JP2004215649A - 抗ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体、これを産生する細胞株、抗ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法、およびｃ反応性タンパク質検出キット - Google Patents
抗ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体、これを産生する細胞株、抗ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法、およびｃ反応性タンパク質検出キット Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ＣＲＰの検出および測定を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供する。
【解決手段】図１に示すように、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の作製方法は、ＣＲＰで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程Ｓｔ１と、上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程Ｓｔ２とを含む。
【選択図】 図１
【解決手段】図１に示すように、本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の作製方法は、ＣＲＰで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程Ｓｔ１と、上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程Ｓｔ２とを含む。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体、これを産生する細胞株、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法、およびＣ反応性タンパク質検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰと略称される）は、肺炎患者の血液中に肺炎球菌の莢膜のＣ多糖体とＣａ２＋存在下で沈降反応を示すタンパク質として見出された。ＣＲＰは、分子量約１３万で、五量体であり、電気泳動によりβグロブリン分画に見出される、代表的な急性相反応物質であり、炎症性疾患、体内組織の壊死などがある時に著しく増加する血漿タンパク質である。ＣＲＰは、例えば、細菌またはウイルスでの感染症、慢性関節リュウマチなどの膠原病、悪性腫瘍、心筋梗塞、肝炎、肝硬変などの消化器疾患、あるいは大きな外傷のような広範囲の組織崩壊性疾患等に罹患している被検体では高い検出値を示す。
【０００３】
このため、ＣＲＰの検査は、疾病を特定できるほどではないものの、被検体における組織崩壊性疾患の存在を検出するために非常に有用である。例えば、ＣＲＰ抗体を用いて、体調不良者の事前検査（ＣＲＰとの抗原抗体反応が陽性の場合、疾患を特定するためのさらなる検査を行なう）、ＣＲＰ量の定量による病態スクリーニング、治療効果の確認、予後の判定等を行なうことが出来る。
【０００４】
従来、ＣＲＰを免疫学的手法により特異的に検出するために、ポリクローナル抗体である抗ヒトＣＲＰ血清が用いられている。従来のＣＲＰの検査法のほとんどは、抗血清とＣＲＰとの凝集反応による沈降線の有無または濁度の増加によってＣＲＰを検査する。しかし、未精製の抗血清は、血清中の種々の抗原に対する種々の抗体を含むことが多いため、ＣＲＰ以外の抗原を検出する可能性がある。そこで、検査においてＣＲＰ以外の抗原を誤って検出することを防ぐために、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を用いて抗血清中からヒト標準血清中のタンパク質に結合する抗体を取り除く。このことによって、ヒト標準血清においてＣＲＰ以外の抗原に由来する反応が起こらないようにすることが一般的である。
【０００５】
また、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いて免疫比濁法によりＣＲＰを測定することも開示されている（特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭６２−１９２６６１号公報。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、抗ヒトＣＲＰ血清では、作製される血清毎に得られる抗ヒトＣＲＰ抗体群が異なる。このため、ＣＲＰとの反応性が変動するおそれがある。さらに、抗ヒトＣＲＰ血清を用いたヒトＣＲＰの検出は、操作が煩雑であり、またＣＲＰの定量も容易ではない。
【０００８】
また、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いて免疫比濁法によりＣＲＰを測定することが上記特許文献１に開示されているが、実際には、抗ＣＲＰモノクローナル抗体とＣＲＰとの凝集時に、それぞれの分子間の立体障害の影響などがある場合には、ＣＲＰの定量が困難になることがある。
【０００９】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、ＣＲＰの検出および測定を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法は、Ｃ反応性タンパク質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程（ａ）と、上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、Ｃ反応性タンパク質、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、Ｃ反応性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程（ｂ）とを含む。
【００１１】
本発明によれば、各細胞株から産生されるモノクローナル抗体について、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する。このため、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する交叉反応性が非常に低い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を選択することができる。従って、ＣＲＰの検出および定量を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することができる。
【００１２】
上記工程（ｂ）において、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない、モノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜することが好ましい。
【００１３】
本発明の細胞株は、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しないモノクローナル抗体を産生する。
【００１４】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号であってもよい。
【００１５】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号であってもよい。
【００１６】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号であってもよい。
【００１７】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号であってもよい。
【００１８】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号であってもよい。
【００１９】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号であってもよい。
【００２０】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
本発明の抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体は、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない。
【００２１】
本発明のＣ反応性タンパク質検出キットは、試料液中のＣ反応性タンパク質を検出するためのＣ反応性タンパク質検出キットであって、第１の抗体および第２の抗体を含み、上記第１の抗体が、抗Ｃ反応性タンパク質抗体であり、上記第２の抗体が、標識された抗Ｃ反応性タンパク質抗体であり、上記第１の抗体または上記第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体である。
【００２２】
本発明のＣ反応性タンパク質検出キットでは、第１の抗体または第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対しても結合能を有する抗体の存在量が大幅に減少する。従って、第１の抗体と第２の抗体とがほぼ確実にＣＲＰを挟んでサンドイッチ状に結合し、抗原抗体反応による複合体を形成する。従って、例えば、従来の分光学的手段を用いる免疫測定法（免疫比濁法、免疫比ろう法等）に本発明のキットを適用することによって、ＣＲＰを高感度で正確に測定することができる。
【００２３】
上記第１の抗体が、固相に固定化されており、上記第２の抗体が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であり、且つ移動相に含まれている。
【００２４】
第２の抗体が補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰの存在を示す標識が検出されなくなる。従って、より高い感度で正確にＣＲＰを検出および測定することができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２６】
簡便な方法でＣＲＰの定量を行なうため、モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ方式の免疫クロマトグラフィーがよく利用される。
【００２７】
サンドイッチ方式の免疫クロマトグラフィーでは、２種類の抗体を用い、まず一方を固相に固定化しておく。次に標識したもう一方の抗体とＣＲＰを反応させた後、これを移動相として固相部分に対して流す。その結果、２種類の抗体はＣＲＰを介してサンドイッチ状に結合する。従って、ＣＲＰが存在する場合にのみ固相上で標識が確認される。
【００２８】
ＣＲＰは、５個のペプチドが繰り返されている５量体（ペンタマー）であり、分子量約１３万である。このため、ＣＲＰを挟んでサンドイッチ状に結合出来る抗体のペアを得ることは比較的容易である。しかし、本発明者らは、モノクローナル抗体を用いる場合、抗体が均一であるため、抗体の交叉反応性は、ポリクローナル抗体のみを用いる場合と比較して非常に大きな問題となることに気付いた。
【００２９】
ＣＲＰのアミノ酸配列は、血清アミロイドＰのアミノ酸配列と５１％の相同性があり、また、ＣＲＰは、補体Ｃ１ｑのアミノ酸配列の一部分と相同性があることが知られている。そのため、ＣＲＰに対する抗体の中には、ＣＲＰだけでなく補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対しても結合能を有する抗体が存在し得る。このような抗体をサンドイッチ法に用いると、ＣＲＰの正確な定量に支障をきたす恐れがある。従って、本発明者らは、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する交叉反応性が可能な限り低い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いる必要があると考察した。
【００３０】
そこで、本実施形態では、次に述べる方法で、抗ＣＲＰモノクローナル抗体およびこれを産生する細胞株を作製する。本実施形態の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の作製方法を、図１を参照しながら説明する。
【００３１】
図１に示すように、本実施形態の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の作製方法は、ＣＲＰで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程Ｓｔ１と、上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程Ｓｔ２とを含む。
【００３２】
本実施形態の方法によれば、各細胞株から産生されるモノクローナル抗体について、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する。このため、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する交叉反応性が非常に低い抗ＣＲＰモノクローナル抗体が得られる。従って、ＣＲＰの検出および定量を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することができる。
【００３３】
上記工程Ｓｔ２において、ＣＲＰに対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない、モノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜することが好ましい。
【００３４】
次に、各工程の詳細を順に説明する。なお、本実施形態においては、特に指示のない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用して行なうことができる。また、以下の説明で記載されているＣＲＰ、血清アミロイドＰ、および補体Ｃ１ｑは、すべてヒト由来のものである。 なお、本実施形態では、ヒトのＣＲＰ、およびそれに特異的に結合する抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体について説明するが、本発明は、ヒト以外の哺乳類（イヌ、ネコ、ウシ、ウマなど）のＣＲＰに特異的に結合する抗ＣＲＰモノクローナル抗体にも、全く同様に適用可能である。
【００３５】
まず、工程Ｓｔ１の詳細を説明する。
【００３６】
（免疫）
哺乳動物をＣＲＰで免疫することによって、動物体内で抗体産生細胞を調製する。
【００３７】
「哺乳動物」の例として、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギが挙げられる。哺乳動物は、好ましくはマウスおよびラットであり、より好ましくはマウスである。免疫する哺乳動物がマウスまたはラットである場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよい。マウスの例として、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウスが挙げられる。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後に血清中に高い抗体力価を示すので、ＣＲＰとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能である。血中抗体力価が、特異的なハイブリドーマの出来易さと関係していることは公知である。また、細胞株の確立後の腹水による抗体大量作製においては、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが一般によく使用される。以上により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、ＣＲＰの免疫に好ましい例である。実験動物の齢は、特に限定されないが、代表的には、約４週齢〜約１２週齢のマウスまたはラットであり、好ましくは約６〜約１０週齢のマウスまたはラットであり、より好ましくは約７週齢のマウスまたはラットである。
【００３８】
免疫に用いられるＣＲＰは、ヒトＣＲＰ、そのモノマーサブユニット、またはそのフラグメントが用いられ、ヒトの血清から精製してもよいし、市販のものを用いてもよい。ＣＲＰは、通常、約８０％以上の純度、好ましくは約９０％以上の純度、さらに好ましくは約９５％以上の純度、そして最も好ましくは約９８％以上の純度で用いられる。
【００３９】
免疫の前に、ＣＲＰは、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合され得る。アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト、およびタピオカアジュバントの他に、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓなどの菌体、細胞壁およびトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）などの菌体成分；グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；β−グルカン（多糖体）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ベスタチン；レバミゾールなどの合成化合物；胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子およびタフトシンなどの生体成分由来のタンパク質またはペプチド性物質；ならびにそれらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）などが挙げられる。
【００４０】
これらのアジュバントは、投与経路、投与量、投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制に効果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗原に対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロブリンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的とする免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択することが好ましい。選択されたアジュバントの取扱い、例えばＣＲＰとの混合方法などは当該分野で公知である。
【００４１】
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行なわれる。例えば、抗原であるＣＲＰは、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射され得る。免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によって異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物に合わせて適切に変更され得る。抗原投与は、最初の免疫の後に、何回か繰り返され得る。このような抗原投与を、追加免疫（ブースト）と称する。追加免疫は、例えば、最初の免疫から２週間後、４週間後、および６週間後に行なわれ得る。
【００４２】
（抗体産生の確認）
免疫後、哺乳動物から採血し、得られた血液をＣＲＰ結合活性の存在についてアッセイすることにより、哺乳動物の体内でＣＲＰに対する抗体が産生されていること、および免疫末期にはＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認する（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【００４３】
適切なアッセイ方法の例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法が挙げられる。本発明では、ＣＲＰに対して高親和性を有する抗ＣＲＰモノクローナル抗体を得ることが望ましい。高親和性のモノクローナル抗体産生細胞を得るためには、抗血清の時点で高い抗体価を示している必要がある。
【００４４】
（ブースト）
ＣＲＰ結合性抗体の産生を確認した後、脾臓を肥大させるために、免疫原の追加投与を行ない得る。免疫原の追加投与（ブースト）で投与されるＣＲＰの量は、最初に免疫されるＣＲＰの量の約４〜５倍の量が望ましいが、これに限定されない。
【００４５】
ブーストは、代表的には、ＣＲＰと不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンを用いて行なわれる。ただし、最終免疫（細胞融合数日前の免疫原の追加投与）で投与されるＣＲＰとしては、アジュバントを加えない、純粋品を用いることが好ましい。投与経路は、皮下、皮内、静脈、または腹腔内それぞれの投与によって、ＣＲＰの異なった部位を認識する抗体が得られる可能性があることを考慮して、適宜決定される。
【００４６】
（細胞融合）
最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株と細胞融合する。
【００４７】
融合細胞の増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、細胞融合には、増殖能力の優れた細胞株を用いることが好ましい。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。骨髄腫由来の細胞株は、新たに調製してもよいし、市販のものを使用してもよい。マウスの骨髄腫由来の細胞株としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０．ＢＵ．１、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１などが挙げられる。抗体の断片を産生せず、かつ融合細胞の増殖能力が優れたものとなるため、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の使用が好ましい。従って、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である場合、短時間に多くの細胞を検定し得る。ラット骨髄腫由来の細胞株としては、２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ．１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げられる。
【００４８】
細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行なわれる（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５［１９７５］、Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２、Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、７７−９６頁［１９８５］などを参照のこと）。細胞融合法の例として、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが挙げられる。細胞毒性も比較的少なく、融合操作も容易で再現性が高いため、ポリエチレングリコール法が好ましい。
【００４９】
得られた融合細胞は、当該分野で公知の条件に従って増殖させ得る。産生される抗体の結合能に基づいて、所望の融合細胞を選択し得る。
【００５０】
以上の内容が、工程Ｓｔ１の詳細である。次に、工程Ｓｔ２の詳細を説明する。
【００５１】
（細胞選別およびクローニング）
融合細胞から産生される抗体の結合能は、当該分野で公知の方法に基づいてアッセイされ得る。本発明においては、ＣＲＰに特異的に結合する抗体を産生する融合細胞を得るために、ＣＲＰ、ならびに上述したようにＣＲＰと相同性の高いタンパク質である、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する結合能に基づく選別を利用して、目的の細胞株がクローニングされる。本明細書中で「ＣＲＰに対して特異的に結合する抗体」とは、ＣＲＰに結合能を有する抗体をいう。このような「特異的に結合する抗体」は、ＣＲＰと最もよく反応し、本抗体が使用される一般的な状況において通常考えられるＣＲＰ以外の物質との反応とは区別可能である。
