JPH09511903A

JPH09511903A - 樹状突起細胞を調製する方法、かくして得られる細胞および本方法を実施するための容器

Info

Publication number: JPH09511903A
Application number: JP7526628A
Authority: JP
Inventors: カンツ、ロタール; ブルーゲル、ヴォルフラム; ヘンシュラー、ラインハルト; ケーラー、ガブリエレ; シェーファー、ハンス−エッカート; リンデマン、アルブレヒト; マーテルスマン、ローランド; マッケンゼン、アンドレアス; パウル、フィシュ; ヘルプスト、ビルジット
Original assignee: クリニクーム・デア・アルベルト−ルドヴィヒス−ウニヴェルジテート・フライブルク
Priority date: 1994-04-14
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 1997-12-02
Also published as: CA2187770A1; US5866115A; WO1995028479A1; AU2302495A; EP0755439A1; AU688897B2; DE4412794A1

Abstract

(57)【要約】樹状突起細胞は、抗原提示細胞として治療上興味深い。末梢血液細胞を先ず単離し次いで該細胞が含有するＣＤ３４抗原提示性の血液前駆細胞を強化・濃縮する方法が開示される。このように強化・濃縮された細胞を、造血性成長因子とサイトカインとの組合せを使用して体外で濃縮・強化させるのである。１０ないし２０日の期間で、これらの細胞は特に樹状突起細胞を生成せしめるので、これを適当な場合はさらに精製すればよい。かかる細胞は、抗原提示能に関して機能的に活性が高い。

Description

【発明の詳細な説明】樹状突起細胞を調製する方法、かくして得られる細胞および本方法を実施するための容器本発明は、基礎研究においてのみならず治療にも有利に使用することができる樹状突起細胞の創製・調製に係る。ＥＰＡ９２．４００８７９．０は、ヒト樹状突起細胞を調製する方法を開示している。この方法においては、ＣＤ３４⁺細胞を、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ −α）とインタ−ロイキン−３またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかを用いて処理するのである。しかしながら、所望とする細胞は、この方法を用いても必要とする収量および純度で得ることが出来ないことが判明している。樹状突起細胞は、生物体内で最も強力な抗原提示細胞である。樹状突起細胞は、骨髄の前駆細胞に由来し、末梢血液中に少量が循環し皮膚の表皮、胃腸粘膜、肺胸膜または尿生殖管の上皮において所謂ランゲルハンス細胞または最終分化細胞（樹状突起細胞）として存在する。これらの細胞は、抗原に暴露された場合皮膚から排出性リンパ節の副皮質に移動するのであるが、ここで終末分化細胞として、特異的Ｔ細胞応答を示すのである。抗原提示細胞としての機能は、インビトロにおいては自系および異系の”混合リンパ球反応”や可溶性抗原を添加した試験系において発現させることができる。このような樹状突起細胞は、やはり抗原提示細胞であるが他の表面マ−カ−を発現する単球／大食細胞から分化させることが出来る。具体的な分化マ−カ−はＣＤ１４抗原であるが、この抗原は、樹状突起細胞中には見出されず単球や大食細胞によって保持されている。樹状突起細胞は、強力な貪食細胞である単球／大食細胞とは異なり、食作用を有さない。循環する樹状突起細胞に存在する表面抗原としては、以下のように定義することが出来るものがある：即ち、ＣＤ１ａ⁺ 、ＣＤ１ｃ⁺、ＣＤ１３⁺、ＣＤ３３⁺、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ３^-、ＣＤ１９^-およびＭＨＣＩＩ⁺である。このような細胞は，インビトロで培養した後または抗原で生理学的に刺激すると、ＭＨＣＩＩ分子の発現が増加しまたＣＤ２５、Ｂ７、ＣＤ４０およびＩＣＡＭ１も発現されている。樹状突起細胞（ＤＣと略記する）は、高い効率でＴ細胞の活性化を誘起する能力を持つ抗原提示細胞である。この細胞は、高度に特殊化・分化しておりかつ自らの使命のために最適の能力を装備しているのであるが、その理由は、樹状突起細胞が大量に抗原（ＭＣＨＩおよびＭＣＨＩＩ）を提示するために必要とされる細胞を発現するからである。このことに加えて、樹状突起細胞はその表面において、構成上からして共同刺激性である分子ＣＤ８０およびＣＤ８６とを発現する。これらの分子は、次にＴ細胞を活性化するうえで必須である。標的細胞との緊密な接触を保証する重要な接着・融合細胞も、かかる樹状突起細胞の表面に存在する。樹状突起細胞においては、二つの成熟段階を区別することができる。かかるランゲルハンス型の細胞（ＬＣと略記する）は、生体の全体に亙って非リンパ性器官中に分布しており、その使命は、抗原を収集しかつこれを処理することである。これらの細胞に対する特異的マ−カ−は全く存在しないのであるが、以下のマ −カ−を発現する：即ち、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８０である。さらに特異的な検出は、電子顕微鏡を用いて行うことができる。所謂バ−ベック顆粒は、ランゲルハンス細胞のみしか有さないのであるが、電子顕微鏡を用いると検出することができる。生体内においては、かかるランゲルハンス細胞は抗原と接触すると、生体の末梢からリンパ系を経由してリンパ性器官内に移行し、かかる移行過程において成熟した免疫刺激性樹状突起細胞に分化するのであるが、この段階では最早や抗原を収集することはなくなるものの種々の強力なＴ細胞応答を誘発するのである。従って、ランゲルハンス細胞と成熟樹状突起細胞（ＤＣと略記）とを相互に識別することは可能である。典型的には、これらのＤＣ細胞は、ＣＤ１ａの発現が減少しまたＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ８０の発現が増大する。かかる樹状突起細胞は、例えば抗感染治療を強化するのに使用することができる。このような抗原提示樹状突起細胞は、種々のウイルス感染症や細菌感染症において特に重要であり、適合する感染症に関連してかかる細胞を追加・補完すると、患者、特に重篤な患者に対して有利な影響を及ぼすことができる。また別の可能性ある使用分野としては、ワクチン接種が挙げられるが、こうすることによって生体の免疫応答が強化される可能性があるからである。本発明の方法を用いて調製することができる細胞は、強力な抗原提示能があるので、特に重要である。本発明に従って得ることができる樹状突起細胞には、異なるワクチン接種治療のためのいくつかの特異的抗原を載荷させることによって、特異的なＴ細胞応答を誘発させることができる。更には、本発明に従って得ることができる樹状突起細胞を使用することは、悪性疾患や感染性疾患の免疫治療において極めて重要である。即ち、本発明に従って調製することができる樹状突起細胞は、如何なる患者からも個別に単離することができるのであって、例えば養子腫瘍免疫治療において、特異的腫瘍抗原を載荷させ、次いで当該患者に再注入すると、当該腫瘍に対して特異的免疫応答を誘発させることができる。