[go: up one dir, main page]

JPH09511124A - キメラ遺伝子ならびにトウモロコシ、ダイズおよびナタネ植物 - Google Patents

キメラ遺伝子ならびにトウモロコシ、ダイズおよびナタネ植物

Info

Publication number
JPH09511124A
JPH09511124A JP7515636A JP51563695A JPH09511124A JP H09511124 A JPH09511124 A JP H09511124A JP 7515636 A JP7515636 A JP 7515636A JP 51563695 A JP51563695 A JP 51563695A JP H09511124 A JPH09511124 A JP H09511124A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plant
lysine
seeds
gene
seed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP7515636A
Other languages
English (en)
Inventor
フアルコ，サベリオ・カール
キーラー，シヤロン・ジヨー
ライス，ジヤネツト・アン
Original Assignee
イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー filed Critical イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Publication of JPH09511124A publication Critical patent/JPH09511124A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C12N15/8254—Tryptophan or lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/54—Leguminosae or Fabaceae, e.g. soybean, alfalfa or peanut
    • A01H6/542—Glycine max [soybean]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は３つのキメラ遺伝子に関し、第１はリシンによる阻害に対して非感受性であり、そして植物クロロプラストのトランジット配列に操作可能に連結されているジヒドロジピコリン酸シンターゼ(DHDPS)、第２はリシンに富むタンパク質をコードし、そして第３は植物リシンケトグルタル酸レダクターゼをコードし、すべてが植物種子−特異的調節配列に操作可能に連結されている。形質転換植物の種子中のリシンレベルを増加するための、その使用法が提供される。また、種子が非形質転換植物よりも高いレベルでリシンを蓄積する、形質転換したトウモロコシ、ナタネおよびダイズ植物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラ遺伝子ならびにトウモロコシ、ダイズおよびナタネ植物 種子中のリシン含量の増加法 本発明は３つのキメラ遺伝子、第１はジヒドロジピコリン酸シンターゼ(DHDPS )、これはリシンによる阻害に対して非感受性であり、そして操作可能に植物ク ロロプラストのトランジット配列に連結されており、第２はリシンに富むタンパ ク質をコードし、そして第３は植物リシンケトグルタル酸レダクターゼをコード し、そして全ては植物種子−特異的調節配列に操作可能に連結している。形質転 換した植物の種子中にリシンを増大して生産するための、その使用方法が提供さ れている。また、形質転換したトウモロコシ、ナタネおよびダイズ植物も提供さ れ、それらの種子は非形質転換植物よりも高いレベルのリシンを蓄積する。 発明の背景 多くの穀粒に由来する人間の食料および動物飼料は、動物の食事に必須な１０ の必須アミノ酸の幾つかが欠けている。トウモロコシ（ゼアメイズ エル.：Zea mays L.）では、多くの動物の食事に必要なリシンが最も限定されているアミノ 酸である。他の作物に由来するミール、例えばダイズ（グリシン マックス エル .：Glycine max L.）またはキャノーラ(ブラッシカ ナプス：Brassica napus)は 、トウモロコシを基本とした動物飼料に添加され、このリシンの欠乏を補充して いる。また、さらに微生物の発酵を通して生産されたリシンが動物飼料中の補助 剤として使用されている。植物起源に由来するミール中のリシン含量が増加 すれば、微生物的に生産されたリシンを穀粒飼料と混合することは減るか、また はその必要が無くなる。 種子中のアミノ酸含量は、主に（90-99％）種子中のタンパク質のアミノ酸組 成により、そして程度は低いが（1-10％）遊離のアミノ酸プールにより定められ る。種子中の全タンパク質量は、乾燥穀物重量の約10％から豆果の乾燥重量の20 -40％と可変である。多くのタンパク質−結合アミノ酸が、種子の発生中に合成 され、そして発芽後の主要な栄養保存物として役立つ種子貯蔵タンパク質中に含 有されている。多くの種子中で、貯蔵タンパク質は全タンパク質の50％を占める 。 種子のアミノ酸組成を改良するためには、遺伝子工学技術がトランスジェニッ ク植物中の貯蔵タンパク質を単離し、そして発現させるために使用されている。 例えば、26％硫黄−含有アミノ酸から成るブラシル産ナッツ由来の種子２Ｓアル ブミン遺伝子が単離され[Altenbachら、(1987)Plant Mol.Biol.8:239-250]、そ してインゲンのファゼオリン貯蔵タンパク質遺伝子由来の調節配列の制御下で、 形質転換したタバコの種子中に発現された。このタバコ種子中の硫黄に富むタン パク質の蓄積により、種子中のメチオニンレベルが最高30％まで増大した[Alten bachら、(1989)Plant Mol.Biol.13:513-522]。しかし、植物タンパク質の平均的 リシン含量に関して、同じようにリシンが濃縮された植物種子貯蔵タンパク質は これまでに確認されておらず、この方法をリシンの増加に使用することを遠ざけ ている。 別の方法は遺伝子工学的手法を介してリシンの生産および蓄積を増大させるこ とである。リシンはトレオニン、メチオニンおよびイソロイシンと共にアスパラ ギン酸から派生し、そしてこの族の各員の生合成の調 節は複雑であり、相互に連絡しており、そして特に植物中ではよく解明されてい ない。経路中の代謝的な流れの調節は、植物中の最終生成物を介しているようで ある。このアスパラギン酸族経路も、分岐点反応で調節されている。リシンに関 しては、これはジヒドロジピコリン酸シンターゼ(DHDPS)により触媒される、ピ ルビン酸とのアスパラチル β-セミアルデヒドの縮合である。 大腸菌 dapA遺伝子は、例えば小麦胚芽DHDPSのような典型的な植物DHDPS酵素 よりも、リシンによる阻害に対して約20倍低い感受性のDHDPS酵素をコードする 。大腸菌 dapA遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターおよ び植物クロロプラストのトランジット配列に連結された。このキメラ遺伝子は形 質転換によりタバコ細胞中に導入され、そして葉中に遊離リシンレベルの増大を 生じることが示された[Glassmanら、(1989)国際出願第PCT/US89/01309号明細書 、Shaulら、(1992)Plant Jour.2:203-209、Galiliら、(1992)欧州特許出願第911 19328.2号明細書、Falco、PCT/US93/02480(国際公開第 93/19190)号明細書)。し かし、種子中のリシン含量はこれらの研究で記載されたいかなる形質転換植物で も増加しなかった。同じキメラ遺伝子をジャガイモ細胞中に導入し、そして再生 した植物の葉、根および塊茎中にわずかに増加した遊離リシンが生じた[Galili ら、(1992)欧州特許出願第91119328.2号明細書、Perlら、(1992)Plant Mol.Biol ．19:815-823]。 Falco、PCT/US93/02480(国際公開第 93/19190)号は、種子中の発現を増大させ るために大腸菌dapA遺伝子をインゲンのファゼオリンプロモーターおよび植物ク ロロプラストのトランジット配列に連結したが、種子中のリシンレベルの増加は 未だ観察されなかった。上記のように、リシ ン生合成経路の第１段階はアスパルトキナーゼ（AK）により触媒され、そしてこ の酵素は多くの生物にとって調節のたのめの重要な標的であることが判明した。 Falcoは、リシン−フィードバック−非感受性ＡＫをコードする大腸菌lysC遺伝 子の突然変異体を単離し、そしてそれをインゲンのファゼオリンプロモーターお よび植物クロロプラストのトランジット配列に連結した。形質転換したタバコの 種子中のこのキメラ遺伝子の発現は、リシンではなくトレオニンレベルの実質的 増加をもたらした。Galiliら、(1992)欧州特許出願第91119328.2号明細書は、種 子特異的プロモーターを植物のクロロプラストのトランジット配列／大腸菌dapA 遺伝子および植物のクロロプラストのトランジット配列／突然変異体大腸菌lysC 遺伝子に連結しているキメラ遺伝子で植物を形質転換すると、種子中のリシンレ ベルの上昇を導くことを示唆している。Falco、PCT/US93/02480(国際公開第 93/ 19190)号は、タバコを両方のキメラ遺伝子(インゲン ファゼオリンプロモーター ／植物クロロプラストのトランジット配列／大腸菌dapA遺伝子およびインゲン ファゼオリンプロモーター／植物クロロプラストのトランジット配列／突然変異 体大腸菌lysC遺伝子)を持つ構築物で形質転換することによりこの実験を行った 。両遺伝子の同時発現は種子中のリシン含量に有意な効果を及ぼさなかった。し かし、リシンの分解生成物であるα-アミノアジピン酸は種子中に蓄積した。こ れは種子中の遊離リシンの蓄積がリシンの異化作用により妨害されることを示唆 している。リシンの生合成速度を増す試みにおいて、Falco、PCT/US93/02480(国 際公開第 93/19190)号は、完全にリシンに非感受性であるDHDPS酵素をコードす るコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebactertium glutamicum)dapA遺伝 子を単離した。Falcoは、 タバコをキメラ遺伝子（インゲン ファゼオリンプロモーター／植物クロロプラ ストのトランジット配列／コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebactertium glutamicum)dapA遺伝子を、インゲン ファゼオリンプロモーター／植物クロロ プラストのトランジット配列／突然変異体大腸菌lysC遺伝子突然変異体に連結し た）を含む構築物で形質転換した。これら２つのリシン−非感受性酵素の同時発 現も、種子中のリシン含量に有意な効果を及ぼさなかった。 したがって、植物、特に種子中のリシン生合成経路調節の詳細に関する理解の 限界から、遺伝子工学をリシン含量を増大するために応用することは不確実であ ることは明らかである。ほとんどの植物に関して、リシンが種子で合成されるの か、または葉から種子に輸送されるのかは未知である。さらに、種子中のリシン の貯蔵および異化作用については知られていない。遊離アミノ酸は種子の全アミ ノ酸含量のわずかな画分を構成するだけなので、種子の全アミノ酸組成に有意な 影響を及ぼすためには過剰−蓄積は何倍にもならなければならない。さらに、リ シンのような遊離アミノ酸の過剰−蓄積が種子発生および生存能力に及ぼす効果 は、知られていない。 遺伝子工学を介した種子中のリシン含量の増加法、および遺伝子工学を介して 得たリシンレベルが増大した種子の例は本明細書に記載される以前には知られて いない。 発明の要約 本発明は新規キメラ遺伝子、ならびに該新規遺伝子を使用して形質転換した植 物に関し、ここでリシンによる阻害に非感受性のジヒドロジピコリン酸シンター ゼをコードする核酸断片が、植物クロロプラストのト ランジット配列および植物種子−特異的調節配列に操作可能に連結されている。 好適な態様では、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片は、コ リネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来のジヒドロ ジピコリン酸シンターゼをコードする配列番号３に示すヌクレオチド配列を含ん で成る。特に好適な態様では、植物クロロプラストのトランジット配列は、リブ ロース1,5-ビスフォスフェイトカルボキシラーゼの小サブユニットをコードする 遺伝子に由来し、そして種子−特異的調節配列がインゲン ファセオラス バルガ リス(Phaseolus vulgaris)由来の種子貯蔵タンパク質ファゼオリンのβ-サブユ ニットをコードする遺伝子、グリシン マックス(Glycine max)のクニッツ トリ プシン インヒビター３遺伝子または単子葉類の胚特異的プロモーター、好まし くはゼア メイズ(Zea maize)のグロブリン１遺伝子に由来する調節配列である。 記載する遺伝子は例えば植物、好ましくはトウモロコシ、ナタネまたはダイズ 植物を形質転換するために使用できる。また形質転換した植物から得られた種子 も特許請求する。本発明は植物の種子が、非形質転換した植物の種子よりも少な くとも10パーセント、好ましくは非形質転換した植物よりも10から400パーセン ト高いレベルでリシンを蓄積する形質転換植物を作成できる。 さらに本発明は、種子が非形質転換植物の種子よりも10から400パーセント高 いレベルのリシンを蓄積する植物、好ましくはトウモロコシ、ナタネまたはダイ ズ植物を得る方法に関し、 （ａ）植物細胞、好ましくはトウモロコシ、ナタネまたはダイズ細胞を上記キ メラ遺伝子で形質転換し、 （ｂ）工程（ａ）から得た形質転換植物細胞に由来する受精した成熟植物を、 種子を得るために適する条件下で再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子のリシンレベルが高い系を選択する、 工程を含んで成る。この方法により獲た形質転換植物も特許請求する。 本発明はさらに核酸断片にも関し、該核酸断片は （ａ）上記の第１キメラ遺伝子、および （ｂ）リシンの重量パーセントが少なくとも15％であるリシンに富むタンパク 質をコードする核酸断片が、植物種子特異的調節配列に操作可能に連結された第 ２キメラ遺伝子、 を含んで成る。 また、（ａ）上記の第１キメラ遺伝子、および （ｂ）リシンに富むタンパク質をコードする核酸断片が、各々の７つ揃が同じか 、または異なるｎ個の７つ揃いの単位（ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ａ、ｂ、ｃ）、ここで ｎは少なくとも４であり、 ａおよびｄは独立してMet、Leu、Val、IleおよびThrから成る群から選択され 、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対、Glu/lys、Lys/Glu、Arg/Glu、Arg/Asp、Ly s/Asp、Glu/Arg、Asp/ArgおよびAsp/Lysから成る群から選択され、そして ｂ、ｃおよびｆは独立してGlyまたはProを除く任意のアミノ酸であり、そして 各々の７つ揃の少なくとも２つのアミノ酸ｂ、ｃおよびｆ がGlu、Lys、Asp、Arg、His、Thr、Ser、Asn、Ala、GlnおよびCysから成る群か ら選択される、 を含んで成るタンパク質をコードする核酸配列を含んで成り、該核酸断片が植物 種子特異的調節配列に操作可能に連結されている、第２キメラ遺伝子を含んで成 る核酸断片を記載する。 さらに本明細書では、 （ａ）上記の第１キメラ遺伝子；および （ｂ）アミノ酸配列(MEEKLKA)6(MEEKMKA)2を有するタンパク質をコードする核 酸配列を含んで成るリシンに富むタンパク質をコードする核酸断片が、種子特異 的調節配列に操作可能に連結されている、第２キメラ遺伝子、 を含んで成る核酸断片を記載する。 また本明細書では、記載した第１キメラ遺伝子および第２キメラ遺伝子の様々 な態様を含む植物、および記載した核酸断片、ならびにそのような植物から得た 種子を特許請求する。 さらに本発明は、 （ａ）上記第１キメラ遺伝子、および （ｂ）リシンケトグルタル酸レダクターゼをコードする核酸断片が、センスま たはアンチセンスの方向で植物種子特異的調節配列に操作可能に連結されている 、第２キメラ遺伝子、 を含んで成る核酸断片に関する。また、ゲノム中に核酸断片を含んで成る植物、 およびそのような植物から得た種子も特許請求する。 図面および配列の記載に関する簡単な説明 本発明は以下の詳細な記載、ならびに本出願の一部を形成する添付の 図面および配列の記載から、より完全に理解できるだろう。 図１は、側面および頂点から見たアルファ−ヘリックス状態を示す。 図２は、アルファ−ヘリックスコイル化コイル構造の末端（図２ａ）および側 面（図２ｂ）を示す。 図３は、同様な形状であることを強調しているロイシンおよびメチオニンの化 学構造を示す。 図４は、種子特異的発現カセットの概略的表示を示す。 図５Ａは、バイナリープラスミドベクターpZS199の地図を示し；図５Ｂはバイ ナリープラスミドベクターpFS926の地図を示す。 図６Ａは、プラスミドベクターpBT603の地図を示し；図６Ｂはプラスミドベク ターpBT614の地図を示す。 図７は、ＳＳＰ遺伝子配列の構築および発現に使用するベクター(pSK5)を作成 するための方法を表す。 図８は、基本の遺伝子配列の独特のEarＩ部位中にオリゴヌクレオチド配列を 挿入するための方法を示す。 図９は、プラスミドpSK6を作成するために、基本の遺伝子オリゴヌクレオチド のpSK5のNcoI/EcoRI部位への挿入を示す。この基本遺伝子配列は図８で使用され た、様々なＳＳＰコーディング領域を独特なEarI部位に挿入して、掲げたクロー ン化セグメントを作成した。 図１０は、図１１の重複スキームに使用するために、非−反復遺伝子配列を作 成するために使用する６３ｂｐ“セグメント”オリゴヌクレオチドの挿入を示す 。 図１１（ＡおよびＢ）は、枠内融合に使用する非−反復遺伝子“セグメント” を増幅する方法を示す。 図１２は、種子特異的プロモーターおよび３’配列カセットを含むベクターを 示す。ＳＳＰ配列を、NcoＩおよびAsp718部位を使用してこれらのベクターに挿 入した。 図１３はバイナリープラスミドベクターpZS97の地図を示す。 図１４はプラスミドベクターpML63の地図を示す。 図１５は、種子特異的調節配列（ダイズ クニッツ トリプシンインヒビター ３遺伝子）がクロロプラストのトランジット配列（ダイズ リブロースビス−フ ォスフェート カルボキシラーゼの小サブユニット由来）およびリシン−非感受 性ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(コリネバクテリウム グルタミカン：Coryn ebacterium glutamicum由来のdapA遺伝子)のコーディング配列に連結されたキメ ラ遺伝子を持つプラスミドベクターpML102の地図を示す。 配列番号１および２は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）dapA遺伝子 の単離のために、PCRプライマーとして実施例１に使用した。 配列番号３は、野生型コリネバクテリウム（Corynebacterium）dapA遺伝子の コーディング領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、これは実施例１に 記載するリシン非感受性DHDPSをコードする。 配列番号４は、大腸菌dapA遺伝子の翻訳開始コドンにNcoＩ部位を作成するた めに実施例２で使用するオリゴヌクレオチドを示す。 配列番号５は、野生型大腸菌lysC遺伝子のコーディング領域のヌクレオチドお よびアミノ酸配列を示し、これは実施例３に記載するAKIIIをコードする。 配列番号６および７は、大腸菌lysC遺伝子の翻訳開始コドンにNcoＩ部位を作 成するために実施例３で使用した。 配列番号８、９、１０および１１は、クロロプラストのトランジット配列を作 成し、そして配列を大腸菌lysC-M4、大腸菌dapAおよびコリネバクテリウム（Cor ynebacterium ）dapA遺伝子に連結するために、実施例４で使用した。 配列番号１２および１３は、大腸菌dapA遺伝子の翻訳終止コドンの直後にKpn Ｉ部位を作成するために実施例４で使用した。 配列番号１４および１５は、ダイズクロロプラストのトランジット配列を作成 すし、そして配列をコリネバクテリウム（Corynebacterium）dapA遺伝子に連結 するために、PCRプライマーとして実施例４で使用した。 配列番号１６−９２は、植物種子中での発現に適するリシンに富む合成種子貯 蔵タンパク質のキメラ遺伝子を作成するために、使用される核酸断片およびそれ がコードするポリペプチドを表す。 配列番号９３−９８は、トウモロコシ クロロプラストのトランジット配列を 作成するために実施例１２で使用した。 配列番号９９および１００は、トウモロコシ クロロプラストのトランジット 配列を作成し、そしてこの配列を大腸菌dapA遺伝子に連結するために、PCRプラ イマーとして実施例１２で使用した。 配列の記載は、Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)およびBiochemic al Journal 219(No.2):345-373(1984)(これらは引用により本明細書に編入する) に記載されるように、IUPAC-IYUB標準に従って定められたヌクレオチド配列の特 性をコードする１つの文字、およびアミノ酸をコードする３つの文字を含む。 