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JPH11187900A - プローブの固相へのスポッティング方法、プローブアレイとその製造方法、及びそれを用いた標的物質の検出方法、標的物質の構造の特定化方法 - Google Patents

プローブの固相へのスポッティング方法、プローブアレイとその製造方法、及びそれを用いた標的物質の検出方法、標的物質の構造の特定化方法

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JPH11187900A
JPH11187900A JP10209923A JP20992398A JPH11187900A JP H11187900 A JPH11187900 A JP H11187900A JP 10209923 A JP10209923 A JP 10209923A JP 20992398 A JP20992398 A JP 20992398A JP H11187900 A JPH11187900 A JP H11187900A
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JP
Japan
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probe
nucleic acid
solid phase
group
stranded nucleic
Prior art date
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JP10209923A
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English (en)
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JP4313861B2 (ja
Inventor
Nobuko Yamamoto
伸子 山本
Hisashi Okamoto
尚志 岡本
Tomohiro Suzuki
智博 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Canon Inc
Original Assignee
Canon Inc
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Priority to EP03076692A priority patent/EP1352976B1/en
Priority to CA2244403A priority patent/CA2244403C/en
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 高密度で効率良くプローブを固相表面にスポ
ッティングする方法を提供する。 【解決手段】 プローブを含む液体をインクジェット法
により液滴として固相に付着させて、プローブを含むス
ポットを固相上に形成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はプローブを固相にス
ポッティングする方法、プローブアレイ、その製造方
法、そしてプローブアレイを用いた標的一本鎖核酸の検
出方法、及び標的一本鎖核酸の塩基配列の特定化方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の塩基配列の決定やサンプル中の標
的核酸の検出、各種細菌の同定を迅速、正確に行ない得
る技術の一つとして、例えば該標的核酸と特異的に結合
し得る物質、いわゆるプローブを固相上に多数並べたプ
ローブアレイの使用が提案されている。
【０００３】このようなプローブアレイの一般的な製造
方法としては、例えばヨーロッパ特許第３７３２０３号
公報（ＥＰ０３７３２０３Ｂ１）に記載されている様に
（１）固相上で核酸プローブを合成していく方法、や
（２）予め合成した核酸プローブを固相上に供給する方
法等が知られている。上記の（１）の方法の詳細が開示
されている先行技術としては例えば米国特許第５４０５
７８３号公報（ＵＳＰ５４０５７８３）が挙げられる。
【０００４】また上記（２）の方法としては、例えば米
国特許第５６０１９８０号公報（ＵＳＰ５６０１９８
０）や「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２７０
巻、４６７頁、（１９９５）にはマイクロピペッティン
グを用いてｃＤＮＡをアレイ状に並べる方法が開示され
ている。
【０００５】ところで上記（１）の方法は、固相上で直
接核酸プローブを合成させている為、予め核酸プローブ
を合成する必要がない。しかし固相上で合成されたプロ
ーブ核酸を精製することは困難である。プローブアレイ
を用いた核酸塩基の配列決定や、サンプル中の標的核酸
の検出等の精度は、核酸プローブの塩基配列の精度に大
きく依存する。従って上記（１）の方法は、より高品質
なプローブアレイの製法としては核酸プローブの精度の
向上に更なる改良が求められるところである。
【０００６】一方、上記（２）の方法は、核酸プローブ
の固相への固定に先立って核酸プローブの合成ステップ
が必要となる反面、固相への結合に先立って核酸プロー
ブを精製することができる。この理由により現段階にお
いては、より高品質なプローブアレイの製法としては上
記（２）の方法は、上記（１）の方法よりも好ましいと
考えられる。
【０００７】しかし上記（２）の方法の課題は、核酸プ
ローブを固相に高密度にスポッティングする方法にあ
る。例えばプローブアレイを用いて核酸の塩基配列決定
を行なう場合、できる限り多種の核酸プローブを固相上
に配置しておくことが好ましい。また遺伝子の変異の検
出を効率的に行なう場合には、それぞれの変異に対応し
た配列を有する核酸プローブを固相上に配置させておく
事が好ましい。さらに、サンプル中の標的核酸の検出
や、遺伝子の変異、欠損の検出に当たっては、被験者か
らのサンプルの採取、具体的には血液等の採取はできる
限り少量に止めておくことが好ましく、よって少量の検
体でできる限り多くの塩基配列の情報を獲得できること
が好ましい。これらの点から考えるとプローブアレイに
は例えば、１インチ角に１００００以上の核酸プローブ
が配置されていることが好ましい。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らはこのよう
な状況の下で種々検討を行なった結果、インクジェット
吐出技術を用いて、極めて高密度にプローブをスポッテ
ィングすることが出来ることを見出し本発明を為すに至
った。
【０００９】そして本発明の目的は、極めて微量のプロ
ーブを、該プローブに損傷を与える事なく且つ効率的に
固相上に正確にスポッティングする方法を提供すること
にある。
【００１０】また本発明の他の目的は、少量の検体から
でも核酸に関するより多くの情報をより正確に検査可能
なプローブアレイを提供することにある。
【００１１】また本発明の更に他の目的は、プローブが
固相上に多数結合しているプローブアレイを、プローブ
を損傷することなく、また効率良く製造する方法を提供
することにある。
【００１２】更に本発明の他の目的は、サンプル中に含
まれている可能性のある標的物質を効率的に検出する方
法を提供することにある。
【００１３】更にまた本発明の他の目的は、少量の検体
からでも標的物質の構造に関する情報を獲得可能な標的
物質の構造の特定化方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するこ
とのできる、本発明の一実施態様にかかるスポッティン
グ方法は、標的物質に対して特異的に結合可能であるプ
ローブを含む液体をインクジェット法により固相表面に
供給し、該固相表面に付着させる工程を有することを特
徴とするものである。
【００１５】上記態様にかかるスポッティング方法を用
いることによってプローブを固相上に正確に、且つ効率
的に付与することができ、プローブアレイを効率的に製
造することが出来るものである。
【００１６】また本発明の一実施態様にかかるプローブ
アレイは、固相表面の複数の部位に互いに独立している
プローブのスポットを１平方インチ内に１００００個以
上の密度で備えていることを特徴とするものである。上
記態様にかかるプローブアレイによればスポットを極め
て高密度に有していることから、少量の検体からでも多
くの情報を得ることができる。
【００１７】また本発明の一実施態様にかかるプローブ
アレイの製造方法は、固相表面の複数の箇所に独立し
て、標的物質に対して特異的に結合可能であるプローブ
を含むスポットを有するプローブアレイの製造方法であ
って、該プローブを含む液体をインクジェット法を用い
て該固相表面の所定の位置に供給し、付着させる工程を
有することを特徴とするものである。この態様によれば
プローブを損なうことなしにスポットが高密度に配置さ
れたプローブアレイを効率的に製造することができるも
のである。
【００１８】また上記の目的を達成することのできる、
本発明の一実施態様にかかる標的物質の検出方法は、サ
ンプル中に含まれている可能性のある標的物質に対して
特異的に結合するプローブを固相上に互いに独立した複
数のスポットとして有するプローブアレイの各々のスポ
ットと該サンプルとを接触させ、該固相上にて該標的物
質及びプローブとの反応物を検出して該サンプル中の該
標的物質の有無を検出する方法において、該スポットの
各々が、該プローブを含む液体をインクジェット法によ
って固相上にスポッティングすることによって形成され
たものであることを特徴とするものである。この態様に
よれば標的物質を効率的に検出することができるもので
ある。
【００１９】更に上記の目的を達成することのできる、
本発明の一実施態様にかかる標的物質の構造の特定化方
法は、試料中に含まれる標的物質の構造を特定する方法
であって、固相表面に該特定の物質に対して特異的に結
合するプローブのスポットを備えたプローブアレイを用
意する工程；該試料を該スポットに接触させる工程；及
び該標的物質と該プローブとの結合を検出する工程、を
有することを特徴とするものである。この態様を用いる
ことによって少量の検体からでも該検体中の標的物質の
構造、例えば標的物質が一本鎖核酸の場合にはその塩基
配列の特定を効率的に行なうことができるものである。
【００２０】なおＵＳＰ５６０１９８０号公報には核酸
プローブのスポッティングにはコンベンショナルなイン
クジェット技術を用いることは適当でないと認定されて
いる。即ちＵＳＰ５６０１９８０号公報の第２欄の第３
１行〜第５２行目には、圧力波（pressure wave）によ
って少量のインクを吐出させるインクジェットプリンタ
技術の利用が適当でないと記載され、その理由としてイ
ンク吐出の為の圧力波がインク温度の急激な温度上昇を
招き、核酸プローブに損傷を与える可能性が有り、また
吐出時のインクの飛び散りが隣接する核酸プローブのス
ポット同士のコンタミネーションを引き起こす危険性を
挙げている。その上でＵＳＰ５６０１９８０号公報にお
いては、ガス圧を利用してマイクロピペットの先端に核
酸プローブを含む液体の滴を、該滴のサイズをモニター
しつつ形成させ、所定のサイズに達した時点で圧力印加
を止め、該滴を固相上に供給してプローブアレイを製造
する方法を開示している。
【００２１】またＵＳＰ５４７４７９６号公報には、固
相表面に疎水性及び親水性のマトリクスを形成し、その
親水性部分に４種類の塩基をピエゾエレクトリックイン
パルスジェットポンプ装置（Piezoelectric Impulse Je
t Pump Apparatus）を用いて順次吐出せしめて、オリゴ
ヌクレオチドアレイを製造すること、そしてそれを用い
て標的核酸の塩基配列を決定する方法が開示されてい
る。
【００２２】しかしこれらの先行技術には、予め所定の
長さの塩基配列を有する核酸プローブをインクジェット
技術を用いて吐出させて、核酸プローブを高密度に、且
つ正確に配列せしめる技術については何ら開示されてい
ない。
【００２３】
【発明の実施の形態】（プローブアレイ製法概略）図１
及び図２は本発明に係るプローブアレイ、例えば核酸プ
ローブアレイの製造方法の概略説明図である。図１にお
いて１０１は吐出液としてのプローブ、例えば核酸プロ
ーブを含む液体を吐出可能に保持している液体供給系
（ノズル）、１０３は該核酸プローブが結合されるべき
固相（例えば透明ガラス板等）、１０５はインクジェッ
トヘッドの一種である、該液体に熱エネルギーを付与し
て吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドであ
る。１０４はバブルジェットヘッド１０５から吐出され
た核酸プローブを含む液体である。また図２は、図１の
バブルジェットヘッド１０５のＡ−Ａ線断面図であり、
図２において１０５はバブルジェットヘッド、１０７は
吐出されるべき核酸プローブを含む液体、そして１１７
は該液体に吐出エネルギーを付与する発熱部を有する基
板部分である。基板部分１１７は、酸化シリコン等で形
成されている保護膜１０９、アルミニウム等で形成され
ている電極１１１−１、１１１−２、ニクロム等で形成
されている発熱抵抗体層１１３、蓄熱層１１５及び放熱
性の良好なアルミナ等で形成されている支持体１１６を
含んでいる。
【００２４】核酸プローブを含む液体１０７は吐出オリ
フィス（吐出口）１１９まできており、所定の圧力によ
ってメニスカス１２１を形成している。ここで電極１１
１−１、１１１−２に電気信号が加わると、１２３で示
す領域（発泡領域）が急激に発熱し、ここに接している
液体１０７に気泡が発生し、その圧力でメニスカスが吐
出し、オリフィス１１９から液体１０７が吐出し、固相
１０３の表面に向って飛翔する。このような構造を備え
るバブルジェットヘッドを用いて吐出可能な液体の量
は、そのノズルのサイズ等によって異なるが、例えば４
〜５０ピコリットル程度に制御することが可能であり、
高密度に核酸プローブを配置させる手段として極めて有
効である。 （吐出液と固相の関係） （固相上でのスポット直径）核酸プローブの固相上での
密度を上記した様な値（例えば１インチ各に１００００
個以上、上限としては１×１０6 個程度）にするために
は各々の核酸プローブのスポット径は、例えば２０〜１
００μｍ程度であることが好ましく、また互いのスポッ
トが互いに独立していることが好ましい。そしてこのよ
うなスポットは、バブルジェットヘッドから吐出される
液体の特性、及び該液体が付着する固相の表面特性等に
よって決定される。
【００２５】（吐出液の特性）吐出用の液体としては、
バブルジェットヘッドから吐出可能であって、且つヘッ
ドから吐出された該液体が固相上の所望の位置に着弾
し、更に核酸プローブとの混合状態、及び吐出時におい
て該核酸プローブが損傷を受けなければいかなる液体で
も用いることができる。
【００２６】そしてバブルジェットヘッドからの吐出性
という観点からは、該液体の特性としては例えば、その
粘度が１〜１５ｃｐｓ、表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ以
上が好ましい。また粘度を１〜５ｃｐｓ、表面張力を３
０〜５０ｄｙｎ／ｃｍとした場合、固相上での着弾位置
が極めて正確なものとなり特に好適に用いられる。
【００２７】次に該液体のインクジェット吐出特性、及
び液体中及びバブルジェット吐出時の核酸プローブの安
定性を考慮すると、液体中には例えば２ｍｅｒ〜５００
０ｍｅｒ、特には２ｍｅｒ〜６０ｍｅｒの核酸プローブ
を、０．０５〜５００μＭ、特には２〜５０μＭの濃度
で含有させることが好ましい。
【００２８】（吐出液組成）バブルジェットヘッドから
吐出される液体の組成としては、上記した様に核酸プロ
ーブと混合したとき、及びバブルジェットヘッドから吐
出させたときに核酸プローブに対して影響を実質的に与
えないものであって、且つバブルジェットヘッドを用い
て固相に対して正常に吐出可能である液体組成が好まし
い条件を満たせば、特に限定されるものでないが、例え
ばグリセリン、尿素、チオジグリコール又はエチレング
リコール、イソプロピルアルコール及び下記式（Ｉ）で
示されるアセチレンアルコールを含む液体は好ましいも
のである。
【００２９】
【化５】
【００３０】（上記式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4
はアルキル基、具体的には例えば炭素数１〜４の直鎖状
または分岐鎖状のアルキル基を表わし、ｍ及びｎは各々
整数を表わし、ｍ＝０且つｎ＝０、もしくは１≦ｍ＋ｎ
≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の場合はｍまたはｎは０で
ある。） 更に具体的には尿素を５〜１０ｗｔ％、グリセリンを５
〜１０ｗｔ％、チオジグリコールを５〜１０ｗｔ％、及
び上記式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコールを０．
０２〜５ｗｔ％、より好ましくは０．５〜１ｗｔ％を含
む液体が好適に用いられる。
【００３１】この液体を用いた場合、バブルジェットヘ
ッドから核酸プローブを含む液体を吐出させて固相上に
付着させたときのスポットの形状が円形で、また吐出さ
れた範囲が広がることがなく、高密度に核酸プローブを
スポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連
結を有効に抑えることができる。更に固相上にスポッテ
ィングされた核酸プローブの変質も認められない。なお
本発明の核酸プローブアレイの製造に用いる液体の特性
は上記のものに限定されるものではない。例えば固相表
面に、バブルジェットヘッドで固相上に付与した液体
が、該固相上で広がり、そして隣接するスポットとの間
で混合してしまうのを防ぐような、ウェルのような構造
を設けた場合には、液体の粘度や表面張力、更には核酸
プローブの塩基長や濃度も上記の範囲外であっても用い
ることができる。
【００３２】（固相と核酸の官能基の種類）固相上に付
着せしめた核酸プローブのスポットを更に限定された位
置に止めさせ、隣接するスポットとのコンタミネーショ
ンをより確実に防ぐ為に有効であり、かつ核酸プローブ
を固相上に強固に結合させるのに有効な手段として、核
酸プローブと固相との双方に互いに反応可能な官能基を
結合させる方法が挙げられる。
【００３３】（ＳＨ基とマレイミド基）好ましい例とし
ては例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との
組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの
末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表
面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、
固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相
表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化
し、その結果核酸プローブのスポットを固相上の所定の
位置に形成することができる。特に末端にチオール基を
有する核酸プローブを上記した組成の液体に溶解させた
ものをバブルジェットヘッドを用いてマレイミド基を導
入した固相表面に付与した場合、核酸プローブ溶液は固
相上に極めて小さなスポットを形成する。その結果、核
酸プローブの小さなスポットを固相表面の所定の位置に
形成することができる。この場合、固相表面に例えば親
水性及び疎水性のマトリクスからなるウェルを形成し、
スポット間の連結を防止する様な構成を予め設けておく
必要性は認められない。
【００３４】例えば塩基長１８ｍｅｒの核酸プローブを
濃度８μＭで含む、粘度や表面張力が前記した範囲内と
なるように調整した液体を、バブルジェットプリンタ
（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製、但し平
板に印字可能に改造したもの）を用いて、固相とバブル
ジェットヘッドのノズルの間隔を１．２〜１．５ｍｍ程
