ポケット内に位置する。従って、Ｔｅｔリプレッサーのテトラサイクリン結合ポ ケットは、この発明の変異したＴｅｔリプレッサーを造るための突然変異のため の標的であり得る。 この発明の融合蛋白質中への取込みのための更なる変異したＴｅｔリプレッサ ーを、この発明の教示に従って造ることができる。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ等の幾 つかの異なるクラスのＴｅｔリプレッサーが記載された（これらの内、Ｔｎ１０ コードされたリプレッサーは、クラスＢリプレッサーである）。種々のクラスの Ｔｅｔリプレッサーのアミノ酸配列は、高度の相同性（即ち、蛋白質の長さの４ ０〜６０％）を共有しする（上記の突然変異を含む領域を含む）。種々のクラス のＴｅｔリプレッサーのアミノ酸配列を図４に示して比較してあるが、これらは 又、Tovar，K等(1988)Mol.Gen.Genet.215:76-80 にも記載されている。従って、 Ｔｎ１０誘導したＴｅｔリプレッサーに関して上記したものと同等の突然変異を 、この発明の融合蛋白質に含ませるために他のクラスのＴｅｔリプレッサー中に 作ることができる。例えば、アミノ酸９５位は、５つのすべてのリプレッサーの クラスにおいてアスパラギン酸であるが、任意のクラスのリプレッサーにおいて アスパラギンに変異させることができる。同様に、１０２位は、５つのすベての リプレッサーのクラスにおいてグリシンであるが、任意のクラスのリプレッサー においてアスパラギン酸に変異させることができる。更なる適当な同等の変異は 、当業者には明白であり、ここに記載の手順によって造り且つ機能について試験 することができる。Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥクラスのＴｅｔリプレッサーのヌクレオチ ド及びアミン酸配列は、Waters,S.H．等(1983)Nucl.Acids Res 11:6089-6105，U nger,B.等(1984)Gene 31:103-108，Unger,B．等(1984)Nucl.Acids Res．12:7693 -7703及びTovar,K.等(1988)Mol.Gen.Genet.215:76-80にそれぞれ間示されている 。これらの野生型の配列は、ここに記載の誘導可能な調節系において利用するた めに、この発明の教示に従って突然変異させることができる。 上記の突然変異に代わるもの、更なる適当な変異したＴｅｔリプレッサー（即 ち、上記の所望の機能的特性を有するもの）を、実施例１に記載したように野生 型Ｔｅｔリプレッサーの突然変異誘発及び選択により造ることができる。野生型 クラスＢＴｅｔリプレッサーのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、Hillen，W.及 びSchollmeier，K.(1983)Nucl.Acids Res.11:525-539及びPostle，K.等(1984) Nucl.Acids Res.12:4849-4863 に開示されている。野生型クラスＡ、Ｃ、Ｄ及び Ｅ型リプレッサーのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、上で引用されている。変 異したＴｅｔリプレッサーは、例えば、次のようにして造り、選択することがで きる：野生型Ｔｅｔリプレッサーをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）をランダ ムな突然変異誘発にかけ、その結果生じた変異した核酸を発現ベクターに取込み 、スクリーニングのための宿主細胞に導入する。テトラサイクリンの存在時にの みｔｅｔオペレーター配列に結合するＴｅｔリプレッサーの選択を可能にするス クリーニングアッセイを用いる。例えば、発現ベクター中の変異した核酸のライ ブラリーを、ｔｅｔオペレーター配列が、Ｌａｃリプレッサーをコードする遺伝 子の発現を制御し、Ｌａｃリプレッサーが、選択可能マーカー（例えば、薬剤耐 性）をコードする遺伝子の発現を制御する大腸菌株中に導入することができる。 Ｔｅｔリプレッサーの細菌中のｔｅｔオペレーター配列への結合は、Ｌａｃリプ レッサーの発現を阻止し、それにより、選択可能マーカー遺伝子の発現が誘導さ れる。マーカー遺伝子を発現している細胞は、選択可能な表現型（例えば、薬剤 耐性）に基づいて選択される。野生型Ｔｅｔリプレッサーに関して、選択可能マ ーカー遺伝子の発現は、Ｔｃの不在時に起きる。変異したＴｅｔリプレッサーを コードする核酸は、Ｔｃの存在時にのみ細菌中の選択可能なマーカー遺伝子の発 現を誘導する核酸の能力に基づいて、この系を用いて選択される。 トランスアクチベーター融合蛋白質（例えば、変異したＴｅｔリプレッサー） の第１のポリペプチドは、ｔｅｔオペレーター配列に特異的に結合する特性を有 する。Ｔｅｔリプレッサーの各クラスは、対応する標的ｔｅｔオペレーター配列 を有する。従って、用語「ｔｅｔオペレーター配列」は、ｔｅｔオペレーター配 列のすべてのクラス例えばクラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを含むことを意図するも のである。ｔｅｔオペレーターのこれらの５つのクラスのヌクレオチド配列を、 図５及びSEQ ID NO:１１〜１５に示すが、Waters,S.H．等(1983)前出、Hillen,W .及びSchollenmeier,K．(1983)前出、Stuber,D．及びBujard,H．(1983)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 78:167-171、Unger,B.等(1984)前出、及びTovar,K 等(1988)前 出に記載されている。好適具体例において、変異したＴｅｔリプレッサーは、Ｔ ｎ１０コードされたリプレッサー（即ち、クラスＢ）であり、ｔｅｔオペレー ター配列は、クラスＢｔｅｔオペレーター配列である。或は、変異したクラスＡ Ｔｅｔリプレッサーは、クラスＡｔｅｔオペレーター配列等と共に用いることが できる（他のクラスのＴｅｔリプレッサー／オペレーターについて）。 クラスＡｔｅｔオペレーターに結合する変異したＴｅｔリプレッサーを造る他 のアプローチは、ここに記載の既に変異したＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー （クラスＢリプレッサー）を、それがもはや有効にクラスＢ型オペレーターに結 合せずにクラスＡ型オペレーターに有効に結合するように、更に変異させること である。クラスＡ又はＢ型オペレーターの第６位のヌクレオチドは、相補的リプ レッサーによるオペレーターの認識について決定的に重要であるということが見 出されている（６位は、クラスＢオペレーターではＧ／Ｃ対であり、クラスＡオ ペレーターではＡ／Ｔ対である）（Wissman 等(1988)J.Mol.Biol.202:397-406参 照）。クラスＡ又はクラスＢＴｅｔリプレッサーの第４０位のアミノ酸が、オペ レーターの６位の認識について決定的に重要なアミノ酸残基であるということも 見出されている（４０位のアミノ酸は、クラスＢリプレッサーではスレオニンで あるが、クラスＡリプレッサーではアラニンである）。更に、クラスＢリプレッ サーのＴｈｒ４０のＡｌａでの置換は、その結合特異性を変えて、そのリプレッ サーは今やクラスＡオペレーターと結合できるようになるということが見出され ている（同様に、クラスＡリプレッサーのＡｌａ４０のＴｈｒでの置換は、その 結合特異性を変えて、そのリプレッサーは今やクラスＢオペレーターと結合でき るようになる）（Altschmied等(1988)EMBO J.7:4011-4017参照）。従って、ここ に開示した変異したＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーの結合特異性を、アミノ 酸残基４０を標準的分子生物学技術（例えば、位置指定突然変異導入法）により 更にＴｈｒからＡｌａに変えることによって変えることができる。 特定の変異を（例えば、上記の７１、９５、１０１及び／又は１０２位に）有 する変異したＴｅｔリプレッサーを、標準的分子生物学技術（例えば、位置指定 突然変異導入法又はヌクレオチド変異を組み込むオリゴヌクレオチドプライマー を用いるＰＣＲ媒介の突然変異導入）により、ヌクレオチド変化を、野生型リプ レッサーをコードする核酸中に導入することによって造ることができる。或は、 変異したＴｅｔリプレッサーがライブラリーからの選択により同定されるときに は、その変異した核酸をライブラリーベクターから回収することができる。この 発明のトランスアクチベーター融合蛋白質を造るためには、変異したＴｅｔリプ レッサーをコードする核酸を、次いで、転写活性化ドメインをコードする他の核 酸にイン・フレームでライゲートし、その融合構築物を組換え発現ベクター中に 組み込む。この組換え発現ベクターを宿主細胞又は動物に導入することにより、 トランスアクチベーター融合蛋白質を発現させることができる。 Ｂ．トランスアクチベーター融合蛋白質の第２のポリペプチド トランスアクチベーター融合蛋白質の第１のポリペプチドを、真核細胞におけ る転写を直接又は間接に活性化する第２のポリペプチドに機能的に結合する。第 １及び第２のポリペプチドを機能的に結合するためには、各ポリペプチドの機能 を保存する方法（例えば、化学的架橋）によって第１及び第２のポリペプチドを 機能的に結合することができるが、典型的には、第１及び第２のポリペプチドを コードするヌクレオチド配列を互いにイン・フレームでライゲートして融合蛋白 質をコードするキメラ遺伝子を造る。好適具体例において、トランスアクチベー ターそれ自身の第２のポリペプチドは、転写活性化活性を有する（即ち、この第 ２のポリペプチドは、直接、転写を活性化する）。他の具体例において、第２の ポリペプチドは、融合蛋白質と相互作用する転写活性化蛋白質の補充により、間 接的機構によって、転写を活性化する。従って、用語「真核細胞中の転写を活性 化するポリペプチド」は、ここで用いる場合、直接又は間接に転写を活性化する ポリペプチドを含むことを意図するものである。 真核細胞における転写を活性化するように機能し得るポリペプチドは、当分野 で公知である。特に、多くのＤＮＡ結合蛋白質の転写活性化ドメインが記載され ており、そのドメインが異種蛋白質に移されたときにそれらの活性化機能を保持 することが示されている。この発明の融合蛋白質における利用のための好適なポ リペプチドは、単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質１６である（ここでは、Ｖ Ｐ１６と呼び、そのアミノ酸配列は、Triezenberg,S.J.等(1988)Genes Dev.2:71 8-729に開示されている）。一具体例において、ＶＰ１６の約１２７のＣ末端ア ミノ酸を用いる。例えば、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列（２０８〜３３５ 位）を有するポリペプチドを、融合蛋白質における第２のポリペプチドとして用 いることができる。他の具体例においては、転写活性化能力を保持しているＶＰ １６のＣ末端からの約１１アミノ酸の少なくとも１コピーを、第２のポリペプチ ドとして用いる。好ましくは、この領域のダイマー（即ち、約２２アミノ酸）を 用いる。ＶＰ１６の適当なＣ末端ペプチド部分は、Seipel,K．等(EMBO J.(1992) 13:4961-4968）に記載されている。例えば、SEQ ID NO:４に示したアミノ酸配列 （SEQ ID NO:３に示したヌクレオチド配列によりコードされる）を有するペプチ ドのダイマーを、融合蛋白質の第２のポリペプチドとして用いることができる。 真核細胞における転写活性化能力を有する他のポリペプチドを、この発明の融 合蛋白質において用いることができる。種々の蛋白質内に見出される転写活性化 ドメインは、類似の構造的特徴に基づいて、幾つかのカテゴリーに分類された。 転写活性化ドメインの型には、酸性転写活性化ドメイン、プロリンリッチ転写活 性化ドメイン、セリン／スレオニンリッチ転写活性化ドメイン及びグルタミンリ ッチ転写活性化ドメインが含まれる。酸性転写活性化ドメインの例には、既に述 べたＶＰ１６の領域及びＧＡＬ４の７５３〜８８１アミノ酸残基が含まれる。プ ロリンリッチ活性化ドメインの例には、ＣＴＦ／ＮＦ１の３９９〜４９９アミノ 酸残基及びＡＰ２のアミノ酸残基が含まれる。セリン／スレオニンリッチ転写活 性化ドメインの例には、ＩＴＦ１の１〜４２７アミノ酸残基及びＩＴＦ２の２〜 ４５１アミノ酸残基が含まれる。グルタミンリッチ活性化ドメインの例には、Ｏ ｃｔ１の１７５〜２６９アミノ酸残基及びＳｐ１の１３２〜２４３アミノ酸残基 が含まれる。上記の領域の各々のアミノ酸配列及び他の有用な転写活性化ドメイ ンは、Seipel,K．等(EMBO J.(1992)13:4961-4968)に記載されている。 前に記載された転写活性化ドメインに加えて、標準的技術によって同定するこ とのできる新規な転写活性化ドメインは、この発明の範囲内にある。ポリペプチ ドの転写活性化能力は、そのポリペプチドをＤＮＡ結合活性を有する他のポリペ プチドに結合させ、その融合蛋白質により刺激される標的配列の転写量を測定す ることによってアッセイすることができる。例えば、当分野で用いられる標準的 アッセイは、推定上の転写活性化ドメインとＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（例え ば、アミノ酸残基１〜９３）との融合蛋白質を利用する。次いで、この融合蛋白 質を用いて、ＧＡＬ４結合部位に結合されたレポーター遺伝子の発現を刺激する （例えば、Seipel,K．等(EMBO J.(1992)11:4961-4968）及びそこで引用されてい る文献を参照されたい）。 他の具体例において、融合蛋白質の第２のポリペプチドは、融合蛋白質と相互 作用する転写アクチベーターを補充することにより転写を間接的に活性化する。 例えば、この発明の変異したｔｅｔＲを、宿主細胞内に存在する転写アクチベー ター蛋白質例えば内在性アクチベーターとの蛋白質−蛋白質相互作用を媒介する ことができるポリペプチドドメイン（例えば、二量体化ドメイン）に融合させる ことができる。ＤＮＡ結合ドメインとトランスアクチベーションドメインとの間 の機能的結合は、共有結合である必要はないことが示されている（例えば、Fiel ds及びSong(1989)Nature 340:245-247; Chien 等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582; Gyuris等(1993)Cell 75:791-803; 及びZervos，A.S.(1993)Cell 72:223-232参照されたい）。従って、融合蛋白質の第２のポリペプチドは、転 写を直接活性化するのではなく、むしろ、適合性の蛋白質−蛋白質総合作用ドメ イン及び転写活性化ドメインを有する内在性ポリペプチドとの安定な相互作用を 形成するのであろう。安定な相互作用（又は二量体化）ドメインの例には、ロイ シンジッパー（Landschulz等(1989)Science 243:1681-1688）、ヘリックス−ル ープ−ヘリックスドメイン（Murre,C.等(1989)Cell 58:537-544）及びジンクフ ィンガードメイン（Frankel,A.D.等(1988)Science 240:70-73）が含まれる。融 合蛋白質内に存在する二量体化ドメインと内在性核因子との相互作用は、その核 因子のトランスアクチベーションドメインの、その融合蛋白質への補充を生じ、 それにより、この融合蛋白質が結合するｔｅｔオペレーター配列へ の補充を生じる。 Ｃ．トランスアクチベーター融合蛋白質の第３のポリペプチド 変異したＴｅｔリプレッサー及び転写活性化ドメインに加えて、この発明の融 合蛋白質は、融合蛋白質の細胞核への輸送を促進する機能的に結合した第３のポ リペプチドを含むことができる。蛋白質中に含まれたときにその蛋白質の核への 輸送を促進するように機能するアミノ酸配列は、この分野で公知であり、核局在 化シグナル（ＮＬＳ）と呼ばれている。核局在化シグナルは、典型的には、塩基 性アミノ酸のストレッチからなる。異種蛋白質（例えば、この発明の融合蛋白質 ）に結合したとき、この核局在化シグナルは、その蛋白質の細胞核への輸送を促 進する。この核局在化シグナルは、異種蛋白質に、その蛋白質表面に露出され且 つその蛋白質の機能を邪魔しないように結合される。好ましくは、ＮＬＳは、蛋 白質の一方の末端例えばＮ末端に結合される。この発明の融合蛋白質に含まれ得 るＮＬＳの非制限的例のアミノ酸配列を、SEQ ID NO:５に示す。好ましくは、核 局在化シグナルをコードする核酸を、標準的ＤＮＡ技術により、融合蛋白質をコ ードする核酸に（例えば、５’末端に）イン・フレームでスプライスする。 SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列を有するこの発明のトランスアクチベ ーターを含むプラスミッドｐＵＨＤ１７−１（実施例１で更に詳細に説明する） を、１９９４年７月８日に、ブダペスト条約の規定により、ドイツ国、Braunsch weig在、Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZellKulturen GmbH（Ｄ ＳＭ）に寄託して、寄託番号ＤＳＭ９２７９を与えられた。II ．トランスアクチベーター融合蛋白質の発現 Ａ．発現ベクター 上記のようにトランスアクチベーター融合蛋白質をコードするこの発明の核酸 を、宿主細胞中での融合蛋白質の発現に適した形態で組換え発現ベクター中に組 み込むことができる。用語「宿主細胞中の融合蛋白質の発現に適した形態で」は 、組換え発現ベクターが、核酸のｍＲＮＡへの転写及びそのｍＲＮＡの融合蛋 白質への翻訳を与える様式で、融合蛋白質をコードする核酸に機能的に結合され た１つ以上の調節配列を含むことを意味することを意図している。用語「調節配 列」は、技術的に認識され且つプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要 素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。かかる制御 配列は、当業者に公知であり、Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,（1991）Academic Press，カリフォルニア、San Diego在に記載され ている。発現ベクターのデザインは、トランスフェクトされる宿主細胞の選択及 び／又は発現すべき融合蛋白質の量等のファクターに依存し得るということは、 理解されるべきである。 哺乳動物細胞で用いる場合、組換え発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウ イルス性遺伝物質により与えられる。例えば、一般に用いられるプロモーターは 、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びＳＶ４０に由来す る。融合蛋白質の発現を指示するためのウイルス性調節要素の利用は、融合蛋白 質の高レベルの構成的発現を種々の宿主細胞において与えることができる。好適 な組換え発現ベクターにおいて、融合蛋白質をコードする配列は、その上流（即 ち、５’側）で、ヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーターと隣接し、下流（ 即ち、３’側）で、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルと隣接する。例えば、実施例１ に記載したものと同様の発現ベクターを用いることができる。ヒトサイトメガロ ウイルスＩＥプロモーターは、Boshart 等(1985)Cell 41:521-530に記載されて いる。他の使用し得る偏在的に発現させるプロモーターには、ＨＳＶ−Ｔｋプロ モーター（McKnight等(1984)Cell 37:253-262に開示されている）及びβ−アク チンプロモーター（例えば、Ng等(1985)Mol.Cell.Biol.5:2720-2732 により記載 されたヒトβ−アクチンプロモーター）が含まれる。 或は、組換え発現ベクターの調節配列は、特定の細胞型における融合蛋白質の 発現を優先的に指示することができる。即ち、組織特異的な調節要素を用いるこ とができる。用いることのできる組織特異的プロモーターの非制限的な例には、 アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert 等(1987)Genes Dev.1:268-277 ）、リンパ特異的プロモーター（Calame及びEaton(1988)Adv.Immunol.43:235-27 5）｛Ｔ細胞レセプター（Winoto及びBaltimore(1989)EMBO J.8:729- 733）及び免疫グロブリン（Banerji 等(1983)Cell 33:729-740; Queen及びBalti more(1983)Cell 33:741-748）の特定のプロモーター中｝、ニューロン特異的プ ロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne 及びRuddle(1 989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5474-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlun d等(1985)Science 230:912-916）及び乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク ホエープロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６ ４，１６６号）が含まれる。発生的に調節されるプロモーター例えばマウスホッ クスプロモーター（Kessel及びGruss(1990)Science 249:374-379）及びα−フェ トプロテインプロモーター（Campes及びTilghman(1989)Genes Dev.3:537-546） も又、含まれる。 或は、トランスアクチベーター融合蛋白質をコードする自己調節性構築物を造 ることができる。これを達成するためには、融合蛋白質をコードする核酸を、最 小プロモーター配列及び少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結 合する。例えば、SEQ ID NO:１の核酸を、SEQ ID NO:８、９又は１０に示したヌ クレオチド配列を有するプロモーターに結合することができる（SEQ ID NO:８及 び９の核酸は、最小ＣＭＶプロモーター及び１０個のｔｅｔオペレーターを含み ；SEQ ID NO:１０の核酸は、ＴＫプロモーター及び１０個のｔｅｔオペレーター を含む）。かかる自己調節性構築物の図式ダイヤグラムを、図９Ｂに示す。この 核酸を（例えば、組換え発現ベクターにて）細胞に導入したときは、トランスア クチベーター遺伝子の少量の基礎的転写が、「漏れやすさ（leakiness）」によ り生じることはありそうなことである。Ｔｃ（又はそのアナログ）の存在下にお いては、この少量のトランスアクチベーター融合蛋白質は、トランスアクチベー ターをコードするヌクレオチド配列の上流のｔｅｔオペレーター配列に結合して 、トランスアクチベーターをコードするヌクレオチド配列の更なる転写を刺激し 、それにより、その細胞におけるトランスアクチベーター融合蛋白質の更なる産 生へと導く。かかる自己調節性プロモーターは、他のテトラサイクリン調節され るトランスアクチベーター例えば、Gossen,M．及びBujard,H.(1992)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 89:5547-5551に記載されたＴｃの不在時にｔｅｔオペレーターと結 合する野生型Ｔｅｔリプレッサー融合蛋白質（ｔＴＡ）（図９Ａに示す） と共に用いることもできるということは、当業者には認識されよう。このトラン スアクチベーターと共に用いる場合、このトランスアクチベーターをコードする ヌクレオチド配列の自己調節された転写は、Ｔｃの不在時に刺激される。自己調 節性プロモーターに機能的に結合されたGossen及びBujard(1992)（前出）に記載 されたｔＴＡをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミッドｐＵＨＤ１５− ３は、１９９４年７月８日に、ブダペスト条約の規定により、ドイツ国、Brauns chweig在、Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZellKulturen GmbH（ ＤＳＭ）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ９２８０が与えられた。 一具体例において、この発明の組換え発現ベクターは、プラスミッド例えば実 施例１に記載したものである。或は、この発明の組換え発現ベクターは、ウイル ス核酸中に導入された核酸の発現を与えるウイルス又はその部分であってよい。 例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスを 用いることができる。組換えレトロウイルスを生成し及びかかるウイルスをイン ・ビトロ又はイン・ビボで細胞に感染させるためのプロトコールは、Current Pr otocols in Molecular Biology ，Ausubel,F.M.等（編）、Greene Publishing As sociates,(1989)，第9.10-9.14 節及び他の標準的実験室マニュアルに見出すこ とができる。適当なレトロウイルスの例には、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐ ＥＭが含まれる（これらは、当業者には、周知である）。適当なパッケージング ウイルス株の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２及びΨＡｍが含まれる。アデ ノウイルスのゲノムは、トランスアクチベーター融合蛋白質をコードし且つ発現 させるが、正常な溶菌性ウイルス生活サイクルにおいて複製する能力に関して不 活性化されるように操作することができる。例えば、Berkner 等(1988)BioTechn iques 6:616; Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434及び；Rosenfeld 等(1992 )Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルスＡｄ株５ｄ１３２４型又は他 のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４等）は、当業者に周知で ある。或は、アデノ関連ウイルスベクター例えば、Tratschin 等(1985)Mol.Cell .Biol.5:3251-3260 に記載されたものを用いて、トランスアクチベーター融合蛋 白質を発現させることができる。 