【００５２】
結合能の評価はインヒビションＥＬＩＳＡ法によって行なわれ得る。本明細書で用いる用語「結合能を有する」は、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１０−６Ｍ以下であることをいう。好ましくは、このインヒビションの半値は、約１０−７Ｍ以下であり、より好ましくは、約１０−８Ｍ以下であり、さらにより好ましくは、約１０−９Ｍ以下である。なおより好ましくは、約１０−１０Ｍ以下である。本明細書で用いる用語「結合能を有さない」は、同じ測定においてインヒビションがかからないことをいう。用語「インヒビションがかかる」とは、固相に固定されたＣＲＰに結合する抗体の量が、競合物質（インヒビター）の存在下で、インヒビターの不在下と比較して減少することをいう。用語「インヒビションがかからない」とは、固相に固定されたＣＲＰに結合する抗体の量が、インヒビターの存在下および不在下で実質的に同等であることをいう。「インヒビションの半値」とは、インヒビターの不在下での吸光度（抗体結合量を反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの濃度をいう。
【００５３】
抗体の結合能は、抗体産生の確認に関して上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイされる。簡便に感度よく抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００５４】
融合細胞のクローニングには、当該分野で公知の方法が用いられ得る。クローニングの方法の例としては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられる。操作も容易で数多くの実績があり、再現性が高いため、限界希釈法が好ましい。
【００５５】
細胞融合により得られた多くの融合細胞の中から、効率よく有用な細胞を選択するために、細胞選別は、クローニングの初期の段階から行なうことが好ましい。
【００５６】
このようにして、望ましい結合能を有する抗体を産生する融合細胞株が最終的に選別される。選別された細胞株は、液体窒素中で半永久的に保存され得る。本発明のモノクローナル抗体産生細胞株によれば、それを培養することによりＣＲＰに対する高い親和性を有し特異性の高い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を半永久的に提供し得る。
【００５７】
以上の内容が工程Ｓｔ２の詳細である。さらに、工程Ｓｔ２の後には以下に述べる工程が行なうことが好ましい。
【００５８】
（抗体の精製）
上記のようにして選別されたモノクローナル抗体産生細胞株を大量培養することにより、ＣＲＰに対して特異的に結合するモノクローナル抗体を大量に産生し得る。モノクローナル抗体産生細胞株の大量培養方法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙げられる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動物の腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養では、融合細胞が培地中で培養され、抗体が培地中に産生される。
【００５９】
大量培養により得られた腹水または培養上清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を精製し得る。精製のためには、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などが適宜組み合わせて用いられる。本発明の抗体は、通常、約９０％の純度、好ましくは約９５％の純度、より好ましくは約９８％の純度となるように精製される。
【００６０】
（抗体の評価）
精製されたモノクローナル抗体の結合能を評価するために、ＥＬＩＳＡプレートにＣＲＰを吸着させ、得られたいくつかの抗体を反応させ、ＣＲＰでインヒビションを行なうことにより、結合能の高い抗体を選択した。結合能の高い抗体はＣＲＰに対して高い感度の検出をするために有用である。
【００６１】
以上のようにして、本発明の細胞株および抗体は作製され得る。本発明の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＣＲＰに対して結合能を有するモノクローナル抗体である。本発明の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体のＣＲＰに対する結合能は、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１０−６Ｍ以下であり、好ましくは、約１０−７Ｍ以下であり、より好ましくは、約１０−８Ｍ以下であり、さらにより好ましくは、約１０−９Ｍ以下であり、なおより好ましくは、約１０−１０Ｍ以下である。このような抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、代表的には、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号（ＭＨ−Ｃ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８１８６号（ＭＨ−Ｃ６）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・ＥＲＭ ＢＰ・・
この抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、好ましくは、ＣＲＰに対して結合能を有し、かつ補体１Ｃｑおよび血清アミロイドＰに対して結合能を有さないモノクローナル抗体である。すなわち、ＣＲＰに対しては、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１０−６Ｍ以下、好ましくは、このインヒビションの半値は、約１０−７Ｍ以下、より好ましくは、約１０−８Ｍ以下であり、さらにより好ましくは、約１０−９Ｍ以下、なおより好ましくは、約１０−１０Ｍ以下であるが、補体１Ｃｑおよび血清アミロイドＰに対しては、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかからない。このような抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・・・
本発明による「抗ＣＲＰモノクローナル抗体」には、その結合特性を保持した機能性の断片もまた含まれる。これらの断片は、それらが由来するインタクトな抗体とＣＲＰへの特異的結合について競合し得、少なくとも１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性で結合し得る。抗体の断片は、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。抗体の断片は、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生じ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化することによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）２断片から、あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体から得ることができる（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２版 Ｒａｖａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第７章を参照のこと）。
【００６２】
本発明はまた、ＣＲＰを検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、抗原抗体結合反応に基づいて試料液中のＣＲＰを高感度に検出し得る。本発明のキットは、第１の抗体および第２の抗体を含み、第１の抗体が、抗ＣＲＰ抗体であり、第２の抗体が、標識された抗ＣＲＰ抗体である。特に、第１の抗体または第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００６３】
つまり、一方の抗体として上述したようなＣＲＰに対して結合能を有し、かつ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対して結合能を有さないモノクローナル抗体を用い、他方の抗体としては、ＣＲＰに結合能を有する限り任意の抗体を使用し得る（これは、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい）。このような他方の抗体としては、市販により入手可能である従来の抗体も、使用され得る。好ましくはモノクローナル抗体が用いられ得る。
【００６４】
本発明のキットでは、第１の抗体または第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対しても結合能を有する抗体の存在量が大幅に減少する。従って、第１の抗体と第２の抗体とがほぼ確実にＣＲＰを挟んでサンドイッチ状に結合し、抗原抗体反応による複合体を形成する。従って、例えば、従来の分光学的手段を用いる免疫測定法（免疫比濁法、免疫比ろう法等）に本発明のキットを適用することによって、ＣＲＰを高感度で正確に測定することができる。
【００６５】
本実施形態において、上述の方法で作製された「抗ＣＲＰモノクローナル抗体」は、本発明のキットの第１の抗体および第２の抗体として使用され得る。このような抗体としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号（ＭＨ−Ｃ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号（ＭＨ−Ｃ６）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・・・のみ結合能を有することが特に望ましい。従って、ＣＲＰに対して結合能を有し、かつ補体１Ｃｑおよび血清アミロイドＰに対して結合能を有さないモノクローナル抗体が好ましい。独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）号、同受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ・・８３３９号（ＭＨ−ＩＩＣ４）、または同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
本発明のキットにおいて、第１の抗体および第２の抗体は、サンドイッチ反応において、第２の抗体が、第１の抗体が結合しなかった抗原上のエピトープを認識し、そこに結合し得るような任意の組み合わせで含まれる。第２の抗体は、第１の抗体が結合するエピトープに結合能を有さない抗体であることが好ましい。ＣＲＰは５量体であるので、第１の抗体および第２の抗体は同じ種類の抗体であってもよい。
【００６６】
また、本発明のキットにおいて、第１の抗体が、固相に固定化されており、第２の抗体が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であり、且つ移動相に含まれているキットとしてもよい。
【００６７】
ＣＲＰは、５量体を構成する各モノマー上にエピトープを有し得るので、サンドイッチ反応において、固定化された抗体および移動相中の標識抗体は、１つのＣＲＰ抗原について別個の構成モノマー上に存在するエピトープに結合し得る。特に、第２の抗体が補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰの存在を示す標識が検出されなくなる。従って、より高い感度で正確にＣＲＰを検出および測定することができる。
【００６８】
本発明のキットにおいて、例えば、第１の抗体と第２の抗体の組み合わせとして、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号（ＭＨ−Ｃ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号（ＭＨ−Ｃ６）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・・・できる。
【００６９】
上述の説明は、「第１の抗体」を「第２の抗体」と交換して用いる場合にも適用される。
【００７０】
本発明のキットにおいてはまた、第１の抗体および第２の抗体がともに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体であり得る。
【００７１】
同様に、本発明のキットにおいては、第１の抗体および第２の抗体がともに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３））の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体であってもよく、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体であっても、そして同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ・・・
第２の抗体は、当該分野で公知の方法により任意の標識により標識され得る。標識の例としては、酵素標識、色素標識、磁性標識、放射性標識、色の付いた粒子（金コロイド、ラテックスなど）による標識などが挙げられる。
【００７２】
通常、上記第１の抗体は、キットの固相（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に固定化され得、そして上記第２の抗体は、移動相として使用され得る。
【００７３】
本発明のキットは、当該分野で公知の方法により適切に作製され得る。本発明のキットは、１つまたはそれ以上の容器中に上記第１の抗体および上記第２の抗体を含み得る。キットはまた、ＣＲＰのサンドイッチアッセイにおける、抗体の使用を教示する説明教材を含み得る。キットは、標識の検出のため、または陽性コントロールおよび陰性コントロールを検出するための適切な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液などを含み得る。キットは、固相に吸着させるための固相抗原溶液、固相ブロッキング溶液、および検量線を作成するための標準ＣＲＰ溶液を含み得る。すべての溶液は生体内と類似の環境をつくるため、ＰＢＳ−Ａｚ（リン酸緩衝生理食塩水−アジ化ナトリウム溶液）を溶媒とするのが好ましい。固相ブロッキング溶液は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミンなどタンパク質溶液が好ましい。特に、カゼインは、牛乳を精製して得られるタンパク質であり、品質が安定し、安価なので好ましい。また、濃度は１％前後が効率よく固相をブロッキングできるので好ましい。標準のアルブミン溶液にも固相ブロッキング溶液と同じタンパク質溶液を用いるのが好ましく、その濃度も固相ブロッキング溶液と同様にするのが固相との平衡関係を効率よく保つことができるため、好ましい。
【００７４】
以上のように、本発明におけるモノクローナル抗体産生細胞株の作製方法によれば、細胞株のクローニングにおいて、融合細胞から産生される抗体のＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対する結合能を検定し、目的の細胞が選別される。そのため、細胞融合の後、初期に存在する多くの細胞から、効率よく有用な細胞が選択され得る。また、ＣＲＰに対する高い親和性を達成しながら、特異性の高い抗体を産生する細胞株が作製され得る。
【００７５】
免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）である場合、抗体の結合能を簡便に感度良く検定し得る。
【００７６】
哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である場合、抗体の断片を産生せず、さらに得られる融合細胞の増殖能力が特に優れているため、短時間に多くの細胞を検定し得る。
【００７７】
免疫する哺乳動物がマウスまたはラットである場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよい。免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである場合、ＣＲＰとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能となる。
【００７８】
本発明のモノクローナル抗体産生細胞株によれば、それを培養することにより、ＣＲＰに対する高い親和性を有し特異性の高い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を半永久的に提供し得る。
【００７９】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法に使用すれば、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰとに交叉反応せず、高特異的なＣＲＰ検出キットを提供し得る。
【００８０】
また、本発明の抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体は、他の近縁の哺乳類のＣＲＰにもほぼ同様に特異的に結合すると考えられる。このため、他の近縁の哺乳類のＣＲＰの検出および測定にも利用可能であると考えられる。
【００８１】
【実施例】
以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞株の作製についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００８２】
＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
以下の実施例においては、得られた抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価は、ＥＬＩＳＡ法により行なった。その操作法を以下に記載する。
【００８３】
（Ａ）抗原（ＣＲＰ）のコーティング
ＣＲＰを、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（０．０４重量％ナトリウムアジド−リン酸緩衝生理食塩水溶液にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したもの）を用いて、５μｇ／ｍＬの濃度に調製した。マイクロプレート（ポリスチレン製高結合型平底＃２５８０、コスター社製）に抗原溶液を１００μｌ／ウェル注入し、室温で飽和水蒸気中に一晩保存した。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
【００８４】
（Ｂ）ブロッキング
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを２００μｌ／ウェル注入し、３０分間室温で放置した。その後、アスピレータで１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。以降の実験を即日に行なわないときは、この状態で、飽和水蒸気中に４℃で保存した。
【００８５】
（Ｃ）抗体の反応
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで種々の濃度に希釈した抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μｌ／ウェル、および１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０μｌ／ウェルで注入した。相対的な親和性を測定する目的でインヒビション（阻害）実験を行なうときは、インヒビター溶液（ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、または血清アミロイドＰのいずれかを含む溶液）を５０μｌ／ウェル注入した後、抗体溶液５０μｌ／ウェルをさらに加え、振盪した。常温で１時間半放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００８６】
（Ｄ）二次抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＭ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを１００μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００８７】
（Ｅ）基質の反応と停止
Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置した。約３分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反応を停止した。
【００８８】
（Ｆ）測定
マイクロプレートリーダ（東洋ソーダ社製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００８９】
なお、本実施例では免疫測定法として酵素免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等を用いてもよい。
【００９０】
＜実施例１＞
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【００９１】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【００９２】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）４匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ、皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位（皮下）に１００μｌずつ注射した。
【００９３】
その後、免疫開始より４週間後および６週間後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ皮下に注射した。２回目の注射の１週間後と、４回目の注射の１週間後とにそれぞれ採血し、以下に示すように、抗体産生を確認した。
【００９４】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【００９５】
その結果、４匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上でありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【００９６】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった１匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から１０週間後、免疫原のＣＲＰを、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【００９７】
最終免疫後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【００９８】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【００９９】
（細胞選別およびクローニング）
細胞融合後５日目および７日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取し、抗体が産生されているかを、上述したようにＥＬＩＳＡ法により確認した。なお、上清を採取した時には、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を各１００μｌ加えて、培養を継続した。
【０１００】