度に設定し、該ノズルから吐出させた場合（吐出量は約
２４ピコリットル）、固相上には直径約７０〜１００μ
ｍ程度のスポットを形成することができ、また液体が固
相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット（以降
「サテライトスポット」と称する）は目視では全く認め
られなかった。該固相上のマレイミド基と核酸プローブ
末端のＳＨ基との反応は、吐出される液体の条件にもよ
るが、室温（２５℃）下で３０分程度で完了する。なお
この時間は液体の吐出にピエゾジェットヘッドを用いた
場合と比較して短い。その理由は明らかでないが、バブ
ルジェット法ではその原理によりヘッド内の核酸プロー
ブを含む液体の温度が上昇し、その結果マレイミド基と
チオール基の反応効率が上昇して反応時間が短縮される
ものと考えられる。
【００３５】なお、マレイミド基とチオール基との組合
せを用いる場合、核酸プローブを含む溶液にチオジグリ
コールを含有させることが好ましい。チオール基は中性
及び弱アルカリ性条件下ではジスルフィド結合（−Ｓ−
Ｓ−）を形成し、二量体をなることがある。しかし、チ
オジグリコールを加えることで、二量体形成によるチオ
ール基とマレイミド基との反応性の低下を防ぐことがで
きる。
【００３６】固相表面へのマレイミド基の導入方法とし
ては、種々の方法が利用できるが、例えばガラス基板に
アミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミ
ノ基と下記構造式で示されるＮ−（６−マレイミドカプ
ロイロキシ）スクシイミド（N-(6-Maleimidocaproylox
y）succinimide）を含む試薬（ＥＭＣＳ試薬：Ｄｏｊｉ
ｎ社製）とを反応させることで可能である。
【００３７】
【化６】
【００３８】またチオール基が結合した核酸プローブ
は、例えばＤＮＡ自動合成機を用いてＤＮＡを自動合成
する際に５’末端の試薬として５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏ
ｄｉｆｉｅｒＣ６（Glen Research社製）を用いる事に
より合成することができ、通常の脱保護反応の後、高速
液体クロマトグラフィーにより精製することで得られ
る。
【００３９】（アミノ基とエポキシ基）固定化に利用す
る官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマ
レイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固
相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が
挙げられる。固相表面へのエポキシ基の導入は、例えば
エポキシ基を有するポリグリシジルメタクリレートを樹
脂からなる固相表面に塗布したり、エポキシ基を有する
シランカップリング剤をガラス製の固相表面に塗布して
ガラスと反応させる方法等が挙げられる。
【００４０】上記したように固相表面と一本鎖核酸プロ
ーブの末端とに互いに反応して共有結合を形成するよう
な官能基を導入した場合、該核酸プローブと固相とがよ
り強固に結合される。また該核酸プローブの固相との結
合部位を常に末端とすることができる為、各々のスポッ
トでの核酸プローブの状態を均一にすることができる。
その結果各々のスポットにおける核酸プローブと標的核
酸とのハイブリダイゼーションの条件が揃うこととな
り、より一層精度の向上した標的核酸の検出や塩基配列
の特定が可能となるものと考えられる。更に末端に官能
基のついた核酸プローブと固相とを共有結合させる事
は、非共有結合（例えば静電的な結合等）によって固相
上に固定した核酸プローブに比べ、配列や長さの違いに
よるプローブＤＮＡの結合量の差を生じることなく定量
的にプローブアレイを作製できる。更にまた核酸の塩基
配列部分が全てハイブリダイゼーション反応に寄与する
為、ハイブリダイゼーション反応の効率を著しく上昇さ
せる事ができる。また一本鎖核酸プローブの標的核酸と
のハイブリダイゼーションに関与する部分と固相との反
応に関与する官能基との間にリンカー部分として例えば
炭素数１〜７程度のアルキレン基を導入しておいても良
い。これによって固相に核酸プローブを結合させたとき
に該固相表面と該核酸プローブとの間に所定の距離を設
けることができ、核酸プローブと標的核酸との反応効率
のより一層の向上が期待できる。
【００４１】（アレイの製法）次に本発明に係るプロー
ブアレイの製造方法の、現状における最も好ましい態様
の一つについて説明する。まず核酸プローブを分散させ
る液体としてグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ
％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、上記一般式（Ｉ）
で示される構造のアセチレンアルコール（例えば商品
名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）
社製）１ｗｔ％を含む液体を用意する。次に末端にチオ
ール基が結合している、長さが例えば２〜５０００ｍｅ
ｒ程度、特には２〜６０ｍｅｒ程度の一本鎖核酸プロー
ブをＤＮＡ自動合成機を用いて合成する。次いでこの核
酸プローブを上記液体に、例えば濃度が０．０５〜５０
０μＭ、特には２〜５０μＭの範囲で、該液体の粘度が
１〜１５ｃｐｓ、特には１〜５ｃｐｓ、また表面張力が
３０ｄｙｎ／ｃｍ以上、特には３０〜５０ｄｙｎ／ｃｍ
となるように混合し、吐出用の液体とする。そしてこの
吐出用液体を例えばバブルジェットヘッドのノズル内に
充填する。また固相には上記の方法に従って表面にマレ
イミド基を導入しておく。そして該固相と該バブルジェ
ットヘッドを、該固相のマレイミド基が結合している面
とバブルジェットヘッドのノズル面との距離が１．２〜
１．５ｍｍ程度にまで近接させ、該バブルジェットヘッ
ドを駆動させて該液体を吐出させる。ここで吐出条件と
しては固相上のスポットが互いに連結することがないよ
うな印字パターンに設定することが好ましい。例えばス
ポッティングに用いるバブルジェットヘッドの解像度が
３６０×７２０ｄｐｉの場合には、３６０ｄｐｉの方向
には１回吐出後２回空吐出させ、７２０ｄｐｉの方向に
は１回吐出後５回空吐出させるという条件でスポッティ
ングした場合、各々のスポット間のスペースは約１００
μｍとなり、隣接するスポットとのコンタミネーション
を十分に防ぐことが可能である。
【００４２】次いで固相上のマレイミド基と液体中の核
酸プローブのチオール基の反応が進み、該核酸プローブ
が固相に確実に固定されるまで該固相を例えば加湿チャ
ンバー内に静置する。この時間は上記したように例えば
室温（約２５℃）で３０分程度で十分である。その後固
相上にあって未反応の核酸プローブを洗い流して核酸プ
ローブアレイが得られる。
【００４３】ここでこの核酸プローブアレイを用いて、
例えば標的核酸の検出等を行なう場合の検出精度（Ｓ／
Ｎ比）の向上を図ることを目的として、該核酸プローブ
を固相表面に固定した後、該固相の核酸プローブ非結合
部分がサンプル中に含まれる標的核酸等と結合しないよ
うにブロッキングを行なうことが好ましい。ブロッキン
グは例えば、該固相を２％ウシ血清アルブミン水溶液中
に、例えば２時間程度浸したり、固相表面の核酸プロー
ブと結合していないマレイミド基を分解させることによ
って可能である。例えばＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル）、β−メルカプトエタノール等を用いても可能であ
る。しかし、標識ＤＮＡの吸着を防ぐ効果からすると、
ウシ血清アルブミン水溶液が最も適する。尚このブロッ
キングの工程は必要に応じて行なえば良く、例えばサン
プルの該プローブアレイへの供給を各々のスポットに対
して限定的に行ない、スポット以外の部位へのサンプル
の付着が実質的にない場合には行なわなくても良い。ま
た固相に予めウェルが形成され、そのウェル以外の部分
が核酸プローブが付着し難い様に加工されている場合に
もブロッキングの工程を省略することができる。
【００４４】この様にして作製するプローブアレイはそ
の用途に応じて、例えば同じ核酸プローブを含む複数の
スポットを有するように構成してもよく、また異種の核
酸プローブを各々含む複数のスポットを有する様に構成
してもよい。そしてこの様な方法によって核酸プローブ
が高密度に配置されたプローブアレイは、その後標的一
本鎖核酸の検出や、塩基配列の特定等に用いられる。例
えばサンプル中に含まれている可能性のある、塩基配列
が既知の標的一本鎖核酸の検出に用いる場合には、該標
的一本鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有
する一本鎖核酸をプローブとして用い、該プローブを含
む複数のスポットが固相上に配置されているプローブア
レイを用意し、該プローブアレイの各々のスポットに、
サンプルを供給して該標的一本鎖核酸と核酸プローブと
がハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々の
スポットにおけるハイブリッドの有無を蛍光検出等の既
知の方法で検出する。それによってサンプル中の標的物
質の有無の検出を行なうことができる。またサンプル中
に含まれている標的一本鎖核酸の塩基配列の特定に用い
る場合には、該標的一本鎖核酸の塩基配列の複数の候補
を設定し、該塩基配列群に対して各々相補的な塩基配列
を有する一本鎖核酸をプローブとして該固相にスポッテ
ィングする。次いで各々のスポットにサンプルを供給し
て該標的一本鎖核酸と核酸プローブとがハイブリダイズ
するような条件下に置いた後、各々のスポットにおける
ハイブリッドの有無を蛍光検出等の既知の方法で検出す
る。これにより標的一本鎖核酸の塩基配列の特定を行な
うことができる。また本発明に係わるプローブアレイの
他の用途としては、例えばＤＮＡ結合蛋白質が認識する
特異的な塩基配列のスクリーニングやＤＮＡに結合する
性質を有する化学物質のスクリーニングへの適用が考え
られる。
【００４５】（インクジェットヘッドの種類）なお上記
の説明においては、核酸プローブの固相への付与をバブ
ルジェットヘッドで行なう構成のみを説明したが、本発
明においてはピエゾ素子の振動圧を利用してノズル内の
液体を吐出せしめるピエゾジェットヘッドを用いること
も可能である。しかし前記した様にバブルジェットヘッ
ドを用いた場合、固相への結合反応が短時間で完了し、
またＤＮＡの二次構造も熱により解消されるため、次に
続くハイブリダイゼーション反応の効率をも上昇させる
ことができるという点で、バブルジェットヘッドは本発
明にとってより好適に用いられるインクジェットヘッド
である。
【００４６】更に２以上のスポット間で含有される核酸
プローブが異なる様に複数のヘッドを備えたインクジェ
ットヘッドを用いて複数のスポットを同時に固相上に形
成しても良い。 （ＰＮＡ／ＤＮＡ）ここまで、プローブの一例として核
酸プローブを用いて本発明を説明した。核酸プローブの
例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブ、リ
ボ核酸（ＲＮＡ）プローブ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）
プローブを含むものである。ＰＮＡはＤＮＡに含まれる
４種の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）
が糖−リン酸エステル主鎖ではなくてペプチド主鎖に結
合し、下記式（ＩＩ）に示される様な構造を有する合成
オリゴヌクレオチドである。
【００４７】
【化７】
【００４８】（式中「Ｂａｓｅ」はＤＮＡを構成する４
種類の塩基（アデニン、シトシン、チミン、グアニン）
の何れかを示す。またｐはＰＮＡの塩基長を表わす。） ＰＮＡは、例えばｔＢＯＣ型固相合成法やＦｍｏｃ型固
相合成法として知られている方法によって合成すること
ができる。そしてＰＮＡはＤＮＡやＲＮＡ等の天然のオ
リゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼやプロテアー
ゼ等の酵素に対する強い耐性を有し、血清中でも酵素的
開裂が殆ど、若しくは全く起らず安定である。また糖部
やリン酸基を有していない為、溶液のイオン強度の影響
を殆ど受けず、従ってＰＮＡと標的一本鎖核酸とを反応
させる際の塩濃度等の調整を行なう必要がなく、更には
静電的な反発が無いためにＤＮＡプローブと標的一本鎖
核酸とのハイブリッドやＲＮＡプローブと標的一本鎖核
酸とのハイブリッドと比較してＰＮＡと標的一本鎖核酸
とのハイブリッドのほうが熱安定性に優れているとも考
えられている。そしてこれらの特性から標的核酸の検出
や塩基配列の決定に用いるプローブとして有望なもので
ある。そして前記した本発明に係る核酸プローブアレイ
の製造方法は、核酸プローブとしてＰＮＡプローブを適
用した場合にも有効であり、ＰＮＡプローブが高密度
に、且つ高精度に配置されたＰＮＡプローブアレイを容
易に製造することができる。具体的には、例えばＰＮＡ
プローブを固相上の限定された位置に止めさせてプロー
ブアレイの高密度化を図る方法としてはＤＮＡプローブ
やＲＮＡプローブと同様に、ＰＮＡプローブの末端と固
相表面との各々に互いに反応性を有する官能基を導入す
る方法を用いることができ、反応性の基の好ましい組合
わせの一つは上述したのと同様のチオール基（ＰＮＡ末
端）とマレイミド基（固相表面）の組合わせである。Ｐ
ＮＡ末端へのチオール基の導入は、例えばＰＮＡプロー
ブのＮ末端（ＤＮＡの５’末端に相当）にチオール基を
含むシステイン（CH(NH2)(COOH)CH2SH）基等を導入する
ことで達成される。ＰＮＡプローブのＮ末端へのシステ
インの導入は、例えばＰＮＡプローブのＮ末端のアミノ
基とシステインのカルボキシル基を反応させることによ
って行なうことができる。またＰＮＡプローブのＮ末端
のアミノ基と例えばN2H(CH2)2O(CH2)2OCH2COOHのように
アミノ基及びカルボキシル基を有している様な適当なリ
ンカーのカルボキシル基とを反応させ、次いで該リンカ
ーのアミノ基とシステインのカルボキシル基とを反応さ
せることでリンカーを介してＰＮＡプローブのＮ末端に
システインを結合させることもできる。この様にリンカ
ーを介して固相との結合基を導入した場合、ＰＮＡプロ
ーブの標的物質との反応部位を固相から所定の距離だけ
離間させることができ、ハイブリダイゼーション効率の
より一層の向上が期待される。
【００４９】またＰＮＡはその塩基長によっては水に対
する溶解性が同じ塩基長のＤＮＡと比較すると低い場合
があり、インクジェット吐出用の液体を調製する際には
ＰＮＡを予めトリフルオロ酢酸（例えば０．１ｗｔ％ト
リフルオロ酢酸水溶液等）等に溶解させた後、前記した
種々の溶媒を用いてインクジェット吐出に適合する特性
に調製することが好ましい。特にトリフルオロ酢酸に溶
解させておくことは、ＰＮＡ末端のシステイン残基中の
チオール基の酸化によるシスチンへの変性を防ぎ、ＰＮ
Ａのチオール基と固相表面のマレイミド基との反応効率
のより一層の向上を図る上で好ましい。またＤＮＡプロ
ーブやＲＮＡプローブの末端に導入したチオール基と固
相表面のマレイミド基の反応時間は前記した様に３０分
（バブルジェットヘッドを用いた場合）で十分である
が、ＰＮＡの場合にはバブルジェットヘッドを用いた場
合であっても２時間程度反応させることが好ましい。
【００５０】更にプローブとしては核酸プローブに限定
されず、検出・分析対象となるサンプル中の標的物質と
特異的に結合し得る物質、例えばレセプターと特異的に
結合可能なリガンド、リガンドと特異的に結合可能なレ
セプター、特定のアミノ酸配列を有するオリゴペプチド
またはポリペプチドと結合可能なオリゴペプチドやポリ
ペプチド、更にはタンパク質（例えば抗体、抗原、酵素
等）等をプローブとして用いることができる。この場
合、いずれも蛋白質に含まれているシステイン残基のＳ
Ｈ基を反応に利用することができる。
【００５１】以上説明した様にインクジェット吐出プロ
セスを用いてプローブ溶液を固相に供給する工程を含む
プローブアレイの製造方法によれば、プローブアレイを
極めて容易に形成することができる。特に核酸プローブ
と固相表面との間で共有結合が形成される様に各々に官
能基を導入した場合には、固相表面に予めウェル等を有
しない、即ち実質的に平坦で且つ表面特性（水に対する
濡れ易さ等）が均一な固相を用いても隣接するスポット
同士が連結してしまうことがない。その結果核酸プロー
ブが精度良く、且つ高密度に配列された核酸プローブア
レイを極めて効率的に、しかも低コストで製造すること
ができる。
【００５２】なおこのことは本発明において表面にウェ
ルを備えた固相を用いることを何ら排除するものではな
い。例えばプローブ溶液が供給されるウェルの間に光不
透過性のマトリクスパターン（以降「ブラックマトリク
ス」と称する）を予め形成しておいた場合、固相上での
プローブと標的物質とのハイブリダイゼイションを光学
的に検出（例えば蛍光の検出）する様な場合の検出精度
（ＳＮ比）をより一層向上させることができる。また隣
接するウェルの間に、表面がプローブ溶液に対する親和
性の低いマトリクスを設けておいた場合、プローブ溶液
のウェルへの供給にあたって多少の位置ずれが生じたと
しても所望のウェルにスムーズにプローブ溶液を供給す
ることができる。このような効果を利用することを目的
として表面にウェルを備えた固相を用いてもよい。以下
に表面にマトリクスを有する固相、その製造方法及び該
固相の本実施態様における使用方法について説明する。
【００５３】図５に、本態様におけるプローブアレイの
一例を示す。図５（Ａ）は平面図であり、図５（Ｂ）は
そのＢＢ断面図である。このプローブアレイは、固相１
０３上にマトリクス状に配置された凹部（ウェル）１２
７を形成した枠体構造を有するマトリクスパターン１２
５を設けた構造を有する。マトリクス１２５（凸部）に
よって互いに隔離されたウェル１２７は、マトリクスパ
ターン中の貫通孔（くり抜き部）として設けられたもの
で、その側壁は凸部からなり、その底面１２９には固相
１０３の表面が露出した状態にある。固相１０３の表面
露出部分は、プローブと結合可能な表面を形成してお
り、所定の凹部にプローブ（不図示）が固定されてい
る。
【００５４】マトリクスパターンを形成する材料は、プ
ローブと標的物質との反応物を光学的に検出、例えば、
反応物の発する蛍光を測定して検出する方法を用いる場
合には、検出感度、Ｓ／Ｎ比及び信頼性の向上を考慮す
ると遮光性を有するものが望ましい。そのような材料と
しては、例えば金属（クロム、アルミ、金等）及び黒色
の樹脂等が挙げられる。該黒色の樹脂としては、アクリ
ル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、
ポリイミド、アクリル酸モノマー、ウレタンアクリレー
ト等の樹脂や、フォトレジスト等の感光性の樹脂に黒色
の染料や黒色の顔料を含有させたものが挙げられる。感
光性樹脂の具体例としては、例えばＵＶレジスト、ＤＥ
ＥＰ−ＵＶレジスト、紫外線硬化樹脂等を用いることが
できる。ＵＶレジストとしては、環化ポリイソプレン−
芳香族ビスアジド系レジスト、フェノール樹脂−芳香族
アジド化合物系レジスト等のネガレジスト、ノボラック
樹脂−ジアゾナフトキノン系レジスト等のポジレジスト
を挙げることができる。
【００５５】ＤＥＥＰ−ＵＶレジストとしては、ポジ型
レジストとして、例えば、ポリメチルメタクリレート、
ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフルオロブチルメタ
クリレート、ポリメチルイソプロペニルケトン、およ
び、臭化ポリ１−トリメチルシリルプロピン等の放射線
分解型ポリマーレジスト、コール酸ｏ−ニトロベンジル
エステル等の溶解抑制剤系レジスト等を挙げることがで
き、ネガ型レジストとして、ポリビニルフェノール−
３，３’−ジアジドジフェニルスルホン、および、ポリ
メタクリル酸グリシジル等を挙げることができる。
【００５６】紫外線硬化樹脂としては、ベンゾフェノ