Ｂ．宿主細胞 この発明の融合蛋白質は、その融合蛋白質をコードする核酸を宿主細胞に導入 することにより、真核細胞内で発現させることができる（ここに、この核酸は、 この宿主細胞における融合蛋白質の発現に適した形態である）。例えば、融合蛋 白質をコードするこの発明の組換え発現ベクターを、宿主細胞中に導入する。或 は、調節配列（例えば、プロモーター配列）に機能的に結合されているが更なる ベクター配列を有しないこの融合蛋白質をコードする核酸を宿主細胞に導入する ことができる。ここで用いる場合、用語「宿主細胞」は、発現すべき蛋白質、選 んだ選択システム又は採用した発酵システムと不適合性でない任意の真核細胞又 は細胞株を含むことを意図している。用い得る哺乳動物細胞株の非制限的例には 、ＣＨＯｄｈｆｒ-細胞（Urlaub及びChasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4 216-4220）、２９３細胞（Graham等(1977)J.Gen.Virol.36:pp59）又はＳＰ２若 しくはＮＳＯ（Galfre及びMilstein(1981)Meth.Enzymol.73(B):3-46）等のミエ ローマ細胞が含まれる。 細胞株に加えて、この発明は、正常細胞例えば遺伝子治療目的のために改変す べき細胞又はトランスジェニック若しくは相同組換え動物を造るために改変した 細胞に適用することができる。遺伝子治療目的に関して特に興味深い細胞型の例 には、造血幹細胞、筋原細胞、肝細胞、リンパ球、ニューロン細胞並びに皮膚上 皮及び気道上皮が含まれる。更に、トランスジェニック又は相同組換え動物に関 して、胎児幹細胞及び受精卵母細胞を、トランスアクチベーター融合蛋白質をコ ードする核酸を含むように改変することができる。更に、植物細胞を改変してト ランスジェニック植物を造ることができる。 この発明は、広く適用可能であり、昆虫（例えば、Sp.frugiperda）、酵母（ 例えば、S.cerevisiae，S.pombe，P.pastoris，K.lactis，H.polymorpha;Fleer, R.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3(5):486-496）、カビ及び植物細 胞を含む非哺乳動物真核細胞を包含する。酵母S.cerevisiaeにおける発現のため のベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Baldari 等(1987)Embo J.6:229-234） 、ｐＭＦａ（Kurjan及びHerskowitz,(1982)Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（ Schultz 等（1987）Gene 54:113-123）及びｐＹＥＳ２ （Invitrogen Corporation，カリフォルニア、San Diego在）が含まれる。バキュロウイ ルス発現ベクター（例えば、O'Reilly等(1992)Baculovirus Expression Vectors :A Laboratory Manual，Stockton Pressに記載されたもの）を用いて、融合蛋白 質を昆虫細胞内で発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞 ）における蛋白質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシ リーズ（Smith 等(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165）及びｐＶＬシリーズ（Luc klow,V.A.及びSummers,M.D.,(1989)Virology 170:31-39）が含まれる。 Ｃ．宿主細胞中への核酸の導入 融合蛋白質をコードする核酸を、真核細胞をトランスフェクトするための標準 的技術によって宿主細胞に導入することができる。用語「トランスフェクトする 」又は「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキス トラン媒介のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーショ ン及びマイクロインジェクションを含む、核酸を宿主細胞に導入するためのすべ ての慣用技術を包含することを意図するものである。宿主細胞をトランスフェク トするための適当な方法は、Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Man ual，第二版、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))及び他の実験室用 テキスト中に見出すことができる。 この発明の核酸でトランスフォームされる宿主細胞の数は、少なくとも部分的 に、用いる組換え発現ベクターの型及び用いるトランスフェクション技術の型に 依存する。核酸を、一時的に宿主細胞に導入することができ、又は一層典型的に は、遺伝子発現の長期の調節のために、核酸を宿主細胞のゲノムに安定にインテ グレートし又は宿主細胞中に安定なエピソームとして維持する。哺乳動物細胞に 導入したプラスミッドベクターは、典型的には、低い頻度でしか宿主細胞ＤＮＡ にインテグレートされない。これらのインテグラントを同定するためには、選択 可能マーカー（例えば、薬剤耐性）を含む遺伝子を、一般に、関心ある核酸と共 に宿主細胞に導入する。好適な選択可能マーカーには、好適な選択可能マーカー には、ある種の薬物例えばＧ４１８及びハイグロマイシンに対する耐性を与える ものが含まれる。選択可能マーカーは、関心ある核酸と別のプラスミッドにて導 入することができ、又は同じプラスミッドで導入する。この発明の核酸（例えば 、組換え発現ベクター）及び選択可能マーカーの遺伝子でトランスフェクトした 宿主細胞を、その選択可能マーカーを用いて、細胞を選択することにより同定す ることができる。例えば、もしネオマイシン耐性を与える遺伝子を選択可能マー カーがコードするならば、核酸を取り込んだ宿主細胞は、Ｇ４１８で選択され得 る。選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は、生存し、他方、他の細胞は、 死滅する。 この発明の融合蛋白質をコードする核酸でトランスフェクトした宿主細胞を、 更に、この融合蛋白質の標的として働く１つ以上の核酸でトランスフェクトする ことができる。この標的核酸は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列（後 記の第III節にて一層詳細に説明）に機能的に結合された転写されるべきヌクレ オチド配列を含む。 この発明の融合蛋白質をコードする核酸を、培養にて生育している真核細胞に 、慣用のトランスフェクション技術（例えば、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥ −デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション）によってイン ・ビトロで導入することができる。核酸は又、例えば、イン・ビボでの細胞への 核酸の導入に適した送達システム例えばレトロウイルスベクター（例えば、Ferr y,N 等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381;及びKay,M.A.等(1992)Huma n Gene Therapy 3:641-647参照）、アデノウイルスベクター（例えば、Rosenfel d,M.A.(1992)Cell 68:143-155;及びHerz,J．及びGerard,R.D.(1993)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 90:2812-2816参照）、レセプター媒介のＤＮＡの取り込み（例えば 、Wu,G．及びWu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263:14621; Wilson等(1992)J.Biol.Che m.267:963-967;及び米国特許第５，１６６，３２０号参照）、ＤＮＡの直接注入 （例えば、Acsadi等(1991)Nature 332:815-818; 及びWolff 等(1990)Science 24 7 :1465-1468参照）又は粒子ボンバードメント（例えば、Cheng,L.等(1993)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90:4455-4459;及びZelenin,A.V.等(1993)FEBS Letters 315: 29-32参照）の適用により、イン・ビボで、細胞中にトランスファーすることが できる。従って、遺伝子治療目的のために、細胞をイン・ビトロで改変して患者 に投与することができ、或は、細胞を直接イン・ビボ で改変することができる。 Ｄ．トランスジェニック生物 核酸トランスアクチベーター融合蛋白質を非ヒト動物の受精卵母細胞にトラン スファーして、１種以上の細胞型においてこの発明の融合蛋白質を発現するトラ ンスジェニック動物を造ることができる。トランスジェニック動物は、トランス ジーンを含む細胞を有する動物であり、トランスジーンは、その動物又はその動 物の先祖に出生前例えば胎児期に導入されたものである。トランスジーンは、ト ランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中にインテグレートされ、成熟動 物のゲノム中に保持され、それにより、そのトランスジェニック動物の１種以上 の細胞型又は組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示するＤＮＡであ る。一具体例において、非ヒト動物はマウスであるが、この発明はそれに限定さ れない。他の具体例において、トランスジェニック動物は、ヤギ、ヒツジ、ブタ 、ウシ又は他の家畜である。かかるトランスジェニック動物は、蛋白質の大規模 生産に有用である（いわゆる「ジーンファーミング」）。 トランスジェニック動物は、例えば、融合蛋白質をコードする核酸（典型的に は、適当な調節要素例えば構成的又は組織特異的エンハンサーに結合されたもの ）を例えばマイクロインジェクションにより受精卵母細胞の雄性前核に導入し、 その卵母細胞を擬妊娠雌養育動物中で発生させることにより造ることができる。 イントロン及びポリアデニル化シグナルをトランスジーンに含ませてそのトラン スジーンの発現の効率を増大させることもできる。トランスジェニック動物特に マウス等の動物を生成する方法は、当分野では慣用的となり、例えば、米国特許 第４，７３６，８６６号及び４，８７０，００９号並びにHogan,B.等(1986)A La boratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク、Cold Spring Harbo r在に記載されている。トランスジェニック創出動物を用いて、トランスジーン を有する更なる動物を繁殖させることができる。この発明の融合蛋白質をコード するトランスジーンを有するトランスジェニック動物を、更に、他のトランスジ ーンを有する他のトランスジェニック動物例えばｔｅｔオペレーター配列に機能 的に結合された遺伝子を含むトランスジェニック動物と交配させることがで きる（後記の第III節にて一層詳細に検討）。 トランスジェニック動物に加えて、ここに記載の調節系を他のトランスジェニ ック生物例えばトランスジェニック植物に適用することができるということは認 められよう。トランスジェニック植物は、当分野で公知の慣用技術によって作る ことができる。従って、この発明は、動物及び植物を含む非ヒトトランスジェニ ック生物を包含し、該生物はこの発明のトランスアクチベーター融合蛋白質を発 現する細胞を含有する（即ち、トランスアクチベーターをコードする核酸は、ト ランスジェニック生物の細胞中の１つ以上の染色体中に取り込まれる）。 Ｅ．相同組換え生物 この発明は又、この発明の融合蛋白質を発現する相同組換え非ヒト生物をも提 供する。用語「相同組換え生物」は、ここで用いる場合、遺伝子と動物の細胞例 えば動物の胚細胞に導入されたＤＮＡ分子との間の相同組換えにより改変された 遺伝子を含む生物例えば動物又は植物を記述することを意図している。一具体例 において、非ヒト動物は、マウスであるが、この発明はそれに限定されない。融 合蛋白質をコードする核酸がゲノムの特定の部位に導入された（即ち、その核酸 が内在性遺伝子と相同的に組換えられた）動物を造ることができる。 かかる相同組換え動物を造るためには、相同組換えが起きる５’及び３’末端 で真核生物遺伝子の付加的核酸と隣接する融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む ベクターを調製する。融合蛋白質をコードする核酸に隣接する付加的核酸は、真 核生物遺伝子との上首尾の相同組換えに対して十分な長さのものである。典型的 には、フランキングＤＮＡ（５’及び３’末端の両方）の数キロベースがベクタ ーに含まれる（相同組換えベクターに関しては、例えば、Thomas,K.R．及びCape cchi,M.R.(1987)Cell 51:503を参照されたい）。このベクターを、胎児幹細胞株 に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入し、導入したＤＮＡが内在性 ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する（例えば、Li,E．等(1992)Cell 6 9 :915参照）。選択した細胞を、次いで、動物の胚盤胞中に注入して、凝集キメ ラを形成する（例えば、Bradley,A．Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cel ls：A Practical Approach，E.J.Robertson 編（IRL、Oxford，1987） 113-152頁参照）。次いで、キメラ胚を適当な擬妊娠雌養育動物中に移植して、 出産まで持って行く。生殖細胞中にこの相同組換えされたＤＮＡを有する子孫を 用いて、すべての細胞がその相同組換えされたＤＮＡを含有する動物を繁殖させ ることができる。これらの「生殖系列伝達」動物を、更に、少なくとも１つのｔ ｅｔオペレーター配列（後記の第III節にて一層詳細に検討）に機能的に結合さ れた遺伝子を有する動物と交配させることができる。 上記の相同組換えアプローチに加えて、酵素補助された部位特異的インテグレ ーション系が当分野で公知であり、この発明の調節系の成分に適用してＤＮＡ分 子を予め決めた位置で第２の標的ＤＮＡ分子にインテグレートすることができる 。かかる酵素補助されたインテグレーション系の例には、Ｃｒｅレコンビナーゼ −ｌｏｘ標的系（例えば、Baubonis,W．及びSauer,B.(1993)Nucl.Acids Res.21: 2025-2029; 及びFukushige,S.及びSauer,B.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7 905-7909に記載されているもの）及びＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例 えば、Dang,D.T．及びPerrimon,N.(1992)Dev.Genet.13:367-375;及びFiering,S. 等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8496-8473に記載されているもの）が含ま れる。III ．テトラサイクリン誘導可能なトランスアクチベーターにより調節される標 的転写ユニット この発明の融合蛋白質を用いて、標的ヌクレオチド配列の転写を調節すること ができる。この標的ヌクレオチド配列は、融合蛋白質が結合する調節配列に機能 的に結合される。特に、この融合蛋白質は、少なくとも１つのｔｅｔオペレータ ー配列に機能的に結合したヌクレオチド配列の発現を調節する。従って、この発 明の他の面は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された 転写されるべきヌクレオチド配列を含む標的核酸（例えば、ＤＮＡ分子）に関す るものである。かかる核酸は又、ここでは、ｔｅｔ調節される転写ユニット（又 は単に転写ユニット）とも呼ぶ。 転写ユニット内において、「転写されるべきヌクレオチド配列」は、典型的に は、それ自身は転写されないが（少なくとも部分的に）転写装置を転写のための 正しい位置に置く働きをする最小プロモーター配列を含む。この最小プロモータ ー配列を、転写される配列に、５’から３’の向きで、ホスホジエステラーゼ結 合により結合して（即ち、プロモーターは、転写される配列の上流に位置する） 連続したヌクレオチド配列を形成する。従って、ここで用いる場合、用語「転写 されるべきヌクレオチド配列」又は「標的ヌクレオチド配列」は、ｍＲＮＡに転 写されるヌクレオチド配列及び機能的に結合された上流の最小プロモーター配列 の両方を含むことを意図するものである。用語「最小プロモーター」は、転写さ れるべき結合した配列の転写開始部位を規定するが、それ自身は転写を効率的に 開始することができない部分的プロモーター配列を記述することを意図するもの である。従って、かかる最小プロモーターの活性は、転写アクチベーター（この 発明のテトラサイクリン誘導可能な融合蛋白質等）の機能的に結合した調節配列 （１つ以上のｔｅｔオペレーター配列等）への結合に依存する。一具体例におい て、最小プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（Boshart等(1985)Cell 41 :521-530に記載）に由来する。好ましくは、約＋７５〜−５３及び＋７５〜−３ １の間のヌクレオチド位置を用いる。他の適当な最小プロモーターは当分野で公 知であり、標準的技術によって同定することができる。例えば、連続的に結合さ れたレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）の転写を活性化する機能的プ ロモーターを、もはや単独ではそのレポーター遺伝子の発現を活性化せずに更な る調節配列の存在を必要とするまで前進的に削除することができる。 転写ユニット内において、標的ヌクレオチド配列（転写されるヌクレオチド配 列及びその上流の最小プロモーター配列）は、少なくとも１つのｔｅｔオペレー ター配列に機能的に結合する。典型的構成において、ｔｅｔオペレーター配列は 、最小プロモーター配列の上流（即ち、５’側）に、ｔｅｔオペレーター配列へ の調節蛋白質（例えば、トランスアクチベーター融合蛋白質）の結合に際して標 的ヌクレオチド配列の転写を与えるのに適当な距離で、ホスホジエステル結合に よって機能的に結合する。即ち、転写ユニットは、ｔｅｔオペレーター配列−最 小プロモーター−転写されるヌクレオチド配列よりなる（５’から３’の向 き）。典型的にはｔｅｔオペレーター配列は、最小プロモーターの約２００〜４ ００塩基対上流に位置するが、ｔｅｔオペレーター配列と最小プロモーターとの 間の許容される距離には幾らかの融通性があるということは、当業者には認めら れよう。 この発明において用いることのできる最小プロモーターに結合されたｔｅｔオ ペレーター配列を含むｔｅｔ調節されるプロモーターの例のヌクレオチド配列を SEQ ID NO:８〜１０に示す。SEQ ID NO:８及び９のヌクレオチド配列は、１０個 のｔｅｔオペレーター配列に結合されたサイトメガロウイルス最小プロモーター を含み；これらの２つのヌクレオチド配列は、オペレーターと最初の転写される ヌクレオチドとの間の距離が異なっている。SEQ ID NO:１０のヌクレオチド配列 は、１０個のｔｅｔオペレーター配列に結合された単純ヘルペスウイルス最小ｔ ｋプロモーターを含む。SEQ ID NO:８のプロモーターは、Gossen,M．及びBujard ,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に記載されたＰhCMV*-1に対応 する。SEQ ID NO:９のプロモーターは、やはり、Gossen,M．及びBujard,H．（前 出）に記載されたＰhCMV*-2に対応する。 或は、調節要素は転写される配列の下流で機能することが当分野では認められ ているので、ｔｅｔオペレーター配列を転写されるヌクレオチド配列の下流（即 ち、３’側）に機能的に結合し得ることはありそうなことである。従って、この 構成においては、転写ユニットは、最小プロモーター−転写されるヌクレオチド 配列−ｔｅｔオペレーター配列（５’から３’の向き）からなる。ｔｅｔオペレ ーター配列が結合される下流の許容される距離に幾らかの融通性があることはあ りそうであることも、やはり認められよう。 用語「ｔｅｔオペレーター配列」は、すべてのクラスのｔｅｔオペレーター（ 例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）を包含することを意図している。転写されるべ きヌクレオチド配列は、単一のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合すること ができ、又は、増大された範囲の調節のためには、それを、複数のｔｅｔオペレ ーター配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のオペレータ ー配列）に機能的に結合することができる。好適具体例において、転写されるべ き配列は、７個のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合される。 ｔｅｔ調節される転写ユニットを、更に、標準的組換えＤＮＡ技術によって、 組換えベクター（例えば、プラスミッド又はウイルスベクター）に取り込むこと ができる。この転写ユニット又はそれを含む組換えベクターを、上述のような標 準的トランスフェクション技術によって宿主細胞に導入することができる。転写 ユニットの宿主細胞集団への導入後に、ｔｅｔオペレーター結合されたヌクレオ チド配列の低い基礎的発現を示す宿主細胞クローンを選択すること（即ち、ｔｅ ｔオペレーター結合したヌクレオチド配列の低い基礎的発現を生じる部位に転写 ユニットがインテグレートされた宿主細胞の選択）が必要であり得るということ は認められるべきである。更に、ｔｅｔ調節される転写ユニットを、上記の手順 により、非ヒト動物のゲノム中に胎児期に導入し又は植物細胞に導入して、幾つ かの又はすべての細胞中に転写ユニットを有するトランスジェニック又は相同組 換え生物を造ることができる。関心のある細胞中でのｔｅｔオペレーター結合し たヌクレオチド配列の基礎的発現が低いトランスジェニック又は相同生物を選択 することが必要であることもやはり認められるべきである。 一具体例において、ｔｅｔ調節される転写ユニットの標的ヌクレオチド配列は 、関心のある蛋白質をコードするものである。従って、この発明のトランスアク チベーターによるこのヌクレオチド配列の転写の誘導及びその結果生じたｍＲＮ Ａの翻訳により、関心のある蛋白質を宿主細胞又は動物にて生成することができ る。或は、転写されるべきヌクレオチド配列は、活性なＲＮＡ分子例えばアンチ センスＲＮＡ分子又はリボザイムをコードすることができる。宿主細胞又は動物 における活性なＲＮＡ分子の発現を用いて、その宿主内の機能を調節することが できる（例えば、関心のある蛋白質の産生を、その蛋白質をコードするｍＲＮＡ の翻訳を阻止することにより妨げることができる）。 この発明のトランスアクチベーターを用いて、宿主細胞又は動物に導入された 外因性ヌクレオチド配列の転写を調節することができる。「外因性」ヌクレオチ ド配列は、宿主細胞に導入され、典型的には、宿主のゲノム中に挿入されたヌク レオチド配列である。この外因性ヌクレオチド配列は、宿主のゲノム中の何処に も存在してはならず（例えば、外来性ヌクレオチド配列）、又は宿主のゲノム中 に存在するがゲノムの異なる部位にインテグレートされている配列の更なるコピ ーであってよい。転写されるべき外因性ヌクレオチド配列及び機能的に結合した ｔｅｔオペレーター配列は、宿主細胞又は動物に導入される単一の核酸分子中に 含まれ得る。 或は、この発明のトランスアクチベーターを用いて、ｔｅｔオペレーター配列 が結合した内在性ヌクレオチド配列の転写を調節することができる。「内在性」 ヌクレオチド配列は、宿主のゲノム中に存在するヌクレオチド配列である。内在 性遺伝子を、ｔｅｔＯ含有組換えベクターと内在性遺伝子の配列との間の相同組 換えによって、ｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合することができる。例え ば、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列及び、内在性遺伝子の現実のプロ モーター領域を排除することにより３’末端で内在性遺伝子のコード領域を表す 配列と隣接し且つ５’末端で内在性遺伝子の上流領域に由来する配列と隣接する 最小プロモーター配列を含む相同組換えベクターを調製することができる。これ らのフランキング配列は、ベクターＤＮＡと内在性遺伝子との上首尾の相同組換 えのために十分な長さである。好ましくは、数キロベースのフランキングＤＮＡ が、相同組換えベクター中に含まれる。ベクターＤＮＡと宿主細胞中の内在性遺 伝子との相同組換えにより、内在性プロモーター領域は、最小プロモーターに機 能的に結合された１つ以上のｔｅｔオペレーター配列を含むベクターＤＮＡによ り置き換えられる。従って、この内在性遺伝子の発現は、もはや、その内在性プ ロモーターの制御下になく、ｔｅｔオペレーター配列及び最小プロモーターの制 御下に置かれる。 他の具体例においては、ｔｅｔオペレーター配列を、内在性遺伝子内の何処か に、好ましくは５’又は３’調節領域内に、相同組換えにより挿入して、ここに 記載のテトラサイクリン調節される融合蛋白質により発現を調節し得る内在性遺 伝子を造ることができる。例えば、１つ以上のｔｅｔＯ配列を、プロモーター又 はエンハンサー機能が維持されるように、内在性遺伝子のプロモーター又はエン ハンサー領域内に挿入する（即ち、ｔｅｔＯ配列を、プロモーター／エンハンサ ー機能に関して決定的に重要ではないプロモーター／エンハンサー領域の部位に 導入する）ことができる。プロモーター／エンハンサー機能の喪失を伴わずに変 えることのできるプロモーター又はエンハンサー内の領域は、多くの遺伝子につ いて、当業者に公知であり、決定的に重要な調節領域を分析するための標準的技 術により決定することができる。決定的に重要ではない調節領域中に挿入された ｔｅｔＯ配列を有する内在性遺伝子は、正常の構成的及び／又は組織特異的な様 式で発現される能力を保持するが、加えて、テトラサイクリン制御される転写イ ンヒビター蛋白質により、制御された様式で、下方調節され得る。