JPH0292300A - 選択可能な切断部位を用いたポリヌクレオチドの測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 随意にオリゴヌクレオチド配列を合成し９合成的手法に
より調製したポリヌクレオチド配列、または天然に存在
する起源より得たポリヌクレオチドをクローン化する能
力は９例えば染色体、配列混合物、　ｍＲＮＡなどのよ
うな広範囲に及ぶオリゴヌクレオチド配列中における特
定配列の存在を検出する機会を大きく発展させた。特定
配列に関する興味には、その機会の例をいくつか挙げれ
ば、病原体の存在の診断、対立形質の存在の決定、宿主
ゲノム中における損傷の存在、特定のｍＲＮＡの検出。

あるいは宿主細胞の改変をモニターすることが伴い得る
。試料中の様々な抗原の存在を診断する分析を行なうた
めに抗体を利用することは、放射性免疫分析の出現によ
り、技術およびプロトコルが非常に発展したが、　ＤＮ
Ａプローブの領域では、それに匹敵する活性が最近まで
見られなかった。それ故、配列の検出は、大体、ポリヌ
クレオチド配列を支持体へ結合させることと、放射標識
したプローブを用いることとを必要とする様々なハイプ
リダーゼ−ジョン技術を伴っている。

多量のオリゴヌクレオチドハイプリダイゼーシッン配列
を経済的な方法で生産する能力の増大を考慮すると、研
究者の注目は、簡便、正確、かつ効率的に特定のオリゴ
ヌクレオチド配列を検出する技術に向けられる。望まし
くは、これらの技術は、迅速であり、技術者が誤りを犯
す機会を最小にし、自動化が可能であり、そして簡便か
つ正確な検出方法が可能となる。この目的に向けて、標
識に結合させるためにオリゴヌクレオチドを誘導する改
良された方法だけでなく、放射性同位元素以外の標識で
オリゴヌクレオチドプローブを標識する手段およびゲル
から支持体へＤＮＡ配列を移動させる精度を向上するた
めの努力が既になされている。ＤＮＡが様々な起源に由
来する種々の場合に興味あるＤＮＡ配列を検出するのに
柔軟性を考慮した新しいプロトコルを与える必要性が続
いている。

（従来の技術） Ｍｅｉｎｋｏｔｈおよび−ａ旧は、　Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔ　（１９８４）ｌｊＩｌｌ：　２６７
−２８４に、ハイブリダイゼーション技術に関する優れ
た総説を与えている。Ｌｅａｒｙらは、Ｌ口）Ｃ−Ｎａ
ｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　（１
９８３）　　８０　　：　　４０４５−４０４９で。

アビジン酵素複合体に結合させたビオチニル化ＤＮＡを
、特定のオリゴヌクレオチド配列の検出に利用すること
を述べている。Ｒａｎｋｉ　らは、　Ｇｅｎｅ（１９８
３）２１　：　７７−８５で、オリゴヌクレオチド配列
を検出するための「サンドウィッチ」ハイブリダイゼー
ションと呼ばれる方法について述べている。Ｐｆｅｕｆ
　ｆｅｒおよびＩｌｅｌｍｒｉｃｈは、　Ｊ、　ｏｆ　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９７５）２５０　：８６７
−８７６で、セファロース４Ｂへのグアノシン−５”０
−（３−チオトリホスフェート）の結合について述べて
いる。Ｂａｕｍａｎらは、　Ｊ、　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ、　ａｎｄ偽佳匹基斐ユ（１９８１）毅：　２２
７−２３７で、蛍光剤によるＲＮＡの３”標識について
述べている。ＰＣＴ出願ＷＯ／８３０２２７７には、標
識するために修飾リボヌクレオチドをＤＮＡ断片に付加
すること、およびこのようなりＮＡ断片を分析する方法
が述べられている。ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚは、　Ｎｕ
ｃｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）ｌ≧、：３４
３５−３４４４で、オリゴヌクレオチドに酵素を共有結
合させることについて述べている。Ｗａｌｌａｃｅは、
　ＤＮＡ　ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　（Ｗｏｏ、　　Ｓ、　　繁）　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、
　　Ｂｏｃａ　ＲａｔｏｎＦｌｏｒｉｄａに１診断にお
けるプローブの利用について、総括的な背景を与えてい
る。ＣｈｏｕおよびＭｅｒｉｇａｎは、　Ｎ、　Ｅｎ　
、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、（１９８３）　３０８　：　
９２１−９２５で。

放射性同位元素により標識したプローブをＣＭＶの検出
に利用することについて述べている。Ｉｎｍａｎは。

Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　３４Ｂ
、　　２４　　（１９７４）　　３０−５９　　で。

ポリアクリルアミドへの結合方法についで述べている。

他方、　Ｐａｒｉｋｈらは、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ。

３４Ｂ、　２４（１９７４）、？？−１０２で、アガロ
ースとの結合反応について述べている。Ａｌｗｅｉｎｅ
らは、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ　（１９７７）　７４　：　５３５０−５３５４
で、オリゴヌクレオチドをゲルから固体支持体に移動さ
せる方法について述べている。Ｃｈｉｎらは、　Ｎｕｃ
ｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　（１９８３）　１１　：　
６５１３−６５２９で、末端のヌクレオチドを誘導する
技術について述べている。Ｉｌｏらは。

ｕ匹匣畦ｌ■（１９８１）毅：　６４−６７で、リン酸
により末端のヌクレオチドを誘導し、エステルを形成さ
せる技術について述べている。ＡｓｈｌｅｙおよびＭｃ
Ｄｏｎａｌｄは、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（
１９８４）　　１４０　：　９５−１０３で１表面に結
合した鋳型からプローブを調製する方法について報告し
ている。いくつかの技術について述べているこれらの文
献は、標識したオリゴヌクレオチドの調製に関する参照
文献としてここに採用する。

（発明の要旨） 固体支持体と、少なくとも１つの標識と、試料および標
識したプローブが関係しているハイブリダイゼーション
とを用いた特定のヌクレオチド配列の検出方法が提供さ
れる。該方法においては。

二本鎖形成の有無により、支持体と標識との間の空間的
な関係を改変する能力が与えられる。この技術の例は、
標識したプローブと試料のＤＮＡとの二本鎖形成により
、標識と支持体との間の切断部位を与えることである。

ここで、二本鎖は支持体に結合している。次いで、該切
断部位は切断されて、支持体と標識との分離を生じる。

標識の有無の検出は、従来の技術に従って行い得る。

当該分野における本発明の第一の利点は１本発明の方法
が、標識の特異的結合と非特異的結合とを区別すること
を可能にすることである。従来の技術では、標識は典型
的には固体支持体上で検出される。すなわち、試料は、
支持体に固定され。

標識した相補的なプローブと接触し１次いで該支持体上
で二本鎖の形成が分析される。この方法における問題点
は、標識が２分析物の非存在下においても支持体に結合
し得ることである。支持体に標識が直接結合することを
、ここでは、「非特異的」結合と呼ぶ。この非特異的な
結合が、相当量生じれば１分析物の有無にかかわらず、
標識が支持体上で検出され、誤った陽性の結果を与える
。

対照的に２本発明の方法では、標識は興味ある分析物が
存在する場合にのみ検出される。すなわち、「特異的」
結合だけが検出される。ある好ましい実施態様では、こ
の方法は、試料と１つまたはそれ以上のプローブとの間
に二本鎖を形成することによって、支持体と選択された
標識との間に切断部位を導入することにより行なわれる
。この切断部位は１本出願の優先権主張の基礎となる米
国出願の親出願である米国特許出願Ｎｏ、０６／６６１
　、５０８に述べられているように、制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位でもあり得、あるいは数多くの種類の化
学的に分解可能な部位（例えば、ジスルフィド結合、過
ヨウ素酸分解可能な１．２−ジオールなど）の１つでも
あり得る。他の実施態様では、特異的に結合した標識は
、鎖置換法によって放出される。

該方法では１分析物／プローブ複合体により支持体に標
識を結合させた後２分析物／プローブ複合体のある部分
に相補的であり、標識した部分に置換して、該標識した
部分を放出するように選択されたＤＮＡ鎖が導入される
。

核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオリゴヌク
レオチド配列の存在を検出する本発明の方法は、該核酸
試料を、ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオ
チド試薬と混合する工程であって、該試料または該試薬
の成分のうちの一方が支持体に結合し、該分析物と該ポ
リヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーションによっ
て２選択可能な切断部位で該支持体に結合している標識
を与える工程；該支持体を、該支持体に結合している標
識から、該選択可能な切断部位以外により実質的に遊離
させる工程；該切断部位で切断する工程；および該支持
体から遊離した標識を検出する工程、を包含する。

核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオリゴヌク
レオチド配列の存在を検出する本発明の他の方法は、該
核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で第１のポリヌ
クレオチド捕護プローブおよび第２のポリヌクレオチド
標識プローブと混合する工程であって、該第１および第
２のプローブが、該分析物中に存在する配列と相補的な
オリゴヌクレオチド配列を有し、該ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で第１および第２の二本鎖を形成し。

そして該捕護プローブが固体支持体に結合している工程
；選択されたポリヌクレオチド鎖の置換を導入し、該捕
護プローブと、第１の二本鎖よりも安定な二本鎖を形成
し、それにより該支持体を。

該支持体に結合している標識から実質体に遊離させる工
程；および該支持体から遊離した標識を検出する工程、
を包含する。

（発明の構成） 特定の配列の検出はハイブリダイゼーションを用いて行
なわれる。それにより、試料ＤＮＡとプローブとの二本
鎖形成が、標識と支持体との間の空間的な関係を改変す
る能力に影舌を及ぼす。このようにして、試料中におけ
る特定配列の有無は。

媒体中に放出された標識量によって容易に決定し得る。

主要な方法は、プロトコルおよび試薬の変更を考慮して
おり、試料の核酸は支持体に結合されるか、あるいは溶
液中に遊離した状態であり得る。

ある好ましい実施態様では、該方法は核酸の二本鎖を形
成することを包含する。標識は選択的に切断可能な結合
により支持体から分離される。従って３選択的な切断を
与える条件下で放出された標識の量は、核酸の試料中に
おける興味ある配列の存在およびその量の尺度となる。

選択可能な切断部位は、ホモ二本鎖形成による制限酵素
認識部位の形成の結果であるか、あるいはこのような選
択可能な部位は、該−本鎖中にこのような部位を導入し
た結果であり得る。

試薬としては、核酸の分析物にハイブリダイズする興味
あるオリゴクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配
列を含有するものが使用される。

この試薬は、ここでは時として「捕護プローブ」と呼ば
れ２本発明の方法では９選択された固体支持体に結合す
る。興味ある配列を含むか、あるいは含まない標識プロ
ーブも使用される。

第１の好ましい実施態様では、主要な方法は。

選択可能な切断部位により支持体に結合した標識を与え
るハイブリダイゼーション媒体中におけるポリヌクレオ
チド二本鎖の形成を包含するＪ試料ＤＮＡが支持体に結
合するかあるいは溶液中に分散するような様々な方法が
使用され得る。

包含される様々なヌクレオチド配列を区別するために、
以下の用語が使用され得る： 核酸試料−興味あるオリゴヌクレオチド配列を有する核
酸配列を含有すると思われる試料；核酸の分析物−興味
あるオリゴヌクレオチド配列を有する前記核酸試料中の
ＤＮＡまたはＲＮＡ　　。