ン、および、その置換誘導体、ベンゾイン、および、そ
の置換誘導体、アセトフェノン、および、その置換誘導
体、ベンジル等のオキシム系化合物等のなかから選ばれ
る、１種、または、２種以上の光重合開始剤を２〜１０
重量％程度含有した、ポリエステルアクリレート、エポ
キシアクリレート、および、ウレタンジアクリレート等
を挙げることができる。黒色の顔料としては、カーボン
ブラックや黒色有機顔料を用いることができる。
【００５７】なお、プローブと標的物質の反応物の検出
を、光学的に行なわない場合や、マトリクスからの光が
反応物の光学的検出に影響を与えない場合には、マトリ
クスパターン形成材料として非遮光性の物を用いる事は
何ら妨げられるものではない。
【００５８】次に上記した様な材料を用いてマトリクス
パターンを形成する一つの方法としては基板表面にコー
トした樹脂や金属上にフォトレジストをコートしパター
ニングの後に樹脂をエッチング等の工程によりパターニ
ングする方法が挙げられる。また、感光性の樹脂であれ
ば、樹脂そのものをフォトマスクを用いたフォトリソグ
ラフィーのプロセスにより露光、現像、必要に応じて硬
化することによりパターニングすることも可能である。
【００５９】ここでマトリクス１２５を樹脂製とした場
合、マトリクス１２５の表面は疎水性となる。この構成
はウェルに供給するプローブを含む溶液として水系の溶
液を用いる場合に好ましいものである。即ちウェルにプ
ローブ溶液をインクジェット法を用いて供給する際に多
少の位置ずれを伴ってプローブ溶液が供給されたとして
も、所望のウェルにプローブ溶液が極めてスムーズに供
給されることになる。また、同時に隣接するウェル間
で、異なる種類のプローブを供給した場合でも、これら
ウエル間に供給された異なるプローブ溶液間での交じり
合い（クロスコンタミネーション）を防ぐことも可能と
なる。
【００６０】通常、ペプチド、核酸等の生体関連物質の
プローブ溶液は水系の溶液であることが多いので、この
ような場合にはマトリクスパターンが撥水性となるこの
構成を好適に利用できる。
【００６１】次にウェルの底面（固相表面の露出部）を
プローブと結合可能な構成とする方法について説明す
る。ウェルの底面に保持させる官能基は、プローブに担
持させる官能基との組合わせによって異なる。例えばプ
ローブとして末端にチオール基を導入した核酸プローブ
を用いる場合には、前述したように固相表面にマレイミ
ド基を導入しておくことでウェルに供給した核酸プロー
ブのチオール基は固相表面のマレイミド基と共有結合を
形成し、核酸プローブが固相表面に固定される。同様に
アミノ基を核酸プローブ末端に有する核酸プローブに対
しては固相表面へのエポキシ基の導入が好ましい。この
様な官能基の他の組合わせとしては、例えばカルボキシ
ル基（スクシンイミド誘導体の核酸プローブ末端への導
入による）を末端に有する核酸プローブに対しては固相
表面へのアミノ基の導入が好ましい。このアミノ基とエ
ポキシ基の組合わせは、チオール基とマレイミド基の組
合わせと比較すると核酸プローブ溶液をインクジェット
吐出方法で吐出した際の固相上への定着性は良好でない
が、固相にウェルを設けてある場合には無視し得る程度
のものである。
【００６２】アミノ基やエポキシ基の固相表面への導入
は、前述した様に固相としてガラス板を用いる場合に
は、まず水酸化カリウムや水酸化ナトリウム等のアルカ
リで該ガラス板表面を処理して水酸基（シラノール基）
を表面に露出させた後、アミノ基を導入したシラン化合
物（例えばＮ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロ
ピルトリメトキシシラン等）やエポキシ基を導入したシ
ラン化合物（例えばγ−グリシドキシプロピルトリメト
キシシラン等）を含むシランカップリング剤を該ガラス
板表面の水酸基と反応させることによって行なうことが
できる。またマレイミド基は、上記の方法によってガラ
ス板表面にアミノ基を導入した後にＮ−マレイミドカプ
ロイロキシスクシンイミドやスクシイミジル−４−（マ
レイミドフェニル）ブチレート等を該アミノ基と反応さ
せることでガラス板表面に導入することができる。
【００６３】なおＮ−β−（アミノエチル）−γ−アミ
ノプロピルトリメトキシシラン、γ−グリシドキシプロ
ピルトリメトキシシラン及びスクシイミジル−４−（マ
レイミドフェニル）ブチレートの構造は下記の通りであ
る。 Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメ
トキシシラン： （ＣＨ3Ｏ）2ＳｉＣ3Ｈ6ＮＨＣ2Ｈ4ＮＨ2 γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン：
【００６４】
【化８】
【００６５】スクシイミジル−４−（マレイミドフェ
ニル）ブチレート：
【００６６】
【化９】
【００６７】上記した固相の表面処理においてエポキシ
基を固相表面に導入した場合、該エポキシ基とプローブ
とを結合させた後、未反応のエポキシ基をエタノールア
ミン水溶液等を用いて開環させて水酸基に変えることに
より、ウェルの底面を親水性にすることができる。この
操作はプローブを結合させたウェルに該プローブと特異
的に反応する標的物質を含む水系溶媒を供給する場合に
好ましいものである。
【００６８】また固相として樹脂基板を用いる場合、例
えばOrganic Thin Films and Surface, Vol.20, Academ
ic Pressの第５章に記載の方法により樹脂基板表面に水
酸基、カルボキシル基またはアミノ基等を導入すること
ができる。或いはこの方法により水酸基を導入した後に
上記したガラス板の場合と同様にアミノ基やエポキシ基
を有するシラン化合物を用いてアミノ基やエポキシ基を
導入したり、更にはマレイミド基を導入することも可能
である。ところで上記した固相への官能基の導入は、固
相表面へのマトリクスの形成前に行なってもよく、或い
はマトリクス形成後に行なってもよい。マトリクス形成
前であれば固相表面にスピンコートやディップコート等
の方法によって官能基の導入に必要な反応溶液を固相表
面に供給すればよく、またマトリクス形成後であればイ
ンクジェット法等によって各ウェルに反応溶液を供給す
ればよい。
【００６９】また、樹脂基板にプローブを結合する方法
としては例えば、特開昭６０−０１５５６０号公報に記
載されている様に、樹脂基板表面を酸化処理して水酸基
を導入し、次いでアミノ基を有するシラン化合物を含む
シランカップリング剤と該水酸基とを反応させてアミノ
基を導入し、このアミノ基とプローブの官能基を反応さ
せる方法が挙げられる。
【００７０】また、前処理後の基板が親水性の場合、他
方の、マトリクスパターンを形成する相対的に撥水性の
材料は、先に延べた樹脂製のマトリクス形成用の樹脂を
そのまま用いることができる。また、さらなる撥水性が
必要とされる場合にはマトリクス材料中に撥水剤を添加
しておくこともできる。また、マトリクスパターンがフ
ォトレジスト等の感光性樹脂で形成される場合には、露
光、現像後にポストベークを適当な条件で行なうことに
よりマトリクスパターンにより強い撥水性を付与するこ
とも可能である。
【００７１】ここまでは、どちらかといえばプローブ溶
液が親水性の場合について述べたが、プローブ溶液が親
油的な場合には逆の処理をすればよいことになる。
【００７２】マトリクスパターンのウエルのサイズや形
状は、基板のサイズ、最終的に作製されるアレイ全体の
サイズ、アレイを構成するプローブ種類数、あるいは、
マトリクスパターンの形成方法、マトリクスパターン間
隙へのプローブ溶液等の供給方法、検出方法等によって
適宜選択することができる。
【００７３】形状としては、図５に示す基板と平行な面
の断面が正方形形状のものに加えて、長方形、各種多角
形、円形、楕円形等種々の形状とすることができる。
【００７４】ウェルのサイズとしては、反応種の数、ア
レイ全体のサイズを考慮した場合、その最長幅が３００
μｍ以下が望ましい。例えば、図５に示すように、ウエ
ルの基板と平行な方向での断面を正方形とする場合には
その１辺の長さを２００μｍ以下とすることができる。
更に、ウェルを長方形とする場合には、その長辺を２０
０μｍ以下、円形とする場合はその直径を２００μｍ以
下とするのがより望ましい。その大きさの下限は例えば
１μｍ程度とすることができる。
【００７５】各ウェルの配列形態は、図５のように平面
図における上下方向で等間隔で配置する態様、隣り合う
列でウェルの位置をずらして配置する態様等所望に応じ
て適宜変更可能である。
【００７６】隣接するウェル間の距離は、例えばインク
ジェット法でプローブ溶液をウェルに供給する際に吐出
位置と供給されるべきウェルとの間に多少の位置ずれが
生じてもそれがクロスコンタミネーションを生じさせな
いような間隔に設定することが好ましく、またアレイ全
体のサイズ等とクロスコンタミネーションや、各種溶液
の供給の際における操作性を考慮すると、隣接するウェ
ル間の距離がウェルの最長幅の１／２〜２倍の範囲にあ
ることが好ましい。
【００７７】例えば、ウェルを正方形形状とする場合
で、基板の大きさを、プローブ固定、試料供給、検出等
の操作を自動化する場合に好適な大きさ（１インチ×１
インチ、あるいは１ｃｍ×１ｃｍ）とすると、コンビナ
トリアルケミストリーとしての機能を十分に果たす必要
性から１００個×１００個、あるいは、１０００個×１
０００個以上のプローブ種類が存在することが望ましい
ので、マトリクス自体のサイズをも考慮して、ウェルの
正方形形状の一辺を１〜２００μｍ、隣接するウェル間
の距離を２００μｍ以下とするのが望ましい。
【００７８】またマトリクスの厚さ（固相表面からの高
さ）は、マトリクスパターンの形成方法やウェルの容
量、供給するプローブ溶液の量等を考慮して決定される
が、好ましくは１〜２０μｍとすることが好ましい。即
ちこのような厚さとすることによって、例えばインクジ
ェット吐出法を用いてプローブ溶液を各ウェルに供給す
る場合、インクジェット吐出条件との関連においてプロ
ーブ溶液の特性を、該プローブ溶液が該固相表面上に小
さなスポットを形成することが困難な特性にしか調整し
得ない場合であっても、該プローブ溶液を固相上の所定
の位置に止めさせることができ、クロスコンタミネーシ
ョンを極めて有効に防止することができる。
【００７９】仮に、上記の望ましい範囲の上限でのウェ
ルの容積は、２００μｍ×２００μｍ×２０μｍ、すな
わち、８００ｐｌとなる。また、このサイズで、隣接す
るウェル間の距離（図１のｘ）も同様に２００μｍとす
ると６２５個／ｃｍ2のウェル密度が得られる。すなわ
ちオーダーとして１０2個／ｃｍ2以上のウェル密度を有
するアレイが得られる。また、ウエルを１辺が５μｍの
正方形形状とし、隣接するウェル間の距離も５μｍと
し、マトリクスパターンの厚さを４μｍとすると、ウェ
ルの容積は０．１ｐｌとなり、その数は１００００００
個／ｃｍ2となる。５μｍ×５μｍ×４μｍのパターニ
ングは現在の微細加工技術では現実的なサイズであるの
でオーダーとして１０6個／ｃｍ2以上のウエル密度のア
レイも本発明の発明の範囲となりうる。
【００８０】本態様においてプローブ溶液、あるいは、
プローブと反応すべき物質のウェルへの供給液量は、例
えばウェルの容積とほぼ同量とする場合には、上記の計
算から、概ね０．１ピコリットル（ｐｌ）から１ナノリ
ットル（ｎｌ）となる。また、マトリクスを供給される
溶液に対して非親和性とした場合に、液種によっては、
その表面張力によりウェルの容積を上回る量の液をウェ
ルの開口上部に留めることが可能となる。そのような場
合、例えば、ウェルの１０倍から数１０倍の液量を供給
し、保持させることができる。すなわち、数ｐｌから数
１０ｎｌの液を供給することになる。いずれの場合に
も、このような少量の液のウェルへの供給は、一般的な
マイクロディスペンサーやマイクロピペットでも可能で
あるが、位置精度と供給量精度を良好に供給することの
できるインクジェット法を用いてプローブ溶液をウェル
に供給することが好ましい。インクジェットプリントで
はμｍオーダーで高精度に位置決めをしてインクを吐出
するので、ウェルへの溶液の供給にはきわめて適してい
るといえる。また、吐出されるインクの量は一般的に数
ｐｌから数１０ｎｌであるので、この点でもウェルへの
溶液の供給に適しているといえる。
【００８１】本態様によれば、液滴の広がりは、核酸プ
ローブと固相表面との反応とウェルにより定量的に制御
され、また、吐出方向に多少の乱れがあっても、ウェル
を含む領域に液滴が付着すれば、液滴のマトリクスにか
かる部分は、マトリクスが吐出液に対して非親和性とな
っていることによって、その部分がはじかれ、ウェル内
にスムーズに収納される。
【００８２】本発明に用いるインクジェット法は特に制
限されないが、例えばピエゾジェット法、熱的な発泡を
利用するバブルジェット法等が利用できる。
【００８３】ところで本発明において固相１０３として
用いることのできる材料としては、固相表面に上記した
様な種々の官能基を導入できるものであれば良く、更に
は第２の態様においては表面にマトリクスを形成できる
ものが好ましい。そしてプローブと標的物質との反応物
の検出を光学的に行なう場合、固相を介した検出系を組
む場合には固相を光学的に透明な固相とすることが好ま
しい。そのような材料としては例えば、合成石英、溶融
石英等を含むガラス、シリコン、アクリル樹脂、ポリカ
ーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、塩化ビニル樹脂等
が挙げられる。また該反応物の光学的な検出を固相を介
さないで検出する場合には光学的に黒色の固相を用いる
ことが好ましく、カーボンブラック等の黒色の染顔料を
含む樹脂基板等が用いられる。
【００８４】本発明ではこれらプローブアレイに反応す
べき物質の溶液を供給し、適当な反応条件に置き、反応
を行なう。個別のウェルに異なる反応すべき物質の溶液
を供給する必要がある場合には、プローブアレイの複数
のウェルのそれぞれに、プローブに反応させるべき少な
くとも１種の物質が溶解した溶液を少なくとも１種供給
する。この場合、上述のように、供給される溶液が、す
でに形成されているプローブアレイのプローブが結合さ
れているウェルに対して親和的であり、マトリクスパタ
ーンに非親和的であれば、供給領域を限定した、クロス
コンタミネーションのない、定量的な液の供給が可能と
なる。表１に示した物質のように生体関連の物質の多く
は水溶性なので、この場合にはウェルは親水性、マトリ
クスパターンは撥水性となる。また、これら反応すべき
物質の供給にも、上述のように、インクジェット法を用
いれば、微量な液量を、定量的に供給可能となる。
【００８５】本発明では、基板に結合するために供給す
るプローブの液量、または、反応すべき物質の液量が微
量であるので、双方の反応条件が、供給された溶液の蒸
発、気散を防ぐ条件を含んでいることが望ましい。
【００８６】以下実施例をもって本発明を更に詳細に説
明する。
【００８７】実施例１ （バブルジェットプリンターを用いた核酸プローブアレ
イの製法、及びそのプローブアレイの評価） （１）基板洗浄 １インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗
剤に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄
を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。蒸留水で
すすいだ後、蒸留水の入った容器中でさらに超音波処理
を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液にガラス板を１０分間浸した。引き
続き水洗、蒸留水洗浄を行って、プローブアレイ用のガ
ラス板を用意した。
【００８８】（２）表面処理 アミノ基を結合したシラン化合物（Ｎ−β−（アミノエ
チル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）を含
むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ６０３；信越
化学工業（株）社製）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時
間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加
水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を
室温（２５℃）で２０分間浸した後、引き上げて、窒素
ガスをガラス板の両面に吹き付けて乾燥させた。次にガ
ラス板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベーク
してシランカップリング処理を完結させ、基板表面にア
ミノ基を導入した。次いでＮ−マレイミドカプロイロキ
シスクシンイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succini
mide；Ｄｏｊｉｎ社製）（以降ＥＭＣＳと略）を２．７
ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタ
ノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとな
る様に溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。シランカップ
リング処理を行ったガラス板をこのＥＭＣＳ溶液に室温
で２時間浸して、シランカップリング処理によってガラ
ス板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカ
ルボキシル基を反応させた。この状態でガラス板表面に
はＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することに
なる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス板はＤＭＳＯ
及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄し
た後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００８９】（３）プローブＤＮＡの合成 ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１の一本鎖核酸を合
成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ
自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈ
ｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（Ｇｌｅ
ｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってチオー
ル（ＳＨ）基を導入した。続いて通常の脱保護を行いＤ
ＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製
し、以下の実験に用いた。 配列番号：１5' HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3' （４）ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板へ
の結合 上記配列番号１の一本鎖ＤＮＡを最終濃度が約４００ｍ
ｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液）に溶解
し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した（正確な濃度は吸収強
度から算出）。
【００９０】グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ
％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び上記一般式