細胞融合後９日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取すると共に、融合細胞を含む残りの培養液を１２枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を加えた。採取した培養上清は、バインディングＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。バインディングＥＬＩＳＡ法は、抗原（本実施例では、ＣＲＰ）への結合能を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、インヒビターを添加せずに行なった。
【０１０１】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した５日後、細胞培養上清を２００μｌ／ウェルずつ採取した。この培養上清を、バインディングＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１０２】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡ法結果を合わせて、２４４ウェルから、ＣＲＰに対して結合能を有する、増殖状態の良い９３ウェルを選択した。第１段階の選択のために、これらのウェルの細胞を、すべて１６枚の６ウェルプレートに継代した。各ウェルには、４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【０１０３】
これら採取した培養上清を、第１段階の選択として、インヒビションＥＬＩＳＡ法を用いて、ＣＲＰに対する結合能を測定した。インヒビションＥＬＩＳＡ法は、被験物質の、固相結合抗原と溶液相中のインヒビターとの相対的な親和性を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、以下に説明するようにインヒビターを添加して行なった。
【０１０４】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとして、ＣＲＰを使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１０５】
この結果、第２段階の選択のために、ＣＲＰに対して結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡにおいてインヒビションがかかった８つのウェルを選択した。これらのウェルの細胞を第１段階の選択の３日後に、それぞれ中フラスコ（容量５０ｍｌ）に継代した。各ウェルには、１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地４５ｍｌを加えた。
【０１０６】
第１段階の細胞選別の継代３日後、培養上清を採取し、第２段階の選択としてインヒビションＥＬＩＳＡ法を用いて、ＣＲＰに対する結合能を測定した。第２段階の選択に使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法は、以下の通りである。
【０１０７】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ（ＨＵＭＡＮ Ｃ１ｑ ＡＮＴＩＧＥＮ、Ｃａｔ＃：ＡＧ７０４、ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、血清アミロイドＰ（ＡＭＹＬＯＩＤ Ｐ、Ｃａｔ＃：０４９０−２７５２、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ製）のいずれかを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、上清中で可溶化されたインヒビターと結合してインヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１０８】
ＣＲＰでのみインヒビションがかかり、補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰではインヒビションがかからなかった２つのウェルを選別した。
【０１０９】
上記２ウェル中の細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各３枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時、細胞培養上清について上記の第２段階のインヒビションＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１１０】
ＣＲＰに対して高い力価を示し、補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰでインヒビションがかからず、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬ中の培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
【０１１１】
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を２株選定した。
【０１１２】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株の１つを細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号）。
【０１１３】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさないもう１つの株を細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ３と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号）。
【０１１４】
ＭＨ−ＩＩＣ１株およびＭＨ−ＩＩＣ３株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−ＩＩＣ１抗体およびＭＨ−ＩＩＣ３抗体と称する。
【０１１５】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１１６】
（抗体の精製）
選択した株を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、遠心分離して培養上清を得た。この培養上清を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体およびＭＨ−ＩＩＣ３抗体）を精製した。
【０１１７】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１１８】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体およびＭＨ−ＩＩＣ３抗体）の精製画分は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０１１９】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体について、ＣＲＰの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一の条件で抗体評価を行なった。
【０１２０】
図２Ａ〜Ｃは、ＭＨ−ＩＩＣ１抗体について、図３Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−ＩＩＣ３抗体について、それぞれＣＲＰ（図２Ａおよび図３Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図２Ｂおよび図３Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図２Ｃおよび図３Ｃ）に対する結合能力を競争反応（インヒビション反応）で測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）の対数値を示す。
【０１２１】
図２Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ１抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約７×１０−７Ｍであり、２〜３×１０−７ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０１２２】
図３Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ３抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約５×１０−７Ｍであり、２〜３×１０−７ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０１２３】
＜実施例２＞
本実施例においても、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１２４】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１２５】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）１５匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ腹腔内、あるいは皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位に１００μｌずつ注射した。
【０１２６】
その後、免疫開始より４週間後、６週間後、および半年後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを合む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ前回と同じ部位に注射した。２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【０１２７】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１２８】
その結果、１５匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＭからＩｇＧへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【０１２９】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった３匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から６ヶ月後、免疫原のＣＲＰを、ＰＢＳを用いて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【０１３０】
最終免疫後３日を経過したマウスのうち１匹の脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【０１３１】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を合むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート１枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１３２】
（細胞選別およびクローニング）
１週間後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取した。一方、融合細胞を含む残りの培養液を４枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【０１３３】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した４日後、細胞培養上清を１５０μｌ／ウェルずつ採取した。この培養上清と、上述の培養開始後１週間目に採取した培養上清を用いて、以下に示すバインディングＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１３４】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【０１３５】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡの結果を合わせて、ＣＲＰに対して高い結合能を有する、増殖状態の良い５３ウェルを確認した。第１段階の選択として、これらのウェルの細胞を、すべて９枚の６ウェルプレートに継代し、各ウェルに４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【０１３６】
第１段階のための細胞選別の２日後、培養上清を採取し、インヒビションＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰに対する結合能を測定した。第１段階の選択に使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法は、以下の通りである。
【０１３７】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１３８】
この結果、第２段階の選択のために、ＣＲＰに対して高い結合能を示し、インヒビションＥＬＩＳＡ法においてインヒビションがかかったウェルを、２２ウェル選別した。これらのウェルの細胞を、それぞれ中フラスコ（容量５０ｍｌ）に継代した。培地は１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４５ｍｌずつ加えた。
【０１３９】
第１段階の選択を受けた細胞の継代３日後、培養上清を採取し、第２段階の選択としてインヒビションＥＬＩＳＡ法を用いてＣＲＰに対する結合能を測定した。第２段階の選択に使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法は、以下の通りである。
【０１４０】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰ、補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰのいずれかを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、インヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１４１】
ＣＲＰでのみインヒビションがかかり補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰでインヒビションがかからなかったウェルを、２ウェル選別した。また、ＣＲＰと血清アミロイドＰでインヒビションがかかり、補体Ｃ１ｑでインヒビションがかからなかったウェルを、２ウェル選別した。
【０１４２】
上記４ウェルの細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダー細胞として生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１４３】
ＣＲＰに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬ中の培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
【０１４４】
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに対して交叉反応を起こさない株を１株選定した。また、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を１株選定した。
【０１４５】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに対して交叉反応を起こさない株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ３と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号）。
【０１４６】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ４と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号）。
【０１４７】
ＭＨ−Ｃ３株およびＭＨ−Ｃ４株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−Ｃ３抗体およびＭＨ−Ｃ４抗体と称する。
【０１４８】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１４９】
（抗体の精製）
選択した２株を、それぞれ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離した。また、選択した２株を、それぞれ雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させた。蓄積した腹水を採取した。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体およびＭＨ−Ｃ４抗体）を精製した。
【０１５０】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１５１】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３およびＭＨ−Ｃ４）の精製分画は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０１５２】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗体について、ＣＲＰの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一条件で抗体評価を行なった。
【０１５３】
図４Ａ〜Ｃは、ＭＨ−Ｃ３抗体について、図５Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−Ｃ４抗体について、それぞれＣＲＰ（図４Ａおよび図５Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図４Ｂおよび図５Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図４Ｃおよび図５Ｃ）に対する結合能を測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の対数値を示す。
【０１５４】
図４Ａに示すように、ＭＨ−Ｃ３抗体では、インヒビションの半値が約８×１０−９Ｍであり、２〜３×１０−９Ｍ以上のＣＲＰを検出できる可能性が示された。図４Ｂに示すように、補体Ｃ１ｑに対してはインヒビションがかからず、交叉反応しないことが確認できた。一方、図４Ｃに示すように、血清アミロイドＰに対してはインヒビションの半値が約５×１０−８Ｍであり、交叉反応することが示された。従って、このことは、ＭＨ−Ｃ３抗体が、補体Ｃ１ｑには結合能を有さないことを示す。
【０１５５】
図５Ａに示すようにＭＨ−Ｃ４抗体では、インヒビションの半値が約５×１０−１０Ｍであり、２×１０−１０Ｍ程度以上のＣＲＰの検出感度を持つ可能性が示された。図５Ｂおよび図５Ｃに示すように、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対してはインヒビションがかからず、交叉反応しないことが確認できた。このことは、ＭＨ−Ｃ４抗体が、血清アミロイドＰおよび補体Ｃ１ｑに結合能を有さないことを示す。
【０１５６】
＜実施例３＞
本実施例においても、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１５７】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１５８】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）４匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ、皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位（皮下）に１００μｌずつ注射した。
【０１５９】
その後、免疫開始より４週間後および６週間後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ皮下に注射した。２回目の注射の１週間後と、４回目の注射の１週間後とにそれぞれ採血し、以下に示すように、抗体産生を確認した。
【０１６０】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１６１】
その結果、４匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上でありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【０１６２】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった１匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から１０週間後、免疫原のＣＲＰを、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【０１６３】
最終免疫後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【０１６４】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１６５】
（細胞選別およびクローニング）
細胞融合後３日目および６日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル７５μｌ採取し、抗体が産生されているかを、上述したようにＥＬＩＳＡ法により確認した。なお、上清を採取した時には、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を各１００μｌ加えて、培養を継続した。
【０１６６】
細胞融合後８日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル７５μｌ採取すると共に、融合細胞を含む残りの培養液を継代し、４枚の２４ウェルプレートに播いた。なお、培地として、１５重量％のＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を各９００μｌを加えた。
【０１６７】
細胞融合後１２日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル２００μｌ採取した。この培養上清を、バインディングＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧおよびＩｇＭ産生、ならびにインヒビションＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰによるインヒビションを評価した。この結果を受けて５３ウェルを選択し、融合細胞を９枚の６ウェルプレートに継代した。各ウェルには、４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。バインディングＥＬＩＳＡ法は、抗原（本実施例では、ＣＲＰ）への結合能を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、インヒビターを添加せずに行なった。インヒビションＥＬＩＳＡ法は、被験物質の、固相結合抗原と溶液相中のインヒビターとの相対的な親和性を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、以下に説明するようにインヒビターを添加して行なった。固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとして、ＣＲＰを使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１６８】