興味あるオリゴヌクレオチド配列−ヌクレオチド鎖の全
体または一部であり、普通少なくとも６塩基、より普通
には少なくとも約１０塩基、好ましくは少なくとも約１
６塩基、そして５ｋｂまたはそれ以上でもあり得るが３
通常０．２ｋｂを超えない、　ＤＮＡ配列またはＲＮＡ
配列。該ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は検出すべき特性
に特徴的である。該特性は遺伝的特性や病源体などに特
徴的な遺伝子または配列である。

（以下余白） ポリヌクレオチド配列−興味あるオリゴヌクレオチド配
列の検出用試薬として用いられるＤＮＡ配列またはＲＮ
Ａ配列。該ポリヌクレオチド配列は標識しても標識しな
くてもよく、支持体に結合させても結合させなくてもよ
く、そして興味あるオリゴヌクレオチド配列に相補的な
配列を必らずしも含んでいるわけではない。単独で、ま
たは核酸分析物と共に、標識と支持体との間の架橋とし
て作用する１つまたは２つのポリヌクレオチド配列が存
在する。該配列は、標識と支持体との中間に。

選択的に切断可能な部位を有する；そして選択的に切断
可能な部位−選択的に切断することができ、そして制限
酵素部位、リン酸エステル。

プリン、ペプチド結合などを包含する１つの官能基また
は複数の官能基である。

説明の便宜のために１選択可能な切断部位を生成する本
発明の好ましい実施態様は、さらに４つの主要な実施態
様に分割される。これらのうちの第１の実施態様（第２
図Ａを参照）では、使用される試薬は単一成分であり、
一方の末端の近くで支持体に結合し、他方の末端の近く
で１つまたはそれ以上の検出可能な標識に結合したポリ
ヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドには、興味あ
る配列とホモ二本鎖を形成する少なくとも４つの連続的
なヌクレオチドの領域が含まれ、このような配列は支持
体と標識との中間にある制限酵素部位を含む。

第２の実施態様（第２図Ｂを参照）の場合には。

使用される試薬は核酸試料が支持体に結合されるか、あ
るいは結合されないか、および選択可能な切断部位の性
質によって異なる２つの成分を有する。核酸試料が支持
体に結合している場合、２つの成分は、（１）架橋ポリ
ヌクレオチド配列；および（２）架橋ポリヌクレオチド
配列のある部分と相補的であり、ハイブリダイズするポ
リヌクレオチド配列である。架橋または相補的なポリヌ
クレオチドのいずれかが標識され得る。架橋配列に結合
した標識の存在は、架橋および分析物ポリヌクレオチド
配列の二本鎖が選択可能な切断部位として制限酵素部位
を定義する場合に限定される。それ以外の場合には、相
補的な配列だけが標識される。相補的な配列と二本鎖を
形成する配列を有する以外に、架橋ポリヌクレオチド配
列は、興味あるオリゴヌクレオチド配列と二本鎖を形成
する領域を有する。

試料核酸が溶液である場合、２つの成分は、（１）支持
体に結合した第１のポリヌクレオチドであり。

該ポリヌクレオチドは核酸分析物中に存在する配列に相
補的な領域を有し、該配列は必らずしも制限酵素部位を
定義するものではなく、また必らずしも興味あるオリゴ
ヌクレオチド配列を定義するものではない；および（２
）核酸分析物中に存在する配列に相補的な領域のような
標識された第２のポリヌクレオチド配列であり、該領域
は第１のポリヌクレオチド配列の領域と同じ制限を受け
る。二本鎖を形成する領域の少なくとも１つは、興味あ
る配列を定義する。制限酵素部位を定義する領域の１つ
が存在しない場合、あるいは制限酵素部位の存在に加え
て、第１または第２のポリヌクレオチド配列と共に選択
可能な切断部位が存在する。

第３の場合（第２図Ｃを参照）には１分析物は支持体に
結合され、そして使用する試薬は制限酵素部位を定義し
得る興味あるオリゴヌクレオチド配列に相補的な領域を
有する標識されたポリヌクレオチド配列である単一成分
である。制限酵素部位および／または標識されたポリヌ
クレオチド配列上に存在する官能基は選択可能な切断部
位として役に立つ。

第４の場合（第２図りを参照）には、捕護プローブが提
供される、該捕護プローブは、結合「Ｙ」を介して固体
支持体に結合したポリヌクレオチド鎖であり、その反対
側の末端は核酸分析物中に存在する第１の配列に相補的
である。標識された第２のポリヌクレオチド鎖を含有す
る標識プローブは、第１の配列とは異なり、かつ重複し
ない分析物中の第２の配列に相補的な領域を有する。第
２図りにおいて「Ｙ」と示された結合は、支持体にプロ
ーブを結合させるあらゆる従来の手段を表わす。結合「
ｘ」は選択可能な切断部位、すなわちジスルフィド結合
、過ヨウ素酸で切断可能な１．２ジオールなどのような
化学的に切断可能な結合である。

核酸を含む試料は、二本鎖形成が相補的な配列間で起こ
るような条件下で、適当な試薬と混合される。得られた
混合物は、興味あるオリゴヌクレオチド配列に対して少
なくともへテロ二本鎖の形成またはホミ二本鎖の形成を
起こすような所定の厳密な条件下で、ハイブリダイズさ
せる。ハイブリダイゼーションが起こるのに充分な時間
の後に。

支持体を上清から分離して洗浄し、少なくとも実質的に
すべての非特異的に結合した標識を遊離させる。次いで
支持体に結合したオリゴヌクレオチドを１つまたはそれ
以上の試薬で処理すると、少なくとも一方の鎖が切断さ
れ、支持体に結合した標識が遊離する。

二本鎖形成をもたらす試料中の特定の配列の存在に依存
して、支持体に結合した標識の遊離が観察される。通常
、標識の存在に対して上清培地を分析する様々なプロト
コルを使用し得る。しかし。

場合によっては支持体が測定される。上清がら支特休を
物理的に分離することが必らずしも必要ではないプロト
コルおよび試薬を使用し得る。

本発明の方法は９種々様々な場合におけるオリゴヌクレ
オチド配列、すなわちＤＮＡまはＲＮＡの検出に使用し
得る。興味ある１つの重要な分野は。

特定の宿主に感染し得る病原体、ウィルス、細菌。

カビ、原生動物などの検出である。例えば、米国特許第
４，３５８．５３５号を参照されたい。興味ある別の分
野は、羊水穿刺に伴うような宿主のゲノムに存在する対
立遺伝子、変異、または障害の検出、；遺伝的カウンセ
リング；宿主の感光性または罹病性の決定；および細胞
集団のモニターである。興味ある第３の分野は、転写の
モニター、　ＲＮＡウィルスの検出１発現されないＲＮ
Ａによる生物の識別などのような理由によるＲＮＡの存
在の決定である。

興味ある他の分野は、外来染色体ＤＮＡまたは組込まれ
たＤＮＡの存在、　ＤＮＡ配列の増幅、このような配列
の維持のために改変された生物をモニターすることを包
含する。これらは２例示とすることを意図されるもので
あるが、全体的に包含されるものではない。

生理学的な試料は１本発明の方法を用いる様々な目的か
ら明らかなように１種々様々な起源から得ることができ
る。起源は９種々の生理学的な流体を包含する：排泄物
（例えば、大便、痰、小便。

唾液など）；血漿、血液、血清、目の水晶体液。

を髄液、リンパ液など。試料は、改変することなく使用
するか、あるいは試料をクローニングなどで増加させる
ことにより改変し、単離を与え得る。

後者の場合には、　ＤＮＡまたはＲＮＡの全体の増幅。

および外来のＲＮＡまたはＤＮＡの減少が起こる。ウィ
ルスは、ウィルスＤＮへの量が増加するように。

適合可能な細胞の層の上に播種することができる；臨床
上の単離物は、試料を栄養寒天培地上に塗布するかまた
はスポットし２個々のコロニーを分析するか、あるいは
試料全てを液体肉汁に導入し。

細胞を選択的に、または非選択的に増加させることによ
り得ることができる。試料を処理する特定の方法は、試
料の性質、　ＤＮＡまたはＲＮＡの起源の性質、存在す
る核酸の総量に対する。存在すると予想される興味ある
オリゴヌクレオチド配列の量および使用されるプロトコ
ルおよび標識の感度に依存する。

試料核酸または試薬ポリヌクレオチドは、共有結合的に
または非共有結合的に、少なくとも非拡散的に、支持体
に結合される。（第２図りにより表わされる実施態様の
場合には、捕護プローブだけが固体支持体に結合される
）。試料核酸が支持体に結合される場合２種々の支持体
には特定の用途が見い出され、その程度までそれらの支
持体は好ましい。これらの支持体は、ニトロセルロース
フィルター、ジアゾ祇、エクテオラ紙（ｅｃｔｅｏｌａ
ｐａｐｅｒ）　、または他の支持体を包含する。他の支
持体は、低い特異的結合または非特異的結合、核酸試料
の保持、操作の簡単さ、および種々の適切な処理（例え
ば、生物の増殖、洗浄、加熱、移動。

および標識の検出）を許容するような所望の特性を与え
る。

ポリヌクレオチド試薬の成分が支持体に結合されるとい
う範囲まで、支持体の種類は、試料オリゴヌクレオチド
を伴う支持体の種類にわたって非常に多種多様である。

支持体は２粒子１紙、プラスチックシート容器壁、デイ
バイダー、ミリポアフィルタ−などを包含する。支持体
の材質は。

天然に存在する有機高分子および合成された有機高分子
の両方を包含する：多ＩＪ！類、ポリスチレン。

ポリアクリル酸、およびこれらの誘導体（例えばポリク
リルアミド）、ガラス、セラミック、金属炭素、ポリ塩
化ビニル、タンパクなど。これらの種々の材料は、共有
結合または非共有結合のいずれが望まれるかに依存して
、官能基化または非官能基化され得る。

試料核酸が支持体に結合される場合、特定の支持体に依
存して、加熱は核酸を申し分なく結合させるのに充分で
あり得る。他の場合には、ジアゾ基を核酸に結合させる
のに使用し得る。しかしながら、ポリヌクレオチド試薬
の成分が支持体に結合される場合には９種々様々な技術
がポリヌクレオチド試薬の支持体への結合の維持を確実
にするために用いられ得る０例えば、支持体は、結合の
ための活性アミノ基を有するように官能基化することが
できる。この官能基化は、支持体へのアルキルアミン、
ヒドラジン、またはチオセミカルバジドの結合により行
なわれる。末端トランスフェラーゼを用いることによっ
て、リボヌクレオチドをＤＮ＾ポリヌクレオチド試薬に
付加することができる。適当な酸化剤（例えば、過ヨウ
素酸、過酸化水素に加えた酸化オスミウム、四節酸鉛な
ど）と共にグリコール開裂を行なうと、ジアルデヒドが
形成され９次いで表面のアミノ基に結合し、−置換のア
ミノ基または二置換のアミノ基を与える。

あるいは、チオホスフェートを使用するとアルキルチオ
エステルを形成するマレイミド基を与えることができる
。アガロースおよびポリアクリルアミドに対して、　Ｐ
ａｒｉｋｈら（前出）およびＩｎｍａｎ　（前出）によ
り述べられた種々の技術を使用し得る。

これらの技術は、他の材料に対しても応用し得る。

分析培地に利用可能な支持体上のポリヌクレオチド試薬
成分の総数は、大部分が経験的に決定されるが、変更し
得る。望ましくは、ポリヌクレオチド密度がハイブリダ
イゼーションを妨害しない限り、支持体上の利用可能な
官能基に対して、ポリヌクレオチドの単位表面積当りに
、かなりの高濃度を用い得る。