（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセ
チレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１
ｗｔ％を含む水溶液を用意し、上記ＤＮＡ溶液に加え、
一本鎖ＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調整し
た。この液体の表面張力は３０〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍの
範囲内であり、また粘度は１．８ｃｐｓ（Ｅ型粘度計：
東京計器（株）社製）であった。この液体をバブルジェ
ットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン
（株）社製）用インクタンクに充填しバブルジェットヘ
ッドに装着した。なおここで用いたバブルジェットプリ
ンター（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）
は平板への印刷が可能な様に改造を施したものである。
またこのバブルジェットプリンターは３６０×７２０ｄ
ｐｉの解像度で印字可能である。次いでこのプリンター
に上記（２）で処理したガラス板を装着し、プローブ核
酸を含む液体をガラス板上にスポッティングした。ここ
でバブルジェットヘッドの液体吐出面とガラス板の液体
付着面との距離は１．２〜１．５ｍｍであった。またス
ポッティングは、３６０ｄｐｉの方向には１回のスポッ
ティングの後２回の空吐出を行ない、７２０ｄｐｉの方
向には１回のスポッティングの後５回の空吐出を行なう
様に条件設定した。スポッティング終了後、ガラス板を
３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマ
レイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応さ
せた。なお上記プリンタの１吐出動作あたりのＤＮＡプ
ローブ溶液の吐出量は約２４ｐｌであった。
【００９１】（５）ブロッキング反応 マレイミド基とチオール基との反応終了後、ガラス板を
１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶液で洗浄し、ガラス板表面のＤＮＡを含む液体を完全
に洗い流した。次いでガラス板を２％ウシ血清アルブミ
ン水溶液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を
行った。
【００９２】（６）ハイブリダイゼーション反応 配列番号１のＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖
ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５’末端にローダ
ミンを結合させて標識化した一本鎖ＤＮＡを得た。この
標識化一本鎖ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶
解し、この溶液中に上記（５）で得たブロッキング処理
したプローブアレイを浸漬し、室温（２５℃）で３時間
ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、プロー
ブアレイを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）溶液で洗浄してプローブ核酸とハイブリダイ
ズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に該プロー
ブアレイのスポットの蛍光量を、画像解析装置（商品
名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス（株）社製）を
接続し、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着
した倒立型蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【００９３】（７）結果 標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号１の核
酸プローブのスポットでは４６００の蛍光量であった。
またハイブリダイゼーション後の、各スポットが蛍光発
光している状態のプローブアレイを蛍光顕微鏡（ニコン
（株）社製）を用いて観察した。その結果本実施例にか
かるプローブアレイでは、 ａ）各々のスポットがほぼ円形であって、またその直径
が約７０〜１００μｍの範囲内にあること、 ｂ）隣接するスポットとの間には各々のスポットの直径
と略等しい、約１００μｍのスペースが有り、各々のス
ポットが互いに明確に独立していること、 ｃ）スポットの行と列が揃っていることが明らかとなっ
た。
【００９４】このことはプローブアレイ上でハイブリダ
イズしたスポットの自動検出等を行わせる上で極めて有
効である。
【００９５】実施例２ （バブルジェットプリンタを用いた核酸プローブアレイ
の製造、及びそのプローブアレイを用いた標的核酸の検
出） （１）上記実施例１の（１）及び（２）と全く同様にし
てプローブアレイ用の表面処理を施したガラス板を用意
した。
【００９６】（２）プローブＤＮＡの合成 ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１〜４の一本鎖核酸
を合成した。なお配列番号１〜４の一本鎖核酸は、実施
例１で用いた配列番号１を基本とし、１塩基変化させた
ものを配列番号２、３塩基変化させたものを配列番号
３、そして６塩基変化させたものを配列番号４とした。
また配列番号１〜４の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動
合成機での合成時にＴｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（Ｇ
ｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事によってチオ
ール（ＳＨ）基を導入した。続いて通常の脱保護を行い
ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製
し、以下の実験に用いた。配列番号２〜４の配列を以下
に示す。 配列番号：２5' HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3' 配列番号：35' HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3' 配列番号：45' HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3' （３）ＢＪプリンターによるＤＮＡプローブの吐出、お
よび基板への結合 上記配列番号１〜４の一本鎖ＤＮＡを用いて、上記実施
例１の（４）に記載した方法と同様の方法で４種類の吐
出用液体を調製し、実施例１で用いたバブルジェットプ
リンタ用の４つのインクタンクに各々の液体を充填し、
各々のインクタンクをバブルジェットヘッドに装着し
た。次いで該プリンタに上記（１）と同じ方法で作成し
たガラス板を装着し、該ガラス板上に４種の核酸プロー
ブの各々を該ガラス板の３×３ｍｍの４つのエリアの各
々にスポッティングした。なお各エリア内でのスポッテ
ィングのパターンは実施例１と同様とした。スポッティ
ング終了後、ガラス板を３０分間加湿チャンバー内に静
置し、マレイミド基とチオール基とを反応させた。
【００９７】（４）ブロッキング反応 マレイミド基とチオール基との反応終了後、ガラス板を
１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶液で洗浄し、ガラス板表面のＤＮＡ溶液を完全に洗い
流した。次いでガラス板を２％ウシ血清アルブミン水溶
液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を行っ
た。
【００９８】（５）ハイブリダイゼーション反応 配列番号１のＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖
ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５’末端にローダ
ミンを結合させて標識化一本鎖ＤＮＡを得た。この標識
化一本鎖ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解
し、（４）で得られたプローブアレイとハイブリダイゼ
ーション反応を３時間行った。その後、プローブアレイ
を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）溶液にて洗浄してプローブ核酸とハイブリダイズし
なかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に該プローブア
レイの各々のスポットを蛍光顕微鏡（ニコン（株）社
製）で観察し、その蛍光量を、画像解析装置（商品名：
ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス（株）社製）を接続
し、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着した
倒立型蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【００９９】（６）結果 標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号１のＤ
ＮＡプローブのスポットでは４６００の蛍光量であるの
に対し、１塩基のミスマッチ配列を有する配列番号２の
ＤＮＡプローブのスポットでは、２８００の蛍光量が得
られた。また、３塩基ミスマッチを有する配列番号３の
ＤＮＡプローブのスポットでは、２１００と完全マッチ
の半分以下の蛍光量しか得られず、６塩基ミスマッチの
配列番号４のＤＮＡでは蛍光は観測されなかった。以上
の事から、ＤＮＡアレイ基板上で完全相補性の一本鎖Ｄ
ＮＡを特異的に検出することができた。
【０１００】実施例３ （液体中のＤＮＡプローブの濃度とバブルジェット吐出
特性） （１）ＤＮＡプローブの合成 以下に示す配列番号５の配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤ
ＮＡ自動合成機を用いて合成し、それを濃度が各々約
０．２ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌにな
るようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８）／１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、濃度の異な
る３種類のＤＮＡプローブ溶液を調製した（正確な濃度
は吸収強度から算出した）。 配列番号：５5' GCCTGATCAGGC3' （２）ＢＪプリンターによる吐出 グリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール
７．５％、上記一般式（Ｉ）で示される構造を有するア
セチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川
研ファインケミカル（株）社製）１％を含む水溶液を用
意し、この水溶液を上記（１）で調整した濃度０．２ｍ
ｇ／ｍｌのプローブ溶液に加えて、最終濃度が約０．０
２ｍｇ／ｍｌ（３μＭ）に希釈した。この液体を上記実
施例１で用いたバブルジェットプリンタ用のインクタン
クに充填し、このインクタンクを実施例１で用いたバブ
ルジェットプリンタのヘッドに装着した。
【０１０１】次に該プリンタにＡ４サイズのアルミ板を
装着し、該アルミ板の３×５平方インチのエリアに対し
てスポッティングを行った。ここでのスポッティング
は、上記エリアに３６０×７２０ｄｐｉの密度でスポッ
ティングされるように設定した。また最初にコントロー
ルとしてＢＪ６２０用の市販のインクを該アルミ板上に
印字した。この操作を計４枚のアルミ板に対して行っ
た。
【０１０２】次に各々のアルミ板上にスポットされた核
酸プローブをＴＥ溶液を用いて回収し、ゲル濾過法によ
り精製し、精製された回収核酸プローブの量を吸収スペ
クトルにより測定した。ここで理論的に求められる核酸
プローブの回収量は以下の通りである。即ち本実施例に
用いたプリンターのヘッドから吐出される液滴１つあた
りの体積は２４ピコリットルである。そして３６０×７
２０ｄｐｉの密度で３×５平方インチのエリアにスポッ
ティングしたアルミ板が４枚であるから、 ２４（ピコリットル）×（７２０×３６０）×（３×
５）×４枚＝３７３μｌ となる。この量のプローブ核酸が示す２６０ｎｍにおけ
る吸光度と回収された核酸プローブの２６０ｎｍにおけ
る吸光度を図３に示す。
【０１０３】上記（２）と全く同様の操作を、濃度２ｍ
ｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ各々のプローブ溶液について
行った。なお各々の吐出用液体の核酸プローブの最終濃
度は３０μＭ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及び２２５μＭ
（１．５ｍｇ／ｍｌ）とした。各溶液から回収されたプ
ローブ核酸が示す吸光度及び理論的に求められたプロー
ブ核酸量が示す吸光度の結果を図３に示す。
【０１０４】（３）結果 図３から分かるように核酸プローブの実際の吐出量は理
論的に予想される値に近い値であった。この事からバブ
ルジェット法を用いての核酸プローブの吐出において、
バブルジェットヘッドのヒータ部への核酸プローブの焦
げ付きなどによる核酸プローブの量的損失は認められな
い。また各々の濃度の液体を用いてのアルミ板へのスポ
ッティング工程中、ヘッドのトラブル、例えば不吐出等
は一切発生しなかった。またコントロールとしてアルミ
板にスポッティングしたバブルジェットプリンター用イ
ンクのスポットと核酸プローブのスポットを目視にて対
比したところ、濃度３μＭ及び３０μＭの液体を用いて
作成したスポットのスポッティング状況は、インクスポ
ットのそれと殆ど同様であった。また濃度２２５μＭの
液体を用いて作成したスポットはインクスポットと比較
して若干の乱れが認められた。
【０１０５】実施例４ （バブルジェットプロセスが核酸プローブに与える影響
の検討） （１）核酸プローブの合成 アデニン（以降「Ａ」と記載）からなる塩基長１０ｍｅ
ｒ（合成品）、ｏｌｉｇｏＡ（４０−６０ｍｅｒ；ファ
ルマシア社製）、ｐｏｌｙ（ｄＡ）（３００〜４００ｍ
ｅｒ；ファルマシア社製）をそれぞれＴＥ溶液で希釈し
て最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるよう調製し、長さの異
なる核酸プローブ溶液を用意した。なお１０ｍｅｒの塩
基配列（配列番号：６）は以下の通りである。 配列番号：６5' AAAAAAAAAA3' （２）バブルジェットプリンターによるＤＮＡ溶液の吐
出 グリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％及び上記一
般式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：
アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル）１ｗｔ％
を含む水溶液を用意し、この水溶液で上記（１）で作成
した各々の核酸プローブ溶液を最終濃度が約０．１ｍｇ
／ｍｌとなるように希釈した。
【０１０６】実施例３と同様カートリッジに充填した各
々の核酸プローブ溶液をアルミ板上に吐出させ、スポッ
ティング状況を目視にて観察した。その結果塩基長１０
ｍｅｒ及び４０〜６０ｍｅｒの核酸プローブに関して
は、アルミ板上に独立したスポットが整然と並んだプロ
ーブアレイが得られた。また３００〜４００ｍｅｒの核
酸プローブに関しても、基本的には同様のプローブアレ
イが得られたが、隣接するスポット同士が繋がっている
部分が認められた。これは核酸プローブの塩基鎖が長い
ことに起因する液体の物性変化が生じ、バブルジェット
ヘッドからの吐出の方向性が若干不正確になった為と考
えられる。
【０１０７】次に各々の核酸プローブ溶液を用いて作成
したプローブアレイ上のスポットを実施例３と同様にし
て回収した。回収した核酸プローブ溶液１００μｌを逆
相ＨＰＬＣで分析し、吐出前の溶液との比較によって核
酸プローブの切断の有無を調べた。なお逆相ＨＰＬＣの
溶出は１Ｍトリエチルアミンアセテートを含む７〜７０
％アセトニトリル濃度勾配により行った。その結果、切
断されたと考えられる様なＤＮＡ断片は観測されず、よ
って核酸プローブはバブルジェット法での吐出によって
も変質を受けなかったことが確認できた。また回収した
核酸プローブの定量を実施例３と同様にして行った結
果、図４に示すように３種類の長さの核酸プローブはほ
ぼ理論値通りの量が回収された。
【０１０８】実施例５ （反応時間の検討）実施例１の（４）において、核酸プ
ローブがスポッティングされた表面処理ガラス板を加湿
チャンバー中に１０分、９０分、一晩室温（２５℃）放
置した以外は実施例１と同様にしてプローブアレイを製
造し、各々のプローブアレイをハイブリダイゼーション
反応に供した。その結果９０分、及び一晩反応させたプ
ローブアレイについては、全て実施例１で得られたプロ
ーブアレイが示す蛍光強度と同程度の蛍光強度を与え
た。このことからガラス板表面のマレイミド基と核酸プ
ローブ末端のチオール基との結合反応は３０分でほぼ終
了している事が明らかになった。一方反応時間が１０分
のプローブアレイは実施例１のそれに比べて、７０％程
度の蛍光量であった。
【０１０９】実施例６ （バブルジェットプリンタを用いたＰＮＡプローブアレ
イの製造、及びそのプローブアレイを用いた標的核酸の
検出） （１）上記実施例１の（１）及び（２）と全く同様にし
てプローブアレイ用の表面処理を施したガラス板を用意
した。
【０１１０】（２）プローブＰＮＡの合成 下記配列番号７及び８の塩基配列を有するプロテイン核
酸（ＰＮＡ）（日本パーセプティブ（株）社製）を用意
した。このＰＮＡはＮ末端（ＤＮＡの５’末端に相当）
にシステイン残基（Ｃｙｓと表記）が結合され、その結
果としてＮ末端にチオール基が導入されている。また配
列番号８のＰＮＡプローブは配列番号７のＰＮＡプロー
ブを一塩基変化させたものである。 配列番号：７N Cys-NH(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2CONH-ACTGGCCGTCGTTTTACAC 配列番号：８N Cys-NH(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2CONH-ACTGGCCGTTGTTTTACAC （３）ＢＪプリンターによるＰＮＡプローブの吐出、お
よび基板への結合 上記各々のＰＮＡプローブを１００μｌの０．１ｗｔ％
トリフルオロ酢酸に最終濃度が８０μＭとなる様に溶解
し、次いでグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ
％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び上記一般式
（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセ
チレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１
ｗｔ％を含む水溶液を上記ＰＮＡのトリフルオロ酢酸溶
液に加えて、ＰＮＡプローブの最終濃度が８μＭとなる
ように調整した。この液体の表面張力は３０〜５０ｄｙ
ｎ／ｃｍの範囲内であり、また粘度は１〜５ｃｐｓの範
囲内であった。
【０１１１】このＰＮＡプローブ溶液各々を、実施例２
の（３）に記載したのと同様にして上記（１）で作成し
たガラス板上の各々のエリアにスポッティングした。ス
ポッティング終了後、３時間加湿チャンバー内に静置
