JPH023698A - ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗ヒトリンホトキシンモノクローナル抗体、
該抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系、該抗体を用い
る吸着法による高純度ヒトリンホトキシンの精製方法、
並びに該抗体を少なくとも一種類使用する免疫学的測定
方法及び免疫学的測定試薬に関する。

〔従来の技術〕

従来、成る抗原に対して特異性を有する抗体の取得は、
抗原で免疫した動物から血液を採取し、抗血清を分離す
ることで達成されてきた。しかし、この抗血清中には、
抗原特異性を異にする他の抗体群が混在しており、目的
とする特異抗体のみを分離することは非常に困難である
。また、精製分離した特異抗体も異なる抗原決定基と反
応するものであり、抗原との親和性も一様ではない。

１９７５年にケーラーとミルシュタインにより、マウス
の骨髄腫細胞と抗原感作マウスの肺臓細胞との融合で、
抗原特異的な抗体を産生ずる雑種細胞（ハイブリドーマ
）を得る方法が報告（ネイチャ、２５６巻、４９５〜４
９７真、１９７５年）されて以来、多数の抗原に特異性
を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
が報告されている。このようなハイブリドーマ細胞は、
予め決めた特異性のある抗体を分泌するという特質を有
し、また、クローン化しそして安定な培養条件下で培養
することができるので、成る抗原決定基に対してのみ特
異性を有する抗体を無限に産生し続けることが可能とな
る。

ハイブリドーマを得る一般的な方法としては、哺乳動物
（例えばマウス、ラットなど）に、モノクローナル抗体
を作製しようとする抗原を含有する試料をくり返し投与
し、その動物の血清中に目的とする抗体の存在が確認さ
れた後、動物から肺臓を摘出して細胞懸濁液とする。こ
れらの細胞と骨髄腫細胞とを融合促進剤（例えばポリエ
チレングリコール）の存在下で接触させることによって
融合させる。こう得られた融合細胞から、慎重なスクリ
ーニングを繰返すことで、目的とする特異性を有する抗
体を分泌する細胞を分離することができる。

リンホトキシン（以下、ＬＴと略称することがある）は
リンパ球及びリンパ球系株化細胞から抗原刺激またはマ
イトジェン刺激によって産生されるリンホカインの１種
であり、種々の癌細胞に対して障害性を有することから
抗腫瘍剤（ＧｒａｎｇｅｒＧ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、１４ｔ
ｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　
ｏｆＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａ
ｎ、Ｊｕｎｅ　２３−２８＋１９８５年、八ｂｓｔｒａ
ｃｔｓ　　ｐ１５；Ｅ、Ｗ、Ｂ、Ｊｅｆｆｅｓ、　　　
ＩＩＩｅｔ　　ａｌＨＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　６１４１　（１９８７））として、ウィルスに
対して障害性を有することから抗ウィルス剤（Ｇ、Ｉｌ
、Ｗ。

Ｗｏｎｇ＆Ｄ、Ｖ、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｎａｔｕｒｅ　３
２３８１９　（１９８６））として、更にマクロファー
ジ活性化剤（特願昭６２１９９１４４号明細書）として
医薬への応用が期待されている。また、Ｂリンパ球の増
殖作用（Ｊ、に、Ｋｅｈｒｌｅｔ　ａｌ；５ｃｉｅｎｃ
ｅ、２３８１１４４（１９８７））　、リポプロティン
リパーゼ活性の抑制（Ｐａｔｔｏｎ、Ｊ、Ｓ、、ｅｔ　
ａｌＨＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、；　８３８３１
３　（１９８６））等の生理作用も報告されており、Ｌ
Ｔの生体内での正確で迅速な測定方法及び測定試薬の開
発が望まれている。

ＬＴは遺伝子組換え技術による生産が可能になり、リン
パ球産生の天然型ＬＴと同様のＬＴ活性が確認されてい
るＣＰ、Ｗ、Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌＨＮａｔｕｒｅ　３
１２７２１　（１９８４）；特開昭６２−１５１１８２
号公報〕。

ＬＴは、その活性部位が分子内のカルボキシ末端側（少
なくともＣ末端より１０残基以内）にあることが知られ
ており（Ｙ　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　　ｅｔ　ａｌ；Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１００７２７　（１９８６）　）　
、ＬＴ活性を有する種々のアミノ末端欠除体及び変異体
が報告されている〔特開昭６２−１８１２９８号、特開
昭６２７２５８３２４号、特開昭６３−５０９９号、特
開昭６３−８３９８号、特開昭６３−８３９９号各公記
載。従って、ＬＴを生産する場合の工程管理においても
、種々のＬＴ変異体を測定することができ、しかも正確
で迅速な測定方法及び測定試薬の開発が望まれている。

ＬＴの精製方法に関しては、動物細胞培養法等により得
られる天然型ＬＴについて、特開昭５８１６６８７号、
特開昭５９−８４８２７号及び特開昭６１１８６３２４
号各公報に記載記載る。その他、特開昭６１５６１９７
号、特開昭６３−３７９６号、特開昭６３−１７８９８
号各公報１特願昭６３−３５０００号明細書、グレイ等
の報告（ネイチャー　３１２巻、７２１頁、１９８４年
）及びブリングマン等の報告（ハイブリドーマ、６巻、
５号、４８９頁、１９８７年）等に精製方法が開示され
ている。

前記の従来法のうち、抗体を用いた免疫アフィニティー
クロマトグラフイーを利用した精製方法は、特開昭６１
−５６１９７号公報、グレイ等の報告及びブリングマン
等の報告に記載の方法であり、いずれも同一発明者らに
よるもので、由来が同一の抗体を用いたものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

ＬＴは極めて微量で強い生理活性を示し、また多様な生
理作用を示すことから、その分離精製及び定量分析の手
段として、ＬＴ分子内の認識領域が同定された特異抗体
の取得が望まれていた。しかし、ＬＴはその分子構造が
動物種間において相同性が高く　〔チャンーベンリー等
、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　ｌｍ５
ｕｎｏ１．）１３８巻、１２号４４９６−４５０１頁、
１９８７年〕、抗原性が低い。特に、ＬＴ活性の発現に
不可欠であるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の相同性
は極めて高く、カルボキシ末端側に認識領域を持つ抗体
の取得は、精製度の低い抗原を用いた場合や、通常の免
疫方法を用いた場合には困難であった。

ＬＴに対するモノクローナル抗体に関しては、特開昭６
１−５６１９７号公報及びブリングマン等の報告（Ｔ、
Ｓ、Ｂｒｉｎｇｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　　ハイプリドー
マ（ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ）　６巻、５号、４８９−５
０７頁、１９８７年〕に記載がある。しかし、特開昭６
１−５６１９７号公報では、得られる抗体のキャラクタ
リゼーションが不十分であり、ＬＴ分子内の抗体認識部
位に関する情報は記載されていない。ブリングマン等の
報告によると、得られたハイブリドーマ１３クローンの
うち７クローンは第２図に示すＬＴ分子のアミノ末端側
のアミノ酸配列７番目（ＴＨＲ）から１９番目（ＬＹＳ
）を認識する抗体を分泌することが確認されている。ま
た、これらのハイブリドーマクローンの分泌する抗体は
、第２図に示すＬＴのアミノ末端側のアミノ酸２３残基
（１番目のＬＥＵから２３番目のＡＬＡ）が欠除したポ
リペプチド分子とは反応しないことも記載されている。

ＬＴは、その活性部位が分子内のカルボキシル末端側に
あることが知られており、ＬＴ活性を有する様々なアミ
ノ末端欠除体及び変異体が報告されている（特開昭６２
−１８１２９８号、特開昭６２−２５８３２４号、特開
昭６３−５０９９号、特開昭６３−８３９８号、特開昭
６３−８３９９号各公記載。ＬＴ活性を有すると報告さ
れている最も短かい配列は、第２図に示すＬＴのアミノ
末端側のアミノ６１１番目（ＬＥＵ）から８９番目（Ｌ
ＹＳ）まで、または１番目（ＬＥＵ）から９１番目（Ｔ
ＨＲ）までが欠除したものである（特開昭６２−２５８
３２４号公報）。これらのアミノ末端欠除体及び変異体
が前記のブリングマン等の報告に記載されているモノク
ローナル抗体と反応しないことは明白である。