細胞融合後１４日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１ｍｌ採取した。この培養上清を、バインディングＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧのバインディング、および翌日、インヒビションＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰによるインヒビションを評価した。その結果、ＣＲＰに対して高い結合能を示し、インヒビションＥＬＩＳＡにおいてインヒビションがかかったウェルのうち２３ウェルを選択し、融合細胞を中フラスコ（容量２５０ｍｌ）に継代した。各フラスコには、４５ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【０１６９】
今までの全ての評価データを総合し、細胞融合後１６日目に、４ウェル分を選択した。
【０１７０】
上記４ウェル中の細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時、細胞培養上清について以下に示すようなインヒビションＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１７１】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ（ＨＵＭＡＮ Ｃ１ｑ ＡＮＴＩＧＥＮ、Ｃａｔ＃：ＡＧ７０４、ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、血清アミロイドＰ（ＡＭＹＬＯＩＤ Ｐ、Ｃａｔ＃：０４９０−２７５２、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ製）のいずれかを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、上清中で可溶化されたインヒビターと結合してインヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１７２】
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を１株選定した。また、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに交叉反応を起こさないが、血清アミロイドＰに対して弱い交叉反応を示す株を１株選定した。
【０１７３】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ５と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年９月１８日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号）。
【０１７４】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに交叉反応を起こさないが、血清アミロイドＰに対して弱い交叉反応を示す株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ６と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年９月１８日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号）。
【０１７５】
ＭＨ−Ｃ５株およびＭＨ−Ｃ６株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−Ｃ５抗体およびＭＨ−Ｃ６抗体と称する。
【０１７６】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１７７】
（抗体の精製）
選択した株を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、遠心分離して培養上清を得た。また、選択した２株を、それぞれ雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させ採取した。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体およびＭＨ−Ｃ６抗体）を精製した。
【０１７８】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１７９】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体およびＭＨ−Ｃ６抗体）の精製画分は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０１８０】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体について、ＣＲＰの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一の条件で抗体評価を行なった。
【０１８１】
図６Ａ〜Ｃは、ＭＨ−Ｃ５抗体について、図７Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−Ｃ６抗体について、それぞれＣＲＰ（図６Ａおよび図７Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図６Ｂおよび図７Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図６Ｃおよび図７Ｃ）に対する結合能力を競争反応（インヒビション反応）で測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）の対数値を示す。
【０１８２】
図６Ａに示すように、ＭＨ−Ｃ５抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約１×１０−１０Ｍであり、２〜３×１０−１１ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。図６ＢおよびＣに示すように、ＭＨ−Ｃ５抗体の固相のＣＲＰへの結合は、インヒビターとしてのＣ１ｑおよびアミロイドＰの存在によっては阻害されなかった。このことは、ＭＨ−Ｃ５抗体が血清アミロイドＰおよび補体Ｃ１ｑには結合能を有さないことを示す。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０１８３】
図７Ａに示すように、ＭＨ−Ｃ６抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約３〜５×１０−１０Ｍであり、２×１０−１０ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。図７Ｃに示すように、インヒビターとしてのアミロイドＰによりＭＨ−Ｃ６抗体の固相のＣＲＰへの結合は阻害され、インヒビションがかかるが、このときインヒビションの半値は約１×１０−７Ｍであり、検出限界は約１×１０−８Ｍ程度である。ヒト血清アミロイドＰの正常血漿レベルは約３０ｍｇ／Ｌ、つまり約２．４×１０−７Ｍである。抗体を検査キットに組込むと、通常、様々な要因により抗体の感度が低下する。しかし、ＭＨ−Ｃ６抗体の血清アミロイドＰに対する上記の感度は、この抗体を検査キットに組込んだ場合でも、正常血漿中の血清アミロイドＰとはほとんど反応が起きない感度であるし、交叉性のないＭＨ−Ｃ５のような抗体と共に用いると実用上問題はないと考えられる。
【０１８４】
＜実施例４＞
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１８５】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ， ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ 社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１８６】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）４匹に、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを４００μｌずつ腹腔に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ， ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に４００μｌずつ注射した。
【０１８７】
その後、免疫開始より４週間後および６週間後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを含む不完全フロイントアジュバントを用いて同様に作製したエマルジョンを、マウスに４００μｌずつ皮下に注射した。２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【０１８８】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体産生の確認をした。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ・・ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたものを使用した。第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１８９】
その結果、４匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【０１９０】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で２匹の脾臓を肥大させるために、免疫原のＣＲＰをＰＢＳを用いて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュパントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射し、最終免疫を行なった。
【０１９１】
最終免疫後３日を経過した２匹のマウス（マウス番号＃３−２、＃３−３）それぞれの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１、５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３・
それぞれの融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート各３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１９２】
（細胞選別およびクローニング）
細胞融合後５日目、７日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取し、抗体が産生されているかＥＬＩＳＡ法により確認を行なった。なお、上清を採取した時には、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を各１００μｌ加えて培養を継続した。
【０１９３】
細胞融合後９日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取すると共に、融合細胞を含む残りの培養液を１２枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を加えた。採取した培養上清は、ＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１９４】
その後、数日おきに上清の評価を行なってウェルの選択をすると共にスケールアップを行ない、ＨＴ培地により培養を継続した。
融合細胞を６ウェルプレートに継代した３日後、細胞培養上清を各ウェル２００μｌ／ウェルずつ採取し、以下に示すＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１９５】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ・・抗体液として細胞培養上清を使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、インヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１９６】
ＣＲＰでのみインヒビションがかかり補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰでインヒビションがかからなかったウェルを、マウス番号＃３−２由来分より２ウェル選別し、マウス番号＃３−３由来分より１ウェル選別した。
【０１９７】
上記３ウェルの細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロブレート各３枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１９８】
ＣＲＰに対して高い力価を示し、補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰでインヒビションがかからず、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬ中の培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株をマウス番号＃３−２由来分より２株、マウス番号＃３−３由来分より１株の計３株選定した。
【０１９９】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさないマウス番号＃３−２由来の株の一つを細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ２と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年３月２４日に国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３３８号）。別の株を細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ４と命名し、寄託センターに平成１５年３月２４日に国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３３９号）。
【０２００】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさないマウス番号＃３−３由来の株の一つを細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ５と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年３月２４日に国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４０号）。
ＭＨ−ＩＩＣ２株、ＭＨ−ＩＩＣ４株およびＭＨ−ＩＩＣ５株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−ＩＩＣ２抗体、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体およびＭＨ−ＩＩＣ５抗体と称する。
【０２０１】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して培養上清を取り除き、約１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０２０２】
（抗体の精製）
選択した３株を、それぞれ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離により採取した。各株の培養上清を、リコンビナントプロテインＡ結合ゲル（リコンビナントプロティンＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体、ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）を精製した。
【０２０３】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０２０４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体、ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）の精製分画は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０２０５】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製した３種類のモノクローナル抗体について、ＣＲＰ、血清アミロイドＰ、および補体Ｃ１ｑの希釈系列を用いて、上記の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一条件で抗体評価を行なった。
【０２０６】
図８Ａ〜Ｃは、ＭＨ−ＩＩＣ２抗体について、図９Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−ＩＩＣ４抗体について、図１０Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−ＩＩＣ５抗体について、それぞれＣＲＰ（図８Ａ、図９Ａおよび図１０Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図８Ｂ、図９Ｂおよび図１０Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図８Ｃ、図９Ｃおよび図１０Ｃ）に対する結合能力を競争反応（インヒビション反応）で測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ、以下Ｍと標記する）の対数値を示す。
【０２０７】
図８Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ２抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約１．５×１０・Ｍであり、２〜３×１０・ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０２０８】
図９Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約２．５×１０・Ｍであり、２〜３×１０・ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０２０９】
図１０Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ５抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約２×１０・Ｍであり、２〜３×１０・ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０２１０】
【発明の効果】
本発明により、ＣＲＰの検出および測定を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図２Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ３抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ３抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ３抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ４抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ４抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ４抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ６抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ６抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ６抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ４抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ４抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ４抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体、これを産生する細胞株、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法、およびＣ反応性タンパク質検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰと略称される）は、肺炎患者の血液中に肺炎球菌の莢膜のＣ多糖体とＣａ２＋存在下で沈降反応を示すタンパク質として見出された。ＣＲＰは、分子量約１３万で、五量体であり、電気泳動によりβグロブリン分画に見出される、代表的な急性相反応物質であり、炎症性疾患、体内組織の壊死などがある時に著しく増加する血漿タンパク質である。ＣＲＰは、例えば、細菌またはウイルスでの感染症、慢性関節リュウマチなどの膠原病、悪性腫瘍、心筋梗塞、肝炎、肝硬変などの消化器疾患、あるいは大きな外傷のような広範囲の組織崩壊性疾患等に罹患している被検体では高い検出値を示す。
【０００３】
このため、ＣＲＰの検査は、疾病を特定できるほどではないものの、被検体における組織崩壊性疾患の存在を検出するために非常に有用である。例えば、ＣＲＰ抗体を用いて、体調不良者の事前検査（ＣＲＰとの抗原抗体反応が陽性の場合、疾患を特定するためのさらなる検査を行なう）、ＣＲＰ量の定量による病態スクリーニング、治療効果の確認、予後の判定等を行なうことが出来る。
【０００４】
従来、ＣＲＰを免疫学的手法により特異的に検出するために、ポリクローナル抗体である抗ヒトＣＲＰ血清が用いられている。従来のＣＲＰの検査法のほとんどは、抗血清とＣＲＰとの凝集反応による沈降線の有無または濁度の増加によってＣＲＰを検査する。しかし、未精製の抗血清は、血清中の種々の抗原に対する種々の抗体を含むことが多いため、ＣＲＰ以外の抗原を検出する可能性がある。そこで、検査においてＣＲＰ以外の抗原を誤って検出することを防ぐために、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を用いて抗血清中からヒト標準血清中のタンパク質に結合する抗体を取り除く。このことによって、ヒト標準血清においてＣＲＰ以外の抗原に由来する反応が起こらないようにすることが一般的である。
【０００５】
また、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いて免疫比濁法によりＣＲＰを測定することも開示されている（特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭６２−１９２６６１号公報。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、抗ヒトＣＲＰ血清では、作製される血清毎に得られる抗ヒトＣＲＰ抗体群が異なる。このため、ＣＲＰとの反応性が変動するおそれがある。さらに、抗ヒトＣＲＰ血清を用いたヒトＣＲＰの検出は、操作が煩雑であり、またＣＲＰの定量も容易ではない。
【０００８】
また、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いて免疫比濁法によりＣＲＰを測定することが上記特許文献１に開示されているが、実際には、抗ＣＲＰモノクローナル抗体とＣＲＰとの凝集時に、それぞれの分子間の立体障害の影響などがある場合には、ＣＲＰの定量が困難になることがある。