し、マレイミド基とチオール基とを反応させた。
【０１１２】なお上記プリンタの１吐出動作あたりのＰ
ＮＡプローブ溶液の吐出量は約２４ｐｌであった。
【０１１３】（４）ブロッキング反応 マレイミド基とチオール基との反応終了後、ガラス板を
１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶液で洗浄し、ガラス板表面のＰＮＡを含む液体を完全
に洗い流した。次いでガラス板を２％ウシ血清アルブミ
ン水溶液中に浸して３時間放置し、ブロッキング反応を
行った。
【０１１４】（５）ハイブリダイゼーション反応 配列番号７のＰＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖
ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５’末端にローダ
ミンを結合させて標識化した一本鎖ＤＮＡを得た。この
標識化一本鎖ＤＮＡを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に最終濃度５ｎＭとなるように溶解し（溶液量１ｍ
ｌ）、このＤＮＡ溶液中に上記（４）で得たブロッキン
グ処理したＰＮＡプローブアレイを浸漬し、室温（２５
℃）で１２時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
その後、プローブアレイを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）溶液で洗浄してＰＮＡプローブとハイブリダイ
ズしなかった一本鎖ＤＮＡを洗い流した。次に該プロー
ブアレイのスポットの蛍光量を、画像解析装置（商品
名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス（株）社製）を
接続し、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着
した倒立型蛍光顕微鏡を用いて定量した。
【０１１５】（６）結果 標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号７のＰ
ＮＡプローブでは２４００の蛍光量であったのに対して
１塩基ミスマッチ配列を有する配列番号８のＰＮＡプロ
ーブでは約半分の１１００であった。以上のことからＰ
ＮＡアレイ上で完全相補性の一本鎖ＤＮＡを特異的に検
出することができた。
【０１１６】またハイブリダイゼーション後の、各スポ
ットが蛍光発光している状態のプローブアレイを蛍光顕
微鏡（ニコン（株）社製）を用いて観察した。その結果
本実施例にかかるプローブアレイでは、 ａ）各々のスポットがほぼ円形であって、またその直径
が約２００μｍの範囲内にあること、 ｂ）隣接するスポットとの間には、約５０μｍのスペー
スが有り、各々のスポットが互いに明確に独立している
こと、 ｃ）スポットの行と列が揃っていることが明らかとなっ
た。
【０１１７】このことはプローブアレイ上でハイブリダ
イズしたスポットの自動検出等を行わせる上で極めて有
効である。
【０１１８】更にハイブリダイゼーション反応時、及び
その後の未反応の一本鎖ＤＮＡの除去に用いる溶液に塩
化ナトリウムを含有させる必要が無いため、蛍光の観察
中に塩化ナトリウムの析出に注意する必要がなく、プロ
ーブアレイ上のハイブリッドの検出をより容易に行うこ
とができた。また保存上も密封の必要がなく、取扱いが
容易であった。
【０１１９】なおＰＮＡプローブのスポット径が実施例
１で得たプローブアレイのスポットよりも大きい理由は
明らかでないが、本発明者らはＰＮＡプローブはＤＮＡ
プローブと比較して若干水溶性が劣るとの知見を得てお
り、両者の水溶性の差が各々のインクジェット吐出液の
表面張力に差異を生じさせる結果、スポット径が異なっ
ているものと推測される。
【０１２０】実施例７ （表面にエポキシ基を導入したプローブアレイ用ブラッ
クマトリクス付ガラス基板の調製及びその評価） （１）合成石英からなるガラス基板（５０ｍｍ×５０ｍ
ｍ）を、２ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液を用いて超音
波洗浄し、次いでＵＶオゾン処理を行なって表面を清浄
化した。エポキシ基を結合したシラン化合物（γ−グリ
シドキシプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカ
ップリング剤（商品名：ＫＢＭ４０３；信越化学工業株
式会社製）を１ｗｔ％含有する５０ｗｔ％メタノール水
溶液を室温下で３時間攪拌し、上記シラン化合物中のメ
トキシ基を加水分解した。ついでこの溶液を上記基板表
面にスピンコーターで塗布し、１００℃で５分間加熱、
乾燥して基板表面にエポキシ基を導入した． （２）次にカーボンブラックを含有するＤＥＥＰ−ＵＶ
レジスト（ブラックマトリクス用ネガ型レジスト）（商
品名：ＢＫ−７３９Ｐ；新日鉄化学株式会社製）をスピ
ンコータで硬化後の膜厚が５μｍとなるように塗布し、
この基板をホットプレートで８０℃で５分間加熱して硬
化させた。ＤＥＥＰ−ＵＶ露光装置を用いて１ｃｍ×１
ｃｍの領域に、図５における隣接ウェル間の距離（Ｘ）
が１００μｍ、及びウェルの形状が１００μｍ×１００
μｍの正方形となるようにパターニングされたマスクを
用いてプロキシミティ露光し、次いで無機アルカリ水溶
液の現像液で、スピン現像機を用いて現像し、更に純水
で洗浄して現像液を完全に除去した。次にスピン乾燥機
を用いて簡単に乾燥し、その後クリーンオーブン中で１
８０℃で３０分間加熱してレジストを本硬化させ、所定
の配列でウェルが２５００個配置され、隣接するウェル
がブラックマトリクスで隔離された基板を得た。なお各
ウェルの容積は５０ピコリットル（ｐｌ）と計算され
る。この時点でブラックマトリクス表面の水に対する接
触角は９３°と濡れにくく、またウェル底面の水に対す
る接触角は３５°と濡れやすかった。
【０１２１】（３）１０μＭのローダミンＢ水溶液をバ
ブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２０：キヤ
ノン（株）社製）用インクタンクに充填し、前記実施例
１で用いたバブルジェットプリンタのバブルジェットヘ
ッドに装着した。そして上記（１）及び（２）で用意し
た固相をプリンタに装着し、該固相のウェルに、市松パ
ターン（ひとつおき）にローダミンＢ水溶液を供給し
た。なお１ウェルあたりの供給量は約５０ｐｌである。
またこのプリンタの吐出位置決め精度は±２．５μｍで
ある。次に１０μＭのアミノＦＩＴＣの水溶液を別のイ
ンクタンクに充填し、上記プリンタのバブルジェットヘ
ッドに装着して、先にローダミンＢ水溶液を供給したウ
ェルに隣接する別のウェルに供給した。ここでローダミ
ンＢ及びアミノＦＩＴＣを用いたのは水溶性でありイン
クジェットヘッドからの吐出が容易に行なえること、及
び蛍光の観察によってウェルに供給された液体の状態や
クロスコンタミネーションを確認できる為である。
【０１２２】（４）蛍光顕微鏡（ニコン（株）社製）に
Ｇ励起フィルター（ローダミンＢ用）、Ｂ励起フィルタ
ー（アミノＦＩＴＣ用）を装着し、倍率１００倍にてウ
ェルに供給された各々の水溶液の状態を蛍光で観察し
た。その結果各々の水溶液とも、液滴を形成することな
くウェル内に均一に供給されていた。また各々のウェル
からは互いに他の色素の蛍光は観察されず、クロスコン
タミネーションは認められなかった。
【０１２３】実施例８ （実施例７の基板を用いたプローブアレイの調製及びそ
れを用いた標的核酸の検出） （１）実施例７と同様の方法によりブラックマトリクス
（ＢＭ）付の基板を作成した。 （２）ＤＮＡプローブとして５’末端の水酸基にリン酸
基とヘキサメチレンを介してアミノ基を結合した１８量
体のオリゴマー（配列番号：９）、配列番号９のオリゴ
マーに対して１個のヌクレオチドがミスマッチのプロー
ブ（配列番号：１０）、及び配列番号９のオリゴマーに
対して２個のヌクレオチドがミスマッチのプローブ（配
列番号：１１）（全て日本製粉株式会社製、ＨＰＬＣグ
レード）を用意した。配列番号９のオリゴマーの塩基配
列は、一本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍｐ１８−ｓｓＤＮＡ
のマルチプルクローニングサイトの一部の塩基配列に相
補的な配列である。以下に配列番号：９〜１１の塩基配
列とリンケージの構造を示す。 配列番号：９5' NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACGACGGCCAGT3' 配列番号：１０5' NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACCACGGCCAGT3' 配列番号：１１5' NH2-(CH2)6-O-PO2-O-TGTATAACCACGCCCAGT3' （３）上記配列番号９〜１１のＤＮＡプローブに対して
完全相補的な一本鎖ＤＮＡを合成した。次にＮａＣｌを
５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）に、各ＤＮＡ
プローブ及び一本鎖ＤＮＡを最終濃度が１００μＭとな
るように溶解し、ＤＮＡプローブ溶液及び一本鎖ＤＮＡ
溶液を調製した。そしてＤＮＡプローブを含む溶液１０
０μｌに対して各々のＤＮＡプローブに相補的な一本鎖
ＤＮＡを含む溶液を１００μｌ加えて混合し、各々の混
合溶液を９０℃から２５℃まで直線的に２時間かけて冷
却し、各々のＤＮＡプローブと各々の一本鎖核酸とのハ
イブリッドを形成させた。次に上記配列番号：９〜１１
の各ＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を、グリ
セリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコ
ール７．５ｗｔ％、及び前記一般式（Ｉ）で示されるア
セチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川
研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む水溶液
に加え、ハイブリッドの最終濃度が８μＭとなるように
調整した。各々のＤＮＡプローブのハイブリッドを含む
これらの液体の表面張力は何れも３０〜５０ｄｙｎｅ／
ｃｍの範囲内であり、また粘度も１〜５ｃｐｓ（Ｅ型粘
度計：東京計器（株）社製）の範囲内であった。
【０１２４】次にバブルジェットプリンター（商品名：
ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタンクを
３個用意し、各々のインクタンクに上記の３種のハイブ
リッド溶液を充填し、実施例１で用いたバブルジェット
プリンタのヘッドに装着した。また上記（１）及び
（２）で作成したＢＭ付ガラス基板をセットし、まず配
列番号９のＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を
１列目のウェル（図６の１３１）に供給した。次に配列
番号１０のＤＮＡプローブのハイブリッドを含む溶液を
上記１列目のウェルに隣接する２列日目ウェル（図６の
１３３）に供給し、更に配列番号１１のＤＮＡプローブ
のハイブリッドを含む溶液を上記２列目のウェルに隣接
する３列目のウェル（図６の１３５）に供給した。なお
１つのウェルに対して何れのハイブリッド溶液を４回吐
出して約１００ｐｌ供給した。この量は１つのウェルの
容積の約２倍であるが、顕微鏡で各ウェルを観察したと
ころ、供給されたハイブリッド溶液はウェルの開口部か
らは盛り上がって存在しているが、疎水性のマトリクス
によってウェル内に止まっており、ウェル間でのクロス
コンタミネーションは観察されなかった。
【０１２５】次に基板を２５℃、湿度１００％の恒温恒
湿槽に１２時間置き、プローブのアミノ基とウェルのエ
ポキシ基とを反応させた。なおプローブの塩基のアミノ
基は完全相補的な一本鎖ＤＮＡとハイブリッドを形成し
ているため、各ウェルのエポキシ基と反応することはな
い。
【０１２６】（４）次に基板を８０℃の純水で１０分間
洗浄し、基板に結合しているプローブとハイブリッドを
組んでいる相補鎖をプローブから解離させると共に洗い
流した。次いで基板を１％エタノールアミン水溶液で室
温下で１時間処理し、各ウェル内の未反応のエポキシ基
を開環させた。次に基板を純水で洗浄、乾燥した。
【０１２７】上記（４）の繰作によってウェル内のＤＮ
Ａプローブと反応しなかったエポキシ基は開環して水酸
基となり、また反応させたエタノールアミンにも水酸基
が存在するためウェルの底面はより親水性が高くなり、
後述の標的一本鎖ＤＮＡを含む溶液のウェルへの供給の
際に有利となる。
【０１２８】（５）次にＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含
むＴＥ溶液（ｐＨ８）に配列番号９のＤＮＡプローブに
対する完全相補性の一本鎖ＤＮＡを最終濃度が１０μＭ
となるように溶解し、この溶液に上記（４）で得たウェ
ルにエポキシ基を導入したプローブアレイを浸漬し、８
０℃から２５℃まで２時間かけて降温しハイブリタイゼ
ーション反応を行なった。ついで２０℃で１０ｍＭのＮ
ａＣｌを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８）で基板を２０分間洗
浄したのちスピン転燥機で表面の洗浄液を除去した。
【０１２９】（６）次にＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含
むＴＥ溶液（ｐＨ８．０）に、二本鎖核酸にインターカ
レートして初めて蛍光を発する、２−メチル−４、６−
ビス（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウ
ムアイオタイド（以下「Ｐ２」と略）をその濃度が１０
μＭとなるように溶解し、この溶液を上記インクジェッ
トプリンタ用のインクタンクに充填して上記インクジェ
ットプリンタのヘッドに取り付けた。また上記（５）に
てハイブリダイゼーションを行なった基板を上記プリン
タにセットし、各々のウェルに対してＰ２溶液を１００
ｐｌづつ供給したのち、乾燥を防止するために湿度１０
０％の専用チャンバー内で５分間放置し、チャンバー内
に保持したまま倒立型の顕微鏡（商品名：ＩＭＴ２；オ
リンパス光学株式会社製、倍率：１００倍、蛍光顕微鏡
用のフィルターキューブ（励起用フィルター４５５ｎｍ
から５９５ｎｍ（透過）、ダイクロイックミラー６２０
ｎｍ、蛍光用バリアーフィルター６１０ｎｍから７２５
ｎｍ（透過））を使用）にＩＣＣＤカメラ（商品名：Ｃ
２４００−８７；浜松ホトニクス社製）とイメージプロ
セッサ（商品名：ＡＲＧＵＳ ５０；浜松ホトニクス社
製）を接続し、蛍光を観察定量した。なお観察エリアは
２５μｍ×２５μｍ、インテグレーション×６４、ＡＲ
ＧＵＳ ５０の増幅レベルは適宜設定した。
【０１３０】その結果、配列番号１１のＤＮＡプローブ
を結合させたウェルからは、バックグラウンドとほぼ同
様の、１２００〜１５００の蛍光強度が観察された。一
方配列番号９のＤＮＡプローブを結合させたウェルから
は、９８００〜１０３００の蛍光強度が観察され、また
配列番号１０のＤＮＡプローブを結合させたウェルから
は、３５００〜３９００の蛍光強度が観察された。更に
各固相をＴＥ緩衝液を用いて３５℃で１０分間洗浄して
再度蛍光強度を測定したところ、配列番号１０のＤＮＡ
プローブを結合させたウェルからはバックグラウンドと
同程度の蛍光強度しか観察されなくなった。
【０１３１】これらの結果から、本実施例に係るプロー
ブアレイを用いることで、各ウェルにおいてハイブリダ
イゼーション反応を行なうことができ、更に配列番号９
と完全相補的な標的核酸を特異的に検出できることが分
かった。
【０１３２】実施例９ （実施例８のプローブアレイの各ウェルへの反応物質の
選択的供給及びプローブとの反応） （１）実施例８と同様にして配列番号９〜１１のＤＮＡ
プローブを結合させた基板を用意した。
【０１３３】（２）配列番号９〜１１のＤＮＡプローブ
に対して完全相補的な３種類の一本鎖ＤＮＡを合成し
た。ＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液（ｐＨ
８）に上記３種類の一本鎖ＤＮＡを各々の濃度が１００
μＭとなるように溶解した。バブルジェットプリンター
（商品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用イン
クタンクを３個用意し、各々のインクタンクに上記の３
種の一本鎖ＤＮＡ溶液を充填し、実施例１で用いたバブ
ルジェットプリンタのヘッドに装着した。また上記
（１）で用意した基板もプリンタにセットし、配列番号
９〜１１のＤＮＡプローブが結合しているウェルに対し
て各々完全相補的な一本鎖ＤＮＡを含む溶液を１つのウ
ェルにつき１００ｐｌづつ供給した。この時点で各ウェ
ルの状態を顕微鏡で観察したところ、液のにじみ、クロ
スコンタミネーションは観察されず、またプローブアレ
イの各ウェルに個別に反応させるべき物質の溶液を供給
できることが分かった。
【０１３４】（３）次に実施例８と同様にして各ウェル
においてハイブリダイゼーション反応を行なわせた後、
実施例８と同様にしてＰ２溶液を各ウェルに供給し、蛍
光を観察することでハイブリッドの検出を行なった。そ
の結果、全てのウェルから９８００〜１０３００の強度
の蛍光が観察された。このことから固相プローブアレイ
の各ウェルに個別に反応物質を供給し、各ウェルにおい
てプローブと反応物質を反応させ、そして反応の結果物
を検出できることが確認された。
【０１３５】実施例１０ （実施例７の基板のウェル底面の親水化処理） （１）実施例７と同様にしてブラックマトリックスパタ
ーンを有するガラス基板を用意した。
【０１３６】（２）この基板のブラックマトリックスが
形成されている側の表面にＵＶオゾン処理を行なった。
この時点でブラックマトリックス表面の水に対する接触
角は９３°と濡れにくい状態であり、ウェル底面の水に
対する接触角は２２°であって実施例７で得たブラック
マトリクス付基板のウェル底面のそれと比較して濡れや
すい状態であった。これは上記ＵＶオゾン処理による効
果と考えられる。
【０１３７】（３）次に実施例７と同様にしてローダミ
ンＢ、及びアミノＦＩＴＣの水溶液を用いてウェルへの
インクジェット吐出液の供給状況を観察したところ、各
々の水溶液は共にウェル内で液滴を形成することなくウ
ェル内に均一に供給されていた。プローブアレイの固相
として表面にウェルを備えた固相を用いる場合には、表
面にウェルを有しない、平坦且つ均一な表面特性を有す
る固相を用いる場合と異なり、インクジェット吐出液を
出来るだけ限定された位置に留めなくてもよく、むしろ
ウェル底面に十分にインクジェット吐出液を行き亘らせ
ることが、後に行なうプローブと標的物質との反応の検
出にはより有利となる。本実施例に記載したウェル底面
の親水化処理はその一実施態様として好ましい方法であ
る。また各々の色素が供給されるウェルからは互いに他
の色素は観察されず、クロスコンタミネーションを生じ
させることなしに、各々のウェルに各々の色素水溶液を
インクジェットプロセスを用いて供給できたことが分か
った。
【０１３８】実施例１１ （ＢＭ形成基板の各ウェルにプローブ固定用官能基導入
の為の液体をインクジェット法にて供給して得た固相を
用いたプローブアレイの製法及びその使用） （１）実施例７と同様にしてブラックマトリックスを備
えた基板を用意した。
【０１３９】（２）アミノ基を結合したシラン化合物
（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリ
メトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品
名：ＫＢＭ６０３；信越化学工業株式会社製）を１ｗｔ
％含有する１０ｗｔ％メタノール水溶液を室温下で３時
間攪拌し、上記シラン化合物中のメトキシ基を加水分解
した。ついでこの溶液をバブルジェットプリンター（商
品名：ＢＪＣ６２０；キヤノン（株）社製）用インクタ
ンクに充填し、実施例１で用いたバブルジェットプリン