例えば、かか る改変された内在性遺伝子の構成的発現は、テトラサイクリン（又はアナログ） の存在下でｔｅｔＯ配列に結合するインヒビター融合蛋白質を用いて、テトラサ イクリン（又はアナログ）の存在により阻止され得る（後記の第IV及びVI節にて 更に詳細に説明する）。 Ａ．ｔｅｔオペレーター結合したヌクレオチド配列の発現の調節 ｔｅｔオペレーター結合したヌクレオチド配列の発現を、この発明のトランス アクチベーター融合蛋白質により調節する。従って、この融合蛋白質及び標的核 酸は、両者とも宿主細胞又は生物中に存在する。同じ宿主細胞又は生物中のトラ ンスアクチベーター融合蛋白質及び標的転写ユニットの両者の存在は、幾つかの 異なる方法により達成することができる。例えば、宿主細胞に（例えば、トラン スアクチベーター融合蛋白質をコードする）発現系の１つの核酸をトランスフェ クトすることができ、安定にトランスフェクトされた細胞を選択することができ 、次いで、それらのトランスフェクトされた細胞を、その発現系の他の核酸（例 えば、転写されるべき標的核酸）に対応する核酸で再トランスフェクトすること ができる（「スーパートランスフェクトする」とも言う）。２つの明確な選択可 能マーカーを、選択用に用いることができる。例えば、第１の核酸の取り込みを Ｇ４１８を用いて選択し、第２の核酸の取り込みをハイグロマイシンを用いて選 択することができる。或は、細胞の単一集団を、この系の両成分に対応する核酸 でトランスフェクトすることができる。従って、この発明は、下記を含む核酸成 分を提供する： ・転写を活性化する融合蛋白質をコードする第１の核酸（この融合蛋白質は、真 核細胞中での転写を活性化する第２のポリペプチドに機能的に結合されたテトラ サイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在下でｔｅｔオペレーター配列に 結合する第１のポリペプチドを含む）；及び ・少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写されるべ きヌクレオチド配列を含む第２の核酸。 一具体例において、これらの２つの核酸は２つの別々の分子（例えば、２つの異 なるベクター）である。この場合には、宿主細胞を、これらの２つの核酸分子で 同時トランスフェクトするか又は最初に一方の核酸分子でトランスフェクトし、 続いて他方の核酸分子でトランスフェクトする。他の具体例においては、これら の２つの核酸を同じ分子（例えば、単一のベクター）中に結合する（即ち、コリ ニアーにする）。この場合には、宿主細胞を単一核酸分子でトランスフェクトす る。 この宿主細胞は、イン・ビトロで培養された細胞又はイン・ビボで存在する細 胞であってよい（例えば、遺伝子治療の標的とされる細胞）。この宿主細胞は、 更に、受精卵母細胞、胎児幹細胞又は非ヒトトランスジェニック又は相同組換え 動物の創造に用いられる任意の他の胚細胞であってよい。この発現系の両核酸成 分を含むトランスジェニック又は相同組換え動物を、両核酸を胎児期に同じ細胞 に導入することにより造ることができ、一層好ましくは、ゲノム中にこの系の一 方の核酸成分を有する動物を、ゲノム中にこの系の他方の核酸成分を有する動物 と交配させる。次いで、両核酸成分を受け継いだ子孫を、標準的技術によって同 定することができる。 Ｂ．２つのヌクレオチド配列の発現の統合的調節 単一の転写されるヌクレオチド配列の調節された発現のための系を提供するこ とに加えて、この発明は、更に、同じｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合さ れた２つのヌクレオチド配列の発現の統合された調節を可能にする。従って、こ の発明の他の面は、２つの遺伝子の統合的調節のための新規なｔｅｔ調節された 転写ユニットに関係する。この転写ユニットにおいては、同じｔｅｔオペレータ ー配列が、共通のｔｅｔオペレーター配列から反対方向に転写される２つの機能 的に結合されたヌクレオチド配列の転写を調節する。従って、一方のヌクレオチ ド配列をｔｅｔオペレーター配列の片側（例えば、ＤＮＡの先頭鎖の５’末端） に機能的に結合し、他方のヌクレオチド配列はそのｔｅｔオペレーター配列の反 対側（例えば、ＤＮＡの先頭鎖の３’末端）に機能的に結合する。更に、転写さ れるべき各ヌクレオチド配列が、転写されるべきヌクレオチド配列とｔｅｔオペ レーター配列との間に位置する機能的に結合した最小プロモーター配列を含むと いうことは、理解されるべきである。 かかる転写ユニットの代表例を、図６に図式ダイヤグラムで示す。このベクタ ーにおいては、同じｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合した２つのヌクレオ チド配列が、ｔｅｔオペレーター配列に関して反対方向に転写される（即ち、こ れらの配列は、この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質による活性化に際 して、発散的様式で転写される）。「ｔｅｔオペレーター配列に関して反対方向 に転写される」とは、第１のヌクレオチド配列が、ＤＮＡの一方の鎖（例えば、 ボトム鎖）から、５’から３’の向きで転写され且つ第２のヌクレオチド配列が 、ＤＮＡの他方の鎖（例えば、トップ鎖）から、５’から３’の向きで転写され て、ｔｅｔオペレーター配列から離れていく二方向性転写を生じることを意味す る。 従って、この発明は、２つのヌクレオチド配列の統合的に調節される二方向性 転写のための組換えベクターを提供する。一具体例において、このベクターは、 ５’から３’の向きで下記を含むホスホジエステル結合により結合されたヌクレ オチド配列を含む： ・少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合され、 ・転写されるべき第２のヌクレオチド配列に機能的に結合された ・転写されるべき第１のヌクレオチド配列 ここに、第１及び第２のヌクレオチド配列の転写は、少なくとも１つのｔｅｔオ ペレーター配列から、反対方向に進行する（即ち、第１及び第２のヌクレオチド 配列が、発散的様式で転写される）。 他の具体例においては、このベクターは、転写されるべき第１及び第２のヌク レオチド配列を含まず、代わりに、関心のあるヌクレオチド配列のベクター中へ の導入を可能にするクローニング部位を含む。従って、この具体例においては、 ベクターは、５’から３’の向きで下記を含むヌクレオチド配列を含む： ・少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合され、 ・転写されるべき第２のヌクレオチド配列の導入のための第２のクローニング 部位に機能的に結合された ・転写されるべき第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング 部位 ここに、ベクターに導入した第１及び第２のヌクレオチド配列の転写は、少なく とも１つのｔｅｔオペレーター配列から、反対方向に進行する。この型の「クロ ーニングベクター」は、第１のクローニング部位に導入された第１のヌクレオチ ド配列が第１の最小プロモーターに機能的に結合され且つ第２のクローニング部 位に導入された第２のヌクレオチド配列が第２の最小プロモーターに機能的に結 合されるように最小プロモーター配列をも含む形態であってよいということは、 当業者には認められよう。或は、この「クローニングベクター」は、最小プロモ ーター配列を含まず、代わりに、結合した最小プロモーター配列を含むヌクレオ チド配列がベクターのクローニング部位に導入される形態であってよい。 この用語「クローニング部位」は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ 部位を含むことを意図している。典型的には、多数の異なる制限エンドヌクレア ーゼ部位（例えば、ポリリンカー）が、この核酸中に含まれる。 更に別の具体例においては、２つのヌクレオチド配列の統合的、二方向性転写 のためのベクターは、転写されるべき第１のヌクレオチド例えば検出可能マーカ ー（例えば、ルシフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ）をコードするもの及び 関心のある第２のヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位を含むこと ができる。 ここに記載したような転写されるべき２つのヌクレオチド配列の統合的調節の ためのベクター中で用いるための２つの異なる適当な二方向性プロモーター領域 のヌクレオチド配列を、図７Ａ及び７Ｂ（それぞれ、SEQ ID NO:６及び７）に示 す。図７Ａの構築物においては、この構築物中に存在する両方の最小プロモータ ーは、ＣＭＶプロモーターに由来する。図７Ｂの構築物において、この構築物中 に存在する１つの最小プロモーターはＣＭＶプロモーターに由来し、他方、第２ の最小プロモーターはＴＫプロモーターに由来する。この発明の二方向性プロモ ーターを含むプラスミッドｐＵＨＤＧ１３１６−８を、１９９４年７月８日に、 ブダペスト条約の規定により、ドイツ国、Braunschweigの Deutsche SammlungVo n Mikroorganismen und ZellKulturen GmbH（ＤＳＭ）に寄託し、寄託番号 ＤＳＭ９２８１が与えられた。 ｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合した２つのヌクレオチド配列の二方向 性転写のためのこの発明の転写ユニットは、関心のある２つのヌクレオチド配列 の発現を統合するのに有用である。好ましくは、転写すべきヌクレオチド配列の 少なくとも１つは、真核生物のヌクレオチド配列である。一つの応用において、 同じ細胞内でヘテロ二量体分子の２つのサブユニットの化学量論的量を生成する ためにこのベクターを用いる。例えば、このベクターを用いて、同じ細胞内で抗 体の重鎖と軽鎖を生成し、又は同じ細胞内で成長因子レセプターサブユニットを 生成することができる。他の応用においては、このベクターを用いて、特定の細 胞の表現型の確立において協力する２つの遺伝子産物を発現させる。更に別の応 用においては、このベクターを用いて、指標機能及び関心のある遺伝子を同時発 現させる（ここに、指標は、関心のある遺伝子の発現を監視するために用いられ る）。従って、２つの統合的に発現される配列の一方は、関心のある遺伝子をコ ードし且つ他方は、関心のある遺伝子を発現させる細胞の選択において用いられ る検出可能なマーカー例えば表面マーカー又は酵素（例えば、β−ガラクトシダ ーゼ又はルシフェラーゼ）をコードすることができる。 ２つの統合的に調節されるヌクレオチド配列の転写を、この発明のＴｃ誘導可 能なアクチベーターの利用により、テトラサイクリン（又はそのアナログ）によ り誘導して、２つのヌクレオチド配列の発現を調節することができる。従って、 この系において、両ヌクレオチド配列の発現は、Ｔｃ（又はアナログ）の不在時 に「オフ」であり、Ｔｃ（又はアナログ）の存在により「オン」となる。或は、 ２つのヌクレオチド配列の統合的調節のためのベクターを、当分野で公知の他の テトラサイクリン調節される転写因子と共に用いることができる。例えば、Ｔｃ （又はアナログ）の不在時に遺伝子発現を活性化する転写活性化ドメインに融合 された野生型Ｔｅｔリプレッサーのトランスアクチベーター融合蛋白質例えばGo ssen,M．及びBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に記載され たｔＴＡも、統合的調節のためにこの標的転写ユニットと共に用いることができ る。 Ｃ．多数のヌクレオチド配列の発現の独立的調節 この発明は、更に、転写すべき２つ以上のヌクレオチド配列の独立的及び逆の 調節を可能にする。従って、この発明の他の面は、２つ以上の遺伝子の独立的調 節のための新規なｔｅｔ調節される転写ユニットに関係する。転写すべき２つの ヌクレオチド配列の発現を独立に調節するためには、一方のヌクレオチド配列を １つのクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合し、他方のヌクレオ チド配列を他のクラス型のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合する。従って 、この発明は、２つのヌクレオチド配列の転写の独立的調節のための少なくとも １つの組換えベクターを提供する。一具体例において、この（これらの）ベクタ ーは、下記を含む： ・少なくとも１つの第１のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結 合された転写されるべき第１のヌクレオチド配列；及び ・少なくとも１つの第２のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結 合された転写されるべき第２のヌクレオチド配列。 （転写されるべき各ヌクレオチド配列が、機能的に結合された上流の最小プロモ ーター配列をも含むことは、理解されるべきである。）これらの２つの独立に調 節される転写ユニットは、単一のベクターに含ませることができ、或は、２つの 別々のベクターに含ませることができる。これらの転写されるべきヌクレオチド 配列を含む組換えベクターは、前述のように、宿主細胞又は動物に導入すること ができる。 他の具体例においては、この（これらの）ベクターは、転写されるべき第１及 び第２のヌクレオチド配列を含まず、代わりに、関心のあるヌクレオチド配列の このベクターへの導入を可能にするクローニング部位を含む。従って、この具体 例においては、この（これらの）ベクターは、下記を含む： ・少なくとも１つの第１のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結 合された転写されるべき第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニ ング部位；及び ・少なくとも１つの第２のクラスの型のｔｅｔオペレーター列に機能的に結合 された転写されるべき第２のヌクレオチド配列の導入のための第２のクローニン グ部位。 この（これらの）クローニングベクターは、それぞれ第１及び第２のクローニン グ部位に機能的に結合された第１及び第２の最小プロモーターを既に含有する形 態であってよい。或は、機能的に結合された最小プロモーターを含む転写される べきヌクレオチド配列をクローニングベクター中に導入することができる。 更に別の具体例においては、２つのヌクレオチド配列の独立的調節のためのベ クターは、転写されるべき第１のヌクレオチド例えば、少なくとも１つの第１の クラスの型のｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された検出可能マーカー遺 伝子若しくは自殺遺伝子及び第２の関心あるヌクレオチド配列の導入のためのク ローニング部位を、それが少なくとも１つの第２のクラスの型のｔｅｔオペレー ター配列に機能的に結合されるように含むことができる。 ２つのヌクレオチド配列の独立的調節のために、ｔｅｔオペレーター配列の種 々の組合せを用いることができるということは、当業者には認められよう。例え ば、第１のｔｅｔオペレーター配列がクラスＡ型であり且つ第２のものがクラス Ｂ型であってよく又は、第１のｔｅｔオペレーター配列がクラスＢ型であり且つ 第２のものがクラスＣ型であってよい等。好ましくは、用いる２つのｔｅｔオペ レーターに対する１つは、クラスＢ型オペレーターである。 第１及び第２のヌクレオチド配列の独立的転写を、宿主細胞において、種々の クラスの型のｔｅｔオペレーター配列に独立的に結合する２つの異なるトランス アクチベーター融合蛋白質をコードする１つ以上の核酸を更に宿主細胞に導入す ることによって調節する。第１の融合蛋白質は、真核細胞における転写を活性化 するポリペプチド（例えば、この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質、例 えば、ＶＰ１６活性化領域に結合された変異したＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッ サー）に機能的に結合されたテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの 存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合するポリペプチドを含む。第２の融合蛋 白質は、真核細胞における転写を活性化するポリペプチド（例えば、ＶＰ１６活 性化領域に結合された野生型Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー、例えばGossen ,M．及びBujard,H.(1992)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に記載されたｔ ＴＡ）に機能的に結合されたテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの 不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するポリペプチドを含む。一具体例にお いて、第１の融合蛋白質は、転写ユニットにおいて用いられる第１のクラスの型 のｔｅｔオペレーター配列に結合し、第２の融合蛋白質は、転写ユニットにおい て用いられる第２のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に結合する。或は、他 の具体例において、第１の融合蛋白質は、第２のクラスの型のｔｅｔオペレータ ーに結合し、第２の融合蛋白質は、第１のクラスの型のｔｅｔオペレーターに結 合する。 例えば、転写されるべき第１のヌクレオチド配列はクラスＡのｔｅｔオペレー ターに結合することができ、第１の融合蛋白質はクラスＡのオペレーターに結合 することができるが、他方、転写されるべき第２のヌクレオチド配列はクラスＢ のｔｅｔオペレーターに結合することができ、第２の融合蛋白質はクラスＢのオ ペレーターに結合することができる。従って、この具体例においては、第１のヌ クレオチド配列の転写は、Ｔｃ（又はそのアナログ）の存在下で活性化されるが 、第２のヌクレオチド配列の転写は、Ｔｃ（又はそのアナログ）の不在時に活性 化される。或は、他の具体例においては、第１の融合蛋白質は、クラスＢのオペ レーターに結合し、第２の融合蛋白質は、クラスＡのオペレーターに結合する。 この場合、第２のヌクレオチド配列の転写は、Ｔｃ（又はそのアナログ）の存在 下で活性化されるが、他方、第１のヌクレオチド配列の転写は、Ｔｃ（又はその アナログ）の不在時に活性化される。この系における使用のための適当なトラン スアクチベーター蛋白質を、第Ｉ節及びGossen及びBujard(1992)前出に記載され たようにデザインすることができる。同じ細胞中に存在する２つの異なる型のＴ ｅｔリプレッサー融合蛋白質の間のヘテロ二量体化を阻止するためには、トラン スアクチベーター融合蛋白質の一方又は両方の二量体化領域を変異させることが 必要であり得る。変異は、二量体化に関与することが知られているＴｅｔＲのＣ 末端領域を標的とすることができる。この二量体化領域は、ＴｅｔＲの結晶構造 に基づいて詳細に説明されている（Hinrichs,W．等(1994)Science 264:418- 240 を参照されたい）。 この系は、２つの遺伝子の発現のＴｃ及びそのアナログによる独立の及び反対 の調節を可能にする。誘導剤としての種々のＴｃアナログの使用は、更に、種々 の配列の高い、低い又は中位のレベルの発現を可能にし得る（後記の第Ｖ節にて 一層詳細に検討する）。上記の２つの遺伝子の発現を独立に調節するためのこの 発明の新規な転写ユニットは、２つの遺伝子産物を同じ細胞中で発現させるべき であるが、一方の遺伝子産物を他方の遺伝子産物の発現を「オフ」にしておいて 発現させることが望ましい状況（及び逆の場合）に用いることができる。例えば 、この系は、同じ宿主細胞内で治療用遺伝子又は自殺遺伝子（即ち、細胞を破壊 するために使用し得る産物例えばリシン又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナ ーセをコードする遺伝子）を発現させるために特に有用である。多くの遺伝子治 療状況において、治療目的のために宿主細胞内で遺伝子を発現させることができ るが、一度治療が完了したならばその宿主細胞を破壊する能力を有することが望 ましい。これは、治療用遺伝子を１つのクラスのｔｅｔオペレーターに結合し且 つ自殺遺伝子を他のクラスのｔｅｔオペレーターに結合することにより、上記の 系を用いて達成することができる。従って、治療用遺伝子の宿主細胞における発 現をＴｃにより刺激することができる（この場合には、自殺遺伝子の発現はない ）。次いで、一度治療が完了したならば、Ｔｃを除去し、それは、この細胞にお ける治療用遺伝子の発現をオフにし且つ自殺遺伝子の発現をオンにする。 Ｄ．多数のヌクレオチド配列の組み合わせた統合的及び独立的調節 更に、第III節Ｂに記載した系を第III節Ｃに記載した系と、配列の２つの対が 統合的に調節されるが、１つの対は他の対とは独立に調節されるように組み合わ せることによって４つのヌクレオチド配列の発現を調節することが可能である。 従って、下記を含む２つの標的転写ユニットをデザインすることができる： ・転写されるべき第１のヌクレオチド配列、第１のクラスの型のｔｅｔオペレー ター配列、及び転写されるべき第２のヌクレオチド配列を、５’から３’の向き で含む第１の核酸 ・転写されるべき第３のヌクレオチド配列、第２のクラスの型のｔｅｔオペレー ター配列、及び転写されるべき第４のヌクレオチド配列を、５’から３’の向き で含む第２の核酸。 第１の核酸中の第１及び第２のヌクレオチド配列の転写は、発散的様式で、第１ のクラスのｔｅｔオペレーター配列から進行する。同様に、第２の核酸中の第３ 及び第４のヌクレオチド配列の転写は、発散的様式で、第２のクラスのｔｅｔオ ペレーター配列から進行する。従って、第１と第２のヌクレオチド配列の発現は 統合的に調節され、第３と第４のヌクレオチド配列の転写は統合的に調節される 。しかしながら、第１と第２の配列の発現は、上記のように、２つの異なるトラ ンスアクチベーター融合蛋白質｛その一方は、Ｔｃ（又はそのアナログ）の存在 下で転写を活性化し、他方は、Ｔｃ（又はそのアナログ）の不在時に転写を活性 化する｝の使用により、第３と第４の配列と比べて独立的に（及び反対に）調節 される。一方のトランスアクチベーターを第１のクラスの型のｔｅｔオペレータ ーに結合するようにデザインし、他方を第２のクラスの型のｔｅｔオペレーター に結合するようにデザインする。他の具体例においては、これらの転写ユニット は、転写されるべき第１、第２、第３及び／又は第４のヌクレオチド配列を既に 含んでいるのではなく、転写されるべき第１、第２、第３及び／又は第４のヌク レオチド配列の導入を可能にするクローニング部位を含むことができる。IV ．テトラサイクリン調節される転写インヒビター この発明の他の面は、転写インヒビター融合蛋白質に関係する。この発明のイ ンヒビター融合蛋白質を、この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質と同様 に構築する（第Ｉ節参照）が、真核細胞における転写を刺激するポリペプチドド メインの代わりに、これらのインヒビター融合蛋白質は、真核細胞における転写 を阻止するポリペプチドドメインを含む。このインヒビター融合蛋白質を用いて 、ｔｅｔＯ配列に機能的に結合された遺伝子の発現を下方制御する。例えば、ｔ ｅｔＯ結合された遺伝子を宿主細胞又は動物に導入する場合には、その遺伝子の 基礎的、構成的発現のレベルは、その遺伝子を導入する細胞又は組織の型によ り及びその遺伝子のインテグレーション部位によって変化し得る。或は、ｔｅｔ Ｏ配列を導入した内在性遺伝子の構成的発現は、近くの更なる内在性調節配列の 強度によって変化し得る。ここに記載したこれらのインヒビター融合蛋白質は、 制御された様式で、かかるｔｅｔＯ結合された遺伝子の発現を阻止するために用 いることのできる組成物を提供する。 一具体例において、この発明のインヒビター融合蛋白質は、真核細胞における 転写を阻止する異種の第２のポリペプチドに機能的に結合されたテトラサイクリ ン（Ｔｃ）又はそのアナログの不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが存 在時には結合しない第１のポリペプチドを含む。他の具体例においては、このイ ンヒビター融合蛋白質は、真核細胞における転写を阻止する異種の第２のポリペ プチドに機能的に結合されたテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーター配 列に結合するが不在時には結合しない第１のポリペプチドを含む。用語「異種の 」は、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドと異なる蛋白質に由来すること を意味することを意図している。トランスアクチベーター融合蛋白質と同様に、 転写インヒビター融合蛋白質は、ここに記載の標準的組換えＤＮＡ技術を用いて 調製することができる。 Ａ．転写インヒビター融合蛋白質の第１のポリペプチド この発明の転写インヒビター融合蛋白質は、部分的に、（ｉ）テトラサイクリ ン（Ｔｃ）又はそのアナログの不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが、 存在時には結合しないか、或は（ｉｉ）Ｔｃ又はそのアナログの存在時に結合す るが不在時には結合しない第１のポリペプチドからなる。 好ましくは、前の具体例において、第１のポリペプチドは、野生型Ｔｅｔリプ レッサーである（それは、Ｔｃの不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが 、存在時には結合しない）。任意のクラス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ）の 野生型Ｔｅｔリプレッサーを、第１のポリペプチドとして用いることができる。 好ましくは、野生型Ｔｅｔリプレッサーは、Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー である。野生型Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーのヌクレオチド及びアミノ酸 配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１６及びSEQ ID NO:１７に示す。 或は、後の具体例において、第１のポリペプチドは、上記の第Ｉ節パートＡに 記載した変異したＴｅｔリプレッサーである（それは、Ｔｃの存在下でｔｅｔオ ペレーター配列に結合するが、不在時には結合しない）。任意のクラス（例えば 、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ）の変異したＴｅｔリプレッサーを第１のポリペプチド として用いることができる。好ましくは、変異したＴｅｔリプレッサーは、７１ 、９５、１０１及び／又は１０２位に１つ以上のアミノ酸置換を有するＴｎ１０ 由来のＴｅｔリプレッサーである。