（以下余白） ポリヌクレオチドの大きさは、広範囲に変化し。

普通は約１５塩基を下回らず、５０塩基またはそれ以上
であり、普通は約５００塩基を越えず、より普通には２
５０塩基を越えない。通常、核酸試料中の配列と相同性
を有する。ポリヌクレオチド試薬成分中の領域が存在し
１通常興味ある該配列は、少なくとも６塩基１通常少な
くとも１２塩基を有する。

ハイブリダイゼーションのための領域は、１６塩基また
はそれ以上であり１通常約１　ｋｂｐを越えない。

完全な相同性は必要ではなく、少なくとも約５０％。

より好ましくは少なくとも８０％の相同性があれば充分
である。（相同性の割合（％）は相補性を表すことを意
図する。ただし、環状に突出している５塩基より大きな
非相補的挿入部分は無視する。）特に、対立遺伝子群、
数多くの異なる株、または関連のある種（ｍＲＮＡやゲ
ノム部分は良く保存されるが、それにもかかわらず多く
の形態をとる）に興味がある場合には、しばしば、その
相違を反映し、いかなる特定の配列に対しても興味ある
すべての配列に対する相同性を最適化するプローブの調
製が望まれる。

標識されたポリヌクレオチド試薬成分の標識は。

選択的に切断可能な部位または分析中に保持される架橋
により、ポリヌクレオチド配列に加えられ得る。種々様
々な標識を使用し得る。該標識は検出可能な信号または
検出可能な信号を得るための手段を提供し得る。

従って、標識は、配位子、放射性同位元素、酵素、蛍光
体、化学発光体、酵素自己不活化抑制剤。

酵素共同因子、酵素基質などの種々の置換基、あるいは
直接的または間接的に検出可能な信号を与え得る他の置
換基を包含する。

配位子が含まれる場合には９通常、該配位子に特異的に
結合する受容体１例えばビオチンおよびアビジン、２．
４−ジニトロベンゼンおよび抗（２，４−ジニトロベン
ゼン）　ＩｇＧなどが使用される。該受容体は、上述の
ように、適当な標識で置換される。

このようにして、ポリヌクレオチド配列１つあたりに１
個の検出可能な信号を与える標識の数を増加させ得る。

大部分は、免疫分析法で使用するために用いられる標識
は１本発明の分析に使用し得る。これらの標識は、米国
特許第３．８５０．７５２号（酵素）；第３．８５３，
９１４号（スピン標識）；第４，１６０，０１６号（蛍
光体）；第４，１７４，３８４号（蛍光体および消光剤
）：第４，１６０，６４５号（触媒）；第４，２７７．
４３７号（化学発光体）；第４，３１８，７０７号（消
光粒子）；および第４，３１８，８９０号（酵素基質）
に例示されている。

例示となる蛍光標識および化学発光標識は、フルオレセ
イン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ビリ
プロティン、ルミノールなどを包含する。

例示となる興味ある酵素は、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
α−アミラーゼ、ウリカーゼ。

マレートデヒドロゲナーゼなどを包含する。すなわち、
興味ある酵素は、主に加水分解酵素および酸化還元酵素
である。

標識をポリヌクレオチド配列に結合させる方法は、該標
識の性質に依存して、広範囲に変化する。

すでに指摘したように、リボヌクレオチドは、オリゴヌ
クレオチド配列に付加され、切断され、そして得られた
ジアルデヒドはアミノ基またはヒドラジン基に結合され
る。この結合の永続性は、アルキルアミンの形成をもた
らす還元条件を用いるとにより、さらに向上する。ある
いは、これら標識は５　α−ブロモまたはα−クロロア
セチルのような活性ハロゲンと置換され得る。活性ハロ
ゲンは、チオリン酸基またはチオプリンに結合され。

チオエーテルを形成する。あるいは、これら標識はマレ
イミド官能性を有し得る。この場合、ポリヌクレオチド
上に存在するメルカプト基はチオエーテルを形成する。

ポリヌクレオチドの末端リン酸は、カルボジイミドで活
性化され得る。この場合、得られたホスホイミダゾリド
は、アミノ基またはアルコールと反応し、ホスホアミデ
ートまたはホスフェートエステルとなる。ポリペプチド
結合は、アミノ修飾されたプリンに形成され得る。

このように、標識の選択、結合の方法、および結合基の
選択には、大きな自由度がある。

ポリヌクレオチド試薬を試料と結合させることにより、
存在する核酸分析物は支持体と結合するようになる。選
択的に切断可能な部位における切断により支持体から放
出される標識の量は９分析物の存在に関係し、該分析物
の量は定量的に決定され得る。

標識と支持体との間の空間的な関係の改変は。

数多くの方法で達成され得る。指摘したように。

プローブおよび同じポリヌクレオチドに共通する少なく
とも１つの認識部位が存在し得る。該部位は制限酵素で
切断され、従って支持体からプローブが放出される。種
々様々な制限酵素は、４塩基。

６塩基、または８塩基の認識部位を検出するに利用可能
である。認識部位における。または認識部位から離れた
箇所における切断は、平滑末端または付着末端を与え得
る。このようにして、認識部位の二本鎖形成は、標識の
放出を伴って二本項が開裂する機会を与える。

選択的に切断可能な部位の性質は、必ずしも結合基に依
存しない。制限部位を含む場合、試薬成分に含まれる結
合は９分析条件下で安定であることだけが必要である。

制限部位を含まない場合。

部位は支持体から標識を分離させる結合を含む。

無秩序な加水分解が支持体から標識を分離するホスホジ
ェステラーゼを使用し得る。ポリヌクレオチドは、引き
続いて標識されるか、または標識され得る改変ヌクレオ
チドに連結され得る。

ヌクレオチドが標識の結合に対して改変されるか、また
は改変されない種々様々な結合基を使用し得る。ＷＯ３
３１０２２７７には、８−アミノアルキルアデノシンの
使用が報告されている。この場合、標識はアミノ基に結
合し得る。次いで、　　ＤＮＡポリヌクレオチド試薬は
、複数の標識が各標識されたポリヌクレオチドの末端に
存在するように、リボヌクレオチドを連結し得る。連結
されたりボヌクレオチドは、　ＲＮａｓｅを使用して選
択的に切断され得る。これは、信号を改変するような相
互作用をする標識を使用する場合に、特に有利である。

例えば、極めて接近した蛍光体は自己消光する傾向があ
る。観察される蛍光体信号は、リン酸結合の加水分解に
よって非常に促進されるので２個々の蛍光体分子は溶液
中に無秩序に存在する。もちろん。

蛍光体はこの現象を示す唯一の標識である必要はなく、
他の標識体も同様の効果を示し得る。酵素基質または共
同因子を用いる場合には、支持体に結合するポリマー上
に、それらが存在することにより、酵素の接近に伴う実
質的な立体障害が起こる。従って、標識体の解重合およ
び支持体からの放出は酵素反応速度を実質的に増大させ
る。

別の技術は、　　ＤＮＡポリヌクレオチド試薬にリボヌ
クレオチドを付加し１次いでリボース部分を開裂させて
、ジアルデヒドを生成させることである。

（例えば、　Ｌｅｅら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（
１９７０）　９　：１１３−１１８を参照されたい）。

ジアルデヒドは１選択的に切断可能な部位により標識に
結合するアミノ基に連結され得る。例えば、ジスルフィ
ド結合は、シッフ塩基と、還元により切断される標識と
の間に存在し、エルマン試薬などにより標識を放出し得
る。

制限エンドヌクレアーゼを用いて標識を放出させる場合
には、ジアルデヒドは、還元アミノ化条件下でアミノ官
能基と結合し得る。タンパク（例えば、酵素の）のよう
な種々のアミノ源、フィコビリプロティン蛍光体、免疫
グロブリンやアビジンのような受容体、またはタンパク
標識を使用し得る。

別の結合方法は、カルボジイミドを用いて末端のリン酸
を活性化し、ホスホイミダゾリドを形成することを包含
する（Ｃｈｕら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ。

（１９８３）■：　６５１３−６６２８）。ホスホイミ
ダゾリドは。

アミンと反応して、ホスホアミデートを形成する。

前述のように、アミン結合基は１選択可能な切断部位を
適当に含む。該部位は、ピロホスファターゼにより開裂
し得るピロホスフェートジエステル。

ペプチダーゼにより開裂し得る短いポリペプチド。

光感性官能基（例えば、アブ、ペルオキシなど）であり
得る。

標識を付着する別の方法は、１２原子のアミンリンカ−
アームを含むシトシンまたはウラシルのような改変可能
なヌクレオシド誘導体を用いたポリヌクレオチドの化学
合成を包含する。該化学合成の後には、フルオレセンま
たはジニトロベンゼンのようなりボーク基の導入が行わ
れる（Ｒｕｓｈ、　ＤＮＡ（１９８４）　３　：　１２
３）。

検出可能な信号を直接与えないが、１つまたはそれ以上
の標識と複合体を形成するりボークに結合するような配
位子で置換されたヌクレオチドを使用し得る。具体例と
しては、アビジンに結合するビオチニル化ヌクレオチド
、免疫グロブリンに結合するハプテン、およびタンパク
受容体（例えば、レクチンを伴った糖、細胞表面の膜タ
ンパクを伴ったホルモンおよび成長因子など）に結合す
る種々の天然に存在する化合物が挙げられる。

第２図りにより表される実施態様では１選択可能な切断
部位は、２つの方法のうちの一方で導入される。

まず、架橋化合物は、捕護プローブ１それ自身。

すなわち図中に示されている「Ｘ」の位置に取り込まれ
る。いかなる数の架橋剤も、この目的のために使用され
る。唯一の制限は、該捕護プローブ中に導入された切断
部位が、この方法の残りの部分で使用される種々のプロ
ーブ、標識などと適合する試薬を用いて開裂しなければ
ならないことである。適切な架橋剤の例を以下に示ずニ
ブロープ中にアミド結合を導入するＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（ＮＯ３）　　；ヒドロキシルアミン感受性
架橋を形成するエチレングリコール　ビス（スクシンイ
ミジルスクシネート）（ＥＧＳ）；塩基感受性スルホン
架橋を与えるビス〔２−スクシンイミド−オキシカルボ
ニルオキシ〕エチル〕スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）　；
過ヨウ素酸により開裂し得る１、２−ジオールを導入す
るジスクシンイミジルタルタレート（口ＳＴ）　；そし
てチオールで開裂可能なジスルフィド結合を与えるジチ
オビス（スクシンイミジルプロピオン酸）　（ＤＳＰ）
である。架橋剤は、好ましくは以下の方法によって捕護
プローブ中に導入される：アルキレンアミンプローブの
調製（Ｕｒｄｅａ　ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
　　１６　　（１１）　　　：　　４９３７−４９５６
（１９８Ｂ））　　；（２）プローブ結合架橋剤を与え
る９選択された架橋剤によるプローブ上の遊離アミン官
能基の反応；（３）クロマトグラフィーまたは他の方法
を用いたプローブ結合架橋剤の精製；そして（４）所望
の切断部位を有する支持体結合プローブを与える。プロ
ーブ結合架橋剤の、遊離反応部分（例えば、遊離アミン
基）を有する固定支持体との反応。

（以下余白） それ故、切断部位は１例えば次の結合の型を包含し得る
： Ｃ−Ｎ１１−　　（塩基感受性）； （塩基感受性）； −５−Ｓ−（チオール感受性）；および第２図りにおけ
る選択可能な切断部位「Ｘ」はまた、固体支持体への結
合の前に、捕護プローブの適当な改変により導入され得
る。この方法は。