発明の詳細な説明 以下の技術は核酸断片、ならびに非形質転換植物中のリシンレベルと 比較して形質転換植物の種子中にリシンの蓄積を増加させるのに有用な方法を記 載する。遺伝子工学を介して植物種子中の遊離リシンの蓄積を増加させるために 、この経路のどの酵素が植物種子中の経路を制御しているのかを決定した。これ を行うために、この経路中の酵素をコードする遺伝子を細菌から単離した。植物 の種子中で発現するために、細胞内局在化配列および適当な調節配列を連結して 、キメラ遺伝子を作成した。次にこのキメラ遺伝子を形質転換を介して植物中に 導入し、そして種子中にリシンの蓄積を発現する能力について評価した。強力な 種子特異的プロモーターの制御下のリシン−非感受性ジビドロジピコリン酸シン ターゼ(DHDPS)の発現は、トウモロコシ、ナタネおよびダイズ種子中のリシンレ ベルを10から100倍に増大することを示す。 種子中に過剰な遊離リシンを蓄積するために十分な可能性が、リシン異化作用 により減少させられることが見いだされた。本明細書では異化作用による過剰リ シンの損失を防ぐ２つの別個のルートを提供する。第１の方法では、リシン異化 作用を酵素リシンケトグルタル酸レダクターゼ(LKR)(これはリシン分解の第１段 階を触媒する)の活性を減少させることを通して妨害する。植物LKR遺伝子を単離 する方法を提供する。アンチセンスLKR RNAの発現のための、または植物種子中 のLKRのコーサプレッション(cosuppression)のためのキメラ遺伝子を作成する。 このキメラ遺伝子を次にキメラDHDPS遺伝子につなぎ、そして両方を形質転換を 介して同時に植物中に導入するか、または各キメラ遺伝子で別個に形質転換した 植物を交配することにより遺伝子を一緒に持ち込む。 第２の方法は、過剰な遊離リシンが分解に対して非感受性な状態（例えば、ジ −、トリ−またはオリゴペプチド、あるいはリシンに富む貯蔵 タンパク質中に取り込まれることにより）で取り込まれる。リシンに富む種子貯 蔵タンパク質として役立つために、インビボで発現することができるポリペプチ ドの設計を提供する。リシンに富む合成貯蔵タンパク質（ＳＳＰ）をコードする 遺伝子が合成され、そして植物種子中で発現させるために、ＳＳＰ遺伝子を適当 な調節配列に連結したキメラ遺伝子を作成する。このＳＳＰキメラ遺伝子を次に キメラDHDPS遺伝子に連結し、そして両方を形質転換を介して同時に植物中に導 入するか、あるいは各キメラ遺伝子で別個に形質転換した植物を交配することに より遺伝子を一緒に持ち込む。 植物、好ましくはトウモロコシ、ナタネおよびダイズ植物を形質転換する方法 は本明細書に教示され、そこで生成した植物の種子は、非形質転換植物の種子よ りも少なくとも10パーセント、好ましくは10から400パーセント多いリシンを有 する。実施例として本明細書で提供するのは、種子のリシンレベルが非形質転換 植物に対して100％まで増加した形質転換したナタネ植物、種子のリシンレベル が非形質転換植物に対して400％まで増加したダイズ植物、および種子のリシン レベルが非形質転換植物に対して130％まで増加した形質転換したトウモロコシ 植物である。 本開示の内容には、多くの用語を使用する。本明細書で使用する“核酸”とい う用語は、糖、リン酸塩およびプリンまたはピリミジンのいずれかを含むモノマ ー（ヌクレオチド）から成る一本鎖または二本鎖であることができる巨大分子を 言う。“核酸断片”は所定の核酸分子の画分である。高等植物では、デオキシリ ボ核酸（ＤＮＡ）が遺伝物質であるのに対して、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡの 情報をタンパク質に伝えることに関与している。“ゲノム”とは生物の各細胞中 に含まれる遺伝物 質の全体である。“ヌクレオチド配列”とは、一本−または二本鎖であることが できるＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを言い、これらは場合によってはＤＮＡま たはＲＮＡ中に取り込まれることができる合成、非−天然、または改変したヌク レオチド塩基を含んでいる。 “遺伝子“とは特別なタンパク質を発現する核酸断片を言い、コーディング領 域の前（５’非コーディング）および後（３’非コーディング）にある調節配列 を含む。“天然”の遺伝子とは、自らの調節配列を持つ天然に見いだされる遺伝 子を言う。“キメラ”遺伝子とは、ヘテロロガスな調節およびコーディング配列 を含んで成る遺伝子を言う。“内因性“遺伝子とは、ゲノム中に天然の位置で通 常見いだされる天然の遺伝子を言う。“外来”遺伝子とは、宿主生物中には通常 見いだされないが、遺伝子転移により導入される遺伝子を言う。 “コーディング領域”とは、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を言い 、そして非コーディング配列を除外する。 “開始コドン”および“終止コドン”とは、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳） の開始および鎖終結をそれぞれ特定するコーディング配列中の隣接する３つのヌ クレオチド単位を言う。“読み取り枠”とは、コーディング配列の翻訳開始と終 止コドンの間にコードされたアミノ酸配列を言う。 本明細書で使用するように、適当な“調節配列”とは、コーディング配列の上 流（５’）、その中および／または下流（３’）に位置するヌクレオチド配列を 言い、これは潜在的に細胞のタンパク質生合成装置と関連して、コーディング配 列の転写および／または発現を制御する。これらの調節配列はプロモーター、翻 訳リーダー配列、転写終止配列およ びポリアデニレーション配列を含む。 “プロモーター“とは遺伝子中のＤＮＡ配列を言い、通常、遺伝子のコーディ ング配列の（５’）上流であり、これがＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に 必要な他の因子に認識を提供することにより、コーディング配列の発現を制御す る。プロモーターは、生理学的または発生的条件に反応して、転写開始の効率を 制御するタンパク質因子に結合することに関与するＤＮＡ配列も含んでよい。ま たエンハンサー要素を含むこともできる。 “エンハンサー”とはプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列を言う。これ はプロモーターの内在的要素、またはプロモーターのレベルおよび／または組織 特異性を強化するために挿入されたヘテロロガスな要素であってもよい。“構成 的プロモーター”とは、全ての組織に、かつ何時でも遺伝子発現を支配できるプ ロモーターを言う。本明細書で言う“器官−特異的”または“発生−特異的”プ ロモーターとは、特定の器官（例えば葉または種子のような）で、あるいは器官 の特定の発生段階（例えば胚形成の初期または後期のような）で、それぞれほと んど排他的に遺伝子発現を支配するプロモーターを言う。 “操作可能に連結した”とは、１つの核酸分子に、１つの機能がもう１つによ り影響されるように結合している核酸配列を言う。例えば、プロモーターが構造 遺伝子の発現に影響を与えることができるとき、プロモーターは構造遺伝子に操 作可能に連結されている（すなわち、構造遺伝子はプロモーターの転写制御下で ある）。 本明細書で使用する用語“発現”は、遺伝子によりコードされるタンパク質産 物の生産を意味するものとする。より詳細には“発現”は、細 胞のタンパク質装置と関連して、本発明の核酸断片（１つまたは複数）に由来す るセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を言い 、変化したレベルのタンパク質産物を生じる。“アンチセンス阻害”とは、標的 タンパク質の発現を妨害できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生産を言う。“過剰 発現”とは、通常の、または非形質転換生物での生産レベルを越えるトランスジ ェニック生物での遺伝子産物の生産を言う。“コーサプレッション”とは、外来 および内因性遺伝子の両方の発現のサプレッションを生じる、内因性遺伝子と実 質的なホモロジーを有する外来遺伝子の発現を言う。“変化したレベル”とは、 通常の、または非形質転換生物とは異なる、トランスジェニック生物中での遺伝 子産物（１つまたは複数）の生産量または比率を言う。 “３’非コーディング配列”とは、ポリアデニレーションシグナルおよびｍＲ ＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる他の任意の調 節シグナルを含む、遺伝子のＤＮＡ配列部分を言う。ポリアデニレーションシグ ナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸尾が付加されているこ とが特徴である。 “翻訳リーダー配列”とは、プロモーターと、ＲＮＡに転写され、そして翻訳 開始コドンの（５’）上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡ中に存在するコーデ ィング配列との間の遺伝子のＤＮＡ配列部分を言う。翻訳リーダー配列は、１次 転写産物のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に対し て影響を及ぼすことができる。 “成熟”タンパク質とは、その標的シグナル無しで翻訳後にプロセッシングさ れたポリペプチドを言う。“前駆体”タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産 物を言う。“クロロプラスト標的シグナル”は、タン パク質と結合して翻訳され、そしてタンパク質をクロロプラストに向けるアミノ 酸配列を言う。“クロロプラストのトランジット配列”とは、クロロプラスト標 的シグナルをコードするヌクレオチド配列を言う。 本明細書の“形質転換”とは、外来遺伝子を宿主生物のゲノムへの転移、およ びその遺伝的に安定な継承を言う。植物の形質転換法の例には、アグロバクテリ ウム(Agrobacterium)-媒介形質転換および粒子-加速または“遺伝子銃”形質転 換法がある。 本明細書の“アミノ酸”とは、天然に存在するＬアミノ酸（アラニン、アルギ ニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン 、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロ リン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよ びバリン）を言う。“必須アミノ酸”は、動物により合成されることができない アミノ酸である。本明細書の“ポリペプチド”または“タンパク質”は、アミド 結合（ペプチド結合としても知られている）により直線的に連結したモノマー（ アミノ酸）から成る分子を言う。 本明細書の“合成タンパク質”とは、天然に存在するとが知られてないアミノ 酸配列から成るタンパク質を言う。このアミノ酸配列は、天然に存在するタンパ ク質に共通するものに由来するか、あるいは全体が新規であってよい。 “一次配列”とは、分子の配置とは関係の無いポリペプチド鎖中のアミノ酸結 合の順序を言う。一次配列は慣例により、ポリペプチド鎖のアミノ末端からカル ボキシ末端へ記載される。 本明細書の“二次構造”とは、側鎖の同一性または配置の多様性とは 関係の無いポリペプチド鎖の物理−化学的に好ましい規則的な骨格配列を言う。 本明細書で使用する“アルファ ヘリックス”とは、ヘリックス１回転あたり約 3.6残基を持つ右回りのヘリックスを言う。本明細書の“両親媒性ヘリックス” とは、ヘリックスの１方の側が主に疎水性であり、そして他方の側が主に親水性 であるヘリックス配置のポリペプチドを言う。 本明細書の“コイル化−コイル“とは、互いに巻合って左回りのスーパーヘリ ックスを形成する２つの平行した右回りのアルファヘリックスの集合を言う。 本明細書に記載するような“塩ブリッジ(salt-bridges)“とは、求引的静電相 互作用がポリペプチド鎖の２つの部分あるいは１つの鎖ともう１つの鎖との間に 維持されるように空間内に配列した、荷電したアミノ酸側鎖の酸塩基対を言う。 “宿主細胞”とは、導入された遺伝物質で形質転換された細胞を意味する。 ＤＨＤＰＳ遺伝子の単離 大腸菌dapA遺伝子(ecodapA)を、コハラ、アキヤマおよびイソノ[コハラら、(1 987)Cell 50:595-508]により構築された大腸菌DNAの3400の重複セグメントの整 列ライブラリーから、バクテリオファージ ラムダクローンとして得た。ecodapA の単離および改変の詳細を実施例１に与える。ecodapA遺伝子は、典型的な植物 酵素（例えば小麦ＤＨＤＰＳ）よりもリシンによる阻害に対して感受性が、少な くとも20倍少ないＤＨＤＰＳ酵素をコードする。本発明の目的に関して、リシン による阻害に対して20倍感受性が低いことを、リシン−非感受性と言う。 コリネバクテリウム（Corynebacterium）dapA遺伝子(cordapA)を、ポリメラー ゼ連鎖反応（PCR）を使用して、ＡＴＣＣ13032株のゲノムＤＮＡから単離した。 コリネバクテリウム（Corynebacterium）dapA 遺伝子のヌクレオチド配列は、公 開されている[Bonnassieら、(1990)Nucleic Acids Res.18:6421]。その配列から 、この遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を可能にし、そして同時にさらに遺伝子が 関与するさらなる構築を容易にするために、遺伝子の開始コドンおよび終止コド ンがちょうど終わったところに独特の制限ヌクレアーゼ部位を付加することを可 能にする、ポリメラーゼ連鎖反応PCR）用のオリゴヌクレオチドプライマーを設 計することが可能になる。コリネバクテリウム（Corynebacterium）dapA（corda pA ）遺伝子の単離に関する詳細は実施例１に与える。このcordapA遺伝子は、酵 素反応混合物中に70mM リシンが存在することによっても影響を受けない好適な リシン-非感受性ＤＨＤＰＳ酵素をコートする。 ＤＨＤＰＳをコードする他の遺伝子の単離は、文献に記載されている。小麦由 来のＤＨＤＰＳをコードするｃＤＮＡ[カネコら(1990)J.Biol.Chem.265:17451-1 7455]、およびトウモロコシ由来のＤＨＤＰＳをコードするｃＤＮＡ[Frischら、 (1991)Mol.Gen.Genet,228:287-293]は、単離および配列が決定された植物ＤＨＤ ＰＳ遺伝子の２例である。植物遺伝子は野生型リシン−感受性ＤＨＤＰＳをコー ドする。しかし、Nerutuiら［(1984)Theor.Appl.Genet.68:11-20］は、リシン阻 害に対するＤＨＤＰＳ活性が野生型酵素よりも感受性が低い2つのAEC-耐性タバ コ突然変異体を得た。これはこれらのタバコ突然変異体がリシン-耐性遺伝子を コードするＤＨＤＰＳ遺伝子を含んでいることを示している。こ れらの遺伝子は、小麦またはトウモロコシ遺伝子の単離のためにすでに記載され ている方法を使用して、あるいはヘテロロガスなハイブリダイゼーションプロー ブとして小麦またはトウモロコシ遺伝子を使用することにより、タバコ突然変異 体から容易に単離できた。 さらにＤＨＤＰＳをコードする別の遺伝子は、大腸菌dapA遺伝子、cordapA遺 伝子、またはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして植物ＤＨＤＰＳ遺伝 子のいずれかを使用することにより単離できる。あるいは、ＤＨＤＰＳをコード する他の遺伝子は、cordapA遺伝子[Yehら、(1988)Mol.Gen.Genet.212:105-111] およびトウモロコシＤＨＤＰＳ遺伝子を単離するために成されたように、大腸菌dapA 突然変異体の機能的相補により単離できた。植物中でのdapAコーディング領域の発現用のキメラ遺伝子の構築 外来遺伝子を植物中で発現することは、良く確立されている［De Blaereら、( 1987)Meth.Enzymol.143:277-291］。dapA mRNAの適切な発現レベルには、様々な プロモーターを利用して様々なキメラ遺伝子の使用が必要かもしれない。そのよ うなキメラ遺伝子は宿主植物中に１つの発現ベクター中に一緒に、または１つ以 上のベクターを連続的に使用することにより転移することができる。dapA遺伝子 のコーディング配列の発現に好適なヘテロロガス宿主の好適な種類は、真核宿主 、特に高等植物の細胞である。高等植物およびそれに由来する種子で特に好適な のは、ナタネ(ブラッシカ ナプス：Brassica napus、ビー.カンペストリス:B.c ampestris )およびダイズ(グリシン マックス：Glycine max)である。 コーディング配列の発現を駆動するために、選択されたプロモーターの起源は 、プロモーターが所望の宿主組織中でdapA 遺伝子に転写でき るmRNAを発現することにより、本発明を達成するに十分な転写活性を有する限り 、決定的に重要ではない。好適なプロモーターは、種子中で特異的にタンパク質 を発現できるものである。これは種子が植物アミノ酸の主要な供給源であり、ま た種子特異的発現は非−種子器官に有害であるかもしれない効果を回避するので 特に有用である。制限するわけではないが種子−特異的プロモーターの例には、 種子貯蔵タンパク質のプロモーターがある。この種子貯蔵タンパク質は、厳しく 調節され、高度に器官特異的に、かつ段階−特異的様式でほとんど排他的に種子 中で発現する[Higginsら(1984)Ann.Rev.Plant.Physiol.35:191-221;Goldbergら 、(1989)Cell 56:149-160;Thompsonら(1989)BioEssays 10:108-113]。さらに、 様々な種子貯蔵タンパク質が種子発生の様々な段階で発現できる。 現在、トランスジェニック双子葉植物中での種子貯蔵タンパク質の種子特異的 発現に関する例が多数ある。これらには、インゲンβ−ファゼオリン[Sengupta- Goplalanら、(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3320-3324;Hoffmanら、(1988)P lant Mol．Biol．11:717-729]、インゲンレクチン[Voelkerら、(1987)EMBO J.6: 3571-3577]、ダイズレクチン[オカムロら、(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83:8 240-8244]、ダイズ クニッツトリプシンインヒビター[Perez-Grauら、(1988)Pl ant Cell 1:095-1109]、ダイズβ-コングリシニン[Beachyら、(1985)EMBO J.4.3 047-3053;Barkerら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:458-462;Chenら、(1988 )EMBO J.7:297-302;Chenら、(1989)Dev.Genet.10:112-122;ナイトーら、(1988)P lant Mol．Biol.11:109-123]、エンドウ ビシリン[Higginsら、(1988)Plant Mo l．Biol.11: 683-695]、エンドウ コンビシリン[Newbiginら、(1990)Planta 180:461]、エンドウ レグミン[Shirs atら、(1989)Mol.Gen.Genetics 215:326]、ナタネ ナピン[Radkeら、(1988)The or.Appl.Genet.75:685-694]についての双子葉植物由来遺伝子、ならびにメイズ 15kD ゼイン[Hoffmanら、(1987)EMBO J.6:3213-3221;Schernthanerら、(1988)EM BO J.7:1249-1253;Williamsonら、(1988)Plant Physiol.88:1002-1007]、大麦β −ホルデイン[Marrisら、(1988)Plant Mol.Biol.10:359-366]および小麦グルテ ニン[Colotら、(1987)EMBO J.6:3559-3564]のような単子葉植物由来の遺伝子が ある。さらに、キメラ遺伝子構築物中のヘテロロガスなコーディング配列に操作 可能に連結された種子特異的プロモーターは、トランスジェニック植物中でその 一時的および空間的(spatial)発現パターンも維持する。そのような例には、ア ラビトポシス(Arabidopsis)およびビー．ナプス(B.napus)種子中にエンケファリ ンペプチドを発現するためのアラビトポシス サリアナ(Arabidopsis thaliana)2 S種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーター[Vandekerckhoveら、(1989)Bio/Techno logy 7:929-932]、ルシフェラーゼを発現するためのダイズ レクチンおよびイ ンゲンβ−ファゼオリンプロモーター[Riggsら、(1989)Plant Sci.63:47-57]、 およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現するための小麦 グルテニンプロモーター[Colotら、(1987)EMBO J.6:3559-3564]が含まれる。 