かかる変異したＴｎ１０由来のＴｅｔリプレ ッサーのヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１８及びSEQ ID NO:１９に示す。 Ｂ．転写インヒビター融合蛋白質の第２のポリペプチド 転写インヒビター融合蛋白質の第１のポリペプチドを、真核細胞における転写 を直接又は間接に阻止する第２のポリペプチドに機能的に結合する。上記の第Ｉ 節に記載のように、融合蛋白質の第１及び第２のポリペプチドを機能的に結合す るためには、典型的には、第１及び第２のポリペプチドをコードするヌクレオチ ド配列を、互いにイン・フレームでライゲートして融合蛋白質をコードするキメ ラ遺伝子を造る。しかしながら、これらの第１及び第２のポリペプチドを、各ポ リペプチドの機能を保存する他の手段により機能的に結合することができる（例 えば、化学的に架橋する）。融合蛋白質が、その融合蛋白質のアミノ末端に第１ のポリペプチドを有し且つカルボキシ末端に第２のポリペプチドを有するとして ここに記載されていても、反対の向き（即ち、アミノ末端の第２のポリペプチド 及びカルボキシ末端の第１のポリペプチド）もこの発明により企図されるという ことは、当業者には認められよう。 真核細胞における転写を阻止するように機能することのできる蛋白質及び蛋白 質内のポリペプチドドメインは、この分野において記載されている（概説として は、例えば、Renkawitz,R.(1990)Trends in Genetics 6:192-197; 及びHerschba ch,B.M．及びJohnson,A.D.(1993)Annu.Rev.Cell.Biol.9:479-509を参照されたい ）。かかる転写インヒビタードメインは、当分野では、「サイレンシングドメイ ン」又は「リプレッサードメイン」と呼ばれている。これらのポリペプ チドドメインの多くが転写を阻止する正確な機構は知られていない（そして、こ の発明は、機構によって限定されることを意図していない）が、次を含む、リプ レッサードメインが転写を阻止する幾つかの可能な手段がある：１）アクチベー ター蛋白質又は一般的転写機構の何れかの結合の競争的阻害、２）ＤＮＡ結合し たアクチベーターの活性の防止及び３）一般的転写機構の機能的なプレイニシエ ーション複合体のアセンブリの負の干渉。従って、リプレッサードメインは、転 写機構に対する直接的阻害効果を有するかもしれないし、アクチベーター蛋白質 の活性を阻止することにより間接的に転写を阻止するかもしれない。従って、用 語「真核細胞における転写を阻止するポリペプチド」は、ここで用いる場合、転 写を直接又は間接に阻止するポリペプチドを含むことを意図している。ここで用 いる場合、転写の「阻止」は、標的遺伝子の転写のレベル又は量の、転写インヒ ビター蛋白質による調節前の転写のレベル又は量と比べての減少を意味すること を意図する。転写の阻止は、部分的でも完全でもよい。用語「サイレンサー」、 「リプレッサー」及び「インヒビター」は、ここでは、転写を阻止することので きる調節蛋白質又はそのドメインを記述するために交換可能に用いる。 ここに記載した転写の「リプレッサー」又は「サイレンサー」ドメインは、異 種蛋白質にトランスファーされたときにその転写リプレッサー機能を保持するポ リペプチドドメインである。異種蛋白質にトランスファーされたときに機能し得 るリプレッサードメインを有することが示された蛋白質には、ｖ−ｅｒｂＡオン コジーン産物（Baniahmad,A.等(1992)EMBO J.11:1015-1023）、甲状腺ホルモン レセプター（Baniahmad,前出）、レチノイン酸レセプター（Baniahmad,前出）及 びDrosophilaのKruppel（Ｋｒ）蛋白質（Licht,J.D.等(1990)Nature 346:76-79; Saer,F．及びJackle,H.(1991)Nature 353:563-566; Licht,J.D．等(1994)Mol.C ell.Biol.14:4057-4066）が含まれる。真核細胞における転写リプレッサー活性 を有する他の蛋白質の非制限的例には、Drosophilaのホメオドメイン蛋白質even -skipped（ｅｖｅ）、S.cerevisiaeのＳｓｎ／Ｔｕｐ１蛋白質複合体（Herschba ch及びJohnson、前出参照）、酵母ＳＩＲ１蛋白質（Chien,等(1993)Cell 75:531 -541参照）、ＮｅＰ１（Kohne,等(1993)J.Mol.Biol.232:747-755参照）、Drosop hilaのdorsal蛋白質（Kirov,等(1994)Mol.Cell.Biol.14:713-722; Jiang,等(1993)EMBO J.12:3201-3209参照）、ＴＳＦ３（Chen，等(1993)Mol.Cel l.Biol.13:831-8409照）、ＳＦＩ（Targa,等(1992)Biochem.Biophys.Res.Comm.1 88 :416-4239照）、Drosophilaのhunchback 蛋白質（Zhang,等(1992)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 89:7511-7515参照）、Drosophilaのknirps蛋白質（Gerwin，等(199 4)Mol.Cell.Biol.14:7899-7908参照）、ＷＴ１蛋白質（Wilm's腫瘍遺伝子産物） （Anant,等(1994)Oncgene 9:3113-3126; Madden 等(1993)Oncogene 8:1713-1720 参照）、Ｏｃｔ−２．１（Lillycrop,等(1994)Mol.Cell.Biol.14:7633-7642 参 照）、Drosophilaのengrailed 蛋白質（Badiani,等(1994)Genes Dev.8:770-782; Han及びManley,(1993)EMBO J.12:2723-2733参照）、Ｅ４ＢＰ４（Cowell及びHu rst,(1994)Nucleic Acids Res.22:59-65参照）及びＺＦ５（Numoto，等(1993)Nu cleic Acids Res.21:3767-3775参照）が含まれる。 好適具体例において、この発明の転写インヒビター融合蛋白質の第２のポリペ プチドはDrosophilaのKrueppel蛋白質の転写サイレンサードメインである。リプ レッサー活性を有するＣ末端、例えばその天然の蛋白質のアミノ酸４０３〜４６ ６を用いることができる（Sauer,F.及びJack1e,H．、前出参照）。この領域は、 Ｃ６４ＫＲとして言及される。Ｃ６４ＫＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列を、 それぞれ、SEQ ID NO:２０及びSEQ ID NO:２１に示す。ＴｅｔＲ−Ｃ６４ＫＲ融 合蛋白質をコードする発現ベクターの構築を実施例４に記載する。或は、やはり リプレッサー活性を有するＫｒのアラニンリッチなアミノ末端領域を、融合蛋白 質の第２のポリペプチドとして用いることができる。例えば、Ｋｒのアミノ酸２ ６〜１１０（Licht,J.D.等(1990)、前出参照）を第２のポリペプチドとして用い ることができる。或は、全又は部分的阻止活性を未だ保持しているＫｒサイレン サードメインの何れかをを包含するもっと長い又は短いポリペプチド断片も企図 される（例えば、Ｎ末端サイレンサードメインのアミノ酸６２〜９２；Licht,等 (1994)、前出参照）。 他の好適具体例において、この発明の転写インヒビター融合蛋白質の第２のポ リペプチドは、ｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物の転写サイレンサードメインであ る。ｖ−ｅｒｂＡのサイレンサーは、天然のｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物の約 ３６２〜６３２アミノ酸残基にマップされた（Baniahmad,等、前出参照）。従っ て、この領域を包含する断片をサイレンサードメインの第２のポリペプチドとし て使用する。一具体例において、天然のｖ−ｅｒｂＡ蛋白質の３６４〜６３５ア ミノ酸残基を用いる。ｖ−ｅｒｂＡのこの領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列 を、それぞれ、SEQ ID NO:２２及びSEQ ID NO:２３に示す。ＴｅｔＲ−ｖ−ｅｒ ｂＡ融合蛋白質をコードする発現ベクターの構築を、実施例５に記載する。或は 、未だ全又は部分的阻止活性を保持しているｖ−ｅｒｂＡサイレンサー領域を包 含するもっと長い又は短いポリペプチド断片も企図される。例えば、ｖ−ｅｒｂ Ａのアミノ酸残基３４６〜６３９、３６２〜６３９、３４６〜６３２、３４６〜 ６１６及び３６２〜６１６を用いることができる。更に、内部欠失を有し未だ全 又は部分的阻止活性を保持しているこれらの領域を包含するポリペプチド断片例 えばｖ−ｅｒｂＡのアミノ酸残基３６２〜４６８／５０８〜６３９は、この発明 に包含される。更に、サイレンサードメインの２つ以上のコピー例えばｖ−ｅｒ ｂＡの３６２〜６１６アミノ酸残基の２コピーを融合蛋白質に含めることができ る。ｖ−ｅｒｂＡの適当なサイレンサーポリペプチドドメインが、更にBaniahma d,A.等（前出）に記載されている。 他の具体例においては、他のサイレンサードメインを用いる。用いることので きるポリペプチドドメインの非制限的例には、次が含まれる：甲状腺ホルモンレ セプターα（ＴＨＲα）の１２０〜４１０アミノ酸残基、レチノイン酸レセプタ ーα（ＲＡＲα）の１４３〜４０３アミノ酸残基、knirpsの１８６〜２３２アミ ノ酸残基、ＷＴ１のＮ末端領域（Anant、前出参照）、Ｏｃｔ−２．１のＮ末端領 域（Lillycrop、前出参照）、Ｅ４ＢＰ４の６５アミノ酸ドメイン（Cowell及びH urst、前出参照）及びＺＦ５のＮ末端ジンクフィンガードメイン（Numoto、前出 参照）。更に、未だ全又は部分的阻止活性を保持しているこれらの領域を包含す るもっと短い又は長いポリペプチド断片も企図される。 前に記載された転写インヒビタードメインに加えて、標準的技術により同定す ることのできる新規な転写インヒビタードメインが、この発明の範囲内にある。 ポリペプチドの転写インヒビター活性は：１）ＤＮＡ結合活性を有する他のポリ ペプチドに結合した試験用サイレンサーポリペプチド（即ち、ＤＮＡ結合ドメイ ン−サイレンサードメイン融合蛋白質）をコードする発現ベクターを構築し、２ ）この発現ベクターを、通常宿主細胞内で構成的に発現され且つＤＮＡ結合ドメ インに対する結合部位をも含むレポーター遺伝子構築物と共に宿主細胞に同時ト ランスフェクトし、そして３）宿主細胞内での融合蛋白質の発現により阻止され たレポーター遺伝子構築物の転写の量を測定することによりアッセイすることが できる。例えば、当分野で用いられる標準的アッセイは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ド メイン（例えば、１〜１４７アミノ酸残基）と試験用サイレンサードメインとの 融合蛋白質を利用する。次いで、この融合蛋白質を用いて、正の調節配列（通常 構成的転写を刺激する）及びＧＡＬ４結合部位（例えば、Baniahmad、前出を参 照）を含むレポーター遺伝子構築物の発現を阻止する。 Ｃ．転写インヒビター融合蛋白質の第３のポリペプチド Ｔｅｔリプレッサー及び転写サイレンサードメインに加えて、この発明の転写 インヒビター融合蛋白質は、この融合蛋白質の細胞核への輸送を促進する機能的 に結合された第３のポリペプチドを含むことができる。トランスアクチベーター 融合蛋白質について記載したように（上記の第Ｉ節、パートＣ参照）、各局在化 シグナルを、転写インヒビター融合蛋白質中に取り込むことができる。 Ｄ．転写インヒビター融合蛋白質の発現 この発明の転写インヒビター融合蛋白質をコードする核酸分子を、組換え発現 ベクターに取り込んで宿主細胞に導入し、上記の第II節、パートＡ、Ｂ及びＣに 記載したように、宿主細胞中で融合蛋白質を発現させることができる。好ましく は、この発明の転写インヒビター融合蛋白質を発現する宿主細胞は、関心あるｔ ｅｔオペレーター結合された遺伝子（即ち、転写されるべき標的ヌクレオチド配 列）をも有する。 転写インヒビター融合蛋白質をその細胞中で発現しているトランスジェニック 生物を、上記の第II節、パートＤに記載したように調製することができる。更に 、転写インヒビター融合蛋白質をその細胞中で発現している相同組換え生物もこ の発明に包含され、上記の第II節、パートＥに記載したように調製することが できる。この発明は、相同組換えに適した組換え発現ベクターを提供する。一具 体例において、かかる発現ベクターは、この発明の転写インヒビター融合蛋白質 をコードし、真核生物遺伝子の付加的核酸と５’及び３’末端にて隣接する核酸 分子を含み、その付加的核酸は、その真核生物遺伝子との上首尾の相同組換えに 十分な長さのものである。この発明の調節系の成分を発現する相同組換え生物を 造るベクター及び方法並びにその利用は、米国特許出願第０８／２６０，４５２ に更に詳細に記載されている。好ましくは、転写インヒビター融合蛋白質をその 細胞内で発現しているこの発明のトランスジェニック又は相同組換え生物は又、 関心あるｔｅｔオペレーター結合された遺伝子（即ち、転写されるべき標的ヌク レオチド配列）をもその細胞内に有する。Ｖ．この発明のキット この発明の他の面は、この発明の誘導可能な調節系の成分を含むキットに関係 する。かかるキットを用いて、標的転写ユニット中にクローン化し得る関心ある 遺伝子（即ち、転写されるべき関心あるヌクレオチド配列）の発現を調節するこ とができる。このキットは、転写アクチベーター融合蛋白質又は転写インヒビタ ー融合蛋白質或は両方をコードする核酸を含んでよい。或は、このキットにおい て、真核細胞中で発現されるように安定に取り込まれたトランスアクチベーター 及び／又はインヒビター融合蛋白質をコードする核酸を有する真核細胞を提供す ることができる。 一具体例において、このキットは、その中の近い範囲内に少なくとも次の２つ の容器手段を有するキャリアー手段を含む：この発明のトランスアクチベーター 融合蛋白質をコードする第１の核酸（例えば、ＤＮＡ）（例えば、真核細胞にお ける転写を活性化する第２のポリペプチドに機能的に結合されたテトラサイクリ ンの存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合する第１のポリペプチドをコードす る組換え発現ベクター）を含む第１の容器手段、及び関心あるヌクレオチド配列 をクローン化することのできるトランスアクチベーターの第２の標的核酸（例え ば、ＤＮＡ）。第２の核酸は、典型的には、転写されるべきヌクレオチド配列（ 適宜、機能的に結合された最小プロモーター配列を含む）の導入のためのクロー ニング部位及び少なくとも１つの機能的に結合されたｔｅｔオペレーター配列を 含む。用語「クローニング部位」は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ 部位を含むことを意図している。典型的には、多数の異なる制限エンドヌクレア ーゼ部位（例えば、ポリリンカー）が、この核酸中に含まれる。 このキットの成分を用いて関心あるヌクレオチド配列の発現を調節するために は、そのヌクレオチド配列を、慣用の組換えＤＮＡ技術によってこのキットの標 的ベクターのクローニング部位にクローン化し、次いで、第１及び第２の核酸を 宿主細胞又は動物に導入する。宿主細胞又は動物中で発現されたトランスアクチ ベーター融合蛋白質は、次いで、誘導剤（Ｔｃ又はそのアナログ）の存在下で、 関心あるヌクレオチド配列の転写を調節する。 或は、他の具体例においては、このキットは、この発明のトランスアクチベー ター融合蛋白質をコードする核酸で、そのトランスアクチベーターが細胞内で発 現されるように安定にトランスフェクトされた真核細胞を含む。従って、核酸を 単独で含むのではなく、上記の第１の容器手段は、トランスアクチベーターをコ ードする第１の核酸を（例えば、慣用の方法例えばリン酸カルシウム沈澱又はエ レクトロポレーション等による安定なトランスフェクションにより）安定に導入 した真核細胞株を含むことができる。この具体例においては、関心あるヌクレオ チド配列をこのキットの標的ベクターのクローニング部位にクローン化し、次い で、その標的ベクターをトランスアクチベーター融合蛋白質を発現している真核 細胞内に導入する。 或は、又は更に、２つのヌクレオチド配列の発現の統合的調節のためのこの発 明の組換えベクターを、この発明のキットに取り込むこともできる。そのベクタ ーは、関心ある２つのヌクレオチド配列のベクターへの導入を可能にする形態で このキットに含めることができる。従って、他の具体例において、この発明のキ ットは、１）この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質をコードする核酸（ 又は、その核酸を安定に導入した真核細胞）及び２）関心ある第２のヌクレオチ ド配列の導入のための第２のクローニング部位に機能的に結合された少なくとも １つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された関心ある第１のヌクレオチ ド配列の導入のための第１のクローニング部位を５’から３’の向きで含むヌク レオチド配列を含む第２の核酸（ここに、第１及び第２のヌクレオチド配列の転 写は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列から反対方向に進行する）。適 宜、このベクターは、機能的に結合した最小プロモーター配列を含むことができ る。他の具体例においては、このベクターは、転写されるべき１つのヌクレオチ ド配列（例えば、検出可能なマーカー例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ ーゼ又はＣＡＴをコードするもの）及び転写されるべき関心ある第２のヌクレオ チド配列の導入のためのクローニング部位を既に含む形態であってよい。 転写されるべき２つのヌクレオチド配列の発現の独立的調節のためのこの発明 の転写ユニット及びトランスアクチベーターも又、この発明のキットに取り込む ことができる。標的転写ユニットは、転写されるべき関心あるヌクレオチド配列 の転写ユニットへの導入を可能にする形態であってよい。従って、他の具体例に おいては、この発明のキットは、１）Ｔｃ又はそのアナログの存在下で第１のク ラスの型のｔｅｔオペレーターに結合するトランスアクチベーターをコードする 第１の核酸、２）少なくとも１つの第１のクラスの型のｔｅｔオペレーターに機 能的に結合された転写されるべき第１のヌクレオチド配列の導入のための第１の クローニング部位を含む第２の核酸、３）Ｔｃ又はそのアナログの不在時に第２ のクラスの型のｔｅｔオペレーターに結合するトランスアクチベーターをコード する第３の核酸、及び４）少なくとも１つの第２のクラスの型のｔｅｔオペレー ターに機能的に結合された転写されるべき第２のヌクレオチド配列の導入のため の第２のクローニング部位を含む第４の核酸を含む。（適宜、最小プロモーター 配列を第２及び第４の核酸に含める。）他の具体例においては、転写されるべき １つのヌクレオチド配列（例えば、自殺遺伝子をコードするもの）が、既に、第 ２又は第４の核酸のいずれかに含まれている。更に別の具体例においては、トラ ンスアクチベーターをコードする核酸（例えば、上記の第１及び第３の核酸）を 、このキットにおいて提供される真核細胞株に安定に導入することができる。 更に別の具体例においては、この発明のキットは、この発明の転写インヒビタ ー融合蛋白質（例えば、Ｔｃの存在下でのみ又はＴｃの不在時にのみ真核細胞中 の転写を阻止する融合蛋白質）をコードする第１の核酸を含む第１の容器手段、 及び少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写される べきヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位を含む第２の核酸を含む 第２の容器手段を含む。このキットは、更に、Ｔｃの存在下でのみ又はＴｃの不 在時にのみｔｅｔｏ配列に結合するトランスアクチベーター融合蛋白質をコード する第３の核酸を含むことができる。或は、第１及び／第３の核酸（即ち、イン ヒビター又はトランスアクチベーター融合蛋白質をコードするもの）を、このキ ットにおいて提供される真核宿主細胞に安定に取り込ませることができる。 更に他の具体例において、この発明のキットは、少なくとも１つのテトラサイ クリン又はテトラサイクリンアナログを含むことができる。例えば、このキット は、ここに記載のテトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイ クリン、エピオキシテトラサイクリン又は他のテトラサイクリンアナログを含む 容器手段を含むことができる。VI ．テトラサイクリン又はそのアナログによる遺伝子発現の調節 Ａ．トランスアクチベーター融合蛋白質による遺伝子発現の刺激 この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質をコードする核酸及びｔｅｔオ ペレーター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列（即ち、転写されるべき 関心ある遺伝子）を有する宿主細胞において、ｔｅｔオペレーター配列に機能的 に結合されたヌクレオチド配列の高レベルの転写は、誘導剤、テトラサイクリン 又はそのアナログの不在時には生じない。ヌクレオチド配列の基礎的転写のレベ ルは、宿主細胞及び配列のインテグレーション部位によって変化し得るが、一般 に、Ｔｃの不在時には、きわめて低いか又は検出できない程である。宿主細胞に おける転写を誘導するためには、宿主細胞をテトラサイクリン又はテトラサイク リンアナログに接触させる。従って、この発明の他の面は、この発明のトランス アクチベーター融合蛋白質を発現する宿主細胞又は動物におけるｔｅｔオペレー ター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列の転写を刺激するための方法に 関係する。これらの方法は、細胞をテトラサイクリン若しくはテトラサイクリン アナログに接触させること又はテトラサイクリン若しくはテトラサイクリンアナ ログをその細胞を含む患者に投与することを含む。 用語「テトラサイクリンアナログ」は、構造的にテトラサイクリンに関連し且 つ少なくとも約１０6Ｍ-1のＫaでＴｅｔリプレッサーに結合する化合物を包含す ることを意図している。好ましくは、テトラサイクリンアナログは、約１０9Ｍ- 1 以上のアフィニティーで結合する。かかるテトラサイクリンアナログの例には 、Hlavka及びBoothe，「The Tetracyclines」（R.K.Blackwood 等編、Handbook of Experimental Pharmacology 78，Springer-Verlag，Berlin-New York，1985 中）；L.A.Mitscher，「The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics」，M edicinal Research 9，Dekker，New York，1978; Noyee Development Corporati on，「Tetracycline Manufacturing Process」Chemical Process Reviews(ニュージャージー 、Park Ridge在)，第２巻、1969; R.C.Evans，「The Technol ogy of the Tetracyclines」，Biochemical References Series 1，Quadrangle Press（New York在），1968; 及び H.F.Dowling，「Tetracycline」，Antibioti c Monographs,no.3，Medical Encyclopedia（New York）1955により記載された アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、オ キシテトラサイクリン及びその他が含まれるが、これらに限られない。高レベル の転写の刺激に好適なＴｃアナログは、アンヒドロテトラサイクリン及びドキシ サイクリンである。Ｔｃアナログは、Ｔｃと比べて減じた抗生物質活性を有する ものを選択することができる。かかるＴｃアナログの例は、アンヒドロテトラサ イクリン、エピオキシテトラサイクリン及びシアノテトラサイクリンである。 イン・ビトロで細胞における遺伝子の発現を誘導するためには、その細胞を、 Ｔｃ又はＴｃアナログを含む培地中で培養することによりこの物質に接触させる 。細胞をＴｃ又はＴｃアナログの存在下でイン・ビトロで培養する場合は、誘導 剤の好適濃度範囲は、約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌである。Ｔｃ及びＴｃアナロ グは、細胞を既に培養している培地に直接加えることができ、或は、一層好まし くは、高レベルの遺伝子誘導のためには、細胞をＴｃを含まない培地から集めて Ｔｃ又はそのアナログを含む新鮮な培地にて培養する。 イン・ビボでの遺伝子発現を誘導するには、患者内の細胞を、Ｔｃ又はＴｃア ナログをその患者に投与することにより、この化合物と接触させる。用語「患者 」は、ヒト及び他の非ヒト哺乳動物（サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、 ラット、ウサギ、マウスを含む）、並びにこれらのトランスジェニック及び相同 組換え種を含むことを意図している。更に、用語「患者」は、植物例えばトラン スジェニック植物を含むことを意図している。誘導剤をヒト又は動物の患者に投 与する場合には、投薬量は、好ましくは、約０．０５〜１．０μｇ／ｍｌの血清 濃度を達成するように調節する。Ｔｃ又はＴｃアナログは、イン・ビボでの遺伝 子誘導のために十分な濃度を達成するのに有効な任意の手段によって患者に投与 することができる。投与の適当な方法の例には、経口投与（例えば、誘導剤を飲 料水に溶かす）、ゆっくりと放出するペレット及び拡散ポンプの移植が含まれる 。Ｔｃ又はＴｃアナログをトランスジェニック植物に投与するには、誘導 剤を、その植物に与える水に溶解させることができる。 この系において誘導剤として種々のＴｃアナログを用いる能力は、ｔｅｔオペ レーター結合されたヌクレオチド配列の発現のレベルを調節することを可能にす る。実施例２で示すように、アンヒドロテトラサイクリン及びドキシサイクリン は、強力な誘導剤であることが見出されている。標的配列の転写の増大は、典型 的には、高くても１０００〜２０００倍であり、誘導因子は、２０，０００倍ま で達成し得る。テトラサイクリン、クロロテトラサイクリン及びオキシテトラサ イクリンは、一層弱い誘導剤であることが見出されている。即ち、標的配列の転 写の増大は、約１０倍の範囲である。従って、遺伝子発現の誘導の所望のレベル に基づいて、適当なテトラサイクリンアナログを誘導剤として選択する。