次の構造を有するポリヌクレオチドの調製を包含する： Ｏ−〇− ここで、Ｘは、上記の選択可能な切断部位であるか、あ
るいはこれらの切断部位を含む。特に好適な実施態様で
は、ポリヌクレオチドは次の構造を有する： 次いで、この化合物は、当該分野でよく知られた従来の
方法を用いて固体支持体に付着され、第２図りに示され
た捕護プローブを与える。後者の化合物は、酒石酸から
誘導された試薬を用いて調製される。この場合、１．２
−ジオール系は、　　ＤＮＡの合成の間にジベンゾイル
化合物として保護され。

さらにジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護された水酸
基と、ホスホアミダイト由来の水酸基（ここで。

ｒｉＰｒ」はイソプロピルを表す）とを含んでいる。

Ｈ これらの水酸基は標準的なホスホアミダイト法用いてＤ
ＮＡ断片に結合される。合成および完全な脱保護化の後
、　　ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、上記のように、
１．２−ジオール、すなわちＮａＩＯ４で特異的に開裂
され得る結合を含んでいる。当業者により容易に認めら
れているように、　　ＤＭＴ保護基は。

酸感受性でありかつ塩基安定性であるような適当な部分
Ｒ１（例えば、非置換または置換のアリール基またはア
ルキル基）で置換され得る。ここで。

アルキル基は２例えばフェニル、ナフチル、フラニル、
ビフェニルなどであり、これらの置換基は０〜３個２通
常は０〜２個である。Ｒ１は、非干渉の安定な基（中性
または極性の基、電子供与性または電子吸引性の基）を
包含する。同様に、ホスホアミダイト部分は、ポリヌク
レオチド合成に適したリン誘導体（例えば、ホスホトリ
ニス“チル。

ホスホジエステル、ホスファイトＨ−ホスホネート、ホ
スホロチオエートなど）を包含する別の種のＲＺ、ある
いはハロゲンで置換され得る。例えば。

特開昭６２−１８８９７０号（Ｕｒｄｅａら、「溶液相
核酸サンドウィッチ分析および該分析に有用なポリヌク
レオチドプローブ」）を参照されたい。

第２図Ａ−Ｃによって示された実施態様におけるように
、第２図りの実施態様は、溶液中の特異的結合標識の検
出（および９分析物２の正確な測定）を可能にする。こ
の場合、非特異的結合標識６は固体支持体５に結合した
ままで・ある。

第３図ＡおよびＢによって示された本発明の他の実施態
様では、捕護プローブ１（結合Ｙにより固体支持体５に
結合している）と、核酸分析物２と、標識プローブ３と
の間で、複合体が、第２図の実施態様におけるように、
形成される。このハイブリッド複合体を得る方法は、上
で引用した特開昭６２−１８８９７０号にさらに詳細に
記載されている。

特異的に結合した標識を溶液中へ放出させるために、「
置換」ポリヌクレオチド鎖４が導入され。

分析物と捕護プローブとが形成するハイブリッドよりも
安定なハイブリッドを捕護プローブ１と形成するように
選択される。Ｇ／Ｃ含量もまた。１つの要素であるが、
この方法では、典型的に、置換鎖の長さ「Ｂ」が捕護プ
ローブと分析物との間で形成された二本鎖の長さ「Ａ」
よりも若干長いことが必要である。

オリゴヌクレオチド鎖の非拡散性結合のための種々様々
な支持体および技術は文献に報告されている。総説とし
ては、　ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌのＡｎａ　１
　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８４）　１３８：２６７−２８
４を参照されたい。８０゛Ｃの温度で２時間加温するだ
けで充分な支持体には、ニトロセルロースフィルタがあ
り、さらに活性化を行わなくても結合が起こる支持体に
はジアゾ祇があり、その他の支持体にはエクテオラ紙な
どがある。アガロースビーズは、　　ＤＮＡとの直接反
応のために臭化シアンで活性化され得る（Ｂａｕｍａｎ
ら、　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　　Ｃｔｏｃｈｅｍ、
　　（１９８１）２９：２２７−２３７）あるいは、ポ
リヌクレオチド鎖に存在するチオール官能基と反応し得
るビーズを提供するために。

臭化シアンおよびジアミンと反応させ１次いでα−ハロ
アセチル（例えば、ブロモアセチル）と。

または活性カルボキシル置換オレフィン（例えば。

無水マレイン酸）と１反応させ得る０例えば、　ＤＮＡ
は、改変して５結合のためのα−チオホスフヱートを形
成し得る（Ｐｆｅｕｆｆｅｒおよび旧１ｍｒｅｉｃｈ、
　　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９７５）２５０：８６７−
８７６）　、化学的手段によって、テフロン支持体に結
合したオリゴヌクレオチドを合成し２次いでそれを除去
することなく。

該物品を充分に脱保護化することも可能である（Ｌｏｈ
ｒｍａｎｎら、　　ＤＮＡ（１９８４）　３　：１２２
）。

標識および試薬の多種多様性を考慮して２本発明の方法
における共通の局面が述べられ２次いで２．３の例示的
なプロトコルが述べられている。

これらの手順に共通する部分はハイブリダイゼーション
である。ハイブリダイゼーションは、様々な程度の厳密
さで実行され得る。従って、より高いあるいはより低い
相同性が二本鎖の形成に必要とされる。大部分の場合、
水溶性媒体が用いられ。

それは様々な他の成分の混合物を有し得る。特に。

有機極性溶媒は厳密さを高めるために用いられる。

溶媒の例としては、ジメチルホルムアミド１．ジメチル
アセトアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる
。すなわち、使用量では、水と混和し得る有機溶媒が用
いられる。厳密さはまた。塩濃度を増大することによっ
ても高められ、大きなイオン強度が得られる。また、温
度を上昇させることも、厳密に使用され得る。各場合に
は、逆のことを行えば、厳密さは減少する。他の添加剤
（例えば、界面活性剤）もまた、厳密さを限定するため
に使用され得る。

ハイブリダイゼーションの時間は、興味ある配列の濃度
、厳密さ、相補配列の長さなどにより様々である。通常
、ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１５分、−
船釣には約７２時間またはそれ以内、より普通には約２
４時間またはそれ以内で行われる。さらに、ある厳密さ
でハイブリダイゼーションを行い９次いでより高い厳密
さで洗浄することにより、充分な相同性を欠くヘテロ二
本鎖が除去される。

核酸試料は、様々な方法で処理される。この場合、完全
なゲノム、機械的に剪断されるか、または制限酵素で分
解された０、５ｋｂ〜３０ｋｂの様々なサイズのゲノム
断片、あるいは例えば電気泳動によりサイズで分離され
た断片を使用し得る。場合によっては、興味ある配列は
１例えば−本積ＤＮＡまたはＲＮＡウィルス（例えば、
　Ｍ１３）のような適当なベクター内でクローン化され
た配列である。

分析媒体中に含有されるのは、緩衝液、界面活性剤（４
Ｍエバ、　５ＯＳ）フィコール、ポリビニルピロリドン
を包含する他の添加剤と、外来ＤＮ八であり。

それらは非特異的結合を最小にする。これらの添加剤の
すべては１文献中に例が挙げられているので、ここでは
詳しく述べる必要はない。

特定のプロトコルに従って、試料核酸およびポリヌクレ
オチド試薬は、所定の厳密さのハイブリダイゼーション
媒体中で混合される。充分な時間にわたってハイブリダ
イゼーションを行った後。

支持体は、ハイブリダイゼーション媒体よりも厳しいあ
るいは緩やかな厳密さの媒体で、少なくとも１度洗浄さ
れる。結合したポリヌクレオチドおよび分析物を有する
支持体は１次いで選択可能な切断部位を切断するために
必要な反応物（物理的処理１例えば光を包含する）と接
触させ、−本積または二本鎖の開裂を行なう。大部分の
場合、加水分解酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ
。

ホスホジェステラーゼ、ピロホスファターゼ、ペプチダ
ーゼ、エステラーゼなど）が使用される。

しかし、還元剤、エルマン試薬、または光のような他の
試薬にも有用性が見られる。切断後、標識および測定方
法に依存して、支持体および上清は必ずしも分離されず
、該支持体から放出された標識の量が測定される。

さらに本発明を例示するために、２．３の例示的なプロ
トコルが述べられる。第１の例示的なプロトコルでは、
マイクロタイタープレートが使用される。この場合、蛍
光標識されたポリヌクレオチドは、各ウェルの底に結合
する。クローン化されている病原体由来のＤＮＡは、約
０．５ｋｂ〜２ｋｂの断片を与えるために、１つまたは
それ以上の制限酵素で制限される。断片は、変性させる
ための緩やかな塩基性の条件下で単離され、ハイブリダ
イゼーション媒体中に分散される。次いで、これら断片
は、様々なウェルに順番に加えられる。、各ウェルは、
様々な配列を有しており、これらの配列は、特定の病原
体種の様々な株の配列と特異的な相同性を有する。

これらのウェルは、高温（例えば、６０°Ｃ）で。

ハイブリダイゼーションが起こるのに充分な時間にわた
って保持される。その後、上清は除去されウェルはハイ
ブリダイゼーション媒体よりも低い厳密さの緩衝化媒体
で繰り返し充分に洗浄される。

二本鎖を形成することによりすべての株に共通する制限
酵素の認′識部位が得られる。次いで、各ウェルには、
二本鎖ＤＮＡを分解するための制限酵素媒体が添加され
１分解の結果、蛍光標識は上清中に放出される。上清は
、各ウェルから吸い出され。

照射される。次いで、蛍光の量は、興味ある配列の存在
の指標として測定される。このようにして。

液相中の蛍光の存在を観察することによって０株が存在
するものを迅速にスクリーニングし得る。

第２の例示的なプロトコルでは、標識されていないポリ
ヌクレオチドが結合したガラスピーズを含むカラムを使
用する。次いで、このカラムに。

哺乳動物細胞から得られたＤＮＡ断片を含有する試料核
酸を加える。これらの断片は約０．５ｋｂ〜１０ｋｂま
での範囲に及ぶ。ＤＮＡ試料は、適当なハイブリダイゼ
ーション媒体中に分散され、そしてカラムに加えられ、
ハイブリダイゼーションが起こるのに充分な時間にわた
ってカラム中に保持される。

試料のハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼー
ション媒体は、カラムから放出され、ジスルフィド結合
により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰ）で標識
されたポリヌクレオチド試薬は、第１の媒体よりも厳密
な条件下で、第２のハイブリダイゼーション媒体中に加
えられる。第２の媒体は、ハイブリダイゼーションが起
こるのに充分な時間にわたってカラム中に保持される。

標識されたポリヌクレオチドは、興味ある配列に相補的
な配列を有する。ハイブリダイゼーション媒体はカラム
から減圧により除去される。

標識されたポリヌクレオチドと不充分な相同性しか有さ
ないポリヌクレオチド配列を除去するために、カラムは
より高い厳密さの溶液で、１度またはそれ以上、洗浄さ
れ得る。次いで、エルマン試薬がカラムに加えられ、ジ
スルフィド結合が切断され、そしてＩ（ＲＰが放出され
る。このＨＲＰを含んでいる溶液は、カラムから減圧に
より除去され。

集められる。さらに、遊離の酵素がカラム中に保持され
ないことを確実にするために、洗浄を行なう。得られた
ｌＩＩ？Ｐ標識含有溶液は、ここでＩＩＲＰ標識につい
て分析される。ＩＩＲＰに代えて３種々様々な他の酵素
が使用され得る。これらの酵素は１分光光度または蛍光
光度により検出可能な生成物を与える。