感染性疾患の治療の場合は、本発明に従って得ることができる樹状突起細胞は、例えば抗肝炎ワクチン接種や適切な場合に限るが抗ＨＩＶウイルスワクチン接種と組合せて、免疫抑制状態の患者の免疫感作反応を強化するために使用することができる。異なる細菌性またはウイルス性の感染症のコントロ−ルは、腫瘍疾患の結果化学療法を受けざるを得ない患者にとっては、自らの免疫応答がかかる化学療法によって大幅に低下しているので重大な問題である。従って、まさしくかかる症例においてこそ免疫応答を改善することが必要不可欠である。樹状突起細胞はこの他に、特に残留性が狭小である疾患にも使用することができる。この場合、腫瘍特異的抗原はかかる樹状突起細胞によって提示され、次いでＴ細胞特異的（細胞毒性・障害性）反応が惹起される。樹状突起細胞を体外で増殖させるため本発明の方法を実施する操作方法は、以下のようにすればよい：即ち、ヘパリン添加した血液試料を患者から採取する。本発明に従った方法においては、血液から単離した血球を原料として使用することができる。こうすることによって、ＥＰＡ９２．４００８７９．０において開示された方法では細胞を骨髄または臍帯血液から誘導しなければならないのであるが、これと比較して大きな利点となる。好ましくは、単核細胞（ＭＮＣ）を適当な分離方法を用いて、特にフィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）を介した密度勾配遠心分離によってアフェレ−シス産物から単離することができる。また別の実施態様においては、かかるＣＤ３４⁺細胞は、単核細胞が濃縮強化されている白血球搬出物から得ることができる。前記単核細胞は、ＣＤ３４⁺細胞を血液から直接単離した場合でもまたＣＤ３４⁺を予め白血球搬出物から単離済みである場合でも，密度勾配遠心分離によって濃縮強化することができる。密度勾配遠心分離が好ましいが、絶対的に必要であるわけではない。ＣＤ３４⁺細胞を血液（ヘパリン添加血液試料）から直接単離した場合は、赤血球を溶血させるだけで充分であるはずであるが、以降の生成段階においてはこれに引き続いてアフィニティ−クロマトグラフィ−または別の濃縮強化操作を行う。ＣＤ３４⁺細胞を白血球搬出物から直接単離する場合は、これらの細胞は、洗浄をただ一回行ったあと、フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）による分離を行うことなく、アフィニティ−カラムに添加する。フィコル勾配を用いた濃縮強化は、特に例えば高用量化学療法に関連して起こるように比較的大量のＣＤ３４⁺細胞が既に存在している場合は省略してもよい。本発明の一つの好ましい実施態様においては、樹状突起細胞を調製する方法は、以下から構成されていてもよい：ａ）幹細胞を動員するために、患者をＧ−ＣＳＦで処置するのであるが、通常の濃度のＧ−ＣＳＦを投与する；ｂ）適当な時間経過後、ほぼ５０ないし１００ｍｌの血液を採取する；ｃ）ＣＤ３４⁺細胞の含量が低い場合は、フィコル分離操作を実施する；ｄ）赤血球を溶血する；ｅ）ＣＤ３４⁺細胞分離操作を実施するが、この操作は、特に好ましい実施態様においてはアフィニティ−クロマトグラフィ−操作である；ｆ）ランゲルハンス細胞および樹状突起細胞を下記する成長因子／サイトカイン類を添加することによって分化させる；このようにして得られるランゲルハンス細胞／樹状突起細胞は、目的に応じて更なる処理に供することが出来るが、幹細胞を濃縮強化することを目的とする白血球搬出法は、ランゲルハンス細胞．樹状突起細胞を比較的大量に必要とする場合は特に有用である。かかる単核細胞は、ＣＤ３４⁺表面抗原を有する細胞を濃縮強化するために更なる処理に供する。Ｂｒｅｓｏｎらは、”乳ガン患者または神経芽腫患者へのＣＤ３４⁺骨髄細胞注入後の移植”なる報文においてＣＤ３４⁺抗原について記載している（Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７７、Ｎｏ．８（１９９１）ｐｐ．１７１７−１７２２）。かかる細胞は、ＣＤ３４抗原に対して特異的であるモノクロ−ナル抗体であって、好ましくはビオチニル化した抗体と一緒に培養することによって濃縮強化することができる。この種のモノクロ−ナル抗体は、例えばＤｉａｎｏｖａ、Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣｅｌｌＰｒｏまたはＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｓｏｎから市販され入手することができる。かかるモノクロ−ナル抗体で処理された細胞は、免疫アフィニティ−カラム、好ましくはアビジン（ａｖｉｄｉｎ）免疫アフィニティ−カラムに投入されるが、ここにおいてアビジンは、モノクロ−ナル抗体、従って抗原に結合されたＣＤ３４⁺細胞にも結合する。吸着した細胞は、ＣＤ３４表面抗原を有しており、免疫アフィニティ−カラムから除去され、適当な媒体に導入される。同様に、ＣＤ３４抗原に特異的なモノクロ−ナル抗体は、ＣＤ３４⁺細胞を固定しかつ混合物から除去するために直接固相（例えば細かいビ− ズ）に結合させることも可能であろう。さらに、例えばＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｓｏｎから市販され入手できる蛍光活性化細胞選別器を用いてＣＤ３４⁺細胞を濃縮強化することも可能である。この方法においては、動態化された末梢血液前駆体細胞を、蛍光色素標識を有する抗ＣＤ３４抗体と反応させる。かかる蛍光活性化細胞選別器を用いると、ＣＤ３４⁺細胞を得るため当該細胞を分離することが可能である。高度に精製された細胞は、このようにして得ることができる。また別の可能性としては、Ｄｙｎａｌ、Ｂａｘｔｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙやその他の会社から市販され入手できる磁気ビ−ズを用いることによって当該ＣＤ３４⁺細胞を分離することがある。かくして濃縮強化されたＣＤ３４⁺細胞は、次いで適当な培養基中において培養される。かかる培地の一例として、１０％のウシ胎子血清を含有する補足培地が挙げられる。かかる培養基は、ヘパリン添加自系血漿を濃度として例えば１％含有していてもよい。２００ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭのβ−メルカプトエタノ−ル、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、ＭＥＭビタミン類および１０％のウシ胎子血清を添加補足したＲＰＭＩ１６４０培地を、培養基として使用するのが好ましい。細胞を拡大した後、異なる成長因子の存在下にて培養する。下記する成長因子をかかる目的のために使用する：インタ−ロイキン−１（ＩＬ−１）、ＧｅｒｙＩ．ら、ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌ．、１１６、４５６−４６７（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎｎら、ＭｅｔｈｏｄＺｎｚｙｍｏｌ．