また、ブリングマン等の報告した１３クローンのうち前
記７クローン以外の６クローンについては、第２図に示
すＬＴの７ミノ末端側のアミノ酸２３残基欠除体との反
応性はｉｉｉ認されているものの、それよりも多くのア
ミノ酸残基が欠除したものとの反応性については不明で
ある。

以上述べたとおり、ＬＴ分子内の認識領域が限定されて
おり、かつ本質的にＬＴ活性を有する様々な変異体とも
反応性を持つモノクローナル抗体を分泌するバイプリド
ーマは、これまで取得されていなかった。

一方、動物細胞培養法等により得られる天然型Ｌ−Ｔを
精製する方法は、主にＬＴ分子に付加されている糖鎖の
性質を利用したものである。大腸菌で発現させて得られ
る遺伝子組換え型ＬＴには糖鎖が付加されていないので
、天然型ＬＴの精製方法を利用することは適当でない。

また、特開昭６３−３７９６号及び特開昭６３−１７８
９８号公報に記載の方法では、天然型及び遺伝子組換え
型の両ＬＴの精製が可能ではあるが、高純度、さらには
純粋なＬＴを得ることは不可能である。

特願昭６３−３５０００号明細書に記載の方法によれば
純粋なＬＴを得ることが可能ではあるが、精製工程数が
多く、操作が繁雑であるので、高回収率でＬＴを得るこ
とは困難である。また、大量生産を行うためには、各装
置及び器具等が非常に大きなものとなり広大な精製施設
が必要となる。

以上のような精製分離に関する問題点は、ＬＴに対して
特異性を有する抗体を用いた免疫アフィニティークロマ
トグラフィーを利用することで大部分が解決される。特
開昭６１−５６１９７号公報をはじめとする免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーに用いる抗体は、ヒトＬＴ
に対する特異性は認められているが、ＬＴ分子内の認識
領域は同定されていない。すなわち、これらの抗体を用
いた免疫アフィニティークロマトグラフィーでは、ＬＴ
活性を保持するＬＴのアミノ末端欠除体及び変異体を確
実に吸着させるものではない。

更に、ＬＴの測定方法としては、マウスＬ細胞に対する
細胞障害活性を測定する方法が一般的である（Ｙ、Ｋｏ
ｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｔ；Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
１２２７９１（１９７９）　）。具体的には、最初にマ
ウス上９２９細胞またはその亜株を９６穴マイクロプレ
ート中に単層でコートしく通常１５〜２０時間）、続い
て２倍系列希釈した被検試料と、終濃度１　ｔａｒ　／
　ｒａｔとなるように調製したアクチノマイシンＤとを
加えて２０〜２４時間３７℃で保温する。次いで、培地
を捨て、洗った後、０．５％クリスタルバイオレット（
メタノール：水＝１：４）で染色する。よく洗った後、
エタノールで細胞から色素を抽出し、これをマイクロプ
レートリーダーなどで、５５０ｎｍの吸光度を測定する
。ＬＴ活性は、全Ｌ９２９細胞又はその亜株の５０％を
死に到らせる量を１単位と定義し、試料の希釈倍数より
活性を算出する。

従来のＬＴ測定法では、測定に必要とする時間が２０時
間以上と長いこと、細胞（Ｌ　９２９細胞）の生育状態
により測定値が変動するので再現性のあるデーターが得
られないこと、及び同様の生理作用を有する腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ又はＴＮＦα）の区別ができないのでＬＴと
ＴＮＦとが混在する試料例えば生体試料（血液、尿等）
内のＬＴを定量する場合には不都合である等の問題点を
有していた。

このような問題点を解決する方法として、ＬＴに対する
モノクローナル抗体を用いる免疫学的方法によるＬＴ定
量が報告されている（７．５．［ｌｒｉｎｇｍａｎ＆Ｂ
、Ｂ、Ａｇｇａｒｗａｌ；Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６４８
９　（１９８７）；Ａ、Ｍｅａｇｅｒｅｔ　ａｌＨＪ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、ＭｅＬｈ、、１０４３１　（１９８７
）　）　、これらの方法により測定時間は短縮され、ま
たＴＮＦα混在下でのＬＴ測測定可能になったと考えら
れる。しかし、前述したように、ＬＴのアミノ末端欠除
体及び変異体であってＬＴ活性を有するポリペプチドに
特異性を示すモノクローナル抗体が得られていなかった
ので、前記の方法でさえ、ＬＴのアミノ末端欠除体及び
変異体を確実に検出するものではなかった。

以上のように、ＬＴ分子内の認識部位が同定されており
、しかも本質的にＬＴ活性を有する様々な変異体とも反
応性を有するモノクローナル抗体を用いるＬＴの免疫学
的測定方法及び測定試薬は知られていない。

〔課題を解決するための手段〕

前記の課題は、本発明により、第１図のアミノ酸配列の
７１番目から１５２番目のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを特異的に認識するモノクローナル抗体又はそのフ
ラグメントによって解決することができる。

また、本発明は、第１図のアミノ酸配列を有する遺伝子
組換え型ヒトリンホトキシンで免疫されたマウスから由
来する抗体産生細胞と骨髄腫由来の細胞とを融合して形
成されたハイブリドーマ細胞系であって、前記のモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系にも関す
る。

更に、本発明は前記のモノクローナル抗体又はそのフラ
グメントを結合してなる吸着剤とリンホトキシン含有物
とを接触させてリンホトキシンを吸着剤に吸着させ、次
いで、吸着剤に吸着したリンホトキシンを溶出すること
からなる、高純度リンホトキシンの精製方法にも関する
。

更に、本発明は、モノクローナル抗体又はそのフラグメ
ント少なくとも１種を使用するリンホトキシンの免疫学
的測定方法にも関する。

更にまた、本発明はモノクローナル抗体又はそのフラグ
メント少なくとも１種を含有するリンホトキシンの免疫
学的測定用試薬に関する。

なお、本明細書及び添付図面において、アミノ酸に関す
る符号は以下の意味をもつ。

ＡＬＡ　：アラニン、ＡＲＧ：アルギニン、ＡＳＮ　：
アスパラギン、　ＡＳＰ　：アスパラギン酸、ＣＹＳニ
ジスティン、　　ＧＬＮ：グルタミン、ＧＬＵ：グルタ
ミン酸、　Ｇ！、Ｙニゲリシン、旧Ｓ：ヒスチジン、Ｉ
ＬＥ：イソロイシン、ＬＥＵ：ｏイシン、　　　　ＬＹ
Ｓ：リジ７゜ＭＥＴ　：メチオニン、　　ＰＨＥ　：フ
ェニルアラニン、ＰＲＯニブロリン、　　　　ＳＥＲ：
セリン、ＴＩＩＲ：スレオニン、　　ＴＲＰ：　）リプ
トファン、ＴＹＲ：チロシン、　　　ｖＡＬ：ハリン。

本発明者らは、ＬＴに対して特異性を有する抗体を分泌
するハイブリドーマを取得するため、種々検討し、研究
した結果、高度に精製した遺伝子組換え型ＬＴ（第１図
に示すアミノ酸配列からなる）に亜鉛を配位させたＬＴ
−亜鉛結合体を抗原としてマウスを免疫すると、その血
清中にＬＴ活性を中和する抗体が出現することを認めた
。また、最終免疫として肺臓内抗原直接投与〔ザ・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ。

Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ）　７０巻、３９−
４３頁（１９８４年）〕を用いて免疫応答性を高め、こ
の肺臓細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを得た。こ
のハイブリドーマの培養上清中の抗体価を測定すること
でスクリーニングをくり返し、クローニングによりＬＴ
に対し特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマを樹立することに成功した。得られたモノ
クローナル抗体のＬＴ分子内の認識部位は、ＬＴを酵素
的に限定分解し、各フラグメントに対する抗体の反応性
を測定することで決定された。

本発明により得られたハイブリドーマの分泌するモノク
ローナル抗体は、ＬＴ分子内の限定された領域とのみ反
応する抗体であり、ＬＴの分離精製及び定量分析に使用
可能である。

以下、細胞融合における作業工程を具体的に説明する。

（ａ）　　抗原の調製 本発明者らは、すでにＬＴ遺伝子を導入した形質転換大
腸菌の破砕物からＬＴを高純度で精製することに成功し
ている（特願昭６３−３５０００号明細書）。

こうして得られた高純度ＬＴ標品に亜鉛を配位させて生
じる沈澱を抗原とし、フロイント完全または不完全アジ
ュバントと混合して免疫原とした。

特開昭６１−５６１９７号公報には、ＬＴの免疫方法と
して水酸化アルミニウムゲルにＬＴを吸着させて投与す
ることで中和抗体を得ることが記載されている。しかし
ながら、本発明者が前記特開昭６１−５６１９７号公報
記載の方法を本発明の対照群として実施したところ、中
和抗体は得られなかった。

（ｂ）　　抗体産生細胞の調製 免疫する動物は、哺乳動物であれば何でもよいが、抗原
量、取扱い易さ等を考えるとマウス又はラットが望まし
い。さらに、融合パートナ−細胞としてマウス骨髄腫由
来の細胞が多く樹立されており、その性質も比較的詳し
く研究されているので、マウスを用いるのが最も望まし
い。

免疫原の投与方法は、皮下、腹腔内、静脈、皮肉、筋肉
内又は肺臓内などいずれでもよいが、腹腔内又は肺臓内
投与が最も有効であった。

免疫は、１回または適当な間隔（好ましくは１週間〜５
週間の間隔）で複数回くり返し行なってもよい。免疫し
た動物の血清中の該抗原に対する抗体価を測定し、抗体
価が十分に高くなった段階でその動物を抗体産生細胞の
ソースとして用いれば、目的とする抗体を分泌するハイ
ブリドーマを取得する可能性が高くなる。

融合には、最終免疫から、３〜５日後の動物由来の抗体
産生細胞、例えば肺臓細胞、リンパ節細胞又は末梢血細
胞などが使用される。

（Ｃ）　　骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、一般的にはマウスから得られた株
化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞
株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−１３１（Ｐ３−０１）　、　
Ｐ３−ＮＳ１１−Ａｇ４．１（ＭＳ−１）、　ＳＰ２１
０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３（６５３）又はＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）
等を用いることができる。これらの細胞株は、適当な培
地、例えば８−アザグアニンを添加したＲＰＭ１１６４
０培地、又はＤ　’　ＭＥＭ培地で継代培養するが、細
胞融合の３〜４日前から８−アザグアニンを除去した培
地にて培養する。

（ｄ）　　細胞融合 抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを、培地またはリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）中で十分に洗浄し、抗体産生細胞
と骨髄腫細胞との比が４〜１０：１種度となるように混
合し、遠心分離する。上清を除去した後、沈殿した細胞
をよくほぐし、３７℃に加温しつつ融合促進剤として３
０〜５０％のポリエチレングリコールを撹拌しながら滴
下する。ポリエチレングリコールは平均分子量が１００
０〜６０００程度のものが好ましい。数分後に、培地を
静かに加え、細胞をよくほぐした後に遠心分離して上清
を捨て、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン１０−６〜１０−
’Ｍ。

アミノプテリン１０−８〜１０−　’　Ｍおよびチミジ
ンｌＯ４〜１０−’Ｍを加えたＲＰＭＩ１６４０培地な
ど）を加えて再び細胞をほぐして懸濁する。

（ｅ）　　ハイブリドーマの選択的増殖この細胞懸濁液
を、マイクロタイタープレートに１０’−１ｏ’個／ウ
ェル程度に植えつけ、ＣＯｚインキュベーター（５％Ｃ
Ｏ２程度）にて、３５〜４０℃で培養を開始する。

骨髄腫細胞として８−アザグアニン耐性株を用いれば、
未融合の骨髄腫細胞はＨＡＴ培地中ではｌＯ日１ぐらい
までに全部死滅する。また、抗体産生細胞は正常細胞な
ので培養系においては長時間生育できない。従って、１
０−１４日後ぐらいから生育してくる細胞群は、すべて
ハイブリドーマである。

ハイブリドーマの生育してきたウェルから上滑半容量を
捨て、順次ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを
除いた培地）に変換し、数日培養してから培養上清を一
部採取して、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により
、抗ＬＴ抗体価を測定する。

（ｆ）　　クローニング ハイブリドーマの増殖が、各ウェルに２種以上認められ
る可能性があるため、クローニングを実施する。クロー
ニングの方法としては、限界希釈法による確率的方法、
軟寒天法によるマニュプレート法、セルソーターによる
ソーティング法等があるが、いずれの方法を使用しても
よい。

抗ＬＴ抗体価の認められたウェルにつき、例えば限界希
釈法によりクローニングを２〜４回くり返すことにより
、各ウェルで増殖するハイブリドーマを単一細胞由来と
することができる。

抗体価が安定して検出されるウェルに増殖するハイブリ
ドーマを、抗ＬＴモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ株として選択する。

（ｇ）　　抗体取得 抗ＬＴモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選
択した株を大量に培養することで、その培養上清中に抗
体を取得することができる。これら培養上清を、硫安分
画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ヒドロ
キシアパタイト、プロティンＡアフィニティークロマト
グラフィー等の手段により精製することも可能である。

さらに大量の抗体を取得するためには、骨髄腫細胞の由
来動物と同系の動物に、ブリスタン（２゜６．１０．１
４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内
に投与し、その後ハイブリドーマを投与することで１０
〜２０日後にハイブリドーマは腹水癌化する。血清およ
び腹水中には高濃度の抗体が含有され、これを採取し遠
心分離して固形分を除去後、必要であれば精製を実施す
ることができる。

（ｈ）　　抗体の分類 得られたモノクローナル抗体のタラシフィケーション、
即ちイソタイプ及びサブクラスの決定は、以下のように
行う。

同定法としては、オフタロニー法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏ
ｎｙ法）、ＥＩＡ法またはＥＩＡ法等がある。ＥＩＡ法
またはＥＩＡ法を用いれば培養上清をそのまま抗原吸着
固相と反応させて、さらに第２次抗体として各種１ｇＧ
サブクラスに対する抗体を用いることが可能である。モ
ノクローナル抗体の濃度が比較的高い場合には、オフタ
ロニー法が簡便である。

（ｉ）　　抗体の抗原認識領域の同定 得られたモノクローナル抗体のＬＴ分子内での認識領域
の同定のために、純化したＬＴを酵素的に限定分解し、
各フラグメントとモノクローナル抗体との反応性を調べ
ることで、順次抗体の認識領域を限定することができる
。各フラグメントとモノクローナル抗体との反応性は、
ＥＩＡ法、ＥＩＡ法等によって測定することが可能であ
る。

以上のような工程により、抗原認識領域の同定された抗
ＬＴモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマが樹
立された。

これらのハイプリドーマから分泌される抗ＬＴモノクロ
ーナル抗体を適当な酵素例えばパパイン又はペプシン等
で分解してＦａｂフラグメント又はＦ（ａｂ’）ｔフラ
グメント等にすることができる。

