JPH036461B2 - - Google Patents

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- G—PHYSICS
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Description

請求の範囲１サンプル中のビタミンB₁₂量を測定するため
の放射性同位体希釈検定法において、サンプルを、既知量のビタミンB₁₂放射性同位
体と接触させ、およびビタミンB₁₂と特異的結合
性蛋白質を含有するビタミンB₁₂類似体と反応性
を有しない物質と接触させることからなる、サン
プル中のビタミンB₁₂量を測定するための放射性
同位体希釈検定法。２ビタミンB₁₂の供給源が哺乳動物の組織また
は哺乳動物の血液である請求の範囲第１項記載の
放射性同位体希釈検定法。３ビタミンB₁₂の供給源がヒトの血液である請
求の範囲第１項記載の放射性同位体希釈検定法。４ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質が内因子
である請求の範囲第１項記載の放射性同位体希釈
検定法。５ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質がヒト内
因子（IF）、豚IF、ウサギIFからなる群から選ば
れる蛋白質から実質上なる請求の範囲第４項記載
の放射性同位体希釈検定法。６ビタミンB₁₂類似体をも含有するサンプル中
のビタミンB₁₂（コバラミン）量を検定する放射
性同位体希釈検定法であつて、前記サンプルを既知量のビタミンB₁₂放射性同
位体と接触させ、および下記の放射性同位体希釈
検定用組成物と接触させることからなる、ビタミ
ンB₁₂類似体をも含有するサンプル中のビタミン
B₁₂（コバラミン）量を検定する放射性同位体希
釈検定法；放射性同位体希釈検定用組成物：ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質を含有する
ビタミンB₁₂類似体と反応性を有しない物質と、粗製検定組成物中に共存する放射性同位体希釈
検定技法上の不純物であるビタミンB₁₂非特異的
結合性蛋白質のビタミンB₁₂との結合能力を不活
性化してある１種またはそれ以上の不活性化ビタ
ミンB₁₂非特異的結合性蛋白質とを含み、且つ被検定サンプル中に存在するビタミンB₁₂
およびビタミンB₁₂類似体と反応できる形態の他
の物質を含まない放射性同位体希釈検定組成物。７ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質は、１種
またはそれ以上のビタミンB₁₂類似体で処理して
ビタミンB₁₂類似体と結合させることによりビタ
ミンB₁₂との結合能力を不活性化すなわち非作用
性化してある請求の範囲第６項記載の放射性同位
体希釈検定法。８ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質の不活性
化処理に使用するビタミンB₁₂類似体の少なくと
も一部がコビナミド、CN−Cbl（bde−OH）およ
び（３，５，６−Me₃BZA）（CN，OH）Cbaか
らなる群から選ばれるビタミンB₁₂類似体である
請求の範囲第７項記載の放射性同位体希釈検定
法。９ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質は１種ま
たはそれ以上の蛋白質加水分解酵素で処理するこ
とにより不活性化すなわち非作用性化してあり、
該酵素はビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質と実
質上反応性を有しない請求の範囲第６項記載の放
射性同位体希釈検定法。１０ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質が内因
子蛋白質を含み、ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋
白質がＲ蛋白質を含む、請求の範囲第９項記載の
放射性同位体希釈検定法。１１蛋白質加水分解酵素の少なくとも一部がト
リプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼ
からなる群から選ばれる請求の範囲第９項記載の
放射性同位体希釈検定法。１２蛋白質加水分解酵素が粗製検定組成物に基
づいて0.01mg／ml〜100mg／mlの量で存在する請
求の範囲第９項記載の放射性同位体希釈検定法。１３蛋白質加水分解酵素が粗製検定組成物に基
づいて0.05mg／ml〜40mg／mlの量で存在する請求
の範囲第１１項記載の放射性同位体希釈検定法。１４ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質を含有
するビタミンB₁₂類似体と反応性を有しない物質
からなる、ビタミンB₁₂（コバラミン）放射性同
位体希釈検定用組成物。１５ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質を含有
するビタミンB₁₂類似体と反応性を有しない物質
と、粗製検定組成物中に共存する放射性同位体希釈
検定技法上の不純物であるビタミンB₁₂非特異的
結合性蛋白質のビタミンB₁₂との結合能力をビタ
ミンB₁₂類似体と結合させることにより不活性化
してある１種またはそれ以上のビタミンB₁₂非特
異的結合性蛋白質とビタミンB₁₂類似体との結合
体と、前記ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質を不活
性化後に残存するビタミンB₁₂類似体とを含み、
且つ被検定サンプル中に存在するビタミンB₁₂お
よびビタミンB₁₂類似体と反応できる形態の他の
物質を含まない放射性同位体希釈検定用組成物。１６ビタミンB₁₂と特異的結合性蛋白質が内因
子蛋白質を含み、ビタミンB₁₂類似体で処理する
ことによりビタミンB₁₂との結合能力を不活性化
してあるビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質がＲ
蛋白質を含む、請求の範囲第１５項記載の放射性
同位体希釈検定用組成物。１７ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質の不活
性化処理に使用するビタミンB₁₂類似体の少なく
とも一部がコビナミド、CN−Cbl（bde−OH）お
よび（３，５，６−Me₃BZA）（CN，OH）Cba
からなる群から選ばれるビタミンB₁₂類似体であ
る請求の範囲第１６項記載の放射性同位体希釈検
定用組成物。１８ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質の不活
性化処理に使用するビタミンB₁₂類似体が検定組
成物中の該非特異的結合性蛋白質のモル量の１倍
〜100000倍モル過剰量で存在する請求の範囲第１
５項記載の放射性同位体希釈検定用組成物。１９ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質の不活
性化処理に使用するビタミンB₁₂類似体が検定組
成物中の該非特異的結合性蛋白質のモル量の10倍
〜10000倍モル過剰量で存在する請求の範囲第１
５項記載の放射性同位体希釈検定用組成物。２０ビタミンB₁₂非特異的結合性蛋白質の不活
性化処理に使用するビタミンB₁₂類似体の少なく
とも一部がコビナミドである請求の範囲第１６項
記載の放射性同位体希釈検定用組成物。２１ビタミンB₁₂と特異的結合性物質と放射性
同位体希釈検定技法上の不純物であるビタミン
B₁₂非特異的結合性物質とを含む粗製混合物を、
前記ビタミンB₁₂非特異的結合性物質との反応性
を有し前記ビタミンB₁₂と特異的結合性物質との
反応性を有しないビタミンB₁₂類似体で処理して
ビタミンB₁₂非特異的結合性物質の実質上全部を
不活性化すなわち非作用性化することからなる、
ビタミンB₁₂類似体を含有するサンプル中のビタ
ミンB₁₂（コバラミン）の放射性同位体希釈検定