タのヘッドに装着した。また上記（１）で用意した基板
もプリンタにセットし、ウェルに対してメトキシ基が加
水分解されたシラン化合物を含むシランカップリング剤
溶液を実施例８と同様にして供給した。この基板を２５
℃、湿度１００％の恒温恒湿槽に３０分放置したのち、
純水で洗浄、スピン乾燥し、その後１００℃で３０分間
ベークして、各ウェルの底面にアミノ基を導入した。
【０１４０】（３）次にスクシイミジル−４−（マレイ
ミドフェニル）ブチレート（アルドリッチ社製）を５ｗ
ｔ％ＤＭＳＯ溶液に最終濃度が５ｗｔ％となるように溶
解し、この溶液を上記（２）と同様にしてインクジェッ
トプリンタで各ウェルに１００ｐｌづつ供給し、ついで
３０℃、湿度１００％の恒温恒湿槽に基板を２時間放置
した。次に基板を純粋で洗浄し、スピン乾燥させて各ウ
ェルの底面にマレイミド基を導入した。
【０１４１】（４）ＤＮＡプローブとして５’末端の水
酸基にリン酸基とヘキサメチレンを介してチオール基を
結合した１８量体のオリゴマー（配列番号：１２）、配
列番号１２のオリゴマーに対して１個のヌクレオチドが
ミスマッチのプローブ（配列番号：１３）、及び配列番
号１２のオリゴマーに対して２個のヌクレオチドがミス
マッチのプローブ（配列番号：１４）（全て日本製粉株
式会社製、ＨＰＬＣグレード）を用意した。以下に配列
番号：１２〜１４の塩基配列とリンケージの構造を示
す。 配列番号：１２5' HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACGACGGCCAGT3' 配列番号：１３5' HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTAAAACCACGGCCAGT3' 配列番号：１４5' HS-(CH2)6-O-PO2-O-TGTATAACCACGCCCAGT3' （５）１０ｍＭのリン酸緩衝液に上記配列番号１２〜１
４の各々のＤＮＡプローブを最終濃度が１０μＭとなる
ように溶解させた。各々のＤＮＡプローブ溶液を上記実
施例８と同様にして上記（３）で作成した基板のウェル
に供給した。各ウェルを顕微鏡で観察したところ、供給
されたＤＮＡプローブ溶液は、ウェルの開口部から盛り
上がって存在しているが疎水性のマトリクスによってウ
ェル内に止まっており、クロスコンタミネーションは観
察されなかった。この基板を３０℃、湿度１００％の恒
温恒湿槽に２時間放直し、その後純水で洗浄、スピン乾
燥を行ない、各々のＤＮＡプローブのチオール基を各ウ
ェルのマレイミド基と反応させ、ＤＮＡプローブを基板
に結合させた。
【０１４２】（６）配列番号１２のＤＮＡプローブに対
して完全相補的な一本鎖ＤＮＡを合成し、ＮａＣｌを５
０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液に、この一本鎖ＤＮＡを最
終浪度が１０μＭとなるように溶解した。この溶液に上
記（５）で得たＤＮＡプローブ結合基板を浸漬し、８０
℃〜２５℃まで２時間かけて降温し、ハイブリダイゼー
ションを行なった。次にＮａＣｌを１０ｍＭの濃度で含
むＴＥ溶液（ｐＨ８）を用いて２０℃で２０分間基板を
洗浄したのち、スピン乾燥機で基板表面の洗浄液を除去
した。
【０１４３】（７）ハイブリッドにインターカレートし
てはじめて蛍光を発する試薬であるＹＯＹＯ−１をＮａ
Ｃｌを濃度５０ｍＭで含むＴＥ溶液に、最終濃度が１０
μＭとなるように溶解した（ｐＨ８）。この溶液を上記
（２）と同様にしてインクジェットプリンタを用いて上
記（６）の処理を行なった基板の各ウェルに、１００ｐ
ｌづつ供給し、実施例８と同様にして蛍光を観察定量し
た（Ｂ励起フィルターを使用）。なおＡｒｇｕｓ５０の
信号増幅レベルは実施例８と同一である。
【０１４４】その結果、配列番号１４のＤＮＡプローブ
を結合させたウェルからは、バックグラウンドとほぼ同
様の、１８００〜２０００の蛍光強度が観察された。一
方配列番号１２のＤＮＡプローブを結合させたウェルか
らは、７５００〜８０００の蛍光強度が観察され、また
配列番号１３のＤＮＡプローブを結合させたウェルから
は、３１００〜３３００の蛍光強度が観察された。更に
固相をＴＥ緩衝液を用いて３５℃で１０分間洗浄して再
度蛍光強度を測定したところ、配列番号１３のＤＮＡプ
ローブを結合させたウェルからはバックグラウンドと同
程度の蛍光強度しか観察されなくなった。
【０１４５】これらの結果から、本実施例に係るプロー
ブアレイを用いることで、各ウェルにおいてハイブリダ
イゼーション反応を行なうことができ、更に配列番号９
と完全相補的な標的核酸を特異的に検出できることが分
かった。
【０１４６】実施例１２ （１）実施例１１と同様にして配列番号１２〜１４のＤ
ＮＡプローブを結合させた基板を用意した。
【０１４７】（２）配列番号１２〜１４のＤＮＡプロー
ブに対して完全相補的な３種類の一本鎖ＤＮＡを合成し
た。ＮａＣｌを５０ｍＭの濃度で含むＴＥ溶液に上記３
種類の一本鎖ＤＮＡを各々の濃度が１０μＭとなる様に
溶解した。なお各々の一本鎖ＤＮＡ溶液のｐＨは８であ
る。バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＣ６２
０；キヤノン（株）社製）用インクタンクを３個用意
し、各々のインクタンクに上記の３種の一本鎖ＤＮＡ溶
液を充填し、実施例１で用いたバブルジェットプリンタ
のヘッドに装着した。また上記（１）で用意した基板も
プリンタにセットし、配列番号１２〜１４のＤＮＡプロ
ーブが結合しているウェルに対して各々完全相補的な一
本鎖ＤＮＡを含む溶液を１つのウェルにつき１００ｐｌ
づつ供給した。この時点で各ウェルの状態を顕微鏡で観
察したところ、液のにじみ、クロスコンタミネーション
は観察されず、またプローブアレイの各ウェルに個別に
反応させるべき物質の溶液を供給できることが分かっ
た。
【０１４８】（３）次に実施例１１と同様にして各ウェ
ルにおいてハイブリダイゼーション反応を行なわせた
後、実施例１１と同様にしてＹＯＹＯ−１溶液を各ウェ
ルに供給し、蛍光を観察することでハイブリッドの検出
を行なった。その結果、全てのウェルから７５００〜８
０００の強度の蛍光が観察された。このことから固相プ
ローブアレイの各ウェルに個別に反応物質を供給し、各
ウェルにおいてプローブと反応物質を反応させ、そして
反応の結果物を検出できることが確認された。
【０１４９】実施例１３ （ＢＭ形成基板をエポキシ基導入用の溶液に浸漬してウ
ェルにエポキシ基を導入した基板を用いたプローブアレ
イの製法） （１）実施例７の（２）の記載に従ってブラックマトリ
ックス付基板を作成した。
【０１５０】（２）実施例７の（１）の記載に従って、
エポキシ基を結合したシラン化合物（γ−グリシドキシ
プロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリン
グ剤（商品名：ＫＢＭ４０３；信越化学工業株式会社
製）の１ｗｔ％水溶液を室温下で１時間攪拌して、該シ
ラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次い
でこの溶液中に上記（１）で用意した固相を室温下で３
０分間浸漬し、その後純水で該固相を洗浄し、窒素ガス
流で水を除去し、１２０℃で５分間ベークし、ウェル底
面にエポキシ基を導入した。この時点でＢＭ表面の水に
対する接触角は９５°と濡れにくい状態で有り、またウ
ェル底部の水に対する接触角は３３°と濡れやすい状態
であった。この様にＢＭ形成後の固相をシランカップリ
ング剤で処理することによってもウェル底面へのエポキ
シ基の導入は可能である。
【０１５１】（３）上記実施例８の（３）及び（４）に
記載した方法に従って、配列番号：９〜１１のＤＮＡプ
ローブをウェルの底面に結合させた。
【０１５２】（４）配列番号９に対して相補的な塩基配
列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成橡で合成し、
５’末端にヘキサノールアミンリンカーを介してテトラ
メチルローダミンを結合した標識化一本鎖ＤＮＡを得
た。この標識化一本鎖ＤＮＡをＮａＣｌを５０ｍＭの濃
度で含むＴＥ溶液（ｐＨ８）に最終濃度が２μＭとなる
ように溶解した。この溶液に上記（３）で得たＤＮＡプ
ローブ結合基板を浸漬し、８０℃から２５℃まで２時間
かけて降温してハイブリダイゼーション反応を行なっ
た。その後プローブアレイを１０ｍＭ ＮａＣｌ／ＴＥ
緩衝液（ｐＨ８）を用いて２９℃で２０分間洗浄してプ
ローブ核酸とハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを
洗い流した。次に実施例８と同様にして各ウェルからの
蛍光量を定量した。
【０１５３】（５）結果 標識化一本鎖ＤＮＡと完全マッチである配列番号９のＤ
ＮＡプローブを結合させたウェルからは８５００〜９４
００の蛍光量が確認された。また配列番号１０のＤＮＡ
プローブを結合させたウェルからは２８００〜３４００
の蛍光量が観察されまた配列番号１１のＤＮＡプローブ
を結合させたウェルからは１２００〜１５００程度の蛍
光量しか観察されなかった。また上記プローブアレイを
１０ｍＭＮａＣｌ／ＴＥ緩衝液（ｐＨ８）を用いて更に
３５℃で１０分間洗浄したところ、配列番号１０のＤＮ
Ａプローブを結合させたウェルからの蛍光量は、バック
グラウンドのレベルにまで低下した。よって本来施例に
かかるプローブアレイを用いてもハイブリッドの標的物
質の特異的な検出が可能であることが分かる。
【０１５４】
【発明の効果】以上説明した様に、本発明によればイン
クジェット技術を用いることによって固相上にプローブ
を含むスポットを、該プローブにダメージを与えること
なしに、且つサテライトスポットを生じさせることなし
にスポッティングすることができる。またこの方法を用
いることによってプローブスポットを互いに独立に、且
つ高密度に備えた高品質なプローブアレイを効率良く製
造することができる。
【０１５５】更に本発明によれば少量の検体からでも標
的物質に関するより多くの情報を、より正確に検査可能
なプローブアレイを得ることができ、またそれを用いる
ことでサンプル中に標的物質が存在するか否かをより正
確、且つ迅速に判定できる。同様にこのプローブアレイ
を用いることでサンプル中の標的物質の構造をより正確
に、且つ迅速に特定することができる。
【０１５６】また本発明によれば、プローブアレイの固
相として表面にマトリクスパターンを形成し、ウェルを
設けた固相を用いることで、固相へのプローブ溶液の供
給、若しくは固相へのサンプルの供給の多少の位置ずれ
にも対処することができる。またマトリクスに種々の機
能を担持させることで標的物質の検出、構造の特定等の
より一層の高精度化が可能になった。
【０１５７】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にチオール基が結合 配列 ACTGGCCGTCGTTTTACA 配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にチオール基が結合配列 ACTGGCCGTTGTTTTACA 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGGCCGCTTTTTTACA 配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGGCATCTTGTTTACA 配列番号：５ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCTGATCAGGC 配列番号：６ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAAAAAAAAA 配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＰＮＡ 他の情報：Ｎ’末端にシステイン残基が結合 配列 ACTGGCCGTCGTTTTACA 配列番号：８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＰＮＡ 他の情報：Ｎ’末端にシステイン残基が結合 配列 ACTGGCCGTTGTTTTACA 配列番号：９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にアミノ基が結合 配列 TGTAAAACGACGGCCAGT 配列番号：１０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にアミノ基が結合 配列 TGTAAAACCACGGCCAGT 配列番号：１１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にアミノ基が結合 配列 TGTATAACCACGCCCAGT 配列番号：１２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にチオール基が結合 配列 TGTAAAACGACGGCCAGT 配列番号：１３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５’末端にチオール基が結合 配列 TGTAAAACCACGGCCAGT 配列番号：１４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：５‘末端にチオール基が結合 配列 TGTATAACCACGCCCAGT
【図面の簡単な説明】
【図１】バブルジェットヘッドを用いてプローブアレイ
を製造する方法の概略説明図である。
【図２】図１のバブルジェットヘッドのＡ−Ａ線断面図
である。
【図３】実施例３においてバブルジェット法によってア
ルミ板上にスポッティングした核酸プローブの量の理論
値と、実際の回収量とを対比するグラフである。
【図４】実施例４においてバブルジェット法によってア
ルミ板上にスポッティングした核酸プローブの量の理論
値と、実際の回収量とを対比するグラフである。
【図５】（ａ）本発明にかかるプローブアレイの一実施
態様の概略平面図である。 （ｂ）図５（ａ）のＢＢ線断面図である。
【図６】実施例８におけるスポッティング方法の説明図
である。
【符号の説明】
１０１ ノズル １０３ 固相 １０４ 液滴 １０５ バブルジェットヘッド １０７ 核酸プローブを含む吐出される液体 １０９ 保護膜 １１１−１、１１１−２ 電極 １１３ 発熱抵抗体層 １１５ 蓄熱層 １１６ 放熱性の良好なアルミナ等で形成されている
基板 １１７ 発熱ヘッド １１９ 吐出オリフィス １２１ メニスカス １２３ 発泡領域

Claims (219)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的物質に対して特異的に結合可能であ
    るプローブを含む液体をインクジェット法により固相表
    面に供給し、該固相表面に付着させる工程を有すること
    を特徴とするプローブの固相へのスポッティング方法。
  2. 【請求項２】 該プローブが一本鎖核酸プローブである
    請求項１記載のスポッティング方法。
  3. 【請求項３】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＤＮＡプ
    ローブを含む請求項２記載のスポッティング方法。
  4. 【請求項４】 該一本鎖核酸プローブがＲＮＡプローブ
    を含む請求項２記載のスポッティング方法。
  5. 【請求項５】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮＡプ
    ローブを含む請求項２記載のスポッティング方法。
  6. 【請求項６】 該固相表面と該一本鎖核酸プローブとが
    各々官能基を有し、該官能基同士は接触によって反応す
    るものである請求項２記載のスポッティング方法。
  7. 【請求項７】 該固相表面が有する官能基がマレイミド
    基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基がチ
    オール（ＳＨ）基である請求項６記載のスポッティング
    方法。
  8. 【請求項８】 該固相がガラス板であり、また該マレイ
    ミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した後、
    該アミノ基とＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）ス
    クシイミドとを反応させて導入したものである請求項７
    記載のスポッティング方法。
  9. 【請求項９】 該固相がガラス板であり、また該マレイ
    ミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した後、
    該アミノ基とスクシイミジル−４−（マレイミドフェニ
    ル）ブチレートとを反応させて導入したものである請求
    項７記載のスポッティング方法。
  10. 【請求項１０】 該ガラス基板上のマレイミド基と該一
    本鎖核酸のチオール基とを少なくとも３０分反応させる
    請求項７記載のスポッティング方法。
  11. 【請求項１１】 該一本鎖核酸が末端にチオール基を有
    する一本鎖ＰＮＡプローブを含み、該マレイミド基と該
    チオール基とを少なくとも２時間以上反応させる請求項
    １０記載のスポッティング方法。
  12. 【請求項１２】 該一本鎖ＰＮＡプローブ末端のチオー
    ル基が、一本鎖ＰＮＡプローブのＮ末端側へのシステイ
    ンの結合によって導入されているものである請求項１１
    記載のスポッティング方法。
  13. 【請求項１３】 該固相表面が有する官能基がエポキシ
    基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基がア
    ミノ基である請求項６記載のスポッティング方法。
  14. 【請求項１４】 該固相がガラス板であり、また該エポ
    キシ基は、該ガラス板の表面にエポキシ基を分子内に有
    するシラン化合物を塗布し、該化合物と該ガラス板とを
    反応させて導入したものである請求項１３記載のスポッ
    ティング方法。
  15. 【請求項１５】 該エポキシ基は、エポキシ基を有する
    ポリグリシジルメタクリレートの該固相上への塗布によ
    って導入したものである請求項１３記載のスポッティン
    グ方法。
  16. 【請求項１６】 該液体が、該液体に対して尿素を５〜
    １０ｗｔ％、グリセリンを５〜１０ｗｔ％、チオジグリ
    コールを５〜１０ｗｔ％、及びアセチレンアルコールを
    １ｗｔ％含んでいる請求項１記載のスポッティング方
    法。
  17. 【請求項１７】 該アセチレンアルコールが下記一般式
    （Ｉ）で示される構造を有するものである請求項１６記
    載のスポッティング方法。 【化１】 （上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はアルキル基を表わ
    し、ｍおよびｎは夫々整数を表わし、ｍ＝０かつｎ＝
    ０、もしくは１≦ｍ＋ｎ≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の
    場合はｍまたはｎは０である。）
  18. 【請求項１８】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの濃
    度が０．０５〜５００μＭである請求項２記載のスポッ
    ティング方法。
  19. 【請求項１９】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの濃
    度が２〜５０μＭである請求項１８記載のスポッティン
    グ方法。
  20. 【請求項２０】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜５
    ０００塩基長である請求項２記載のスポッティング方
    法。
  21. 【請求項２１】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜６