中でも本発明の核酸断片を発現するために特に使用するのは、インゲンβ-フ ァゼオリン[Sengupta-Goplalanら、(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3220-332 4;Hoffmanら、(1988)Plant Mol.Biol.11:717-729]、ダイズ クニッツトリプシ ンインヒビター[Jofukuら、(1989)Plant C ell 1:1079-1093;Perez-Grauら、(1989)Plant Cell 1:1095-1109]、ダイズβ-コ ングリシニン[ハラダら、(1989)Plant Cell 1:415-425]、およびナタネナピン[R adkeら、(1988)Theor.Appl.Genet.75:685-694]のような数種の徹底的に特性が研 究された種子貯蔵タンパク質遺伝子由来のプロモーターであろう。インゲン β -ファゼオリンおよびダイズβ-コングリシニン貯蔵タンパク質用の遺伝子のプロ モーターは、種子発生の中期から後期に子葉中にdapA mRNAを発現するのに特に 有用である。 また本発明の核酸断片の発現に特に使用されるのは、10kDゼイン[キリハラら 、(1988)Gene 71:359-370]、27kD ゼイン[Pratら、(1987)Gene 52:51-49;Gallar doら、(1988)Plant Sci.54:211-281;Reinaら、(1990)Nucleic Acids Res.18:642 6-6426]、および19kDゼイン[Marksら、(1985)J.Biol.Chem.260:16451-16459]由 来の内胚乳-特異的プロモーターのような、数種の徹底的に特性が決定されたト ウモロコシ種子貯蔵タンパク質遺伝子由来のヘテロロロガスなプロモーターであ ろう。トウモロコシ中のこれらの相対的転写活性は報告され[Kodrzyckら、(1989 )Plant Cell 1:105-114]、トウモロコシ用にキメラ遺伝子構築物を使用するため のプロモター選択の基礎を提供した。トウモロコシの胚中での発現のために、グ ロブリン１(GLB1)遺伝子由来の強力な胚−特異的プロモーター[Kriz(1989)Bioch emical Genetics 27:239-251,Wallaceら、(1991)Plant Physiol.95:973-975]を 使用できる。 本発明を達成するために、エンハンサーまたはエンハンサー−様要素を他のプ ロモーター構築物中に導入することも、dapA 遺伝子の一次転写レベルを増大さ せるだろうと考える。これらには、35Sプロモーター[O dellら、(1988)Plant Mol.Biol.10:263-272]に見いだされるようなウイルスエン ハンサー、オピン遺伝子[Frommら、(1989)Plant Cell 1:977-984]由来のエンハ ンサー、または本発明の核酸断片に操作可能に連結されたプロモーター中に置か れた時、転写の増大を生じる任意の他の起源のエンハンサーを含む。 特に重要なのは、構成的プロモーターに40倍の種子特異的増強を付与すること ができる、β-コングリシニンα'-サブユニットの遺伝子から単離されたＤＮＡ 配列要素である[Chenら、(1988)EMBO J.7:297-302;Chenら、(1989)Dev．Genet.1 0:112-122]。当業者はこの要素を容易に単離し、そしてトランスジェニック植物 中のプロモーターで種子−特異的増強発現を得るために、任意の遺伝子のプロモ ーター領域に挿入できる。β-コングリシニン遺伝子とは異なる時期に発現する 任意の種子−特異的遺伝子にそのような要素を挿入すると、種子発生中、より長 期間、トランスジェニック植物中に発現することになる。 ポリアデニレーションシグナル、およびdapAコーディング領域の適切な発現に 必要な他の調節配列を提供できる任意の３'非−コーディング領域を、本発明を 達成するために使用できる。これはインゲンファゼオリン遺伝子由来の３'末端 、ダイズβ-コングリシニン遺伝子由来の３'末端、３５Ｓまたは１９Ｓカリフラ ワーモザイクウイルス転写物の３'末端のようなウイルス由来の３'末端、オピン シンターゼ遺伝子由来の３'末端、リブロース1,5'−ビスホスフェートカルボキ シラーゼまたはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質由来の３'末端、または使用 する配列がその核酸配列中に必要な調節情報を提供し、核酸が操作可能に結合し たプロモーター／コーディング領域の組み合わせの正しい発現を生じ るような任意の起源の３'末端配列のような任意の起源の３'末端を含む。当該技 術分野には、様々な３'非コーディング領域の有用性を教示する多数の例がある[ 例えば、Ingelbrechtら、(1989)Plant Cell 1:671-680を参照にされたい]。 本発明を達成するための正しい発現に必要であるならば、細胞内局在化配列を コードするＤＮＡ配列をdapAコーディング配列に付加できる。植物アミノ酸生合 成酵素は、クロロプラストに位置すると知られているので、これら酵素はクロロ プラスト標的シグナルで合成される。コリネバクテリウム（Corynebacterium）D HDPSのような細菌のタンパク質は、そのようなシグナルを持たない。クロロプラ ストのトランジット配列は、したがってdapAコーディング配列に融合されること ができた。好適なクロロプラストのトランジット配列は、双子葉植物に使用する ために例えばダイズ[Berry-Loweら、(1982)J.Mol．Appl.Genet.1:483-498]由来 の、および単子葉植物に使用するためにトウモロコシ[Lebrunら、(1987)Nucleic Acids Res.15:4360]由来のリブロース1,5'-ビスホスフェートカルボキシラーゼ の小サブユニットのようなものである。 植物中へのdapA キメラ遺伝子の導入 高等植物の真核細胞へのＤＮＡ配列の様々な導入法（すなわち形質転換）を利 用できる(欧州特許出願公開第 0 295 959号および同0 138 341号明細書を参照に されたい)。そのような方法には、アグロバクテリウムＳＰＰ．(Agrobacterium spp. )のＴｉおよびＲｉプラスミドに基づく形質転換ベクターに基づいた方法を 含む。これらベクターのバイナリー型(binary type)を使用することが特に好ま しい。Ｔｉ-由来ベクターは広範な高等植物を形質転換し、それにはダイズ、綿 およびセイヨウ アブラナのような単子葉および双子葉植物を含む[Pacciottiら、(1985)Bio/Tech nology 3:241;Byrneら、(1987)Plant Cell,Tissue and Organ Culture8:3;Sukha pindaら、(1987)Plant Mol.Biol.8:209-216;Lorzら、(1985)Mol.Gen.Genet.199: 178;Potrykus（1985）Mol.Gen.Genet.199:183]。 植物中へ導入するために、本発明のキメラ遺伝子を実施例６−１２に記載する ようにバイナリーベクター中に挿入することができる。このベクターはアグロバ クテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のＴｉプラスミドベ クター系の一部である[Bevan,(1984)Nucl.Acids Res.12:8711-8720]。 当業者には他の形質転換法、例えば外来ＤＮＡ構築物の直接的取り込み[欧州 特許出願公開第0 295 959号明細書を参照にされたい]、エレクトロポレーション 法[Frommら、(1986)Nature(ロンドン)319:791を参照にされたい]、または核酸構 築物を被覆した金属粒子での高速弾道衝撃法[Klineら、(1987)Nature(ロンドン) 327:70、および米国特許第4,945,050号明細書を参照にされたい]のような方法も 利用可能である。いったん形質転換したら、細胞を当該技術により再生できる。 特に関連があるのは、最近記載されたナタネ[De Blockら、(1989)Plant Physi ol.91:694-701]、ヒマワリ [Everettら、(1987)Bio/Technology 5:1201]、ダイ ズ[McCabeら、(1988)Bio/Technology 6:923;Hincheeら、(1988)Bio/Technology 6:915;Cheeら、(1989)Plant Physiol.91:1212-1218;Christouら、(1989)Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 86:7500-7504;欧州特許出願公開第0 301 749号明細書]および トウモロコシ[Gordon-Kammら、(1990)Plant Cell 2:603-618;Frommら、(1990)Bi otechnol ogy 8:833-839]のような商業的に重要な作物中に外来遺伝子を形質転換する方法 である。 高速弾道衝撃法による植物中への導入のために、本発明のキメラ遺伝子を実施 例６に記載するような適当なベクター中に挿入できる。ナタネ、ダイズおよびトウモロコシ植物中でのdapAキメラ遺伝子の発現 種子中のキメラdapA 遺伝子の発現、および種子中のアミノ酸含量に関する発 現結果を分析するために、種子ミールを実施例５または６に記載するように、あ るいは任意の他の適当な方法により調製できる。この種子ミールは、所望により 例えばヘキサン抽出を介して部分的に、または完全に脱脂することができる。タ ンパク質抽出物はこのミールから調製でき、そしてDHDPS酵素活性について分析 することができる。あるいはDHDPSタンパク質の存在を当該技術分野で周知な方 法により、免疫学的に試験することができる。ほとんどすべての形質転換体が外 来DHDPSタンパク質を発現した（実施例５、６および１３を参照にされたい）。 種子中の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸をミールから抽出し 、そして当該技術分野で周知な方法により分析することができる（適当な方法に ついては実施例５および６を参照にされたい）。 DHDPSタンパク質を発現するナタネ形質転換体は、その種子中に遊離リシンレ ベルを100倍より多く増加させることを示した。より高レベルのDHDPSタンパク質 を発現する形質転換体と、より高い遊離リシンレベルを有するものとの間に良好 な相関があった。形質転換体の中で、リシン−非感受性DHDPS単独の発現と比べ て、リシン−非感受性DHDPSと共にリシン非感受性ＡＫ酵素が発現しても遊離リ シンの蓄積がより多くはなかった。したがって、ナタネにおいては、種子中のリ シン非感受性DHDP Sの発現が遊離リシンの増大を引き起こすために必要かつ十分である。高レベル のα-アミノアジピン酸(リシンの異化作用を示す)は、遊離リシンが増大した形 質転換系のすべてで観察された。 成熟したナタネ種子中の全アミノ酸組成を測定するために、実施例５に記載し たように脱脂ミールを分析した。これらの種子中の相対的アミノ酸残レベルを、 全アミノ酸に対するリシンの割合として比較した。最高に発現している系は、種 子中にほぼ２倍近くのリシンレベルの増大を示し、それによりリシンは全アミノ 酸の12％となった。 ２３のダイズ形質転換体のうちの２１がDHDPSタンパク質を発現した。これら の形質転換体の単一種子の分析では、個々の種子中でGUS形質転換マーカー遺伝 子とDHDPSの発現との間に優れた相関が示された。したがってGUSおよびDHDPS遺 伝子はダイズゲノムの同じ部位中に組み込まれている。 コリネバクテリア(Corynebacteria)DHDPSタンパク質を発現する形質転換体と 、より高レベルの遊離リシンを有する形質転換体との間に優れた相関があった。 遊離リシンレベルについて20倍から120倍の増加が、コリネバクテリア(Coryneba cteria )DHDPSを発現する種子中で観察された。 トランス遺伝子が単一座として分離している形質転換体からの個々の種子中の 遊離リシンレベルの分析により、遊離リシンレベルの増大は、有意に種子の約１ ／４より高かったことが明らかになった。種子の１／４はトランス遺伝子に関し てホモ接合体となることが期待されるので、より高いリシン種子はホモ接合体で あろう。さらに、これは遊離リシンの増大レベルがDHDPS遺伝子のコピー数に依 存することを示している。 したがって、リシンレベルは２つの異なる形質転換体のハイブリッドを作成し、 そして両方のトランス遺伝子座でホモ接合体である子孫を得、これによりDHDPS 遺伝子のコピー数を２から４に増加することにより、さらに増大させることがで きた。 高レベルのサッカロピン（リシンの異化作用を示す）が、高レベルのリシンを 含む種子中に観察された。したがって、リシンケトグルタル酸レダクターゼの不 活性化によるリシン異化作用の防止は、さらに種子中に遊離リシンの蓄積を増大 させる。あるいは、リシンをペプチドまたはリシンに富むタンパク質中に取り込 むことにより、異化作用を防止し、そして種子中にリシンの蓄積を増大させるこ とになるだろう。 全リシンレベルは、コリネバクテリア(Corynebacteria)DHDPSタンパク質を発 現する種子中で有意に増加した。非形質転換対照と比較して、リシンレベルが10 -260％増大した種子が観察された。リシン−非感受性アスパルトキナーゼ酵素と 一緒のDHDPS発現は、400％よりも多いリシンの増大を生じた。したがって、これ らの種子はこれまでのダイズ種子よりもはるかに多くのリシンを含有する。 胚での発現用のトウモロコシグロブリン１プロモーター、または内胚乳中での 発現用のトウモロコシグルテリン２プロモーターのいずれかにより駆動されるコ リネバクテリウム（Corynebacterium）DHDPSタンパク質の発現が、トウモロコシ 種子中で観察された。種子中の遊離リシンレベルは、対象種子中での遊離アミノ 酸の約1.4％から、グロブリン１プロモーターからコリネバクテリウム(Coryneba cterium )DHDPSを発現する種子中の遊離アミノ酸の15-27％に増大した。グルテリ ン２プロモーターからコリネバクテリウム(Corynebacterium)DHDPSを発現する種 子では、遊離リシンの少量の増大が観察された。したがってリシンを増大させる ために、内胚乳よりも胚中でこの酵素を発現させることがより良いかもしれない 。高レベルのサッカロピン（リシンの異化作用を示す）は、高レベルのリシンを 含む種子中で観察された。グロブリン１プロモーターからコリネバクテリウム（Corynebacterium ）DHDPSを発現する種子中の遊離リシンの蓄積の増大は、種子中 の全リシン含量を実質的に増加させるのに（35-130％）十分であった。 植物リシンケトグルタル酸レダクターゼ遺伝子の単離 高レベルの遊離リシンを蓄積するために、リシン異化作用を妨害することが望 ましいかもしれない。証拠として、リシンはサッカロピン経路を介して植物中で 異化されることが示される。この経路の存在についての第一の酵素的証拠は、発 生しているメイズ種子中の未成熟内胚乳中のリシンケトグルタル酸レダクターゼ (LKR)活性の検出である[Arrudaら、(1982)Plant Pysiol.69:988-989]。LKRはリ シン異化の最初の段階で、NADPHをコファクターとして使用して、L-リシンとα- ケトグルタル酸のサッカロピンへの縮合を触媒する。LKR活性はトウモロコシ中 で内胚乳発生の開始から鋭く増加し、受粉後約20日でピークレベルに到達し、そ して次に下降する[Arrudaら、(1983)Phytochemistry 22:2687-2689]。リシン異 化作用を防ぐために、LKR発現または活性を減少または排除することが望ましい だろう。これはLKR遺伝子をクローニングし、LKRのコーサプレッション用キメラ 遺伝子を調製するか、あるいはLKR用のアンチセンスRNAを発現するためのキメラ 遺伝子を調製し、そしてキメラ遺伝子を植物中に形質転換を介して導入すること により達成できた。 当業者は、植物LKR遺伝子をクローン化するために幾つかの方法を利 用できる。このタンパク質はトウモロコシ内胚乳からBrochetto-Bragaら[(1992) Plant Physiol．98:1139-1147]に記載されたように精製でき、そして抗体を生成 するために使用することができる。次にこの抗体は、LKRクローンのcDNA発現ラ イブラリーを調査するために使用されることができる。あるいは精製タンパク質 を、タンパク質またはプロテアーゼ処理内部ペプチド断片のアミノ−末端のアミ ノ酸配列を決定するために使用できる。縮重オリゴヌクレオチドプローブをアミ ノ酸配列に基づき調製し、そして植物ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー をハイブリダイゼーションを介して調査するために使用できる。別の方法は、20 μg/mLのL-リシンを含有する合成培地中で、成長できない大腸菌株を使用する。 この株中のLKR完全長ｃＤＮＡの発現は、リシン濃度を減少させることにより成 長阻害を変化させるだろう。植物ｃＤＮＡライブラリーからリシン−耐性成長を 導くクローンを選択するための、適当な大腸菌株の構築およびその使用を実施例 ７に記載する。 形質転換植物中でLKR遺伝子の発現を遮断するために、LKRのコーサプレッショ ン用に設計されたキメラ遺伝子は、LKR遺伝子または遺伝子断片を上記の任意の 植物プロモーター配列に連結することにより構築できる(米国特許第5,231,020号 明細書)。 あるいはLKR遺伝子の全部または一部に関するアンチセンスＲＮＡを発現する ように設計したキメラ遺伝子は、LKR遺伝子または遺伝子断片を上記記載の任意 の植物プロモーター配列に逆方向で連結することにより構築できる（欧州特許出 願第84112647.7号明細書）。コーサプレッションまたはアンチセンスキメラ遺伝 子のいずれかを、形質転換を介して植物中に導入することができる。内因性LKR 遺伝子の発現が減少した、ま たは排除された形質転換体を選択する。 キメラ遺伝子用の好適なプロモーターは、種子−特異的プロモーターである。 ダイズ、ナタネおよび他の双子葉植物用に、インゲン ファゼオリン遺伝子、ダ イズβ-コングリシニン遺伝子、グリシニン遺伝子、クニッツトリプシンインヒ ビター遺伝子またはナタネ ナピン遺伝子由来の強力な種子−特異的プロモータ ーが好ましい。トウモロコシおよび他の単子葉植物用に、例えば10kDまたは27kD ゼインプロモーターのような強力な内胚乳-特異的プロモーターが好ましい。 任意のキメラLKR遺伝子を含む形質転換した植物を、上記の方法により得るこ とができる。LKRのコーサプレッションまたはアンチセンスLKRのためのキメラ遺 伝子、ならびにリシン−非感受性DHDPSをコードするキメラ遺伝子を発現する形 質転換した植物を得るために、コーサプレッションまたはアンチセンスLKR遺伝 子を、リシン−非感受性DHDPSをコードするキメラ遺伝子に連結し、そして２つ の遺伝子を形質転換を介して植物に導入することができる。あるいは、LKRのコ ーサプレッションまたはアンチセンスLKR用のキメラ遺伝子を、リシン−非感受 性DHDPSを発現するすでに形質転換した植物に導入するか、またはコーサプレッ ションまたはアンチセンスLKR遺伝子を正常植物に導入し、そして得られた形質 転換体をリシン−非感受性DHDPSを発現する植物と交配することができる。 リシンに富むポリペプチドの設計 生産される高レベルのリシンを、分解に対して非感受性状態（例えば、ジ−、 トリ−またはオリゴペプチド、あるいはリシンに富む貯蔵タンパク質に取り込ま れることによる）に転換することが望ましいかもしれな い。天然のリシンに富むタンパク質は知られていない。 本発明の１つの観点は、リシンに富む種子貯蔵タンパク質として役立つように インビボで発現できるポリペプチドの設計である。ポリペプチドは、鎖中の１つ のアミノ酸のα−カルボキシル基が共有的に次のアミノ酸のα−アミノ基と結合 しているアミノ酸の直線ポリマーである。鎖中の残基間の非共有的相互作用、な らびに周辺の溶媒が、分子の最終的配置を決定する。当業者は、安定な折り畳ま れたポリペプチド鎖の設計において、個々のアミノ酸残基の静電的力、水素結合 、ファン デルワールスカ、疎水的相互作用および配置的選択性を考慮しなけれ ばならない[例えば、Creighton,(1984)タンパク質、構造および分子的性質(Prot eins,Structures and Molecular Properties)、ダブリュー.エイチ.フリーマン アンド カンパニー(W.H.Freeman and Company)、ニューヨーク、第133-197頁、 またはSchulzら、(1979)タンパク質構造の原理(Principles of Protein Structu re)、スプリング ファーラーク(Spring Verlag)、ニューヨーク、第27-45頁を 参照にされたい]。多くの相互作用およびその複雑さは、可能な天然タンパク質 モデルを使用して、設計プロセスを援助できることを示唆している。 本発明で実現される合成貯蔵タンパク質(SSPs)は、植物種子中の平均的なタン パク質レベルに比べて、リシンが豊富となり得るようなポリペプチドが選択され る。リシンは生理的ｐＨで荷電したアミノ酸であり、したがってタンパク質分子 の表面に最もよく見いだされる[Chotia,(1976)Journal of Molecular Biology 1 05:1-14]。リシン含量を最大にするために、出願人は本発明で実現される合成貯 蔵タンパク質に関して、高い表面−対−容量比を持つ分子形を選択する。あるい は、ほとんどの タンパク質に共通の球形状態を伸ばして棒−様の延長構造にするか、あるいは球 形状態を平らにしてディスク−様構造にする。繊維状タンパク質の種類には長い 棒−様タンパク質に関する幾つかの天然モデルがあるので[Creighton、(1984)タ ンパク質、構造および分子的性質、ダブリュー.エイチ.フリーマン アンド カン パニー、ニューヨーク、第191頁]、出願人は前者の配置を選択する。 コイル化-コイルは、よく研究された種類の繊維状タンパク質のサブセットを 構成している[Cohenら、(1986)Trends Biochem.Sci．