JPH1123575A - 心筋梗塞マーカーを測定する方法 - Google Patents
心筋梗塞マーカーを測定する方法Info
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- JPH1123575A JPH1123575A JP17486897A JP17486897A JPH1123575A JP H1123575 A JPH1123575 A JP H1123575A JP 17486897 A JP17486897 A JP 17486897A JP 17486897 A JP17486897 A JP 17486897A JP H1123575 A JPH1123575 A JP H1123575A
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- plasmon resonance
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Abstract
(57)【要約】
【解決すべき課題】 心筋梗塞のマーカーを、簡便にか
つ迅速に測定できる手法の開発を課題とする。 【解決手段】 本出願人が先に出願した表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー）用測定チップを
利用することによって、心筋梗塞マーカー、特にヒトミ
オグロビン及び／又はヒトトロポニンＴを、血液をその
まま使用してノンラベルで測定することができることを
見出した。
つ迅速に測定できる手法の開発を課題とする。 【解決手段】 本出願人が先に出願した表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー）用測定チップを
利用することによって、心筋梗塞マーカー、特にヒトミ
オグロビン及び／又はヒトトロポニンＴを、血液をその
まま使用してノンラベルで測定することができることを
見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】抗原抗体反応に基づく表面プ
ラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー）用測定
チップを用いて、心筋梗塞マーカーを測定する方法に関
する。
ラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー）用測定
チップを用いて、心筋梗塞マーカーを測定する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】急性心筋梗塞は冠動脈の閉塞により心筋
が壊死に陥る疾患であるが、この疾患の検査手法として
は、胸痛、心電図及び心筋梗塞マーカーを利用すること
が行われてきている。この心筋梗塞マーカーも大別する
と、生化学的指標と免疫学的指標に二分される。生化学
的指標には、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やその心筋特
異性アイソザイム（ＣＫＭＢ）が用いられているが、測
定が簡便ではあるものの、ＣＫは心筋梗塞特異性が低
く、ＣＫＭＢもトロポニンＴに比し特異性が低いことか
ら、有用性に限界がある。一方、免疫学的指標には、ミ
オグロビン、ミオシン軽鎖及びトロポニンＴ等が実用化
されている。
が壊死に陥る疾患であるが、この疾患の検査手法として
は、胸痛、心電図及び心筋梗塞マーカーを利用すること
が行われてきている。この心筋梗塞マーカーも大別する
と、生化学的指標と免疫学的指標に二分される。生化学
的指標には、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やその心筋特
異性アイソザイム（ＣＫＭＢ）が用いられているが、測
定が簡便ではあるものの、ＣＫは心筋梗塞特異性が低
く、ＣＫＭＢもトロポニンＴに比し特異性が低いことか
ら、有用性に限界がある。一方、免疫学的指標には、ミ
オグロビン、ミオシン軽鎖及びトロポニンＴ等が実用化
されている。
【０００３】ミオグロビンは、筋細胞の細胞質内に豊富
に存在する低分子蛋白であるので、壊死心筋から容易に
血中に流出し、心筋梗塞の発症後１〜３時間で異常値を
示す。しかし、骨格筋のミオグロビン含量は心筋より多
いため、ミオグロビンの心筋特異性は低い。従って、ミ
オグロビンは心筋特異性が低いという欠点はあるが、ミ
オグロビン濃度は簡便・迅速に測定できるため、現時点
では急性心筋梗塞の早期診断及び経静脈的血栓溶解療法
の成否の判定における最も有用なマーカーである。
に存在する低分子蛋白であるので、壊死心筋から容易に
血中に流出し、心筋梗塞の発症後１〜３時間で異常値を
示す。しかし、骨格筋のミオグロビン含量は心筋より多
いため、ミオグロビンの心筋特異性は低い。従って、ミ
オグロビンは心筋特異性が低いという欠点はあるが、ミ
オグロビン濃度は簡便・迅速に測定できるため、現時点
では急性心筋梗塞の早期診断及び経静脈的血栓溶解療法
の成否の判定における最も有用なマーカーである。
【０００４】ミオシン軽鎖については、筋原線維の太い
フィラメントがほとんど全てミオシンという単一蛋白よ
りなっており、心筋ミオシンは重鎖（分子量２００００
０）のダイマーと分子量２７０００の軽鎖Ｉと分子量１
９０００の軽鎖IIから構成されている。現在用いられて
いるミオシン軽鎖Ｉの測定方法としては、ＲＩＡ法（ラ
ジオイムノアッセイ）とＥＩＡ法（エンザイムイムノア
ッセイ）とがある。ＲＩＡ法は２種類のミオシン軽鎖Ｉ
モノクロナール抗体をサンドイッチ法で用いた方法であ
る。この測定法は操作が複雑で測定時間が長いという欠
点を有している。また、ＥＩＡ法も、インキュベーショ
ン時間だけでも４５分以上もかかり、迅速な測定には適
当ではない。この他にテストストリップタイプの測定法
があるが、これは定性測定のみで定量測定ができない。
以上のようにミオシン軽鎖は、構造蛋白であるため、梗
塞発症後数日を経過した症例の診断や梗塞サイズの評価
に適しているが、測定に時間がかかり心筋特異性もやや
低い。
フィラメントがほとんど全てミオシンという単一蛋白よ
りなっており、心筋ミオシンは重鎖（分子量２００００
０）のダイマーと分子量２７０００の軽鎖Ｉと分子量１
９０００の軽鎖IIから構成されている。現在用いられて
いるミオシン軽鎖Ｉの測定方法としては、ＲＩＡ法（ラ
ジオイムノアッセイ）とＥＩＡ法（エンザイムイムノア
ッセイ）とがある。ＲＩＡ法は２種類のミオシン軽鎖Ｉ
モノクロナール抗体をサンドイッチ法で用いた方法であ
る。この測定法は操作が複雑で測定時間が長いという欠
点を有している。また、ＥＩＡ法も、インキュベーショ
ン時間だけでも４５分以上もかかり、迅速な測定には適
当ではない。この他にテストストリップタイプの測定法
があるが、これは定性測定のみで定量測定ができない。
以上のようにミオシン軽鎖は、構造蛋白であるため、梗
塞発症後数日を経過した症例の診断や梗塞サイズの評価
に適しているが、測定に時間がかかり心筋特異性もやや
低い。
【０００５】トロポニン複合体は筋原線維の細いフィラ
メントに存在する蛋白で、トロポニンＴ（分子量３７０
００）、トロポニンＩ（分子量２２５００）、トロポニ
ンＣ（分子量１８０００）の３つのザユニットからな
る。トロポニンＴで極めて心筋特異性の高い心筋トロポ
ニンＴの測定系が開発された。そして、このトロポニン
Ｔは心筋梗塞発症後早期から長期間にわたって異常値を
示すので、従来のマーカーでは検出できなかった微小心
筋障害を診断することが可能となった。すなわち、トロ
ポニンＴは発症早期（発症後３〜４時間以降）から７〜
１０日までの長い期間にわたる心筋梗塞の診断に有用で
ある。
メントに存在する蛋白で、トロポニンＴ（分子量３７０
００）、トロポニンＩ（分子量２２５００）、トロポニ
ンＣ（分子量１８０００）の３つのザユニットからな
る。トロポニンＴで極めて心筋特異性の高い心筋トロポ
ニンＴの測定系が開発された。そして、このトロポニン
Ｔは心筋梗塞発症後早期から長期間にわたって異常値を
示すので、従来のマーカーでは検出できなかった微小心
筋障害を診断することが可能となった。すなわち、トロ
ポニンＴは発症早期（発症後３〜４時間以降）から７〜
１０日までの長い期間にわたる心筋梗塞の診断に有用で
ある。
【０００６】心筋トロポニンＴの測定方法として、心筋
トロポニンＴに対する少なくとも１つの抗体および心筋
トロポニンＴ又は該抗体の結合相手Ｂと一緒に血清又は
血漿試料をインキュベートし、それによって、心筋トロ
ポニンＴに対する抗体又は結合相手Ｂのいずれかを測定
可能な基で標識し、こうして生成する測定可能な基を含
有する免疫学的複合体を単離し、単離した相または残り
の相中の該測定可能な基を測定することが示されてい
る。（特開平７ー１９８７１８号公報）この測定方法
は、血液を分離した上で標識することが必須であるた
め、その操作が煩雑で時間を要するという欠点を有して
いる。
トロポニンＴに対する少なくとも１つの抗体および心筋
トロポニンＴ又は該抗体の結合相手Ｂと一緒に血清又は
血漿試料をインキュベートし、それによって、心筋トロ
ポニンＴに対する抗体又は結合相手Ｂのいずれかを測定
可能な基で標識し、こうして生成する測定可能な基を含
有する免疫学的複合体を単離し、単離した相または残り
の相中の該測定可能な基を測定することが示されてい
る。（特開平７ー１９８７１８号公報）この測定方法
は、血液を分離した上で標識することが必須であるた
め、その操作が煩雑で時間を要するという欠点を有して
いる。
【０００７】以上のような各種の測定方法があるが、い
ずれも操作時間がかかったり、操作が複雑であったり等
の難点があった。そこで全血をそのまま使用し、ノンラ
ベルで簡便かつ迅速に測定し、心筋梗塞の診断に資する
方法が求められているところである。
ずれも操作時間がかかったり、操作が複雑であったり等
の難点があった。そこで全血をそのまま使用し、ノンラ
ベルで簡便かつ迅速に測定し、心筋梗塞の診断に資する