    ０塩基長である請求項２０記載のスポッティング方法。
  22. 【請求項２２】 該インクジェット法がバブルジェット
    法である請求項１記載のスポッティング方法。
  23. 【請求項２３】 該プローブが特定のアミノ酸配列を有
    するオリゴペプチド或いはポリペプチドである請求項１
    記載のスポッティング方法。
  24. 【請求項２４】 該プローブが蛋白質である請求項１記
    載のスポッティング方法。
  25. 【請求項２５】 該蛋白質が抗体である請求項２４記載
    のスポッティング方法。
  26. 【請求項２６】 該蛋白質が酵素である請求項２４記載
    のスポッティング方法。
  27. 【請求項２７】 該プローブが酵素である請求項１記載
    のスポッティング方法。
  28. 【請求項２８】 該液体を、該固相上に１平方インチあ
    たり１００００個以上の密度で、互いに独立したスポッ
    トとなるようにスポッティングする請求項１記載のスポ
    ッティング方法。
  29. 【請求項２９】 該固相は表面が平坦であって、且つ均
    一な表面特性を有している請求項１記載のスポッティン
    グ方法。
  30. 【請求項３０】 隣接するスポットの間隔が該スポット
    の最大幅以上となるようにスポッティングする請求項２
    ９記載のスポッティング方法。
  31. 【請求項３１】 該固相表面の、スポット以外の部位に
    核酸が付着しないようにブロッキングされている請求項
    ３０記載のスポッティング方法。
  32. 【請求項３２】 該ブロッキングが牛血清アルブミンに
    よって達成されている請求項３１記載のスポッティング
    方法。
  33. 【請求項３３】 該固相が表面にパターン状に配置され
    たマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる該
    固相表面を底面とする複数のウェルを備え、該液体を各
    々のウェルに供給する請求項１記載のスポッティング方
    法。
  34. 【請求項３４】 該固相が光学的に透明であり、該マト
    リクスが遮光性である請求項３３記載のスポッティング
    方法。
  35. 【請求項３５】 該マトリクスが樹脂を含む請求項３３
    記載のスポッティング方法。
  36. 【請求項３６】 該マトリクスの表面が疎水性である請
    求項３３記載のスポッティング方法。
  37. 【請求項３７】 該ウェルの底面が親水性である請求項
    ３３記載のスポッティング方法。
  38. 【請求項３８】 該マトリクスの厚さが１〜２０μｍで
    ある請求項３３記載のスポッティング方法。
  39. 【請求項３９】 該ウェルの最長幅が２００μｍである
    請求項３３記載のスポッティング方法。
  40. 【請求項４０】 該マトリクスの幅が、該ウェルの最長
    幅の１／２〜２倍である請求項３３記載のスポッティン
    グ方法。
  41. 【請求項４１】 固相表面の複数の部位に互いに独立し
    ているプローブのスポットを１平方インチ内に１０００
    ０個以上の密度で備えていることを特徴とするプローブ
    アレイ。
  42. 【請求項４２】 該固相は平坦な表面を有し、かつ均一
    な表面特性を有している請求項４１記載のプローブアレ
    イ。
  43. 【請求項４３】 該プローブが一本鎖核酸プローブであ
    る請求項４２記載のプローブアレイ。
  44. 【請求項４４】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＤＮＡ
    プローブを含む請求項４３記載のプローブアレイ。
  45. 【請求項４５】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＲＮＡ
    プローブを含む請求項４３記載のプローブアレイ。
  46. 【請求項４６】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮＡ
    プローブを含む請求項４３記載のプローブアレイ。
  47. 【請求項４７】 該固相表面と一本鎖核酸プローブとが
    各々有する官能基同士の反応によって該一本鎖核酸プロ
    ーブが該固相表面に共有結合によって結合している請求
    項４３記載のプローブアレイ。
  48. 【請求項４８】 該固相表面が有する官能基がマレイミ
    ド基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基が
    チオール（ＳＨ）基である請求項４７記載のプローブア
    レイ。
  49. 【請求項４９】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮＡ
    プローブであり、Ｎ末端側にシステイン残基を有する請
    求項４８記載のプローブアレイ。
  50. 【請求項５０】 該固相表面が有する官能基がエポキシ
    基であり、該一本鎖プローブの有する官能基がアミノ基
    である請求項４７記載のプローブアレイ。
  51. 【請求項５１】 該スポットが、核酸プローブを含む液
    体の該固相上への付与によって形成されたものである請
    求項４２記載のプローブアレイ。
  52. 【請求項５２】 該プローブが特定のアミノ酸配列を有
    するオリゴペプチド或いはポリペプチドである請求項４
    ２記載のプローブアレイ。
  53. 【請求項５３】 該プローブが蛋白質である請求項４２
    記載のプローブアレイ。
  54. 【請求項５４】 該蛋白質が抗体である請求項５３記載
    のプローブアレイ。
  55. 【請求項５５】 該蛋白質が酵素である請求項５３記載
    のプローブアレイ。
  56. 【請求項５６】 該プローブが抗原である請求項４２記
    載のプローブアレイ。
  57. 【請求項５７】 該スポットの間隔が該スポットの最長
    幅以上である請求項４２記載のプローブアレイ。
  58. 【請求項５８】 該固相が表面にパターン状に配置され
    たマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる該
    固相表面を底面とする複数のウェルを備え、各々のスポ
    ットが各々のウェルの位置と一致している請求項４１記
    載のプローブアレイ。
  59. 【請求項５９】 該プローブが一本鎖核酸プローブであ
    る請求項５８記載のプローブアレイ。
  60. 【請求項６０】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＤＮＡ
    プローブを含む請求項５９記載のプローブアレイ。
  61. 【請求項６１】 該一本鎖核酸プローブがＲＮＡプロー
    ブを含む請求項５９記載のプローブアレイ。
  62. 【請求項６２】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮＡ
    プローブを含む請求項５９記載のプローブアレイ。
  63. 【請求項６３】 該固相表面と一本鎖核酸プローブとが
    各々有する官能基同士の反応によって該一本鎖核酸プロ
    ーブが該固相表面に共有結合によって結合している請求
    項６２記載のプローブアレイ。
  64. 【請求項６４】 該固相表面が有する官能基がマレイミ
    ド基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基が
    チオール（ＳＨ）基である請求項６３記載のプローブア
    レイ。
  65. 【請求項６５】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮＡ
    プローブであり、Ｎ末端側にシステイン残基を有する請
    求項６４記載のプローブアレイ。
  66. 【請求項６６】 該固相表面が有する官能基がエポキシ
    基であり、該一本鎖プローブの有する官能基がアミノ基
    である請求項６３記載のプローブアレイ。
  67. 【請求項６７】 該スポットが、該核酸プローブを含む
    液体の該固相上への付与によって形成されたものである
    請求項５８記載のプローブアレイ。
  68. 【請求項６８】 該プローブが特定のアミノ酸配列を有
    するオリゴペプチド或いはポリペプチドである請求項５
    ８記載のプローブアレイ。
  69. 【請求項６９】 該プローブが蛋白質である請求項５８
    記載のプローブアレイ。
  70. 【請求項７０】 該蛋白質が抗体である請求項６９記載
    のプローブアレイ。
  71. 【請求項７１】 該蛋白質が酵素である請求項６９記載
    のプローブアレイ。
  72. 【請求項７２】 該プローブが抗原である請求項５８記
    載のプローブアレイ。
  73. 【請求項７３】 該マトリクスが遮光性である請求項５
    ８記載のプローブアレイ。
  74. 【請求項７４】 該固相が光学的に透明である請求項７
    ３記載のプローブアレイ。
  75. 【請求項７５】 該マトリクスが樹脂を含む請求項５８
    記載のプローブアレイ。
  76. 【請求項７６】 該ウェルにのみ該プローブが付着して
    いる請求項５８記載のプローブアレイ。
  77. 【請求項７７】 該マトリクスの厚さが１〜２０μｍで
    ある請求項５８記載のプローブアレイ。
  78. 【請求項７８】 該ウェルの最長幅が２００μｍである
    請求項５８記載のプローブアレイ。
  79. 【請求項７９】 該ウェルの間隔が、該ウェルの最長幅
    の１／２〜２倍である請求項５８記載のプローブアレ
    イ。
  80. 【請求項８０】 互いに異なる種類のプローブからなる
    スポットを少なくとも２つ有する請求項４１記載のプロ
    ーブアレイ。
  81. 【請求項８１】 固相表面の複数の箇所に独立して、標
    的物質に対して特異的に結合可能であるプローブを含む
    スポットを有するプローブアレイの製造方法であって、
    該プローブを含む液体をインクジェット法を用いて該固
    相表面の所定の位置に供給し、付着させる工程を有する
    ことを特徴とするプローブアレイの製造方法。
  82. 【請求項８２】 該プローブが一本鎖核酸プローブであ
    る請求項８１記載の製造方法。
  83. 【請求項８３】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＤＮＡ
    プローブを含む請求項８２記載の製造方法。
  84. 【請求項８４】 該一本鎖核酸プローブがＲＮＡプロー
    ブを含む請求項８２記載の製造方法。
  85. 【請求項８５】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮＡ
    プローブを含む請求項８２記載の製造方法。
  86. 【請求項８６】 該固相表面と該一本鎖核酸プローブと
    が各々官能基を有し、該官能基同士は接触によって反応
    するものである請求項８２記載の製造方法。
  87. 【請求項８７】 該固相表面が有する官能基がマレイミ
    ド基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基が
    チオール（ＳＨ）基である請求項８６記載の製造方法。
  88. 【請求項８８】 該固相がガラス板であり、また該マレ
    イミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した
    後、該アミノ基とＮ−（６−マレイミドカプロイロキ
    シ）スクシイミドとを反応させて導入したものである請
    求項８７記載の製造方法。
  89. 【請求項８９】 該固相がガラス板であり、また該マレ
    イミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した
    後、該アミノ基とスクシイミジル−４−（マレイミドフ
    ェニル）ブチレートとを反応させて導入したものである
    請求項８７記載の製造方法。
  90. 【請求項９０】 該ガラス基板上のマレイミド基と該一
    本鎖核酸のチオール基とを少なくとも３０分反応させる
    請求項８７記載の製造方法。
  91. 【請求項９１】 該一本鎖核酸が末端にチオール基を有
    する一本鎖ＰＮＡプローブを含み、該マレイミド基と該
    チオール基とを少なくとも２時間以上反応させる請求項
    ８７記載の製造方法。
  92. 【請求項９２】 該一本鎖ＰＮＡプローブ末端のチオー
    ル基が、一本鎖ＰＮＡプローブのＮ末端側へのシステイ
    ンの結合によって導入されているものである請求項９１
    記載の製造方法。
  93. 【請求項９３】 該固相表面が有する官能基がエポキシ
    基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基がア
    ミノ基である請求項８６記載の製造方法。
  94. 【請求項９４】 該固相がガラス板であり、また該エポ
    キシ基は、該ガラス板の表面にエポキシ基を分子内に有
    するシラン化合物を塗布し、該化合物と該ガラス板とを
    反応させて導入したものである請求項９３記載の製造方
    法。
  95. 【請求項９５】 該エポキシ基は、エポキシ基を有する
    ポリグリシジルメタクリレート樹脂の該固相上への塗布
    によって導入したものである請求項９３記載の製造方
    法。
  96. 【請求項９６】 該液体が、該液体に対して尿素を５〜
    １０ｗｔ％、グリセリンを５〜１０ｗｔ％、チオジグリ
    コールを５〜１０ｗｔ％、及びアセチレンアルコールを
    １ｗｔ％含んでいる請求項８２記載の製造方法。
  97. 【請求項９７】 該アセチレンアルコールが下記一般式
    （Ｉ）で示される構造を有するものである請求項９６記
    載の製造方法。 【化２】 （上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はアルキル基を表わ
    し、ｍおよびｎは夫々整数を表わし、ｍ＝０かつｎ＝
    ０、もしくは１≦ｍ＋ｎ≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の
    場合はｍまたはｎは０である。）
  98. 【請求項９８】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの濃
    度が０．０５〜５００μＭである請求項８２記載の製造
    方法。
  99. 【請求項９９】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの濃
    度が２〜５０μＭである請求項９８記載の製造方法。
  100. 【請求項１００】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜
    ５０００塩基長である請求項８２記載の製造方法。
  101. 【請求項１０１】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜
    ６０塩基長である請求項１００記載の製造方法。
  102. 【請求項１０２】 該インクジェット法がバブルジェッ
    ト法である請求項８１記載の製造方法。
  103. 【請求項１０３】 該一本鎖核酸プローブを含む液体を
    該固相上に、１平方インチあたり１００００個以上の密
    度で、互いに独立したスポットとなるようにスポッティ
    ングする請求項８１記載の製造方法。
  104. 【請求項１０４】 該プローブが特定のアミノ酸配列を
    有するオリゴペプチド或いはポリペプチドである請求項
    ８１記載の製造方法。
  105. 【請求項１０５】 該プローブが蛋白質である請求項８
    １記載の製造方法。
  106. 【請求項１０６】 該蛋白質が抗体である請求項１０５
    記載の製造方法。
  107. 【請求項１０７】 該蛋白質が酵素である請求項１０５
    記載の製造方法。
  108. 【請求項１０８】 該プローブが抗原である請求項８１
    記載の製造方法。
  109. 【請求項１０９】 該固相は表面が平坦であって、且つ
    均一な表面特性を有している請求項８１記載の製造方
    法。
  110. 【請求項１１０】 固相に該一本鎖核酸を固定させた
    後、該一本鎖核酸が固定化されている部位以外の部位に
    核酸が付着しないようにブロッキングを行なう請求項１
    ０９記載の製造方法。
  111. 【請求項１１１】 該ブロッキングが、該一本鎖核酸が
    固定された固相をウシ血清アルブミン水溶液に浸す工程
    を有する請求項１１０記載の製造方法。
  112. 【請求項１１２】 該ウシ血清アルブミンの濃度が０．
    １〜５％である請求項１１１記載の製造方法。
  113. 【請求項１１３】 該固相のウシ血清アルブミン水溶液
    への浸漬を少なくとも２時間行なう請求項１１１記載の
    製造方法。
  114. 【請求項１１４】 隣接するスポットの間隔が該スポッ
    トの最大幅以上となるようにスポッティングする請求項
    １０９記載の製造方法。
  115. 【請求項１１５】 該固相が表面にパターン状に配置さ
    れたマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる
    該固相表面を底面とする複数のウェルを備え、該液体を
    各々のウェルに供給する請求項８１記載の製造方法。
  116. 【請求項１１６】 該固相が光学的に透明であり、該マ
    トリクスが遮光性である請求項１１５記載の製造方法。
  117. 【請求項１１７】 該マトリクスが樹脂を含む請求項１
    １５記載の製造方法。
  118. 【請求項１１８】 該マトリクスの表面が疎水性である
    請求項１１５記載の製造方法。
  119. 【請求項１１９】 該ウェルの底面が親水性である請求
    項１１５記載の製造方法。
  120. 【請求項１２０】 該ウェルの最長幅が２００μｍであ
    る請求項１１５記載の製造方法。
  121. 【請求項１２１】 該マトリクスの幅が、該ウェルの最
    長幅の１／２〜２倍である請求項１１５記載の製造方
    法。
  122. 【請求項１２２】 該マトリクスの厚さが１〜２０μｍ
    である請求項１１５記載の製造方法。
  123. 【請求項１２３】 該マトリクスパターンを、フォトリ
    ソグラフィー法によって形成する請求項１１５記載の製
    造方法。
  124. 【請求項１２４】 該フォトリソグラフィー法が、該基
    板の第１の表面に樹脂層を形成し、該樹脂層上にフォト
    レジスト層を形成し、該フォトレジスト層を該マトリク
    スパターンに対応するようにパターン状に露光し、現像
    してフォトレジストのパターンを該樹脂層上に形成する
    工程；及び該フォトレジストのパターンをマスクとして
    該樹脂層をパターニングした後、該フォトレジストのパ
    ターンを除去する工程、を有する請求項１２３記載の製
    造方法。
  125. 【請求項１２５】 該フォトリソグラフィー法が、該基
    板の第１の表面に感光性樹脂層を形成し、該感光性樹脂
    層を該マトリクスパターンに対応するようにパターン状
    に露光し、現像する工程を有する請求項１２３記載の製
    造方法。
  126. 【請求項１２６】 該感光性樹脂層が、ＵＶレジスト、
    ＤＥＥＰ−ＵＶレジスト、または紫外線硬化樹脂を含む
    ものである請求項１２５記載の製造方法。
  127. 【請求項１２７】 該ＵＶレジストが、環化ポリイソプ
    レン−芳香族ビスアジド系レジスト、フェノール樹脂−
    芳香族アジド化合物系レジスト、またはノボラック樹脂