【０００９】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、ＣＲＰの検出および測定を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法は、Ｃ反応性タンパク質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程（ａ）と、上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、Ｃ反応性タンパク質、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、Ｃ反応性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程（ｂ）とを含む。
【００１１】
本発明によれば、各細胞株から産生されるモノクローナル抗体について、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する。このため、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する交叉反応性が非常に低い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を選択することができる。従って、ＣＲＰの検出および定量を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することができる。
【００１２】
上記工程（ｂ）において、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない、モノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜することが好ましい。
【００１３】
本発明の細胞株は、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しないモノクローナル抗体を産生する。
【００１４】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号であってもよい。
【００１５】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号であってもよい。
【００１６】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号であってもよい。
【００１７】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号であってもよい。
【００１８】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号であってもよい。
【００１９】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号であってもよい。
【００２０】
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
上記細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
本発明の抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体は、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない。
【００２１】
本発明のＣ反応性タンパク質検出キットは、試料液中のＣ反応性タンパク質を検出するためのＣ反応性タンパク質検出キットであって、第１の抗体および第２の抗体を含み、上記第１の抗体が、抗Ｃ反応性タンパク質抗体であり、上記第２の抗体が、標識された抗Ｃ反応性タンパク質抗体であり、上記第１の抗体または上記第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体である。
【００２２】
本発明のＣ反応性タンパク質検出キットでは、第１の抗体または第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対しても結合能を有する抗体の存在量が大幅に減少する。従って、第１の抗体と第２の抗体とがほぼ確実にＣＲＰを挟んでサンドイッチ状に結合し、抗原抗体反応による複合体を形成する。従って、例えば、従来の分光学的手段を用いる免疫測定法（免疫比濁法、免疫比ろう法等）に本発明のキットを適用することによって、ＣＲＰを高感度で正確に測定することができる。
【００２３】
上記第１の抗体が、固相に固定化されており、上記第２の抗体が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であり、且つ移動相に含まれている。
【００２４】
第２の抗体が補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰの存在を示す標識が検出されなくなる。従って、より高い感度で正確にＣＲＰを検出および測定することができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２６】
簡便な方法でＣＲＰの定量を行なうため、モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ方式の免疫クロマトグラフィーがよく利用される。
【００２７】
サンドイッチ方式の免疫クロマトグラフィーでは、２種類の抗体を用い、まず一方を固相に固定化しておく。次に標識したもう一方の抗体とＣＲＰを反応させた後、これを移動相として固相部分に対して流す。その結果、２種類の抗体はＣＲＰを介してサンドイッチ状に結合する。従って、ＣＲＰが存在する場合にのみ固相上で標識が確認される。
【００２８】
ＣＲＰは、５個のペプチドが繰り返されている５量体（ペンタマー）であり、分子量約１３万である。このため、ＣＲＰを挟んでサンドイッチ状に結合出来る抗体のペアを得ることは比較的容易である。しかし、本発明者らは、モノクローナル抗体を用いる場合、抗体が均一であるため、抗体の交叉反応性は、ポリクローナル抗体のみを用いる場合と比較して非常に大きな問題となることに気付いた。
【００２９】
ＣＲＰのアミノ酸配列は、血清アミロイドＰのアミノ酸配列と５１％の相同性があり、また、ＣＲＰは、補体Ｃ１ｑのアミノ酸配列の一部分と相同性があることが知られている。そのため、ＣＲＰに対する抗体の中には、ＣＲＰだけでなく補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対しても結合能を有する抗体が存在し得る。このような抗体をサンドイッチ法に用いると、ＣＲＰの正確な定量に支障をきたす恐れがある。従って、本発明者らは、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する交叉反応性が可能な限り低い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いる必要があると考察した。
【００３０】
そこで、本実施形態では、次に述べる方法で、抗ＣＲＰモノクローナル抗体およびこれを産生する細胞株を作製する。本実施形態の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の作製方法を、図１を参照しながら説明する。
【００３１】
図１に示すように、本実施形態の抗ＣＲＰモノクローナル抗体の作製方法は、ＣＲＰで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程Ｓｔ１と、上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程Ｓｔ２とを含む。
【００３２】
本実施形態の方法によれば、各細胞株から産生されるモノクローナル抗体について、ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する。このため、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する交叉反応性が非常に低い抗ＣＲＰモノクローナル抗体が得られる。従って、ＣＲＰの検出および定量を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することができる。
【００３３】
上記工程Ｓｔ２において、ＣＲＰに対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない、モノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜することが好ましい。
【００３４】
次に、各工程の詳細を順に説明する。なお、本実施形態においては、特に指示のない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用して行なうことができる。また、以下の説明で記載されているＣＲＰ、血清アミロイドＰ、および補体Ｃ１ｑは、すべてヒト由来のものである。 なお、本実施形態では、ヒトのＣＲＰ、およびそれに特異的に結合する抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体について説明するが、本発明は、ヒト以外の哺乳類（イヌ、ネコ、ウシ、ウマなど）のＣＲＰに特異的に結合する抗ＣＲＰモノクローナル抗体にも、全く同様に適用可能である。
【００３５】
まず、工程Ｓｔ１の詳細を説明する。
【００３６】
（免疫）
哺乳動物をＣＲＰで免疫することによって、動物体内で抗体産生細胞を調製する。
【００３７】
「哺乳動物」の例として、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギが挙げられる。哺乳動物は、好ましくはマウスおよびラットであり、より好ましくはマウスである。免疫する哺乳動物がマウスまたはラットである場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよい。マウスの例として、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウスが挙げられる。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後に血清中に高い抗体力価を示すので、ＣＲＰとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能である。血中抗体力価が、特異的なハイブリドーマの出来易さと関係していることは公知である。また、細胞株の確立後の腹水による抗体大量作製においては、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが一般によく使用される。以上により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、ＣＲＰの免疫に好ましい例である。実験動物の齢は、特に限定されないが、代表的には、約４週齢〜約１２週齢のマウスまたはラットであり、好ましくは約６〜約１０週齢のマウスまたはラットであり、より好ましくは約７週齢のマウスまたはラットである。
【００３８】
免疫に用いられるＣＲＰは、ヒトＣＲＰ、そのモノマーサブユニット、またはそのフラグメントが用いられ、ヒトの血清から精製してもよいし、市販のものを用いてもよい。ＣＲＰは、通常、約８０％以上の純度、好ましくは約９０％以上の純度、さらに好ましくは約９５％以上の純度、そして最も好ましくは約９８％以上の純度で用いられる。
【００３９】
免疫の前に、ＣＲＰは、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合され得る。アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト、およびタピオカアジュバントの他に、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓなどの菌体、細胞壁およびトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）などの菌体成分；グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；β−グルカン（多糖体）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ベスタチン；レバミゾールなどの合成化合物；胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子およびタフトシンなどの生体成分由来のタンパク質またはペプチド性物質；ならびにそれらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）などが挙げられる。
【００４０】
これらのアジュバントは、投与経路、投与量、投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制に効果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗原に対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロブリンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的とする免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択することが好ましい。選択されたアジュバントの取扱い、例えばＣＲＰとの混合方法などは当該分野で公知である。
【００４１】
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行なわれる。例えば、抗原であるＣＲＰは、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射され得る。免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によって異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物に合わせて適切に変更され得る。抗原投与は、最初の免疫の後に、何回か繰り返され得る。このような抗原投与を、追加免疫（ブースト）と称する。追加免疫は、例えば、最初の免疫から２週間後、４週間後、および６週間後に行なわれ得る。
【００４２】
（抗体産生の確認）
免疫後、哺乳動物から採血し、得られた血液をＣＲＰ結合活性の存在についてアッセイすることにより、哺乳動物の体内でＣＲＰに対する抗体が産生されていること、および免疫末期にはＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認する（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【００４３】
適切なアッセイ方法の例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法が挙げられる。本発明では、ＣＲＰに対して高親和性を有する抗ＣＲＰモノクローナル抗体を得ることが望ましい。高親和性のモノクローナル抗体産生細胞を得るためには、抗血清の時点で高い抗体価を示している必要がある。
【００４４】
（ブースト）
ＣＲＰ結合性抗体の産生を確認した後、脾臓を肥大させるために、免疫原の追加投与を行ない得る。免疫原の追加投与（ブースト）で投与されるＣＲＰの量は、最初に免疫されるＣＲＰの量の約４〜５倍の量が望ましいが、これに限定されない。
【００４５】
ブーストは、代表的には、ＣＲＰと不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンを用いて行なわれる。ただし、最終免疫（細胞融合数日前の免疫原の追加投与）で投与されるＣＲＰとしては、アジュバントを加えない、純粋品を用いることが好ましい。投与経路は、皮下、皮内、静脈、または腹腔内それぞれの投与によって、ＣＲＰの異なった部位を認識する抗体が得られる可能性があることを考慮して、適宜決定される。
【００４６】
（細胞融合）
最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株と細胞融合する。
【００４７】
融合細胞の増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、細胞融合には、増殖能力の優れた細胞株を用いることが好ましい。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。骨髄腫由来の細胞株は、新たに調製してもよいし、市販のものを使用してもよい。マウスの骨髄腫由来の細胞株としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０．ＢＵ．１、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１などが挙げられる。抗体の断片を産生せず、かつ融合細胞の増殖能力が優れたものとなるため、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の使用が好ましい。従って、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である場合、短時間に多くの細胞を検定し得る。ラット骨髄腫由来の細胞株としては、２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ．１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げられる。
【００４８】
細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行なわれる（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５［１９７５］、Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２、Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、７７−９６頁［１９８５］などを参照のこと）。細胞融合法の例として、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが挙げられる。細胞毒性も比較的少なく、融合操作も容易で再現性が高いため、ポリエチレングリコール法が好ましい。
【００４９】
得られた融合細胞は、当該分野で公知の条件に従って増殖させ得る。産生される抗体の結合能に基づいて、所望の融合細胞を選択し得る。
【００５０】
以上の内容が、工程Ｓｔ１の詳細である。次に、工程Ｓｔ２の詳細を説明する。
【００５１】
（細胞選別およびクローニング）
融合細胞から産生される抗体の結合能は、当該分野で公知の方法に基づいてアッセイされ得る。本発明においては、ＣＲＰに特異的に結合する抗体を産生する融合細胞を得るために、ＣＲＰ、ならびに上述したようにＣＲＰと相同性の高いタンパク質である、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対する結合能に基づく選別を利用して、目的の細胞株がクローニングされる。本明細書中で「ＣＲＰに対して特異的に結合する抗体」とは、ＣＲＰに結合能を有する抗体をいう。このような「特異的に結合する抗体」は、ＣＲＰと最もよく反応し、本抗体が使用される一般的な状況において通常考えられるＣＲＰ以外の物質との反応とは区別可能である。
【００５２】
結合能の評価はインヒビションＥＬＩＳＡ法によって行なわれ得る。本明細書で用いる用語「結合能を有する」は、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１０−６Ｍ以下であることをいう。好ましくは、このインヒビションの半値は、約１０−７Ｍ以下であり、より好ましくは、約１０−８Ｍ以下であり、さらにより好ましくは、約１０−９Ｍ以下である。なおより好ましくは、約１０−１０Ｍ以下である。本明細書で用いる用語「結合能を有さない」は、同じ測定においてインヒビションがかからないことをいう。用語「インヒビションがかかる」とは、固相に固定されたＣＲＰに結合する抗体の量が、競合物質（インヒビター）の存在下で、インヒビターの不在下と比較して減少することをいう。用語「インヒビションがかからない」とは、固相に固定されたＣＲＰに結合する抗体の量が、インヒビターの存在下および不在下で実質的に同等であることをいう。「インヒビションの半値」とは、インヒビターの不在下での吸光度（抗体結合量を反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの濃度をいう。
【００５３】
抗体の結合能は、抗体産生の確認に関して上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイされる。簡便に感度よく抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００５４】
融合細胞のクローニングには、当該分野で公知の方法が用いられ得る。クローニングの方法の例としては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられる。操作も容易で数多くの実績があり、再現性が高いため、限界希釈法が好ましい。
【００５５】
細胞融合により得られた多くの融合細胞の中から、効率よく有用な細胞を選択するために、細胞選別は、クローニングの初期の段階から行なうことが好ましい。
【００５６】
このようにして、望ましい結合能を有する抗体を産生する融合細胞株が最終的に選別される。選別された細胞株は、液体窒素中で半永久的に保存され得る。本発明のモノクローナル抗体産生細胞株によれば、それを培養することによりＣＲＰに対する高い親和性を有し特異性の高い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を半永久的に提供し得る。
【００５７】
以上の内容が工程Ｓｔ２の詳細である。さらに、工程Ｓｔ２の後には以下に述べる工程が行なうことが好ましい。
【００５８】
（抗体の精製）
上記のようにして選別されたモノクローナル抗体産生細胞株を大量培養することにより、ＣＲＰに対して特異的に結合するモノクローナル抗体を大量に産生し得る。モノクローナル抗体産生細胞株の大量培養方法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙げられる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動物の腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養では、融合細胞が培地中で培養され、抗体が培地中に産生される。
【００５９】
大量培養により得られた腹水または培養上清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を精製し得る。精製のためには、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などが適宜組み合わせて用いられる。本発明の抗体は、通常、約９０％の純度、好ましくは約９５％の純度、より好ましくは約９８％の純度となるように精製される。
【００６０】
（抗体の評価）
精製されたモノクローナル抗体の結合能を評価するために、ＥＬＩＳＡプレートにＣＲＰを吸着させ、得られたいくつかの抗体を反応させ、ＣＲＰでインヒビションを行なうことにより、結合能の高い抗体を選択した。結合能の高い抗体はＣＲＰに対して高い感度の検出をするために有用である。
【００６１】
以上のようにして、本発明の細胞株および抗体は作製され得る。本発明の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、ＣＲＰに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＣＲＰに対して結合能を有するモノクローナル抗体である。本発明の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体のＣＲＰに対する結合能は、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１０−６Ｍ以下であり、好ましくは、約１０−７Ｍ以下であり、より好ましくは、約１０−８Ｍ以下であり、さらにより好ましくは、約１０−９Ｍ以下であり、なおより好ましくは、約１０−１０Ｍ以下である。このような抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、代表的には、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号（ＭＨ−Ｃ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭＢＰ−８１８６号（ＭＨ−Ｃ６）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・ＥＲＭ ＢＰ・・
この抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、好ましくは、ＣＲＰに対して結合能を有し、かつ補体１Ｃｑおよび血清アミロイドＰに対して結合能を有さないモノクローナル抗体である。すなわち、ＣＲＰに対しては、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１０−６Ｍ以下、好ましくは、このインヒビションの半値は、約１０−７Ｍ以下、より好ましくは、約１０−８Ｍ以下であり、さらにより好ましくは、約１０−９Ｍ以下、なおより好ましくは、約１０−１０Ｍ以下であるが、補体１Ｃｑおよび血清アミロイドＰに対しては、下記の実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかからない。このような抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・・・
本発明による「抗ＣＲＰモノクローナル抗体」には、その結合特性を保持した機能性の断片もまた含まれる。これらの断片は、それらが由来するインタクトな抗体とＣＲＰへの特異的結合について競合し得、少なくとも１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性で結合し得る。抗体の断片は、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。抗体の断片は、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生じ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化することによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）２断片から、あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体から得ることができる（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２版 Ｒａｖａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第７章を参照のこと）。
【００６２】
本発明はまた、ＣＲＰを検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、抗原抗体結合反応に基づいて試料液中のＣＲＰを高感度に検出し得る。本発明のキットは、第１の抗体および第２の抗体を含み、第１の抗体が、抗ＣＲＰ抗体であり、第２の抗体が、標識された抗ＣＲＰ抗体である。特に、第１の抗体または第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体である。
【００６３】
つまり、一方の抗体として上述したようなＣＲＰに対して結合能を有し、かつ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対して結合能を有さないモノクローナル抗体を用い、他方の抗体としては、ＣＲＰに結合能を有する限り任意の抗体を使用し得る（これは、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい）。このような他方の抗体としては、市販により入手可能である従来の抗体も、使用され得る。好ましくはモノクローナル抗体が用いられ得る。
【００６４】
本発明のキットでは、第１の抗体または第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗ＣＲＰモノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対しても結合能を有する抗体の存在量が大幅に減少する。従って、第１の抗体と第２の抗体とがほぼ確実にＣＲＰを挟んでサンドイッチ状に結合し、抗原抗体反応による複合体を形成する。従って、例えば、従来の分光学的手段を用いる免疫測定法（免疫比濁法、免疫比ろう法等）に本発明のキットを適用することによって、ＣＲＰを高感度で正確に測定することができる。
【００６５】
本実施形態において、上述の方法で作製された「抗ＣＲＰモノクローナル抗体」は、本発明のキットの第１の抗体および第２の抗体として使用され得る。このような抗体としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号（ＭＨ−Ｃ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号（ＭＨ−Ｃ６）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・・・のみ結合能を有することが特に望ましい。従って、ＣＲＰに対して結合能を有し、かつ補体１Ｃｑおよび血清アミロイドＰに対して結合能を有さないモノクローナル抗体が好ましい。独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）号、同受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ・・８３３９号（ＭＨ−ＩＩＣ４）、または同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・
本発明のキットにおいて、第１の抗体および第２の抗体は、サンドイッチ反応において、第２の抗体が、第１の抗体が結合しなかった抗原上のエピトープを認識し、そこに結合し得るような任意の組み合わせで含まれる。第２の抗体は、第１の抗体が結合するエピトープに結合能を有さない抗体であることが好ましい。ＣＲＰは５量体であるので、第１の抗体および第２の抗体は同じ種類の抗体であってもよい。
【００６６】
また、本発明のキットにおいて、第１の抗体が、固相に固定化されており、第２の抗体が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であり、且つ移動相に含まれているキットとしてもよい。
【００６７】
ＣＲＰは、５量体を構成する各モノマー上にエピトープを有し得るので、サンドイッチ反応において、固定化された抗体および移動相中の標識抗体は、１つのＣＲＰ抗原について別個の構成モノマー上に存在するエピトープに結合し得る。特に、第２の抗体が補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であるので、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰの存在を示す標識が検出されなくなる。従って、より高い感度で正確にＣＲＰを検出および測定することができる。
【００６８】
本発明のキットにおいて、例えば、第１の抗体と第２の抗体の組み合わせとして、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号（ＭＨ−Ｃ３）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号（ＭＨ−Ｃ６）、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・・・できる。
【００６９】
上述の説明は、「第１の抗体」を「第２の抗体」と交換して用いる場合にも適用される。
【００７０】
本発明のキットにおいてはまた、第１の抗体および第２の抗体がともに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号（ＭＨ−ＩＩＣ１）の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体であり得る。
【００７１】
同様に、本発明のキットにおいては、第１の抗体および第２の抗体がともに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号（ＭＨ−ＩＩＣ３））の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体であってもよく、同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号（ＭＨ−Ｃ４）の細胞株により産生される抗ＣＲＰモノクローナル抗体であっても、そして同受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号（ＭＨ−Ｃ５）、同受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ・・・
第２の抗体は、当該分野で公知の方法により任意の標識により標識され得る。標識の例としては、酵素標識、色素標識、磁性標識、放射性標識、色の付いた粒子（金コロイド、ラテックスなど）による標識などが挙げられる。
【００７２】
通常、上記第１の抗体は、キットの固相（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に固定化され得、そして上記第２の抗体は、移動相として使用され得る。
【００７３】
本発明のキットは、当該分野で公知の方法により適切に作製され得る。本発明のキットは、１つまたはそれ以上の容器中に上記第１の抗体および上記第２の抗体を含み得る。キットはまた、ＣＲＰのサンドイッチアッセイにおける、抗体の使用を教示する説明教材を含み得る。キットは、標識の検出のため、または陽性コントロールおよび陰性コントロールを検出するための適切な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液などを含み得る。キットは、固相に吸着させるための固相抗原溶液、固相ブロッキング溶液、および検量線を作成するための標準ＣＲＰ溶液を含み得る。すべての溶液は生体内と類似の環境をつくるため、ＰＢＳ−Ａｚ（リン酸緩衝生理食塩水−アジ化ナトリウム溶液）を溶媒とするのが好ましい。固相ブロッキング溶液は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミンなどタンパク質溶液が好ましい。特に、カゼインは、牛乳を精製して得られるタンパク質であり、品質が安定し、安価なので好ましい。また、濃度は１％前後が効率よく固相をブロッキングできるので好ましい。標準のアルブミン溶液にも固相ブロッキング溶液と同じタンパク質溶液を用いるのが好ましく、その濃度も固相ブロッキング溶液と同様にするのが固相との平衡関係を効率よく保つことができるため、好ましい。
【００７４】
以上のように、本発明におけるモノクローナル抗体産生細胞株の作製方法によれば、細胞株のクローニングにおいて、融合細胞から産生される抗体のＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対する結合能を検定し、目的の細胞が選別される。そのため、細胞融合の後、初期に存在する多くの細胞から、効率よく有用な細胞が選択され得る。また、ＣＲＰに対する高い親和性を達成しながら、特異性の高い抗体を産生する細胞株が作製され得る。
【００７５】
免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）である場合、抗体の結合能を簡便に感度良く検定し得る。
【００７６】
哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である場合、抗体の断片を産生せず、さらに得られる融合細胞の増殖能力が特に優れているため、短時間に多くの細胞を検定し得る。
【００７７】
免疫する哺乳動物がマウスまたはラットである場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよい。免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである場合、ＣＲＰとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能となる。
【００７８】
本発明のモノクローナル抗体産生細胞株によれば、それを培養することにより、ＣＲＰに対する高い親和性を有し特異性の高い抗ＣＲＰモノクローナル抗体を半永久的に提供し得る。
【００７９】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法に使用すれば、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰとに交叉反応せず、高特異的なＣＲＰ検出キットを提供し得る。
【００８０】
また、本発明の抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体は、他の近縁の哺乳類のＣＲＰにもほぼ同様に特異的に結合すると考えられる。このため、他の近縁の哺乳類のＣＲＰの検出および測定にも利用可能であると考えられる。
【００８１】
【実施例】
以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞株の作製についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００８２】
＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
以下の実施例においては、得られた抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価は、ＥＬＩＳＡ法により行なった。その操作法を以下に記載する。
【００８３】
（Ａ）抗原（ＣＲＰ）のコーティング
ＣＲＰを、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（０．０４重量％ナトリウムアジド−リン酸緩衝生理食塩水溶液にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したもの）を用いて、５μｇ／ｍＬの濃度に調製した。マイクロプレート（ポリスチレン製高結合型平底＃２５８０、コスター社製）に抗原溶液を１００μｌ／ウェル注入し、室温で飽和水蒸気中に一晩保存した。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
【００８４】
（Ｂ）ブロッキング
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを２００μｌ／ウェル注入し、３０分間室温で放置した。その後、アスピレータで１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。以降の実験を即日に行なわないときは、この状態で、飽和水蒸気中に４℃で保存した。
【００８５】
（Ｃ）抗体の反応
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで種々の濃度に希釈した抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μｌ／ウェル、および１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０μｌ／ウェルで注入した。相対的な親和性を測定する目的でインヒビション（阻害）実験を行なうときは、インヒビター溶液（ＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ、または血清アミロイドＰのいずれかを含む溶液）を５０μｌ／ウェル注入した後、抗体溶液５０μｌ／ウェルをさらに加え、振盪した。常温で１時間半放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００８６】
（Ｄ）二次抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＭ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを１００μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００８７】
（Ｅ）基質の反応と停止
Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置した。約３分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反応を停止した。
【００８８】
（Ｆ）測定
マイクロプレートリーダ（東洋ソーダ社製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００８９】
なお、本実施例では免疫測定法として酵素免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等を用いてもよい。
【００９０】
＜実施例１＞
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【００９１】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【００９２】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）４匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ、皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位（皮下）に１００μｌずつ注射した。
【００９３】
その後、免疫開始より４週間後および６週間後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ皮下に注射した。２回目の注射の１週間後と、４回目の注射の１週間後とにそれぞれ採血し、以下に示すように、抗体産生を確認した。
【００９４】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【００９５】
その結果、４匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上でありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【００９６】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった１匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から１０週間後、免疫原のＣＲＰを、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【００９７】
最終免疫後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【００９８】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【００９９】
（細胞選別およびクローニング）
細胞融合後５日目および７日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取し、抗体が産生されているかを、上述したようにＥＬＩＳＡ法により確認した。なお、上清を採取した時には、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を各１００μｌ加えて、培養を継続した。
【０１００】
細胞融合後９日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取すると共に、融合細胞を含む残りの培養液を１２枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を加えた。採取した培養上清は、バインディングＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。バインディングＥＬＩＳＡ法は、抗原（本実施例では、ＣＲＰ）への結合能を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、インヒビターを添加せずに行なった。
【０１０１】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した５日後、細胞培養上清を２００μｌ／ウェルずつ採取した。この培養上清を、バインディングＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１０２】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡ法結果を合わせて、２４４ウェルから、ＣＲＰに対して結合能を有する、増殖状態の良い９３ウェルを選択した。第１段階の選択のために、これらのウェルの細胞を、すべて１６枚の６ウェルプレートに継代した。各ウェルには、４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【０１０３】
これら採取した培養上清を、第１段階の選択として、インヒビションＥＬＩＳＡ法を用いて、ＣＲＰに対する結合能を測定した。インヒビションＥＬＩＳＡ法は、被験物質の、固相結合抗原と溶液相中のインヒビターとの相対的な親和性を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、以下に説明するようにインヒビターを添加して行なった。
【０１０４】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとして、ＣＲＰを使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１０５】
この結果、第２段階の選択のために、ＣＲＰに対して結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡにおいてインヒビションがかかった８つのウェルを選択した。これらのウェルの細胞を第１段階の選択の３日後に、それぞれ中フラスコ（容量５０ｍｌ）に継代した。各ウェルには、１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地４５ｍｌを加えた。
【０１０６】
第１段階の細胞選別の継代３日後、培養上清を採取し、第２段階の選択としてインヒビションＥＬＩＳＡ法を用いて、ＣＲＰに対する結合能を測定した。第２段階の選択に使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法は、以下の通りである。
【０１０７】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ（ＨＵＭＡＮ Ｃ１ｑ ＡＮＴＩＧＥＮ、Ｃａｔ＃：ＡＧ７０４、ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、血清アミロイドＰ（ＡＭＹＬＯＩＤ Ｐ、Ｃａｔ＃：０４９０−２７５２、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ製）のいずれかを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、上清中で可溶化されたインヒビターと結合してインヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１０８】
ＣＲＰでのみインヒビションがかかり、補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰではインヒビションがかからなかった２つのウェルを選別した。
【０１０９】
上記２ウェル中の細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各３枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時、細胞培養上清について上記の第２段階のインヒビションＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１１０】