１１６、４６７−４９７（１９８５）；Ｍａｒｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ３１５、６４１（１９８５）によって記載されたもの；インタ−ロイキン−３（ＩＬ−３）、ＥＰＡ１３８１３３、Ｉｈｌｅら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍａｌｏ．１１６、５４０−５５２（１９８５）；Ｏｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０、２２８８−２２９５（１９８８）において記載されたもの；インタ−ロイキン−４（ＩＬ−４）、ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐ．から入手出来るもの；インタ−ロイキン−６（ＩＬ−６）、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９、４１１６−４１２１（１９８７）、Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３、１１７５−１１８２（１９８９）によって記載されたもの；顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐ．から入手出来るもの；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、Ｊａｃｏｂｓら、Ｎａｔｕｒｅ３１３、８０６−８１０（１９８５）、Ｓａｓａｋｉら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、１４７、３２８−３４０（１９８７）によって記載されたもの；幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＷＯ９１／０５７９７、Ｎｏｃｋａら、ＥＭＢＯＪ．９。３２８７−３２９４（１９９０）、およびインタ−フェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＥＰ７７６７０，Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ２９５、５０３−５０８（１９８２）；Ｄｅｖｏｓら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０、２４８７−２５０１（１９８２）；Ｙｉｐら、ＰＮＡＳ７９，１８２０−１８２４（１９８２）およびＢｒａｕｄｅ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１１９、１９３−１９９（１９８６）。ＣＤ３４⁺前駆体細胞は下記する成長長因子の組合せによって拡大・増殖することが発見されたのである。；即ち、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＥＰＯおよびＳＣＦである。これら５種類の成長因子を使用した場合、表面抗原ＣＤ１ａを発現する樹状突起細胞が１ないし５％得られる。このような細胞は、所謂バ− ベック顆粒を検出することによって顕微鏡によって同定することもできる。樹状突起細胞の収率は、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを添加することによって顕著に増大せしめられた。かかる細胞は、成長因子であるＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＥＰＯやＳＣＦの存在下において培養する。この目的のために、かかる細胞を幹細胞因子の存在下で培養するとともに、当該培地にはさらにサイトカイン類や成長因子類を含有させるのが必要であることが重要である。一つの好ましい実施態様においては、当該細胞は、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの組合せの存在下において拡大させる。適切であれは、ＩＬ−４（インタ−ロイキン−４）も添加することができる（１０−１、０００ｎｇ／ｍｌ）。本発明の特に好ましい一つの実施態様においては、樹状突起細胞の分化をサイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＥＰＯをサイトカインであるＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとともに使用することによって行うのである。前記したサイトカインと共に培養を行うと、二ないし三週間の間で多数の細胞が成熟化するのであるが、これらの細胞は、その形態学及びマ−カ−プロファイルから典型的なランゲルハンス型の細胞である。上記した七種のサイトカインを含有する培地でほぼ五週間培養すると、これらの細胞は、成熟樹状特記細胞の表現型となる。バ−ベック顆粒の喪失、ＣＤ１ａの発現の減少、および表面抗原であるＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ８０の発現の増大が、このような成熟化段階には典型的である。本発明の範囲においては、サイトカイン類の継続した添加が、かかる細胞の分化を一層良好に制御することが可能となるために特に好ましい。かかる実施態様においては、サイトカインであるＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＥＰＯ前駆細胞を使用して一ないし二週間の間拡大せしめる。この期間経過後、増殖は大部分は終了しており、かかる細胞は、サイトカインであるＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦのみを含有する培地に移すのである。このようにすれば、かかる細胞をランゲルハンス細胞の段階で、ランゲルハンス細胞から樹状突起細胞へと分化する途上で停止させることができ、かくしてこれら全ての細胞をほぼ分化の同一段階にもっていくことができるわけである。この段階においては、細胞は抗原を補集しかつ処理するのに特に適している。所期の目的のために一様な数の樹状突起細胞が必要である場合は、かかる樹状突起細胞は、適宜の分離方法で濃縮強化又は精製することができる。一つの分離方法としては、例えば細胞をＣＤ１ａ表面抗原に対して誘導されたモノクロ−ナル抗体と反応させる方法が挙げられる。このような細胞／抗体複合体を次に、免疫アフィニティ−カラムを用いるか又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分離装置）を使用して分離することが出来る。使用する成長因子及びサイトカイン類の濃度は、生体外培養において最も効率が高くなる、通常使用される濃度範囲内にある。ＩＬ−１は、１０ｎｇ／ｍｌないし１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用される；またＩＬ−３は、ＩＵ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で使用される；ＩＬ−４は、１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で使用される；ＩＬ−６は、１０Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で使用される。