11:245-248]。天然の例は 、α-ケラチン、パラミオシン、ライトメロミオシンおよびトロポミオシンに見 いだされる。これらのタンパク質分子は、左回りのスーパーコイルにそれぞれが より合わさった２つの平行したアルファヘリックスから成る。このスーパーコイ ルの反復距離は140Å(反復距離が5.4Åである個々のヘリックスの１回転と比較 して)。このスーパーコイルは2つの個々のアルファヘリックスの軸の間に、わず かな歪み(10°)を生じる。 コイル化-コイルは、個々のヘリックスの１回転あたり3.5残基があり、スーパ ーヘリックスの軸に関して、正確に７残基の塩基対数(periodicity)を生じる（ 図１を参照にされたい）。したがってポリペプチド鎖中の７つのアミノ酸毎に、 ヘリックス軸に関して均等な位置を占めている。出願人は本発明のこの７単位中 の７つの位置を、図１および２ａに示すように（ｄ ｅ ｆ ｇ ａ ｂ ｃ）と呼ぶ 。これはコイル化-コイルの文献に使用される慣例と同じとする。 １次配列中で７つ揃の中のａおよびｄアミノ酸が４，３の反復パターンに従い 、そして個々のアルファヘリックスの１方の側に下がっている （図１を参照にされたい）。もしアルファヘリックスの１つの側のアミノ酸が全 部非−極性ならば、ヘリックス面は疎水性であり、そして例えばもう１つの同様 なヘリックスの非極性面のような別の疎水性表面と結合するだろう。コイル化- コイル構造は、２つのヘリックスの疎水性面が互いに並ぶように二量体化する時 に生こる(図２ａを参照にされたい)。 成分アルファヘリックスの外面上のアミノ酸（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ｇ）は、露出 した、および球状タンパク質中に埋められた残基の種類の予想パターンに従い、 通常天然のコイル化−コイル中で極性である（Schulzら、(1979)タンパク質構造 の原理、スプリング ファーラーク、ニューヨーク、第12頁；Talbotら、(1982) Acc.Chem.Res.15:224-230;Hodgesら、(1981)Journal of Biological Chemistry 256:1214-1224]。荷電したアミノ酸には、時々、対面する鎖の位置ｅおよびｇ’ または位置ｇおよびｅ’の間に塩結合の形成が見られる（図２ａを参照にされた い）。 したがって図１に示したような２つの両親媒性ヘリックスは、ａ、ａ’ｄおよ びｄ’間の疎水的相互作用と、ならびにｅとｇ’かつ／またはｇとｅ’残基間の 塩結合との組み合わせにより一緒に結合している。スーパーコイル中の疎水性残 基のパッケージングは、鎖を“重なりあった状態(in registar)”に維持する。 ２−３回転のみの成分アルファヘリックス鎖を含んで成る短いポリペプチドにつ いては、ヘリックス軸間の10°の歪みを無視でき、そして２つの鎖を平行として 扱うことができる（図２ａに示すように）。 多数の合成コイル化−コイルが文献に報告された（Lauら、(1984)Journal of Biological Chemistry 259:13253-13261;Hodgesら、(1988)Peptide Research 1: 19-30;DeGradoら、(1989)Science 243:622-628; O'Neilら、(1990)Science 250:646-651]。これらのポリペプチドは大きさが様々 であるが、Lauらは29アミノ酸が二量体化してコイル化−コイルを形成するのに 十分であることを見いだした[Lauら、(1984)Journal of Biological Chemistry 259:13253-13261]。出願人は配置的な安定性という理由から、本発明のペプチド を28残基以上の鎖に構築した。 本発明のポリペプチドは水性の環境中で、コイル化−コイルモチーフと二量体 化するように設計されている。出願人はコイル化−コイル配置を安定化するため に、疎水的相互作用および静電的相互作用を組み合わせて使用した。ほとんどの 非極性残基が、ヘリックスの軸に平行な疎水性ストライプを作成するａおよびｄ 位に限定されている。これが二量体化面である。出願人は二量体化の立体的妨害 を最小にするために、そして安定なコイル化−コイル構造を形成し易くするため に、この面に沿った大きな、嵩高いアミノ酸は避けた。 ａおよびｄ位のメチオニンがロイシンジッパーサブグループ中のコイル化−コ イルを不安定化することを示唆する、最近の文献の報告[Landschulzら、(1989)S cience 243:1681-1688およびHuら、(1990)Science 250:1400-1403]にもかかわら ず、出願人はSSPポリペプチドの疎水性面上に、メチオニン残基をロイシンに代 えて選択する。メチオニンおよびロイシンは同様な分子形である（図３）。出願 人は、疎水性コア中のメチオニンにより引き起こされ得るコイル化−コイルの不 安定化は、ヘリックス中のすべての可能な位置（すなわち７単位あたり２回）で 、塩ブリッジ（ｅ−ｇ’およびｇ−ｅ’）が生じる配列中で補正されることを実 証した。 リシンが豊富なポリペプチドを作成するという目的と適合する程度ま で、出願人はポリペプチド中のアンバランスな電荷を最小にした。これはポリペ プチドがインビボで発現される時、合成貯蔵タンパク質と他の植物タンパク質と の間の望ましくない相互作用を防ぐのに役立つことができる。 本発明のポリペプチドは、１次配列について最小の制限で、定められた配置的 に安定な構造、アルファヘリックスコイル化−コイルに自然に折り畳まれれるよ うに設計されている。これにより合成の貯蔵タンパク質が、特別な末端ユーザー の要求にカスタム−合成できるようになる。任意のアミノ酸は７つの反復単位中 のｂ、ｃ、およびｆを使用して、７残基毎に最高１つの頻度で組み込まれること ができる。出願人は本発明の合成貯蔵タンパク質中に、イソロイシン、ロイシン 、リシン、メチオニン、トレオニンおよびバリンの群から最高４３％の必須アミ ノ酸を組み込むことができ、そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチ ロシンの群から最高１４％の必須アミノ酸を組み込むことができることを示す。 SSP中に、Met、Leu、Ile、Val、またはThrのみが疎水性コアに位置している。 さらに、SSP中のｅ、ｇ、ｅ’およびｇ’位は、SSP二量体中の２つのポリペプチ ド鎖間のこのような位置で求引的静電相互作用がいつでも起こるように制限され ている。これはSSPポリペプチドを二量体としてより安定にしている。 したがって、本発明に記載する新規貯蔵タンパク質は、可能なコイル化−コイ ルポリペプチドの特定のサブセットを表す。水溶液中で両親媒性のアルファヘリ ックス配置に適合するすべてのポリペプチドが、本明細書に記載する応用に適す るわけではない。 出願人の研究から生まれた以下の規則は、出願人がその発明に使用するＳＳＰ ポリペプチドを定義する： 合成ポリペプチドはｎの７つ揃（ｄ ｅ ｆ ｇ ａ ｂ ｃ）を含んで成り 、それぞれの７つ揃は同じであるか、または異なり、ここで ｎは少なくとも４であり： ａおよびｄは独立してMet、Leu、Val、Ile、およびThrから成る群から選択 され、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対 Glu/Lys、Lys/Glu、Arg/Glu、Arg/Asp、 Lys/Asp、Glu/Arg、Asp/ArgおよびAsp/Lysから成る群から選択され；そして ｂ、ｃおよびｆは独立してGlyまたはProを除く任意のアミノ酸であり、そし て各々の７つのうちのｂ、ｃおよびｆの少なくとも２つが、Glu、Lys、Asp、Arg 、His、Thr、Ser、Asn、Gln、CysおよびAlaから選択される。 リシンに富むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子 上記のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、遺伝子コードに基づき設計で きる。特定のアミノ酸について多くのコドンが存在する場合、コドンは植物中で 翻訳されるのに好ましいものを選択すべきである。これらのＤＮＡ配列に対応す るオリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機を使用して合成し、相補鎖に対 応するオリゴヌクレオチドとアニールし、そして当該技術分野で周知な方法によ りプラスミドベクター中に挿入することができる。コードされたポリペプチド配 列を、合成遺伝子に工作した制限エンドヌクレアーゼ部位でさらにアニール化し たオリゴヌクレオチドを挿入することにより長くすることができる。本発明のリ シンに富むポリペプチドをコードする遺伝子を構築するための幾つかの代表的な 方法、ならびに好適な態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列を実施例８に提供する。 リシンに富むポリペプチドをコードする合成貯蔵タンパク質のＲＮＡを発現す るように設計されたキメラ遺伝子は、遺伝子を上記の任意の植物プロモーター配 列に連結することにより構築できる。好適なプロモーターは、種子−特異的プロ モーターである。ダイズ、ナタネおよび他の双子葉植物には、インゲン ファゼ オリン遺伝子、ダイズβ−コングリシニン遺伝子、グリシニン遺伝子、クニッツ トリプシンインヒビター遺伝子またはナタネ ナピン遺伝子由来の強力な種子− 特異的プロモーターが好ましい。トウモロコシまたは他の単子葉植物には、例え ば10kDまたは27kDゼインプロモーターのような強力な内胚乳−特異的プロモータ ー、あるいは例えばトウモロコシグロブリン１プロモーターのような強力な胚− 特異的プロモーターが好ましい。 リシンに富むポリペプチドをコードする合成貯蔵タンパク質のキメラ遺伝子を 発現する植物を得るために、植物を上記記載の任意の方法により形質転換するこ とができる。キメラ遺伝子ＳＳＰ遺伝子およびリシン−非感受性ＤＨＤＰＳをコ ードするキメラ遺伝子の両方を発現する植物を得るために、このＳＳＰ遺伝子を リシン−非感受性ＤＨＤＰＳをコードするキメラ遺伝子に連結することができ、 そして２つの遺伝子を形質転換を介して植物中に導入することができる。あるい はキメラＳＳＰ遺伝子を、リシン−非感受性ＤＨＤＰＳを発現する予め形質転換 した植物中に導入するか、またはＳＳＰ遺伝子を正常な植物に導入し、そして得 られた形質転換体をリシン−非感受性ＤＨＤＰＳを発現する植物と交配 することができる。 リシン生合成遺伝子を含む形質転換した植物と、リシンに富むタンパク質遺伝 子を含む形質転換した植物との遺伝的交配の結果（実施例１０を参照にされたい ）は、種子中の全リシンレベルがこれら遺伝子の同等発現により増加できること を実証する。トランス遺伝子のすべての遺伝子コピー数はハイブリッド中で減少 したので、この結果は特に衝撃的であった。リシンレベルは、生合成遺伝子およ びリシンに富むタンパク質遺伝子がすべてホモ接合体であるならば、さらに増加 することが期待される。 実施例 本発明は以下の実施例でさらに明らかになるが、実施例中、特に言及しないが きり、すべての部およびパーセントは重量であり、そして度は摂氏である。 実施例１ 大腸菌およびコリネバクテリウム グルタミカン (Corynebacterium glutamicum)dapA遺伝子の単離 大腸菌dapA遺伝子(ecodapA)はすでにクローン化、制限エンドヌクレアーゼ地 図の作成、ならびに配列決定された[Richaudら、(1986)J.Bacteriol．166:297-3 00]。本発明のためにdapA遺伝子は、コハラ、アキヤマおよびイソノ[コハラら、 (1987)Cell 50:595-508]により構成されたクローン化大腸菌ＤＮＡの3400の重複 セグメントの整列したライブラリーから、バクテリオファージ ラムダ クローン で得た。大腸菌遺伝子地図について53分のdapAの地図の位置[Bachman(1983)Micr obiol.Rev.47:180-230]、クローン化遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地図[Rich aud ら、(1986)J.Bacteriol.166:297-300]、および大腸菌ライブラリー中のクローン 化ＤＮＡ断片の制限エンドヌクレアーゼ地図[コハラら、(1987)Cell 50:595-508 ]に関する知識から、dapA遺伝子を持つ良い候補としてラムダファージ4C11およ び5A8を選ぶことができた[コハラら、(1987)Cell 50:595-508]。このファージを 、記載されているように[分子生物学における現在の手法(Current Protocols in Molecular Biology(1987)、Ausubelら編集、ジョン ウィリー アンド サン ズ(John Wiley & Sons)ニューヨーク]、LE392を宿主として使用して[Sambrookら 、(1989)モレキュラークローニング(Molecular Cloning)；ア ラボラトリーマ ニュアル(A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出 版を参照にされたい]液体培地で単一プラークから成長させた。ファージＤＮＡ を記載されているように［分子生物学における現在の手法(1987)、Ausubelら編 集、ジョン ウィリー アンド サンズ、ニューヨークを参照にされたい］、フ ェノール抽出により調製した。両方のファージがdapA遺伝子について予想される 約2.8kbのPstIDNA断片を含んだ[Richaudら、(1986)J.Bacteriol.166:297-300]。 この断片をファージ5A8の消化から単離し、そしてPstI消化ベクターpBR322に挿 入し、プラスミドpBT427を得た。 コリネバクテリウム(Corynebacterium)dapA遺伝子(cordapA)を、ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ATCC 13032株由来のゲノムＤＮＡから単離した 。コリネバクテリウム(Coryncbacterium)dapA遺伝子のヌクレオチド配列は公開 されている[Bonassieら、(1990)Nucleic Acids Res.18.6421]。この配列から、 この遺伝子を含有するＤＮＡ断片を増幅できるＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプ ライマーを設計することが でき、そして当時に遺伝子の開始コドン(NcoI)および終止コドンが丁度過ぎたと ころ(EcoRI)に独特の制限エンドヌクレアーゼを付加することができた。使用し たオリゴヌクレオチドプライマーは： ＰＣＲはパーキン−エルマーシータス(Perkin-Elmer Cetus)キットを使用して 、同社により製造された熱循環器で販売元の指示に従い行った。反応生成物はア ガロースゲルで泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色した時、コリネバクテ リウム(Corynebacterium)dapA遺伝子と予想される約900bpの大きさの強いＤＮＡ バンドを示した。ＰＣＲ−生成断片を制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびEcoRI で消化し、そして同じ酵素で消化した発現ベクターpBT430（実施例２を参照にさ れたい）中に挿入した。翻訳開始部位にNcoI部位を導入することに加えて、ＰＣ ＲプライマーはセリンのＡＧＣコーディングからアラニンのＧＣＴコーディング へ第二コドンの変化を生じた。活性なリシン−非感受性ＤＨＤＰＳ（実施例２を 参照にされたい）を発現した幾つかのクローンが単離され、第二コドンのアミノ 酸置換は活性に影響しないことを示し；１つのクローンをFS766と命名した。 ＰＣＲ−生成コリネバクテリウム(Corynebacterium)dapA遺伝子を持つこのNco I−EcoRI断片を、プロメガ(Promega)からのファゲミドベクタ ーpGEM-9zf(-)にサブクローン化し、一本鎖のＤＮＡを調製し、そして配列決定 した。この配列を配列番号３に示す。 既に述べた第二コドンの差異とは別に、２つの位置、ヌクレオチド798および7 99の配列を除いて、配列は公開された配列と一致した。公開された配列はこれら がＴＣであるが、配列番号３に示す遺伝子はこれらがＣＴである。この変化はセ リンのロイシンへのアミノ酸置換を生じる。この差異の理由は知られていない。 これは公開された配列中の誤り、遺伝子を単離するために使用した株の差異、ま たはＰＣＲ−生成誤差であるかもしれない。同じ変化が少なくとも３回の別個に 単離したＰＣＲ−生成dapA遺伝子に観察されたので、後者ではないと思われる。 この差異はＤＨＤＰＳ酵素活性に明らかな影響を及ぼさない（実施例２を参照に されたい）。 実施例２ 大腸菌中の大腸菌およびコリネバクテリウム グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)dapA遺伝子の高レベル発現 NcoI(CCATGG)部位を大腸菌dapA遺伝子の翻訳開始部位に、オリゴヌクレオチド −特異的突然変異誘発法を使用して挿入した。プラスミドpBT427中にdapA遺伝子 を持つ2.8kbのPstI ＤＮＡ断片（実施例１を参照にされたい）を、ファゲミドベ クターpTZ18R(ファルマシア：Pharmacia)のPstI部位に挿入し、pBT431を得た。d apA 遺伝子の方向はコーディング鎖が一本鎖ファゲミドＤＮＡに存在するような ものだった。オリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発法は、以下に示す突然変 異プライマーでバイオ−ラッド(Bio-Rad)のMuta-Geneキットを使用して、製造元 の方法に従い行った： 推定上の突然変異体をNcoI部位の存在についてスクリーニングし、そしてpBT437 と命名されたプラスミドがＤＮＡシークエンシングにより、この突然変異の付近 に正しい配列を有することを示した。NcoI部位を翻訳開始コドンに付加すること によっても、第２コドンのフェニルアラニンをコードするＴＴＣからバリンをコ ードするＧＴＣに変化を生じた。大腸菌中でdapA遺伝子の高レベル発現を達成す るために、細菌発現ベクターpBT430。この発現ベクターは、バクテリオファージ T7 RNAポリメラーゼ／T7プロモーターシステムを使用するpET-3a[Rosenbergら、 (1987)Gene 56:125-135]から派生したものである。プラスミドpBT430は、始めに pET-3a中のEcoRIおよびHindIII部位を元々の位置で破壊することにより構築され た。EcoRIおよびHindIII部位を含むオリゴヌクレオチドアダプターをpET-3aのBa mHＩに挿入した。これにより、発現ベクター中に遺伝子を挿入するためのさらな る独特なクローニング部位を持つpET-3aMが生成した。次にオリゴヌクレオチド 特異的突然変異誘発法を使用して、翻訳開始の位置でのNdeI部位をNcoI部位に転 換した。この領域中のpET-3aMのＤＮＡ配列、５’−ＣＡＴＡＴＧＧを、pBT430 中の５’−ＣＣＣＡＴＧＧに転換した。 大腸菌dapA遺伝子をプラスミドpBT437から1150bp NcoI-HindIII断片として切 り出し、そして同じ酵素で消化した発現ベクターpBT430中に挿入し、プラスミド pBT442を得た。コリネバクテリウム(Corynebacterium)dapA遺伝子の発現のため に、pBT430に挿入された配列番号3の917bp Nco I-EcoRI断片(pFS766、実施例１を参照にされたい)を使用した。 高レベル発現のために、各プラスミドを大腸菌BL21(DE3)株中で形質転換した[ Studierら、(1986)J.Mol.Biol.189:113-130]。培養物を、アンピシリン(100mg/L )を含有するＬＢ培地中で25℃で成長させた。600nmの光学密度が約１で、IPTG( イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物)を最終濃度0.4mMで加え、そして インキューベーションを25℃で３時間続行した。細胞を遠心により回収し、そし て元の培養物容量(50mM NaCl;50mM Tris-Cl、pH 7.5;1mM EDTA)の1/20倍（または 1/100倍）に再懸濁し、そして-20℃で凍結した。1mLの凍結アリコートを37℃で 解凍し、そして氷−水浴中で超音波処理し、細胞を溶解した。溶解物を4℃で5分 間、15,000rpmで遠心した。上清を取り出し、ペレットを1mLの上記緩衝液中に再 懸濁した。 BL21(DE3)/pBT442またはBL21(DE3)/pFS766の非誘導およびIPTG−誘導培養物の 上清およびペレット画分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析 した。両方の誘導した培養物中の上清およびペレット画分のクマシーブルー染色 により見ることができる主要タンパク質は、ＤＨＤＰＳと予想される大きさの32 -34kdの分子量を有した。非誘導培養物中でも、このタンパク質が最も優勢に生 産された。 BL21(DE3)/pBT442 IPTG−誘導培養物では、約80％のＤＨＤＰＳタンパク質が 上清にあり、そしてＤＨＤＰＳは抽出物中の全タンパク質の10-20％を表した。B L21(DE3)/pFS766 IPTG−誘導培養物では、５０％よりも多くのＤＨＤＰＳタンパ ク質がペレット画分に存在した。両方の場合のこのペレット画分は90-95％純粋 なＤＨＤＰＳであり、他の単一タンパク質は有意な量で存在しなかった。したが って、これらの画分は、抗 体作成に使用するために十分な純度であった。