（以下余白） 第３の方法においては、核酸のサンプルをフィルターに
吸収させ、　８０″Ｃ２時間加熱することにより、ニト
ロセルロースフィルターの一方の端に非拡散的に結合さ
せる。フィルターを洗浄し、それからハイブリダイゼー
ション条件下の下で、アルキルカルボキシ置換アデニン
にエステル結合したウンベリフェロンで標識したポリヌ
クレオチドのハイブリダイゼーション溶液に添加する。

標識したポリヌクレオチドは、目的の塩基配列に相補性
のある配列を有する。充分な時間でハイブリダイゼーシ
ョンを行った後、フィルターをハイブリダイゼーション
溶液から取り出し、非特異的に結合した核酸を除くため
に洗浄し、そして、計量したエステラーゼ溶液中に浸す
。螢光量の増加の割合を核酸サンプル中における分析物
の量として測定し、モニターする。

また別の方法においては、プラスチック材料製のデイツ
プスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）が用いられる。

このデイツプスティックにおいては、該ストリップ（末
端に螢光物質を有し９分析物の配列に相補性のある。標
識ポリヌクレオチド配列を有する）を支持するホルダー
が用いられ得る。核酸サンプルは適当なハイブリダイゼ
ーション媒質内で調製されデイツプスティックが導入さ
れ、そして、ハイブリダイゼーションが行われる。十分
な時間でハイブリダイゼーションを行った後、デイツプ
スティックを除き、全ての非特異的結合ポリヌクレオチ
ドを除くために洗浄する。目的とするポリヌクレオチド
配列の存在により、制限酵素認識部位が形成され、そし
て、デイツプスティックが制限酵素反応混合物に入れら
れ１分解が行われる。充分な時間分解した後、デイツプ
スティックを除き。

充分に洗浄し、溶液の螢光量を測定する。ベースライン
を上回る螢光量は２分析物の存在を示す。

また別の方法においては、ポリヌクレオチド試薬成分は
、核酸分析物のある領域に相補性のある配列を持ち、か
つ、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合する
第１のポリヌクレオチド；および核酸分析物の別の領域
に相補性のある第２の標識ポリヌクレオチドである。標
識は、Ｎ８−アミノヘキシルデオキシアデノシントリホ
スフェート　ランベリフェリカルボキシアミドでポリヌ
クレオチドの尾部分に行なう。核酸サイプルを７１イブ
リダイゼ一シヨン条件下で、過剰の標識ポリヌクレオチ
ドの入ったウェルの中に導入する。充分な時間でハイブ
リダイゼーションを行った後、ノ＼イブリダイゼーシゴ
ン溶液をウェルからアスピレータ−で取り除き、ウェル
を洗浄し、ウェル内に残ったＤＮＡを脱プリン化する。

この脱プリン化は。

９０χギ酸を加え、　６０″Ｃにて時間加熱するか、あ
るいはピペリジンを加え９０°Ｃにて３０分間加熱する
ことにより行われる。

あるいは、標識を、螢光物質Ｎ’−：ニー：アデノシン
をつくる５ｉｌｖｅｒおよびＦｅ１ｓｈの方法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒ（１９８２）　２１　：　６０６６）
によりポリｄＡをクロロアセトアルデヒド処理すること
によって得られるオリゴマーの過剰量で標識したポリヌ
クレオチドを連結させることにより行なう。標識の除去
は、ミクロコツカスのヌクレアーゼを用いて、１０１０
０ｐ　ＣａＣＩｚ中で３７°Ｃにて１時間にわたり行な
うことにより達成される。

両方の場合において、ポリマーの螢光は自己消光のため
に実質的に減少する。溶解により、螢光量の実質的な増
加が見られる。このように、脱重合化抵抗性を示す非特
異的結合標識ポリヌクレオチドは、検出可能なシグナル
の妨げとはならない。

さらに、核酸分析物を定量するために蛍光量増加の割合
を測定することができる。なぜなら、バックグラウンド
の螢光レベルは弱いからである。自己消光の代わりに、
螢光物質と消光物質のどちらか、あるいは、その両方の
成分の試薬系を用いることも可能である。このような系
においては、１つの成分中には非消光螢光物質が存在し
、消光物質は、もう一方の成分中に存在する。

次の実施例は９本発明を説明するものであり制限するも
のではない。

（以下余白） 実」１阿 ■、リボヌクレオチドのＤＮＡの３′末端への結合ａ、
ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（
ＴｄＴ）による尾部伸長 次に述べるのは、　Ｒ，Ｒｏｙｃｈｏｕｄｒｙ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄ　ｉｎ上咳と剋旦■（１９８０）６５：４３の
方法に修正を加えたものである。合成したＡＴＴＣＧＡ
ＣＧＣＴＴＡＴＧＧ　　（５’→３゛）である断片ｌの
末端にｒＡＴＰを付加した。１５μｌの０．８３ｍＭ　
ＡＴＰ、および２．５ｕ１．の１０ＸＴｄＴ　緩衝液（
１，４Ｍカコジル酸カリウム、０．６ＭトリスｐＨ７，
６，１０ｍＭＣ０Ｃ＋２．１　ｍＭジチオトレイトール
（ＤＴＴ））の溶液中の４００５ピコモル（２０００，
、。単位を１■とする）の断片ｌに、２μβのＴｄＴ（
仔ウシの胸腺由来、　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌ
ｓ、　Ｉｎｃ、　：１３．５単位）を加える。２４．５
μ２のサンプルを、３７°Ｃで１時間放置後、エバポレ
ーションにより乾燥させた。ペレットを１０μ２の９０
％ホルムアミド、　０．０５％ブロモフェノールブルー
、１％フィコールに溶解させ、９０℃にて５分間加温し
た。次に、２０％の変性ボリアクルリアミドゲル上にの
せ、４０ミリアンペアで流した。

リボアデノシン１単位によって伸長させた断片１に相当
するバンドをＵ、Ｖ、照射によって確認し、ゲルから切
り出し、０．１Ｍ）リス、　ｐＨ８，０，５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ。

０．５Ｍ　ＮａＣ１中に１晩かけて溶出させた。（Ｍａ
ｘａｍａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　　（１９８０）６５：４９９−５
６０）。　Ｃ−１０５ＥＰ−ＰＡＫ（Ｗａｔｅｒｓ　　
Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）　　による脱塩は次のようにし
て行った。まず、カートリッジを５ｄの試薬グレードの
メタノールで２次いで１０戚の蒸留水で洗浄した。次に
、濾過したサンプルを５ＥＰ−ＰＡＫに注射器で注入し
た。２０ｒｄの水で洗浄後、　ＤＮＡを３戚の酢酸トリ
エチルアミン（ｐＨ７，３）　：メタノール（体積比１
：１）で溶出させた。次に、エバポレーションにより乾
燥させた（収率的８０％）。

ｂ、Ｔ、リガーゼによるライゲーション（連結）次に述
べられている方法は、３°末端にリボアデノシンを含む
１３７ベースの断片を合成するのに用いられた。上記に
て合成された断片ｌは、共通に適合し得るアダプターと
して、ライゲーションにより、末端にリボヌクレオチド
のついたＤＮＡ配列を合成するのに用いられる。

断片２ ＡＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＡ
ＴＧＧＡＡＡＣＧＡＴＧＴＡＴＡＴＴＴＣＣＧＣＧＡＧ
ＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧ 断片３ ＧＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＧＧＡＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡ
ＣＧＧＧＡＣＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＧ　ＡＣＧＴＣＣＣ
ＧＣＧＡＡＧＧＡＴＣＣ 断片４ ＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣ
ＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣ
ＴＴＴＧＴＴＴＡＣＧ 断片５ ＾ＡＴＴＣＴＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＣＧＣＧ断片６ ＣＣＡＴＡＡＧＣＧＴＣＧ 特に指示のない限り、上に示した塩基配列の５゛および
３”末端は水酸基である。これらの配列は。

次のように連結され得る。

（以下余白） ５’　　　　　３　　　　　　　２　　　　　　　１　
　　　　　　ｒ八　３　。

１）ライゲーション ２）ゲルによる単離 断片２を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより。

リン酸化した。あらかじめエバポレートして乾燥した９
００ピコモルの断片に、２μｌのＩＯＸＫＢ−ＴＳ（５
００ｍＭ　）リス、　１００　ｍＭ　ＭｇＣｈ、１０１
１ｇ　／　ｌ１ｄｌスペルミジン）と、２μｌの１０ｍ
Ｍ　ＡＴＰと、２μｌの１０ｍＭＤＴＴと、　　１　ｕ
ｌ　（ｆ３ユニット）のＴ４キナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）と、１３μｍの水とを加えた
。３７°Ｃで３０分間保温した後、さらに８ユニツトの
Ｔ４キナーゼを加えた。さらに３７℃にて３０分間保温
した後、同様の方法によりすでに５゛位をリン酸化した
４５μｆ　（９９０ピコモル）の断片ｌを加えた。２２
μｌの２Ｍ酢酸ナトリウムと８９１の２５０ｍＭ　ＥＤ
Ｔ八とを加えた後Ｉ　ＴＪキナーゼを不活性化させるた
めに、溶液を６５°Ｃで５分間加熱した。次に、断片３
〜６を加えた（それぞれ２．６μＮ、９０２ピコモル；
８μｆ、１００８ピコモル；３２μｆｆｉ、１００３ピ
コモル４５μｆ、９３６ピコモル）。この溶液をポルテ
ックスにかけ、６８０μ２の冷エタノールを加え、−８
０°Ｃに２０分間放置する。次にペレットを１２８０Ｏ
ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みをゆっくり捨て、
冷エタノールで２回洗浄し、乾燥させる。

これらのものをアニールさせるため、　１８μｌの水を
加え、加熱を行ってペレットを溶かした。加熱を行った
混合物の加熱は沸騰水浴中で行い、室温までゆっくりと
冷却した（約１０分間）。ここで。

３μｆの１０　Ｘ　ＫＢ−ＴＳと、３μＮの１０ｍＭ　
ＡＴＰと、３μ２のＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　ｆ！ｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　；　４００００単位／　ｒｒ
ｄｌ）　とを加えた。１４℃で３０分間放置した後。

溶液を乾燥させ、（断片１について上述したように）１
０％の変性ポリアクリルアミドゲルで精製した（収量：
約７５ピコモル）。

ｃ、２”−ニトロベンジルウリジン　コントロールポア
ガラス支持体上でのＤＮＡの合成コントロールポアガラ
スの５゛−ジメトキシトリチル２″−二トロベンジンウ
リジン誘導体（長鎖アルキルアミノ；はＰｉｅｒｃｅ　
Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）は。

Ｇｏｕｇら、　ＴｅＬｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、（
１９８１）２２：４１７７の方法により、Ｃｒｕａｃｈ
ｅｍ、Ｂｅｎｄ　Ｏｒｅｇｏｎにより調製された。オリ
ゴヌクレオチドの合成は、自動合成装置（Ｗａｒｎｅｒ
ら、賎程主印刷中）により行った。

２”−ニトロベンジル官能基は、２１００ワツトの水銀
ランプを使用したこと以外は、０ｎｔｓｕｋａ　　ら、
ム−ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９７４）　１
　：　１３５１に記載されたようにしてυＶ照射により
取除した。全てのサンプル（約１４．５μモルの２゛−
ニトロベンジルウリジン）について、５分間の照射は、
パイレックスのキュベツトで行った。