ＥＰＯは、０．１Ｕ／ｍｌから１０Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在すればよい。ＳＣＦは、１０ｎｇ／ｍｌと１０００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で使用され、またＩＮＦ−は、１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で使用される。ＧＭ−ＣＳＦについては、使用する濃度が１０ｎｇ／ｍｌと１０００ｎｇ／ｍｌとの間であり、またＴＮＦ−については、その使用濃度は１０Ｕ／ｍｌと１０００Ｕ／ｍｌとの間である。ＩＬ−１の好ましい濃度は１０ｎｇ／ｍｌと１５０ｎｇ／ｍｌとの間である；またＩＬ−３については、好ましい濃度は５０Ｕ／ｍｌと１５０Ｕ／ｍｌとの間である；またＩＬ−４については、好ましい濃度は１０ｎｇ／ｍｌと１５０ｎｇ／ｍｌとの間である；またＩＬ−６については、好ましい濃度は５０Ｕ／ｍｌと１５０Ｕ／ｍｌとの間である；ＥＰＯについては、好ましい濃度は０．５Ｕ／ｍｌと１．５Ｕ／ｍｌとの間である；またＳＣＦについては、１０ｎｇ／ｍｌと１５０ｎｇ／ｍｌとの間である；ＧＭ−ＣＳＦについては、好ましい濃度は５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌまでである；またＴＮＦ−については、好ましい濃度は２０Ｕ／ｍｌから１５０Ｕ／ｍｌまでありまたＩＮＦ−については、好ましい濃度は５０Ｕ／ｍｌからと１５０Ｕ／ｍｌまでである。これらの成長因子とサイトカイン類の最適の効率を決定するのは、当業界で通常の知識を有する者の能力範囲に収まることである。本発明の一つの好ましい実施態様によれば、末梢血液前駆細胞は、癌に罹患していて、広範な抗腫瘍活性を有する治療処置と末梢血液前駆細胞の同時併発的動態化とを組み合わせるため従来公知の化学療法とコロニ−刺戟因子とで動態化しておいた患者から採取するのである。動態化は、当該患者をＶＰ１６（５００ｍｇ／ｍ²）、イフォスファマイド（４ｇ／ｍ²）、シスプラチン（５０ｍｇ／ｍ² ）及び適当な場合に限るがエピルビシン（５０ｍｇ／ｍ²）を標準投与（ＶＩＰ（Ｅ）療法）して処置し、引き続き１２から１４日の間５μｇ／ｄの用量でＧＭ −ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ社から入手可能）を皮下投与することによって行うことが出来る。例えばサンドＡＧ（ＳａｎｄｏｚＡＧ）、バ−ゼルから”Ｌｅｕｋｏｍａｘ”なる商標で市販されているＧＭ−ＣＳＦを投与することも可能である。癌患者をエトポサイド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ＶＰ１６）、イフォスファマイド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）及びシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）から成る化学療法で処置し、次いで遺伝子組換えヒトインタ−ロイキン−３（ｒｈＩＬ−３）及び遺伝子組換えヒト顆粒球マクロファ−ジュコロニ刺戟因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）とを順次組み合わせ使用することによって処置してもよいかかる化学療法後１０日と１８日との間の期間経過後患者から末梢血液前駆細胞を採取することが特に好ましい。本発明はまた、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＥＰＯとＳＣＦ及び適宜には、インタフェロン−γおよびＴＮＦ−αとの組み合わせを含有する培養培地をも包含して成るのである。本発明に従った別の培養培地は、ＳＣＦ、ＧＭ−ＳＣＦ及びＴＮＦ−αの組み合わせを含有する。本発明の範囲において特に好ましい樹状突起細胞のための培養培地は、ＩＬ− １、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＥＰＯ及びＧＭ−ＳＣＦとの組合わせを含有するのである。本発明に従った培養培地は、ランゲルハンス細胞及び樹状突起細胞を試験管内で生成させるために使用され、上記したような成長因子とサイトカイン類とを含有する。これらの生物学的活性化合物は、上記した濃度で使用される。末梢血液細胞を培養するための培養培地を設けた容器を作成するこが可能であるが、かかる培地は上記した成長因子の組合わせを含有するものである。かかる容器は、血液保存袋、マイクロタイタ−プレ−ト又は組織培養瓶であってもよい。このような既製の、使用可能な容器も本発明の主題である。実施例１末梢血液前駆細胞（ＯＢＰＣ）の動態化誘導治療の一環として、ＶＰ１６（５００ｍｇ／ｍ２）、イフォスファマイド（４ｇ／ｍ２）およびシスプラチン（５０ｍｇ／ｍ２）による標準投与量（ＶＩＰ）によって１８人の患者を処置し、次いで遺伝子組み換え型ヒトＧ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ、ドイツ）を５μ／ｋｇ／ｄなる容量で1０日から１４日までの機関静脈ない投与して、ＰＢＰＣ細胞を動態化させた。固形腫瘍の患者１２人と難治性ホジキンリンパ腫の患者６人とを試験に含めた。ＰＢＰＣ細胞は、ＶＩＰによる化学療法を行った後１０日ないし１２日に採取した。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２０、ｐｐ．１４５２−１４５９（１９９２）においてブルッガ−ら（Ｂｒｕｇｇｅｒｅｔａｌ．）およびＢｒｉｔｉｓｈＪ．ｏｆＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ８４、ｐｐ．４０２−４０７（１９９３）においてブルッガ −らが記載した方法を使用して、ＶＩＰ化学療法後１０日ないし１２日に所謂” 少量チャンバ−”（Ｂａｘｔｅｒ社から入手可能）を用いて白血球搬出法によって、末梢血液前駆細胞を除去した。実施例２ＰＢＰＣ細胞の培養単核細胞（ＭＮＣ）をアフェレ−シス産物からフィコ−ル／ヒパク（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ）（１．００７ｇ／ｍｌ）を介した密度勾配遠心分離によって単離し、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄した。末梢血液または骨髄ＭＮＣ細胞を現行到達技術（例えば、Ｋａｎｚら、Ｂｌｏｏｄ、６８、９９１（１９８６）に記載された通りに培養した。ＭＮＣ細胞（１ｘ１０５）をメチルセルロ−スに固定化し（０．９％）、３０％ウシ胎児血清（Ｐａｅｓｅｌ、ドイツ）を添加したＩＭＤＭで培養した。実施例３免疫アフィニティ−吸着カラムを用いた培養したＰＢＰＣ細胞からＣＤ３４＋細胞のポオジティブセレクション単核細胞（ＭＮＣ細胞）をビオチン化ＩｇＭ抗−ＣＤ３４モノクロ−ナル抗体と共に培養し、次いで洗浄しアビディン免疫アフィニティ−カラムの装荷した。