2-4ミリグラムの大腸菌ＤＨＤＰ Ｓまたはコリネバクテリウム(Corynebacterium)ＤＨＤＰＳのいずれかを含むこ れらのペレット画分を、50mM NaCl;50mM Tris-Cl、pH7.5;1mM EDTA、0.2mM ジチ オスレイトール、0.2％ ＳＤＳ中で可溶化し、そしてこのタンパク質に対するウ サギ抗体を得るために、ハゼルトン研究所(Hazelton Research Facility)(17517 ペンシルバニア州、デンバー、スワンプリッジロード 310)に送った。 ＤＨＤＰＳ酵素活性は以下のようにアッセイした：アッセイ混合物(10×1.0mL のアッセイ管または40×0.25mLのマイクロタイター皿)；使用直前に新しく調製 ： ２.５ｍＬ Ｈ2Ｏ ０.５ｍＬ １.０Ｍ Tris-ＨＣｌ ｐＨ８.０ ０.５ｍＬ ０.１Ｍ Ｎａ ピルビン酸 ０.５ｍＬ ｏ−アミノベンズアルデヒド（１０ｍｇ／ｍＬエタノ ール中） ２５μＬ １.０Ｍ ＤＬ−アスパラギン酸−β−セミアルデヒド （ＡＳＡ） １.０Ｎ ＨＣｌ中 アッセイ(1.0mL)： ミクロアッセイ(0.25mL): DHDPSアッセイ混合物 0.40mL 0.10mL 酵素抽出物＋H2O; 0.10mL .025mL 10mM L-リシン 5μL又は20μＬ 1μL又は5μL 30℃で所望時間インチュベーション。加えて停止する 1.0N HCl 0.50mL 0.125mL 発色は30-60分で生じる。沈殿物をエッペンドルフ遠心で落とした。0分のＯＤ54 0 の読み取りをブランクとした。マイクロアッセイ用に、0.2mLのアリコートをマ イクロタイターウェルに入れ、そしてOD530を読んだ。 誘導した抽出物の上清画分中の大腸菌ＤＨＤＰＳの比活性は、1.0mLアッセイ で１ミリグラムタンパク質１分あたり、約50 OD540単位であった。大腸菌ＤＨＤ ＰＳはアッセイ中のＬ−リシンの存在に感受性であった。約0.5mM濃度で50％阻 害が見られた。コリネバクテリウム(Corynebacterium)ＤＨＤＰＳについては、 活性を誘導抽出物ではなく非誘導抽出物の上清画分で測定した。酵素活性は、0. 25mLアッセイにおいて、１ミリグラムタンパク質あたり、１分間で約４ OD530単 位であった。大腸菌ＤＨＤＰＳとは対照的に、コリネバクテリウム(Corynebacte rium )ＤＨＤＰＳはたとえＬ−リシン濃度が70mMであってもは全く阻害されなか った。 実施例３ リシン−非感受性ＡＫIIIを生成する大腸菌lysC遺伝子の単離 およびlysCの突然変異 大腸菌ｌｙｓＣ遺伝子はすでにクローン化、制限エンドヌクレアーゼ地図の 作成、ならびに配列決定された[Cassanら、(1986)J.Biol.Chem.261:1052-1057] 。本発明のために、lysC遺伝子は、コハラ、アキヤマおよびイソノ[コハラら、( 1987)Cell 50:595-508]により構築されたクローン化大腸菌ＤＮＡの3400の重複 セグメントの整列したライブラリーから、バクテリオファージ ラムダ クロー ンで得た。 このライブラリーは全大腸菌染色体の物理的地図を提供し、そして物理的地図 と遺伝地図とを結び付ける。大腸菌遺伝子マップについて90分 のlysCの地図の位置[Thezeら、(1974)J.Bacteriol.117:133-143]、クローン化遺 伝子の制限エンドヌクレアーゼ地図[Cassanら、(1986)J.Biol.Chem.261:1052-10 57]、および大腸菌ライブラリー中のクローン化ＤＮＡ断片の制限エンドヌクレ アーゼ地図[コハラら、(1987)Cell 50:595-508]に関する知識から、lysC遺伝子 を持つ良い候補としてラムダファージ4E5および7A4を選ぶことができた[コハラ ら、(1987)Cell 50:595-508]。このファージを、記載されているように［分子生 物学における現在の手法、(1987)Ausubelら編集、ジョン ウィリー アンド サンズニューヨーク］、LE392を宿主として[Sambrookら、(1989)モレキュラーク ローニング；ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラ トリー出版]液体培地で単一プラークから成長させた。ファージＤＮＡを記載さ れているように［分子生物学における現在の手法(1987)、Ausubelら編集、ジョ ン ウィリー アンド サンズ、ニューヨークを参照にされたい］、フェノール 抽出により調製した。 遺伝子配列から、lysC遺伝子を判断する幾つかの制限エドヌクレアーゼ断片が 示され、それには1860bp EcoRI-NheI断片、2140bp EcoRI-XmnI断片および1600bp EcoRI-BamHI断片が含まれた。これら各々の断片は両方のファージＤＮＡ中で検 出され、これらがLysC遺伝子を持つことが確認された。こをEcoRI−NheI断片を 単離し、そして同じ酵素で消化したプラスミドpBR322にサブクローン化し、アン ピシリン-耐性、テトラサイクリン−感受性大腸菌形質転換体を得た。このプラ スミドをpBT436と命名した。 クローン化lysC遺伝子が機能的であることを確立するために、pBT436を、３つ の各大腸菌AK遺伝子に突然変異を有する大腸菌Gif1061M1株(大 腸菌遺伝子保存センター：E.Coli Genetics Stock Center CGSG-5074株)中に形 質転換した[Thezeら、(1974)J.Bacteriol.117:133-143]。この株はすべてのAK活 性を欠き、したがってジアミノピメリン酸塩（リシンの前駆体であり、同時に細 胞壁生合成に必須）、トレオニンおよびメチオニンを必要とする。形質転換体で は、すべてのこれらの栄養要求性が明らかとなり、クローン化lysC遺伝子が機能 的ＡＫIIIをコードしていることを実証した。 成長培地に約0.2mM 濃度でリシン(またはインビボで直ぐにリシンに転換する ジアミノピメリン酸塩)を加えると、pBT436で形質転換したGif106M1の成長を阻 害する。アルギニンおよびイソロイシンを補充したM9培地[Sambrookら、(1989) モレキュラークローニング;ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハ ーバーラボラトリー出版を参照にされたい]は、Gif106M1の成長に必要であり、 そしてアンピシリンをpBT436プラスミドを選択するために使用した。この阻害は 成長培地にトレオニンおよびメチオニンを加えると変化した。これらは結果は、 AKIIIを外部から付加されたリシンにより阻害でき、アスパラギン酸塩から派生 する他のアミノ酸に関する欠乏を導く。このpBT436形質転換Gif106M1の特性を、 リシン−非感受性ＡＫIIIをコードするlysCの突然変異を選択するために使用し た。 pBT436で形質転換したGif106M1の単一コロニーを取り出し、そして100μL 1％ リシンおよび100μLのM9培地の混合物200μLに再懸濁した。107−108細胞を含む 全細胞懸濁液を、アルギニン、イソロイシンおよびアンピシリンを補充したＭ９ 培地を含むペトリ皿に広げた。このようにして16枚のペトリ皿を準備した。16の ペトリ皿のうち11のペトリ皿で1から2 0個のコロニーが出現した。１つまたは２つ（可能ならば）のコロニーを取り出 し、そしてリシン耐性に関して試験し、そしてこれから9つのリシン-耐性コロニ ーを得た。プラスミドＤＮＡをこれらのうちの８つから調製し、そしてGif106M1 中に再−形質転換してリシン耐性決定因子がプラスミドに保持されているかどう かを決定した。８つのプラスミドＤＮＡのうちの６つがリシン−耐性クローンを 生成した。これら６つのうち３つが、15mM リシンにより阻害されないAKIIIをコ ードするlysC遺伝子を持ち、一方野生型AKIIIは0.3-0.4mM リシンにより50％が 、そして1mM リシンにより90％より多くが阻害される(詳細は実施例２を参照に されたい)。 リシン−耐性に関する分子的基礎を決定するために、野生型lysC遺伝子および ３つの突然変異体遺伝子の配列を決定した。“二本鎖鋳型をsequenase(商標)で シークエンシングするためのmini-prepプラスミドＤＮＡを使用すること”[Kraf tら、(1988)BioTechniques 6:544-545]の方法を使用した。公開されたlysC配列 に基づき、そして約200bp毎に間隔を空けたオリゴヌクレオチドプライマーをシ ークエンシングを容易にするために合成した。pBT436にクローン化された野生型lysC 遺伝子の配列（配列番号５）は、公開されたlysC配列とコーディング領域の ５つの位置で異なった。これらのヌクレオチド差異のうち４つはコドンの第３番 目の位置にあり、そしてＡＫIIIタンパク質のアミノ酸に変化を生じなかった。 １つの差異はＡＫIIIのアミノ酸58でシステインからグリシンへの置換を生じた 。これらの差異はおそらくlysC遺伝子がクローン化された株の差異によるもので あろう。 リシン−非感受性ＡＫそれぞれをコードする３つの突然変異体lysC遺 伝子配列は、１つのヌクレオチドで野生型配列とは異なり、タンパク質中に１つ のアミノ酸置換を生じた。突然変異体Ｍ２では配列番号５のヌクレオチド954で ＧがＡに置換され、アミノ酸318でメチオニンのイソロイシンへの置換を生じ、 そして突然変異体Ｍ３およびＭ４は配列番号５のヌクレオチド1055でＣからＴへ の同一置換を有し、アミノ酸352でトレオニンからメチオニンへの置換を生じた 。このように、これらの１つのアミノ酸置換は、ＡＫIII酵素をリシン阻害に対 して非感受性にするために十分である。 NcoI（ＣＣＡＴＧＧ）部位を、以下のオリゴヌクレオチドを使用してlysC遺伝 子の翻訳開始コドンに挿入した： アニール化した時、これらのオリゴヌクレオチドはBamHＩおよびAsp718“粘着 ”末端を有した。プラスミドpBT436をBamHＩで消化し、これはlysCコーディング 配列の上流を切断し、そしてAsp 718で消化し、これは開始コドンの下流31ヌク レオチドを切断した。アニール化したオリゴヌクレオチドをプラスミドベクター に連結し、そして大腸菌形質転換体を得た。プラスミドＤＮＡを調製し、そして NcoI部位の存在に基づき、オリゴヌクレオチドの挿入についてスクリーニングし た。この部位を含むプラスミドを配列決定して挿入が正しいことを確認し、そし てpBT457 と命名した。lysCの開始コドンにNcoI部位を作成することに加えて、このオリゴ ヌクレオチド挿入により、セリンをコードするＴＣＴからアラニンをコードする ＧＣＴへと第２コドンが変化した。このアミノ酸置換はＡＫIII酵素活性に対し て明らかな影響を及ぼさなかった。 このlysC遺伝子をプラスミドpBT457から1560bpのNcoI-EcoRI断片として切り出 し、そして同じ酵素で消化した発現ベクターpBT430中に挿入し、プラスミドpBT4 61を得た。突然変異体lysC-M4遺伝子の発現のために、pBT461をKpnＩ−EcoRIで 消化し、これで野生型lysC遺伝子を翻訳開始コドンの約30ヌクレオチド下流から 取り出し、そして突然変異体遺伝子から類似のKpnＩ−EcoRI断片を挿入し、プラ スミドpBT492を得た。 実施例４ 植物の種子中で発現するためのキメラdapA遺伝子の構築 種子−特異的発現カセット（図４）は、インゲンファセオラス ブルガリス(Ph aseolus vulgaris)由来の種子貯蔵タンパク質ファゼオリンのβ-サブユニットを コードする遺伝子のプロモーターおよび転写ターミネーターから成る[Doyleら、 (1986)J.Biol.Chem.261:9228-9238]。このファゼオリンカセットは、ファゼオリ ンの翻訳開始コドンから(5')上流の約500ヌクレオチド、および翻訳終止コドン から3'下流の約1650ヌクレオチドを含む。この５’および３’領域の間は、独特 な制限エンドヌクレアーゼ部位NcoI(これはATG翻訳開始コドンを含む）、SmaＩ 、KpnＩおよびXbaＩである。全カセットはHindIII部位により平滑化されている 。 植物のアミノ酸生合成酵素は、クロロプラストに位置することが知られている ので、これらの酵素はクロロプラスト標的シグナルで合成され る。ＤＨＤＰＳおよびＡＫIIIのような細菌タンパク質は、そのようなシグナル を持たない。それゆえにクロロプラストのトランジット配列(chloroplast trans it sequence:cts)が、キメラ遺伝子中のdapAおよびlysC-M4コーディング配列に 連結された。この使用するctsは、ダイズ由来のリブロース1,5-ビスホスフェー トカルボキシラーゼの小サブユニットのctsに基づいた[Berry-Loweら、(1982)J. Mol.Appl.Genet.1:483-498]。オリゴヌクレオチド配列番号８−１１は、以下の ように合成され、そして使用された。 ３つのキメラ遺伝子を作成した： Ｎｏ．１）ファゼオリン５’領域／cts／lysC-M4／ファゼオリン３’領域 Ｎｏ．２）ファゼオリン５’領域／cts／ecodapA／ファゼオリン３’領域 Ｎｏ．３）ファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域 クロロプラスト標的シグナルのカルボキン末端部をコードするオリゴヌクレオ チド配列番号８および配列番号９をアニールし、NcoI適合末端を生成し、ポリア クリルアミドゲル電気泳動で精製し、そしてNcoI消化pBT461に挿入した。この正 しい配列の正しい方向での挿入は、ＤＮＡシークエンシングにより確認し、そし てpBT496を得た。クロロプラスト標的シグナルのアミノ末端部をコードするオリ ゴヌクレオチド配列番号１０および配列番号１１をアニールし、NcoI適合末端を 生成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、そしてNcoI消化pBT496に挿 入した。この正しい配列の正しい方向での挿入は、ＤＮＡシークエンシングによ り確認し、そしてpBT521を得た。このようにctsはlysC遺伝子に融合された。 ctsをlysC-M4遺伝子に融合するために、pBT521をSalＩ消化し、そしてctsおよ びlysCのアミノ末端コーディング領域を含む約900bp ＤＮＡ断片を単離した。こ の断片をSalＩ消化pBT492に挿入し、lysC-M4のアミノ末端コーディング領域を融 合ctsおよびlysCのアミノ末端コーディング領域に効果的に置き換えた。リシン 非感受性を生じる突然変異は置換断片中には無かったので、新たなプラスミドpB T523はlysC-M4に連結したctsを持った。 lysC-M4に融合したctsおよび約90bpの3'非−コーディング領域を含む1600bpの NcoI-HpaＩ断片を単離し、そしてNcoIおよびSmaＩ消化した種子−特異的発現カ セット（キメラ遺伝子Ｎｏ．１）に挿入し、プラスミドpBT544を得た。 発現カセット中に挿入する前に、ecodapA遺伝子を改変して、翻訳停止コドン 直後の制限エンドヌクレアーゼ部位KpnＩに挿入した。オリゴヌクレオチド配列 番号１２−１３をこの目的のために合成した： オリゴヌクレオチド配列番号１２および配列番号１３をアニールし、SphＩ適 合末端を１つの末端に生成し、そしてもう１つの末端にHindIII 適合末端を生成し、SphＩおよびHindIII消化pBT437に挿入した。正しい配列の挿 入は、ＤＮＡシークエンシングにより確認し、pBT443を得た。 全ecodapAコーディング領域を含むpBT443からの880bpのNcoI-KpnI断片を、電 気泳動後にアガロースゲルから単離し、そしてNcoIおよびKpnＩで消化した種子 −特異的発現カセットに挿入し、プラスミドpBT494を得た。オリゴヌクレオチド 配列番号８−１１を上記のように使用し、ctsを種子−特異的発現カセットのecodapA コーディング領域に加え、pBT520中にキメラ遺伝子Ｎｏ．２を得た。 全cordapAコーディング領域を含むpFS766からの870bpのNcoI-EcoRI断片を、電 気泳動後にアガロースゲルから単離し、そしてNcoIおよびEcoRIで消化した葉の 発現カセットに挿入し、プラスミドpFS789を得た。ctsをcordapA遺伝子に付加す るために、全ctsを含むＤＮＡ断片をPCRを使用して調製した。鋳型ＤＮＡはpBT5 44であり、そして使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りである： PCRはパーキン-エルマーシータスキットを使用して、販売元の指導に従い同社 で製造した熱循環器で行った。PCR-生成160bp断片を、4種のデオキシリボヌクレ オチド三リン酸が存在する中で、T4 DNAポリメラーゼで処理し、平滑末端化断片 を得た。cts断片は、すでに消化し、そして ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理して５’突出部を埋めたcordapA遺伝 子の開始コドン（NcoI含有）中に挿入した。挿入した断片およびベクター／挿入 連結部はＤＮＡシークエンシングにより正しいと決定された。 cordapAコーディング領域に付加したctsを含む1030bpのNcoＩ-KpnＩ断片を、 電気泳動後にアガロースゲルから単離し、そしてNcoＩおよびKpnＩ消化したファ ゼオリン種子発現カセット中に挿入し、キメラ遺伝子Ｎｏ．３を含むプラスミド pFS889を得た。 実施例５ ファゼオリンプロモーター／cts／cordapAおよびファゼオリン プロモーター／cts／lysC-M4／キメラ遺伝子でのナタネの形質転換 キメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン ３’領域、ファゼオリン５’領域／cts／lysC−M4／ファゼオリン３’、ならび にファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域に加えてファゼ オリン５’領域／cts／lysC−M4／ファゼオリン３’（実施例４）を、バイナリ ーベクター(binary vector)pZS199(図５Ａ)に導入した。pZS199中、カリフラワ ーモザイクウィルス由来の３５ＳプロモーターはＮＰＴIIの発現を駆動する。 ファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域キメラ遺伝子カ セットを、オリゴヌクレオチドアダプターを使用して修飾し、各末端のHindIII 部位をBamHＩ部位に転換した。遺伝子カセットを次に2.7kbのBamHＩ断片として 単離し、そしてBamHＩ処理pZS199に挿入し、プラスミドpFS926（図５Ｂ）を得た 。このバイナリーベクターは、35S/NPT II/nos3'マーカー遺伝子と同じ方向に挿 入されたキメラ遺伝子、ファ ゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域を有する。 ファゼオリン５’領域／cts／lysC−M4／ファゼオリン３’領域を挿入するた めに、遺伝子カセットを3.3kbのEcoRI−SpeＩ断片として単離し、そしてEcoRIに 加えてXbaＩ消化pZS199に挿入し、プラスミドpBT593を得た。このバイナリーベ クターは35S/NPT II/nos3'マーカー遺伝子と同じ方向に挿入されたキメラ遺伝子 、ファゼオリン５’領域／cts／lysC-M4／ファゼオリン３’領域を有する。 ２つのカセットを組み合わせるために、pBT593のEcoRI部位をオリゴヌクレオ チドアダプターを使用してBamHＩに転換し、生成したベクターをBamHＩで切断し 、そしてファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域遺伝子カ セットを2.7kbのBamHＩ断片として単離し、そして挿入してpBT597を得た。この バイナリーベクターは35S/NPT II/nos3'マーカー遺伝子と同じ方向に挿入された 両方のキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’ 領域およびファゼオリン５’領域／cts／lysC−M4／ファゼオリン３’領域を持 つ。 ブラッシカ ナプス(Brassica napus)の栽培種“Westar”を、適当なバイナリ ーベクターを有する安全化したアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobact erium tumefaciens)LBA4404で、実生苗片を同時培養することにより形質転換し た。 ビー．ナプス(B.napus)種子を10％Chlorox、0.1％ SDS中で30分間撹拌するこ とにより安定化し、そして次に滅菌水で徹底的にすすいだ。種子は30mM CaCl2お よび1.5％寒天を含有する滅菌培地で発芽させ、そして６日間暗室中、24℃で成 長させた。 植物形質転換用に、アグロバクテリウム(Agrobacterium)の液体培養 物を28℃で一晩、100mg/Lのカナマイシンを含有する最少Ａ培地中で成長させた 。細菌細胞を遠心でペレット化し、そして108細胞/mLの濃度で100uMのアセトシ リンゴンを含有する液体 MurashingおよびSkoog最少有機培地中に再懸濁した。 ビー．ナプス(B.napus)の実生苗の胚軸を5mmセグメントに切断し、これを直ぐ に細菌懸濁液中に入れた。30分後、胚軸片を細菌懸濁液から取り出し、そして10 0uMのアセトシリンゴンを含有するBC-35カルス培地に入れた。植物組織およびア グロバクテリア(Agrobacteria)を３日間、24℃にて減光下にて同時培養した。 この同時培養は、アグロバクテリア(Agrobacteria)を殺すために200mg/Lのカ ルベニシリンを、そして形質転換した植物細胞の成長を選択するために25mg/Lの カナマイシンを含有するBC-35カルス培地に胚軸片を移すことにより終了させた 。