誘導剤 として用いるＴｃアナログを変えることによって、宿主細胞又は動物における長 時間の遺伝子発現のレベルを変えることも可能である。例えば、最初は遺伝子発 現の強いバーストを有し、次いで、持続的な低レベルの遺伝子発現が望ましいと いう状況はありえよう。従って、高レベルの転写を刺激するアナログを最初に誘 導剤として用い、次いで、誘導剤を、低レベルの転写を刺激するアナログに交換 することができる。更に、多数のヌクレオチド配列の転写を調節する場合（例え ば、上記の第III節、パートＣに記載のように、一方の配列を１つのクラスのｔ ｅｔオペレーター配列により調節し、他方を他のクラスのｔｅｔオペレーター配 列により調節する場合）には、各配列の発現のレベルを、どのトランスアクチベ ーター融合蛋白質を用いて転写を調節するか及びどのＴｃアナログを誘導剤とし て用いるかによって独立的に変えることが可能であり得る。種々のトランスアク チベーター融合蛋白質が、Ｔｃアナログに対する種々のレベルの応答性をを示す ことはありそうなことである。トランスアクチベーター融合蛋白質及び誘導剤（ Ｔｃ又はＴｃアナログ）の特定の組合せによる遺伝子発現の誘導のレベルを、こ こに記載の技術によって測定することができる（例えば、実施例２参照）。更に 、遺伝子発現のレベルは、誘導剤の濃度を変えることによって調節することがで きる。従って、この発明の発現系は、遺伝子発現をオン・オフするだけでなく、 用いる誘導剤の型及び濃度によって、中間レベルにおいて、遺伝子発現のレベル を「微細同調」もする機構を提供する。 Ｂ．転写インヒビター融合蛋白質による遺伝子発現の阻止 この発明は又、この発明の転写インヒビター融合蛋白質を用いて遺伝子発現を 阻止するための方法をも提供する。これらの方法を用いて、関心あるｔｅｔＯ結 合された遺伝子の基礎的、構成的又は組織特異的な転写を下方調節することがで きる。例えば、ｔｅｔＯ配列に機能的に結合された関心ある遺伝子及び更なる正 の調節要素（例えば、構成的又は組織特異的なエンハンサー配列）を、宿主細胞 内で、宿主細胞内での正の調節要素の強さにより最初に決定したレベルで転写す ることができる。更に、ｔｅｔＯ配列に機能的に結合された関心ある遺伝子及び 最小プロモーター配列のみは、宿主細胞若しくは組織及び／又は配列のインテグ レーション部位に基づいて基礎レベル転写の変化する程度を示し得る。かかる標 的配列を含み且つこの発明のインヒビター融合蛋白質を発現している宿主細胞に おいて、標的配列の転写は、その宿主細胞と接触しているＴｃ（又はアナログ） の濃度を変えることにより、制御された様式で、下方調節することができる。例 えば、Ｔｃの不在時にインヒビター融合蛋白質がｔｅｔｏに結合するときは、宿 主細胞に接触しているＴｃの濃度を減じて標的遺伝子の発現を阻止する。好まし くは、宿主細胞を、Ｔｃの不在にて培養して、標的遺伝子発現を抑制しておく。 同様に、Ｔｃを、宿主生物に投与しないで、標的遺伝子発現を抑制しておく。或 は、インヒビター融合蛋白質がＴｃの存在下でｔｅｔＯに結合する場合には、宿 主細胞と接触しているＴｃの濃度を増して標的遺伝子の発現を阻止する。例えば 、Ｔｃを、宿主細胞の培養培地に加え又は、Ｔｃを宿主生物に投与して、標的遺 伝子の発現を抑制する。 ここに記載のインヒビター融合蛋白質は、最小プロモーター配列の５’側にｔ ｅｔＯ配列が位置する関心あるｔｅｔＯ結合された遺伝子を阻止する（例えば、 上記の第III節に記載したテトラサイクリン調節される転写ユニット）。更に、 インヒビター融合蛋白質を用いて、ｔｅｔＯ結合された配列がプロモーターの３ ’側で転写開始部位の５’側に置かれた関心ある遺伝子の発現を阻止することが できる。更に、インヒビター融合蛋白質を用いて、ｔｅｔＯ結合された配列が転 写開始部位の３’側に置かれた関心ある遺伝子の発現を阻止することができる。 トランスアクチベーター融合蛋白質に関して、同様に、上記の第VI節、パート Ａに記載の様々なＴｃアナログを用いて、インヒビター融合蛋白質の活性を調節 することができる。更に、第VI節、パートＡに記載のＴｃ（又はアナログ）を用 いるイン・ビトロ培養及びＴｃ（又はアナログ）のイン・ビボ投与の方法は、転 写インヒビター融合蛋白質に等しく適用可能である。 Ｃ．遺伝子発現の組み合わせた正及び負の調節 転写アクチベーター又はインヒビター融合蛋白質を単独で用いる遺伝子発現の 調節に加えて、２つの型の融合蛋白質を組み合わせて用いて、宿主細胞における １つ以上の標的遺伝子の発現の正及び負の調節の両方を可能にすることができる 。従って、ｔｅｔＯに（ｉ）Ｔｃの不在時に結合するが存在時には結合しない転 写インヒビター蛋白質又は（ｉｉ）Ｔｃの存在時に結合するが不在時には結合し ない同インヒビター蛋白質を、ｔｅｔＯと（ｉ）Ｔｃの不在時に結合するが存在 時には結合しないトランスアクチベーター蛋白質又は（ｉｉ）Ｔｃの存在時に結 合するが不在時には結合しない同アクチベーター蛋白質との組合せにおいて用い ることができる。ｔｅｔＯにＴｃの不在時に結合するが存在時には結合しないト ランスアクチベーター蛋白質（例えば、野生型ＴｅｔＲ−アクチベーター融合蛋 白質）は、米国特許出願第０８／０７６，７２６号、第０８／０７６，３２７号 及び第０８／２６０，４５２号に、更に詳細に記載されている。Ｔｃの存在時に ｔｅｔＯに結合するが不在時には結合しない転写融合蛋白質（例えば、変異した ＴｅｔＲ−アクチベーター融合蛋白質）は、本明細書（上記の第Ｉ節参照）及び 米国特許出願第０８／２７０，６３７号及び第０８／２７５，８７６号に記載さ れている。転写インヒビター融合蛋白質は、本明細書の第IV節に記載されている 。 第III節、パートＣに記載のように、１つ以上のＴｅｔＲ融合蛋白質を宿主細 胞又は生物にて発現させる場合には、更なるステップを取って種々のＴｅｔＲ融 合蛋白質間のヘテロ二量体化を阻止することができる。例えば、１つのクラスの ＴｅｔＲよりなるトランスアクチベーターを、第１のクラスのＴｅｔＲとヘテロ 二量体化しない第２の異なるクラスのＴｅｔＲよりなる転写インヒビターと組み 合わせて用いることができる。或は、二量体化に関係するＴｅｔＲのアミノ酸残 基を突然変異させてヘテロ二量体化を阻止することができる。しかしながら、た とえ宿主細胞においてトランスアクチベーター及びインヒビター融合蛋白質間で 幾つかのヘテロ二量体化がおきても、ここに記載のような効率的な正及び負の調 節を可能にするだけ十分量のホモダイマーが生成するはずである。 アクチベーター及びインヒビター蛋白質の種々の組合せを用いて、関心ある単 一のｔｅｔＯ結合された遺伝子を正及び負の様式の両方で調節し又は、関心ある 多数のｔｅｔＯ結合された遺伝子を、ここに記載の教示を用いて、統合的様式若 しくは独立的様式で調節することができるということは、当業者には認められよ う。用いる正確な調節用成分は、調節される遺伝子及び所望の調節の型に依存す る。トランスアクチベーター及びインヒビター融合蛋白質をどのように組み合わ せて用いるかという幾つかの非制限的例を、更に、以下に記載する。しかしなが ら、本明細書の教示を考慮するならば、多くの他の可能な組合せが当業者には明 らかであり、それらは、この発明に包含されるものである。 図１０に図式的に示した好適具体例において、宿主細胞におけるｔｅｔＯ結合 された標的遺伝子の発現は、負及び正の様式で、テトラサイクリン又はそのアナ ログの不在時にｔｅｔＯに結合するが存在時には結合しないインヒビター融合蛋 白質（テトラサイクリン制御されるサイレンシングドメイン又はｔＳＤと呼ぶ） 及びテトラサイクリン又はそのアナログの存在時にｔｅｔＯに結合するが不在時 には結合しないアクチベーター融合蛋白質（リバーステトラサイクリン制御され るトランスアクチベーター又はｒｔＴＡと呼ぶ）の組合せにより調節される。ｔ ｅｔＯ配列に加えて、標的遺伝子をプロモーターに結合し、そして宿主細胞にお ける遺伝子の基礎レベルの構成的転写に寄与する他の正の調節要素（例えば、エ ンハンサー配列）を含むことができる。テトラサイクリン又はアナログ（例えば 、ドキシサイクリン）の不在時におけるｔＳＤのｔｅｔＯ配列への結合は、関心 ある遺伝子の基礎的構成的転写を阻止し、それ故に、その関心ある遺伝子を遺伝 子発現が望まれるまで抑制状態に維持する。遺伝子発現を所望するときは、宿主 細胞と接触しているテトラサイクリン又はアナログ（例えば、ドキシサイクリン ）の濃度を増加させる。薬物の添加に際して、ｔＳＤは、ｔｅｔＯ配列に結 合する能力を失い、他方、それ以前に結合してなかったｒｔＴＡがｔｅｔＯ配列 に結合する能力を得る。その結果生じたｒｔＴＡの、関心ある遺伝子に結合され たｔｅｔＯ配列への結合は、関心ある遺伝子の転写を刺激する。発現のレベルは 、前述したように、テトラサイクリン若しくはアナログの濃度、用いるＴｃアナ ログの型、誘導の遅延等により制御され得る。融合蛋白質の逆の組合せ（即ち、 インヒビターが薬物の存在時に結合するが不在時には結合せず且つアクチベータ ーが薬物の不在時に結合するが存在時には結合しない）も用い得るということは 、認められよう。この場合には、関心ある遺伝子の発現を、宿主細胞を薬物に接 触させる（例えば、Ｔｃ又はアナログと共に培養する）ことにより抑制させてお き、その薬物の除去により遺伝子発現を活性化する。 他の具体例においては、前段落に記載のように、アクチベーター及びインヒビ ター融合蛋白質を組み合わせて用いて、正及び負の様式の両方で、関心ある２つ の遺伝子を、上記の第111節、パートＢに記載の二方向性ｔｅｔＯ結合された転 写ユニットを用いて統合的に調節する。この場合には、遺伝子１及び遺伝子２を 同じｔｅｔＯ配列に、逆向きに結合する。インヒビター融合蛋白質を用いて、遺 伝子１及び遺伝子２の両方の転写の基礎レベルを統合的様式で抑制するが、他方 、トランスアクチベーター融合蛋白質を用いて、遺伝子１及び遺伝子２の発現を 統合的様式で刺激する。 更に別の具体例においては、アクチベーター及びインヒビター融合蛋白質を用 いて関心ある２つ以上の遺伝子を、上記の第III節、パートＣに記載のｔｅｔＯ 結合された転写ユニットを用いて独立に調節する。例えば、一具体例において、 Ｔｃ又はアナログの存在時に１つのクラス（例えばクラスＡ）のｔｅｔＯ配列に 結合するが不在時には結合しないトランスアクチベーター融合蛋白質を、やはり Ｔｃ又はアナログの存在時に第２の異なるクラス（例えばクラスＢ）のｔｅｔＯ 配列に結合するが不在時には結合しないインヒビター融合蛋白質と組み合わせて 用いる。クラスＡｔｅｔＯ配列に結合された遺伝子１及びクラスＢｔｅｔＯ配列 に結合された遺伝子２を含む宿主細胞において、両遺伝子は、この薬物の不在時 に基礎レベルで発現されるが、遺伝子１の発現はこの薬物の添加により刺激され 且つ遺伝子２の発現はこの薬物の添加により抑制される。 或は、他の具体例において、トランスアクチベーターは、Ｔｃ又はアナログの 存在時に１つのクラス（例えばクラスＡ）のｔｅｔＯ配列に結合するが不在時に は結合せず、インヒビター融合蛋白質は、Ｔｃ又はアナログの不在時に第２の異 なるクラス（例えばクラスＢ）のｔｅｔＯ配列に結合するが存在時には結合しな い。前段落に記載のように宿主細胞においては、遺伝子１は、薬物の不在時に基 礎レベルで発現され、薬物の添加に際して刺激されるが、遺伝子２は、薬物の不 在時には抑制され、薬物の添加に際して基礎レベルの発現を有する。種々の他の 可能な組合せは、当業者には明らかであろう。種々のクラスのｔｅｔＯ配列に結 合するトランスアクチベーター及びインヒビター融合蛋白質を、第Ｉ節、パート Ａに記載のように調製することができる。種々のクラスのｔｅｔＯ配列を含む標 的転写ユニットを、第III節、パートＣに記載のようにして調製することができ る。VII ．この発明の応用 この発明は、多面発現性又は細胞毒性を引き起こすことなく、迅速に、効率的 且つ制御された様式で、遺伝子発現をオン・オフし又は遺伝子発現のレベルを調 節することができることが望ましい種々の状況に対して広く応用可能である。従 って、この発明の系は、真核細胞、植物及び動物における細胞の発生及び分化の 研究に対して広い応用可能性を有している。例えば、オンコジーンの発現を、細 胞中で制御された様式で調節して、それらの機能を研究することができる。更に 、この系を用いて、部位特異的レコンビナーゼ例えばＣＲＥ又はＦＬＰの発現を 調節し、それにより、トランスジェニック生物の遺伝子型を発生の特定のステー ジで制御された条件下で不可逆的に改変することを可能にすることができる。例 えば、トランスジェニック植物のゲノムに挿入された、特定のトランスジェニッ ク植物の選択を可能にする薬剤耐性マーカーを、Ｔｃ調節される部位特異的レコ ンビナーゼにより不可逆的に除去することができるであろう。この発明の調節系 の他の応用は、下記を含む： Ａ．遺伝子治療 この発明は、遺伝的又は後天的疾患の治療における遺伝子治療目的に特に有用 である。遺伝子治療の一般的アプローチは、核酸を細胞へ導入して、その導入し た遺伝物質によりコードされる１つ以上の遺伝子産物がそれらの細胞中で生成さ れて機能的活性を回復し又は増大させることを含む。遺伝子治療アプローチにつ いての概説は、Anderson,W.F.(1992)Science 256:808-813; Miller,A.D.(1992)N ature 357:455-460; Friedmann,T.(1989)Science 244:1275-1281; 及びCournoye r,D.等(1990)Curr.Opin.Biotech.1:196-208 を参照されたい。しかしながら、現 在の遺伝子治療用ベクターは、典型的には、内在性転写因子に応答性の構成的な 調節要素を利用する。これらのベクター系は、患者における遺伝子発現のレベル を調節する能力を可能にしない。対照的に、この発明の誘導可能な調節系は、こ の能力を提供する。 この発明の系を遺伝子治療目的に用いるために、一具体例においては、遺伝子 治療の必要な患者の細胞を、１）この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質 を宿主細胞におけるそのトランスアクチベーターの発現に適した形態でコードす る核酸及び２）ｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された関心ある遺伝子（ 例えば、治療目的のためのもの）を含むように改変する。この患者の細胞を、エ キソ・ビボで改変し、次いで、その患者に導入することができ、又は、それらの 細胞をイン・ビボで直接改変することができる（これらの細胞の改変方法は、上 記の第II節に記載してある）。患者の細胞の関心ある遺伝子の発現を、次いで、 Ｔｃ又はＴｃアナログをその患者に投与することにより刺激する。遺伝子発現の レベルは、どの特定のＴｃアナログを誘導剤として用いるかによって変わり得る 。遺伝子発現のレベルは又、患者に投与するテトラサイクリン又はそのアナログ の量を調節して、それにより循環中及び関心ある組織において達成される濃度を 調節することによっても調節することができる。 更に、他の具体例においては、転写インヒビター融合蛋白質を用いて、関心あ る遺伝子の発現のレベルを更に制御する。例えば、患者の細胞を改変して、Ｔｃ の不在時にｔｅｔｏに結合する転写インヒビター融合蛋白質をコードする核酸を も含むようにすることができる。この核酸は、宿主細胞におけるインヒビター融 合蛋白質の発現に適した形態である。従って、患者へのＴｃ（又はアナログ）の 投与前に、関心ある遺伝子の転写の基礎レベルを、インヒビター融合蛋白質によ りサイレントに維持する。Ｔｃの投与に際して、インヒビター融合蛋白質のｔｅ ｔＯへの結合は、阻止されるが、トランスアクチベーター融合蛋白質の結合が誘 導され、それにより、関心ある遺伝子の転写が刺激される。この発明のトランス アクチベーター融合蛋白質及び転写インヒビター融合蛋白質の両方を用いる、遺 伝子発現のかかる組み合わせた正及び負の調節を、図１０に図式的に示す。 当分野で公知の慣用の検出方法例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイを用いて、 宿主細胞における調節された関心ある蛋白質の発現をモニターし、関心ある蛋白 質の発現の所望のレベルが達成されるまで、Ｔｃ又はＴｃアナログの濃度を変化 させることができる。従って、関心ある蛋白質の発現を、個人の生涯を通じて変 化し得るその個人の医療的ニーズに応じて調節することができる。患者の細胞に おける関心ある遺伝子の発現を停止するためには、誘導剤の投与を停止する。従 って、この発明の調節系は、治療状況の必要に応じて遺伝子発現のレベルを調節 することを可能にする構成的調節系を超える利点を提供する。 遺伝的又は後天的疾患の治療のために患者の細胞中で発現させるべき特に関心 のある遺伝子には、アデノシンデアミナーゼ、VIII因子、IX因子、ジストロフィ ン、β−グロビン、ＬＤＬレセプター、ＣＦＴＲ、インシュリン、エリスロポエ チン、抗血管形成因子、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、β−グルクロ ニダーゼ、α１−アンチトリプシン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロ シンヒドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネ ートシンテターゼ、ＵＤＰ−グルクロニシルトランスフェラーゼ、アポＡ１、Ｔ ＮＦ、可溶性ＴＮＦレセプター、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２）、イン ターフェロン（例えば、α−又はγ−ＩＦＮ）、並びに他のサイトカイン及び成 長因子をコードするものが含まれる。遺伝子治療目的のために改変し得る細胞型 には、造血幹細胞、筋原細胞、肝細胞、リンパ球、皮膚上皮及び気道上皮が含ま れる。遺伝子治療のための細胞型、遺伝子及び方法お更なる記載は、例えば、Wi lson,J.M等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018; Armentano,D．等(199 0)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145; Wolff,J.A．等(1990)Science 247 :1465-1468; Chowdhury,J.R．等(1991)Science 254:1802-1805; Ferry,N．等 (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381; Wilson,J.M.等(1992)J.Biol.Che m.267:963-967; Quantin,B.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584; Da i,Y.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895; van Beusechem,V.W.等( 1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644; Rosenfeld,M.A．等(1992)Cell 68 :143-155; Kay,M.A.等(1992)Human Gene Therapy 3:641-647; Cristiano,R.J.(1 993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122-2126; Hwu,P．等(1993)J.Immunol.150:41 04-4115;並びにHerz,J．及びGerard,R.D.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:281 2-2816 を参照されたい。 癌治療において特に興味深い遺伝子治療応用には、リンパ球を浸潤させる腫瘍 におけるサイトカイン遺伝子（例えば、ＴＮＦ−α）の過剰発現又は腫瘍部位に おける抗腫瘍免疫応答を誘導する腫瘍細胞におけるサイトカインの異所的発現、 無毒性因子を毒性因子に変換し得る腫瘍細胞における酵素の発現、抗腫瘍免疫応 答を誘導する腫瘍特異的抗原の発現、腫瘍細胞における腫瘍サプレッサー遺伝子 （例えば、ｐ５３又はＲｂ）の発現、骨髄細胞を化学療法の毒性から保護するた めのそれらの細胞における多剤耐性遺伝子（例えば、ＭＤＲ１及び／又はＭＲＰ ）の発現が含まれる。 ウイルス性疾患の治療において特に興味深い遺伝子治療応用には、トランス優 性負のウイルス性トランスアクチベーション蛋白質例えばＨＩＶについてのトラ ンス優性負のｔａｔ及びｒｅｖ変異体又はＨＳＶについてのトランス優性ＩＣｐ ４変異体の発現（例えば、Balboni,P.G.等(1993)J.Med.Virol.41:289-295; Liem ,S.E．等(1993)Hum.Gene Ther.4:625-634; Malim,M.H．等(1992)J.Exp.Med.176: 1197-1201;Daly,T.J．等(1993)Biochemistry 32:8945-8954;及びSmith,C.A.等(1 992)Virology 191:581-588を参照）、トランス優性負のエンベロープ蛋白質例え ばＨＩＶについてのｅｎｖ変異体（例えば、Steffy,K.R．等(1993)J.Virol.67:1 854-1859参照）、ウイルス性産物に対する抗体又はその断片の細胞内発現（「内 部免疫化」、例えば、Marasco,W.A.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7 893 参照）及び可溶性ウイルスレセプター例えば可溶性ＣＤ４の発現が含まれる 。更に、この発明の系を用いて、条件付きで自殺遺伝子を細胞内で発現さ せ、それにより、細胞が意図された機能を果たした後にそれらを除去することを 可能にする。例えば、予防接種に用いられた細胞を、患者に免疫応答が生じた後 に、Ｔｃ又はＴｃアナログをその患者に投与することにより、それらの細胞内の 自殺遺伝子の発現を誘導することによって、その患者内から排除することができ る。 この発明のＴｃ制御される調節系は、遺伝子治療への応用に特に適している多 くの有利な特性を有している。例えば、この系は、患者における遺伝子産物の調 節された投与を可能にする遺伝子発現のための「オン」／「オフ」スイッチを提 供する。単に設定されたレベルで遺伝子産物を構成的に発現するのではなく、調 節された様式で、特定のレベル及び／又は時間で遺伝子産物を供給することがで きることが望ましい幾つかの状況がある。例えば、関心ある遺伝子を、固定した 間隔で（例えば、毎日、隔日、毎週）スイッチ「オン」して、関心ある遺伝子産 物の最も効果的なレベルを最も効果的な時間で与えることができる。患者中で産 生された遺伝子産物のレベルを、標準的方法（例えば、免疫学的アッセイ例えば ＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡを用いる直接的モニタリング又は関心ある遺伝子産物 の機能に依存する実験室パラメーター例えば血中グルコースレベル等による間接 的モニタリング）によってモニターすることができる。別々の時間間隔で患者内 で遺伝子の発現を「オン」させる一方、他の時間においてその遺伝子を「オフ」 に維持することも可能にするこの能力は、断続的間隔で関心ある遺伝子産物を連 続的に投与する必要性を回避する。このアプローチは、痛く且つ／又は副作用を 生じ得るし、継続して医者に通うことが必要となるであろう遺伝子産物の反復的 注射を回避する。対照的に、この発明の系は、これらの欠点を回避する。更に、 別々の時間間隔で患者内で遺伝子の発現を「オン」にする能力は、活性の「再発 」を含む病気（例えば、多くの自己免疫疾患）の、痛み及び症状の明らかな急性 フェーズの間の治療が必要なときだけの集中的治療を可能にする。かかる病気が 鎮静しているときには、この発現系を「オフ」状態に維持することができる。 別々の時間間隔で遺伝子発現を調節するこの能力から特に有益であり得る遺伝 子治療応用は、下記の非制限的例を含む： リウマチ様関節炎 − 炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１及び ＩＬ−１２）の産物を阻止する遺伝子産物をコードする遺伝子を、患者にて発現 させることができる。かかるインヒビターの例には、サイトカインのレセプター の可溶性型が含まれる。更に又は或は、サイトカインＩＬ−１０及び／又はＩＬ −４（防護的Ｔｈ２型応答を刺激する）を発現させることができる。更に、擬似 糖質コルチコイドレセプター（ＧＣＭＲ）を発現することができる。 下垂体低下症 − ヒト成長ホルモンの遺伝子を、かかる患者にて、早い子供 の時期に、遺伝子発現が必要であるならば、正常の伸長が達成されるまで発現さ せ、その時点で遺伝子発現を下方調節することができる。 傷の治癒／組織の再生 − 治癒のプロセスに必要な因子（例えば、成長因子 、血管形成因子等）を、必要なときにだけ発現させ、次いで、下方調節すること ができる。 抗癌治療 − 抗癌治療において有用な遺伝子産物の発現を、腫瘍の成長の遅 延が達成されるまでの治療フェーズに限ることができ、その時点でその遺伝子産 物の発現を下方調節することができる。可能な全身性抗癌治療には、免疫刺激性 分子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１２等）を発現する腫瘍浸潤性リンパ球、血管 形成インヒビター（ＰＦ４、ＩＬ−１２等）、ヘレグリン、ロイコレグリン（Ｐ ＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８５／０４６６２参照）、及び骨髄サポート治療のための成 長因子例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦの利用が含まれる。後者 に関して、骨髄サポート治療用の因子を発現するこの発明の調節系の利用は、化 学療法から骨髄サポート治療への規則的間隔での簡単な治療の切り替えを可能に する（同様に、かかるアプローチは又、ＡＩＤＳ治療にも適用可能である。例え ば、抗ウイルス治療から骨髄サポート治療への簡単な切り替え）。更に、抗癌治 療剤の制御された局所的ターゲティングも可能である。例えば、この発明のレギ ュレーターによる自殺遺伝子の発現（ここに、レギュレーター自身は例えば腫瘍 特異的プロモーター又は放射誘導されたプロモーターにより制御される）。 他の具体例において、この発明の調節系を用いて、腫瘍中から、この発明の系 により調節されたトランスジーンにより血管形成インヒビターを発現させる。こ の様式での血管形成インヒビターの発現は、そのインヒビターの全身投与より効 率がよく、全身投与に伴い得る如何なる有害な副作用をも回避するであろう。特 に、血管形成インヒビターの発現を腫瘍内に限定することは、未だ正常細胞成長 と関連する血管形成を受けている子供における癌治療に特に有用であり得よう。 他の具体例において、高レベルに調節されたサイトカインの発現は、腫瘍細胞 に対する患者自身の免疫応答を集中させる方法を代表する。腫瘍細胞を変換して 、個人における自然の免疫応答の増大において重要な化学誘引性及び成長促進性 サイトカインを発現させることができる。腫瘍の近くではサイトカインが最高濃 度となるので、腫瘍抗原に対する免疫学的応答の誘出の見込が増大する。