方法が求められているところである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】心筋梗塞のマーカーを
簡便にかつ迅速に測定できる手法の開発を課題とする。
簡便にかつ迅速に測定できる手法の開発を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決する手段
として、本発明者等が鋭意努力した結果、本出願人が先
に出願した表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ
センサー）用測定チップ（特願平９−７３６４６）を利
用することが極めて有効であることを見出した。すなわ
ち、本発明は、（１）透明基板、該透明基板上に配置さ
れる金属膜、該金属膜上に固定される、心筋梗塞マーカ
ーに対する抗体を備えていることを特徴とする表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（２）金属膜
上に配置される有機ケイ素膜を有し、該有機ケイ素膜上
に心筋梗塞マーカーに対する抗体が固定されていること
を特徴とする（１）に記載の表面プラズモン共鳴バイオ
センサー用測定チップ、（３） 前記心筋梗塞マーカー
に対する抗体が抗ヒトミオグロビン抗体、抗ヒトトロポ
ニン抗体であることを特徴とする、（１）又は（２）記
載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、
（４） 前記有機ケイ素膜がシランカップリング剤によ
り形成された膜であることを特徴とする、（１）又は
（２）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップ、（５） 前記シランカップリング剤が３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルト
リメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチ
ルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ト
リメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロ
ピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピ
ルトリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプト
プロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくと
も１種であることを特徴とする、（４）記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（６） 前記
有機ケイ素膜と前記心筋梗塞マーカーに対する抗体との
間に、さらに水溶性二価性試薬により形成した層が設け
られていることを特徴とする、（１）又は（２）記載の
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、
（７） 前記水溶性二価性試薬が、グルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スク
シニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−
マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミド
ヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミ
ドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホ
スクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−
マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド・ナト
リウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スル
ホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミ
ドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム
塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）スルホ
スクシンイミド・ナトリウム塩及びＮ［２−（１−ピペ
ラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸からなる群から
選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、
（６）に記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ、（８） 透明基板上に金属膜を配置した後、
該金属膜の上に有機ケイ素膜を配置し、次いで該有機ケ
イ素膜上に心筋梗塞マーカーに対する抗体を配置するこ
とを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップの製造方法、（９） 前記有機ケイ素膜をシ
ランカップリング剤を用いて形成させることを特徴とす
る、（８）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップの製造方法、（１０） シランカップリング
剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−ア
ミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピル
ジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミ
ノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエ
チルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メ
ルカプトプロピルトリメトキシシラン及びジメトキシ−
３−メルカプトプロピルメチルシランからなる群から選
ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、（９）
記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ
の製造方法、（１１）（１）又は（２）に記載の測定用
チップを用いて心筋梗塞マーカーを測定する方法、（１
２）全血をそのまま表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップに投与することを特徴とする（１１）に記
載の心筋梗塞マーカーを測定する方法、に関するもので
ある。従来の測定方法では、全血を遠心分離し、血球成
分を取り出す必要があったが、このチップを使用するこ
とによって、全血を直接そのままセンサーチップに投与
することができる。これは、抗原抗体反応に基づき抗原
が抗体と特異的結合を形成するが、抗原以外はリンスで
除くことができる上、ＳＰＲセンサーチップの表面の金
あるいは抗体の極めて近傍の情報のみが共鳴シグナルと
して忠実に反映されるという理由に起因するからであ
る。本発明においては、特にマーカーとしてミオグロビ
ン及びトロポニンＴを使用すれば、障害初期から出現す
るミオグロビンと、心筋特異性が高く異常値持続時間の
長いトロポニンＴの２項目を同時にモニタリングするこ
とで、障害初期からのモニタリングを可能とする。な
お、ミオグロビン又はトロポニンＴ単独で測定チップ投
与することによっても、前述のような本発明の当初の目
的を充分達成することができる。
として、本発明者等が鋭意努力した結果、本出願人が先
に出願した表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲ
センサー）用測定チップ（特願平９−７３６４６）を利
用することが極めて有効であることを見出した。すなわ
ち、本発明は、（１）透明基板、該透明基板上に配置さ
れる金属膜、該金属膜上に固定される、心筋梗塞マーカ
ーに対する抗体を備えていることを特徴とする表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（２）金属膜
上に配置される有機ケイ素膜を有し、該有機ケイ素膜上
に心筋梗塞マーカーに対する抗体が固定されていること
を特徴とする（１）に記載の表面プラズモン共鳴バイオ
センサー用測定チップ、（３） 前記心筋梗塞マーカー
に対する抗体が抗ヒトミオグロビン抗体、抗ヒトトロポ
ニン抗体であることを特徴とする、（１）又は（２）記
載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、
（４） 前記有機ケイ素膜がシランカップリング剤によ
り形成された膜であることを特徴とする、（１）又は
（２）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップ、（５） 前記シランカップリング剤が３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルト
リメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチ
ルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ト
リメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロ
ピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピ
ルトリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプト
プロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくと
も１種であることを特徴とする、（４）記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、（６） 前記
有機ケイ素膜と前記心筋梗塞マーカーに対する抗体との
間に、さらに水溶性二価性試薬により形成した層が設け
られていることを特徴とする、（１）又は（２）記載の
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ、
（７） 前記水溶性二価性試薬が、グルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スク
シニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−
マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミド
ヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミ
ドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホ
スクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−
マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド・ナト
リウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スル
ホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミ
ドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム
塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）スルホ
スクシンイミド・ナトリウム塩及びＮ［２−（１−ピペ
ラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸からなる群から
選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、
（６）に記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ、（８） 透明基板上に金属膜を配置した後、
該金属膜の上に有機ケイ素膜を配置し、次いで該有機ケ
イ素膜上に心筋梗塞マーカーに対する抗体を配置するこ
とを特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップの製造方法、（９） 前記有機ケイ素膜をシ
ランカップリング剤を用いて形成させることを特徴とす
る、（８）記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップの製造方法、（１０） シランカップリング
剤が、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−ア
ミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピル
ジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミ
ノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエ
チルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メ
ルカプトプロピルトリメトキシシラン及びジメトキシ−
３−メルカプトプロピルメチルシランからなる群から選
ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、（９）
記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ
の製造方法、（１１）（１）又は（２）に記載の測定用
チップを用いて心筋梗塞マーカーを測定する方法、（１
２）全血をそのまま表面プラズモン共鳴バイオセンサー
用測定チップに投与することを特徴とする（１１）に記
載の心筋梗塞マーカーを測定する方法、に関するもので
ある。従来の測定方法では、全血を遠心分離し、血球成
分を取り出す必要があったが、このチップを使用するこ
とによって、全血を直接そのままセンサーチップに投与
することができる。これは、抗原抗体反応に基づき抗原
が抗体と特異的結合を形成するが、抗原以外はリンスで
除くことができる上、ＳＰＲセンサーチップの表面の金
あるいは抗体の極めて近傍の情報のみが共鳴シグナルと
して忠実に反映されるという理由に起因するからであ
る。本発明においては、特にマーカーとしてミオグロビ
ン及びトロポニンＴを使用すれば、障害初期から出現す
るミオグロビンと、心筋特異性が高く異常値持続時間の
長いトロポニンＴの２項目を同時にモニタリングするこ
とで、障害初期からのモニタリングを可能とする。な
お、ミオグロビン又はトロポニンＴ単独で測定チップ投
与することによっても、前述のような本発明の当初の目
的を充分達成することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において用いる表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップ（以下、単に「測定チップ」という）と
は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチ
ップであって、該センサーより照射された光を透過及び
反射する部分、並びに抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒ
トミオグロビン抗体及びそれを固定化する部分とを含む
部材をいい、該センサーの本体に固着されるものであっ
てもよく、また脱着可能なものであってもよい。
本発明において用いる表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ー用測定チップ（以下、単に「測定チップ」という）と
は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるチ
ップであって、該センサーより照射された光を透過及び
反射する部分、並びに抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒ
トミオグロビン抗体及びそれを固定化する部分とを含む
部材をいい、該センサーの本体に固着されるものであっ
てもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００１１】本発明で用いる測定チップは、透明基板、
該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置さ
れる有機ケイ素膜、及び該有機ケイ素膜上に配置される
抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体を
備えている。ここで、「透明基板上に配置される金属
膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置されて
いる場合のほか、金属膜が透明基板に直接接することな
く、他の層を介して配置されている場合をも含む意であ
る。「金属膜上に配置される有機ケイ素膜」及び「有機
ケイ素膜上に配置される抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗
ヒトミオグロビン抗体」も上記と同様の意味である。こ
の場合、測定基板上には、トロポニンＴ検出領域とミオ
グロビン検出領域を独立に有しており、トロポニンＴ検
出領域には抗ヒトトロポニンＴ抗体が、ミオグロビン検
出領域には抗ヒトミオグロビン抗体が固定される。
該透明基板上に配置される金属膜、該金属膜上に配置さ
れる有機ケイ素膜、及び該有機ケイ素膜上に配置される
抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体を
備えている。ここで、「透明基板上に配置される金属
膜」とは、金属膜が直接接して透明基板上に配置されて
いる場合のほか、金属膜が透明基板に直接接することな
く、他の層を介して配置されている場合をも含む意であ
る。「金属膜上に配置される有機ケイ素膜」及び「有機
ケイ素膜上に配置される抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗
ヒトミオグロビン抗体」も上記と同様の意味である。こ
の場合、測定基板上には、トロポニンＴ検出領域とミオ
グロビン検出領域を独立に有しており、トロポニンＴ検
出領域には抗ヒトトロポニンＴ抗体が、ミオグロビン検
出領域には抗ヒトミオグロビン抗体が固定される。
【００１２】本発明の一例による測定チップの断面概略
図を図１に示す。本実施例により用いられる測定チップ
は、透明基板１と、透明基板１上に形成された金属膜２
と、金属膜２の上に形成された有機ケイ素膜３と、有機
ケイ素膜３の表面に固定化された抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体４とを有する。
図を図１に示す。本実施例により用いられる測定チップ
は、透明基板１と、透明基板１上に形成された金属膜２
と、金属膜２の上に形成された有機ケイ素膜３と、有機
ケイ素膜３の表面に固定化された抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体４とを有する。