実生苗の切片をこの培地で3週間、24℃にて連続光の下でインキューベーショ ンした。 3週間後、セグメントを200mg/Lのカルベニシリンおよび25mg/Lのカナマイシン を含有するBS-48再生培地に移した。植物組織を２週間毎に新しい選択再生培地 中で、カルス培地について記載した同じ培養条件下で継代培養した。推定上の形 質転換体カルスは再生培地で急激に成長し；カルスが約2mmの直径に達した時、 それらを胚軸片から取り出し、カナマイシンを欠いた同じ培地に置いた。 苗条はBS-48再生培地に移した後、数週間以内に現れ始めた。苗条が識別でき る幹を形成するとすぐに、それらをカルスから切り取り、MSV-1A伸長培地に移し 、そして24℃で16:8−ｈの照射時間に移した。 いったん苗条が数節間に伸びたら、それらを寒天表面上で切り取り、 そして切片末端をRootoneに浸した。処置した苗条を直接湿ったMetro-Mix 350 水耕鉢植え培地に置いた。鉢はプラスチック製の袋で覆い、これは植物が明らか に成長した時、およそ10日後に取り除いた。形質転換の結果を表１に示す。形質 転換した植物は各々のバイナリーベクターで得た。最小Ａ細菌成長培地 蒸留水に溶解する： １０.５ｇ リン酸カリウム、二塩基性 ４.５ｇ リン酸カリウム、一塩基性 １.０ｇ 硫黄アンモニウム ０.５ｇ クエン酸ナトリウム、二水和物 蒸留水で９７９ｍｌにする オートクレーブ ２０ｍｌの濾過滅菌１０％スクロースを加える １ｍｌの濾過滅菌１ＭＭｇＳＯ4を加えるブラッシカカルス培地ＢＣ−３５ リットル当り： MurashigeおよびSkoog最少有機培地 （ＭＳ塩、１００ｍｇ／Ｋ ｉ−イノシトール、０.４ｍｇ／Ｌチアミン；ＧＩ ＢＣＯ＃５１０−３１１８） ３０ｇ スクロース １８ｇ マンニトール ０.５ｍｇ／Ｌ ２,４−Ｄ ０.３ｍｇ／Ｌ キネチン ０.６％ アガロース ｐＨ５.８ブラッシカ再生培地ＢＳ−４８ MurashigeおよびSkoog最少有機培地 Gamborg Ｂ５ビタミン（ＳＩＧＭＡ ＃１０１９） １０ｇ グルコース ２５０ｍｇ キシロース ６００ｍｇ ＭＥＳ ０.４％ アガロース ｐＨ５.７ 濾過滅菌し、そしてオートクレーブ後に加える： ２.０ｍｇ／Ｌ ゼアチン ０.１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡブラッシカ苗条伸長培地ＭＳＶ−１Ａ MurashigeおよびSkoog最少有機培地 Gamborg Ｂ５ Vitamins １０ｇ スクロース ０.６％ アガロース ｐＨ５.８ 植物を23℃の日中温度、そして17℃の夜間温度の16:8-hの照射時間で成長させ た。第一開花幹が伸び始めた時、外部交配を防ぐためにメッシュの花粉−混入バ ックでその幹を覆った。自家受粉は、毎日植物を数回揺することにより行った。 自家−受粉から派生した成熟種子を、植え込み後３カ月で収穫した。 部分的に脱脂した種子ミールを以下のように調製した：40ミリグラムの成熟乾 燥種子を乳鉢および乳棒で、液体窒素下で挽いて粉末にした。１ミリリットルの ヘキサンを加え、混合物を室温で15分間震盪した。このミールをエッペンドルフ 遠心管中でペレットとし、ヘキサンを除去し、そしてこのヘキサン抽出を繰り返 した。次にミールを65℃で10分間、ヘキサンが完全に蒸発するまで乾燥させ、乾 燥粉末を残した。全タンパク質を成熟種子から以下のように抽出した。約30-40m gの種子を1.5mLのプラスチック製の使い捨て試験管に入れ、そして0.25mLの50mM Tris-HCl pH6.8、2mM EDTA、1％ SDS 1％ β-メルカプトエタノール中で挽いた 。粉砕はミクロ遠心管中に適するように設計された使い捨てのプラスチック製シ ャフトを備えたモーターグラインダーを使用して行った。生成し た懸濁液を5分間、室温でミクロ遠心管中で遠心して、粒子を除去した。３容量 の抽出物を１容量の4× SDS-ゲル試料緩衝液(0.17M Tris-HCl pH6.8、6.7％ SDS 、16.7％ β-メルカプトエタノール、33％ グリセロール)と混合し、そして各抽 出物から5μLをSDSポリアクリルアミドゲルの1レーンで泳動し、大きさの標準と して細菌が生産したＤＨＤＰＳまたはＡＫIIIを使用し、そして陰性対照として 非形質転換タバコ種子から抽出したタンパク質を使用した。次にタンパク質を電 気泳動的にニトロセルロース膜上にブロットした。この膜を、バイオ−ラッドに より提供された標準的な手法を使用して、バイオ−ラッドのImmun-Blot Kitで、 1:5000倍に希釈したウサギ血清のＤＨＤＰＳまたはＡＫIII抗体にさらした。非 結合１次抗体を除去するためにすすいだ後、膜を２次抗体(1:3000希釈の西洋ワ サビペルオキシダーゼ結合ロバ−抗−ウサギＩｇ：アマシャム(Amersham))にさ らした。すすいで非結合２次抗体を除去した後、膜をアマシャムの化学ルミネッ センス試薬およびＸ−線フィルムにさらした。 ８つのFS926形質転換体のうちの８つ、および７つのBT597形質転換体のうちの ７つが、ＤＨＤＰＳタンパク質を発現した。１つのBT593形質転換体および７つ のBT597形質転換体のうちの５つが、ＡＫIII−Ｍ４タンパク質を発現した（表２ ）。 種子中の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を40ミリグラムの 脱脂ミール(0.6mLのメタノール/クロロホルム/水(MCW)を12v/5v/3vの容量で混合 した中で)から室温で抽出した。混合物をボルテックス混合し、次にエッペンド ルフマイクロ遠心で約3分間遠心した。約0.6mLの上清をデカントし、そしてさら に0.2mLのMCWをペレットに加え、こ れをボルテックス混合し、そして上記のように遠心した。第２の上清(約0.2mL) を第１の上清に加えた。これに0.2mLのクロロホルムを加え、続いて0.3mLの水を 加えた。混合物をボルテックス混合し、そしてエッペンドルフマイクロ遠心で約 3分間遠心し、上部液相(約1.0mL)を取り出し、そしてSavant Speed Vac 濃縮器 で乾燥した。試料を6N 塩酸、0.4％ β-メルカプトエタノール中で窒素下にて24 時間、110-120℃で加水分解した；試料の1/4をポスト−カラムニンヒドリン検出 を使用して、ベックマン(Beckman)モデル6300アミノ酸分析機で分析した。種子 中の相対的な遊離アミノ酸レベルを、ロイシンに対するリシンまたはトレオニン の比として比較し、すなわちロイシンは内部標準として使用した。 高レベルのＤＨＤＰＳタンパク質を発現している形質転換体と、高い遊離リシ ンレベルを有するものとの間には良好な相関があった。最高に発現している系は 、種子中に遊離リシンレベルを100倍より高く増加させることが示された。コリ ネバクテリア(Corynebacteria)ＤＨＤＰＳ単独の発現と比較して、コリネバクテ リア(Corynebacteria)ＤＨＤＰＳと一緒のＡＫIII−Ｍ４の発現による遊離リシ ンの蓄積は、より多くはなかった。コリネバクテリア(Corynebacteria)ＤＨＤＰ Ｓの不在でＡＫIII−Ｍ４を発現する形質転換体は、種子中に遊離トレオニンレ ベルについて、５倍の増加を示した。α-アミノアジピン酸の高レベル（リシン 異化作用を示す）は、多くの形質転換系で観察された。したがって、リシンケト グルタル酸レダクターゼの不活性化によるリシン異化作用の妨害は、種子中にさ らに遊離リシンの蓄積を増大するはずである。あるいはリシンをペプチドまたは リシンに富むタンパク質へ取り込むことが、異化作用を妨げ、そして種子中にリ シンの蓄積を増加させるだろう。 成熟種子中の全アミノ酸組成を測定するために、２ミリグラムの脱脂ミールを 6N 塩酸、0.4％ β-メルカプトエタノール中、窒素下にて24時間、110-120℃で 加水分解し；1/100の試料をベックマンモデル6300アミノ酸分析機で、ポスト− カラムニンヒドリン検出を使用して分析した。種子中の相対的アミノ酸レベルは 、全アミノ酸に対するリシン、トレオニンまたはα-アミノアジピン酸の割合と して比較した。DHDPSタンパク質を発現している形質転換体と高リシンレベルを 有するものとの間には、良い相関があった。非形質転換対照と比較して、リシン レベルが5-100％増加した種子が観察された。最高レベルの種子で、リシンは全 種子アミノ酸の11-13％となり、これまでに知られているいかなるナタネ種子よ りもかなり高い。 実施例６ ファゼオリン プロモーター／cts／cordapAおよびファゼオリン プロモ ーター／cts／lysC-M4 キメラ遺伝子によるダイズの形質転換 キメラ遺伝子カセット、ファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファ ゼオリン３’領域およびファゼオリン５’領域／cts／lysC-M4／ファゼオリン３ ’（実施例４）を、ダイズ形質転換ベクターpBT603に挿入した（図６Ａ）。この ベクターは、大腸菌β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の発現を駆動する、 カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターから成るダイズ形質転 換マーカー遺伝子[Jeffersonら、(1986)Proc.Nal.Acad.Sci.USA 83:8447-8451] を、改質pGEM9Zプラスミド中にNos3'とともに有する。 ファゼオリン５’領域／cts／lysC-M4／ファゼオリン３’領域を挿入するため に、遺伝子カセットを3.3kbのHindIII断片として単離し、そしてHindIII消化pBT 603に挿入し、プラスミドpBT609を得た。このベクターは35S/GUS/Nos3'マーカー 遺伝子から反対の方向に挿入されたキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域／cts ／lysC-M4／ファゼオリン３’領域を有する。 ファゼオリン５’領域／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域キメラ遺伝子カ セットを、オリゴヌクレオチドアダプターを使用して改質し、各末端のHindIII 部位をBamHＩ部位に転換した。この遺伝子カセットを次に2.7kbのBamHＩ断片と して単離し、そしてBamHＩ消化pBT609に挿入し、プラスミドpBT614を得た（図６ Ｂ）。このベクターは、同じ方向に挿入され、そして両方とも35S/GUS/Nos3'マ ーカー遺伝子から反対の方向である両方のキメラ遺伝子、ファゼオリン５’領域 ／cts／cordapA／ファゼオリン３’領域およびファゼオリン５’領域／cts／lys C -M4／ファゼオリン３’を有する。 プラスミドpBT614を、米国特許第5,015,580号明細書に記載された方法に従い 、アグラセタス カンパニー(Agracetus Company)(ミッドレ トン、ウィスコンシン州)による形質転換を介してダイズ中に導入した。５つの 形質転換体系からの種子を得、そして分析した。 トランス遺伝子が形質転換した植物のＲ１種子中で分離していることが期待さ れた。形質転換マーカー遺伝子を持つ種子を同定するために、種子の小片をカミ ソリで切り取り、そして使い捨てのプラスチック製マイクロタイタープレート中 のウェル中に入れた。100mMのNaH2PO4、10mMのEDTA、0.5mMのK4Fe(CN)6、0.1％ のTriton X-100、0.5mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-グルクロン 酸から成るGUSアッセイ混合物を調製し、そして0.15mLを各マイクロタイターウ ェルに加えた。マイクロタイタープレートを37℃で45分間インキューベーション した。青色の発色は種子中のGUSの発現を示していた。 ５つの形質転換体系の４つがGUS発現に関して約３：１の分離を示した（表３ ）。これは GUS遺伝子がダイスゲノムの１つの部位に挿入されたことを示して いる。他の形質転換体は９：１の分離を示し、GUS遺伝子が２つの部位に挿入さ れたことを示唆していた。 ミールを個々の種子の断片から微細粉末に粉砕することにより調製した。全タ ンパク質は、1mgを0.1mLの43mM Tris-HCl pH6.8、1.7％ SDS、4.2％ β-メルカ プトエタノール、8％グリセロールに加え、懸濁液をボルテックス混合し、２− ３分間煮沸し、そして再度ボルテックス混合することにより、ミールから抽出し た。生成した懸濁液を室温で５分間、マイクロ遠心機で遠心して粒子を除去し、 そして各抽出物から10μLをSDSポリアクリルアミドゲルの1レーンで泳動し、細 菌が生産したＤＨＤＰＳまたはＡＫIIIを大きさの標準として用いた。このタン パク質を次に電気泳動的にニトロセルロース膜上にブロットした。膜をウサギ血 清のＤ ＨＤＰＳまたはＡＫIII抗体（それぞれ1:5000または1:1000希釈）に、バイオラ ッドのImmun-Blot Kitで同社により提供された標準法を使用して暴露した。非結 合の１次抗体を除去するためにすすいだ後、膜を２次抗体、ロバ抗−ウサギＩｇ 結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（アマシャム）(1:3000希釈で)に暴露した。非 結合の２次抗体を除去するためにすすいだ後、膜をアマシャム化学ルミネッセン ス試薬およびX-線フィルムに暴露した。 ５つの形質転換体系の４つがＤＨＤＰＳタンパク質をS発現した。ＤＨＤＰＳ を発現した４つの形質転換体で、個々の種子においてＧＵＳとＤＨＤＰＳ発現の 間に良好な相関があった（表３）。したがって、ＧＵＳおよびＤＨＤＰＳ遺伝子 はダイズゲノムの同じ部位に挿入されている。５つの形質転換体のうちの２つが ＡＫIIIタンパク質を発現し、そしてここでも個々の種子においてＡＫIII、ＧＵ ＳおよびＤＨＤＰＳ発現の間に良好な相関があった（表３）。したがって、これ ら２つの形質転換体ではＡＫIII、ＧＵＳおよびＤＨＤＰＳ遺伝子がダイズゲノ ム中の同じ部位に挿入されている。１つの形質転換体は種子中にＧＵＳのみを発 現した。 種子の遊離アミノ酸組成を測定するために、遊離アミノ酸を8-10ミリグラムの ミール(1.0mLのメタノール/クロロホルム/水(MCW)を12v/5v/3vの容量で混合した 中で)から室温で抽出した。混合物をボルテックス混合し、次にエッペンドルフ マイクロ遠心で約3分間遠心した。約0.8mLの上清をデカントした。この上清に0. 2mLのクロロホルムを加え、続いて0.3mLの水を加えた。この混合物をボルテック ス混合し、そしてエッペンドルフマイクロ遠心で約3分間遠心し；上部液相(約1. 0mL)を取り出し、そしてSavant Speed Vac 濃縮器で乾燥した。試料を6N 塩酸、 0.4％ β -メルカプトエタノール中で窒素下にて24時間、110-120℃で加水分解した；試料 の1/10をポスト−カラムニンヒドリン検出を使用してベックマンモデル6300アミ ノ酸分析機で分析した。種子中の相対的な遊離アミノ酸レベルを、ロイシンに対 するリシンの比として比較し、すなわちロイシンは内部標準として使用した。 コリネバクテリア(Corynebacteria)ＤＨＤＰＳタンパク質を発現している形質 転換体と、高い遊離リシンレベルを有するものとの間には良好な相関があった。 遊離リシンレベルの発現において、20から120倍の増加がコリネバクテリア(Cory nebacteria )ＤＨＤＰＳを発現している種子で観察された。高レベルのサッカロ ピン(リシンの異化作用を示す)は、高いリシンレベルを含む種子中で観察された 。 成熟種子中の全アミノ酸組成を測定するために、1-1.4ミリグラムの種子ミー ルを6N 塩酸、0.4％ β-メルカプトエタノール中、窒素下にて24時間、110-120 ℃で加水分解し；1/50の試料をベックマンモデル6300アミノ酸分析機で、ポスト −カラムニンヒドリン検出を使用して分析した。種子中のリシン(および他のア ミノ酸)レベルは、全アミノ酸に対する割合として比較した。 コリネバクテリア(Corynebacteria)DHDPSタンパク質を発現している種子と、 高リシンレベルを有するものとの間には、良い相関があった。非形質転換対照と 比較して、リシンレベルが5-35％増加した種子が観察された。これらの種子で、 リシンは全種子アミノ酸の7.5-7.7％となり、これまでに知られているいかなる ダイズ種子よりもかなり高い。 さらに18の形質転換したダイズ系を得た。これら系からの単一種子をGUS活性 について上記のように分析し、そしてすべての系がＧＵＳ−陽性種子を表した。 ミールを単一種子から、または場合によっては数個の種子プールから抽出し、そ してＤＨＤＰＳおよびＡＫIIIタンパク質の発現に関してウエスタンブロットを 介してアッセイした。18の系から17がＤＨＤＰＳを発現し、そして18のうちの15 がＡＫIIIを発現した。ここでもＧＵＳ、ＤＨＤＰＳおよびＡＫIIIを発現する種 子の間に優れた相関があり、遺伝子が形質転換した系中で連結していることを示 す。 これらの系からの種子のアミノ酸組成を上記のように測定した。ここでもコリ ネバクテリア(Corynebacteria)ＤＨＤＰＳタンパク質を発現している種子はリシ ンレベルの増加を示した。ＤＨＤＰＳ単独の発現は、全種子リシンにおいて５％ から40％の増加を生じた。ＡＫIII−Ｍ４と一緒のＤＨＤＰＳの発現は、400％よ り多いリシンの増加を生じた。すべ ての異なる形質転換系の要約を表３Ａに示す。 実施例７ 植物リシンケトグルタル酸レダクターゼ遺伝子の単離 リシンケトグルタル酸レダクターゼ(LKR)酵素活性が、発生しているメイズ種 子の未成熟内胚乳で観察された[Arrudaら、(1982)Plant Phys iol.69:988-989]。LKR活性は内胚乳の発生開始から急激に増加し、受粉後20日で ピークレベルに達し、そして下降する[Arrudaら、(1983)Phytochemistry 22:268 7-2689]。 トウモロコシ LKR遺伝子をクローン化するために、RNAを受粉後19日に発生中 の種子から単離した。ベクター ラムダ ZapII中のcDNAライブラリーをカスタム 合成するために、このRNAをクローンテック ラボラトリーズ社(Clontech Labora tories,Inc)(パロアルト、カリフォルニア州)に送った。ラムダZapIIライブラリ ーのファゲミドライブラリーへの転換、次にプラスミドライブラリーへの転換は クローンテックにより提供された方法に従い行った。いったんプラスミドライブ ラリーに転換されれば、得られたアンピシリン−耐性クローンはベクターpBlues cript SK(-)中にcDNA挿入物をもつ。cDNAの発現はベクターのlacZプロモーター の制御下にある。 ２つのファゲミドライブラリーを、ラムダZapIIファージおよび100μLから1μ Lの繊維状ヘルパーファージの混合物を使用して生成した。さらに２つのライブ ラリーは、100μLのラムダZapIIから10μLのヘルパーファージおよび20μLのラ ムダZapIIから10μLのヘルパーファージの混合物を使用して生成した。ファゲミ ド調製物の力価は使用した混合物にかかわらず同様であり、そして大腸菌XL1-Bl ue株を宿主として約2×103アンピシリン−耐性トランスフェクション体/mLであ り、そしてDE126(以下を参照にされたい)を宿主として約1×103であった。 LKR遺伝子をもつクローンを選択するために、特別に設計された大腸菌宿主、D E126を構築した。DE126の構築は、数段階で行われた。 （１）コリファージPlvirの普遍形質導入ストックを、標準的方法(方法 についてはJ.Miller、分子遺伝学の実験(Experiments in Molecular Genetics) を参照にされたい)を使用して、TST1[F-,araD139,delta(argF-lac)205,flb5301,pts F25,relA1,rpsL150,malE52::Tn10,deoC1,λ-](大腸菌遺伝子保存センター#61 37)の培養物の感染により生成した。 （２）導入交配(方法についてはJ.Miller、分子遺伝学の実験を参照にされたい) において、このファージストックを供与体として、GIF106M1株(F-,arg-,ilvA296 ,lysC1001,thrA1101,metL1000,λ-,rpsL9,malT1,xyl-7,mtl-2,thil(?),supE44(? )](大腸菌遺伝子保存センター#5074)を受容体として使用した。組換え体は、抗 生物質テトラサイクリンを含有するリッチ培地[DAPを補充したL]で選択した。テ トラサイクリン耐性を付与するトランスポゾンTn10は、TST1株のmalE遺伝子中に 挿入される。この交配からのテトラサイクリン−耐性導入体は、malEの近くに大 腸菌染色体の最高2分を含むと思われる。遺伝子malEおよびlysCは、構築距離内 の0.5分未満でよく別れている。 （３）200のテトラサイクリン-耐性導入体は完全に表現型が決定された；適当な 発酵および栄養要求が評価された。受容体GIF106M1株は、thrA,metLおよびlysC の突然変異によりアスパルトキナーゼアイソザイムを完全に欠き、したがってト レオニン、メチオニン、リシンおよびメソージアミノピメリン酸（ＤＡＰ）が成 長に必要である。遺伝したlysC +とTST1からのmalE::Tn10とを有する導入体は、 炭素源およびエネルギー源として役立つグルコースに加えて、ビタミンＢ１、L- アルギニン、L-イソロイシンおよびL-バリンを含む最少培地で成長すると期待さ れた。さらに、lysC +,metL -およびthrA -の遺伝的構成を持つ株は、リシン感受性 アスパルトキナーゼを発現するだけであろう。したがってリシンを最少培 養に加えると、トレオニン、メチオニンおよびＤＡＰの欠乏を導くことによりly sC + 組換え体の成長を妨害するはずである。