吸着されたＣＤ３４＋細胞（標的細胞集団）アビディンカラムから除去し、３ｍＭ／Ｌのグルタミンと５ｘ１０−５Ｍ／Ｌのβ−メルカプトエタノ−ル（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）とを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）ドイツ）に再度分散させた。実施例４分散培養液における濃縮強化したＣＤ３４＋の拡大濃縮強化したＣＤ３４＋細胞を０．５から１５ｘ３０３細胞・ＭＬの濃度で平底９６−ウエルマイクロタイタ−プレ−トを用いて１０％ウシ胎児血清または異なる濃度のオ−トロガス血漿中において培養した。成長因子を上記したように組合せたものをマイクロタイタ−プレ−トにＣＤ３４⁺を播種したあと直ちに添加した（全容量を２００μＬ／ウエル）。試験した３６の成長因子組合せについて、それぞれ４倍培養物を調製した。下記する造血性成長因子およびサイトカインを使用した：即ち、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γおよびＳＣＦである。ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦ− αＳＣＦなどの成長因子は、１００ｎｇ／ｍｌなる濃度で使用し、またサイトカインであるＩ１−３およびＩＬ−６は１００Ｕ／ｍｌなる濃度で使用した。エリスロポイエチンは、２Ｕ／ｍｌなる濃度で使用しまたＴＮＦ−αは５０Ｕ／ｍｌなる濃度で使用した。細胞は、これ以上成長因子または培地を添加することなく５％ＣＯ²中にて３７℃で最大２８日までの期間培養した。分析するために、各ウエルの内容物を再度分散させ、ＲＰＭＩ１６４０で二度洗浄して、残留する成長因子を除去した。これら細胞の生存・生命力は、トリパンブル−染料排除法およびヨウ化プロピジウムによるフロ−血球計算染色法で測定決定した。実施例５末梢ＣＤ３４⁺血液前駆細胞の体外拡大による樹状突起細胞の調製実施例４において記載したように２５ｍｌの培養瓶を用いてＲＰＭＩ１６４０培地において最大２１日の期間、細胞密度が０．５から３ｘ１０４／ｍｌまでにてＣＤ３４⁺血液前駆細胞を培養した。下記する成長因子およびサイトカインを培地に添加した：即ち、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびエリスロポイエチンを実施例４において述べた濃度で使用した。また二回目の培養物において、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦを培地に添加して、樹状突起細胞の収量を増加させた。試料を培養物から毎週採取し、ＦＡＣＳｃａｎ分析装置（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフロ−血球計算法によって分析し、免疫表現型を決定した。デ−タは、ＦＡＣＳｃａｎＬｙｓｉｓ２ソフトウヱアプログラムを用いて評価した。二色の標識を行うために、細胞を２％のＦＣＳを含むＰＢＳで洗浄し、４℃にて３０分間ＣＤ３３に対するＰＥ接合抗体とともに培養したが、この際何れの場合にも下記するＦＩＴＣ接合抗体の何れか一つを併用した：即ち、抗−ＨＬＡ−ＤＲ、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ１ａ、（何れもＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｓｏｎから入手可能）および抗−ＣＤ２５（Ｄａｋｏ）である。この他に、抗ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、およびＣＤ４０抗体（Ｄｙａｎｏｖａ、ハンブルグ）を用いて、単一標識化も行った。このような抗体標識化は、間接方法を使用しても行った。顆粒球及び単球の成熟化カスケ−ドから細胞の１００分率での比率を求めるため、細胞を更に抗ＣＤ１５（顆粒球）とＣＤ１４（単球）抗体で標識化した。マウスイソタイプコントロ−ル（ＩｇＧ１−ＦＩＴＣおよびＰＥ−接合ＩｇＧ２ａ）をネガティブコントロ−ルとして実施した。培養終了後、細胞は二回洗浄し、ＦＣＳを添加することなく２５０μｌのＰＢＳに再度分散させて、フロ−血球計算法による解析を行った。死滅細胞排除するために、ヨウ化プロピディウム（ＰＩ）を測定直前に各試料に添加し、ＰＩで標識した死滅細胞を適切な方法によって当該解析から排除した。各試料から２０、０００個の細胞を解析・分析した。結果：１２日後、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦを含有する培養物中のＣＤ１ａ⁺ の百分率割合は、有意に低下したが、これらの細胞も樹状突起細胞のマ−カ− を構成するＨＬＡ−ＤＲ分子を発現した。しかしながら、高度にかかる表面マ− カ−であるＣＤ１ａを発現するのは、ランゲルハンス細胞だけであるので、樹状突起細胞の実際の数は、これより有意に大きくなる可能性がある。さらに、ＣＤｌｃはこれらの細胞のほぼ１７％において発現されまたＣＤ４０はほぼ４５％において発現されているので、これらの細胞もやはり樹状突起細胞に対するマ−カ −である。ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ及びエリスロポイエチンを添加した培地は、より多くのクロ−ン原性前駆細胞を生成したが、樹状突起細胞の比率は、有意に低かった。ＣＤ１ａ⁺細胞は、体外で拡大した細胞のほぼ４％に見出されたが、ＣＤ１ｃ−発現細胞の割合はほぼ２％であった。実施例６異なる培養条件を相互に比較し、ランゲルハンス細胞および樹状突起細胞の収量を最大限高くすることを可能成らしめた成長因子の組合せを決定した。アビディン免疫アフィニティ−カラム工程を行ったところ、得られた細胞の６０％が、マ−カ−ＣＤ３４⁺を示した。これらの細胞は、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ中で培養した。サイトカインであるＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１β、ＩＬ−３およびＩＬ−６の混合物を当初成長因子として使用した。この混合物にはＬ−３およびＩＬ−６の混合物を当初成長因子として使用した。この混合物には、ＳＥ１３６なる名称を付与した。この混合物を使用すると、細胞核を有する細胞およびクロ−ン原性前駆細胞の拡大が高くなった。ＴＮＦ−α／ＧＭ−ＣＳＦとＳＥ１３６またはＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦとＳＥ１３６の何れかの組合せを使用して、ランゲルハンス細胞と樹状突起細胞への分化を特異的に行わしめた。ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦをコントロ−ルとして使用した。この実験の結果を表１に示すが、有核細胞およびＣＤ１ａ⁺マ−カ−を有する細胞の合計収量とまた細胞の表面構造と同様に示した。表１から、サイトカインであるＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦをＳＥ１３６混合物に添加すると、ＣＤ１ａ⁺ マ−カ−を有する細胞の収量が最高となることが判る。