ＣＲＰに対して高い力価を示し、補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰでインヒビションがかからず、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬ中の培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
【０１１１】
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を２株選定した。
【０１１２】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株の１つを細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号）。
【０１１３】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさないもう１つの株を細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ３と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号）。
【０１１４】
ＭＨ−ＩＩＣ１株およびＭＨ−ＩＩＣ３株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−ＩＩＣ１抗体およびＭＨ−ＩＩＣ３抗体と称する。
【０１１５】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１１６】
（抗体の精製）
選択した株を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、遠心分離して培養上清を得た。この培養上清を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体およびＭＨ−ＩＩＣ３抗体）を精製した。
【０１１７】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１１８】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体およびＭＨ−ＩＩＣ３抗体）の精製画分は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０１１９】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体について、ＣＲＰの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一の条件で抗体評価を行なった。
【０１２０】
図２Ａ〜Ｃは、ＭＨ−ＩＩＣ１抗体について、図３Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−ＩＩＣ３抗体について、それぞれＣＲＰ（図２Ａおよび図３Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図２Ｂおよび図３Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図２Ｃおよび図３Ｃ）に対する結合能力を競争反応（インヒビション反応）で測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）の対数値を示す。
【０１２１】
図２Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ１抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約７×１０−７Ｍであり、２〜３×１０−７ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０１２２】
図３Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ３抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約５×１０−７Ｍであり、２〜３×１０−７ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０１２３】
＜実施例２＞
本実施例においても、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１２４】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１２５】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）１５匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ腹腔内、あるいは皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位に１００μｌずつ注射した。
【０１２６】
その後、免疫開始より４週間後、６週間後、および半年後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを合む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ前回と同じ部位に注射した。２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【０１２７】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１２８】
その結果、１５匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＭからＩｇＧへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【０１２９】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった３匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から６ヶ月後、免疫原のＣＲＰを、ＰＢＳを用いて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【０１３０】
最終免疫後３日を経過したマウスのうち１匹の脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【０１３１】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を合むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート１枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１３２】
（細胞選別およびクローニング）
１週間後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取した。一方、融合細胞を含む残りの培養液を４枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【０１３３】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した４日後、細胞培養上清を１５０μｌ／ウェルずつ採取した。この培養上清と、上述の培養開始後１週間目に採取した培養上清を用いて、以下に示すバインディングＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１３４】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【０１３５】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡの結果を合わせて、ＣＲＰに対して高い結合能を有する、増殖状態の良い５３ウェルを確認した。第１段階の選択として、これらのウェルの細胞を、すべて９枚の６ウェルプレートに継代し、各ウェルに４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【０１３６】
第１段階のための細胞選別の２日後、培養上清を採取し、インヒビションＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰに対する結合能を測定した。第１段階の選択に使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法は、以下の通りである。
【０１３７】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１３８】
この結果、第２段階の選択のために、ＣＲＰに対して高い結合能を示し、インヒビションＥＬＩＳＡ法においてインヒビションがかかったウェルを、２２ウェル選別した。これらのウェルの細胞を、それぞれ中フラスコ（容量５０ｍｌ）に継代した。培地は１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４５ｍｌずつ加えた。
【０１３９】
第１段階の選択を受けた細胞の継代３日後、培養上清を採取し、第２段階の選択としてインヒビションＥＬＩＳＡ法を用いてＣＲＰに対する結合能を測定した。第２段階の選択に使用したインヒビションＥＬＩＳＡ法は、以下の通りである。
【０１４０】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰ、補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰのいずれかを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、インヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１４１】
ＣＲＰでのみインヒビションがかかり補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰでインヒビションがかからなかったウェルを、２ウェル選別した。また、ＣＲＰと血清アミロイドＰでインヒビションがかかり、補体Ｃ１ｑでインヒビションがかからなかったウェルを、２ウェル選別した。
【０１４２】
上記４ウェルの細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダー細胞として生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１４３】
ＣＲＰに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬ中の培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
【０１４４】
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに対して交叉反応を起こさない株を１株選定した。また、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を１株選定した。
【０１４５】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに対して交叉反応を起こさない株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ３と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号）。
【０１４６】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ４と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号）。
【０１４７】
ＭＨ−Ｃ３株およびＭＨ−Ｃ４株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−Ｃ３抗体およびＭＨ−Ｃ４抗体と称する。
【０１４８】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１４９】
（抗体の精製）
選択した２株を、それぞれ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離した。また、選択した２株を、それぞれ雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させた。蓄積した腹水を採取した。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体およびＭＨ−Ｃ４抗体）を精製した。
【０１５０】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１５１】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３およびＭＨ−Ｃ４）の精製分画は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０１５２】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗体について、ＣＲＰの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一条件で抗体評価を行なった。
【０１５３】
図４Ａ〜Ｃは、ＭＨ−Ｃ３抗体について、図５Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−Ｃ４抗体について、それぞれＣＲＰ（図４Ａおよび図５Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図４Ｂおよび図５Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図４Ｃおよび図５Ｃ）に対する結合能を測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）の対数値を示す。
【０１５４】
図４Ａに示すように、ＭＨ−Ｃ３抗体では、インヒビションの半値が約８×１０−９Ｍであり、２〜３×１０−９Ｍ以上のＣＲＰを検出できる可能性が示された。図４Ｂに示すように、補体Ｃ１ｑに対してはインヒビションがかからず、交叉反応しないことが確認できた。一方、図４Ｃに示すように、血清アミロイドＰに対してはインヒビションの半値が約５×１０−８Ｍであり、交叉反応することが示された。従って、このことは、ＭＨ−Ｃ３抗体が、補体Ｃ１ｑには結合能を有さないことを示す。
【０１５５】
図５Ａに示すようにＭＨ−Ｃ４抗体では、インヒビションの半値が約５×１０−１０Ｍであり、２×１０−１０Ｍ程度以上のＣＲＰの検出感度を持つ可能性が示された。図５Ｂおよび図５Ｃに示すように、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに対してはインヒビションがかからず、交叉反応しないことが確認できた。このことは、ＭＨ−Ｃ４抗体が、血清アミロイドＰおよび補体Ｃ１ｑに結合能を有さないことを示す。
【０１５６】
＜実施例３＞
本実施例においても、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１５７】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１５８】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）４匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ、皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ，ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位（皮下）に１００μｌずつ注射した。
【０１５９】
その後、免疫開始より４週間後および６週間後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ皮下に注射した。２回目の注射の１週間後と、４回目の注射の１週間後とにそれぞれ採血し、以下に示すように、抗体産生を確認した。
【０１６０】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した５μｇ／ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１６１】
その結果、４匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上でありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【０１６２】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった１匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から１０週間後、免疫原のＣＲＰを、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【０１６３】
最終免疫後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【０１６４】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１６５】
（細胞選別およびクローニング）
細胞融合後３日目および６日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル７５μｌ採取し、抗体が産生されているかを、上述したようにＥＬＩＳＡ法により確認した。なお、上清を採取した時には、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を各１００μｌ加えて、培養を継続した。
【０１６６】
細胞融合後８日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル７５μｌ採取すると共に、融合細胞を含む残りの培養液を継代し、４枚の２４ウェルプレートに播いた。なお、培地として、１５重量％のＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を各９００μｌを加えた。
【０１６７】
細胞融合後１２日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル２００μｌ採取した。この培養上清を、バインディングＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧおよびＩｇＭ産生、ならびにインヒビションＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰによるインヒビションを評価した。この結果を受けて５３ウェルを選択し、融合細胞を９枚の６ウェルプレートに継代した。各ウェルには、４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。バインディングＥＬＩＳＡ法は、抗原（本実施例では、ＣＲＰ）への結合能を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、インヒビターを添加せずに行なった。インヒビションＥＬＩＳＡ法は、被験物質の、固相結合抗原と溶液相中のインヒビターとの相対的な親和性を測定するものであり、上述の＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞節の記載に従って、以下に説明するようにインヒビターを添加して行なった。固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとして、ＣＲＰを使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＣＲＰに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＣＲＰと結合してインヒビションがかかる（固相ＣＲＰへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１６８】
細胞融合後１４日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１ｍｌ採取した。この培養上清を、バインディングＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧのバインディング、および翌日、インヒビションＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰによるインヒビションを評価した。その結果、ＣＲＰに対して高い結合能を示し、インヒビションＥＬＩＳＡにおいてインヒビションがかかったウェルのうち２３ウェルを選択し、融合細胞を中フラスコ（容量２５０ｍｌ）に継代した。各フラスコには、４５ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【０１６９】
今までの全ての評価データを総合し、細胞融合後１６日目に、４ウェル分を選択した。
【０１７０】
上記４ウェル中の細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時、細胞培養上清について以下に示すようなインヒビションＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１７１】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＣＲＰ、補体Ｃ１ｑ（ＨＵＭＡＮ Ｃ１ｑ ＡＮＴＩＧＥＮ、Ｃａｔ＃：ＡＧ７０４、ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、血清アミロイドＰ（ＡＭＹＬＯＩＤ Ｐ、Ｃａｔ＃：０４９０−２７５２、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ製）のいずれかを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、上清中で可溶化されたインヒビターと結合してインヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１７２】
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を１株選定した。また、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに交叉反応を起こさないが、血清アミロイドＰに対して弱い交叉反応を示す株を１株選定した。
【０１７３】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑまたは血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ５と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年９月１８日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号）。
【０１７４】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑに交叉反応を起こさないが、血清アミロイドＰに対して弱い交叉反応を示す株を細胞株名：ＭＨ−Ｃ６と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年９月１８日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号）。
【０１７５】
ＭＨ−Ｃ５株およびＭＨ−Ｃ６株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−Ｃ５抗体およびＭＨ−Ｃ６抗体と称する。
【０１７６】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１７７】
（抗体の精製）