【００１３】透明基板１としては、通常表面プラズモン
共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるもので
あればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレ
ーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、
偏光に対して異方性を示さず、かつ加工性の優れた材料
が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるもので
あればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレ
ーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、
偏光に対して異方性を示さず、かつ加工性の優れた材料
が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
【００１４】金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜２に使用することのできる金属の種類としては、
金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それら
を単独で又は組み合わせて使用することができる。ま
た、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１
と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層
を設けてもよい。
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜２に使用することのできる金属の種類としては、
金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それら
を単独で又は組み合わせて使用することができる。ま
た、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１
と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層
を設けてもよい。
【００１５】金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるの
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。
が好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。30
00Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出
することができない。また、クロム等からなる介在層を
設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが
好ましい。
【００１６】金属膜２の形成は常法によって行えばよ
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。
【００１７】有機ケイ素膜３とは、Ｓｉ−Ｏ及びＳｉ−
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。該有機
ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いて
形成させることができる。シランカップリング剤とは、
その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカ
プト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、
メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のあ
る加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
シランカップリング剤中の加水分解基は、金属膜２中の
金属原子と結合し、有機官能基は抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体４と結合する。これによ
り金属膜２、有機ケイ素膜３及び抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体４の三者は強固に固定化
される。本発明に使用できるシランカップリング剤は、
上記定義に該当するものであればいかなるものでもよ
く、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミ
ノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジ
エトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノ
プロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチ
ルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メル
カプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−
メルカプトプロピルメチルシランなどを単独又は組み合
わせて使用することができる。
Ｃ結合を分子内に含む高分子からなる膜をいう。該有機
ケイ素膜３は、例えば、シランカップリング剤を用いて
形成させることができる。シランカップリング剤とは、
その分子中にビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカ
プト基のような有機材料と親和性のある有機官能基と、
メトキシ基、エトキシ基のような無機材料と親和性のあ
る加水分解基を有する有機ケイ素化合物のことをいう。
シランカップリング剤中の加水分解基は、金属膜２中の
金属原子と結合し、有機官能基は抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体４と結合する。これによ
り金属膜２、有機ケイ素膜３及び抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体４の三者は強固に固定化
される。本発明に使用できるシランカップリング剤は、
上記定義に該当するものであればいかなるものでもよ
く、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミ
ノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジ
エトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノ
プロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチ
ルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メル
カプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−
メルカプトプロピルメチルシランなどを単独又は組み合
わせて使用することができる。
【００１８】有機ケイ素膜３は、ケイ素原子が上下方向
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗
ヒトミオグロビン抗体と相互作用する測定対象物と、入
射した光が反射する面との距離を短くすることができ、
良好な感度が得られるとともに、使用するシランカップ
リング剤の量を必要最小限に抑え、コストの低減化を図
ることができる。
に重ならない単分子層膜であることが好ましい。単分子
層膜にすることにより、抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗
ヒトミオグロビン抗体と相互作用する測定対象物と、入
射した光が反射する面との距離を短くすることができ、
良好な感度が得られるとともに、使用するシランカップ
リング剤の量を必要最小限に抑え、コストの低減化を図
ることができる。
【００１９】また、有機ケイ素膜３は、細密充填構造を
とるのが好ましい。細密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
細密充填構造をとることにより、抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体を高い密度で均等に固定
することができ、測定感度を向上させることができる。
有機ケイ素膜３が細密充填構造をとるかどうかは、以下
の方法により確認することができる。
とるのが好ましい。細密充填構造とは、有機ケイ素膜３
を構成するＳｉ及びＯの網目構造中に他の分子が貫入す
る余地のないほど、網目構造が緻密であることをいう。
細密充填構造をとることにより、抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体を高い密度で均等に固定
することができ、測定感度を向上させることができる。
有機ケイ素膜３が細密充填構造をとるかどうかは、以下
の方法により確認することができる。
【００２０】プロピルエトキシシラン（シランカップリ
ング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランの
アミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜
２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシ
シランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ
素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシラ
ンの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を
知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下
した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素
膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか
水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておら
ず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測
される。
ング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシランの
アミノ基を水素原子で置換した化合物）を用いて金属膜
２上に有機ケイ素膜３を形成させる。プロピルエトキシ
シランは、強い疎水性を有する化合物なので、有機ケイ
素膜２の表面の濡れ程度により、プロピルエトキシシラ
ンの密度（即ち、有機ケイ素膜３の細密充填の程度）を
知ることができる。即ち、シリンジにより蒸留水を滴下
した際に表面が一様に水滴を弾くのであれば有機ケイ素
膜３は細密充填構造をとっており、表面が部分的にしか
水を弾かないのであれば、細密充填構造をとっておら
ず、Ｓｉ及びＯの網目構造に空隙が存在することが推測
される。
【００２１】有機ケイ素膜３は、例えば、シランカップ
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。
リング剤を用いることにより形成させることができる。
具体的には、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属
膜２を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカ
ップリング剤を含む溶液中に金属膜２を一定時間浸漬す
る方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピン
コーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラ
ビア法）などにより成膜することができる。本発明にお
いては、これらのいずれの方法を用いてもよいが、細密
充填構造をとる単分子層膜を形成させるためには、飽和
蒸気法を用いるのが好ましい。
【００２２】飽和蒸気法においては、暴露時の温度、湿
度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を
与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間
が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間
が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、
通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とする
のが更に好ましい。
度なども単分子層構造及び細密充填構造の形成に影響を
与えるが、暴露時間が最も重要な要素である。暴露時間
が長すぎると単分子層構造が得られず、また、暴露時間
が短すぎると細密充填構造が得られない。暴露時間は、
通常、１〜600 分とするのが好ましく、15〜90分とする
のが更に好ましい。
【００２３】本発明における有機ケイ素膜３は、以下の
ような利点を有する。 抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗
体４を金属膜２に極めて近い位置に固定化することがで
きるので、従来の測定チップを使用する場合よりも大幅
に測定感度を向上させることができる。 成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理が
できる。 シランカップリング剤の種類を変えることにより、
膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾
が可能となる。
ような利点を有する。 抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗
体４を金属膜２に極めて近い位置に固定化することがで
きるので、従来の測定チップを使用する場合よりも大幅
に測定感度を向上させることができる。 成膜が容易であり、また、一度に大量の成膜処理が
できる。 シランカップリング剤の種類を変えることにより、
膜厚だけでなく、表面改質、官能基導入などの化学修飾
が可能となる。
【００２４】通常は図１に示されるように抗体のＦｃフ
ラグメントが有機ケイ素膜３の表面のみに固定化され、
抗体は単分子層状態に形成される。但し、抗体のＦａｂ
フラグメントが有機ケイ素膜３から離れる程、感度や反
応速度が低下するため、図２に示すようにＦａｂフラグ
メント（図２(a) ）又はＦ(ａｂ')2 フラグメント（図
２(b) ）を直接有機ケイ素膜３に固定化して、感度や反
応速度を向上させてもよい。
ラグメントが有機ケイ素膜３の表面のみに固定化され、
抗体は単分子層状態に形成される。但し、抗体のＦａｂ
フラグメントが有機ケイ素膜３から離れる程、感度や反
応速度が低下するため、図２に示すようにＦａｂフラグ
メント（図２(a) ）又はＦ(ａｂ')2 フラグメント（図
２(b) ）を直接有機ケイ素膜３に固定化して、感度や反
応速度を向上させてもよい。
【００２５】抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグ
ロビン抗体４の厚さは、使用するマーカー自体の大きさ
にもよるが、100 〜3000Åであるのが好ましく、特に10
0 〜1000Åであるのが好ましい。抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体の固定化方法は常法によ
って行えばよく、例えば、所定量の抗ヒトトロポニンＴ
抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体４を有機ケイ素膜３に
所定時間接触させることにより固定化することができ
る。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサーに有機ケイ素膜３を形成させた透明基板１を設置
して一定流量の抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオ
グロビン抗体４を所定時間（所定量）流すことによって
も固定化できる。
ロビン抗体４の厚さは、使用するマーカー自体の大きさ
にもよるが、100 〜3000Åであるのが好ましく、特に10
0 〜1000Åであるのが好ましい。抗ヒトトロポニンＴ抗
体又は抗ヒトミオグロビン抗体の固定化方法は常法によ
って行えばよく、例えば、所定量の抗ヒトトロポニンＴ
抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体４を有機ケイ素膜３に
所定時間接触させることにより固定化することができ
る。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセ
ンサーに有機ケイ素膜３を形成させた透明基板１を設置
して一定流量の抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオ
グロビン抗体４を所定時間（所定量）流すことによって
も固定化できる。
【００２６】抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグ
ロビン抗体のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素膜３
に固定化する場合には、パパインを用いて抗ヒトトロポ
ニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体を部分分解した
後、同様の処理を行えばよい。一方、抗ヒトトロポニン
Ｔ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体のＦ(ａｂ')2 フラ
グメントを直接有機ケイ素膜３に固定化する場合には、
ペプシンを用いて抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミ
オグロビン抗体を部分分解した後、同様の処理を行えば
よい。
ロビン抗体のＦａｂフラグメントを直接有機ケイ素膜３
に固定化する場合には、パパインを用いて抗ヒトトロポ
ニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体を部分分解した
後、同様の処理を行えばよい。一方、抗ヒトトロポニン
Ｔ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体のＦ(ａｂ')2 フラ
グメントを直接有機ケイ素膜３に固定化する場合には、
ペプシンを用いて抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミ
オグロビン抗体を部分分解した後、同様の処理を行えば
よい。
【００２７】本発明の他の一例による測定チップの概略
断面図を図３に示す。本実施例による測定チップは、上
記測定チップとほぼ同様の構成を有するが、有機ケイ素
膜３の上にさらに水溶性二価性試薬により形成した膜
（これを「共有結合膜」という。）６が設けられてお
り、抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗
体４がこの共有結合膜６を介して有機ケイ素膜３に固定
されている。
断面図を図３に示す。本実施例による測定チップは、上
記測定チップとほぼ同様の構成を有するが、有機ケイ素
膜３の上にさらに水溶性二価性試薬により形成した膜
（これを「共有結合膜」という。）６が設けられてお
り、抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗
体４がこの共有結合膜６を介して有機ケイ素膜３に固定
されている。
【００２８】共有結合膜６を形成する水溶性二価性試薬
は、抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗
体４を共有結合的に強固に固定化できるものであれば、
特に限定されない。そのような水溶性二価性試薬として
は、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'
−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、
Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシ
ニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスク
シニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１
−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイ
ミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）ス
ルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイ
ミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウ
ム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスク
シンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウン
デカノイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム
塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド
・二塩酸等が挙げられ、それぞれ単独で又は組み合わせ
て使用することができる。これらの中でも、汎用性が高
く、取扱いの容易なグルタルアルデヒドが好ましい。
は、抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗
体４を共有結合的に強固に固定化できるものであれば、
特に限定されない。そのような水溶性二価性試薬として
は、例えばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'
−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、
Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシ
ニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスク
シニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１
−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイ
ミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）ス
ルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイ
ミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウ
ム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスク
シンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウン
デカノイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム
塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド
・二塩酸等が挙げられ、それぞれ単独で又は組み合わせ
て使用することができる。これらの中でも、汎用性が高
く、取扱いの容易なグルタルアルデヒドが好ましい。
【００２９】このような共有結合膜６を設け、抗ヒトト
ロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体４を共有結
合で強固に固定化することにより、当該測定チップを洗
浄しても抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビ
ン抗体４の固定化を維持できるため、繰り返し測定に使
用することができるという利点が得られる。共有結合膜
６の厚さは、10〜100 Åであるのが好ましく、特に10〜
20Åであるのが好ましい。
ロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体４を共有結
合で強固に固定化することにより、当該測定チップを洗
浄しても抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビ
ン抗体４の固定化を維持できるため、繰り返し測定に使
用することができるという利点が得られる。共有結合膜
６の厚さは、10〜100 Åであるのが好ましく、特に10〜
20Åであるのが好ましい。
【００３０】共有結合膜６は、水溶性二価性試薬を有機
ケイ素膜３に接触させることにより形成することができ
る。共有結合膜６に抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒト
ミオグロビン抗体４を固定化する方法は、抗ヒトトロポ
ニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体４を有機ケイ素
膜３に固定化する場合と同様にして行うことができる。
ケイ素膜３に接触させることにより形成することができ
る。共有結合膜６に抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒト
ミオグロビン抗体４を固定化する方法は、抗ヒトトロポ
ニンＴ抗体又は抗ヒトミオグロビン抗体４を有機ケイ素
膜３に固定化する場合と同様にして行うことができる。
【００３１】本発明の測定チップは、例えば、図４に示
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。
されるような表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用
することができる。この表面プラズモン共鳴バイオセン
サーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器
９とを有し、カートリッジブロック７の上に本発明の測
定チップ10を設置して使用する。測定チップ10は、透明
基板が上になるように設置する。カートリッジブロック
７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測
定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71
は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に
連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流
れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出さ
れる。
【００３２】光源８からは、測定チップ10の透明基板に
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。
【００３３】上記のような構造によって、ある入射角θ
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射
光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるも
のである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との
界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波
といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズ
モンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波
数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が
表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強
度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属
膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるた
め、測定対象物質と抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒト
ミオグロビン抗体との相互作用により媒質の屈折率が変