調査した200のテトラサイクリン耐性 導入体のうち、49がトレオニン、メチオニンおよびＤＡＰを欠いた最少培地で成 長した。さらに49のすべてがL-リシンを最少培地に添加することにより阻害され た。これらの導入体のうちの１つをDE125と命名した。DE125はテトラサイクリン 耐性、アルギニン、イソロイシンおよびバリンの成長要求性、およびリシン感受 性の表現型を有する。この株の遺伝型はF-,malE52::Tn10 arg- ilvA296 thrA110 1 metL1000 lambda-rpsL9 malT1 xyl-7 mtl-2,thil(?),supE44(?)である。 （４）この段階にはDE125株の雄性誘導体の生成が関与する。DE125株を雄株AB15 28[F'16/delta(gpt-proA)62,lacY1またはlacZ4,gln44,galK2 rac-(?),hisG4,rfb d 1,mgl-51,kdgK51(?),ilvC7,argE3,thi-1](大腸菌遺伝子保存センター#1528)と 接合法により交配した。F'16はilvGMEDAYC遺伝子クラスターを持つ。２つの株を 各株の成長を許容できるリッチ培地上に交差して線状に接種した。インキューベ ーション後、プレートのレプリカを合成培地（テトラサイクリン、アルギニン、 ビタミンＢ１およびグルコースを含有する）にとった。DE125は、イソロイシン を合成できないので、この培地では成長できない。AB1528の成長は、抗生物質テ トラサイクリンの包含、および合成培地からプロリンおよびヒスチジンを排除し たことにより妨げられる。細胞の斑点(patch)がこの選択培地上で成長した。 これらの組換え体細胞は同じ培地で１つのコロニー単離を受けた。１つのクロ ーンの表現型はIlv+,Arg-,TetR,リシン−感受性、雄性特異的ファージ(MS2)-感 受性であり、AB1528からDE125へのの単純なF'16転移 と一致していた。このクローンをDE126と命名し、そしてこれは遺伝型F'16/malE 52::Tn10 arg- ilvA296 thrA1101 metL100 lysC +,λ -,rpsL9malT1 xyl-7 mtl-2,thi-1 ?,supE44?を有する。これは合成培地中で20μg/mlのL-リシンにより阻害さ れる。 LKR遺伝子を持つトウモロコシｃＤＮＡライブラリーからクローンを選択する ために、100pLのファゲミドライブラリーを、Ｌブロス中で一晩成長させた100μ LのDE126培養物と混合し、そして細胞をビタミンＢ１、L-アルギニン、炭素およ びエネルギー源としてグルコース、100μg/mLのアンピシリンおよびL-リシン(20 、30または40μg/mL)を有する合成培地にまいた。3種のリシン濃度で、各々4つ のプレートが準備された。ファゲミドおよびDE126の量は、プレートあたり1×105 のアンピシリン耐性トランスフェクション体を生じるものと予想された。プレ ートあたり10から30個のリシン−耐性コロニーが成長した(5000個のアンピシリ ン−耐性コロニー あたり約1個のリシン−耐性コロニー)。 プラスミドＤＮＡを10個の別個のクローンから単離し、DE126に再度形質転換 した。10のＤＮＡのうち７つがリシン−耐性クローンを生じ、リシン−耐性特性 がプラスミドに保持されていることが示された。クローン化したＤＮＡの幾つか を配列決定し、そして生化学的に特性決定した。挿入されたＤＮＡ断片は、トウ モロコシｃＤＮＡというよりはむしろ大腸菌ゲノムに由来し、クローンテックに より提供されたｃＤＮＡライブラリーは混入していることが判明した。したがっ て新たなｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして上記のようにスクリーニングし た。 実施例８ 発現ベクターpSK5中の合成遺伝子の構築 以下に記載する合成遺伝子の構築および発現を行うために、以下の特性を持つ プラスミドベクターを構築する必要があった： １．配列の挿入が独特な部位を作り出すように、EarI制限エンドヌクレアーゼ部 位が無い。 ２．成長中のプラスミドの損失および毒性タンパク質の発現を回避するために、 テトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいる。 ３．大腸菌中で挿入した配列を発現させるために、T7プロモーターおよびターミ ネーターセグメントを含む、プラスミドpBT430からの約290bpを含んでいる。 ４．オリゴヌクレオチド配列を挿入できるように、T7プロモーターの後ろの正し い位置に独特の制限エンドヌクレアーゼ認識部位EcoRIおよびNcoIを含んでいる 。 １および２の特性を得るために、出願人はpBR322の天然の突然変異体であり、 その遺伝子に近いアンピシリン遺伝子およびEarI部位がすでに欠失しているプラ スミドpSK1を使用した。プラスミドpSK1はテトラサイクリン耐性遺伝子、独特な EcoRI制限部位を塩基１に、そして１つのEarＩ部位を塩基2353に保持していた。 pSK1の塩基2353のEarＩ部位を除去するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、 pSK1を鋳型として使用して行った。約10フェントモルのpSK1を1μgの各オリゴヌ クレオチドSM70およびSM71(これらはABI1306B DNA合成機で製造元の手順に従い 合成した)と混合した。 これらのオリゴヌクレオチドのpSK1鋳型での釣り上げ部位を図７に示す。この PCRはパーキン エルマー シータスキット(エミリービレ、カリフォルニア州)を 使用して、同社が製造している熱循環器に関する販売元の指示に従い行った。25 サイクルは、95℃で1分間、42℃で２分間そして72℃で12分間であった。オリゴ ヌクレオチドは、EarＩ部位の周辺30b断片を除く全pSK1プラスミドの複製を釣り 上げるように設計された（図７を参照にされたい）。100μLの反応生成物の10マ イクロリットルを、1％アガロースゲルで泳動し、そしてエチジウムブロミドで 染色して予想された複製プラスミドの大きさに対応する約3.0kbのバンドが現れ た。 残りのPCR反応混合物(90μL)を、添加した20μLの2.5mM デオキシヌクレオチ ド三リン酸(dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP)、30単位のクレノー酵素と混合し、そ して混合物を37℃で30分間、続いて65℃で10分間インキューベーションした。ク レノー酵素はPCRにより生じた突出末端を埋めるために使用した。このＤＮＡを エタノール沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、吸引乾燥させ、そして水に再懸 濁した。このＤＮＡを次に、キナーゼ緩衝液中に1mM ATPが存在する中でT4 DNA キナーゼで処理した。この混合物を37℃で30分間、続いて65℃で10分間インキュ ーベーションした。10μLのキナーゼ調製物に、2μLの5×ライゲーション緩衝液 および10単位のT4 DNAリガーゼを加えた。ライゲーションは15°で16時間行った 。ライゲーション後、ＤＮＡを半分に分け、１方をEarＩ酵素で消化した。クレ ノー、キナーゼ、ライゲーションおよび制限エンドヌクレアーゼ反応は、Sambro okら、[モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第２版、(198 9)コールドスプリングハーバーラボラトリー 出版]に記載されているように行った。クレノー、キナーゼ、リガーゼおよびほ とんどの制限エンドヌクレアーゼは、BRLから購入した。幾つかの制限エンドヌ クレアーゼはNENバイオラボズ(NEN Biolabs:ベヴァリー、マサチューセッツ州) またはベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim:インディアナポリス、イ ンディアナ州)から購入した。両方の連結されたＤＮＡ試料を、別個にコンピテ ントJM103[supE thi del(lac-proAB)F'[traD36 porAB,lacIq lacZ del M15]制限 マイナス]細胞中に、Sambrookら、[モレキュラークローニング、ア ラボラトリ ーマニュアル、第２版、(1989)コールドスプリングハーバーラボラトリー出版] に記載されているCaCl2法を使用して形質転換し、12.5ug/mLのテトラサイクリン を含有する培地にまいた。EarＩ消化の有無で同数の形質転換体が回収され、Ear Ｉ部位がこれらの構築物から除去されたことを示唆した。クローンは、Sambrook ら、[モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第２版、(1989) コールドスプリングハーバーラボラトリー出版]に記載されているアルカリ溶解 ミニプレップ法でＤＮＡを調製することによりスクリーニングし、続いて制限エ ンドヌクレアーゼ消化分析を行った。テトラサイクリン−耐性であり、かつEar Ｉ部位を含まない１つのクローンが選択された。このベクターをpSK2と命名した 。pSK2の残るEcoRI部位は、EcoRIでプラスミドを完全に消化して破壊し、末端を クレノーで埋めて、そして連結した。EcoRI部位を含まないクローンをpSK3と命 名した。 上記３および４の特性を獲得するために、プラスミドpBT430(実施例２を参照 にされたい)から、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター/ターミ ネーターセグメントをPCRにより増幅した。オリゴヌ クレオチドプライマーSM78(配列番号18)およびSM79(配列番号19)は、T7プロモー ター/ターミネーター配列に広がるpBT430由来の300b断片を釣り上げるように設 計した（図７を参照にされたい）。 PCR反応はすでに記載したように、pBT430を鋳型として使用して行い、そして3 00bpの断片を生成した。断片の末端はクレノー酵素およびキナーゼを使用して上 記のように埋めた。プラスミドpSK３からのＤＮＡをPvuII酵素で完全に消化し、 そして次にウシ腸管アルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム）で処理 して５’リン酸を除去した。手法はSambrookら、[モレキュラークローニング、 ア ラボラトリーマニュアル、第２版、（1989） コールドスプリングハーバー ラボラトリー出版]の記載されているように行った。切断およびホスファターゼ 処理pSK3 DNAをエタノール沈殿により精製し、そして一部をT7プロモーター配列 を含むPCR生成断片でのライゲーション反応に使用した。このライゲーション混 合物を、JM103[supE thi del(lac-proAB)F'[traD36 porAB,lacIq lacZ del M15] 制限マイナス]中に形質転換し、そしてテトラサイクリン−耐性コロニーをスク リーニングした。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解ミニプレップ法を介して調製 し、そして制限エンドヌクレアーゼ分析を行い、PCR生成物の挿入および方向を 検出した。２つのクローンをシークエンシング分析用に選択した：プラスミドpS K5は図７に示す方向で断片を有した。Sequenase(商標)T7 DNAポリメラーゼ(USバ イオケミ カル社)および製造元が推薦する方法を使用して、アルカリ変性二本鎖ＤＮＡに ついて行った配列分析で、pSK5はPCR複製誤差がＴ７プロモーター／ターミネー ター配列にないことが明らかとなった。 EarＩ部位に基づく反復合成遺伝子配列の構築法を、図８に表す。第一段階は1 4アミノ酸の基本遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド配列の挿入であった。 このオリゴヌクレオチド挿入物は、後に１つ以上の７反復単位をコードするオリ ゴヌクレオチドを挿入するための独特のEarＩ制限部位を含み、そして植物ベク ターに遺伝子配列を転移させるために使用する独特のAsp718制限部位を加えた。 オリゴヌクレオチド組の突出末端は、ベクターpSK5の独特のNcoIおよびEcoRI部 位への挿入を可能にした。 プラスミドpSK5由来のDNAを、NcoIおよびEcoRI制限エンドヌクレアーゼで完全 に消化し、そしてアガロースゲル電気泳動で精製した。精製したＤＮＡ(0.1ug) を、1ugの各オリゴヌクレオチドSM80(配列番号14)およびSM81(配列番号13)と混 合し、そして連結した。ライゲーション混合物を大腸菌JM103株[supE thi del(l ac-proAB)F'[traD36 porAB,lacIq lacZ del M15]制限マイナス]中に形質転換し 、そしてテトラサイクリン−耐性形質転換体を迅速プラスミドＤＮＡプレップに よりスクリーニングし、続いて制限消化分析を行った。オリゴヌクレオチドの正 しい挿入を示す、１つの各EarＩ、NcoI、Asp 718およびEcoRI部位を有するクロ ーンを選択した。このクローンをpSK6で消化した(図９)。T7プロモーター後のＤ ＮＡ領域のシークエンシングで、予想された配列のオリゴヌクレオチドの挿入を 確認した。 繰り返しの７つ揃のコーディング配列を、基本遺伝子の独特のEarＩ 部位に直接連結できるオリゴヌクレオチド対を生成することにより、上記の基本 遺伝子構造に付加した。オリゴヌクレオチドSM84(配列番号23)およびSM85(配列 番号24)は、SSP5の７つ揃の反復をコードする。オリゴヌクレオチドSM82(配列番 号25)およびSM83(配列番号26)はSSP7の７つ揃の反復をコードする。 オリゴヌクレオチドの組を連結そして精製して、発現ベクター中に挿入するた めの多くの７つ揃の反復をコードするＤＮＡ断片を得た。全2μgの各組のオリゴ ヌクレオチドをキナーゼ処理し、そして室温で２時間連結させた。このオリゴヌ クレオチドの連結多量体を18％の未−変性20×20×0.015cmのポリアクリルアミ ドゲル(アクリルアミド：ビス-アクリルアミド=19:1)で分離した。ゲルで168bp( 8n)以上として分離した多量体は、そのバンドを含むポリアクリルアミドの小片 を細かい切片に切り、1.0mLの0.5M 酢酸アンモニウム、1mM EDTA(pH7.5)を加え 、そして試験管を37℃で一晩回転させることにより精製した。このポリアクリル アミドを遠心により落とし、1μgのtRNAを上清に加え、ＤＮＡ断片を２容量のエ タノールで-70℃にて沈殿させ、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、10μLの水に 再懸濁した。 10マイクログラムのpSK6 DNAをEarＩ酵素で完全に消化し、そしてウ シ腸管アルカリホスファターゼで処理した。切断し、そしてホスファターゼ処理 したベクターＤＮＡを、低融点アガロースゲルで電気泳動した後に結合したＤＮ Ａを切り出し、アガロースゲルを55℃で液体化し、そして製造元の推薦方法に従 いNACS PREPAC(商標)カラム(BRL)で精製すことにより単離した。約0.1μgの精製 EarI消化、そしてホスファターゼ処理pSK6 DNAを、5μLのゲル精製多量体オリゴ ヌクレオチドの組と混合し、そして連結した。連結した混合物を大腸菌JM103株[ supE thi del(lac-proAB)F'[traD36 porAB,lacIq lacZ del M15]制限マイナス] 中に形質転換し、そしてテトラサイクリン−耐性形質転換体を選択した。クロー ンは迅速プラスミドプレップＤＮＡの制限消化によりスクリーニングして挿入Ｄ ＮＡの長さを決定した。制限エンドヌクレアーゼ分析は通常、プラスミドＤＮＡ をAsp718およびBglIIで消化し、続いて断片の分離を18％の未変性ポリアクリル アミドゲルで分離することにより行った。エチジウム ブロミドによる断片の視 覚化により、150bp断片は基本遺伝子セグメントが存在する時のみ生成されるこ とが示された。オリゴヌクレオチド断片の挿入は、この大きさを21塩基の倍数で 増大させた。このスクリーニングから、幾つかのクローンがＤＮＡ配列分析およ び大腸菌中でのコード化配列の発現のために選択された。各構造の配列を挟む最 初の、および最後のSSP5の７つ揃は、上記の基本塩基に由来する。挿入物は下線 により表される（表４）。 オリゴヌクレオチドのオリゴマー状態のゲル精製では、より長い（すなわち＞ 8n）挿入物が望まれた濃度(enricchment)で存在しなかったので、出願人は続く 挿入物構築では異なる手法を使用した。この一連の構築物のために、さらに４組 のオリゴヌクレオチドを生成し、これらはそれぞれＳＳＰ８、９、１０および１ １アミノ酸配列をコードする： 上記のようにオリゴヌクレオチドのキナーゼ処理および連結の後、オリゴヌク レオチドの組の多量化状態を精製するために続いてＨＰＬＣ法を使用した。クロ マトグラフィーはヒューレットパッカード（Hewlett Packard）液体クロマトグ ラフ装置、モデル1090Mで行った。溶出液の吸収は260nmでモニターした。連結し たオリゴヌクレオチドを12,000×gで5分間遠心し、そして0.5μイン-ラインフィ ルター(スペルコ：Supelco)を備えた2.5μ TSK-DEAE-NPRイオン交換カラム(35cm ×4.6mm I.D.)に注入した。オリゴヌクレオチドは、勾配溶出および２種類の緩 衝液移動相[緩衝液Ａ：25mM Tris-Cl、pH9.0および緩衝液Ｂ：緩衝液Ａに１M Na Clを加えた]を使用して、長さに基づき分離された。両方の緩衝液ＡおよびＢは 、使用前に0.2μフィルターを通した。 以下の勾配プログラムを、30℃にて流速1mL/分で使用した。 画分(500μl)を3分から9分の間で回収した。120bpから2000bpの間の長さに対 応する画分は、プラスミドDNAの制限消化物の対照分離物から決定してプールし た。 各オリゴヌクレオチドの組について4.5mLのプール画分を、10μgのtRNAおよび 9.0mLのエタノールを加えることにより沈殿させ、70％エタノールで２回すすぎ 、そして50μLの水に再懸濁した。再懸濁したHPLC精製オリゴヌクレオチドの10 マイクロリットルを、上記の0.1μgのEarＩ切断、ホスファターゼ処理pSK6 DNA に加え、そして15°で一晩連結した。キナーゼ処理され、自己連結しているが、 ゲルまたはＨＰＬＣにより精製されていない上記のすべての６つのオリゴヌクレ オチドの組も、pSK6 ベクターでの別のライゲーション反応に使用された。この ライゲーション混合物を、大腸菌DH5α株[supE44 del lacU169(phi 80 lacZ del M15)hsdR17 recA1 endA1 gyr196 thil relA1]中で形質転換し、そしてテトラサ イクリン−耐性コロニーを選択した。DH5α[supE44 del lacU169(phi 80 lacZ d el M15)hsdR17 recA1 endA1 gyr196 thil relA1]株が大変高い形質転換率を有し 、かつrecA -であるので、出願人はこの株を続くすべての研究に使用するために 選択した。このrecA -表現型は、これらの反復性ＤＮＡ構造が相同組換えの基質 となり、多量体配列の欠失を引き起こすかもしれないという心配を排除する。 クローンを上記のようにスクリーニングした。幾つかのクローンを、各々の６ つのオリゴヌクレオチドの組の挿入物を表すために選択した。配列を挟んだ最初 の、および最後のＳＳＰ５の７つ揃は、基本遺伝子配列を表す。挿入配列は下線 を付す。文字”Ｈ”を含むクローン番号は、HPLC-精製オリゴヌクレオチドを表 す(表５)。 クローン82-4の初めの基本遺伝子反復の損失は、ベクターpSK6がrecA -株中に転 移する前に、基本遺伝子反復5.5の間の相同組換えにより生じたものかもしれな い。HPLC法は、オリゴヌクレオチドの組のより長い多量体状態を基本遺伝子中に 挿入することを増大させなかったが、連結されたオリゴヌクレオチドの効率的精 製として役立った。 ＳＳＰ配列のオ混合物をコードし、そしてできるかぎり可変コドンが利用でき るオリゴヌクレオチドを設計した。これは、いったん合成遺伝子が植物中で形質 転換されたら、組換えによる反復挿入物欠失の可能性を減らすために、そして構 築された遺伝子セグメントの長さを延ばすために行った。これらのオリゴヌクレ オチドは７つ揃のコーディング単位の４つの反復をコードし(28アミノ酸残基)、 すでに構築した任意のクローンの独特なEarＩ部位に挿入できる。SM96およびSM9 7はSSP(5)4をコードし、SM98およびSM99はSSP(7)4をコードし、ならびにSM100お よびSM101はSSP8.9.8.9をコードする。 クローン82-4および84-H3からのDNAをEarＩ酵素で完全に消化し、ホスファタ ーゼで処理し、そしてゲル精製した。約0.2μgのこのDNAを1.0μgの各オリゴヌ クレオチドの組、SM96およびSM97、SM98およびSM99またはSM100およびSM101(予 めキナーゼ処理してある)と混合した。このＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを 一晩連結し、次にライゲーション混合物を大腸菌DH5α株中に形質転換した。テ トラサイクリン耐性コロニーをオリゴヌクレオチド挿入物の存在について、上記 のようにスクリーニングした。クローンをその制限エンドヌクレアーゼ消化パタ ーンに基づき、シークエンシング分析用に選択した（表６）。 クローン2-9は、クローン82-4（上記参照）のEarＩ部位に連結されたオリゴヌ クレオチドSM100(配列番号71)およびオリゴヌクレオチドSM101(配列番号72)由来 のものであった。