以下、本発明をモノクローナル抗体に関して説明するが
、それらはフラグメントについても当てはまるものと理
解されたい。

前記のハイプリドーマから分泌された抗ＬＴモノクロー
ナル抗体を精製した後、不溶性高分子からなる支持体に
前記抗体を固定化して親和性吸着体すなわち抗体結合吸
着剤を作成し、これをクロマト管につめてアフィニイテ
イークロマトグラフを作成することができる。支持体と
しては、例えばシアノゲンブロマイド活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社製）、アフィゲルＩＯ、アフィ
プレソプ１０　（バイオ・ランド社製）、又はホルミル
セルロファイン（生化学工業社製）等にを使用すること
ができる。前記の抗体結合吸着剤と、ＬＴ含有物例えば
ＬＴ産生動物細胞株、ＬＴ産生ハイブリドーマ等の培養
上清、ＬＴ遺伝子導入大腸薗の破砕液又はその硫安分画
液等とを接触させてＬＴを抗体に吸着させ、次いでｐｌ
＋変化、極性変化、タンパク質変性剤、カオトロピック
イオン等の溶出手段によりＬＴを溶出する。溶出液によ
りＬＴが失活する可能性がある場合には、すみやかに中
和、透析等の手段をとることが必要である。

このようにして得られるＬＴは、純度８０〜９０％以上
が期待でき、−工程で精製度が飛躍的に向上する。さら
に純粋なＬＴを得るために、上記高純度ＬＴ中にｉｔ混
入する雑タンパク質及び抗体結合吸着剤より漏出する抗
体等を除去する手段を組み合わせることができる。この
ような手段としては、例えばイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィ、金属キレートアフィニイティークロマトグラフィ
ー等が考えられるが、１つ又はそれ以上の方法を組み合
わせることで目的を達成することができる。このような
精製方法により工程が簡略化され、精製施設の縮小も可
能であり、ＬＴの回収率も向上させることができる。

なお、本発明による抗ＬＴモノクローナル抗体は、第１
図に示すＬＴのアミノ酸配列において７１番目（Ａ　Ｌ
　Ａ＞から１５２５２番目ＥＵ）のアミノ酸配列内に抗
原認識領域を有することから、ＬＴ活性を保持するアー
ミノ末端欠除体として現在まで報告されているものの中
で最も短かい配列（第２図に示すＬＴの１番目（ＬＥＵ
）から８９番目（ＬＹＳ）までの欠除体及び１番目（Ｌ
ＥＵ）から９１番目（ＴＨＲ）までの欠除体：特開昭６
２−２５８３２４号公報）とも充分に反応することがで
き、これらの精製にも利用することができる。

さらに、本発明によるモノクローナル抗体少くとも１種
を使用することにより、ＬＴ活性を有する全てのポリペ
プチドの測定を可能とする免疫学的測定方法及び免疫学
的測定用試薬を提供することができる。

本発明の免疫学的測定方法としては、原則として全ての
慣用のイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ　
（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）及び
螢光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等が含まれる。

反応の形式としては競合法及び非競合法をいずれも使用
することができる。

標識付けのためにはそれぞれの測定法に慣用の手段を用
いる。すなわち、ＥＩＡ法の場合にはラジオアイソトー
プ例えば１２５Ｉを標識付けのために使用する。ＥＩＡ
法のためには、このために通例使用される全ての酵素例
えばバーオキンダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼが好適
である。ＦＩＡ法のためには、慣用の発光団をマーカー
として使用することができる。これらの種々の試験法及
び変法の詳細は当業者にとって公知である。

本発明のＬＴ測定方法としては、適当な不溶性担体に結
合した抗原特異性モノクローナル抗体又はポリクローナ
ル抗体を用意し、これにＬＴ抗原を結合させ、続いて、
標識付けされた抗体と接触させるサンドインチ法が特に
好適である。

このサンドイツチ法の好ましい態様においては、第１抗
体として本発明による前記のモノクローナル抗体を使用
して、これを固定相に結合させることができる（第１抗
体の固定相への結合）。第２工程で、測定目的のＬＴ含
有被検試料と共に、インキュベートする。この際、本発
明のＬＴ特異的モノクローナル抗体により選択的にＬＴ
が結合される。慣用の洗浄工程の後に標識された抗ＬＴ
抗体く第２抗体）と共にインキュベートする。（第・２
抗体としての抗ＬＴ抗体は必ずしも本発明によるＬＴ特
異的モノクローナル抗体に限られることなく、例えばポ
リクローナル抗体を使用することもできる。反応液（第
２抗体含有液）を除いて洗浄した後、固相に結合した標
識物質を測定することによって試料中のＬＴを測定する
ことができる。

また、標識付の第２抗体として本発明によるＬＴ特異的
モノクローナル抗体を使用し、第１抗体として別の抗Ｌ
Ｔ抗体を用いることもできる。本発明の測定法の態様と
してサンドインチ法の変法も含まれる。例えば、ビオチ
ニル化第２抗体、次いで標識されたアビジンを加えて、
最後に標識物質を測定する方法を使用することができる
。前記のサンドインチ法において、第１抗体又は第２抗
体として用いられるポリクローナル抗体は、マウス、モ
ルモット、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ又はウマ等の
動物を常法により純度９５％以上に精製したＬＴで免疫
して得た抗血清を、好ましくは免疫グロブリン分画とし
て濃縮、精製して用いる。

本発明による測定法においてはモノクローナル抗体及び
ポリクローナル抗体それ自体、あるいはそれらの相当す
る免疫学的特性を有するフラグメント例えばＦａｂフラ
グメントを使用することもできる。

本発明は、前記のモノクローナル抗体少なくとも１種を
含有する免疫学的測定用試薬にも関する。

ＬＴの免疫学的測定に必要な試薬のうち、特異性、検出
感度等に最も影響を及ぼすのが特異抗体であり、本発明
により得られたＬＴ特異的モノクローナル抗体を用いる
ことにより、様々な誘導体、変異体を含めたＬＴを確実
に検出することが可能である。このＬＴ特異的モノクロ
ーナル抗体は、第１抗体として不溶性担体、例えば９６
六マイクロプレート、ポリスチレンビーズ等に固定して
も、また第２抗体として、例えばラジオアイソトープ、
酵素等により標識して使用してもよい。また、ポリクロ
ーナル抗体との併用についても、測定法の態様に応じ固
相もしくは、各種標識を実施して使用できる。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものでないことは当然
である。

実」１舛−」＝（抗原タンパク質の調製）特願昭６３−
３５０００号明細書の実施例１〜実施例２に記載の方法
によって遺伝子組換え型ＬＴを得た。

すなわちＬＴ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＫ１２に
よって形質転換したエシェリヒア・コリ（Ｈｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｗ３１１０株を培養し、集菌し
、菌体を破砕した後に、核酸除去処理を行ない、硫安分
画を実施してから熱処理して得た試料を、陰イオン交換
クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー
及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し、純度
９５％以上の遺伝、手紐換えＬＴを得た。こうして得ら
れたＬＴｌｍｇを含有するＰＢＳ溶液に、１０ｍＭ酢酸
亜鉛５−を添加し、４℃で一晩放置した。形成された沈
殿をＰＢＳで３回洗浄してＬＴ−亜鉛結合体を得た。

実１１殊−」−（免疫マウス牌細胞の調製）ＢｉＦ令の
ＢＡＬＢ／　Ｃ雌マウスに、抗原として実施例１で得た
ＬＴ−亜鉛結合体６ｎをフロイント完全アジュバント（
ＦＣＡ）とともに腹腔内投与して免疫した。４週間後、
前記の抗原７ｎをフロイント不完全アジュバント（ＦＩ
Ａ）とともに腹腔内に追加免疫した。さらに３週間後、
抗原をアジュバントなしで追加免疫した。さらに１週間
後、抗原をアジュバントなしで肺臓内に直接投与するこ
とにより最終ブースターを行なった。３日後に、このマ
ウスから無菌的に肺臓を摘出し、肺臓細胞を調製し細胞
融合に用いた。