用組成物の製法。２２粗製混合物中のビタミンB₁₂と特異的結合
性物質は内因子結合性蛋白質を含み、ビタミン
B₁₂非特異的結合性物質がＲ蛋白質を含む、請求
の範囲第２１項記載の放射性同位体希釈検定用組
成物の製法。２３粗製混合物中のビタミンB₁₂非特異的結合
性蛋白質の不活性化に使用するビタミンB₁₂類似
体の少なくとも一部がコビナミド、CN−Cbl
（bde−OH）および（３，５，６−Me₃BZA）
（CN，OH）Cbaからなる群から選ばれる請求の
範囲の第２２項記載の放射性同位体希釈検定用組
成物の製法。２４粗製混合物中のビタミンB₁₂非特異的結合
性蛋白質の不活性化に使用するビタミンB₁₂類似
体が検定組成物中の前記非特異的結合性蛋白質の
モル量の１倍〜100000倍モル過剰量で存在する請
求の範囲第２２項記載の放射性同位体希釈検定用
組成物の製法。２５粗製混合物中のビタミンB₁₂非特異的結合
性蛋白質の不活性化に使用するビタミンB₁₂類似
体が検定組成物中の前記非特異的結合性蛋白質の
モル量の10倍〜10000倍モル過剰量で存在する請
求の範囲第２２項記載の放射性同位体希釈検定用
組成物の製法。本発明の背景技術本発明の分野本発明は哺乳類の血液および組織を検定するた
めの方法および材料に関する。更に詳しくは本発
明はヒトの血漿中のビタミンB₁₂およびビタミン
B₁₂類似体の量を決定する方法および材料に関す
る。先行技術長年に亘つて人体中のビタミンB₁₂の量の検定
は例えば悪性貧血症、胃切除後遺症、栄養失調、
腸管障害および他の疾病のようなある種の疾病の
鑑別および治療に対する価値ある技術であると認
められてきた。最初はビタミンB₁₂はユーグレ
ナ・グラシリス（Euglena Gracilis）またはラク
トバチルス・ライヒマニ（Lactobacillus
Leichmanni）のいずれかを使用して微生物学的
方法により検定された。最近になつてビタミン
B₁₂に対する放射性同位体希釈検定法（RID）が
使用されてきた。このような放射性同位体希釈検
定技術は文献中においてよく証明されている。例
えばBLOOD第26巻202頁のラウ（Lau）および
協同者による「放射性同位体希釈および被覆炭を
使用する血清ビタミンB₁₂量の測定」
（Measurement of Serum B₁₂ Levels Using
Radioisotope Dilution and Coated Charcoal）、
ラベン（Raven）およびその協同者（1968年）に
よるGUYS HOSPITAL REPOTS第117巻89頁
の「内因子⁵⁷Co−B₁₂および被覆炭素を使用する
放射性同位体法によるビタミンB₁₂の検定に及ぼ
すシアン化血清および他の因子の効果」（The
Effect of Cyanide Serum and Other Factors
on the Assay of Vitamin B₁₂ by Radio
Isotope Method Using⁵⁷Co−B₁₂，Intrinsic
Factor and Coated Charcoal）および
JOUNAL OF CLINICAL PATHOLOGY第22
巻205頁（1969年）の「内因子、⁵⁷Co−B₁₂および
被覆炭素を使用する血清中のビタミンB₁₂の改良
測定法」（Improved Method for Measuring
Vitamin B₁₂ in Serum Using Intrinsic
Factor，⁵⁷Co−B₁₂ and Coated Charcoal）を参
照されたい。ビタミンB₁₂のこのような先行技術による放射
性同位体希釈検定法は一般に内生B₁₂をその天然
の結合蛋白質から、選定されたPHで煮沸すること
によつて遊離する工程および次いで計量した放射
性同位体⁵⁷Co−B₁₂および限定量の結合蛋白質を
添加する工程を含む。添加した放射性B₁₂の量は
それぞれ自体少量の蛋白質を結合するのに充分で
あるから、結合蛋白質は全部がB₁₂の何れかの形
態のものと結合する。天然のB₁₂と放射性B₁₂と
は蛋白質と結合するために競合し、蛋白質が結合
したB₁₂とは蛋白質と結合するために競合し、蛋
白質が結合したB₁₂の放射能計数が禁止される程
度が供試サンプル中に存在する天然のB₁₂の量を
示すものと考えられる。更に詳述すれば、ラベン（Raven）らにより改
変されたラウ（lau）らの技法では、血漿サンプ
ルを0.25規定のHClで煮沸することによつて血漿
サンプル中の結合蛋白質から血清B₁₂が分離され
る。放射性同位体B₁₂が反応混合物に添加され、
得られたB₁₂混合物が商業的に入手しうる結合剤
の蛋白質と反応する。次いで遊離の、すなわち未
結合B₁₂を蛋白質で被覆した炭素によつて蛋白質
と結合したB₁₂から分離し、結合した放射性B₁₂
および結合した非放射性B₁₂の混合物を含有する
上澄液の放射能を計測する。次いで血清B₁₂の濃
度を屡々標準チヤートとの比較によつて前記によ
り得た計測値から計算する。この技法が使用され
始めるとほとんどすぐに、このビタミンB₁₂の測
定値は微生物学的検定法のようなB₁₂の他の検定
法より得た結果とは通常一致しないことが認めら
れた。非常に屡々、放射性同位体希釈法によつて
得たビタミンB₁₂の検定値は高くでることが判明
した。この高ビタミンB₁₂検定値の原因を説明す
るために多くの理論が提唱された。しかし、哺乳
動物の血液および組織中には放射性同位体検定法
に際し、ある種の非特異性蛋白質と反応する物質
があつて、これがサンプル中に実際に存在する
B₁₂の量よりも明らかに高いビタミンB₁₂の分析
値を与えるということを認識した先行技術の文献
はどこにもないと信ぜられる。更に、最も普通
の、そして工業的なRID検定法の蛋白結合剤はビ
タミンB₁₂に特異性でなく、それらはまたこれま
で未知のB₁₂類似体とも結合でき、従つて誤つた
B₁₂検定値を与えることを認めた先行技術の文献
はどこにもないと信ぜられる。発明の簡単な説明既に述べたように、ビタミンB₁₂に対する標準
の放射性同位体結合検定法では、既知量の放射性
ビタミンB₁₂が用意された供試サンプルと混合さ
れる。次いで天然ビタミンB₁₂および放射性B₁₂
の両方と結合できる蛋白質の極度に限定された既
知量が前記により得た混合物に添加される。次い
で周知の技法を使用して結合したサンプルの放射
能を例えば標準の曲線と比較して供試サンプル中
に存在する天然ビタミンB₁₂の量を決定する。こ
のような標準の曲線は、例えば同じタイプおよび
量の蛋白質の存在において、しかし既知の非放射
性B₁₂の数種の異なる量を用いて、結合放射性
B₁₂の量を測定することによつて、RID検定用に
使用するために予め造られる。さて、哺乳動物の血液および組織はビタミン
B₁₂以外にRID検定法に普通使用されるある種の
結合蛋白質と結合する物質を含むことが始めて見
いだされた。この明細書および請求の範囲におい
ては、蛋白質と結合できるこのような非ビタミン
B₁₂物質を「ビタミンB₁₂類似体」、「B₁₂類似体」
または単に「類似体」と称するものとする。前記
物質はここに類似体と称されるけれども、それら
の化学構造が確実に知られていないために総称す
るのでもなく、また「類似体」という言葉の普通
許容されている化学的意味で云うわけでもない。
むしろそれらはRID検定法で普通使用される結合
蛋白質との反応性のために類似体と称されるので
ある。以下に更に詳細に説明するように、ビタミ
ンB₁₂と哺乳動物の血液および組織中に存在する
新規に発見された類似体との間には他の類似性も
あることが見いだされたのである。 B₁₂類似体の存在が発見された後で、RID検定
法において普通存在する蛋白質結合剤は(1)ビタミ
ンB₁₂との結合に対して非特異性であり、(2)ビタ
ミンB₁₂とB₁₂類似体の両者との結合に対して反
応性であり、(3)PHに無関係にB₁₂およびB₁₂類似
体と反応できることが決定された。これらの最も
普通なものはＲ蛋白質である。更に、他の蛋白質
結合剤は(1)それらの反応性が実質上ビタミンB₁₂
の反応にだけ非常に特異性があり、(2)実質上ビタ