この収率は、全有核細胞の４６％にも達したのである。アフィニティ−カラムの純度に応じて、収率は、６５％にまでの増大させることができる。ＴＮＦ−α／ＧＭ−ＣＳＦをＳＥ１３６混合物とともに使用すると、ＣＤ１ａ⁺細胞の収率が低下したが、これらの細胞の大半は、ＣＤ１５およびＣＤ１４マ−カ−を有していたので、このことから、このような培養条件が顆粒球と単球への分化を促進することが示唆される。ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦを用いて培養したＣＤ３４⁺マ−カ−を有する末梢血液前駆細胞はＣＤ１ａ⁺細胞の割合が高かったが、一方この細胞型式の拡大は示さなかった。従ってこの実施例から、ランゲルハンス細胞／樹状突起細胞の最適収率は、Ｉ１−４／ＧＭ−ＣＳＦと成長因子ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１β、ＩＬ −３およびＩＬ−６との組合せによって実現できることが明らかとなった。注記；１）ＳＥ１３６は、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１β、ＩＬ−３およびＩＬ−６のサイトカイン混合物である。２）これらの異なる細胞集団の抗原発現は、Ｄａｙ２０にフロ−血球計算法によって測定した。表面抗原発現は、下記する割り当て系に帰属させたが、細胞数に基ずく分類は、下記の通り選択した：−＜５％；＋＝５−２５％；＋＋＝２５− ５０％；＋＋＋＝５０−１００％；ＮＤ＝測定不能。＃、結果は６回の異なる実験に基づくもの。実施例７免疫応答を誘発するための抗原提示細胞としての本発明に従った樹状突起細胞の用途を、破傷風トキソイド抗原の提示を示す下記する実験によってさらに詳細に説明する。その他の抗原、例えば腫瘍抗原なども、前記破傷風トキソイドの代わりにかかる用途において使用することができる。ａ）事前刺激したＰＢＭＣ細胞の調製化学療法開始およびＧ−ＣＳＦ投与に先だって３０ｍｌの血液を患者から採取した。末梢単核球（ＰＢＭＣ細胞）をＦｉｃｏｌｌ傾斜を用いてこの血液から単離した。次いでこのＰＢＭＣ細胞を破傷風トキソイド（ベ−リングベルケ、マ− ルブルグから入手可能）で事前刺激したが、この際下記の方法を用いた：１ｘ１０⁷個のＰＢＭＣ細胞を１：８０に希釈した破傷風トキソイドと共に１０％ヒト血清を含有する培地で培養した。七日後に、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２をこの細胞に添加枝次いでさらに四日管培養した。この容易にして事前刺激した細胞を先ず凍結し、次いで抗原提示実験を開始する二日前にもう一度解凍した。この方法におて、利用したのは、このようなＰＢＭＣ細胞が、破傷風トキソイドを吸収し、これを同様に存在するＴ細胞に提示する抗原提示細胞を既に含有している、という事実である。かくして、破傷風トキソイドに特異的であるＴ−細胞は、事前刺激を受けており、具体的には、ＩＬ−２の添加によって同時に濃縮強化されているのである。その理由は、このようなサイトカインはＴ−細胞の生存と成育・増殖を支持するものの、その他の細胞種の大半は死滅するるからである。ｂ）ランゲルハンス細胞／樹状突起細胞の調製化学療法およびＧ−ＣＳＦ投与後、ＣＤ３４⁺マ−カ−を有する前駆細胞を患者から白血球搬出法次いでアフィニティ−クロマトグラフィ−を行って単離した。細胞を好ましいサイトカインの組合せ（ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１β、ＩＬ− ３、ＩＬ−６、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ）を用いて培養し、本発明に従った方法を用いてランゲルハンス細胞／樹状突起細胞に分化させた。また別のバッチとして、いくつかのＣＤ３４⁺細胞は、五種類の拡大サイトカイン、即ちＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＥＰＯを含有するに過ぎない培地において培養した。Ｄａｙ２４において、細胞をＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎから市販されているＦＡＣＳ選別装置を用いて選別し、かくして二種類の樹状突起細胞の亜型、即ちＣＤ１ａ＋／ＣＤ１４^-およびＣＤ１ａ⁺／ＣＤ１４⁺とを単離した。ｃ）抗原提示実験ｂ）において前記したランゲルハンス細胞／樹状突起細胞細胞を先ず照射処理して、これらの細胞が確実にこれ以上増殖しないようにした。次いでこの細胞をａ）において記載したように調製した事前刺激末梢単核細胞と混合し、マイクロタイタ−プレ−トに移した。コントロ−ルの混合物において、この細胞を破傷風トキソイドを添加することなく培養した。それ以外は、破傷風トキソイドを希釈率１；８０で添加した。この実験の結果を図１に示す。この実験においては、以下の細胞集団について、それぞれの抗原提示能を調べた：ａ）選別済みＣＤ１ａ⁺／ＣＤ１４^-（ＬＣ／ＤＣ）。丸印で示す』ｂ）選別済みＣＤ１ａ⁺／ＣＤ１４⁺（ＬＣ／ＤＣ）。三角印で示す』ｃ）ＬＣ／ＤＣ培養物から得た未選別細胞（ＬＣ）。四角印で示す。ｄ）拡大サイトカイン類を含有するだけの培養物から得た未選別細胞（ＫＣ）。星印で示す：ｅ）ＰＢＭＣ細胞のみ（コントロ−ル）；ｆ）抗原提示細胞のみ（ａないしｄ）。これらの混合物は二日間培養したあと、³Ｈ−チミジンを添加し、その混合物をさらに１８時間培養した。次いでこれらの細胞を採取して洗浄し、一分間当たりの細胞数（ＣＰＭ）を測定した。³Ｈ−チミジンガ培養中に細胞に取り込まれているので、この一分間当たりの細胞数が、Ｔ細胞増殖の一つの尺度であり、従って使用した細胞の抗原提示能の一つの尺度である。この実験から以下の如き結論が導き出される：ａ）ＰＢＭＣ細胞単独では、増殖を一切示さない：ｂ）抗原提示細胞（全ての集団を使用）単独では、増殖を一切示さない（照射）；ｃ）ＰＢＭＣ細胞＋抗原提示細胞は、増殖を一切示さない；ｄ）それに対して、ＰＢＭＣｓｂ＋抗原提示細胞＋破傷風トキソイドは、使用した細胞型に依存して強度の増殖を示す。選別したＬＣ−ＤＣ集団（ＣＤ１ａ⁺／ＣＤ１４^-およびＣＤ１ａ⁺／ＣＤ１４⁺）は、最も強度の高い増殖を誘発した。未選別のＬＣ／ＤＣ集団は、その誘発強度は若干低い。このことは、かかる細胞集団も高原提示性をしめ鎖な他の細胞をも含有しているという事実に帰結させることができる。このＫＣ集団、即ち拡大サイトカインであるＩＬ−１β、ＩＬ −３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＥＰＯを含有するだけの細胞であるが、比較的弱い増殖を誘発したに過ぎなかった。この実験から、特に好ましいサイトカイン混合物を用いて試験管内において生成させたランゲルハンス細胞／樹状突起細胞は、傑出した顕著な態様で抗原を吸収して、これを提示しかつ極めて強度の高いＴ細胞応答を誘発させることができることが証明された。