    −ジアゾナフトキノン系レジストである請求項１２６記
    載の製造方法。
  128. 【請求項１２８】 該ＤＥＥＰ−ＵＶレジストが放射線
    分解型レジストまたは溶解抑制剤系レジストである請求
    項１２６記載の製造方法。
  129. 【請求項１２９】 該放射線分解型ポリマーレジスト
    が、ポリメチルメタクリレート、ポリメチレンスルホ
    ン、ポリヘキサフルオロブチルメタクリレート、ポリメ
    チルイソプロペニルケトンまたは臭化ポリ−１−トリメ
    チルシリルプロピンから選ばれる少なくとも１つである
    請求項１２８記載の製造方法。
  130. 【請求項１３０】 該溶解抑制剤系レジストが、コール
    酸ｏ−ニトロベンジルエステルである請求項１２８記載
    の製造方法。
  131. 【請求項１３１】 該ＤＥＥＰ−ＵＶレジストがポリビ
    ニルフェノール−３，３’−ジアジドジフェニルスルホ
    ンまたはメタクリル酸グリシジルである請求項１２６記
    載の製造方法。
  132. 【請求項１３２】 該感光性樹脂層のパターニングによ
    って形成したマトリクスパターンを、更にポストベーク
    して該マトリクスパターンの撥水性を向上させる請求項
    １２５記載の製造方法。
  133. 【請求項１３３】 該プローブが有する官能基と共有結
    合を形成可能な官能基を該固相表面に、該ウェルの形成
    に先立って導入する請求項１１５記載の製造方法。
  134. 【請求項１３４】 該プローブが有する官能基と共有結
    合を形成可能な官能基を該固相表面に、該ウェルの形成
    後に導入する請求項１１５記載の製造方法。
  135. 【請求項１３５】 該固相表面に、該官能基を導入する
    ための化合物を含む溶液を該ウェルに付与する請求項１
    ３４記載の製造方法。
  136. 【請求項１３６】 該溶液のウェルへの付与をインクジ
    ェット法を利用して行なう請求項１３５記載の製造方
    法。
  137. 【請求項１３７】 該溶液がエポキシ基又はアミノ基を
    分子内に有するシラン化合物を含むシランカップリング
    剤である請求項１３６記載の製造方法。
  138. 【請求項１３８】 該溶液がガラス基板上のアミノ基と
    反応してガラス基板上にマレイミド基を導入させること
    のできる化合物を含む請求項１３６記載の製造方法。
  139. 【請求項１３９】 該化合物がＮ−マレイミドカプロイ
    ロキシスクシンイミドまたはスクシイミジル−４−（マ
    レイミドフェニル）ブチレートである請求項１３８記載
    の製造方法。
  140. 【請求項１４０】 サンプル中に含まれている可能性の
    ある標的物質に対して特異的に結合するプローブを固相
    上に互いに独立した複数のスポットとして有するプロー
    ブアレイの各々のスポットと該サンプルとを接触させ、
    該固相上にて該標的物質及び該プローブとの反応物を検
    出して該サンプル中の該標的物質の有無を検出する方法
    において、該スポットの各々が、該プローブを含む液体
    をインクジェット法によって固相上にスポッティングす
    ることによって形成されたものであることを特徴とする
    標的物質の検出方法。
  141. 【請求項１４１】 該標的物質が所定の塩基配列を備え
    た標的一本鎖核酸であり、該プローブが該塩基配列に対
    して相補的な塩基配列を有する標的一本鎖核酸プローブ
    である請求項１４０記載の検出方法。
  142. 【請求項１４２】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＤＮ
    Ａプローブを含む請求項１４１記載の検出方法。
  143. 【請求項１４３】 該一本鎖核酸プローブがＲＮＡプロ
    ーブを含む請求項１４１記載の検出方法。
  144. 【請求項１４４】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮ
    Ａプローブを含む請求項１４１記載の検出方法。
  145. 【請求項１４５】 該固相表面と該一本鎖核酸プローブ
    とが各々官能基を有し、該官能基同士は接触によって反
    応するものである請求項１４１記載の検出方法。
  146. 【請求項１４６】 該固相表面が有する官能基がマレイ
    ミド基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基
    がチオール（ＳＨ）基である請求項１４５記載の検出方
    法。
  147. 【請求項１４７】 該固相がガラス板であり、また該マ
    レイミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した
    後、該アミノ基とＮ−（６−マレイミドカプロイロキ
    シ）スクシイミドとを反応させて導入したものである請
    求項１４６記載の検出方法。
  148. 【請求項１４８】 該固相がガラス板であり、また該マ
    レイミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した
    後、該アミノ基とスクシイミジル−４−（マレイミドフ
    ェニル）ブチレートとを反応させて導入したものである
    請求項１４６記載の検出方法。
  149. 【請求項１４９】 該ガラス基板上のマレイミド基と該
    一本鎖核酸のチオール基とを少なくとも３０分反応させ
    る請求項１４６記載の検出方法。
  150. 【請求項１５０】 該一本鎖核酸が末端にチオール基を
    有する一本鎖ＰＮＡプローブを含み、該マレイミド基と
    該チオール基とを少なくとも２時間以上反応させる請求
    項１４９記載の検出方法。
  151. 【請求項１５１】 該一本鎖ＰＮＡプローブ末端のチオ
    ール基が、一本鎖ＰＮＡプローブのＮ末端側へのシステ
    インの結合によって導入されているものである請求項１
    ４６記載の検出方法。
  152. 【請求項１５２】 該固相表面が有する官能基がエポキ
    シ基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基が
    アミノ基である請求項１４５記載の検出方法。
  153. 【請求項１５３】 該固相がガラス板であり、また該エ
    ポキシ基は、該ガラス板の表面にエポキシ基を分子内に
    有するシラン化合物を塗布し、該化合物と該ガラス板と
    を反応させて導入したものである請求項１５２記載の検
    出方法。
  154. 【請求項１５４】 該エポキシ基は、エポキシ基を有す
    るポリグリシジルメタクリレート樹脂の該固相上への塗
    布によって導入したものである請求項１５２記載の検出
    方法。
  155. 【請求項１５５】 該液体が、該液体に対して尿素を５
    〜１０ｗｔ％、グリセリンを５〜１０ｗｔ％、チオジグ
    リコールを５〜１０ｗｔ％、及びアセチレンアルコール
    を１ｗｔ％含んでいる請求項１４１記載の検出方法。
  156. 【請求項１５６】 該アセチレンアルコールが下記一般
    式（Ｉ）で示される構造を有するものである請求項１５
    ５記載の検出方法。 【化３】 （上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はアルキル基を表わ
    し、ｍおよびｎは夫々整数を表わし、ｍ＝０かつｎ＝
    ０、もしくは１≦ｍ＋ｎ≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の
    場合はｍまたはｎは０である。）
  157. 【請求項１５７】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの
    濃度が０．０５〜５００μＭである請求項１５５記載の
    検出方法。
  158. 【請求項１５８】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの
    濃度が２〜５０μＭである請求項１５７記載の検出方
    法。
  159. 【請求項１５９】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜
    ５０００塩基長である請求項１５５記載の検出方法。
  160. 【請求項１６０】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜
    ６０塩基長である請求項１５９記載の検出方法。
  161. 【請求項１６１】 該インクジェット法がバブルジェッ
    ト法である請求項１４１記載の検出方法。
  162. 【請求項１６２】 該プローブが特定のアミノ酸配列を
    有するオリゴペプチド或いはポリペプチドである請求項
    １４０記載の検出方法。
  163. 【請求項１６３】 該プローブが蛋白質である請求項１
    ４０記載の検出方法。
  164. 【請求項１６４】 該蛋白質が抗体である請求項１６３
    記載の検出方法。
  165. 【請求項１６５】 該蛋白質が酵素である請求項１６３
    記載の検出方法。
  166. 【請求項１６６】 該プローブが抗原である請求項１４
    ０記載の検出方法。
  167. 【請求項１６７】 該液体を、該固相上に１平方インチ
    あたり１００００個以上の密度で、互いに独立したスポ
    ットとなるようにスポッティングする請求項１４０記載
    の検出方法。
  168. 【請求項１６８】 該固相は表面が平坦であって、且つ
    均一な表面特性を有している請求項１４０記載の検出方
    法。
  169. 【請求項１６９】 隣接するスポットの間隔が該スポッ
    トの最大幅以上となるようにスポッティングする請求項
    １６８記載の検出方法。
  170. 【請求項１７０】 該固相表面の、スポット以外の部位
    に核酸が付着しないようにブロッキングされている請求
    項１６８記載の検出方法。
  171. 【請求項１７１】 該ブロッキングが牛血清アルブミン
    によって達成されている請求項１７０記載の検出方法。
  172. 【請求項１７２】 該固相が表面にパターン状に配置さ
    れたマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる
    該固相表面を底面とする複数のウェルを備え、該液体を
    各々のウェルに供給する請求項１４０記載の検出方法。
  173. 【請求項１７３】 該固相が光学的に透明であり、該マ
    トリクスが遮光性である請求項１７２記載の検出方法。
  174. 【請求項１７４】 該マトリクスが樹脂を含む請求項１
    ７２記載の検出方法。
  175. 【請求項１７５】 該マトリクスの表面が疎水性である
    請求項１７２記載の検出方法。
  176. 【請求項１７６】 該ウェルの底面が親水性である請求
    項１７２記載の検出方法。
  177. 【請求項１７７】 該マトリクスの厚さが１〜２０μｍ
    である請求項１７２記載の検出方法。
  178. 【請求項１７８】 該ウェルの最長幅が２００μｍであ
    る請求項１７２記載の検出方法。
  179. 【請求項１７９】 該マトリクスの幅が、該ウェルの最
    長幅の１／２〜２倍である請求項１７２記載の検出方
    法。
  180. 【請求項１８０】 試料中に含まれる標的物質の構造を
    特定する方法であって、固相表面に該特定の物質に対し
    て特異的に結合するプローブのスポットを備えたプロー
    ブアレイを用意する工程；該試料を該スポットに接触さ
    せる工程；及び該標的物質と該プローブとの結合を検出
    する工程、を有することを特徴とする標的物質の構造の
    特定化方法。
  181. 【請求項１８１】 該特定の物質が標的一本鎖核酸であ
    り、特定化する構造が該標的一本鎖核酸の塩基配列であ
    り、該プローブアレイは固相上に異なる塩基配列の一本
    鎖核酸を各々含む複数のスポットを備え、該スポットの
    少なくとも１つは、該標的一本鎖核酸の予測される塩基
    配列に対して相補的な塩基配列の一本鎖核酸を含み、且
    つ該複数のスポットは、各々の一本鎖核酸を含む液体を
    インクジェット法を用いて該固相上に付着せしめたもの
    である請求項１８０記載の特定化方法。
  182. 【請求項１８２】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＤＮ
    Ａプローブを含む請求項１８１記載の特定化方法。
  183. 【請求項１８３】 該一本鎖核酸プローブがＲＮＡプロ
    ーブを含む請求項１８１記載の特定化方法。
  184. 【請求項１８４】 該一本鎖核酸プローブが一本鎖ＰＮ
    Ａプローブを含む請求項１８１記載の特定化方法。
  185. 【請求項１８５】 該固相表面と該一本鎖核酸プローブ
    とが各々官能基を有し、該官能基同士は接触によって反
    応するものである請求項１８１記載の特定化方法。
  186. 【請求項１８６】 該固相表面が有する官能基がマレイ
    ミド基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基
    がチオール（ＳＨ）基である請求項１８１記載の特定化
    方法。
  187. 【請求項１８７】 該固相がガラス板であり、また該マ
    レイミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した
    後、該アミノ基とＮ−（６−マレイミドカプロイロキ
    シ）スクシイミドとを反応させて導入したものである請
    求項１８６記載の特定化方法。
  188. 【請求項１８８】 該固相がガラス板であり、また該マ
    レイミド基は、該ガラス板の表面にアミノ基を導入した
    後、該アミノ基とスクシイミジル−４−（マレイミドフ
    ェニル）ブチレートとを反応させて導入したものである
    請求項１８６記載の特定化方法。
  189. 【請求項１８９】 該ガラス基板上のマレイミド基と該
    一本鎖核酸のチオール基とを少なくとも３０分反応させ
    る請求項１８６記載の特定化方法。
  190. 【請求項１９０】 該一本鎖核酸が末端にチオール基を
    有する一本鎖ＰＮＡプローブを含み、該マレイミド基と
    該チオール基とを少なくとも２時間以上反応させる請求
    項１８９記載の特定化方法。
  191. 【請求項１９１】 該一本鎖ＰＮＡプローブ末端のチオ
    ール基が、一本鎖ＰＮＡプローブのＮ末端側へのシステ
    インの結合によって導入されているものである請求項１
    ８６記載の特定化方法。
  192. 【請求項１９２】 該固相表面が有する官能基がエポキ
    シ基であって、該一本鎖核酸プローブの有する官能基が
    アミノ基である請求項１８５記載の特定化方法。
  193. 【請求項１９３】 該固相がガラス板であり、また該エ
    ポキシ基は、該ガラス板の表面にエポキシ基を分子内に
    有するシラン化合物を塗布し、該化合物と該ガラス板と
    を反応させて導入したものである請求項１９２記載の特
    定化方法。
  194. 【請求項１９４】 該エポキシ基は、エポキシ基を有す
    るポリグリシジルメタクリレート樹脂の該固相上への塗
    布によって導入したものである請求項１９２記載の特定
    化方法。
  195. 【請求項１９５】 該液体が、該液体に対して尿素を５
    〜１０ｗｔ％、グリセリンを５〜１０ｗｔ％、チオジグ
    リコールを５〜１０ｗｔ％、及びアセチレンアルコール
    を１ｗｔ％含んでいる請求項１８１記載の特定化方法。
  196. 【請求項１９６】 該アセチレンアルコールが下記一般
    式（Ｉ）で示される構造を有するものである請求項１９
    ５記載の特定化方法。 【化４】 （上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はアルキル基を表わ
    し、ｍおよびｎは夫々整数を表わし、ｍ＝０かつｎ＝
    ０、もしくは１≦ｍ＋ｎ≦３０であって、ｍ＋ｎ＝１の
    場合はｍまたはｎは０である。）
  197. 【請求項１９７】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの
    濃度が０．０５〜５００μＭである請求項１９５記載の
    特定化方法。
  198. 【請求項１９８】 該液体中の該一本鎖核酸プローブの
    濃度が２〜５０μＭである請求項１９７記載の特定化方
    法。
  199. 【請求項１９９】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜
    ５０００塩基長である請求項１９７記載の特定化方法。
  200. 【請求項２００】 該一本鎖核酸プローブの長さが２〜
    ６０塩基長である請求項１９９記載の特定化方法。
  201. 【請求項２０１】 該インクジェット法がバブルジェッ
    ト法である請求項１８１記載の特定化方法。
  202. 【請求項２０２】 該プローブが特定のアミノ酸配列を
    有するオリゴペプチド或いはポリペプチドである請求項
    １８０記載の特定化方法。
  203. 【請求項２０３】 該プローブが蛋白質である請求項１
    ８０記載の特定化方法。
  204. 【請求項２０４】 該蛋白質が抗体である請求項２０３
    記載の特定化方法。
  205. 【請求項２０５】 該蛋白質が酵素である請求項２０３
    記載の特定化方法。
  206. 【請求項２０６】 該プローブが抗原である請求項１８
    ０記載の特定化方法。
  207. 【請求項２０７】 該液体を、該固相上に１平方インチ
    あたり１００００個以上の密度で、互いに独立したスポ
    ットとなるようにスポッティングする請求項１８０記載
    の特定化方法。
  208. 【請求項２０８】 該固相は表面が平坦であって、且つ
    均一な表面特性を有している請求項１８０記載の特定化
    方法。
  209. 【請求項２０９】 隣接するスポットの間隔が該スポッ
    トの最大幅以上となるようにスポッティングする請求項
    ２０８記載の特定化方法。
  210. 【請求項２１０】 該固相表面の、スポット以外の部位
    に核酸が付着しないようにブロッキングされている請求
    項２０８記載の特定化方法。
  211. 【請求項２１１】 該ブロッキングが牛血清アルブミン
    によって達成されている請求項２１０記載の特定化方
    法。
  212. 【請求項２１２】 該固相が表面にパターン状に配置さ
    れたマトリクスで区画され、パターン状に露出してなる
    該固相表面を底面とする複数のウェルを備え、該液体を
    各々のウェルに供給する請求項１８０記載の特定化方
    法。
  213. 【請求項２１３】 該固相が光学的に透明であり、該マ
    トリクスが遮光性である請求項２１２記載の特定化方
    法。
  214. 【請求項２１４】 該マトリクスが樹脂を含む請求項２
    １２記載の特定化方法。
  215. 【請求項２１５】 該マトリクスの表面が疎水性である
    請求項２１２記載の特定化方法。
  216. 【請求項２１６】 該ウェルの底面が親水性である請求
    項２１２記載の特定化方法。
  217. 【請求項２１７】 該マトリクスの厚さが１〜２０μｍ
    である請求項２１２記載の特定化方法。
  218. 【請求項２１８】 該ウェルの最長幅が２００μｍであ
    る請求項２１２記載の特定化方法。
  219. 【請求項２１９】 該マトリクスの幅が、該ウェルの最
    長幅の１／２〜２倍である請求項２１２記載の特定化方
    法。
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