ミンB₁₂類似体とは非反応性であり、(3)高酸性環
境中ではビタミンB₁₂またはB₁₂類似体のいずれ
とも非反応性であることが決定された。これらは
最も普通にはヒト内因子（IF）、豚内因子、ラビ
ツト内因子、、他の内因子類およびビタミンB₁₂
特異性結合剤の形態の蛋白質である。過去における問題はRID結合剤がかなりの量
の、ビタミンB₁₂非特異性蛋白質を含むことであ
つた。従つてB₁₂類似体を含有するサンプルにそ
のような結合剤を使用する放射性同位体希釈検定
法は実際に存在するより多い量のB₁₂が血漿中に
存在することを示す測定値を与える。以下に更に
詳細に説明するように、従来内因子を含むと称さ
れている普通に入手できる蛋白質結合剤は実際は
約10％〜約30％の内因子蛋白質を含むのにすぎ
ず、残りの蛋白質は非特異性型例えばＲ蛋白質で
ある。従つて市販の蛋白質結合剤中の蛋白質はヒ
トの血液および組織に存在する従来未知のビタミ
ンB₁₂類似体とも無差別に反応できる。これらの
余計の反応はサンプル中に実際に含まれているよ
りも明らかに高ビタミンB₁₂含量をもつように見
えるRID分析値を与える。これは結合剤ビタミン
B₁₂に非特異性でビタミンB₁₂とB₁₂類似体との両
方と反応できる蛋白質を含むときのこの蛋白質を
放射性同位体結合検定法に使用するとサンプル中
に存在するビタミンB₁₂とB₁₂類似体との両方を
測定するためである。しかしこの発明によれば、
使用する蛋白質が実質上純粋な内因子のようなビ
タミンB₁₂に実質上異性であるから、RID検定に
際しては余計のB₁₂類似体を測定することなく、
サンプル中の実質上ビタミンB₁₂だけと結合し、
測定される。このことが一層正確なビタミン
B₁₂RID検定値を与えるのである。これらの新知見に基づいてRID検定の実施に際
してビタミンB₁₂との反応に対して特異性をもつ
蛋白質だけを使用することが提唱される。或いは
また、ビタミンB₁₂特異性結合蛋白質とビタミン
B₁₂非特異性結合蛋白質との混合物をRID検定に
使用する前に前記非特異性結合蛋白質とだけ結合
する、すなわち不活性化するビタミンB₁₂類似体
のような物質の過剰量で処理して、RID検定の実
施時に前記非特異性蛋白質がサンプル中のビタミ
ンB₁₂または類似体との反応に実質上利用されな
いようにすることが提唱される。この発明の更に
他の改変形では非特異性結合蛋白質を含む粗製結
合剤をRID検定にビタミンB₁₂結合剤として使用
する前に蛋白質加水分解酵素処理にかける。この
ような蛋白質加水分解性酵素処理はビタミンB₁₂
特異性蛋白質の結合力を破壊することなく、非特
異性蛋白質の結合力を破壊する。この発明の技法を使用すれば、例えばビタミン
B₁₂特異性結合剤を使用して存在するビタミン
B₁₂の量を分析し、次いで非特異性結合剤を使用
してサンプルを検定し、これら２回の分析の差を
決定して存在するビタミンB₁₂類似体の量とする
ことによつてB₁₂類似体を検定できる。この発明によつて始めて教示されたように、ひ
とたび哺乳動物の血液および組織中にB₁₂類似体
が存在することが認識されれば、これらの技法ま
たは他の技法も容易に測定を行うことができる。この発明の前述および他の目的、特長および利
点はこの発明の好適な実施例の記載から明らかと
なろう。発明の詳細な記述以下の例および表においては、ある種の化学成
分を使用した。伝達を容易にするためにこの明細
書ではそれらの略称を使用した。それらの成分名
と略称との間の関係は下記のとおりである。成分実際の組成Ａ緩衝剤 1.0モルトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−HCl、PH10.0 Ｂアルブミン牛の血清アルブミン、H₂O中１
ml当り２mg Ｃ塩 0.15モルNaCl Ｄ煮沸緩衝剤 0.5モル酢酸ナトリウム−HCl
（１部）、PH4.5 0.01モルKPO₄（１部）PH7.5 0.15モルNaCl 0.15モルNaCl／１ml当り50μｇのKCN（２部）全容液を100℃で45分間加熱Ｅ標準（100pgB₁₂／ml）１ml当り100pgのビタミンB₁₂を
含有する溶液Ｄ：ビタミンB₁₂を
添加後この溶液を100℃で45分間
加熱。成分Ｅを造るために使用し
た原液中のビタミンB₁₂の濃度は
278、361および550nmにおける吸
光度で測定して決定した。Ｆ標準（100pgB₁₂／ml）ビタミンB₁₂の濃度が1000pg／ml
である以外は成分Ｅと同じH₂O1
ml当り1000pgの（⁵⁷Co）B₁₂（150
〜300μCi／μg）Ｇ（⁵⁷Co）B₁₂水１ml当り（⁵⁷Co）B₁₂1000pg
（150〜300μCi／μg）Ｈ結合剤 0.15モルNaClおよび１ml当り50μ
ｇの牛の血清アルブミンを含有す
る0.01モルのトリス（Tris）−
HCl（PH8.2）中に存在。結合剤はビタミンB₁₂結合能力が１ml当り
700pgの濃度に達するようにこの溶液中に希釈
される。ここの結合剤は下記のとおり：１ヒトの内因子（ヒトIF）抗内因子抗体（95％抑止）および
コビナミド（cobinamide）（５％
抑止）がビタミンB₁₂と結合する
のを阻止する検定に基づく95％以
上の内因子を含むヒト胃液２ヒトのＲ蛋白質（ヒトＲ）コビナミド（95％抑止）および抗
内因子抗体（５％抑止）がビタミ
ンB₁₂と結合するのを阻止する検
定に基づく95％以上のＲ蛋白質を
含むヒトの唾液３豚の内因子（豚IF）この蛋白質は「豚内因子濃縮剤」
からビタミンB₁₂−セフアロース
上のアフイニテイークロマトグラ
フイーにより、グラニジン−HCl
による勾配溶出、次いでゲル過
を使用して精製した。最後の試料
は抗内因子抗体（95％抑止）およ
びコビナミド（５％抑止）がビタ
ミンB₁₂と結合するのを阻止する
検定により95％以上の内因子を含
有した。４豚Ｒ蛋白質（豚Ｒ）（科学文
献では豚非内因子濃縮剤とも呼ば
れている）この蛋白質は「豚内因子濃縮」
から３）に述べたようにして精製
した。最終試料は抗内因子抗体
（５％抑止）とコビナミド（95％
抑止）がビタミンB₁₂と結合する
のを阻止する検定に基づいて95％
以上のＲ蛋白質を含有した。５ラビツト内因子（ラビツト
IF）−抗内因子抗体（95％抑止）
とコビナミド（５％阻止）がビタ
ミンB₁₂と結合するのを阻止する
検定に基づいて95％以上の内因子
を含むラビツト胃粘膜６豚内因子濃縮剤（豚IFC）−
豚の幽門粘膜の粗製抽出物。これは抗内因子抗体（25％抑
止）とコビナミド（75％抑止）が
ビタミンB₁₂と結合するのを阻止
する検定に基づき、豚IF25％と
豚Ｒ蛋白質75％とを含有する７豚IFC＋コビナミドビタミンB₁₂類似体と全ビタミ
ンB₁₂結合力の100倍のモル量の
コビナミド〔CN，OHCbi〕即ち
コビナミドの100倍過剰を含有す
る豚IFC ８ IFC＋CN−Cbl〔bde−OH〕
−添加した類似体がCN−Cbl
〔bde−OH〕で100モル倍過剰に
存在する以外は上記７）と同じ９豚IFC＋〔３，５，６−
Me₃BZA〕（CN，OH）Cba− 添加した類似体が〔３，５，６
−Me₃BZA〕（CN，OH）Cbaである以外は
上記７）と同じ 10 消化豚IFC− 牛の膵臓トリプシン（２mg／
ml）および牛の膵臓キモトリプシ
ン（２mg／ml）で37℃で60分間培
養した豚IFC Ｉ木炭（炭素）中性木炭〔ノーリツト
（商品名）〕25mg／mlおよび牛の血
清アルブミン５mg／mlを水中に含
む溶液Ｊ未知サンプル未結合ビタミンB₁₂を溶
液Ｄ（上記参照）中に希釈したサ
ンプル。血清のような結合したビ
タミンB₁₂を含有するサンプルを
下記のようにして造つた：サンプル１部 0.5モル酢酸ナトリウム−HCl，
PH4.51部 0.15モルNaCl中ml当り50μgの
KCN2部全混合物を100℃で45分間加熱し、
４℃で20分間5000×ｇで遠心分離
した。上澄液を取出し、検定に使
用した。ここに述べるRID検定の各々では上述の成分を
使用した。成分を使用する方法および順序は第１
表に記載のとおりである。すなわち成分Ａ，Ｂ，
Ｃ等、すなわち緩衝剤、アルブミンおよび塩等は
第１表の左から右へ向かう順序で添加した。