選択した株を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、遠心分離して培養上清を得た。また、選択した２株を、それぞれ雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させ採取した。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体およびＭＨ−Ｃ６抗体）を精製した。
【０１７８】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１７９】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体およびＭＨ−Ｃ６抗体）の精製画分は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０１８０】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体について、ＣＲＰの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一の条件で抗体評価を行なった。
【０１８１】
図６Ａ〜Ｃは、ＭＨ−Ｃ５抗体について、図７Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−Ｃ６抗体について、それぞれＣＲＰ（図６Ａおよび図７Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図６Ｂおよび図７Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図６Ｃおよび図７Ｃ）に対する結合能力を競争反応（インヒビション反応）で測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）の対数値を示す。
【０１８２】
図６Ａに示すように、ＭＨ−Ｃ５抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約１×１０−１０Ｍであり、２〜３×１０−１１ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。図６ＢおよびＣに示すように、ＭＨ−Ｃ５抗体の固相のＣＲＰへの結合は、インヒビターとしてのＣ１ｑおよびアミロイドＰの存在によっては阻害されなかった。このことは、ＭＨ−Ｃ５抗体が血清アミロイドＰおよび補体Ｃ１ｑには結合能を有さないことを示す。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０１８３】
図７Ａに示すように、ＭＨ−Ｃ６抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約３〜５×１０−１０Ｍであり、２×１０−１０ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。図７Ｃに示すように、インヒビターとしてのアミロイドＰによりＭＨ−Ｃ６抗体の固相のＣＲＰへの結合は阻害され、インヒビションがかかるが、このときインヒビションの半値は約１×１０−７Ｍであり、検出限界は約１×１０−８Ｍ程度である。ヒト血清アミロイドＰの正常血漿レベルは約３０ｍｇ／Ｌ、つまり約２．４×１０−７Ｍである。抗体を検査キットに組込むと、通常、様々な要因により抗体の感度が低下する。しかし、ＭＨ−Ｃ６抗体の血清アミロイドＰに対する上記の感度は、この抗体を検査キットに組込んだ場合でも、正常血漿中の血清アミロイドＰとはほとんど反応が起きない感度であるし、交叉性のないＭＨ−Ｃ５のような抗体と共に用いると実用上問題はないと考えられる。
【０１８４】
＜実施例４＞
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【０１８５】
（免疫）
免疫原であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。このＣＲＰのＰＢＳ溶液に、同体積の完全アジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ， ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ 社製）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【０１８６】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）４匹に、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを４００μｌずつ腹腔に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント（ＡＤＪＵＶＡＮＴ ＩＮＣＯＭＰＬＥＴＥ ＦＲＥＵＮＤ， ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に４００μｌずつ注射した。
【０１８７】
その後、免疫開始より４週間後および６週間後に、２週間後の免疫と同じ組成および濃度のＣＲＰを含む不完全フロイントアジュバントを用いて同様に作製したエマルジョンを、マウスに４００μｌずつ皮下に注射した。２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【０１８８】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗体産生の確認をした。固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ・・ｍＬ・ＣＲＰを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたものを使用した。第２抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＣＲＰに結合する抗体が存在することが確認される。
【０１８９】
その結果、４匹すべてのマウスにおいて抗ＣＲＰ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上ありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【０１９０】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で２匹の脾臓を肥大させるために、免疫原のＣＲＰをＰＢＳを用いて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュパントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射し、最終免疫を行なった。
【０１９１】
最終免疫後３日を経過した２匹のマウス（マウス番号＃３−２、＃３−３）それぞれの脾臓細胞を摘出した。平均分子量１、５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３・
それぞれの融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート各３枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１９２】
（細胞選別およびクローニング）
細胞融合後５日目、７日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取し、抗体が産生されているかＥＬＩＳＡ法により確認を行なった。なお、上清を採取した時には、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を各１００μｌ加えて培養を継続した。
【０１９３】
細胞融合後９日目に、融合細胞の培養上清を各ウェル１００μｌ採取すると共に、融合細胞を含む残りの培養液を１２枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むイシコフ培地で調製したＨＡＴ培地を加えた。採取した培養上清は、ＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１９４】
その後、数日おきに上清の評価を行なってウェルの選択をすると共にスケールアップを行ない、ＨＴ培地により培養を継続した。
融合細胞を６ウェルプレートに継代した３日後、細胞培養上清を各ウェル２００μｌ／ウェルずつ採取し、以下に示すＥＬＩＳＡ法によりＣＲＰに対する結合能を測定した。
【０１９５】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ・・抗体液として細胞培養上清を使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在すると、インヒビションがかかるので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１９６】
ＣＲＰでのみインヒビションがかかり補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰでインヒビションがかからなかったウェルを、マウス番号＃３−２由来分より２ウェル選別し、マウス番号＃３−３由来分より１ウェル選別した。
【０１９７】
上記３ウェルの細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロブレート各３枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。
【０１９８】
ＣＲＰに対して高い力価を示し、補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰでインヒビションがかからず、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬ中の培地中で５×１０５細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。
最終的に、ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさない株をマウス番号＃３−２由来分より２株、マウス番号＃３−３由来分より１株の計３株選定した。
【０１９９】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさないマウス番号＃３−２由来の株の一つを細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ２と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年３月２４日に国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３３８号）。別の株を細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ４と命名し、寄託センターに平成１５年３月２４日に国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３３９号）。
【０２００】
ＣＲＰに対して結合能を示し、かつ補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対して交叉反応を起こさないマウス番号＃３−３由来の株の一つを細胞株名：ＭＨ−ＩＩＣ５と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年３月２４日に国際寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４０号）。
ＭＨ−ＩＩＣ２株、ＭＨ−ＩＩＣ４株およびＭＨ−ＩＩＣ５株の産生する抗体を、それぞれＭＨ−ＩＩＣ２抗体、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体およびＭＨ−ＩＩＣ５抗体と称する。
【０２０１】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して培養上清を取り除き、約１×１０７細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０２０２】
（抗体の精製）
選択した３株を、それぞれ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離により採取した。各株の培養上清を、リコンビナントプロテインＡ結合ゲル（リコンビナントプロティンＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体、ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）を精製した。
【０２０３】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／ｈ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０２０４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体、ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）の精製分画は、いずれも分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【０２０５】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製した３種類のモノクローナル抗体について、ＣＲＰ、血清アミロイドＰ、および補体Ｃ１ｑの希釈系列を用いて、上記の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一条件で抗体評価を行なった。
【０２０６】
図８Ａ〜Ｃは、ＭＨ−ＩＩＣ２抗体について、図９Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−ＩＩＣ４抗体について、図１０Ａ〜Ｃは、同様にＭＨ−ＩＩＣ５抗体について、それぞれＣＲＰ（図８Ａ、図９Ａおよび図１０Ａ）、補体Ｃ１ｑ（図８Ｂ、図９Ｂおよび図１０Ｂ）、および血清アミロイドＰ（図８Ｃ、図９Ｃおよび図１０Ｃ）に対する結合能力を競争反応（インヒビション反応）で測定した結果を示すグラフである。各図において、縦軸は吸光度（波長：４９２ｎｍ）を、横軸はそれぞれＣＲＰ濃度（ｍｏｌ／Ｌ、以下Ｍと標記する）、補体Ｃ１ｑ濃度（ｍｇ／ｍｌ）、血清アミロイドＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ、以下Ｍと標記する）の対数値を示す。
【０２０７】
図８Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ２抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約１．５×１０・Ｍであり、２〜３×１０・ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０２０８】
図９Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ４抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約２．５×１０・Ｍであり、２〜３×１０・ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０２０９】
図１０Ａ〜Ｃに示すように、ＭＨ−ＩＩＣ５抗体では、ＣＲＰに対するインヒビションの半値が約２×１０・Ｍであり、２〜３×１０・ＭのＣＲＰを検出できる可能性が示された。補体Ｃ１ｑ、血清アミロイドＰに対しては反応を示さず、交叉反応を起こさないことが確認できた。
【０２１０】
【発明の効果】
本発明により、ＣＲＰの検出および測定を、正確に、且つ簡便に行なうことが可能な抗ＣＲＰモノクローナル抗体、およびＣＲＰ検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図２Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ１抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ３抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ３抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ３抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図４Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ３抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ４抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ４抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図５Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ４抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ５抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ６抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ６抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−Ｃ６抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ２抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ４抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ４抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ４抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０Ａ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）のＣＲＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）の補体Ｃ１ｑに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０Ｃ】
本発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＨ−ＩＩＣ５抗体）の血清アミロイドＰに対する結合能を示す、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
Claims (15)
- Ｃ反応性タンパク質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞株を得る工程（ａ）と、
上記細胞株から産生されるモノクローナル抗体を、Ｃ反応性タンパク質、補体Ｃ１ｑ、および血清アミロイドＰに対する結合能を免疫測定法で検定することによって、Ｃ反応性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する工程（ｂ）と、
を含む、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法。 - 請求項１に記載の抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体作製方法であって、
上記工程（ｂ）において、Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない、モノクローナル抗体を産生する細胞株を選抜する、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体の作製方法。 - Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しないモノクローナル抗体を産生する、細胞株。
- 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４１号である、細胞株。 - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４２号である、細胞株。 - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９３９号である、細胞株。 - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４０号である、細胞株。 - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８５号である、細胞株。 - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１８６号である、細胞株。 - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・ - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・ - 請求項３に記載の細胞株であって、
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ・ - Ｃ反応性タンパク質に対して結合能を有し、且つ補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない、抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体。
- 試料液中のＣ反応性タンパク質を検出するためのＣ反応性タンパク質検出キットであって、
第１の抗体および第２の抗体を含み、
上記第１の抗体が、抗Ｃ反応性タンパク質抗体であり、
上記第２の抗体が、標識された抗Ｃ反応性タンパク質抗体であり、
上記第１の抗体または上記第２の抗体の少なくとも一方が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体である、Ｃ反応性タンパク質検出キット。 - 請求項１４に記載のＣ反応性タンパク質検出キットであって、
上記第１の抗体が、固相に固定化されており、
上記第２の抗体が、補体Ｃ１ｑおよび血清アミロイドＰに結合しない抗Ｃ反応性タンパク質モノクローナル抗体であり、且つ移動相に含まれている、Ｃ反応性タンパク質検出キット。
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|---|---|---|---|---|
| JP2011128110A (ja) * | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Fujifilm Corp | 犬ｃｒｐ測定用乾式分析要素 |
| CN112574303A (zh) * | 2019-09-30 | 2021-03-30 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗c反应蛋白的抗体 |
| CN114594261A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-06-07 | 美康生物科技股份有限公司 | 一种筛选不受补体干扰的单克隆抗体对的方法 |
| CN118344476A (zh) * | 2024-05-16 | 2024-07-16 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 人c反应蛋白单克隆抗体、抗体对和检测试剂或试剂盒及其应用 |
-
2003
- 2003-05-09 JP JP2003131511A patent/JP2004215649A/ja active Pending
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