免疫マウスの血清中抗体価は、３回免疫後に酵素免疫測
定法（Ｅ　Ｉ　Ａ法）により測定した。

旦土人法 ９６大のＥＩＡ用プレート（＃３９１５　（ファルコン
社製）〕に、５５０ｍＭ炭酸バフファーｐＨ９，５）で
希釈した特異的抗原（ＬＴ：３Ｊｔｇ／ｄ）を１０ＯＩ
づつ分注し、室温で２時間又は４℃で一晩放置すること
により、抗原をプレートにコートする。

プレート底面上の蛋白質結合性残基は、ＰＢＳに溶解し
た１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、室温で
３０分間放置することによって飽和させ、これによって
非特異的なタンパク質吸着を防ぐことができる。

このようにして準備した抗原コートプレートに、第１抗
体として段階希釈した試料（マウス血清、ハイブリドー
マ培養上清等’）　１００　ｔｄ／ウェルを分注し、室
温で１時間放置する。０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０（
トウイーン２０：バイオランド社製）を含有するＰ　Ｂ
　Ｓ　（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　）にて３回洗浄後、第２
抗体としてパーオキシターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロ
ブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）の１０００倍希釈液を、１
００ｍ／ウェルで分注し、室温で１時間放置する。

ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎにて３回洗浄後、パーオキシター
ゼ基質液（３０＋＋＋Ｍオルト、フェニレンジアミン及
び０．０２％過酸化水素含有０．１　Ｍクエン酸バッフ
ァー（ｐＨ５，０））を１００ｕｌ／ウエルで分注し、
室温で３０分間放置する。１．５Ｎ硫酸を１００ＩＪ１
／ウエルで添加して酵素反応を停止させ、発色量をマイ
クプレートリーダー（バイオランド社製）により吸光度
測定する（４９２ｎｍ　、　６３０ｎｍでの三波長測定
）。

１見炎−主（細胞融合） 実施例２により得られた肺臓細胞を、ＲＰＭ１１６４０
（日永製薬社製）でよく洗浄した。８−アザグアニン耐
性マウス骨髄腫細胞Ｐ　３−　Ｘ６３−Ａｇ３．６５３
を同様にＲＰＭＩ１６４０でよく洗浄し、肺臓細胞と骨
髄腫細胞との比がｌＯ：１となる割合（１，５ｘ　１０
−”個：　１．５　Ｘ　１０−’個）にて混合し、１０
００ｒｐｎ＋で５分間遠心分離した。沈殿として得られ
た細胞群をよくほぐした後、３７℃にて撹拌しながら５
０％ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ　４００
０）　：和光紬薬社製）ｌ−をゆっくり加え、１分後か
らＲＰＭ１１６４０を１分間に１−の割合で撹拌しなが
ら添加し、全量で１０−となるようにした。細胞を塊り
のないように十分解きほぐし、１１０００ｒｐで５分間
遠心分離して上清を捨てた。５０＋＋ｄのＨＡＴ培地（
１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭ１１６４０
培地に、ヒポキサンチン１０−　’　Ｍ　、アミノプテ
リン４Ｘ１０−’Ｍ１チミジン１．５　Ｘ　１０−’Ｍ
を加えた培地）を加えて再び細胞をほぐし懸濁させた。

細胞懸濁液をマイクロプレート（＃３０７２：ファルコ
ン社製）に０、１　ｄ　／ウェルにてまき込み、５％Ｃ
Ｏ，と９５％空気との００８インキユベーター中で３７
℃にて培養を開始した。翌日、ＨＡＴ培地をさらに０．
１＋ｄ／ウエル添加し、その後３〜４日ごとに各ウェル
の培地半分量を除去し、新しいＨＡＴ培地と交換した。

７日目頃より、ハイプリドーマの生育が認められ、１０
日目上り交換する培地をＨＴ培地（上記ＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いた培地）に変えた。１６日目上は
、融合５１８ウエルのうち１１８ウエルにハイブリドー
マが出現し、培養上清を一部採取して実施例２に記載の
ＥＩＡ法にて抗体価をスクリーニングした。

一部スクリーニングの結果、１１８ウエル中６ウエルに
特異抗体の分泌を認めた。

！ＪＪ！Ｌｉ（抗ＬＴモノクローナル抗体産生細胞のク
ローニング） 実施例３で得られたハイプリドーマ６株のうちの５株ニ
ツキ、１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０培地中に各
細胞を１個／−の濃度となるように懸濁させ、マイクロ
プレート（＃３０１２：ファルコン社製）の各ウェルに
２０ｏＩづつ分注し、限界希釈液によるクローン化を行
なった。フィーダー細胞としては、同系マウスの胸腺細
胞をｌＸｌ０’個／ウェルとなるように添加した。

１４日目上４８０個のウェルから３９個のハイフ゛リド
−マクローンが出現した。各クローンの培養上清中の抗
体価を、実施例２に記載のＥＩＡ法にて測定した。得ら
れたクローンのうち、ハイブリドーマ１−６−３５、ハ
イブリドーマ１−４５−１０及びハイブリドーマ１−７
４−５４の３種についてその結果を表１に示す。

尖■拠−立（ハイブリドーマの染色体数分析）実施例３
に記載の骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−八ｇ８．６５３及び
実施例４に記載の３種のハイブリドーマの各培養液にコ
ルセミド（半片化学社製）を最終濃度０．０６μｇ／−
となるように添加し、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて
４時′間静置した後、細胞を遠心により回収した。沈澱
した細胞に１％クエン酸ナトリウムを１０ｍ！添加し、
低張処理を行なった。遠心によって細胞を回収した後、
固定液（氷酢酸：エタノール−１＝３）にて細胞をスラ
イドグラス上に固定し、ギムザ液にて染色して後、顕微
鏡下で染色体の数を計数した。結果を表１に示す。

去膳斑−旦（モノクローナル抗体の分類）実施例４によ
り得られた３種ハイブリドーマのクローンの培養上清を
、°モノクローナルクイピングキット（マイルス社製）
を用いたオクタロニ法にて分析した。

各ハイブリドーマクローンの分泌する抗体のサブクラス
を表１に示す。

実施±−工（モノクローナル抗体と培養細胞由来ＬＴと
の反応性） 本発明者らは、すでにヒトＴ細胞融合によりＬ　Ｔを分
泌するＴａ１ｌ胞ハイブリドーマ（Ａ−Ｃ５−８）を樹
立している（特公昭６０−１１８８９号公報；特許第１
．３６４，２６４号）。

このＡ−Ｃ５−８株を、２Ｘ１０’／ｍＩの細胞濃度で
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）１０ｘ／ｍ７及びフォル
ボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）２０ｎｇ
／ｍで刺激し、４日後の培養上清を回収した。この培養
上清を、浅田らの方法（第１４回日本免疫学会総会記録
、３６９頁、１９８４年）により精製した。すなわち、
６０％硫安分画、陰イオンクロマトグラフィー（口ＥＡ
Ｅ−セファセル）、疎水クロマトグラフィー（フェニル
・セファローズ）、アフィニティークロマトグラフィー
（レンチル・レクチン・セファローズ）、ゲル濾過クロ
マトグラフィー（ＴＳＫＧ３０００ＳＷ）により精製し
た。

得られたＴ細胞ハイブリドーマ由来のＬＴ試料を５０ｍ
Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９，５）によって３０ｔｔｇ／
ｍｌのタンパク濃度に調製し、９６大のＥＩＡ用プレー
ト（＃３９１５　、ファルコン社製）に１００７７７づ
つ分注し、４℃で一晩放置して抗原をプレートにコート
した。以下続いて、実施例２に記載のＥＩＡ法に準じ前
記の３種のハイブリドーマクローンの培養上清との反応
性を調べた。結果を表２に示す。

ｔ８（モノクローナル抗体によるＬＴ活性中和） 実施例４により得られた各種ハイブリドーマクローンの
培養上清と、ＬＴ試料（１００Ｕ／ｍＺ）とを等量混合
し、３７℃にて６０分間反応させた。