【表】 ⁵⁷Co−B₁₂を添加後成分を充分混合して自然生
成B₁₂と放射性同位体B₁₂とが混合されて、それ
らを結合剤との結合反応に同じように有効で、且
つ競合できるようにした。結合剤Ｈを添加後成分
を再び充分に混合し、次いで約37℃で45分間培養
した。次いで炭素を培養した混合物に添加し、成
分を再び充分に混合し、室温で更に５分間培養し
た。この後で４℃で30分間2000×ｇで遠心分離
し、次いで得られた上澄液1000μlをサンプルから
ピペツトにとり、存在する⁵⁷Co−B₁₂の量を決定
した。⁵⁷Co−B₁₂の量は供試サンプル中の天然B₁₂
の量を指示するものであり、⁵⁷Co−B₁₂の量が少
なくなるほどサンプル中の天然ビタミンB₁₂の量
が多いことを示すものである。上述のようにして得たデータを使用してビタミ
ンB₁₂の計算は下記のように行われる：第１表に概説した血漿ビタミンB₁₂に対する放
射性同位結合検定からのデータの計算１結合剤を使用しない「ブランク」管の管３お
よび４の値を平均し、管５で始まる他のすべて
の管から差引いた。２バツクグランド放射量は管１および管２から
差引き、これらの価を平均した。３管５および管６を平均した。この価は結合剤
がすべて〔⁵⁷Co〕B₁₂単独の存在において確実
に飽和されるために管１および２の平均値の少
なくとも15％低い価であるべきである。４管７以降の各管の価は管５および６の平均値
で除して痕跡結合％のための価とした。５標準曲線を造るために管７〜管14のトレース
結合％を使用した。トレース結合％をロジツト
−対数紙の縦軸に対数目盛上のビタミンB₁₂pg
に対してプロツトした。６未知サンプル中のビタミンB₁₂の量は標準曲
線すなわちトレース結合％対ビタミンB₁₂pgの
データから内挿により決定した。７使用した種々のすべての結合剤に対する標準
曲線は実際には区別できず、日によつてほとん
ど変わらない。しかし各検定のセツトについて
どの結合剤についても完全な標準曲線を造つ
た。代表的な検定データを第２表に掲げる。