このような特性は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦが存在しない場合は、それほど顕著ではなくなる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月１７日【補正内容】３４条補正による特許請求の範囲：１．以下の工程を行うことを特徴とする、樹状突起細胞を調製する方法：ａ）末梢血液細胞を血液から単離すること；ｂ）ＣＤ３４抗原を発現する末梢血液前駆細胞を濃縮・強化すること；ｃ）これらの細胞をインタ−ロイキン１（ＩＬ−１）、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）、インタ−ロイキン６（ＩＬ−６）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）および幹細胞成長因子を含有する細胞増殖培地中において培養することによって拡大させる；ｄ）これらの細胞をサイトカインであるＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦのみを含有する培地に移すこと；及びｅ）かかる樹状突起細胞を次に濃縮・強化すること。２．該末梢血液前駆細胞をヘパリン処理血液試料から密度勾配遠心分離で単離することを特徴とする、請求項１に記載された方法。３．該末梢血液前駆細胞をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅを介して密度勾配遠心分離で単離することを特徴とする、請求項２に記載された方法。４．該末梢血液前駆細胞を表面抗原ＣＤ３４に配向せしめたモノクロ−ナル抗体と反応させることを特徴とする、請求項１に記載された方法。５．表面抗原ＣＤ３４に配向せしめたモノクロ−ナル抗体と事前に反応させた該末梢血液前駆細胞を免疫アフィニティ−カラム、特にアビジン免疫アフィニティ−カラムによる処理で反応しなかった細胞から分離することを特徴とする、請求項４に記載された方法。６．該血液を通常の用量での化学療法に供しておいた癌患者から採取するに際して、該化学療法がエトポサイド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ；Ｖ１６）、イフォスファマイド（Ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）およびシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）とを使用することから成るものであることを特徴とする、請求項１に記載された方法。７．化学療法に供し次いで遺伝子組み換えヒトインタ−ロイキン３（ｒｈＩＬ −３）、遺伝子組み換え顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ｒｈＧＭ− ＣＳＦ）または遺伝子組み換え顆粒球コロニ−刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）の連続併用に供した癌患者から該血液を採取することを特徴とする、請求項１に記載された方法。８．該ＣＤ３４⁺を白血球搬出法産物から採取することを特徴とする、前記請求項のうちの一項に記載された方法。９．請求項１ないし８のうちの一項に記載された方法で得ることができる樹状突起細胞。１０．インタ−ロイキン１（ＩＬ−１）、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）、インタ−ロイキン６（ＩＬ−６）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）および幹細胞成長因子（ＳＣＦ）から成る造血性成長因子の組合せを含有することを特徴とする、樹状突起細胞を拡大するための容器。１１．インタ−ロイキン１が１０ｎｇ／ｍｌと１０００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在し、インタ−ロイキン３が１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在し、インタ−ロイキン６が１０Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在し、エリスロポイエチンが０．１Ｕ／ｍｌと１０Ｕ／ｍｌとの間の濃度で存在し且つ幹細胞増殖因子が１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在し、顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在しかつ腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ−α）が１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在することを特徴とする、請求項１０に記載された組合せを含有する容器。１２．細胞培養瓶であることを特徴とする、請求項１０に記載された容器。１３．請求項９に記載された樹状突起細胞を免疫応答を誘発させるための抗原提示細胞として使用する用途。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｍ 1/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 (72)発明者ヘンシュラー、ラインハルトドイツ国、デー−79106、フライブルク、フェルト−ヴァイス−シュトラーセ、45番 (72)発明者ケーラー、ガブリエレドイツ国、デー−79104、フライブルク、レンゲンハルト−シュトラーセ、16番 (72)発明者シェーファー、ハンス−エッカートドイツ国、デー−79111、フライブルク、ヴァインベルクシュトラーセ、15番 (72)発明者リンデマン、アルブレヒトドイツ国、デー−79294、ゼルデン、ビュルグレシュトラーセ、18デー (72)発明者マーテルスマン、ローランドドイツ国、デー−79104、フライブルク、ゾンハルデ、72番 (72)発明者マッケンゼン、アンドレアスドイツ国、デー−79106、フライブルク、カルトイザーシュトラーセ、92番 (72)発明者パウル、フィシュドイツ国、デー−79110、フライブルク、エディト−スタイン−シュトラーセ、16番 (72)発明者ヘルプスト、ビルジットドイツ国、デー−79227、シャールシュタット、アオフ・デム・フェルデーレ、20番