その１００ｔ１１をマイクロプレート（＃３０７２．７
ァルコン社製）にて増殖させたＬ９２９細胞の亜株であ
るＬ−Ｐ３細胞［東京大学より入手］（ＩＸＩＯ’個）
に添加し、アクチノマイシンＤの存在下で５％ＣＯｔ雰
囲気中で３７℃にて１８時間培養した。

生存したＬ−Ｐ３細胞を０．５％クリスタルバイオレッ
トにて染色し、染色細胞からクリスタルバイオレットを
エタノールで抽出して、５５０ｎ−における吸光度を測
定した。

ＬＴ活性は、全Ｌ−Ｐ３細胞の５０％を死に到らせる量
を１単位と定義し、試料の希釈倍数から活性を算出した
。

各種ハイブリドーマクローンの培養上清による、ＬＴ中
和活性測定結果を表３に示す。

臥下金ｅ ス１１殊−」−（モノクローナル抗体によるＴＮＦ活性
中和） 実施例４により得られた各種ハイブリドーマクローンの
培養上清と、ヒト遺伝子組換え腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
（ゼンザイム社製）　　１００Ｕ／ｍ１とを等量混合し
、３７℃にて６０分間反応させた。

以下、実施例８と同様に処理し、ＴＮＦ活性を測定した
。各種ハイブリドーマクローンの培養上清による、ＴＮ
Ｆ中和活性測定結果を表４に示す。

麦−−（ 水中に含まれる細胞等を除去した。

各ハイブリドーマクローン接種マウス腹水の抗体価を、
実施例２に記載のＥＩＡ法にて測定した。

結果を表５に示す。

１０（ハイブリドーマのマウス腹腔内での増殖） ８週令ＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスの腹腔内にブリスタン０．
５−を投与し、１０日後に実施例４で得られた３種のハ
イブリドーマクローン５ＸｌＯｂ個を腹腔内に接種した
。１０日から２０日後に、マウスの腹部が肥大し腹水の
貯留が確認されたマウスから注射器で腹水を採取し、抗
凝固剤を含むチューブに回収した。１匹のマウスから、
１回につき２〜１０ｔＩｉの腹水を回収した。遠心分離
により、腹（＊）ＥＩＡ力価とはＯＤ　４９２／６３０
が１．０となる希釈倍数である。

実Ｕ（抗体の抗原認識領域の同定） 実施例１において得られたＬ　Ｔ　２．４■とアルギニ
ルエンドペプチダーゼ（宝酒造社製）　　１００ｍとを
３５℃で１８時間反応させ、その反応液をシリカ系０４
カラムＡ　Ｐ　−８０３（４，６Ｘ　２５（ｈｍ）（山
村化学社製）に吸着させ、０．１％トリフルオロ酢酸（
Ｔ　Ｆ　Ａ）存在下でアセトニトリルの直’ａ　１１度
勾配にて溶出する逆相クロマトグラフィーを行なった。

溶出ピークを分取し、遠心濃縮装置により溶媒を除去し
た後、ＰＢＳに再溶解して０．２％グルタルアルデヒド
処理したマイクロプレート（＃３９１５　；ファルコン
社製）に固定した。ハイブリドーマ１−７４−５４から
分泌された抗体を用い、実施例２に記載のＥＩＡ法と同
様に反応性を測定した。

ＥＩＡ法にて抗体との反応がｆ、１！ｉＪｊされた逆相
クロマトグラフィーのピークに含有されるポリペプチド
フラグメントのアミノ酸配列をパルスリキッド・プロテ
ィンシーケンサ−４７７Ａ　（アプライド・バイオシス
テムズ社製）により決定した。ＥＩＡ陽性ポリペプチド
フラグメントのアミノ末端から２００番目残基までのア
ミノ酸配列は、ＡＬＡ−Ｔ！（Ｒ−５ＥＲ−ＳＥＩ？　
−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＴＹＲ−Ｌｕｌｌ　−ＡＬＡ　−Ｈ
Ｉ　５−ＧＬＬＩ−ＶＡＬ−ＧＬＮＬＥＤ−ＰＩＩＥ−
ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＴＹＲ−ＰＲＯであった。Ｃ
４逆相クロマトグラフィーパターン及びアミノ酸配列分
析よりハイブリドーマ１−７４−５４から分泌される抗
体は、第１図に示すＬＴの７１番目（Ａ　Ｌ　Ａ）から
１５２番目（ＬＥＵ）のアミノ酸配列（すなわち第１図
のＡ）内に抗原認識領域に有することが判明した。同様
の分析を実施した結果、ハイブリドーマ１−６−３５か
ら分泌される抗体及びハイブリドーマｌ−４５−１０か
ら分泌される抗体も同一の領域を認識することが分かっ
た。

実ｌＩ津−１」工（抗体結合吸着剤の作製）実施例１Ｏ
で得られた腹水２０ｍ１について５０％飽和硫安分画を
行ない、０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７，４）
に対して透析し、予め同じバッファーで平衡化しておい
たＤＥＡＥ−セルロース（ｐＨ５２；ワットマン社製）
カラム（１６Ｘ　２５０ａｍ）に給送した。そのカラム
に吸着しなかった両分を抗体画分（ＩｇＧ画分）として
回収し、ＩｇＧ約２２０　ｒｔｇを得た。上記精製方法
により、抗体純度は９０％以上と推定された（電気泳動
分析による）。

前記の方法により得られたＩｇＧ画分をアフィブレソブ
１０（バイオ・ランド社製）と結合し、抗体結合吸着剤
を作製した。すなわち、アフィプレフプ１０をガラスフ
ィルター上で水冷下にイソプロパツールで洗浄し、さら
に氷水で３回洗浄してゲルを回収した。

このゲル５ｍｌと、前記１．Ｇ画分５０ｍｇ（０，２Ｍ
　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）　−０，３Ｍ　ＮａＣｌ
！溶液〕とを等容量で混合し、４℃で５時間撹拌しなが
ら結合反応を行わせた０反応終了後、ゲルを遠心回収し
、０、　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ，と０．１５Ｍ　ＮａＣＪ
！との混合液で２回洗浄した後、０．１　Ｍエタノール
アミン−塩酸塩（ｐ）１８　）と室温で６０分間よく混
合して抗体結合吸着剤を得た。

このゲルをカラムに充填して、抗体結合カラムを作製し
た（１０Ｘ６０龍）。

遺」１例−１３（遺伝子組換え型ＬＴの精製）ＬＴ遺伝
子を含有するプラスミドｐＤＫ１２によって形質転換し
たエシェリヒア・コリ　（Ｅｃｈｅｒｊｃｈｉａｃｏ目
）Ｗ３１１０株を培養し、集菌し、菌体を破砕した後に
、核酸除去処理及び硫安分画を行って粗精製を実施した
。この粗精製液を、実施例１２で作製した抗体結合カラ
ムに給送し、ＬＴを吸着させた。

０．０２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８，０）にて十分に
洗浄後、０．２　Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ２
，５）にて、カラムに吸着していたＬＴを溶出した。溶
出液は、等容量の０．２　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７
，４）によりすみやかに中和し、ＬＴの失活を防いだ。

カラムを通す前の粗精製液とカラムを通した後の精製液
とについて活性を比較した。

タンパク定量は、プロティンアッセイキット（バイオ・
ランド社製）により実施し、１ｍｇのタンパク貿当りの
ＬＴ活性を比活性として算出した。

精製結果を表６に示す。

（＊）（）内は活性回収率（％）を示す。

プｌ虻例−一１」ユ（他のクロマトグラフィーとの併用
）抗体結合カラムにて精製した高純度ＬＴを、さら４．
：ＤＥＡＥ−セ／Ｌローフ、　（Ａ−５００：生化学工
業社製）にて精製した。すなわち、１０ｍＭ　ＮａＣ１
を含有する１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８，０
）にてあらかじめ平衡化したＡ−５００カラム（１３Ｘ
１．５０龍）に、抗体結合カラムにて精製した高純度Ｌ
Ｔを給送し、前記と同じバッファーにて十分に洗浄した
後、５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する１０ｍＭ）リス塩酸
バッファー（ｐＨ８，０）にて溶出した。得られたＬＴ
を、ソディウムドデシルサルフェート・ポリアクリルア
ミド電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）で分析したところ、
純度は９９％以上であった。