【表】哺乳類血液および組織中にビタミンB₁₂類似体の
期限および存在先行技術の問題点の原因が何であるかがわかつ
たら、すなわち哺乳類の血液および組織中にビタ
ミンB₁₂類似体があると認められると、このよう
な同族体の存在および化学的性質を明らかにする
ことは比較的簡単なことになつた。RID検定の
種々の工程がB₁₂類似体を例えばビタミンB₁₂か
ら形成させることはないことを立証することも適
切である。ある場合には、これは純ビタミンB₁₂を得て、
これを血液および組織サンプルから内生ビタミン
B₁₂を抽出するのに使用する条件に該純ビタミン
B₁₂の種々の既知濃度のものをもたらし（同じ抽
出溶液中で45分間煮沸）、次いで数種の結合蛋白
質例えばヒトIF、豚IF、ヒトＲ蛋白質、豚Ｒ蛋
白質および豚IFCの形態の結合蛋白質を同じ抽出
したビタミンB₁₂サンプルの種々の割合を使用し
てRID検定により分析することによつて最も信頼
性が高く示すことができた。第２表を参照すれば、純ビタミンB₁₂の約8pg
〜約800pgの種々の既知量を種々の蛋白質結合剤
を用いて試験したこと、各場合において放射性ト
レース結合％すなわちより正確には観察された
〔⁵⁷Co〕−B₁₂結合阻止性は各結合剤について同じ
であることがわかる。従つてどの蛋白質結合剤を
使用するか否かに無関係に〔⁵⁷Co〕−B₁₂の結合
％すなわち阻止剤は実質上同じである。このこと
はRID検定のための前処理中に純ビタミンB₁₂は
哺乳類血液および組織中に今観察されたタイプの
類似体に転化しなかつたことを示すものである。
このことはまたサンプル中に妨害性のマスキング
成分例えばB₁₂類似体が不在ならビタミンB₁₂の
実質上等しい正確なRID検定値を得るために任意
の結合蛋白質を使用できることを示すものであ
る。更に第２表のデータは同じRID検定によるビ
タミンB₁₂の測定の標準として適当である。比較のために74人の健康な供血者（女性37人、
男性37人、17才〜61才）からの血清から内生ビタ
ミンB₁₂を抽出し、同じ結合蛋白質（但し豚IFC
は使用しなかつた）を使用して試験した結果は非
常に異なるものであつた。健康供血者からの血清
を試験したどの場合にも〔⁵⁷Co〕−B₁₂のより大
きな阻止制、従つてより多量の見かけのビタミン
B₁₂が、結合剤としてヒトIFまたは豚IFを使用す
る検定の場合よりもヒトＲ蛋白質または豚Ｒ蛋白
質を使用する検定の場合に観察された。この74人
の健康供血者のデータを第３表に掲げる。ビタミンB₁₂欠乏症と診断された患者に関する
データも掲げる。