この方法により、５”ＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧ
ＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧ
ＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴＴＴＡＣＧｒＵ　３　
’に相当する配列（断片７）を合成し、下記に述べられ
ている結合に用いた。

Ｉｌ、ＤＮＡ　３°末端の固体支持体への結合ａ、チオ
セミカルバジド　コントロールポアグラス（ＴＳＣ−Ｃ
ＰＧ）の合成 イソチオシアネート　コントロールポアグラス（Ｐｉｅ
ｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）をヒドラジンにより次のよ
うに修飾し、チオセミカルバジド誘導体を生成させた。

４００■のイソチアシアネートＣＰＧを５０ｍ１の丸底
フラスコに入れた。２５ｄのジメチルスルホキシドと、
２００μ！の蒸留ピリジンと、ジメチルスルホキシド中
に溶解させた０、６％のヒドラジン５００μｌを加えた
（例えば、Ｊ、Ｂａｕｍａｎら、　Ｊ、ｆｌｉｓｔｏｃ
ｈｅｍ。

現世−旦ハＡ旦恒」工（１９８１）２９　：　２２７を
参照されたい）。

時おり撹拌しながら暗所で１８時間放置した後、ジメチ
ルスルホキシド、ピリジンおよびメタノールのそれぞれ
５０μβずつ、そして、　０．０１Ｍ、ｐＨ７，５のト
リス２１で洗浄した。

ｂ、固体支持体への断片７の結合 約２０００ピコモルの断片７をエバポレーションにより
水を除去して乾燥させた。これに、１００μＣｉのγ”
Ｐ−ＡＴＰ（Ｎｃｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ
）と、２μ２の１０×にＢ（０，５Ｍ　ｌ−リス塩酸ｐ
Ｈ７，８，１０（ｌａＭ　ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭ　Ｄ
ＤＴ）と、Ｉｕｊ２（８ユニツト）のＴ４キナーゼ（Ｎ
ｅｓ＋Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）とを加えた。

３７°Ｃで３０分間保温したあと、その溶液をゲル抽出
緩衝液で１雌に稀釈し、上述のように、　５ＥＰ−ＰＡ
Ｋ脱塩を行った。断片７（２０μｍ、９８２ピコモル）
に、０．０１Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ８，０）中の１ｍＭ
ｍ口過素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）２０ｔｉｌを加え
、暗所で０°Ｃにて１時間保持した。

これに、　０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）　１
００μｌ中のＴＳＣ−ＣＰＧ　１０■を加え、混合物を
暗所で０°Ｃにて１時間保持し、４°Ｃにて一夜放置し
た。

残存するチオセミカルバジド官能基をブロックするため
に、過ヨウ素酸で酸化したＡＴＰが用いられた。１００
　ｍＭ　ＡＴＰの２０μｌのサンプルを、１００μ！の
０．０１Ｍ　　トリス塩酸（ｐＨ８，０）中の２０■の
過ヨウ素酸により処理した。暗所で１時間放置した後、
この溶液４５μｌを、　０．１Ｍ　　酢酸ナトリウム１
５０　μｌ中の断片マーＴＳＣ−ＣＰＧＩＱＩｕｇに加
えた。４°Ｃで６時間放置後、この支持体を４×標準ク
エン酸ナトリウム（ＳＳＣ）溶液で充分に洗浄した。

取り込まれたカント数に基づくと、断片７の１３％（１
２８ピコモル）が、ガラス支持体に結合した。

ＩＩｌ、ＤＮＡの５”末端の固体支持体への結合ａ、ブ
ロモアセチル　コントロールポアガラス（ＢＡ−ＣＰＧ
）の調製 ０−ブロモアセチルＮ−ヒドロキシスフシイミドの合成
は、　Ｃｕａｔｒｅａｃａｓａｓ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、（１９７４）２４５：３０５９の方法にほぼ基
づいて行った。

３４７１１１ｇの臭化酢酸と、３４５■のＮ−ヒドロキ
シスフシイミド（Ｓｉｇｎ＋ａ）との混合物を、２０μ
！の蒸留ジオキサン中での混合物を調製した。この混合
物に、５３２■のジシクロへキシルカルボジイミドを加
えた。室温で７０分間振とうした後、混濁した溶液をグ
ラスウールにより濾過した。

５００　ｍｇＯ長鎖アルカリアミノ　コントロールボア
ガラス（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　；　０．１
ｍｅｑ／　ｇ）に、ＬＯｍｌの０．１０Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ１７，６）を加えた。このスラリーを氷上に置
き、０−ブロモアシルＮ−ヒドロキシスフシイミド溶液
をゆっくりと加えた。３０分間１時おり撹拌した後、　
ＢＡ−ＣＰＧを５１の０．１ＭＮａＣ１で洗浄した。

支持体上の臭化酢酸の当量数は、５’、５”−ジチオビ
ス（２−二トロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）テスト（Ｂｕ
　ｔ　ｔｅｒｗｏｒ　ｔｈら、＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｌ、Ｂ
ｉｏ　ｈ　ｓｌ、（１９６７０１８ニア１６）の方法に
より決定した。５０ｍＩ／、の水に溶解させた２００　
ｍｇのＤＴＮＢと、　１００　Ｉ！１１の水に溶解させ
た２−メルカプトエチルアミン１１４■とを含有するス
トック溶液を調製した。ＢＡ−ＣＰＧ（１０ＩＩＩｇ”
）を、１０μｌの２−メルカプトエチルアミンｍ　ｔ＆
に０．０５Ｍのリン酸ナトリウム５００　μｌ　（ｐｈ
８．０）を加えたものと。

１０分間室温で反応させた。次に、その溶液を１００μ
ｌのＤＴＮＢにより試験し可視スペクトルで記録した（
Ｅ＝１．３６Ｘ１０’ｍｏ＋−’ｃｍ−’、　ｐＨ８）
　、　ＢＡ−ＣＰＧなしで２−メルカプトエチルアミン
を用いたものをコントロールとした。ＢＡ−ＣＰＧ処理
によって失われた２−メルカプトエチルアミンの量から
、　ＢＡ−ＣＰＧが１０ｍモルフ■の臭化酢酸を含んで
いることが決定された。

ｂ、　ＤＮＡ　５”末端のＢＡ−ＣＰＧへの結合ｌＯμ
ｆｆｉ　（３３３ピコモル）の断片３（上記参照）に。

１０μｌの３−”５−ＡＴＰ　（アデノシン５°−０−
（３−チオトリリン酸ｓ　０．２５ｍＣ１，Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ））と、２〜５μ２の１
０　Ｘ　ＫＢと、１μｆ（８ユニツト）のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを加えた。３７°Ｃで３０分間保温し
、１μ２の５０ｍＭ　３−５−ＡＴＰ　（リチウム塩、
　Ｐ、−Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）＋および１μ
１８１Ｊ）のＴ４キナーゼを添加した。さらに３７゛Ｃ
で３０分間保温し、断片を上述したようにゲルにより分
離した。（Ｉ［ｔ：２６６ピコモル）。サンプルを［ｌ
ｅｃｋｍａｎＬＳ７０００液体シンチレーションカウン
ターＡｔｏｍｌ　ｉ　ｔｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｎｕｃｌｅａｒ）によりカウントした。

ＢＡ−ＣＰＧの５１１Ｉｇのサンプルを水により３回、
　０．１０ＭｐＨ７，６のリン酸ナトリウム溶液で２回
遠心分離にかけることにより洗浄した。５゛−チオリン
酸断片２を１００μ！のリン酸緩衝液に溶かし、洗浄し
たＢＡ−ＣＰＧに加えた。スラリーは、ロータリーエバ
ポレーターを回転させることにより２時間室温で撹拌し
た。溶液はデカンテーションにより廃棄した。

残留する臭化酢酸官能基をブロックするため、支持体を
２００ｕＡの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）
と、５０μｌの２−メルカプトエタノールとによってさ
らに２時間処理した。続いて、溶液のデカンテーション
を行い、支持体を４ｘｓｓｃにより充分に洗浄した（収
量：ＣＰＧｌ■当たり約１０ピコモル）。

■、西洋ワサビペルオキシダーゼーＤＮＡ　７３１合体
の合成 ａ、Ｅｌｕｔｉｐによる精製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｔｌＲＰ）（２ｍｇ；タ
イプＶｌ、Ｓｉｇｍａ；　１０，００００／３８ｍｇ）
を、０．５ｄのＯ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ
７，５）に熔解させた。０−ブロモアセチルＮ−ヒドロ
キシスフシイミド（１５μｌ）を上記溶液に加え、室温
で３０分間反応させた。この溶液を、　３０１ｄの０．
１Ｍ　リン酸ナトリウム（ＰＨ７，５）であらかじめ平
衡化したＰＤ−１０５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（
ファルマシア）に通した。褐色のフラクション（１−１
，２ｄ）を集めた。あらかじめ３°−３５Ｓ−ＡＴＰで
上述のように５°位をチオリン酸化し、乾燥させた（３
０ピコモル）断片８　（５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＡ
ＡＣＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＧ−３’　
）を、リン酸緩衝液５０μ！中に入れた。このチオリン
酸化断片８溶液に１分画したＨＲＰを加え、混合物を室
温に３０分放置した。

この混合物をＥｌｕｔｉｐ−ｄ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）カラムに通した。ペルオキ
シダーゼ−ＤＮＡ　？ＪＢｌｌはボイド体積に流出する
（２０χのカウントを回収した）。５°位を１２ｐ−リ
ン酸で標識した断片８を用いて対照実験を行なうと、こ
れらの条件下で０．５χを下まわるカウントが）立川し
た す、　ゲルによる分離 断片９　　（５’−ＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＧＴＴ
ＴＧＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴ
ＧＣＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡＡＣＣ−３’　）のペルオ
キシダーゼ複合体は、前述のように調製した。ただし。

３６０　ｐｍｏｌｅのブロモアセチル化西洋ワサビペル
オキシダーゼと１５６　ｐｍｏｌｅの断片９とを、１２
０μｆｆｉの０．０２５　Ｍ　リン酸ナトリウム、ＰＨ
７，５，中で結合させた。Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカラムにか
ける代わりに、この混合液をエバボレート・乾固し、１
７１の７５χグリセロール、　１０μｌの水、そしてｌ
μｒの１χブロモフ工ノールブルー混合液に懸濁させた
。次いで。

これを１０χの天然タンパクゲルに流した。（Ｌｉｎｄ
ｌｅら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｏ＋、（
１９８３）　９２：３０９　）。５’−３２ｐリン酸断
片９を用いて、対照実験を行った。酵素ｏＮ１．ｉ合体
は、結合していないペルオキシダーゼから（３５Ｓで標
識した。より速く流れるものとして）よく分離した。ゲ
ルは　１００ｍｆｉの１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ
７，５，５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、　６０ｕ　ｌ　３０″
Ａ過酸化水素水に、　６Ｑａ＋ｇの４−クロロ−１−ナ
フトールを２０厩の冷メタノールに溶かした溶液を加え
たもので染色した。この染色は、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの活性に基づいているので、ペルオキシダーゼ−
ＤＮＡ？３合体自体が活性であることを示すことが可能
であった。コントロールである３２Ｐ−断片９により活
性のあるものはつくり出されなかった。

ｃ、　　ＤＮＡ−ペルオキシダーゼと相補ＤＮＡとのハ
イブリダイゼーション ５°−チオリン酸化フラグメント１１（５’−ＣＣＡＡ
ＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＡＣ
ＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧ
ＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＣＴＴＴＧ）を前述のよう
に３２ｐで標識化した。１０％過剰量の断片１２（断片
１１に対して）を、５゛−チオリン酸化した断片１１と
ブロモアセチルペルオキシダーゼとの反応混合物に加え
た。溶液は６０°Ｃで３分間加熱し、室温に冷却した。