この型 の治療に伴う潜在的問題は、サイトカインを産生する腫瘍細胞が免疫応答の標的 でもあり、それ故、すべての腫瘍細胞の根絶が確実になり得る前にサイトカイン の源が排除されるであろうということである。これと戦うためには、感染細胞を 免疫系からマスクすることが知られているウイルス蛋白質の発現を、サイトカイ ン遺伝子と共に、同じ細胞内で、調節下に置くことができる。かかる蛋白質の１ つは、アデノウイルス由来のＥ１９蛋白質である（例えば、Cox，Science 247:7 15を参照）。この蛋白質は、クラスＩのＨＬＡ抗原の細胞表面への輸送を阻止し 、それ故、宿主の細胞毒性Ｔ細胞による細胞の認識と溶解を阻止する。従って、 腫瘍細胞中でのＥ１９の調節された発現は、サイトカイン産生細胞を、サイトカ インの発現により刺激された免疫応答の攻撃の間、細胞毒性Ｔ細胞から遮蔽する ことができるであろう。Ｅ１９を発現するもの以外のすべての腫瘍細胞を根絶さ せるのに十分な時間の経過後、Ｅ１９の発現をオフにし、次いで、これらの細胞 を刺激された抗腫瘍免疫応答の餌食にする。 良性前立腺肥大 − 上記と同様に、自殺遺伝子をこの発明のレギュレーター により調節することができ、レギュレーター自身は、例えば、前立腺特異的プロ モーターにより制御される。 この発明の調節系を用いて、制御された様式で、自殺遺伝子（例えば、アポト ーシス遺伝子、ＴＫ遺伝子等）を発現させる能力は、この系の一般的安全性及び 有用性を増す。例えば、所望の治療の終りに、自殺遺伝子の発現は、遺伝子治療 用ベクターを有する細胞例えば生物学的に不活性な移植片、最初に意図した位置 から散り広まった細胞等を排除することができる。更に、もし移植片が腫瘍性に なったり副作用を有する場合には、自殺遺伝子の誘導によって、それらの細胞を 迅速に除去することができる。１つの細胞中での１つより多くのＴｃ制御される 「オン」／「オフ」スイッチの利用は、治療上関心のある遺伝子（本明細書中に 詳述）の調節と完全に独立に自殺遺伝子を調節することを可能にする。 この発明の調節系は、更に、達成され得る遺伝子産物の発現のレベルに何らの 融通性も提供しない制御されない構成的発現と対照的に、患者における遺伝子産 物の治療上適当な発現レベルを確立する能力を提供する。遺伝子産物発現の生理 学的に適当なレベルは、患者の特定の医療上の必要性に基づいて、例えば（上記 の方法を用いて）関連遺伝子産物レベルをモニターする実験室試験に基づいて確 立することができる。既に上述した医療上の例並びに遺伝子産物及びその遺伝子 産物の投与のための遺伝子に加えて、所望の時間に所望のレベルで発現させるこ とのできる他の治療上適当な遺伝子産物には：血友病患者におけるXIII及びIX因 子（例えば、傷害の危険のある時間中例えばスポーツ中に、発現を高めることが できる）；糖尿病患者におけるインシュリン又はアミリン（患者の病気の状態、 食事療法等によって必要ならとき）；赤血球減少症を治療するためのエリスロポ エチン（末期腎不全等で必要なとき）；アテローム性動脈硬化症又は肝臓におけ る遺伝子治療のための低密度リポ蛋白質レセプター（ＬＤＬｒ）又は超低密度リ ポ蛋白質（ＶＬＤＬΓ）（例えば、エキソ・ビボ移植片を使用）が含まれる。中 枢神経系の病気の治療への応用も含まれる。例えば、アルツハイマー病において 、アセチルコリンレベルを回復するコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡ Ｔ）、向神経性因子（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＧＦ等）及び／又は補体インヒビ ター（例えば、ｓＣＲ１、ｓＭＣＰ、ｓＤＡＦ、ｓＣＤ５９等）の「微細に切り 替わる」発現は、達成され得る。かかる遺伝子産物は、例えば、その遺伝子産物 を、この発明の系を用いて調節された様式で発現している移植された細胞により 提供され得る。更に、パーキンソン病を、レボドーパ及びドーパミンレベルを上 昇させるチロシンヒドロキシラーセ（ＴＨ）の「微細に切り替わる」発現により 治療することができる。 上記の蛋白質様遺伝子産物に加えて、機能的ＲＮＡ分子（例えば、アンチセン スＲＮＡ及びリボザイム）である遺伝子産物を、制御された様式で、患者におい て、治療目的で発現させることができる。例えば、遺伝子の変異型と野生型とを 識別するリボザイムをデザインすることができる。従って、「正しい」遺伝子（ 例えば、野生型ｐ５３遺伝子）を、その遺伝子の変異型（例えば、変異した内在 性ｐ５３遺伝子）に特異的に調節されたリボザイムの導入と並行して細胞に導 入して、その内在性遺伝子から発現された欠陥のあるｍＲＮＡを除去するするこ とができる。このアプローチは、この欠陥遺伝子からの遺伝子産物が外因性の野 生型遺伝子の作用を邪魔する状況において特に有利である。 この発明の調節系を用いる患者における遺伝子産物の発現は、テトラサイクリ ン又はそのアナログを用いて調節される。所望の作用部位への薬物の送達（例え ば、発現を制御すべき遺伝子を含む細胞への送達）に適した任意の経路によって 、かかる薬物を投与することができる。関係する特定の細胞型に依存して、投与 の好適経路には、経口投与、静脈投与及び局所投与（全身投与の如何なる可能な 副作用をも回避して、皮下の局所的移植片の細胞例えばケラチノサイトに達する ための経皮的パッチを用いる）が含まれる。 ある種の遺伝子治療状況においては、治療を受ける患者における望ましくない 免疫反応を回避し又は阻止するためのステップを取ることが必要又は望ましいこ とがあり得る。治療用遺伝子産物を発現している細胞に対する反応を回避するた めには、可能ならば、一般に、患者自身の細胞を用いて、治療用遺伝子産物を発 現させる（患者の細胞のイン・ビボでの改変によるか又は患者から細胞を得、そ れらをエキソ・ビボで改変してその患者に戻すことによる）。同種又は異種細胞 を用いて関心ある遺伝子産物を発現させる状況においては、この発明の調節系を 、治療用遺伝子の調節に加えて用いて、細胞の免疫認識に関与する１つ以上の遺 伝子を調節して外来細胞に対する免疫反応を阻止することができる。例えば、Ｔ リンパ球による外来細胞の認識に関係する細胞表面分子を、例えば、その細胞表 面分子をコードするｍＲＮＡを開裂させるリボザイムの外来細胞における調節さ れた発現によって、治療用遺伝子産物の送達に用いる外来細胞の表面にて下方調 節することができる。この様式で下方調節されて望ましくない免疫応答を阻止し 得る特に好適な細胞表面分子には、クラスＩ及び／又はクラスIIの主要組織適合 性複合体（ＭＨＣ）分子、補助刺激用分子（例えば、Ｂ７−１及び／又はＢ７− ２）、ＣＤ４０及び種々の「接着」分子例えばＩＣＡＭ−１又はＩＣＡＭ−２が 含まれる。多数の遺伝子の独立的で統合的でない調節のためのここに記載のアプ ローチを用いて、宿主細胞内での細胞表面分子の発現の下方調節を、治療用遺伝 子の発現の上方調節と統合することができる。従って、治療が完了して、 治療用遺伝子の発現を停止した後に、内在性の細胞表面分子の発現を正常に回復 することができる。 更に、上記のように、抗癌治療に関して、ＭＨＣ抗原の発現を下方調節するウ イルス性蛋白質（例えば、アデノウイルスＥ１９蛋白質）を、宿主細胞において 、この発明の系を望ましくない免疫学的反応を回避する手段として用いて調節す ることができる。 治療用遺伝子産物を送達する外来細胞に対する免疫応答を回避し又は阻止する ことに加えて、ある種の状況においては、患者内で発現されたこの発明の調節系 のある種の成分（例えば、ここに記載のレギュレーター融合蛋白質）に対する免 疫応答を回避し又は阻止することも、これらの融合蛋白質は望ましくない免疫反 応を刺激し得る非哺乳動物ポリペプチドを含んでいるので、必要であり得る。こ れに関して、レギュレーター融合蛋白質を、宿主において免疫応答を刺激する能 力の減じたものをデザインし及び／又は選択することができる。例えば、このレ ギュレーター融合蛋白質において使用するための転写アクチベータードメインは 、最小免疫原性を有するものを選択することができる。これに関して、単純ヘル ペスウイルス蛋白質ＶＰ１６の野生型転写活性化ドメインは、哺乳動物において 免疫応答を刺激し得るので、イン・ビボで用いるための好適な転写活性化ドメイ ンではありえない。或は、転写活性化ドメインを、ここに記載のように、患者に おけるそれらの減じた免疫原性に基づいて用いることができる。例えば、宿主と 同じ種の蛋白質の転写活性化ドメインは、好適である（例えば、ヒトにおける調 節融合蛋白質の利用のためのヒト蛋白質由来の転写活性化ドメイン）。或は、こ の発明の調節融合蛋白質を改変して、患者におけるその免疫原性を、例えば、融 合蛋白質のポリペプチド（例えば、Ｔｅｔリプレッサー部分又は転写モジュレー ター部分例えばＶＰ１６ポリペプチド）の内の１つ以上の優性のＴ細胞エピトー プを同定し且つ改変するによって減じることができる。かかるＴ細胞エピトープ は、標準的方法によって同定することができ、やはり標準的方法によって突然変 異誘発により変えることができる。次いで、未改変の融合蛋白質と比較して患者 における減少した免疫原性を示し、その元の転写調節能力を未だ保持している改 変された形態のレギュレーター融合蛋白質を選択することができる。 上記に加えて、患者における免疫応答を一般的又は特異的に下方調節するため のすべての慣用の方法を、免疫応答の阻止が望ましい状況において、この発明の 調節系の利用と組み合わせることができる。一般的な免疫抑制剤例えばシクロス ポリンＡ及び／又はＦＫ５０６を、患者に投与することができる。或は、一層特 異的な免疫抑制を可能にし得る免疫調節剤を用いることができる。かかる薬剤は 、補助刺激用分子のインヒビター（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白質、可溶性 ＣＤ４、抗ＣＤ４抗体、抗Ｂ７−１及び／又は抗Ｂ７−２抗体又は抗ｇｐ３９抗 体）を含み得る。 最後に、ある種の状況においては、治療用遺伝子を発現する細胞のための送達 用ビヒクルは、移植した細胞の免疫系への露出を最小にするものを選択すること ができる。例えば、細胞を、蛋白質（例えば、関心ある治療用遺伝子産物）の移 植片からの拡散及びその移植片への栄養素及び酸素の拡散を可能にするが、免疫 細胞の浸入を阻止し、それにより、移植された細胞が免疫系にさらされるのを阻 止する細孔を有する生物学的に不活性のカプセル／生体適合性膜に移植すること ができる（隔絶された細胞移植に適用可能）。 Ｂ．イン・ビトロでの蛋白質の生成 関心ある蛋白質の大規模生産を、１）細胞中での発現に適した形態のこの発明 のトランスアクチベーター融合蛋白質及び２）ｔｅｔオペレーター配列に機能的 に結合された関心ある蛋白質をコードする遺伝子を含むように改変したイン・ビ トロで培養した細胞を用いて達成することができる。例えば、哺乳動物、酵母又 はカビ細胞を、ここに記載のように、これらの核酸成分を含むように改変するこ とができる。それらの改変した哺乳動物、酵母又はカビ細胞を、次いで、Ｔｃ又 はそのアナログの存在下で標準的発酵技術によって培養して、遺伝子の発現を誘 導し、関心ある蛋白質を生成することができる。従って、この発明は、関心ある 蛋白質を単離するための製造方法を提供する。この方法においては、この発明の トランスアクチベーター融合蛋白質をコードする核酸及び少なくとも１つのｔｅ ｔオペレーター配列に機能的に結合された関心ある蛋白質をコードする核酸の両 方を導入した宿主細胞（例えば、酵母又はカビ）を、関心ある蛋白質をコー ドするヌクレオチド配列の転写を刺激するテトラサイクリン又はテトラサイクリ ンアナログの存在下で、培養培地中で、生産的規模で生育させ、関心ある蛋白質 を集めた宿主細胞から又は培養培地から単離する。標準的蛋白質精製技術を用い て、関心ある蛋白質を培地から又は集めた細胞から単離することができる。 Ｃ．イン・ビボでの蛋白質の生成 この発明は、動物例えばトランスジェニック家畜における関心ある蛋白質の大 規模生産をも提供する。トランスジェニック技術の進歩は、トランスジェニック 家畜例えばウシ、ヤギ、ブタ及びヒツジを作成することを可能にした（Wall,R.J .等(1992)J.Cell.Biochem.49:113-120;及びClark,A.J.等(1987)Trends in Biote chnology 5:20-24）。従って、この発明の誘導可能な調節系の成分をゲノム中に 有するトランスジェニック家畜を作ることができ、ここに、関心ある蛋白質をコ ードする遺伝子は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合す る。遺伝子発現（従って、蛋白質の産生）を、Ｔｃ（又はそのアナログ）をトラ ンスジェニック動物に投与することにより誘導する。蛋白質生成は、トランスア クチベーター融合蛋白質をコードする核酸を、そのトランスアクチベーターの発 現をある種の細胞に限定する適当な組織特異的な調節要素に結合することによっ て特定の組織を標的とすることができる。例えば、乳腺特異的な調節要素例えば ミルクホエープロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開 第２６４，１６６号）をトランスアクチベータートランスジーンに結合して、そ のトランスアクチベーターの発現を乳腺組織に限定することができる。従って、 Ｔｃ（又はアナログ）の存在時には、関心ある蛋白質が、トランスジェニック動 物の乳腺組織で産生される。この蛋白質は、このトランスジェニック動物の乳中 に分泌されるようにデザインすることができ、所望であれば、次いで、その蛋白 質をその乳から単離することができる。 Ｄ．ヒトの病気のモデル動物 この発明の転写アクチベーター及びインヒビター蛋白質を、単独又は組み合わ せて用いて、動物の特定の遺伝子の発現を剌激し又は阻止して、ヒトの病気の病 態生理を真似し、それにより、ヒトの病気のモデル動物を造ることができる。例 えば、宿主動物において、ある病気に関係があると考えられる関心ある遺伝子を 、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列の転写制御下に置くことができる（例えば 、本明細書に記載のように、相同組換えによって）。かかる動物を、トランスア クチベーター融合蛋白質及び／又はインヒビター融合蛋白質の１つ以上のトラン スジーンを有する第２の動物と交配させて、テトラサイクリン調節される融合蛋 白質遺伝子及びｔｅｔ調節される標的配列の両方を有する子孫を造ることができ る。これらの子孫中の関心ある遺伝子の発現を、テトラサイクリン（又はアナロ グ）を用いて調節することができる。例えば、関心ある遺伝子の発現を、転写イ ンヒビター融合蛋白質を用いて下方調節して、遺伝子発現と病気との関係を調べ ることができる。かかるアプローチは、ここに記載のｔｅｔ調節される系は、関 心ある遺伝子の発現のレベル及びいつ遺伝子発現を下方又は上方調節するかのタ イミングの両方を制御することを可能にするので、病気の動物モデルを造るのに 、相同組換えによる遺伝子「ノックアウト」を超えて有利であり得る。 Ｅ．遺伝子クローニング及び他の利用のための安定な細胞系統の生成 ここに記載の転写インヒビター系を用いて、遺伝子発現を「オフ」に維持し、 それにより、さもなければ生成され得ない安定な細胞系統を作ることができる。 例えば、自身に対して細胞毒性である遺伝子を有する安定な細胞系統は、その毒 性遺伝子の発現の「漏れやすさ」のために、造るのが困難又は不可能であり得る 。この発明の転写インヒビター融合蛋白質を用いてかかる毒性遺伝子の遺伝子発 現を抑制することにより、毒性遺伝子を有する安定な細胞系統を造ることができ る。次いで、かかる安定な細胞系統を用いて、かかる毒性遺伝子をクローン化す ることができる（例えば、Ｔｃ又はアナログを用いる制御された条件下での毒性 遺伝子の発現を誘導する）。この発明の転写インヒビター系を適用することので きる遺伝子の発現、クローニングの一般的方法は、当分野で公知である（例えば 、Edwards,C.P.及びAruffo,A.(1993)Curr.Opin.Biotech.4:558-563を参照）。そ の上、この転写インヒビター系を適用して、他の細胞における遺伝子の基礎発現 を阻止して、安定な細胞系統例えば胎児幹細胞（ＥＳ）における該細胞系統を 造ることができる。ＥＳ幹細胞に導入されたある種の遺伝子の残留の発現は、安 定なトランスフェクトされたクローンの単離をできなくし得る。ここに記載の転 写インヒビター系を用いるかかる遺伝子の転写の阻止は、この問題を克服するの に有用であり得る。利点 この発明のトランスアクチベーター融合蛋白質を利用する誘導可能な調節系は 、当分野の他の誘導可能な調節系の限界の多くを扱って克服する。例えば、この 発明の転写アクチベーター融合蛋白質の非常に高い細胞内濃度は、遺伝子発現の 効率的な調節に必要でない。更に、遺伝子発現は、誘導剤を除去するよりも加え ることにより誘導されるので、この発明の系における誘導の動力学は、誘導剤の 除去速度によって制限されず、それ故、典型的に一層早い。更に、誘導剤は、遺 伝子転写が誘導されるときに存在するだけであり、それにより、遺伝子発現をオ フに維持するための薬剤の連続的存在の必要性が回避される。 真核細胞における転写を阻止するためのこの発明の転写インヒビター融合蛋白 質の利用は、真核細胞における転写を阻止する原核生物のリプレッサー（例えば 、ＴｅｔＲ、ｌａｃＲ）の単独での利用を超える利点をも提供する。この発明の インヒビター融合蛋白質は真核生物の転写サイレンサードメインを含んでいるの で、これらの融合蛋白質は、真核細胞における転写の抑制において一層効率的で あり、従って、潜在的に、効率的な抑制のために一層低い細胞内濃度しか必要と せず、「漏れやすさ」の可能性は一層低い。更に、ｔｅｔＯ配列の内在性遺伝子 の調節領域への挿入により、この発明の転写インヒビター融合蛋白質を用いて、 内在性遺伝子の構成的及び／又は組織特異的発現を下方制御することができる。 更に、ｌａｃ系（例えば、Labow 等(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356; Baim 等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076）の種々のバージョン｛それら は、誘導剤（ＩＰＴＧ）の負の特性により制限され及び／又は遺伝子発現を誘導 するために温度を上げる必要があること（これは、多面発現性効果を誘出し得る ）により制限される｝と対照的に、この発明の系において用いる誘導剤（Ｔｃ 又はそのアナログ）は、多くの有利な特性を有する：１）Ｔｃ及びそのアナログ はＴｅｔＲに対する高いアフィニティー及び真核細胞に対する低い毒性を示し、 従って、細胞成長又は形態に影響しない濃度で遺伝子誘導に用いることができる ；２）ＲｅｔＲ結合を保持するが抗生物質活性の減じたＴｃアナログは、存在し 且つ誘導剤として用いることができ、それにより、Ｔｃの抗生物質特性に由来す る可能な副作用を回避する；３）Ｔｃ及びＴｃアナログの薬物動力学特性は、迅 速且つ効率的な取り込み及び生理学的バリヤー例えば胎盤又は血液−脳関門の透 過を可能にする；及び４）種々の誘導能力を有するＴｃアナログは、遺伝子発現 のレベルの調節を可能にする。 従って、この発明は、細胞毒性及び誘導指数の限度を伴わない遺伝子転写の迅 速な活性化を可能にする誘導可能な調節系を提供する。誘導による遺伝子発現の 増加は、典型的には、１０００〜２０００倍であり、約２０，０００倍の高さま で可能である。或は、低レベルの遺伝子誘導（例えば１０倍）は、どの誘導剤を 用いるかに依存して達成することができる。この系は、広い範囲の応用において 利用することができる。これらの応用には、遺伝子治療、培養細胞又はトランス ジェニック家畜における蛋白質の大規模生産、及び例えば細胞の発生と分化に関 する遺伝子機能の研究が含まれる。更に、この発明の新規な転写ユニットは、こ の発明の調節成分を用いる多数の遺伝子の発現の統合的又は独立的調節を可能に する。 この発明を、更に、下記の実施例により説明するが、これらは制限するものと 解釈すべきではない。この出願中で引用されているすべての参考文献、特許及び 公開された特許出願の内容を、参考として本明細書中に援用する。実施例１ ： 変異したＴｅｔリプレッサーの選択及び テトラサイクリン誘導可能な転写アクチベーターの構築 テトラサイクリンの不在時ではなく存在時に標的ＤＮＡと結合する「リバース 」Ｔｅｔリプレッサーを、本質的にHecht,B.等(1993)J.Bacteriology 175:1206- 1210により記載されたように化学的突然変異誘発及び選択により生成し た。野生型のＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーをコードする一本鎖ＤＮＡ（コ ード鎖及び非コード鎖）を、亜硝酸ナトリウムを用いて化学的に突然変異誘発し た。一本鎖ＤＮＡ（４０μｌトリスＥＤＴＡ緩衝液中の４０μｇ）を、１０μｌ の２．５Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．３）及び５０μｌの０．２５〜２Ｍ 硝 酸ナトリウムと共に４５〜６０分間室温で混合した。突然変異誘発後、逆転写酵 素を用いて又は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用 いる増幅により相補鎖を合成した。この突然変異誘発手順は、ＤＮＡ中に多くの 突然変異を生ずるので、各々約２００塩基対の遺伝子の３つの断片を、別々に、 組換え発現ベクター中のｗｔＴｅｔリプレッサー遺伝子中にサブクローン化して 、野生型遺伝子の対応する部分を置き換えた。これは、変異したＴｅｔリプレッ サー遺伝子のプールを造った（ここに、各遺伝子は、殆ど、この遺伝子の２００ 塩基対の変異断片中に単一の突然変異を有した）。 この変異したＴｅｔリプレッサーのプールを、Ｔｅｔリプレッサーと大腸菌Ｗ Ｈ２０７（λＷＨ２５）株（この株の構築は、Wissmann,A．等(1991)Genetics 1 28 :225-232 に詳細に記載されている）を用いる同種のオペレーターとの間の機 能的相互作用について正に選択する遺伝学的アッセイにてスクリーニングした。 この大腸菌株において、ｔｅｔオペレーターは、発散的に配置されたβ−ガラク トシド（ｌａｃＺ）及びＬａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）遺伝子の発現を指示し 且つｌａｃ調節領域は、ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）遺伝子の発現を指示する 。Ｔｅｔリプレッサーのｔｅｔオペレーターへの結合は、ｌａｃＩ及びｌａｃＺ 遺伝子の転写をオフにする。Ｌａｃリプレッサーの不在は、ｇａｌＫ遺伝子の発 現を可能にし、それは、この大腸菌株がガラクトースを唯一の炭素源として利用 することを可能にし、それは１つのマーカーとして働く。ｌａｃＺ-の表現型は 、第２のマーカーとして働く。従って、ｔｅｔオペレーターに結合するＴｅｔリ プレッサーを含む細菌は、Ｇａｌ+、ｌａｃＺ-の表現型を有する。野生型Ｔｅｔ リプレッサーを含む細菌は、テトラサイクリンの不在時にＧａｌ+，ｌａｃＺ-の 表現型を有する。変異した「リバース」Ｔｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）を、 テトラサイクリンの存在下でのＧａｌ+、ｌａｃＺ-の表現型に基づいて選択した 。 ｒＴｅｔＲ変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO: １（ヌクレオチド１〜６２１位）及び２（アミノ酸１〜２０７位）に示す。この ｒＴｅｔＲ変異体の配列分析は、下記のアミノ酸及びヌクレオチドの変化を示し た： ２つの更なる突然変異は、アミノ酸の交換を生じなかった： ｒＴｅｔＲ変異体を転写アクチベーターに変換するためには、ｒＴｅｔＲのア ミノ酸３〜１３５をコードする３９９塩基対のＸｂａＩ／Ｅｃｏ４７III断片（ 即ち、変異した領域を包含する）を発現ベクターｐＵＨＤ１５−１の対応する制 限断片と交換してｐＵＨＤ１７−１を造った。ｐＵＨＤ１５−１において、野生 型ＴｅｔＲをコードするヌクレオチド配列を、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６の Ｃ末端の１３０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列にイン・フレームで結合 する。これらのトランスアクチベーター配列は、上流側で、ＣＭＶプロモーター ／エンハンサーと隣接し、下流側で、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位と隣接する（ｐＵ ＨＤ１５−１の構築は、米国特許出願第０８／０７６，７２６号及びGossen,M． 及びBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に一層詳細に記載さ れている）。従って、ｐＵＨＤ１７−１において、リバースＴｅｔＲ 変異体をコードするヌクレオチド配列を、イン・フレームで、ＶＰ１６配列に結 合して、リバースＴｃ制御されるトランスアクチベーター（ここでは、ｔＴＡR と呼ぶ）を造る。このｒＴｅｔＲの変異した領域の、ＴｅｔＲの野生型領域との 類似の交換を、プラスミッドｐＵＨＤ１５２−１を用いて実施したが、それは、 Ｔｅｔリプレッサーをコードするヌクレオチド配列の５’末端にイン・フレーム で結合された核局在化シグナルをコードするヌクレオチド配列を更に含むことを 除いては、ｐＵＨＤ１５−１と同じである。核局在化シグナルのアミノ酸配列は ＭＰＫＲＰＲＰ（SEQ ID NO:５）であり、それは、ＴｅｔＲの第２位アミノ酸セ リンに結合する。その結果生成した、核局在化シグナルを含むリバースＴｃ制御 されるトランスアクチベーター（ここでは、ｎｔＴＡRと呼ぶ）をコードする発 現ベクターをｐＵＨＤ１７２−１と命名した。実施例２ ： ｔＴＡRにより転写のテトラサイクリン誘導される転写一時的トランスフェクション これらのｐＵＨＤ１７−１及びｐＵＨＤ１７２−１発現ベクターを、最小ｈＣ ＭＶプロモーター及びルシフェラーゼ遺伝子の上流に８量体のｔｅｔオペレータ ーを融合したレポータープラスミッドｐＵＨＣ１３−３と共に、標準的リン酸カ ルシウム法により一時的にＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした（このレポー タープラスミッドは、米国特許出願第０８／０７６，７２６号及びGossen,M.及 びBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に詳細に記載されてい る）。これらのトランスフェクトされた細胞のテトラサイクリン（又はそのアナ ログ）の存在時又は不在時における３７℃で２０時間に及ぶインキュベーション の後に、ルシフェラーゼ活性を次のように測定した：イーグル最小必須培地にて 、３５ｍｍ皿中で約８０％集密に成長した細胞を２ｍｌのリン酸緩衝塩溶液で洗 ってから、それらを、２５ｍＭ トリスホスフェート（ｐＨ７．８）／２ｍＭ ジチオスレイトール／２ｍＭ ジアミノシクロヘキサン四酢酸／１０％グリセロ ール／１％トリトンＸ−１００にて、室温で１０分間、溶解させた。