【表】

【表】いない価を使用すると曲線は右に歪んだ。
第３表では健康供血者と患者との比較も行い、
以下に詳細に説明する。第３表を参照すれば血清
ml当りのビタミンB₁₂のpgの形で表した平均内生
ビタミンB₁₂RID検定量はヒトＲ蛋白質および豚
Ｒ蛋白質の場合にはそれぞれ548および542である
のに対して、ヒトIFおよび豚IFの場合にはそれ
ぞれ298および361にすぎない。このことはヒト
IFおよび豚IFのビタミン⁵⁷Co−B₁₂を結合する能
力を阻止する程度よりも大きい程度にヒトＲ蛋白
質および豚Ｒ蛋白質のビタミン⁵⁷Co−B₁₂との結
合能力を阻止する何物かが健康人血清の抽出物中
に存在することを実証するものである。現在の
RID検定技法の下ではヒトＲ蛋白質および豚Ｒ蛋
白質を使用する時に見いだされるこの大きな阻止
性はより高含量のビタミンB₁₂を示すものと解析
されている。この高阻止性を示すのはヒトの血清
中に存在することが今はじめて発明され、そして
それがヒトＲ蛋白質および豚Ｒ蛋白質の⁵⁷Co−
B₁₂との結合を優先的に阻止する、この明細書で
「ビタミンB₁₂類似体」と呼称される物質である。ビタミンB₁₂類似体の化学的性質および特性哺乳類の血液および組織中に存在することが始
めて確認された、この明細書で云うビタミンB₁₂
類似体はペーパークロマトグラフにより単離さ
れ、純ビタミンB₁₂と比較された。ビタミンB₁₂
およびいわゆる「ビタミンB₁₂類似体」は下記の
共通の性質をもつことがわかつた；(1)両者ともに
炭素（チタコール）に吸着され、炭素を５％フエ
ノールで洗浄しても溶出しない；(2)炭素を67％ア
セトンで洗浄すると、両者ともに炭素から溶離さ
れる；(3)両者ともに水溶液からフエノール中に抽
出され、このフエノールを繰返し水で洗つた時で
さえ、フエノール相に止まる；(4)両者ともにフエ
ノール相を過剰のジエチルエーテル中に溶解する
と水性相中に移行する；(5)両者ともにバイオラツ
ドＰ−４ポリアクリルアミド塔でゲル過中に類
似の見かけ分子量（約1356）のものと共に溶離さ
れる；(6)両者ともに、共有結合により結合された
豚Ｒ蛋白質を含むセフアロース（Sepharose）−
2Bアガロースの塔に吸着され、この塔を0.1モル
グリセリンNaOH（PH10.0）、1.0モルNaCl溶液で
洗浄しても塔中に結合されたまま止り、85％フエ
ノールかまたは60％ピリジンで両者ともにセフア
ロースから溶離される。これらの類似性のため
に、この新規に見いだされた物質はビタミンB₁₂
に類似していると思われ、従つてここにビタミン
B₁₂類似体と称するものとする。哺乳類の血液および組織中に存在することが始
めて判明した、新規に発見されたビタミンB₁₂類
似体の化学的性質および構造は未知である。時に
はビタミンB₁₂の類似体として文献中で呼ばれる
ことがあるが、ビタミンB₁₂の化学的に正しい形
態のもの、すなわち既に血清および組織中に存在
することが知られているCN−B₁₂、OH−B₁₂、
アデノシル−B₁₂およびCH₃−B₁₂とそれら新規ビ
タミンB₁₂類似体とを比較する努力がなされた。
これは前記既知の形態のビタミンB₁₂の各々
500pgを同じヒト血清の４つの異なる部分に暗所
で、添加することにより行われた。添加前に血清
はヒトIFおよびヒトＲ蛋白質を使用してRIDによ
り検定したビタミンB₁₂の250pgおよび450pgをそ
れぞれ含有していたから、200pgの差を示した。
血清に上記物質を添加後に各々暗所で15分間培養
して添加した既知形のビタミンB₁₂を血清中に通
常存在する結合蛋白質に結合させた。添加した既
知形のビタミンを含む血清を次いで標準条件下で
抽出し、ビタミンB₁₂の見かけの量をヒトＲ蛋白
質およびヒトIF蛋白質を使用してRIDで検定し
た。ヒトＲ蛋白質およびヒトIF蛋白質検定値は
ともに約500pgのビタミンB₁₂の見かけ量に増大
した。しかし元の差はヒトＲ蛋白質およびヒト
IF蛋白質を用いて得た価の間に観察された、す
なわち200pgは変化しなかつた。もし添加した既
知形のビタミンB₁₂のいずれかがヒト血清中で新
規に発見された類似体に転化してしまつたとすれ
ば、検定値の差は増大するはずである。このこと
は新規に発見されたビタミンB₁₂類似体が抽出操
作中に既知の元から存在したビタミンB₁₂の内生
形のいずれかからも生成したものではないという
証拠を与えるものである。ビタミンB₁₂類似体の単離この明細書で「ビタミンB₁₂類似体」と命名さ
れ、ビタミンB₁₂検定でＲ蛋白質を優先的に阻止
することが判明した物質は下記の精製工程によつ
て内生ビタミンB₁₂から実質上分離した。150pg
といつた微量の⁵⁷Co−B₁₂を新しく捕集した健康
人の血漿1800mlに添加した。添加した⁵⁷Co−B₁₂
は次後のRID検定を阻害しないほど充分に少量で
ある。室温で30分間培養後にビタミンB₁₂を抽出
し、標準条件の下で検定した。ヒトIF結合剤を
RID検定に使用した時には抽出物はビタミンB₁₂
を1050ng含有することが判明したが、ヒトＲ蛋
白質を結合剤として使用した時にはビタミン
B₁₂2030ngを含有するように思われ、ほとんど２
倍も多いビタミンB₁₂量である。次に抽出物を共
有結合した豚Ｒ蛋白質を含むセフアロースの塔を
通した。この塔はヒトIFまたはヒトＲ蛋白質を
使つてRIDにより検定した時には⁵⁷Co−B₁₂なら
びに内生ビタミンB₁₂の99％以上を保持する。塔
を種々の緩衝剤および水で洗浄した後で物質を60
％ピリジンで溶離し、減圧下に乾燥し、水に溶か
し、炭素上に吸着させた。炭素を５％フエノール
で、次いで水で洗浄し、ビタミンB₁₂、⁵⁷Co−B₁₂
およびB₁₂の類似体の混合物を67％アセトンを使
つて炭素から溶離した。溶離された物質を再び減
圧下で乾燥し、水に溶かし、次いでペーパークロ
マトグラフイ用の長さ48.3cm（19インチ）のワツ
トマン（Whatman）3MMペーパー、および第２
級ブタノール800ml、氷酢酸８ml、HCN6ミリモ
ルおよび水400mlからなる溶媒系を使つて分離し
た。クロマトグラフ分析は溶媒の蒸発を阻止する
環境中で室温で30時間下流式に行つた。ペーパー
クロマトグラムを通気炉中で乾燥し、38個の1.27
cm（1/2インチ）の切片に切断し、ペーパークロ
マトグラムに前記物質をかけた始端を１とし、ク
ロマトグラムの最下端を38として番号を付した。
各1.27cm（1/2インチ）ずつの切片を水５mlで４
℃で12時間、ビタミンB₁₂，⁵⁷Co−B₁₂およびB₁₂
類似体を溶離するために、培養した。水を次いで
除き、減圧下で乾燥した。乾燥した各切片を次い
で水2.5mlに溶離し、種々の結合蛋白質を使用し
て⁵⁷Co−B₁₂およびビタミンB₁₂について検定し
た。⁵⁷Co−B₁₂の最終回収率は64％であつた。ビ
タミンB₁₂の最終回収率は64％であつた。ビタミ
ンB₁₂の見かけの回収率は、検定にヒトIFを使用
した時には75％で、検定にヒトＲ蛋白質を使用し
た時には66％であつた。ペーパークロマトグラフ
イによつて得た38個の切片を使用した検定の結果
を第4A表、第4B表および第4C表に掲げる。対照
として参照するための⁵⁷Co−B₁₂および純ビタミ
ンB₁₂のペーパークロマトグラフイに関する類似
のデータを第4D表に掲げた。第4E表に便宜のた
めにまとめたこれらの数個のクロマトグラフイの
表のデータはヒトの血漿から抽出された⁵⁷Co−
B₁₂の挙動はクロマトグラフイ挙動を変化せず、
従つて標準抽出操作中または精製操作中も変化し
ないことを証明した。同様にして真のビタミン
B₁₂は精製工程または検定の処理工程のいずれの
工程でも変化しないことは自明である。