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を行うことを特徴とする、樹状突起細胞を調製する方法：ａ）末梢血液細胞を血液から単離すること；ｂ）ＣＤ３４抗原を発現する末梢血液前駆細胞を濃縮・強化すること；ｃ）これらの細胞を造血性成長因子および／またはサイトカインと共に培養すること；および、適切な場合、ｄ）樹状突起細胞を次に濃縮・強化すること。２．該末梢血液前駆細胞をヘパリン処理血液試料から密度勾配遠心分離で単離することを特徴とする、請求項１に記載された方法。３．該末梢血液前駆細胞をＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅを介して密度勾配遠心分離で単離することを特徴とする、請求項２に記載された方法。４．該末梢血液前駆細胞を表面抗原ＣＤ３４に対向・配向せしめたモノクロ− ナル抗体と反応させることを特徴とする、請求項１に記載された方法。５．表面抗原ＣＤ３４に対向・配向せしめたモノクロ−ナル抗体と事前に反応させた該末梢血液前駆細胞を免疫アフィニティ−カラム、特にアビジン免疫アフィニティ−カラムによる処理で反応しなかった細胞から分離することを特徴とする、請求項４に記載された方法。６．該末梢血液前駆細胞を、インタ−ロイキン１（ＩＬ−１）、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）、インタ−ロイキン６（ＩＬ−６）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）および幹細胞成長因子を含有する細胞増殖培地中において培養することによって拡大させることを特徴とする、請求項１に記載された方法。７．該末梢血液前駆細胞を、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファ −ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α ）また適切である場合は、インタ−ロイキン４（ＩＬ−４）含有する細胞増殖培地中において拡大させることを特徴とする、請求項１に記載された方法。８．該末梢血液前駆細胞を、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インタ−ロイキン１β（ＩＬ−１β）、インタ−ロイキン３（ＩＬ −３）、インタ−ロイキン４（ＩＬ−４）、インタ−ロイキン６（ＩＬ−６）および顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含有する細胞増殖培地中において拡大させることを特徴とする、請求項１に記載された方法。９．該末梢血液前駆細胞を、第一段階として幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インタ−ロイキン１β（ＩＬ−１β）、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）、インタ−ロイキン４（ＩＬ−４）およびインタ−ロイキン６（ＩＬ−６）を含有する細胞増殖培地中において拡大させることおよび該細胞を拡大させた後、第二段階として分化させるためにインタ−ロイキン４（ＩＬ −４）と顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とを含有する培地に移すことを特徴とする請求項１に記載された方法。１０．該血液を通常の用量での化学療法に供しておいた癌患者から採取するに際して、該化学療法がエトポサイド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ；Ｖ１６）、イフォスファマイド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）とを使用することから成るものであることを特徴とする、請求項１に記載された方法。１１．化学療法に供し次いで遺伝子組み換えヒトインタ−ロイキン３（ｒｈＩＬ−３）、遺伝子組み換え顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ｒｈＧＭ −ＣＳＦ）または遺伝子組み換え顆粒球コロニ−刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）の連続併用に供した癌患者から該血液を採取することを特徴とする、請求項１に記載された方法。１２．該ＣＤ３４⁺を白血球搬出法産物から採取することを特徴とする、前記請求項のうちの何れか一項に記載された方法。１３．請求項１ないし１２のうちの一項に記載された方法で得ることができる樹状突起細胞。１４．インタ−ロイキン１（ＩＬ−１）、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）、インタ−ロイキン６（ＩＬ−６）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）および幹細胞成長因子から成る造血性成長因子の組合せ。１５．インタ−ロイキン１β（ＩＬ−１β）、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）、インタ−ロイキン４（ＩＬ−４）、インタ−ロイキン６（ＩＬ−６）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、および顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とから成ることを特徴とする、造血性成長因子の組合せ。１６．幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）から成る造血性成長因子の組合せ。１７．インタ−ロイキン１（ＩＬ−１）が１０ｎｇ／ｍｌと１０００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在し、インタ−ロイキン３（ＩＬ−３）が１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在し、インタ−ロイキン４（ＩＬ−４）が５０ｎｇ／ｍｌと２００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在し、インタ−ロイキン６（ＩＬ −６））が１０Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在し、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）が０．１Ｕ／ｍｌと１０Ｕ／ｍｌとの間の濃度で存在し、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）が１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在し、顆粒球マクロファ−ジュコロニ−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度で存在しかつ腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ−α）が１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で存在することを特徴とする請求項１４ないし１６のうちの何れか一項に記載された組合せ。１８．さらに１Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度でのインタ−フェロン−γ（ＩＦＮ−α）を含んで成ることを特徴とする、請求項１７に記載された組合せ。１９．請求項１４ないし１８までのうちの何れか一項に記載された組合せを含有していることを特徴とする、樹状突起細胞を拡大するための容器。２０．細胞培養瓶であることを特徴とする請求項１９に記載された容器。２１．請求項１３に記載された樹状突起細胞を免疫応答を誘発させるための抗原提示細胞として使用する用途。