ＬＴ活性及び比活性を実施例１３と同様に算出した。

精製結果を表７に示す。

裏止賀土工（他のクロマトグラフィーとの併用）抗体結
合カラムにて精製した高純度ＬＴを、さ、表−」− 尖１１−上■（アミノ末端欠除体ＬＴの精製）実施例１
５により得られた高精製Ｌ　Ｔ　０．８■とアルギニル
・エンドペプチダーゼ（宝酒造社製）３０遁とを３５℃
で１８時間反応させ、その反応液を実施例１２で得られ
た抗体結合カラムに給送した。０．２Ｍホウ酸バッファ
ー（ｐＨ８，０）にて十分に洗浄した後、０．２　Ｍグ
リシン塩酸バッファー（ｐＨ２，５）にて溶出を行なっ
た。抗体結合カラムに吸着した両分（吸着画分）を、シ
リカ系０４カラムＡ　Ｐ　−８０３（４，６Ｘ　２５０
龍）（山村化学社製）にて、０．１％トリフルオロ酢酸
（Ｔ　Ｆ　Ａ）の存在下でアセトニトリルの直線濃度勾
配にて溶出する逆相クロマトグラフィーを行なった。ア
セトニトリルの濃度４３％及び４５％位置にピークが認
めららに金属キレートクロマトグラフィー及びゲル濾過
クロマトグラフィーにて精製した。すなわち、Ｉ　Ｍ　
Ｎａ（Ｊ！を含有する２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
７，６）にてあらかじめ平衡化した、亜鉛結合キレ−テ
ィングセファロースＦＦ（ファルマシア社製）カラム（
１０Ｘ６０ｍｍ）に、抗体結合カラムにて精製した高純
度ＬＴを給送し、同じバッファーにて十分に洗浄した後
、５０ｍＭイミダゾールを含有する同じバッファーにて
溶出した。

溶出液をさらにセファクリルＳ−２００ＨＲ（ファルマ
シア社製）カラム（１６Ｘ１０００鰭）にてゲル濾過を
行ない、エンドトキシン及びイミダゾールを除去した。

得られたＬＴは、５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析により純度９９
％以上、トキシカラーシステム（生化学工業社製）によ
りエンドトキシン含有量０．０３遁ｇ／■・ＬＴである
ことが分かった。

ＬＴ活性及び比活性を実施例１３と同様に算出した。

精製結果を表８に示す。

れた。各ピークを分取した後、パルスリキッドプロティ
ンシーケンサ−４７７Ａ　（アプライド・バイオシステ
ムズ社製）により、４３％位置の溶出ピークは、第１図
に示すＬＴの７１番目（Ａ　Ｌ　Ａ）から１５２番目（
ＬＥＵ）（すなわち第１図のＡの部分〕のポリペプチド
であり、４５％位置の溶出ピークは酵素処理で分解しな
かったＬＴ、すなわち第１図に示す１番目（ＭＥＴ）か
ら１５２番目（ＬＥＵ）のＬＴであることが判明した。

前記の処理から第１図のＡに示すアミノ酸配列をもつＬ
Ｔ及び第１図会体のアミノ酸配列をもつＬＴが、本発明
による抗体結合カラムに吸着することが確認された。

ｍ−土工（モノクローナル抗体と培養細胞由来ＬＴとの
反応性） 実施例７に記載のヒトＴ細胞ハイブリドーマ（＾−Ｃ５
−８）株を、２Ｘ１０”／−の細胞濃度でコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）１０ｎ／−及びフォルボール・ミリス
テート・アセテート（ＰＭＡ）２０遁ｇ／ｒｎ１で刺激
し、４日後の培養上清を回収した。

この培養上清１（ｌを実施例１２で作製した抗体結合カ
ラムに給送し、ＬＴを吸着させた。０．０２Ｍホウ酸バ
ッファー（ｐＨ８，０）にて十分に洗浄した後、０．２
Ｍグリシン・塩酸バッファーにてカラムに吸着していた
ＬＴを溶出した。溶出液を、等容量の０．２　Ｍリン酸
バッファー（ｐＨ７，４）によりすみやかに中和し、Ｌ
Ｔの失活を防いだ。

ＬＴ活性及び比活性を、実施例１３と同様に算出した。

精製結果を表９に示す。

１土■−１１３（ＥＩＡ試薬類の調製）（１）ＬＴ特異
的モノクローナル抗体固定プレートの作製 実施例１０において得られた腹水５ｍＪを、０．０１Ｍ
リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６，８）で処理した
ハイドロキシアパタイト（バイオ・ランド社製）カラム
（直径３　ＣｓＸ　’ｌ　Ｑ　ｃｍ）に吸着させ、０．
０１Ｍ〜０．３Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ
６，８）グラジェントで溶出するｔｇ画分を取得し、そ
の百分を０．２　Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９，５）に対
して透析し、■ｇ濃度をそのバッファーにて３０ｎ／ｄ
に調製し、こうして得られた液０．２−ずつを市販の免
疫測定用９６六マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウ
ェルに入れ、４℃で２０時間コーティングを実施した。

次いで、０．０５％ツウィーン２０を含むＰＢＳで１回
、更にＰＢＳで２回、マイクロプレートの各ウェルを洗
浄した。０．５％牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）含有
ＰＢＳ０．１ｍＺ／ウェルを加え、プラスチック表面の
タンパク質結合部位をＢＳＡでブロックした。このよう
に作製した固相プレートはこの状態で冷蔵庫中で長期間
保存することができる。

（２）ポリクローナル抗ＬＴ抗体の作製特開昭６３−８
３９９号公報実施例７〜実施例８に記載の方法で作製し
た第１図に示す遺伝子組換え型Ｌ　Ｔ　Ｏ，３■及び１
■を体重約２　ｋｇのウサギにュージーランドホワイト
種；オス；佐藤養鶏場）にＦＣＡ　（完全フロインドア
ジュバント）と共に皮下投与し、２週間後に同じＬ　Ｔ
　Ｏ，１■及び０．４■をＦＩＡ（不完全フロインドア
ジュバント）と共に皮下投与した。２週間後、ＰＢＳに
溶解した同じＬＴｏ、０３■及び０．３■をそのまま静
注し、更に１０日後に同様の静注を行ない、１０日後に
採血した。

採血した血液は、凝固した後で血清を分離し、３３％飽
和硫安および５０％飽和硫安で塩析した。

ＰＢＳにて透析した後、遠心し、その上清をポリクロー
ナル抗ＬＴ抗体とした。

ポリクローナル抗ＬＴ抗体の抗体価は、第２抗体として
パーオキシダーゼ標識ヤギ抗゛ウサギ免疫グロブリン抗
体（ＤＡＫＯ社製）を用い、実施例２に準じＥＩＡ法に
より測定した結果１０６〜１０７であった。

（３）パーオキシダーゼ標識ポリクローナル抗ＬＴ抗体
の作製 パーオキシダーゼ（シグマ社製）４■／−に０、１　Ｍ
　Ｎａ１Ｏａ　０．２−を加え、室温で２０分インキエ
ベートした後、１ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４）に対し
て透析し、続いて０．２Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９，５
）に対して透析した。ポリクローナル抗ＬＴ抵抗６■と
混合し、室温で２時間インキュベートした後、ＮａＢＨ
４０，４■を加えて４℃で２時間還元反応を行わせ、更
に、ＰＢＳに対して４０時間透析することによりパーオ
キシダーゼ標識抗ＬＴポリクローナル抗体を作製した。