この溶解物 を、培養皿からかき取ってエッペンドルフ遠心機にて１０秒間遠心分離 した。次に、上清のアリコート（１０μｌ）を、２５０μｌの２５ｍＭ グリシ ルグリシン／１５ｍＭ ＭｇＳＯ4／５ｍＭ ＡＴＰと混合して、ルシフェラー ゼ活性を、ＬｕｍａｔＬＢ９５０１（Berthold，Wildbad,F.R.G.）を積分モード （１０秒）で用いてアッセイした。Ｄ−ルシフェリン（Ｌ６８８２、Sigma）を ０．５ｍＭで用いた。ルシフェラーゼ遺伝子を含まないＨｅＬａ細胞の抽出物に て測定したバックグラウンドシグナルは、機器のバックグラウンド（８０〜１２ ０相対的光単位（ｒｌｕ）／１０秒）と区別できなかった。この溶解物の蛋白質 含量を、Bradford（Bradford,M.M.(1976)Anal.Biochem.72:248-254）に従って測 定した。ｔＴＡR又はｎｔＴＡRの何れかをコードするプラスミッドでトランスフ ェクトした細胞は、テトラサイクリンの存在下で増大したレベルのルシフェラー ゼ活性を示した。この効果は、アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）をテトラ サイクリンの代わりに用いたときに、一貫して明白であった。安定なトランスフェクション この一時的トランスフェクション分析の後に、細胞の安定なトランスフェクシ ョンのための発現ベクターを調製した。ｐＳＶ２ｎｅｏ由来のネオマイシン耐性 カセット（Southern,P.J．及びBerg.P.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:327-341 に記 載）を、トランスアクチベーター発現ベクターｐＵＨＤ１７−１及びｐＵＨＤ１ ７２−１にインテグレートして、それぞれ、ｐＵＨＤ１７−１ｎｅｏ及びｐＵＨ Ｄ１７２−１ｎｅｏを生成した。ｎｔＴＡRをコードしているｐＵＨＤ１７２− １ｎｅｏは、標準的技術によって、ＨｅＬａ細胞中に安定にインテグレートされ た。１０個のＧ４１８耐性細胞のコロニーを、最小ＣＭＶプロモーター及びｔｅ ｔオペレーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＵＨＤ１３−３での 一時的スーパートランスフェクションにより、それらの表現型について分析した 。３つのクローンＨＲ４、ＨＲ５及びＨＲ１０が、ＡＴｃの存在時に、ルシフェ ラーゼ活性の強い増加を示した。これらのクローンの内から、ＨＲ５を、更なる 実験用に選択した。 ｎｔＴＡR及びｔｅｔオペレーター結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝 子の両方についての安定なトランスフェクタントを造るために、ＨＲ５細胞を、 ｐＵＨ１３−３及びハイグロマイシン耐性をコードするｐＨＭＲ２７２（Bernha rd,H-U．等(1985)Exp.Cell Res.158:237-243参照）で同時トランスフェクトし、 ハイグロマイシン耐性クローンを選択した。類似の実験において、ＨＲ５細胞を 、ｐＵＨ１３−７及びｐＨＭＲ２７２で同時トランスフェクトした。ｐＵＨ１３ −７は、最小ＣＭＶプロモーターではなくて８量体のｔｅｔＯ配列と隣接したＨ ＳＶｔｋプロモーターの＋１９〜−３７位に及ぶ最小プロモーター配列を含む。 ２１個のハイグロマイシン耐性クローンの内の１０個が、Ｔｃ又はドキシサイク リン（Ｄｃ）の培養培地への添加に際して、誘導可能なルシフェラーゼ活性を示 した。最小ＣＭＶプロモーターに結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を 含むクローンは、ＨＲ５−Ｃと呼び、最小ｔｋプロモーターに結合されたルシフ ェラーゼレポーター遺伝子を含むものはＨＲ５−Ｔと呼ぶ。 ｎｔＴＡR依存性レポーターユニットで安定にトランスフェクトされ且つ以前 にテトラサイクリンに応答することが示されたＨＲ５クローン６個を、１μｇ／ ｍｌのドキシサイクリンの不在又は存在下で、並行して、生育させた。約３×１ ０4細胞を、各３５ｍｍ皿（各クローンにつき４皿）中にプレートした。６０時 間生育させた後に、細胞を集め、その抽出物のルシフェラーゼ活性を（抽出蛋白 質１μｇ当りの相対的光単位（ｒｌｕ）にて）測定した。表１に示したように、 ６個のクローンの絶対発現レベルは、等級の３オーダーを超えるルシフェラーゼ 遺伝子発現の活性化を、ｎｔＴＡR調節系を含む二重の安定な細胞系統の幾つか において達成していることを示している。 一層高い誘導率（例えば、発現の２０，０００倍増）でさえ、もし誘導剤を単 に培養培地に加えるのではなく、誘導前にそれらの細胞を洗ってから、誘導剤を 含む新鮮な培養培地に再プレートするならば、達成し得るであろうということに 注意すべきである。 種々のテトラサイクリンによるルシフェラーゼ活性の誘導 テトラサイクリン及び幾つかの異なるテトラサイクリンアナログの、ＨＲ５− Ｃ１１細胞においてルシフェラーゼ活性を誘導する能力を試験した。ＨＲ５−Ｃ １１細胞を約３×１０4細胞／３５ｍｍ皿（約８０％集密度）でプレートした。 細胞の完全な接着の後に、次のテトラサイクリン類を、１μｇ／ｍｌの濃度で、 培地に加えた：テトラサイクリン−ＨＣｌ（Ｔｃ）、オキシテトラサイクリン− ＨＣｌ（ＯＴｃ）、クロロテトラサイクリン（ＣＴｃ）、アンヒドロテトラサイ クリン−ＨＣｌ（ＡＴｃ）及びドキシサイクリン（Ｄｏｘｙ）。これらの化合物 は、ミズーリ、St.Louis在、Sigma Chemical Co.から市販されているものであり、１ μｇ／ｍｌの濃度の水溶液にて維持した。抗生物質の不在（−）にて生育させた 細胞は、対照として働いた。３日後、細胞を集め、その抽出物のルシフェラーゼ 活性及び蛋白質含量を測定した。その結果を、図１に棒グラフで示す。この図中 の各棒（箱型及び平行線をひいたもの）は、単一の培養皿の相対的ルシフェラー ゼ活性（抽出した蛋白質の量に対して標準化したもの）を表している。テトラサ イクリンなしで生育させた２つのプレートから得たルシフェラーゼ活性の平均を １として定義した。Ｔｃ、ＣＴｃ及びＯＴｃは、ルシフェラーゼ活性の控え目な 刺激を示した。対照的に、ＡＴｃとＤｏｘｙは、ルシフェラーゼ活性を、それぞ れ、約１０００及び１５００倍刺激した。ＨＲ５−Ｃ１１細胞におけるドキシサイクリンに対するルシフェラーゼ活性の用 量−応答 種々のテトラサイクリンの誘導能力を試験する上記の実験は、ドキシサイクリ ンが調べたテトラサイクリン類の最も強力なエフェクターであることを示した。 それ故、ドキシサイクリンを、用量−応答を定量的に分析するために選択した。 ＨＲ５−Ｃ１１細胞を、種々の濃度のドキシサイクリンとインキュベートして、 ルシフェラーゼ活性を測定した。３つの独立の実験のデータを、図２に示す。培 養培地中で１０ｎｇ／ｍｌより低濃度では、ドキシサイクリンは、ルシフェラー ゼ活性の誘導において効果がない。しかしながら、その濃度が１０ｎｇ／ｍｌよ り高くなると、ルシフェラーゼの発現において殆ど直線的増加が認められる。最 大の活性化は、１μｇ／ｍｌにて達成された。３μｇ／ｍｌより高濃度では、ド キシサイクリンは、ＭＴＴアッセイで測定して、ＨｅＬａ細胞に対する僅かな成 長阻害効果を示した。ｎｔＴＡR系の誘導の動力学 ドキシサイクリン誘導のｎｔＴＡR媒介の遺伝子発現の誘導の動力学を調べる ために、ＨＲ５−Ｃ１１細胞におけるルシフェラーゼ活性の誘導のタイムコース を、培地へのドキシサイクリンの添加（終濃度１μｇ／ｍｌ）の後にモニターし た。細胞を、ドキシサイクリンの存在下で培養し、様々な時間間隔の後に、それ らの細胞を集めて、上記のようにルシフェラーゼ活性を測定した。図３に示すよ うに、Ｄｏｘｙとの５．５時間のインキュベーションの後に、ルシフェラーゼ活 性の１００倍の誘導が認められた。完全に誘導したレベルは、Ｄｏｘｙとの２４ 時間未満のインキュベーションにて達成された。従って、これらの結果は、遺伝 子発現の誘導は、細胞を誘導剤にさらした後に、迅速に生じるということを示す 。実施例３： Ｔｃ制御される転写アクチベーターによる２つのヌクレオチド配列 の発現の統合的調節 ２つのヌクレオチド配列の統合的、二方向性転写のための組換え発現ベクター を構築した（それは、次のものを５’から３’の方向で含む：ルシフェラーゼ遺 伝子、第１の最小プロモーター、７つのｔｅｔオペレーター配列、第２の最小プ ロモーター及びＬａｃＺ遺伝子）。この構築物を、図６に図解する。この構築物 においては、ルシフェラーゼ及びＬａｃＺ遺伝子は、それらがｔｅｔオペレータ ー配列に関して反対方向に転写されるように向けられている（即ち、このルシフ ェラーゼ遺伝子は、５’から３’の向きで、ＤＮＡの下側の鎖から転写され、Ｌ ａｃＺ遺伝子は、５’から３’の向きで、ＤＮＡの上側の鎖から転写される）。 このルシフェラーゼ遺伝子の後ろには、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続き 、ＬａｃＺ遺伝子の後ろには、β−グロビンポリアデニル化シグナルが続く。 この構築物を、野生型Ｔｅｔリプレッサー−ＶＰ１６融合蛋白質を発現するＨ ｅＬａ細胞株ＨｔＴＡ−１細胞中にトランスフェクトした（ｔＴＡと呼ぶ。Goss en,M．及びBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に記載されて いる）。このｔＴＡ融合蛋白質は、Ｔｃ（又はアナログ）の不在時にｔｅｔオペ レーター配列に結合するが、Ｔｃ（又はアナログ）の存在時には結合しない。こ の構築物を、ハイグロマイシン耐性を与えるプラスミッドと共に、ＨｔＴＡ−１ 細胞に同時トランスフェクトし、安定にトランスフェクトされたク ローンをそれらのハイグロマイシン耐性の表現型に基づいて選択した。選択した ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒｒ）クローンを、ルシフェラーゼ及びβ−ガラ クトシダーゼ活性について試験した。３つのすべてのマーカー（Ｈｙｇｒｒ、ｌ ｕｃ+、β−ｇａｌ+）が陽性のクローンを、次いで、ルシフェラーゼ及びβ−ガ ラクトシダーゼ活性のテトラサイクリン依存性の同時調節について、それらのク ローンをテトラサイクリン量を増しながら培養してルシフェラーゼ及びβ−ガラ クトシダーゼ活性を測定することによって試験した。クローンＨｔ１３１６−８ ／５０を用いてのかかる実験の結果を、図８に示す。テトラサイクリンの不在時 には（この場合は、ｔＴＡはｔｅｔオペレーターに結合して遺伝子発現を活性化 することができる）、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され る。増大する量のテトラサイクリンの存在下で、ルシフェラーゼ及びβ−ガラク トシダーゼ活性は、統合的且つ同等に下方調節される。このデータは、２つの遺 伝子の発現は、テトラサイクリン制御されるトランスアクチベーターにより、２ つの遺伝子を同じｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合することにより、統合 的に調節され得ることを示している。実施例４ ： ＴｅｔＲ及びＫｒｕｅｐｐｅｌサイレンサードメインを含む テトラサイクリン調節される転写インヒビター融合蛋白質の構築 この発明のテトラサイクリン調節される転写インヒビター（テトラサイクリン 制御されるサイレンサードメイン又はｔＳＤとも呼ぶ）をコードする発現ベクタ ーを構築するために、転写サイレンサードメインをコードする核酸断片を、野生 型又は改変（即ち、変異）ＴｅｔＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベ クター中に、そのサイレンサードメインをコードする配列がＴｅｔＲコード配列 とイン・フレームでライゲートされるようにライゲートする。プラスミッドｐＵ ＨＤ１４１ｓｍａ−１は、野生型Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーをコードす るヌクレオチド配列を含む（このヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ、 SEQ ID NO:１６及び１７に示す）。ｐＵＨＤ１４１ｓｍａ−１において、Ｔｅｔ Ｒコード配列は、その５’末端においてＣＭＶプロモーターと、その直ぐ３’側 で、更なる核酸断片を導入することのできるポリリンカーを造るヌクレオチド配 列に結合される。このポリリンカー領域のヌクレオチド配列は：TCC CCG GGT AA C TAA GTA AGG ATC C（SEQ ID NO:２４）（ここに、TCC CCG GGT ACCは、Ｔｅｔ の２０５〜２０８アミノ酸残基即ちＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎをコードす る）である。このポリリンカー領域は、ＰｓｐＡＩ（CCC GGG）及びＢａｍＨＩ （GGA TCC）用の制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。ポリリンカー領域 の下流において、このプラスミッドは、ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナル を含む。ｐＵＨＤ１４１ｓｍａ−１ベクターを、図１１に図式的に図解する。 ＴｅｔＲとDrosophila Krueppel（Ｋｒ）蛋白質由来の転写サイレンサードメ インとの間の融合蛋白質をコードする発現ベクターを構築するには、Ｋｒ由来の サイレンサードメインをコードする核酸断片を、ＫｒのｃＤＮＡをテンプレート として用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。ＫｒのＣ末端の ６４アミノ酸をコードする核酸断片を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを デザインする（Ｃ６４ＫＲと呼ぶ）。この領域は、天然の蛋白質の４０３〜４６ ６位のアミノ酸に対応する。Ｃ６４ＫＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列を、そ れぞれ、SEQ ID NO:２０及びSEQ ID NO:２１に示す。ＰＣＲプライマー を、増幅された断片がその５’及び３’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を含 むように制限エンドヌクレアーゼ部位を含むようにデザインする。増幅された断 片のポリリンカー中へのイン・フレームの直接的ライゲーションを与えるｐＵＨ Ｄ１４１ｓｍａ−１のポリリンカー内に含まれる制限エンドヌクレアーゼ部位を 選択する。例えば、ＰｓｐＡＩ部位（CCC GGG）をＣ６４ＫＲをコードする断片 の５’末端に組み込み且つＢａｍＨＩ部位をその断片の３’末端に組み込むＰＣ Ｒプライマーをデザインする。標準的ＰＣＲ反応の後に、増幅した断片及びｐＵ ＨＤ１４１−ｓｍａ１を、ＰｓｐＡＩ及びＢａｍＨＩで消化する。この増幅した 断片を、次いで、標準的ライゲーション条件を用いて、ｐＵＨＤ１４１−ｓｍａ １のポリリンカー部位に直接ライゲートして発現ベクタ−ｐＵＨＤ１４１ｋｒ− １を造る。標準的技術を用いて、所望のプラスミッドを単離してその構築を確認 する。ｐＵＨＤ１４１ｋｒ−１の構築を、図１１に、図式的に解説する。 この生成したｐＵＨＤ１４１ｋｒ−１発現ベクターは、Ｋｒのアミノ酸の（Ｃ ６４ＫＲ）４０３〜４６６位にイン・フレームで結合された野生型ＴｅｔＲのア ミノ酸１〜２０７位を含む融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。こ の融合蛋白質の接合点を横切るヌクレオチド及びアミノ酸配列は：AGT GGG TCC CCG GGT GAC ATG GAA（SEQ ID NO:２５）及びＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（SEQ ID NO:２６）である。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ −Ｓｅｒは、ＴｅｔＲのアミノ酸２０５〜２０７に対応し、Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、 ポリリンカーによりコードされ、そしてＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕは、Ｃ６４ＫＲ のアミノ酸４０３〜４０５に対応する。 同様に、変異したＴｅｔＲ（Ｔｃの存在時にのみｔｅｔＯに結合する）とＣ６ ４ＫＲとの融合蛋白質をコードする発現ベクターを、変異したＴｅｔＲをコード するヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、それぞれ、 SEQ ID N0:１８及び１９に示す）をｐＵＨＤ１４１−ｓｍａ１中の野生型Ｔｅｔ Ｒ配列の代わりに用いて、上記のように構築することができる。 ＴｅｔＲ−Ｋｒ融合蛋白質をコードする発現ベクター（例えば、ｐＵＨＤ１４ １ｋｒ−１）を、実施例２に記載の宿主細胞に一時的に又は安定にトランス フェクトして、その宿主細胞においてＴｅｔＲ−Ｋｒ融合蛋白質を発現させる。 １つ以上のｔｅｔＯ配列、最小プロモーター及びレポーター遺伝子例えばルシフ ェラーゼを含むレポーター遺伝子構築物も又、実施例２に記載の細胞にトランス フェクトする。（レポーター遺伝子構築物は、米国特許出願第０８／０７６，７ ２６号及びGossen,M．及びBujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-55 51）。Ｔｃ又はアナログ例えばドキシサイクリンの増加する濃度の存在時又は不 在時におけるルシフェラーゼ活性を、実施例２に記載のように測定する。上記の 野生型ＴｅｔＲ−Ｋｒ融合蛋白質について、この融合蛋白質の転写阻止活性を、 ドキシサイクリンの存在時（抑制なし）におけるルシフェラーゼ活性の量をドキ シサイクリンの不在時（抑制あり）のルシフェラーゼ活性の量と比較することに より測定する。この融合蛋白質の転写阻止活性は又、更なる正の調節要素（例え ば、エンハンサー配列）を含むレポーター遺伝子構築物を用いることにより発現 の一層高い基礎レベル（即ち、ドキシサイクリンの存在時における一層高レベル の発現）を示すレポーター遺伝子構築物を用いて試験することもできる。実施例５ ： ＴｅｔＲ及びｖ−ｅｒｂＡサイレンサードメインを含む テトラサイクリン調節される転写インヒビター融合蛋白質の構築 ＴｅｔＲとｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物由来の転写サイレンサードメインと の間の融合蛋白質をコードする発現ベクターを構築するために、ｖ−ｅｒｂＡ由 来のサイレンサードメインをコードする核酸断片を、実施例４に記載のように、 イン・フレームで、ｐＵＨＤ１４１ｓｍａ−１中にライゲートする。ｐＵＨＤ１ ４１ｓｍａ−１中へのライゲーションに適したｖ−ｅｒｂＡサイレンサードメイ ンをコードする核酸断片を、ｖ−ｅｒｂＡのｃＤＮＡをテンプレートとして用い るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。天然のｖ−ｅｒｂＡ蛋白質 のアミノ酸３６４〜６３５をコードする核酸断片を増幅するオリゴヌクレオチド プライマーをデザインする。ｖ−ｅｒｂＡのこの領域のヌクレオチド及びアミノ 酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:２２及びSEQ ID NO:２３に示す。実施例４に記 載したように、ＰＣＲプライマーを、増幅されたｖ−ｅｒｂＡ断片が５’及び ３’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を含む（例えば、５’末端にＰｓｐＡＩ 及び３’末端にＢａｍＨＩ）ようにデザインする。標準的ＰＣＲ反応の後に、増 幅した断片及びｐＵＨＤ１４１−ｓｍａ１を、ＰｓｐＡＩ及びＢａｍＨＩで消化 する。この増幅した断片を、次いで、標準的ライゲーション条件を用いて、ｐＵ ＨＤ１４１−ｓｍａ１のポリリンカー部位に直接ライゲートして、発現ベクター ｐＵＨＤ１４１ｋｒ−１を造る。標準的技術を用いて、所望のプラスミッドを単 離してその構築を確認することができる。ｐＵＨＤ１４１ｅｒｂ−１の構築を、 図１１に、図式的に図解する。 その結果生成したｐＵＨＤ１４１ｅｒｂ−１発現ベクターは、ｖ−ｅｒｂＡの アミノ酸３６４〜６３５にイン・フレームで結合された野生型ＴｅｔＲを含む融 合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。この融合蛋白質の接合点を横切 るヌクレオチド及びアミノ酸配列は：AGT GGG TCC CCG GGT CTG GAC GAC（SEQID NO:２７）及びＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａ ｓｐ（SEQ ID NO:２８）である。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、ＴｅｔＲのアミノ 酸２０５〜２０７、Ｐｒｏ−Ｇｌｙは、ポリリンカーによりコードされ、そして Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐは、ｖ−ｅｒｂＡサイレントドメインのアミノ酸３６４ 〜３６６に対応する。 実施例４に記載のように、変異したＴｅｔＲ（Ｔｃの存在時にのみｔｅｔＯに 結合する）及びｖ−ｅｒｂＡサイレンサードメインの融合蛋白質をコードする発 現ベクターを、ｐＵＨＤ１４１−ｓｍａ１中の野生型ＴｅｔＲ配列の代わりに変 異したＴｅｔＲをコードするヌクレオチド配列（このヌクレオチド及びアミノ酸 配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１８及び１９に示す）を用いて、上記のように構 築することができる。 ＴｅｔＲ−ｖ−ｅｒｂＡ融合蛋白質の宿主細胞における発現及びその融合蛋白 質の転写阻止活性のアッセイは、ＴｅｔＲ−Ｋｒ融合蛋白質について実施例４に 記載した通りである。実施例６ ： ｔＴＡRによるトランスジェニック動物中での遺伝子発現の調節 イン・ビボで遺伝子発現を調節するｔＴＡRの能力を試験するため、ｔＴＡR 発現構築物又は機能的にｔｅｔオペレーターに結合されたレポーター遺伝子の異 種染色体挿入を含むマウスのトランスジェニック系統を構築した。ｔＴＡR発現 構築物又はｔｅｔＯ結合されたレポーター遺伝子を含む単ートランスジェニック 系統を、次いで、交雑させて、二重トランスジェニック子孫を同定した。この二 重トランスジェニック動物を、次いで、レポーター遺伝子の発現をテトラサイク リン依存様式で調節するｔＴＡRの能力について特性決定した。この例は、ｔＴ ＡRが、動物の組織において、ｔｅｔオペレーターに機能的に結合された遺伝子 の発現を、その動物へのテトラサイクリン（又はアナログ）の投与に際して、イ ン・ビボで、効果的に刺激するが、テトラサイクリン又はアナログの不在時には 、ｔｅｔＯ結合された遺伝子の発現は、バックグラウンドレベルのままであるこ とを示す。これらの結果は、ここに記載のテトラサイクリン制御される転写調節 系が、イン・ビトロの細胞株に加えて、動物において効果的に機能することを示 す。ＰhCMV−ｔＴＡR発現ユニットについてのトランスジェニックマウスの生成 ｔＴＡ蛋白質を発現するマウスを、プラスミッドｐＵＨＧ１７−１から切り出 した２．７ｋｂのＸｈｏＩ−ＰｆｍＩ断片の受精卵母細胞への前核注入により得 た。このＤＮＡ断片は、ｔＴＡR遺伝子（SEQ ID NO:１）を、ヒトＣＭＶ ＩＥ プロモーター（＋７５〜−６７５位）及びイントロンを含むウサギβ−グロビン ポリアデニル化部位の転写制御下で含んだ。このヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター は、ｔＴＡRをコードするＤＮＡ配列の染色体インテグレーションが起きたすべ ての細胞における変異したｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合蛋白質の発現を与える構成的 プロモーターである。ＤＮＡを、標準的技術により、約５ｎｇ／μｌの濃度で、 受精卵母細胞に注入した。これらの注入した受精卵母細胞から、標準的手順に従 って、トランスジェニックマウスを生成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） 及びサザーンハイブリダイゼーションを用いてトランスジェニック創出マウスを 分析して、これらのマウスの染色体ＤＮＡ中のｔＴＡRトランスジーンの存在を 検出した。２つのトランスジェニックマウス系統ＣＲ３及びＣＲ４を同定し、ｔ ｅｔＯ配列の制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する別のトランス ジェニックマウス系統と交雑させた（以下で詳述）。ＰhCMV*-1ルシフェラーゼレポーターユニットについてのトランスジェニックマ ウスの生成 ＰhCMV*-1ｌｕｃレポーター遺伝子発現ユニットを有するマウスを、プラスミ ッドｐＵＨＣ１３−３から切り出した３．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＥａｅＩ断片の受 精卵母細胞への前核注入により生成した。このＤＮＡ断片は、テトラサイクリン 応答性ＰhCMV*-1プロモーター（SEQ ID NO:８）及びイントロンを含むＳＶ４０ ｔ初期ポリアデニル化部位の転写制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含む。約５ｎ ｇ／μｌの濃度でＤＮＡを卵母細胞に注入し、標準的手順に従って、トランスジ ェニックマウスを生成した。サザーンハイブリダイゼーションを用いて、トラン スジェニック創出マウスを分析して、これらのマウスの染色体ＤＮＡ中にＰhCMV *-1ｌｕｃトランスジーンの存在を検出した。ｔｅｔＯ結合されたルシフェラー ゼレポーター遺伝子Ｌ７についてのトランスジェニックマウス系統を、ｔＴＡR トランスジェニック系統ＣＲ３及びＣＲ４と交雑させた（以下で、詳述）。ＰhCMV*-1ｌｕｃ及びＰhCMVｔＴＡRについてのトランスジェニックマウスの生成 ｔＴＡRを発現するか又はＰhCMV*-1ｌｕｃを有する単一トランスジェニックマ ウスを構築したので、ｔＴＡ発現ベクター及びルシフェラーゼレポーターユニッ トの両方を有する二重トランスジェニックマウスを、これら２つのトランスジー ンの一方についてのヘテロ接合トランスジェニックマウスの交雑により得た。標 準的スクリーニング（例えば、ＰＣＲ及び／又はサザーンハイブリダイゼーショ ン）により二重トランスジェニック動物を同定し、それらのマウスの染色体ＤＮ Ａ中にｔＴＡRトランスジーン及びＰhCMV*-1ｌｕｃトランスジーンの存在を検出 した。マウス由来の組織試料におけるルシフェラーゼ活性の誘導及び分析 経口投与のために、テトラサイクリン又はその誘導体ドキシサイクリンを、こ れらの抗生物質の苦味を隠すための５％シュークロースを加えた２００μｇ／ｍ ｌの濃度の飲料水にて与えた。泌乳マウスについては、乳を介して幼若動物に十 分取り込まれることを確実にするために、濃度を、１０％シュークロースを加え た２ｍｇ／ｍｌとした。 