【表】

【表】第4D表の対照クロマトグラムについて述べる
と、ヒトＲ蛋白質、ヒトIF蛋白質および豚IFCを
使つて種々に実施した純ビタミンB₁₂の数種の
RID検定は活性の実質上一つの対称的ピークを与
えることがわかる。各場合においてビタミンB₁₂
の95％以上が切片区分14〜16に存在することがわ
かる。結合蛋白質がヒトIF、豚IFおよびラビツ
トIFである時にも血漿抽出物のペーパークロマ
トグラフから第4B表に示すように類似の結果が
得られた。これらのデータはこれらの３種のIF
結合蛋白質がビタミンB₁₂に対する結合力におい
て実質上特異性をもち、血漿中に存在するビタミ
ンB₁₂類似体に対しては実質上非反応性であるこ
とを示す。 RID検定において通常使用される結合剤であ
り、また90％もの多量の豚Ｒ蛋白質を含有するが
豚IF蛋白質は10％のように少量しか含まない豚
IFCを、その豚Ｒ蛋白質を除去するか或いは不活
性化することによつて変性するための労作がなさ
れた。数種の場合において、豚IFCをRID検定に
使用前に３種の化学的に合成されたビタミンB₁₂
の過剰量と共に豚IFCを培養した。第4C表を参照
すれば、この変性後に変性された豚IFCを使用し
て得たクロマトグラフイの結果は実質上純粋の豚
IFを使つて得た結果と近似することがわかる。
従つて、この発明の実施においてはビタミンB₁₂
特異結合蛋白質およびビタミンB₁₂非特異結合蛋
白質の両者を含む蛋白質混合物をビタミンB₁₂類
似体の過剰量を添加することによつて変性でき、
この方法によれば前記類似体は前記非特異性蛋白
質とを結合して、それを実質上拘束された、すな
わち不活性なものとなし、その結果該非特異性蛋
白質はビタミンB₁₂またはRID試験にかけられる
サンプル中の（⁵⁷Co）B₁₂との反応に有効でなく
なる。非特異性蛋白質を拘束すなわち不活性化す
るために特異性蛋白質および非特異性蛋白質の混
合物に添加されるべきビタミンB₁₂類似体の量は
存在する両種蛋白質および拘束すなわち不活性化
剤として使用されるビタミンB₁₂の両者に依存し
て広範囲に亘つて変化できる。一般的に云つて、
第4C表に示した例の場合、コビナミドを非特異
性蛋白質の完全結合のために必要な量に等しい量
から該蛋白質を結合するのに要する量より1000万
倍も多量までの量で添加でき、好適な範囲は完全
結合に要する量の約10倍〜約10000倍過剰量であ
る。CoB−シアノ−コバミツク−ａ，ｃ，ｇ−ト
リアミドとして知られるCN−Cb（bde−OH）を
非特異性蛋白質と結合する必要量の少なくとも約
10倍ないし約1000万倍過剰量で使用でき、約100
倍ないし約100000倍過剰に使用するのが好適であ
る。Co（３，５，６−トリメチルベンズイミダゾ
ール）コバミドとして知られる（３，５，６−
Me₃BZA）（CN，OH）−Cbaも非特異性蛋白質
の量の約１倍ないし約1000万倍過剰な量で使用す
べきで、約10倍ないし約10000倍過剰量が好適で
ある。適当量の他のビタミンB₁₂類似体を使用し
て同様にして特異性蛋白質と混合して存在する非
特異性蛋白質を結合すなわち不活性化して⁵⁷Co−
B₁₂または供試サンプル中に天然に存在するビタ
ミンB₁₂とだけ実質上結合する結合蛋白質の調剤
をうることができ、こうして供試サンプル中のビ
タミンB₁₂のより正確な定量RID検定値を与える。再び第4C表を参照すると、トリプシンおよび
キモトリプシン（chymotrypsin）で消化した豚
IFCのサンプルについてのデータが示されてい
る。これらの、および他の蛋白質分解酵素は実質
上Ｒ蛋白質を消化（分解）するそれらの能力にお
いて特異性であり、内因子蛋白質を変化させずに
残し、RID検定における⁵⁷Co−B₁₂およびビタミ
ンB₁₂を結合するための実質上唯一の蛋白質とし
て利用できる。例えばエラスターゼを含めた他の
酵素も同じ目的に使用できる。使用する酵素の量
は処理される蛋白質の１ml当り約0.01〜約100mg
の範囲で、好適な量は蛋白質１ml当り約0.05〜約
40mgである。この蛋白質分解酵素消化法を使用す
れば⁵⁷Co−B₁₂およびビタミンB₁₂だけと実質上
結合し、処理されるサンプル中のビタミンB₁₂同
族体により作用されない蛋白質結合剤が得られ、
従つてサンプル中の新規に発見されたビタミン
B₁₂類似体と反応できるために供試サンプル中の
ビタミンB₁₂の量について不正確な検定値を与え
る非特異性蛋白質をも含む豚IFC蛋白質類の原始
混合物を使用した時に得られるRID検定値より一
層正確なRID検定値が得られる。さて、第4A表を参照すれば、血漿抽出物クロ
マトグラムからのサンプルをヒトＲ蛋白質、豚Ｒ
蛋白質および豚IFCを用いてビタミンB₁₂の検定
を行う場合には、これらのサンプルをヒトIF、
豚IF、ラビツトIFまたはビタミンB₁₂類似体で処
理した豚IFCまたは蛋白質分解酵素で消化した豚
IFCで検定した時に得られる結果とは異なる結果
が得られる。ヒトＲ蛋白質、豚Ｒ蛋白質または非
処理豚IFCを蛋白質結合剤として使用した各場合
には、クロマトグラム試料中、特に切片区分１〜
13および17〜38により多くのビタミンが存在する
ような様相を呈する。この観察は上述のデータに
ついてみるに、Ｒ蛋白質との結合するために⁵⁷Co
−B₁₂と競合する著量の多数のビタミンB₁₂類似
体が健康人血漿中に含まれることを強く立証する
ものである。それはまた、B₁₂類似体の部分に及
ぼすそのような活性はRID検定に使用された結合
用蛋白質がビタミンB₁₂に実質上特異性である場
合には実質上存在しない。クロマトグラムデータ（第4A表）はRID検定
が酸性PHで行われた時にもヒトＲ蛋白質および豚
Ｒ蛋白質の特異性の欠如は変わらなかつたことに
留意すべきである。このことはRID検定を酸性で
行つた時にはビタミンB₁₂類似体を含有するサン
プルの真のビタミンB₁₂含量は得られず、誤つた
結果を与えることを示すものである。上述のと同じ技法および基準を使用することに
より、ビタミンB₁₂類似体は単に人体の血液から
得られた血清中に存在するだけでなく、哺乳動物
の組織中においてもそれらが血液中に存在する量
よりも高濃度でさえ存在することが見いだされた
のである。哺乳動物の組織から抽出されたビタミ
ンB₁₂類似体を上述したのと同じ手続きに従つて
精製した、精製物をペーパークロマトグラフイを
使用して分析すると、それらは血溝から抽出サン
プル中で観察されたビタミンB₁₂の易動度と同様
な易動度を示した。組織中には血液中より大量の
ビタミンB₁₂類似体が存在するから、それらはペ
ーパークロマトグラフイ中目視により赤色または
橙色の点として観察できた。組織抽出物から精製
されたビタミンB₁₂類似体の吸収スペクトルを測
定し、該吸収スペクトルは真正のビタミンB₁₂の
吸収スペクトルに似ているが、明瞭に区別される
べきものであることが示された。これらの観察は
Ｒ蛋白質と優先的に反応するが、内因子蛋白質と
は反応しない血清中の物質は実際は種々のビタミ
ンB₁₂類似体である他の付加的な証拠である。新
規に発見されたビタミンB₁₂類似体はその生物学
上の活性についてもビタミンB₁₂とは異なる。す
なわち第５表に示すように、ビタミンB₁₂欠乏症
と診断された11人の患者についてユーグレナ・グ
ラシリス（Euglena gracillis）で得た血清ビタ
ミンB₁₂値は結合蛋白質としてヒトIFまたは豚IF
を使用するRID検定により得た結果と実質的に類
似のものである。