化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化
する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、測
定対象物質の濃度の変化を検知することができる。入射
角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を
１RUとして表す。
に対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射
光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるも
のである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との
界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波
といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズ
モンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波
数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が
表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強
度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属
膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるた
め、測定対象物質と抗ヒトトロポニンＴ抗体又は抗ヒト
ミオグロビン抗体との相互作用により媒質の屈折率が変
化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化
する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、測
定対象物質の濃度の変化を検知することができる。入射
角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を
１RUとして表す。
【００３４】以下、実施例により本発明を更に具体的に
説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定され
るものではない。前述したように、本発明は、特にマー
カーとしてミオグロビン及びトロポニンＴを併用すれ
ば、障害初期から出現するミオグロビンと、心筋特異性
が高く異常値持続時間の長いトロポニンＴの２項目を同
時にモニタリングすることで、障害初期からのモニタリ
ングを可能とするので、本実施例においては、測定チッ
プ上に抗ヒトミオグロビン抗体及び抗ヒトトロポニンＴ
抗体の両抗体を固定したものを示すこととする。抗ヒト
ミオグロビン抗体及び抗ヒトトロポニンＴ抗体の固定
は、両抗体をミオグロビン検出領域及びトロポニンＴ検
出領域にそれぞれ分離して固定することとなる。
説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定され
るものではない。前述したように、本発明は、特にマー
カーとしてミオグロビン及びトロポニンＴを併用すれ
ば、障害初期から出現するミオグロビンと、心筋特異性
が高く異常値持続時間の長いトロポニンＴの２項目を同
時にモニタリングすることで、障害初期からのモニタリ
ングを可能とするので、本実施例においては、測定チッ
プ上に抗ヒトミオグロビン抗体及び抗ヒトトロポニンＴ
抗体の両抗体を固定したものを示すこととする。抗ヒト
ミオグロビン抗体及び抗ヒトトロポニンＴ抗体の固定
は、両抗体をミオグロビン検出領域及びトロポニンＴ検
出領域にそれぞれ分離して固定することとなる。
【００３５】
【実施例】本実施例では、図１に示されるような構成を
有する測定チップを作製した。透明基板としては、18mm
×18mm、厚さ0.17mmのカバーグラス（松浪硝子工業社
製）を使用した。この透明基板上に、スパッタリングに
よりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し
た。スパッタリングは、クロムについては100 Ｗ，30秒
間、金については100 Ｗ，150 秒間で行った。得られた
クロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åで
あった。
有する測定チップを作製した。透明基板としては、18mm
×18mm、厚さ0.17mmのカバーグラス（松浪硝子工業社
製）を使用した。この透明基板上に、スパッタリングに
よりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し
た。スパッタリングは、クロムについては100 Ｗ，30秒
間、金については100 Ｗ，150 秒間で行った。得られた
クロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åで
あった。
【００３６】上記の金属膜を有する透明基板を、シラン
カップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機
ケイ素膜を形成させた。まず、φ200のガラスシャーレ
に原液のままのγ−アミノプロピルエトキシシラン（H2
N-(CH2)3Si(OEt)3、東芝シリコーン（株）TSL 8331 ）
を30ｍl 入れ、室温で24時間放置し、シャーレ内部をγ
−アミノプロピルエトキシシランの飽和蒸気で満たし
た。次に、上記で作製した透明基板を金属膜部分が露出
するようにアルミ製のマスク（支持具）に固定し、この
マスクをシャーレの開口部に載せ、60分間放置し、カバ
ーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を形成させ、測定チ
ップを作製した。
カップリング剤の飽和蒸気中に暴露し、金属膜上に有機
ケイ素膜を形成させた。まず、φ200のガラスシャーレ
に原液のままのγ−アミノプロピルエトキシシラン（H2
N-(CH2)3Si(OEt)3、東芝シリコーン（株）TSL 8331 ）
を30ｍl 入れ、室温で24時間放置し、シャーレ内部をγ
−アミノプロピルエトキシシランの飽和蒸気で満たし
た。次に、上記で作製した透明基板を金属膜部分が露出
するようにアルミ製のマスク（支持具）に固定し、この
マスクをシャーレの開口部に載せ、60分間放置し、カバ
ーグラスの金属膜上に有機ケイ素膜を形成させ、測定チ
ップを作製した。
【００３７】この測定チップを、市販の表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社
製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置し
た。このセンサーは図４に示すような構造を有する。こ
のセンサーの測定セルに５％グルタルアルデヒドを流速
１μl/分で20分間流し込み、次いで、それぞれのチャン
ネルに１mg/ml の抗ヒトミオグロビン抗体及び抗ヒトト
ロポニンＴ抗体を流速１μl/分で10時間流し込み、有機
ケイ素膜の表面に抗ヒトミオグロビン抗体及び抗ヒトト
ロポニンＴ抗体を固定化した。その後固定化した抗体を
ブロッキングするために常法に基づきＢＳＡを用いた。
次いで固定されていない余分な抗体を洗い流すために、
0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定セルに流し
込んだ。
共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社
製、BIAcore2000 ）のカートリッジブロック上に設置し
た。このセンサーは図４に示すような構造を有する。こ
のセンサーの測定セルに５％グルタルアルデヒドを流速
１μl/分で20分間流し込み、次いで、それぞれのチャン
ネルに１mg/ml の抗ヒトミオグロビン抗体及び抗ヒトト
ロポニンＴ抗体を流速１μl/分で10時間流し込み、有機
ケイ素膜の表面に抗ヒトミオグロビン抗体及び抗ヒトト
ロポニンＴ抗体を固定化した。その後固定化した抗体を
ブロッキングするために常法に基づきＢＳＡを用いた。
次いで固定されていない余分な抗体を洗い流すために、
0.1 Ｎの塩酸５μl を流速５μl/min で測定セルに流し
込んだ。
【００３８】抗体を固定化した測定チップを設置した測
定セルに、0.01、0.1、1、10、又は100 ｐｐｍのヒトミ
オグロビン（１０〜３０００ｎｇ／ｍｌ）及びヒトトロ
ポニンＴ（２.０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を各々流速５μl
/分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル
（RU）を求めた。この結果を図５及び図６に示す。
定セルに、0.01、0.1、1、10、又は100 ｐｐｍのヒトミ
オグロビン（１０〜３０００ｎｇ／ｍｌ）及びヒトトロ
ポニンＴ（２.０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を各々流速５μl
/分で10分間流しながら光強度を測定し、共鳴シグナル
（RU）を求めた。この結果を図５及び図６に示す。
【００３９】図５及び図６に示すように、試料濃度と共
鳴シグナルに正比例に類似した右肩上がりの関係がみら
れた。これは、抗体の特異的反応に起因するものである
ものと推測される。これより、本実施例による測定チッ
プを用いれば、共鳴シグナルの値を測定することにより
抗原を定量することができる。
鳴シグナルに正比例に類似した右肩上がりの関係がみら
れた。これは、抗体の特異的反応に起因するものである
ものと推測される。これより、本実施例による測定チッ
プを用いれば、共鳴シグナルの値を測定することにより