ルシフェラーゼ活性を分析するために、マウスを頚椎脱臼により殺し、組織試 料を、５００μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭトリスホスフェート（ｐＨ７．８）／ ２ｍＭ ＤＴＴ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％グリセロール／１％トリトンＸ１０ ０）を含む２ｍｌチューブにて、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘを用いてホモジェナ イズした。このホモジェネートを液体窒素にて凍結させ、解凍後に、５分間１５ ，０００ｇにて遠心分離した。その上清２〜２０μｌを、２５０μｌのルシフェ ラーゼアッセイ用緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７．５）／１５ｍＭ ＭｇＳＯ4／５ｍＭ ＡＴＰ）と混合し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬｕｍａｔＬＢ ９５０１を用いて、１００μｌの１２５μＭルシフェリン溶液を注入した後にル シフェラーゼ活性を１０秒間測定した。このホモジェネートの蛋白質含量をＢｅ ｒｔｈｏｌｄアッセイを用いて測定し、ルシフェラーゼ活性を、蛋白質総量（μ ｇ）当りの相対的光単位（ｒｌｕ）として計算した。結果 ＰhCMV−ｔＴＡRトランスジーンを有する２系統（ＣＲ３及びＣＲ４）からの マウスを、ＰhCMV*-1ｌｕｃについてのトランスジェニック系統Ｌ７からのマウ スと交配させた。Ｌ７系統は、種々の器官において、非常に低いが検出可能なル シフェラーゼ活性のバックグラウンドを示し、これは、おそらく、インテグレー ション部位の位置効果によるものである。このＬ７単一トランスジェニックマウ スの種々の組織におけるバックグラウンドのルシフェラーゼ活性を、図１２にグ ラフ表示し、試験した各組織について、右側のチェックのカラムにより示した（ 各カラムは、一匹の動物からの結果を示している）。テトラサイクリンアナログ のドキシサイクリンの不在時（即ち、非誘導状態）におけるＣ３／Ｌ７二重トラ ンスジェニックマウスの種々の組織におけるルシフェラーゼ活性を、図１２に グラフ表示し、試験した各組織について、中央の暗いカラムにより示した。ドキ シサイクリンの存在時（即ち、誘導状態）におけるＣ３／Ｌ７二重トランスジェ ニックマウスの種々の組織におけるルシフェラーゼ活性を、図１２にグラフ表示 し、試験した各組織について、左側の明るいカラムにより示した。 ルシフェラーゼ活性は、試験した二重トランスジェニックマウスの７つの組織 （膵臓、腎臓、胃、筋肉、胸腺、心臓及び舌）において検出可能であった。これ らの二重トランスジェニックマウスにおける活性化された（即ち、ドキシサイク リンの存在時の）ルシフェラーゼレベルの組織パターンは、文献に報告されたｈ ＣＭＶ ＩＥプロモーターの発現パターンと類似していた。これは、ｔＴＡRに より調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現と一致する（それは、マ ウスにおいて、ｈＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下で発現される）。レポータ ー遺伝子の誘導のレベルは、試験した異なる組織間で変化した。最大で１００， ０００倍の調節率（即ち、等級の５オーダー）が、例えば膵臓において達成され た。同等物 当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認 識し又は、常例的実験を用いて確認することができよう。かかる同等物は、後述 の請求の範囲に包含されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／３８３，７５４ (32)優先日 1995年２月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／８４６，８１４ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ゴセン，マンフレート アメリカ合衆国 94530 カリフォルニア, エル セリートー，アーリントン ブール バード ナンバービー 978 【要約の続き】 れる発現を可能にする新規なｔｅｔオペレーター含有転 写ユニットをも開示する。この調節系の成分を含むキッ トも又、この発明に包含される。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．転写を活性化する融合蛋白質をコードする単離された核酸であって、この融 合蛋白質が、真核細胞における転写を活性化する第２のポリペプチドに機能的に 結合されたテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在時にｔｅｔオ ペレーター配列に結合するが不在時には結合しない第１のポリペプチドを含む、 上記の単離された核酸。 ２．第１のポリペプチドが変異したＴｅｔリプレッサーである、請求項１に記載 の核酸。 ３．変異したＴｅｔリプレッサーが、野生型Ｔｅｔリプレッサーと比べて少なく とも１つのアミノ酸置換を有する、請求項２に記載の核酸。 ４．変異したＴｅｔリプレッサーが、野生型Ｔｅｔリプレッサーと比べて少なく とも１つのアミノ酸の付加又は欠失を有する、請求項２に記載の核酸。 ５．変異したＴｅｔリプレッサーが、７１位、９５位、１０１位及び１０２位よ りなる群から選択する少なくとも１つのアミノ酸位置にアミノ酸置換を有する変 異したＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーである、請求項３に記載の核酸。 ６．変異したＴｎ１０由来のリプレッサーが、SEQ ID NO:２の１〜２０７位に対 応するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸。 ７．第２のポリペプチドが、単純ヘルペスビリオン蛋白質１６の転写活性化ドメ インを含む、請求項１に記載の核酸。 ８．転写活性化ドメインが、SEQ ID NO:２の２０８〜３３５位に対応するアミノ 酸配列を含む単純ヘルペスウイルスビリオン蛋白質１６のＣ末端アミノ酸領域を 含む、請求項７に記載の核酸。 ９．転写活性化ドメインが、SEQ ID NO:４に示したアミノ酸配列を含む単純ヘル ペスウイルスビリオン蛋白質１６のＣ末端領域の少なくとも１コピーを含む、請 求項７に記載の核酸。 １０．第２のポリペプチドが、酸性転写活性化ドメイン、プロリンリッチ転写活 性化ドメイン、セリン／スレオニンリッチ転写活性化ドメイン及びグルタミンリ ッチ転写活性化ドメインよりなる群から選択する転写活性化ドメインを含む、請 求項１に記載の核酸。 １１．融合蛋白質が、更に、この融合蛋白質の細胞核への輸送を促進する機能的 に結合された第３のポリペプチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。 １２．真核細胞における転写を活性化する第２のポリペプチドに機能的に結合さ れたテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在時にｔｅｔオペレー ター配列に結合するが不在時には結合しない第１のポリペプチドを含む、転写を 活性化する融合蛋白質。 １３．第１のポリペプチドが、変異したＴｅｔリプレッサーである、請求項１２ に記載の融合蛋白質。 １４．第２のポリペプチドが、単純ヘルペスビリオン蛋白質１６の転写活性化ド メインを含む、請求項１２に記載の融合蛋白質。 １５．SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の融合蛋白 質。 １６．宿主細胞中での融合蛋白質の発現に適した形態で請求項１に記載の核酸分 子を含む組換えベクター。 １７．融合蛋白質の発現が、少なくとも１つの組織特異的な調節要素により調節 される、請求項１６に記載の組換えベクター。 １８．融合蛋白質の発現が、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列により調 節される、請求項１６に記載の組換えベクター。 １９．請求項１６に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。 ２０．少な＜とも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写され るべきヌクレオチド配列を更に含む、請求項１９に記載の宿主細胞。 ２１．転写されるべきヌクレオチド配列が宿主細胞中に導入された外因性ヌクレ オチド配列である、請求項２０に記載の宿主細胞。 ２２．転写されるべきヌクレオチド配列が、少なくとも１つのｔｅｔオペレータ ー配列が機能的に結合された外因性ヌクレオチド配列である、請求項２０に記載 の宿主細胞。 ２３．哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。 ２４．ヒト細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。 ２５．酵母、昆虫又はカビ細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。 ２６．請求項２０に記載の宿主細胞において、少なくとも１つのｔｅｔオペレー ター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列の転写を刺激する方法であって 、その宿主細胞をテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログと接触させる ことを含む、上記の方法。 ２７．テトラサイクリンアナログが、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイ クリン又はシアノテトラサイクリンである、請求項２６に記載の方法。 ２８．宿主細胞又は宿主細胞を生育させる培養培地由来の少なくとも１つのｔｅ ｔオペレーター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列によりコードされる 蛋白質を単離することを更に含む、請求項２６に記載の方法。 ２９．請求項１に記載の核酸分子を含むトランスジーンを、非ヒトトランスジェ ニック生物の細胞における融合蛋白質の発現に適した形態で含む、非ヒトトラン スジェニック生物。 ３０．トランスジーンが、生物のゲノム中の予め決めた位置にインテグレートさ れる、請求項２９に記載の非ヒトトランスジェニック生物。 ３１．少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写され るべきヌクレオチド配列を更に含む、請求項２９に記載の非ヒトトランスジェニ ック生物。 ３２．少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写され るべきヌクレオチド配列を更に含む、請求項３０に記載の非ヒトトランスジェニ ック生物。 ３３．請求項３１に記載の非ヒトトランスジェニック生物において、少なくとも １つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列の転写を 刺激する方法であって、その生物にテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナ ログを投与することを含む、上記の方法。 ３４．テトラサイクリンアナログが、アンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイ クリン又はシアノテトラサイクリンである、請求項３３に記載の方法。 ３５．真核細胞における転写を阻止する融合蛋白質をコードする単離した核酸で あって、その融合蛋白質が、真核細胞における転写を阻止する異種の第２のポリ ペプチドに機能的に結合されたｔｅｔオペレーター配列に結合する第１のポリペ プチドを含む、上記の核酸。 ３６．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが、存在時には結合しない、請求 項３５に記載の核酸。 ３７．第１のポリペプチドが、Ｔｅｔリプレッサーである、請求項３６に記載の 核酸。 ３８．第１のポリペプチドが、SEQ ID NO:１７に示したアミノ酸配列を含む、請 求項３７に記載の核酸。 ３９．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが、不在時には結合しない、請求 項３５に記載の核酸。 ４０．第１のポリペプチドが、変異したＴｅｔリプレッサーである、請求項３９ に記載の核酸。 ４１．変異したＴｅｔリプレッサーが、野生型のＴｅｔリプレッサーと比べて少 なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項４０に記載の核酸。 ４２．変異したＴｅｔリプレッサーが、野生型のＴｅｔリプレッサーと比べて少 なくとも１つのアミノ酸付加又は欠失を有する、請求項４０に記載の核酸。 ４３．変異したＴｅｔリプレッサーが、野生型のＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッ サーアミノ酸配列の７１位、９５位、１０１位及び１０２位よりなる群から選択 するアミノ酸位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸においてアミノ酸置換を 有する、請求項４１に記載の核酸。 ４４．変異したＴｅｔリプレッサーが、SEQ ID NO:１９に示したアミノ酸配列を 含む、請求項４３に記載の核酸。 ４５．第２のポリペプチドが、ｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物の転写サイレンサ ードメインを含む、請求項３５に記載の核酸。 ４６．第２のポリペプチドが、SEQ ID NO:２３に示したアミノ酸配列を含む、請 求項４５に記載の核酸。 ４７．第２のポリペプチドが、Drosophila Krueppel 蛋白質の転写サイレンサー ドメインを含む、請求項３５に記載の核酸。 ４８．第２のポリペプチドが、SEQ ID NO:２１に示したアミノ酸配列を含む、請 求項４７に記載の核酸。 ４９．第２のポリペプチドが、レチノイン酸レセプターα、甲状腺ホルモンレセ プターα、酵母Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１蛋白質複合体、Drosophila蛋白質even-skipp ed、ＳＩＲ１、ＮｅＰ１、Drosophilaの dorsal 蛋白質、ＴＳＦ３、ＳＦＩ、Dr osophilaの hunchback蛋白質、Drosophilaの knirps 蛋白質、ＷＴ１、Ｏｃｔ− ２．１、Drosophilaの engrailed蛋白質、Ｅ４ＢＰ４及びＺＦ５よりなる群から 選択する蛋白質の転写サイレンサードメインを含む、請求項３５に記載の核酸。 ５０．融合蛋白質が、更に、その融合蛋白質の細胞核への輸送を促進する機能的 に結合された第３のポリペプチドを含む、請求項３５に記載の核酸分子。 ５１．真核細胞における転写を阻止する融合蛋白質であって、真核細胞における 転写を阻止する異種の第２のポリペプチドに機能的に結合されたｔｅｔオペレー ター配列に結合する第１のポリペプチドを含む、上記の融合蛋白質。 ５２．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが、存在時には結合しない、請求 項５１に記載の融合蛋白質。 ５３．第１のポリペプチドが、SEQ ID NO:１７に示したアミノ酸配列を含む、請 求項５２に記載の融合蛋白質。 ５４．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが、不在時には結合しない、請求 項５１に記載の融合蛋白質。 ５５．第１のポリペプチドが、SEQ ID NO:１９に示したアミノ酸配列を含む、請 求項５４に記載の融合蛋白質。 ５６．第２のポリペプチドが、ｖ−ｅｒｂＡオンコジーン産物の転写サイレンサ ードメインを含む、請求項５１に記載の融合蛋白質。 ５７．第２のポリペプチドが、SEQ ID NO:２３に示したアミノ酸配列を含む、請 求項５６に記載の融合蛋白質。 ５８．第２のポリペプチドが、Drosophila Krueppel 蛋白質の転写サイレンサー ドメインを含む、請求項５１に記載の融合蛋白質。 ５９．第２のポリペプチドが、SEQ ID NO:２１に示したアミノ酸配列を含む、請 求項５８に記載の融合蛋白質。 ６０．第２のポリペプチドが、レチノイン酸レセプターα、甲状腺ホルモンレセ プターα、酵母Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１蛋白質複合体、Drosophila蛋白質even-skipp ed、ＳＩＲ１、ＮｅＰ１、Drosophilaの dorsal 蛋白質、ＴＳＦ３、ＳＦＩ、Dr osophilaの hunchback蛋白質、Drosophilaの knirps 蛋白質、ＷＴ１、Ｏｃｔ− ２．１、Drosophilaの engrailed蛋白質、Ｅ４ＢＰ４及びＺＦ５よりなる群から 選択する蛋白質の転写サイレンサードメインを含む、請求項５１に記載の融合蛋 白質。 ６１．請求項３５に記載の核酸分子を、宿主細胞中での融合蛋白質の発現に適し た形態で含む組換えベクター。 ６２．請求項６１に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。 ６３．少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写され るべきヌクレオチド配列を更に含む、請求項６２に記載の宿主細胞。 ６４．転写されるべきヌクレオチド配列が、宿主細胞に導入された外因性ヌクレ オチド配列である、請求項６３に記載の宿主細胞。 ６５．転写されるべきヌクレオチド配列が、少なくとも１つのｔｅｔオペレータ ー配列が機能的に結合した外因性ヌクレオチド配列である、請求項６３に記載の 宿主細胞。 ６６．請求項６３に記載の宿主細胞において、少なくとも１つのｔｅｔオペレー ター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列の転写を調節する方法であって 、その宿主細胞に接触しているテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の濃度を調節することを含む、上記の方法。 ６７．請求項３５に記載の核酸分子を、非ヒトトランスジェニック生物の細胞中 での融合蛋白質の発現に適した形態で含むトランスジーンを含む非ヒトトランス ジェニック生物。 ６８．トランスジーンが、生物のゲノム中の予め決めた位置にインテグレートさ れる、請求項６７に記載の非ヒトトランスジェニック生物。 ６９．少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写され るべきヌクレオチド配列を更に含む、請求項６７に記載の非ヒトトランスジェニ ック生物。 ７０．少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写され るべきヌクレオチド配列を更に含む、請求項６８に記載の非ヒトトランスジェニ ック生物。 ７１．請求項６９に記載の非ヒトトランスジェニック生物において、少なくとも １つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合されたヌクレオチド配列の転写を 調節する方法であって、その生物中に存在するテトラサイクリン又はテトラサイ クリンアナログの濃度を調節することを含む、上記の方法。 ７２．テトラサイクリンアナログがアンヒドロテトラサイクリン、ドキシサイク リン又はシアノテトラサイクリンである、請求項７１に記載の方法。 ７３．下記を含む宿主細胞： 転写を活性化する第１の融合蛋白質をコードする第１の核酸（この第１の融合 蛋白質は、真核細胞における転写を活性化する第２のポリペプチドに機能的に結 合されたｔｅｔオペレーター配列に結合する第１のポリペプチドを含む）； 転写を阻止する第２の融合蛋白質をコードする第２の核酸（この第２の融合蛋 白質は、真核細胞における転写を阻止する第４のポリペプチドに機能的に結合さ れたｔｅｔオペレーター配列に結合する第３のポリペプチドを含む）；及び 少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写されるべ きヌクレオチド配列を含む第３の核酸分子。 ７４．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが不在時には結合せず、第３のポ リペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの不在時にｔｅ ｔオペレーター配列に結合するが存在時には結合しない、請求項７３に記載の宿 主細胞。 ７５．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが存在時には結合せず、第３のポ リペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在時にｔｅ ｔオペレーター配列に結合するが不在時には結合しない、請求項７３に記載の宿 主細胞。 ７６．下記を含む非ヒトトランスジェニック生物： 転写を活性化する第１の融合蛋白質をコードする第１のトランスジーン（この 第１の融合蛋白質は、真核細胞における転写を活性化する第２のポリペプチドに 機能的に結合されたｔｅｔオペレーター配列に結合する第１のポリペプチドを含 む）； 転写を阻止する第２の融合蛋白質をコードする第２のトランスジーン（この第 ２の融合蛋白質は、真核細胞における転写を阻止する第４のポリペプチドに機能 的に結合されたｔｅｔオペレーター配列に結合する第３のポリペプチドを含む） ；及び 少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写されるべ きヌクレオチド配列を含む第３のトランスジーン。 ７７．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の存在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが不在時には結合せず、第３のポ リペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの不在時にｔｅ ｔオペレーター配列に結合するが存在時には結合しない、請求項７６に記載の非 ヒトトランスジェニック生物。 ７８．第１のポリペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログ の不在時にｔｅｔオペレーター配列に結合するが存在時には結合せず、第３のポ リペプチドが、テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在時にｔｅ ｔオペレーター配列に結合するが不在時には結合しない、請求項７６に記載の非 ヒトトランスジェニック生物。 ７９．転写されるべき第１及び第２のヌクレオチド配列の統合的、二方向性転写 のための組換えベクターであって、下記を５’から３’の向きで含むヌクレオチ ド配列を含む当該組換えベクター： 転写されるべき第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部 位、 該部位が機能的に結合される少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列 該オペレーター配列が機能的に結合される、転写されるべき第２のヌクレオチ ド配列の導入のための第２のクローニング部位（このベクターに導入された第１ 及び第２のヌクレオチド配列の転写は、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配 列に関して反対方向に進行する）。 ８０．転写されるべき第１及び第２のヌクレオチド配列を、それぞれ、第１及び 第２のクローニング部位に導入した、請求項７９に記載の組換えベクター。 ８１．第１及び第２のヌクレオチド配列が、ヘテロ二量体蛋白質のポリペプチド サブユニットをコードする、請求項８０に記載の組換えベクター。 ８２．第１のヌクレオチド配列が関心ある蛋白質をコードし、第２のヌクレオチ ド配列が検出可能マーカーをコードする、請求項８０に記載の組換えベクター。 ８３．転写されるべき第１及び第２のヌクレオチド配列の転写の独立的調節のた めの少なくとも１つの組換えベクターを含む組成物であって、この少なくとも１ つのベクターは、下記を含むヌクレオチド配列を含む： 転写されるべき第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部 位（該部位は、少なくとも１つの第１のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に 機能的に結合されている）；及び 転写されるべき第２のヌクレオチド配列の導入のための第２のクローニング部 位（該部位は、少なくとも１つの第２のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列に 機能的に結合されている）。 ８４．第１又は第２のクラスの型のｔｅｔオペレーター配列が、クラスＢのｔｅ ｔオペレーター配列である、請求項８３に記載の組成物。 ８５．転写されるべき第１及び第２のヌクレオチド配列を、それぞれ、第１及び 第２のクローニング部位に導入した、請求項８３に記載の組成物。 ８６．第１のヌクレオチド配列が治療用遺伝子を含み且つ第２のヌクレオチド配 列が自殺遺伝子を含む、請求項８５に記載の組成物。 ８７．近い範囲内に次を含む少なくとも２つの容器手段を有するキャリアー手段 を含むキット： 転写を活性化する融合蛋白質をコードする第１の核酸を含む第１の容器手段（ この融合蛋白質は、真核細胞における転写を活性化する第２のポリペプチドに機 能的に結合されたテトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログの存在時にｔ ｅｔオペレーター配列に結合する第１のポリペプチドを含む）；及び 少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列に機能的に結合された転写されるべ きヌクレオチド配列の導入のためのクローニング部位を含む第２の核酸を含む第 ２の容器手段。 ８８．転写を阻止する融合蛋白質をコードする第３の核酸を含む第３の容器手段 を更に含む、請求項８７に記載のキットであって、該融合蛋白質が、真核細胞に おける転写を阻止する異種の第２のポリペプチドに機能的に結合されたｔｅｔオ ペレーター配列に結合する第１のポリペプチドを含む、上記のキット。 ８９．テトラサイクリン又はテトラサイクリンアナログを含む容器手段を更に含 む、請求項８８に記載のキット
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