【表】

【表】標準範囲

(平均±2、 220− 245− 136−6
56 157−717 (1130)
標準偏差) 1230 1135

標準範囲 9 10
0 0 0
(43PCT) (48PCT)

微生物検定またはヒトIFまたは豚IFを使用す
る検定によつて得られた価はすべてが、RID検定
を結合蛋白質としてヒトＲ蛋白質または豚Ｒ蛋白
質を使用して行つた時よりも実質的に低い価が得
られることに留意すべきである。このことはヒト
血液中および組織中で確認されたビタミンB₁₂類
似体はユーグレナ・グラシリスの増殖を促進する
のに必要なタイプのビタミンB₁₂活性をもたない
ことを示すものである。第５表にはビタミンB₁₂
欠乏症であると診断された更に10人の患者との合
計21人の患者についてのデータが開示されてい
る。21人の患者の各々について、ヒトIFまたは
豚IFを使つてRID検定を行つた時に得たビタミン
B₁₂の値は74人の健康人の対照グループで得られ
たビタミンB₁₂の範囲より低い。しかしヒトＲ蛋
白質または豚Ｒ蛋白質を使用してRID検定を行つ
た時には上記21人のビタミンB₁₂欠乏症患者の約
半分だけが健康人のビタミンB₁₂の範囲以下であ
るように検定されていることが判る。このこと
は、新規に見いだされたビタミンB₁₂類似体が供
試サンプル中に存在し、結合蛋白質がビタミン
B₁₂に特異性をもたない場合には、得られる結果
は本当にビタミンB₁₂欠乏症患者であつてもビタ
ミン欠乏範囲に入らないことを示唆することを示
す。これはビタミン欠乏症に対する治療を患者に
施すことを遅延させることになる。これはまた新
規に見いだされたビタミンB₁₂同族体はビタミン
B₁₂欠乏症に付随する血清学上の異常および／ま
たは神経学上の異常を阻止することができないと
云う意味でビタミンB₁₂の治療上の活性すなわち
有益な活性を欠如していることを示すものであ
る。

【表】

【表】臨床研究室においてビタミンB₁₂の検定に利用
できる数多くの市販のRID検定型装置があるが、
第６表にこのような数種の装置による分析値を掲
げ、且つ豚IF、豚Ｒ蛋白質および豚IFCを使用し
てこれらの装置で得られた蛋白質の種類の比較を
掲げる。第６表を参照することによつて、市販の
装置は約13％〜約35％にすぎない内因子および約
60％〜約85％Ｒ蛋白質をもつように思われる。従
つてこれらの装置を使用すると、サンプル中のビ
タミンB₁₂の量のかなり誤つた検定値を与えるよ
うに思われる。哺乳類血液および組織中に存在することが新規
に発見されたビタミンB₁₂類似体のような、ビタ
ミンB₁₂類似体をサンプルが含むときは、結合ビ
タミンB₁₂に対する内因子の有効性は若干PHに依
存し、約4.1のPHでは内因子はその結合能力の約
10％を喪失し、約1.9のPHでは内因子はその結合
能力の約99％を喪失する。こうして結合処理中約
4.1のPHを使用する市販の装置では第６表に示さ
れるより約10％低い内因子をもち、約1.7〜約1.9
の結合処理中のPHをもつ装置は内因子から実質上
全く結合は行われない。この発明を特に好適な実施例について記載した
が、前述および他の改変はその形式および詳細な
部分においてこの発明の範囲および精神を逸脱す
ることなく当業者により容易に実施できることが
理解されよう。

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