（４）基質Ａの作製 ０−フェニレンジアミン（東京化成工業社製）１６曜を
ｌＯ−バイアルに分注した。

（５）基質Ｂの作製 ３０％過酸化水素水（和光紬薬社製）を０．１　Ｍクエ
ン酸バッファー（ｐ）１５．０）で希釈して０．０２％
液を調製した。

７３１例−一１９　（ＬＴの測定方法）実施例１Ｂ（１
）のＬＴ特異的モノクローナル抗体固相プレートに満た
されている液を捨てた。

次いで、実施例１４により得られた被検試料（Ｌ　９２
９の亜株Ｌ・Ｐ３細胞を用いた従来ＬＴアッセイ法でＬ
Ｔとして１０〜３００　ｕ　／−含まれる。

ＬＴの比活性は３　Ｘ　１０’　ｕ／ａｇ）を１００ｐ
１／ウェル加えた。３７℃で６０分間反応させた後、０
．０５％ツウィーン２０含有のＰＢＳ（−）（洗浄液）
で３回洗浄した後、実施例１８（３）の標識抗体の洗浄
液による１０倍希釈液１００Ｉを各ウェルに加えた。３
７℃で６０分間反応させ、洗浄液で３回洗浄した。次い
で、実施例１８（４）の基質Ａ１バイアルを実施例１８
（５）の基質８４ｍ１に溶かし、その溶液１００ＩＩＩ
を各ウェルに加え、反応を停止させ、波長４９２ｎｍ及
び６３０ｎｍ　（主波長＝４９２ｎ−）での吸光度をマ
イクロプレートリーダーにより測定した。参考として、
ヒトＴＮＦ−α（ゼンザイム社製）を検体として同様の
方法により測定した。これらの測定値を表１Ｏに示す。

Ｎ末端アミノ酸配列の異なる２種のＬＴ（特開昭６３−
８３９８号公報の特許請求の範囲第１項に記載のＬＴ及
び特願昭６２−１６０１１５号明細書の特許請求の範囲
第°１項に記載のＬＴ）　、実施例１７に示す方法で作
製したヒトＴ細胞ハイブリドーマ（Ａ−Ｃ５−８）培養
上清、並びに第１図に示すＬＴをアルギニルエンドペブ
チターゼで処理した後にＣ４逆相クロマトグラフィーに
より分画して得たペプチドｌ〔第１図に示すアミノ酸配
列において１番目（ＭＥＴ）から７００番目ＬＹＳ）ま
でを含むＬＴ）及びペプチド■〔第１図のアミノ酸配列
において７１番目（ＡＬＡ）から１５２番目（ＬＥＵ）
までを含むＬＴ）について、実施例１９に記載の方法で
ＬＴ量を測定した。結果を表１１に示す。

（＊）実施例８に示すＬ−Ｐ３障害性試験裏施■−１１
（パーオキシダーゼ標識ＬＴ特異的モノクローナル抗体
の作製） パーオキシダーゼ４■／−に０．　Ｉ　Ｍ　Ｎａ１０４
０．２−を加え、室温で２０分間インキュベートした後
、１ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４）に対して透析し、続
いて０．２　Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９，５）に対して
透析した。実施例１８の方法で得たＬＴ特異的モノクロ
ーナル抗体６■と混合し、室温で２時間インキエベート
した後、ＮａＢＨｚ　０．４■を加え、４℃で２時間還
元反応を行い、更にＰＢＳに対して４０時間透析するこ
とによりパーオキシダーゼ標識ＬＴ特異的モノクローナ
ル抗体を作製した。

ＩＪｉ例ニー２２（マウス及びヒト血清へのＬＴの添加
回収試験） １１ＡＬＢ／Ｃマウス及び健康人の血清中に、既知の濃
度のＬＴを添加し、実施例１９に記載の方法と同様に被
検試料中のＬＴ量を酵素免疫測定法により測定した。

結果を表１２に示す。

以下余ｅ 〔発明の効果） 本発明によるハイブリドーマから得られるモノクローナ
ル抗体は、ヒ１−ＬＴに対して特異的に反応するもので
あり、該抗体結合カラムによりＬＴ含有物からのＬＴの
単離・精製を簡便がっ迅速に実施することが可能になる
。さらに、本発明により取得された抗体結合カラムでは
、ＬＴ活性を保持する種々の誘導体、変異体も精製でき
るので、より毒性が低くより有効な誘導体を自損したタ
ンパク工学的研究により生み出される各種ＬＴ誘導体の
研究に大いに役立つ。

さらに、本発明によるＬＴ測定方法及び測定試薬を用い
ることにより、ＬＴの測定時間が大巾に短縮され、ＬＴ
とＴＮＦ−αが混在する試料例えば、生体試料中のＬＴ
の定量が可能になる。更に、アミノ末端が欠除した変異
ＬＴの測定ができるので、多くの種類のＬＴの測定に対
応できる。

本発明によるハイブリドーマは、液体窒素中にて保存可
能であり、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。寄託番号は以下のとおりである。

ハイブリドーマ　１−６−３５： 微工研条寄第１８９０号（ＦＥＲＭ　　８Ｐ−１８９０
）ハイブリドーマ　ｔ−４ｓ−ｔｏ： 微工研条寄第１８９１号（ＦＥＲＭ　　ＨＰ−１８９１
）ハイブリドーマ　１−７４−５４　： 微工研条寄第１８９２号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８９２
）

【図面の簡単な説明】

第１図は、特開昭６３−８３９９号公報特許請求の範囲
第１項記載のＬＴのアミノ酸配列を示す。 第２図は、ネイチャー、第３１２巻第７２１頁（１９８
４年）に記載のＬＴのアミノ酸配列を示す。 第１図においてＡは本発明によるモノクローナル抗体が
認識可能なアミノ酸配列の領域を示し、そして第２図に
おいてＢは、第１図のアミノ酸配列全体に相当する領域
を示すものである。 ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＨＩＳ　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＹ　Ａ
ＳｉＰ　ＰＲＯＳＥＲＬＹ！３ＡＳＰ　　ＡＲＧ　　Ａ
ＬＡ　　ＰＨＥ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＳＰ　　Ｇ
ＬＹ　　ＰＨＥ　　ＳＥＲＬＥＵ　ＳＥＲＡＳＮ　ＡＳ
Ｎ　ＳＥＲＬＥＵ　ＬＥＤ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＨＲＳＥ
ＲＧＬＹ　ＩＬＥ　ＴＹＲＰＨＥ　ＶＡＬ　ＴＹＲＳＥ
ＲＧＬＮ　ＶＡＬ第 図 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図のアミノ酸配列の７１番目から１５２番目の
   アミノ酸配列を含むポリペプチドを特異的に認識するモ
   ノクローナル抗体又はそのフラグメント。 ２、第１図のアミノ酸配列を有する遺伝子組換え型ヒト
   リンホトキシンで免疫されたマウスから由来する抗体産
   生細胞と骨髄腫由来の細胞とを融合して形成されたハイ
   ブリドーマ細胞系であって、請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ細
   胞系。 ３、請求項１記載のモノクローナル抗体又はそのフラグ
   メントを結合してなる吸着剤とリンホトキシン含有物と
   を接触させてリンホトキシンを吸着剤に吸着させ、次い
   で、吸着剤に吸着したリンホトキシンを溶出することを
   特徴とする、高純度リンホトキシンの精製方法。 ４、請求項１記載のモノクローナル抗体又はそのフラグ
   メント少なくとも１種を使用することを特徴とする、リ
   ンホトキシンの免疫学的測定方法。 ５、請求項１記載のモノクローナル抗体又はそのフラグ
   メント少なくとも１種を含有することを特徴とする、リ
   ンホトキシンの免疫学的測定用試薬。