抗原を定量することができる。
【００４０】
【発明の効果】本発明は、良好な感度で小型であり、全
血を遠心分離することなく、そのまま使用することがで
き、操作も簡単で精度高く、心筋梗塞のマーカー、特に
ヒトミオグロビン及び／又はヒトトロポニンＴをノンラ
ベルで測定することができる。
血を遠心分離することなく、そのまま使用することがで
き、操作も簡単で精度高く、心筋梗塞のマーカー、特に
ヒトミオグロビン及び／又はヒトトロポニンＴをノンラ
ベルで測定することができる。
【図１】本発明の一例による測定チップの概略断面図で
ある。
ある。
【図２】本発明の他の例による測定チップの概略断面図
である。(a) は抗体のＦａｂフラグメントを固定化した
例、(b) は抗体のＦ(ａｂ')2 フラグメントを固定化し
た例を示す図である。
である。(a) は抗体のＦａｂフラグメントを固定化した
例、(b) は抗体のＦ(ａｂ')2 フラグメントを固定化し
た例を示す図である。
【図３】本発明の別の例による測定チップの概略断面図
である。
である。
【図４】本発明の測定チップに使用する表面プラズモン
共鳴バイオセンサーの概念図である。
共鳴バイオセンサーの概念図である。
【図５】ミオグロビン濃度と共鳴シグナルとの関係を示
すグラフである。
すグラフである。
【図６】トロポニンＴ濃度と共鳴シグナルとの関係を示
すグラフである。
すグラフである。
１，１'…透明基板 ２…金属膜 ２'…金属膜 ３…有機ケイ素膜 ４，４'…マーカー（抗体） ６…共有結合膜 ７…カートリッジブロック 71…測定セル 72，73…流路 ８…光源 80…入射光 ９…検出器 90…反射光 10…測定チップ
Claims (12)
- 【請求項１】 透明基板、該透明基板上に配置される金
属膜、該金属膜上に固定される、心筋梗塞マーカーに対
する抗体を備えていることを特徴とする表面プラズモン
共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項２】 金属膜上に配置される有機ケイ素膜を有
し、該有機ケイ素膜上に心筋梗塞マーカーに対する抗体
が固定されていることを特徴とする請求項１に記載の表
面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項３】 前記心筋梗塞マーカーに対する抗体が抗
ヒトミオグロビン抗体、抗ヒトトロポニン抗体であるこ
とを特徴とする、請求項１又は２記載の表面プラズモン
共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項４】 前記有機ケイ素膜がシランカップリング
剤により形成された膜であることを特徴とする、請求項
１又は２記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測
定チップ。 - 【請求項５】 前記シランカップリング剤が３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項４記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ。 - 【請求項６】 前記有機ケイ素膜と前記心筋梗塞マーカ
ーに対する抗体との間に、さらに水溶性二価性試薬によ
り形成した層が設けられていることを特徴とする、請求
項１又は２記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用
測定チップ。 - 【請求項７】 前記水溶性二価性試薬が、グルタルアル
デヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレ
イミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−ス
クシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４
−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミ
ドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スル
ホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４
−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド・ナ
トリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）ス
ルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイ
ミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム
塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）スルホ
スクシンイミド・ナトリウム塩及びＮ［２−（１−ピペ
ラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸からなる群から
選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求
項６に記載の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップ。 - 【請求項８】 透明基板上に金属膜を配置した後、該金
属膜の上に有機ケイ素膜を配置し、次いで該有機ケイ素
膜上に心筋梗塞マーカーに対する抗体を配置することを
特徴とする、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定
チップの製造方法。 - 【請求項９】 前記有機ケイ素膜をシランカップリング
剤を用いて形成させることを特徴とする、請求項８記載
の表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製
造方法。 - 【請求項１０】 シランカップリング剤が、３−アミノ
プロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリ
メトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチル
シラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリ
メトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピ
ル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピル
トリメトキシシラン及びジメトキシ−３−メルカプトプ
ロピルメチルシランからなる群から選ばれた少なくとも
１種であることを特徴とする、請求項９記載の表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１又は２に記載の測定用チップ
を用いて心筋梗塞マーカーを測定する方法。 - 【請求項１２】 全血をそのまま表面プラズモン共鳴バ
イオセンサー用測定チップに投与することを特徴とする
請求項１１に記載の心筋梗塞マーカーを測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17486897A JPH1123575A (ja) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | 心筋梗塞マーカーを測定する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17486897A JPH1123575A (ja) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | 心筋梗塞マーカーを測定する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1123575A true JPH1123575A (ja) | 1999-01-29 |
Family
ID=15986069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17486897A Pending JPH1123575A (ja) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | 心筋梗塞マーカーを測定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1123575A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014054389A1 (ja) | 2012-10-03 | 2014-04-10 | コニカミノルタ株式会社 | 表面プラズモンを利用した免疫測定方法 |
-
1997
- 1997-06-30 JP JP17486897A patent/JPH1123575A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014054389A1 (ja) | 2012-10-03 | 2014-04-10 | コニカミノルタ株式会社 | 表面プラズモンを利用した免疫測定方法 |
| JPWO2014054389A1 (ja) * | 2012-10-03 | 2016-08-25 | コニカミノルタ株式会社 | 表面プラズモンを利用した免疫測定方法 |
| US10228326B2 (en) | 2012-10-03 | 2019-03-12 | Konica Minolta, Inc. | Immunoassay method utilizing surface plasmon |
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