対照実験は、断片１２とブロモアセチル化酸素を用い、
５゜チオリン酸化断片１１を除いたもので行った。ゲル
は、断片１１の反応混合物とブロモアセチル化酵素とを
標準試料とし、前述のように泳動させた。

断片２＋酵素、および断片１１は、泳動の遅い（断片１
１−ペルオキシダーゼ複合体と比較して）新しいバンド
を示した。これはｘｚｐ標識を含んでいた。

このバンドにはまた。ペルオキシダーゼ活性があった。

断片１２−ペルオキシダーゼの対照実験では。

酵素活性のある３　ｔ　ｐでラヘルされたバンドは見い
出されなかった。

■１分析 この分析において、断片はモデルシステムで示され、Ｂ
型肝炎ウィルスのゲノムの一部分を含む。

この部分は、　ＩＩＢＶ　ＤＮＡの１４０３番目の塩基
のＢａｍ旧部位から、５゛方向に約６０塩基対伸びたも
の（断片３）と、３′方向に約６０塩基対伸びたもの（
断片２）とを含む０分析物である断片４は、断片３の３
°末端と断片２の５°末端に相補的である。

固体支持体に結合した断片３は、■ｂ節で述べたように
して調製した。■ｂ節の初めの部分に記載した方法に従
って、断片２の５゛部分をＴ３！−ｐ−６７Ｐで標識化
した（断片７に適用）。

ａ、ハイブリダイゼーション、プローブの捕捉約３　ｐ
Ｉｌｏｌｅの、支持体に固定された断片３　（０，３■
）の懸濁液と、　　５　ｐｍｏｌｅの″′Ｐ−断片２（
１０μｆ１１□０中）とを、それぞれの実験に使用した
。適量の試薬（表１参照）を加え、最終容量を５０〜１
００μｌとし、９０°Ｃに加熱し、１時間以上にわたり
室温にまで放冷した。室温にて４ｘｓｓｃで洗浄後。

支持体に固定したサンプルをベックマンし５７０００液
体シンチレーションカウンターにより、チェルネンコフ
　（Ｃｈｅｒｎｅｎｋｏｖ）で測定した。

表１ ｂ、制限酵素処理 典型的には、上記のようにプローブと結合した固体支持
体は、加重緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−■ｃＩ。

ｐＨ８，ｏ、　７ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、　１００　ｍＭ　
ＮａＣ１，２ｍＭ　　２−メルカプトエタノール）で２
回洗浄し、　２０μｌの同じ緩衝液に再び懸濁させた。

これに１μｌのＢａｍ旧（ＢＩＩＬ；　５０００単位／
７１５μりを加え混合した。３７°Ｃで３０分間インキ
ユベートシ、上１ｎおよび１回水洗した洗液を、処理さ
れた固体支持体の残る試験管から除去し３カウントした
。次に、懸濁液を２０μ！および酵素２μｌを加え、３
７°Ｃで一晩放置した。

上清と洗浄水はあらかじめカウントした。酵素の入って
いない対照実験も行った。

表２ Ｖｌ、ＰＣＬ　（過ヨウ素酸塩開裂リンカ−）の調製０
．０ジヘンゾイル酒石酸−水和物（１８，８ｇ、ｍｍｏ
ｌｅ）を２５０　ｄのＣＩｈＣＮに溶かし、溶媒を減圧
下で除去した。この操作を繰返した。得られたオイルを
２５０戚のＴＩＩＦに溶かし、シンクロへキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ）１０．６　ｇ（５０ｍｍｏｌｅ）を
５０ｍ１ＴＩＩＦに溶かしたものを加えた。数分以内に
、沈澱が生じ始めた。

２０°Ｃで１８時間撹拌した後１反応液を濾過し沈澱を
少量のＴ）ＩＦで洗浄した。次に沈澱を減圧下で乾燥さ
せると、　１０．ｈ　（１００％、　５０ｍｍｏｌｅ）
のジシクロへキシルウレア（ＤＣＩＩＵ）が得られた。

濾液に、　　２−（Ｎメチル）アミノエタノール（４，
０ｍ１．５０ｍｍｏｌｅ）を加え１反応液を２０°Ｃで
１時間撹拌した。次に、　ＤＣＣ（１０，６ｇ、　５０
ｍｍｏｌｅ）を５０ｍ！のＴＩＩＦに溶かしたものを加
えると、少量の沈澱を生じた。約１時間後に。

２−（Ｎ−メチル）アミンエタノール（４，０ｍ　、　
５０ｍｍｏｌｅ）を加え９反応液を２０°Ｃにて、１８
時間撹拌した。

生じた沈澱をしばしば濾過し、少量のＴＩＩＰで洗浄し
た。乾燥させたＤＣＨｌｌの沈澱は１０．８ｇ（１００
％）であった。濾液を合併し、エバポレートして油状と
した。シリカのクロマトグラフィーにより、　　８ｇ（
１７ｍｍｏｌｅ）の０．０−ジベンゾイル酒石酸ジ（Ｎ
−メチル−２−ヒドロキシエチル）アミド（１）を得た
。生成物は６％のメタノール／ジクロロメタンで溶出さ
せた。

ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）０．１１ｇ　とト
リエチルアミン（ＴＥＡ）２．４ｄとを含むＱｌ（８，
６ｍｍｏｌｅ）に。

５０ｍｆｌのＣＨｚＣｈに溶かしたＤＭＴ−ＣＩ（８，
６ｍｍｏｌｅ）を滴下した。ＤＭＴ−ＣＩを加えた後３
反応部合物を２０°Ｃにて１時間撹拌した。溶媒はエバ
ポレーションによって除去した。残渣を６００−の酢酸
エチルに溶かし。

有機相を４００ｍ１ｌの５％炭酸水素ナトリウムと４０
０−の８０％飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。

有機相を固体の硫酸ナトリウム上で乾燥した。

３０分後に、硫酸ナトリウムを濾過し、上清を油状に濃
縮し、トルエンおよびＣＩｈＣＮと共にエバポレートし
た。

粗製の物質をシリカゲルクロマトグラフィーにより、ｎ
−ブタノール／ＣＨ，ＣＩ□で溶出させた。純粋なモノ
ー〇肘生成物は、２〜３％ｎ−ブタノール／Ｃ１１□ｃ
ｈで溶出し、　１．５３ｇ（２ｍｍｏｌｅ）の０．０−
ジベンゾイル酒石酸２−（Ｏ−ジメトキシトリチル）ヒ
ドロキシエチル−Ｎ−メチル、Ｎ−メチル−２−ヒドロ
キシエチルジアミンを得た。

この物質をジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）
３ｍｍｏｌｅを含む２０ｍ１のｃｕｚｃ＋ｚに溶かした
。１０°Ｃにまで冷却し、２．２ｍｏｌｅのメトキシ−
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィンをアル
ゴン下で加えた。１５分後に酢酸エチルを加え、有機相
を８０％飽和塩化ナトリウム【洗浄し、固体の硫酸ナト
リウム上で乾燥し、エバポレーションにより乾燥した。

トルエンと乾燥Ｃｌ３ＣＮとの共エバポレーションの後
、残渣を１０１ｎＩｌの乾燥（Ｊｌ、ＣＮに溶かした。

この溶液を１９本の乾燥したーｅａ　ｔｏｎバイヤルに
分注し、溶媒を減圧下で除いた。バイヤルはネジ付キャ
ップでしめて一２０°Ｃで保存した。

ＤＭＴ−ＰＣＬ−ホスホルアミダイトをオリゴヌクレオ
チドに常法によりカップリングした。次のオリゴヌクレ
オチドを合成した。

−Ｏ 上記構造において、“ＰＣＬ　は過ヨウ素酸開裂性の結
合を示す。

”　ＢＬＡ３ｃ”はヌクレオチド配列５’　−ＧＡＴＧ
ＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＴＴ−３’　を示し、１°Ｌ
ＬΔ２°ＴＴ’はヌクレオチド配列５　’　−ＴＴＧＡ
ＣＡＣＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＡＡＴ−３’　を示
す。完全に脱保護化した後、オリゴヌクレオチドをＰＡ
ＧＥによって精製し、生成物のバンドを切りとり、　Ｍ
Ｇ緩衝液にで溶出させ、　５ＥＰ−ＰＡＫカートリッジ
で、　５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、　ＤＮＡ
　　３：３３９−３４３（１９８４）の方法により脱塩
した。

分解は次のように行った：約０．６００の精製した物質
（６λｌＩ２０中）を、５０λ０．ＩＭ　Ｎａ■Ｏａで
処理し２０°Ｃにて１時間放置した。水（１λ”／ｍｌ
りに入った０、４ｔｅｌのグリセロール水溶液を加えた
。溶液ヲ合併し、　０．１Ｍ酸酸トリエチルアンモニウ
ム（ＴＥＡＡ）で平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ２５）に通し同じ緩衝液で溶出した。０
．５ｍｌのフラクションを集め、　５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ
によって溶媒を除去した。１５％ＰＡＧＥによる分析で
、出発物質は、予想していた大きさの２つのバンドに完
全に分解していた。

（以下余白） ■　過ヨウ素酸ナトリウム脱離 Ａ、　３２ｐでラベルされたプローブは、　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ八ｃｉｄｓ　へｅ５ｅｒｃｈ　　１６、（１９８８
）でＵｒｄｅａらより記載されたとおりに調製した。こ
のプローブの配列は。

ＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＡＣ
ＣＴＣＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴ”　Ｔノ２Ｐ（５゛→３゛
）であった。ここで１本は、特開昭６２−１８８９７０
号（前出）に述べられた修飾ヌクレオチドであり。

この修飾ヌクレオチドは１次の構造を有する：Ｎｉ＋□ ＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴ
ＧＧＡＧ八八ＡＧＴＧＧＴＧ　（５’→３゛）という配
列の合成オリゴへへレオチドが分析物として使われた。

マイクロタイター捕捉ウェル（Ｍｉｃｒ。

ｔｉｔｅｒ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｗｅｌｌ）は、２つの異
なるプローブを用いて下記の方法により調製した：　（
１）　”ＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧ　
（下記の表３でＸＴ１”ｌｃａと命名された）；および
（２）　’ＴＴ−Ｘ−ＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡ
ＡＧＡＡＧ（本は上述のアルカリアミンヌクレオチドを
示す）。

ここで、“°Ｘ°°は前の節に述べられたように、過ヨ
ウ素酸脱離可能な結合を示す。このマイクロタイター捕
捉ウェルは、２００μｆｆｉの２００　、ｌ／　ｇ　／
　ｍ１ポリフエニルアラニルリジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｃ、）の水溶液を各ウェルに加える
ことにより、イミュロン■ストリッフ゛から８周製した
。カバーされたストリップを室温に３０分から２時間保
持し、上述のように洗浄を行なった。上述の３Ｂオリゴ
ヌクレオチドの１０００．、。サンプルを含有する６０
μｌの１×ＰＢＳ　ヲ、　１０■のエチレングリコール
ビス（スクシイミジルースクシネート）　（Ｐｉｅｒｃ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｃ、）を含む１４０μ２の
ＤＭＦで処理した。この混合物をポルテックスで撹拌し
、室温にて暗所でインキュベートした。１５分後にこの
溶液を、あらかじめ３〇−の１ｘｐａｓで平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム（ＰＤ−Ｄ；Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）にかけた。カラムのボイドボリュームがＩＸＰ
ＢＳで最終容積が３５−となるまで希釈された。各ウェ
ルに、捕捉プローブ（ｃａｐｔｕｒｅｐｒｏｂｅ）溶液
５０μｌを添加した。プラスチックラップでカバーした
後、ウェルを室温で暗所にて３０分〜−晩中インキユベ
ートした。これらのウェルは。

ハイブリダイゼーション混合物でおおわれていなかった
。

１　ｆｍｏｌｅ　、　ｔｏｏ　ａｍｏｌｅｓおよび１０
ａｍｏｌｅｓの分析物断片を含有するストック液は、４
ＸＳＳＣを含むハイブリダイゼーション緩衝液で調製し
た。コントロール液は同様に調製されたが、これには分
析物は含有されない。４組のウェルを調製した。各ウェ
ルに４０μｌの選択溶液を加えた。この選択溶液には、
　　１　ｆｍｏｌｅ　、　１００　ａｎｎｏｉｅｓ、　
１０ａｍｏｌｅｓの分析物または分析物を含有しない液
が包含される。ハイブリダイゼーションは５５°Ｃの水
溶液中で１時間行なった。チューブは蓋をし、ウェルも
粘着性のＬｉｎｂｒｏ／Ｔｉ　ｔｅｒｔｅｋ膜でシール
した。３８０ｕ１の４×ＳＳＣで２度洗浄した後、　１
０ｆｍｏｌｅｓの３２Ｐ−標識されたプローブを含む４
　ｘＳＳＣ４０μｌを加えた。ウェルを３７°Ｃで１時
間インキュベートした後、再び３８０μｌの４ｘｓｓｃ
で２度洗浄した。

ｉｚｐの総カウントは、　ＬＫＢ　１２１４　Ｒａｃｋ
ｂｅｔａシンチレーションカウンターで測定した。その
結果を表３の「総カウント」の項に示した。

過ヨウ素酸脱離可能なポリヌクレオチドを含有する１組
のウェル、およびＸＴ１”ｌｃａ溶液を含む１組のウェ
ルに、１００μｌの４ＸＳＳＣに溶かした１００ｍＭＮ
ａ１Ｏ，液を加えた。ウェルを室温で１分間インキュベ
ートした。この過ヨウ素酸溶液を新しいウェルに移し、
カウントした。結果を表３の’１１００ｍＭＮａ１Ｏお
よびｒ４ＸｓｓｃＪの項に示す。

コントロールとして、　１００　ｕ　ｌの４ｘｓｓｃを
過ヨウ素酸開裂可能なポリヌクレオチドを含有する１組
のウェルに加えた。次に、ウェルを室温で１分間インキ
ュベートし、溶液を新たなウェルに移した。この移した
溶液をカウントし、その結果を表３のｒＸＴｌ”ｌｃａ
ウヱル」の項に示す。

表３ Ｂ、第２の実験は、以下のように変更を加え、前述と同
様の手法で行なった：（１）使用したプローブは、　　
”ＣＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣ（５°→３”
１本は前述と同意義を有する）という配列を有する″′
Ｐ−標識化１９量体であった；（２）分析物は、　ＧＧ
ＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧ
ＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ　：という配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドであった；（３）分析物の濃度は。

３つ測定するのではなく、１つであった。（４）：１２
ｐ標識化プローブは、　１０ｆｍｏｌでなく　、　１０
０　ｆｍｏｌであった。結果を表４に要約して示す。

（以下余白） 肌１μＬし 脱離 Ｓ／Ｎ比 ｍｏｌｅ 表４ 泄１μ（し ２．４０　　＋／−０，５５ 股塁 １２．６　＋／−４，５９ ■、ストランド（鎖）置換 アルカリホスファターゼプローブは、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　　１６．でＵｒｄｅａ
らにより記載された方法により調製した。このプローブ
は、＾＾ＧＴＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧ
ＡＣＣＴＣＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴ”Ｔ　（５’→３°）
という配列を含む。本は上記と同意義を有する。ＧＡＴ
ＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡ
ＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧ　（５’→３’）　　の配列を有
する合成オリゴヌクレオチドを分析物として用いた。第
２の合成オリゴヌクレオチドは。

ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧ＾＾ＡＧＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴ
ＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＧＡ
ＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡの配列を有し、特異的な脱離スト
ランド、つまり、上述のように標識を脱離させうる置換
ストランドとして使用した。　”ＴＡＴＣＣＣＴＡＴＡ
ＴＣＧＴＧＴＣＴＣＴＡ　Ｔ　ＡＴＡ　ＴＣＧ　ＴＴＴ
ＣＴＣＴＡＴＧ　Ａ　ＡＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡ
ＭＡＧＡＡＧの配列を有するオリゴヌクレオチド捕捉プ
ローブとして使用し、プレートを作成した。Ｍｉｃｒ。

１ｉｔｅ　Ｉウェル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を使用したこ
と以外は。

前節に述べられたようにウェルを調製し、そして。

最後のインキュベーション工程後、ウェルをｌ×ＰＢＳ
で洗浄し、Ｈ緩衝液でおおったのち、再び洗浄した。

３組の捕捉ウェルが調製され、各組は１分析物含有ウェ
ルおよびコントロールウェル（つます分析物を含まない
ウェル）を包含する。各ウェルにｌ　ｆｍｏｌの分析物
または分析物を含まない４０μｌの４ｘｓｓｃを加えた
。ハイブリダイゼーションを５５°Ｃにて１時間行った
。３８０μ２の４ＸＳＳＣで２度洗浄した後、　１００
　ｆｍｏｌｓのアルカリホスファターゼプローブを含有
する４０μｌの４ｘｓｓｃをウェルに加えた。ウェルを
３７°Ｃで１時間インキュベートした後、洗浄を行なっ
た。つまり、　（１）０．　Ｉ　Ｘ　ＳＳＣと０．１％
ＳＤＳとを含有緩衝液３８０ｕｌで２度洗浄を行ない、
　（２）４　Ｘ５ＳＣ３８０μｌで２度洗浄を行なった
。

アルカリホスファターゼ活性は、化学発光物質であるジ
オキセタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅ）　とのインキュベー
ションにより測定した。発光はマイクロタイターデイツ
シュ　リーディング　ルミノメータ−（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）を使用して記録した。

１組のウェルに、２０μｌの４ＸＳＳＣを加えて。

次に、３７°Ｃで１時間インキュベーションした。２０
μ！のジオキセタンを加え、また３７°Ｃで再び１時間
インキュベートした。アルカリホスファターゼ活性を測
定し、その結果を表５の「移動なし」の項に示す。

２０μｌの４ＸＳＳＣを第２の組のウェルに加え。

３７°Ｃにて１時間インキュベートした。個々の溶液を
Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｉ　ウェルに移し、２０ｕｆのジ
オキセタンを加えた。これらのウェルを再び３７°Ｃで
１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ活
性を上記のように測定し２その結果を表５　ｒＳＳＣ脱
離」の項に示す。

２０ａｌｔの４ＸＳＳＣを第３の組のウェル（３０ｐｍ
ｏｌｅｓの特異的な脱離オリゴヌクレオチドを含有する
）に加えた。ウェルを３７℃にて１時間インキュベート
した後、この溶液をＭｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｉ　ウェルに
移した。２０μ！ジオキセクンを加え、ウェルを３７°
Ｃにて１時間インキュベートした。アルカリホスファタ
ーゼ活性を上記のように測定し、その結果を表５の「オ
リゴ脱離」の項に示す。

表５ Ｂ、第■１ｆｆＡの実験を繰り返して行ない、その結果
を表６に示す。

表６ ０．８８ ０．４ ６．９ 上記結果より１本法は、簡単、迅速、そして正確に種々
の試料から特異的なポリヌクレオチド配列を検出する手
段を提供することが明らかである。

この方法は異なった型の標識（それは、免疫分析に使用
されてきた検出可能な信号を包含する）を与えることに
おいて、高い感度と広い柔軟性を与える。従って５本法
は、免疫分析のための従来の装置に容易に適用し得る。

これらの装置は、放射能活性１分光光度計における吸光
度、蛍光光度計あるいはシンチレーションカウンターに
おける光放射を検出することが可能である。本性は、ど
のようなりＮＡ配列にも適用が可能であり、そして。

比較的短いプローブを使用して偽陽性を減らし。

好ましくないヘテロ二本鎖化を最少にするために用いら
れ得る。測定のために支持体から標識を開裂させること
により、バックグラウンド値を大幅に減らし得る。なぜ
なら、読みとりが支持体から離れて行なわれるためであ
る。さらに、ポリヌクレオチド鎖から標識を開裂させる
必要性に基づいてバックグラウンドの問題をさらに注目
する必要がある。本性は、従って、病気を診断すること
。

ハイブリッドＤＮＡ操作をモニターすること、遺伝的特
徴を決定することなどのために正確で経済的なりＮＡ配
列を決定することを提供する。

上記に記載された発明は、その理解を明確にするために
、いくぶん詳細に記載されている。しかし、添付の特許
請求の範囲内でその改変や修飾がなされ得ることは明ら
かである。

（以下余白） （発明の要約） 核酸分析の新規方法が提供される。この方法において１
分析物における目的とする配列と実質的に相同性を有す
るオリゴヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを用
い、あらかじめ決められた程度の厳密な条件下でハイブ
リダイゼーションを行うかまたは行わずに、支持体から
標識を脱離させる。特に１種々の手法が、支持体に標識
を結合し、そして、−本領または二本鎖の開裂により。

支持体から標識を脱離させるために用いられる。

その標識の脱離は、試料中の特定のオリゴヌクレオチド
配列の存在の指標として検出される。この方法は病気の
診断、遺伝的モニター、そして核酸混合物の分析に有用
である。

４、　°′　　の　　　なｉ′■ 第１図は、固体支持体に対する標識の特異的結合および
非特異的結合の相違を示す。第２図Ａから第２図りまで
は１本発明の好適な方法を模式的に示す説明図であり２
選択的に切断可能な部位が支持体と標識の間に１分析と
プローブとの複合体を介して導入されることを示す。

第３図は２本発明の別の方法を模式的に示す説明図であ
り、特異的に結合した標識が、鎖置換技術によって、脱
離することを示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオリゴ
   ヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、 該核酸試料を、ハイブリダイゼーション条件下でポリヌ
   クレオチド試薬と混合する工程であって、該試料または
   該試薬の成分のうちの一方が支持体に結合し、該分析物
   と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーション
   によって、選択可能な切断部位で該支持体に結合してい
   る標識を与える工程； 該支持体を、該支持体に結合している標識から、該選択
   可能な切断部位以外により実質的に遊離させる工程； 該切断部位で切断する工程；および 該支持体から遊離した標識を検出する工程、を包含する
   方法、 ２、核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオリゴ
   ヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、 該核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で第１のポリ
   ヌクレオチド捕護プローブおよび第２のポリヌクレオチ
   ド標識プローブと混合する工程であって、該第１および
   第２のプローブが、該分析物中に存在する配列と相補的
   なオリゴヌクレオチド配列を有し、該ハイブリダイゼー
   ション条件下で第１および第２の二本鎖を形成し、そし
   て該捕護プローブが固体支持体に結合している工程；選
   択されたポリヌクレオチド鎖の置換を導入し、該捕護プ
   ローブと、第１の二本鎖よりも安定な二本鎖を形成し、
   それにより該支持体を、該支持体に結合している標識か
   ら実質体に遊離させる工程；および 該支持体から遊離した標識を検出する工程、を包含する
   方法。