クローン3-5(配列番号78)は、オリゴヌクレオチドの組SM96(配 列番号65)およびSM97(配列番号66)の最初の22塩基をクローン82-4(配列番号53) のEarI部位への挿入したものに由来した。この部分的挿入はこれらの高度に反復 的なオリゴの不正確なアニーリングを反映するものかもしれない。クローン5-1( 配列番号76)は、クローン84-H3(配列番号55)のEarI部位中に連結されたオリゴヌ クレオチドSM98(配列番号68)およびSM99(配列番号69)に由来した(セクションを 参照にされたい)。 方法II． 第２の合成遺伝子配列の構築法は、ＤＮＡおよびアミノ酸配列両方のさらなる 柔軟性を可能にすることであった。この方法を図１０および図１１に表す。第１ 段階は16アミノ酸の基本遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド配列を元のベク ターpSK5に挿入することであった。このオリゴヌクレオチド挿入物は、１つ以上 の７つ揃の反復をコードするオリゴヌクレオチドの挿入に使用するために、独特 なEarI部位を前の基本遺伝 子構築物のように含んだ。この基本遺伝子もBspHI部位を3'末端に含んだ。この 開裂部位の突出末端は、NcoI突出末端を使用して“枠内”のタンパク質融合を可 能にするように設計されている。したがって遺伝子セグメントは図１１に記載す る重複スキームを使用して、多量化することができる。このオリゴヌクレオチド の組の突出末端は、ベクターpSK5の独特なNcoIおよびEcoRI部位への挿入を可能 にした。 このオリゴヌクレオチド組をpSK5ベクターに上記方法Ｉに記載されたように挿 入した。生成したプラスミドをpSK34と命名した。 35アミノ酸“セグメント”をコードするオリゴヌクレオチド組を、上記記載の 方法を使用してpSK34基本遺伝子の独特なEarI部位に連結した。この場合、オリ ゴヌクレオチドはゲルまたはＨＰＬＣ精製されていないが、単にアニールしてラ イゲーション反応に使用した。以下のオリゴヌクレオチド組を使用した： 挿入セグメントの存在について、制限消化、続いて6％アクリルアミドゲルで の断片の分離により、クローンをスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの正 しい挿入をＤＮＡ配列分析により確認した。セグメント３、４および５を含むク ローンを、それぞれpSKseg3、pSKseg4およびpSKseg5と命名した。 これらの“セグメント”クローンを、図１１に示すような重複スキームに使用 した。10μgのプラスミドpSKseg3をNheIおよびBspHIで完全に消化し、そして150 3bp断片をワットマン(Whatmann)ペーパー法を使用してアガロースゲルから単離 した。10μgのプラスミドpSKseg4をNheIおよびN coIで完全に消化し、そして2109bpバンドのゲルを単離した。等量のこれらの断 片を連結し、そして組換え体をテトラサイクリンで選択した。クローンを制限消 化によりスクリーニングし、そしてその配列を確認した。生成したプラスミドを pSKseg34と命名した。 pSKseg34およびpSKseg5プラスミドＤＮＡを消化し、断片を単離し、そして上 記と同様な方法で連結して、セグメント３および４に融合したセグメント５をコ ードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを作成した。この構築物をpSKseg534と命 名し、そして以下のアミノ酸配列をコードする。 実施例９ 植物種子中での発現のためのＳＳＰキメラ遺伝子の構築 実施例８に記載した合成遺伝子構築物を植物種子中で発現させるために、この 配列を種子プロモーターベクターCW108、CW109またはML113に転移させた（図１ ２）。ベクターCW108およびML113はインゲン ファゼオリンプロモーター(塩基+1 から塩基-494)およびインゲンファゼオリン遺伝子の3'配列の1191塩基を含む。C M109はインゲンβ-コングリシニンプロモーター(塩基+1から塩基-619)、および インゲンファゼオリン遺伝子の同じ3'配列の1191塩基を含む。これらのベクター は、独特なNcoIおよびAsp718部位中に、コーディング配列を直接クローニングで きるように設計された。これらのベクターは、適当なバイナリーベクター中にプ ロモーター／コーディング領域／３’配列を直接転移できるように、５’ および３’末端に部位（HindIIIまたはSalＩ）も提供する。 合成貯蔵タンパク質遺伝子配列を挿入するために、10μgのベクターDNAをAsp7 18およびNcoI制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。直線化したベクターを 1.0％アガロースゲルで一晩、15ボルトで電気泳動して精製した。断片はバンド の前のアガロースを切り取り、10×5mmのワットマン3MMペーパー片をアガロース に挿入し、そして断片をペーパー中に電気泳動することにより回収した[Erringt on,(1990)Nucleic Acids Research,18:17]。断片および緩衝液を遠心によりペー パーから落とし、そして〜100μL中のＤＮＡを10mgのtRNA、10μLの3M 酢酸ナト リウムおよび200μLのエタノールを加えることにより沈殿させた。沈殿したＤＮ Ａを70％エタノールで２回洗浄し、そして吸引乾燥した。断片ＤＮＡを20μLの 水に再懸濁し、そしてライゲーション反応に使用するために一部を10倍に希釈し た。 クローン3-5およびpSK534からのプラスミドＤＮＡ(10mg)を、Asp718およびNco I制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。この消化生成物を18％ポリアクリ ルアミド非−変性ゲルで実施例８に記載したように分離した。所望の断片を含む ゲル切片をゲルから切り出し、そしてゲル切片を1％アガロースゲルに入れ、そ して100ボルトで20分間電気泳動することにより精製した。ＤＮＡ断片を10×5mm のワットマン3MMペーパー片で回収し、緩衝液および断片を遠心により落とし、 そしてＤＮＡをエタノールで沈殿させた。断片ＤＮＡを6μLの水に再懸濁した。 １マイクロリットルの希釈した上記ベクター断片、2μLの5×ライゲーション緩 衝液および1μLのT4 DNAリガーゼを加えた。混合物を15°で一晩連結した。 ライゲーション混合物を大腸菌DH5a株[supE44 del lacU169(phi 80 l acZ del M15)hsdR17 recA1 endA1 gyr196 thil relA1]中に形質転換し、そして アンピシリン耐性コロニーを選択した。クローンは制限エンドヌクレアーゼ消化 分析でスクリーニングし、迅速プラスミドDNAおよびDNAシークエンシングで分析 した。 実施例１０ キメラ遺伝子、ファゼオリンプロモーター／cts／ecodapA、 ファゼオリンプロモーター／cts／lysC-M4および β-コングリシニンプロモーター／SSP3-5を含むタバコ植物 バイナリーベクターpZS97は、実施例９のキメラSSP3-5遺伝子および実施例４ のキメラ大腸菌dapAおよびlysC-M4遺伝子を、タバコ植物中に転移するために使 用した。バイナリーベクターpZS97(図１３)は、アグロバクテリウム ツメファ シエンス(Agrobacterium tumefaciens)のバイナリーＴｉプラスミドベクターシ ステムの一部である[Bevan,(1984)Nucl.Acids Res.12:8711-8720]。このベクタ ーは以下のものを含む： （１）形質転換した植物細胞の選択性マーカー遺伝子としてキメラ遺伝子ノパリ ンシンターゼ::ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nos::NPTII)[Bevanら、 （1983）Nature 304:184-186]、（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左および 右境界[Bevan,(1984)Nucl.Acids Res.12:8711-8720]、（３）独特なSalI部位(pS K97K)または独特なHindIII部位(pZS97)をポリリンカー領域に持つ、大腸菌lacZ a-相補セグメント[Vieringら、（1982）Gene 19:259-267]、（４）シュードモナ ス（Pseudomonas）プラスミドpVS1由来の細菌複製起源[イトーら、（1984）Plas mid 11:206-220]、および（５）形質転換したエイ.ツメファシエンス(A.tumefac iens) を選択できるマーカーとして細菌β-ラクタマーゼ遺伝子。 プラスミドpZS97 DNAをHindIII酵素で完全に消化し、そして消化プラスミドを ゲル精製した。このHindIII消化pZS97 DNAを、HindIII消化そしてゲル単離した キメラ遺伝子断片と混合し、連結し、上記のように形質転換し、そしてアンピシ リンでコロニーを選択した。 キメラ遺伝子を含むバイナリーベクターを、三親交配[Ruvkinら、（1981）Nat ure 289:85-88]により、カルベニシリン耐性で選択されるアグロバクテリウム(A grobacterium )LBA4404/pAL4404株[Hockemaら、（1983）Nature 303:179-180]に 転移した。 バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)の培養物は、 タバコの葉のディスクを形質転換するために使用した[Horschら、（1985）Scien ce 227:1229-1231]。トランスジェニック植物をカナマイシン含有選択培地で再 生させた。 キメラ遺伝子、β-コングリシニン プロモーター/SSP3-5/ファゼオリン3'領域 を含む形質転換したタバコ植物をこのように得た。２つの形質転換した系、pSK4 4-3AおよびpSK44-9A(これはSSP3-5遺伝子の1つの挿入部位を持つ)を、カナマイ シン耐性についてマーカー遺伝子の3:1の分離に基づき同定した。１次形質転換 体の子孫（これらはトランス遺伝子についてホモ接合体）、pSK44-3A-6およびpS K44-9A-5をこれら植物の種子中のカナマイシン耐性の4:0の分離に基づき同定し た。 同様に、キメラ遺伝子、ファゼオリン5'領域/cts/lysC-M4/ファゼオリン3'領 域およびファゼオリン5'領域/cts/ecodapA/ファゼオリン3'領域で形質転換した タバコ植物を得た。形質転換系、BT570-45A(これはDHDPSおよびAK遺伝子の1つの 挿入部位を持つ)を、カナマイシン耐性に関するマーカー遺伝子の3:1分離に基づ き同定した。トランス遺伝子につ いてホモ接合体である１次形質転換体からの子孫、BT570-45A-3およびBT570-45A -4を、これらの種子中のカナマイシン耐性の4:0の分離に基づき同定した。 すべての３つのキメラ遺伝子を持つ植物を生成するために、ホモ接合体の親を 使用して遺伝的交配を行った。植物を温室条件下で成熟するまで成長させた。雄 性および雌性として使用する花を、開花１日前に選択し、花序上の古い花は取り 除いた。交配のために、雌性の花は葯が裂開性でない時、開花直前に選択した。 花冠が１方の側で開き、そして葯を取り出した。同日に開き、そして成熟した花 粉を落とす裂開性の葯の有する花を雄性の花として選択した。葯を取り出し、そ して葯を落とした雌花の雌蕊を受粉させるために使用した。次に雌蕊をプラスチ ック製チューブで覆い、さらに受粉することを防いだ。種子のさやを発生させ、 そして4-6週間乾燥し、そして収穫した。各々の交配から２−３の別個のさやが 回収された。以下の交配を行った： 乾燥種子のさやを壊して開き、そして種子を集め、そして各々の交配からプー ルした。各々の交配から３０の種子が計数され、そして各々の親から自家受粉し た花からの対照種子を使用した。２連の種子試料を加 水分解し、そして実施例５に記載したように全アミノ酸含量をアッセイした。野 生型の種子（2.56％のリシンを含有）の全アミノ酸に対する割合としてのリシン 増加を、種子の内胚乳中の各遺伝子のコピー数と一緒に表７に与える。 これらの交配の結果は、種子中の全リシンレベルがリシン生合成遺伝子および 高リシンタンパク質SSP3-5の共役発現により、10-25パーセント増加できること を示している。ハイブリット植物に由来する種子中で、この相乗作用は生合成遺 伝子が雌性の親に由来する時に最高に強く、おそらく内胚乳中の遺伝子量による ものであろう。リシンレベルは生合成 遺伝子およびリシンに富むタンパク質遺伝子がすべてホモ接合体ならば、さらに 増加すると期待される。 実施例１１ キメラ遺伝子 ファゼオリンプロモーター／cts／cordapAおよび ファゼオリンプロモーター／SSP3-5を含むダイズ植物 キメラ遺伝子、ファゼオリンプロモーター／cts／cordapA／ファゼオリン3'領 域を発現する形質転換したダイズ植物は、実施例６に記載した。キメラ遺伝子、 ファゼオリンプロモーター／SSP3-5／ファゼオリン3'領域を発現する形質転換し たダイズ植物は、キメラ遺伝子を単離したHindIII断片として同等のダイズ形質 転換ベクタープラスミドpML63(図１４実施例６)に挿入し、そして実施例６に記 載されたように形質転換を行うことにより得た。 １次形質転換体からの種子を、種子の脇の小片を胚軸から切り取ることにより 試料とした。この小片をＧＵＳ活性について、実施例６に記載したようにアッセ イして、どの分離種子がトランス遺伝子を持つのかを決定した。半分の種子をミ ールに挽き、そして酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によりSSP3-5タンパク質 の発現についてアッセイした。Elisaは以下のように行った： グルタチオン-S-トランスフェラーゼとSSP3-5遺伝子産物の融合タンパク質は 、Pharmacia(商標)pGEX GST 遺伝子融合システムを使用して作成した(分子生物 学の現在の技法：Current Protocols in Molecular Biology、第2巻、第16.7.1- 8(1989)、ジョン ウィリー アンド サンズ)。融合タンパク質をグルタチオンア ガロース（シグマ：Sigma）またはグルタチオンセファロース（ファルマシア） ビーズでアフィニティークロ マトグラフィー精製し、Centricon10(商標)(アミコン;Amicon)フィルターを使用 して濃縮し、そしてさらに精製するためにＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動(1 5％アクリルアミド、19:1アクリルアミド:ビスアクリルアミド)に供した。この ゲルをクマシーブルーで30分間染色し、50％メタノール、10％酢酸中で脱色し、 そしてタンパク質バンドをAmicon(商標)Centiluter Microelectroeluter(Paul T .マツダイラ編集、マイクロシークエンシングのためのタンパク質およびペプチ ド精製に関する実践ガイド：A Practical Guide to Protein and Peptide Purif ication for Microsequencing、アカデミック出版社、ニューヨーク、1989)を使 用して電気溶出した。同様に調製および泳動した第２ゲルを、酢酸を含有しない 染色法［９部の0.1％クマシーブルーG250(バイオ-ラッド)(50％メタノール中)お よび１部のセルバ ブルー(セルバ:Serva、ウエストベリー、ニューヨーク州)（ 蒸留水中）］で1-2時間染色した。ゲルを簡単に20％メタノール、3％グリセロー ルで0.5-1時間、GST-SSP3-5バンドが辛うじて見えるまで脱色した。このバンド をゲルから切り出し、そしてニュージーランドラビットを免疫するための抗原と して使用するために、電気溶出物とともにハゼルトンラボラトリーズ(Hazelton Laboratories)に送った。全1mgの抗原を使用した(ゲル中に0.8mg、溶液中に0.2m g)。試験ブリーズ(bleeds)は、ハゼルトン研究所から３週間毎に提供された。お よその力価は、T7プロモーターの制御下のSSP3-5遺伝子を含む細胞からの大腸菌 を、様々な濃度のタンパク質および血清希釈物でウエスタンブロットにより試験 した。 IgGをProteinＡセファロースカラムを使用して血清から単離した。このIgGを マイクロタイタープレートにウェルあたり5μgで被覆した。別に IgGの一部をビオチン化した。 トランスジェニック植物からの水性抽出物を希釈し、そして通常は全タンパク 質の1μｇを含む試料から始まるウェルに添加した。試料をさらに数回希釈して 、少なくとも１つの希釈物が同じプレートで作成された標準曲線の範囲内で結果 を得ることを確実にした。標準曲線は化学的に合成したSSP3-5タンパク質を使用 して作成した。試料を37℃で１時間インキューベーションし、そしてプレートを 洗浄した。ビオチン化IgGを次にこのウェルに加えた。プレートを37℃で１時間 インキューベーションし、そして洗浄した。ストレプトアビジンに結合したアル カリホスファターゼをウェルに加え、37℃で１時間インキューベーションし、そ して洗浄した。1mg/ml pニトロフェニルリン酸(1M ジエタノールアミン中）から 成る基質をウェルに加え、そしてプレートを37℃で１時間インキューベーション した。5％ EDTA停止溶液をウェルに加え、そして405nmの読み取りから650nmの読 み取りを引いた。トランスジェニックダイズ種子はSSP3-5として0.5から2.0％の 水抽出性タンパク質を含んだ。 GUSおよびSSP3-5タンパク質に対して陽性の残る半分の種子を植え、そして温 室条件で成熟するまで成長させた。GUS表現型についてホモ接合体であることを 決定するために、これらＲ１植物からの種子を上記のようにGUS活性の分離につ いてスクリーニングした。ファゼオリン／SSP3-5についてホモ接合体植物を、コ リネバクテリウム(Corynebacterium)dapA遺伝子産物を発現するホモ接合体トラ ンスジェニックダイズと交配した。 キメラSSP遺伝子およびキメラcordapA遺伝子Aを一緒に、遺伝的交配を介して 、両遺伝子を持つ１つのダイズ形質転換ベクターに持ち込むた めに、１つの好適な別の選択肢を構築した。上記キメラ遺伝子、ファゼオリンプ ロモーター／SSP3-5／ファゼオリン3'領域を持つプラスミドpML63を、制限酵素B amHＩで開裂し、そしてキメラ遺伝子、ファゼオリンプロモーター／cts／cordap A／ファゼオリン3'領域(実施例５)を持つBamHＩ断片を挿入した。このベクター は実施例６に記載したようにダイズ中で形質転換することができる。 実施例１２ 形質転換したトウモロコシの胚および内胚乳中のコリネバクテリウム (Corynebacterium)DHDPSおよびSSP3-5発現用のキメラ遺伝子の構築 以下のキメラ遺伝子をトウモロコシ中への形質転換のために作成した： グロブリン１プロモーター／mcts／cordapA／NOS 3 領域 グルテリン２プロモーター／mcts／cordapA／NOS 3′領域 グロブリン１プロモーター／SSP3-5／globulin 1 3′領域 グルテリン２プロモーター／SSP3-5／10 kD 3′領域 グルテリン2プロモーターを、トウモロコシゲノムDNAからPCRを使用して、公 開された配列[Reinaら、(1990)Nucleic Acids Res.18:6426-6426]に基づくプラ イマーでクローン化した。このプロモーター断片はATG翻訳開始コドンの上流に1 020ヌクレオチドを含む。NcoI部位をPCRを介してATG開始部位に導入し、直接的 な翻訳融合を可能にした。BamHＩ部位をプロモーターの5'末端に導入した。1.02 kbのBamHＩ−NcoIプロモーター断片を植物発現ベクターpML63(実施例１１を参照 にされたい)のBamHＩ-NcoI部位にクローン化し、35Sプロモーターを置き換えて ベクターpML90を作成した。このベクターは、GUSコーディング領域およびNOS3' に連結したグルテリン２プロモーターを含む。 10kDゼイン3'領域は、公開された配列[キリハラら、(1988)Gene 71:359-370] に基づき、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムDNAからPCRにより 生成した10kDゼイン遺伝子クローンに由来した。この3'領域は停止コドンから94 0ヌクレオチド広がっている。クローニングし易くするために、KpnI、SmaIおよ びXbaI部位用の制限エンドヌクレアーゼ部位を、TAG停止コドンの直後にオリゴ ヌクレオチド挿入により付加した。10kD 3'領域を含むSmaI−HindIIIセグメント を単離し、そしてSmaIおよびHindIII消化pML90に連結してNOS3'配列を10kD3'領 域に置き換え、これによりプラスミドpML103を作成した。pML103はグルテリン2 プロモーター、GUS遺伝子のATG開始コドンにNcoI部位、停止コドンの後にSmaIお よびXbaI部位、そして940ヌクレオチドの10kDゼイン3'配列を含む。 グロブリン１プロモーターおよび３’配列は、グロブリン１遺伝子の公開され た配列[Krizら、（1989）Plant Physiol.91:636]に基づくオリゴヌクレオチドプ ローブを使用して、クローンテックのトウモロコシゲノムDNAライブラリーから 単離した。クローン化セグメントは、ATG翻訳開始コドンから上流1078ヌクレオ チドに広がるプロモーター断片、イントロンを含む全グロブリンコーディング配 列、および翻訳停止から803塩基広がる3'配列を含む。グロブリン１コーディン グ配列を他のコーディング配列に置き換えることができるように、PCRを介してN coI部位をATG開始コドンに導入し、そしてKpnＩおよびXbaＩ部位を翻訳停止コド ンの後に導入してベクターpCC50を作成した。第２のNcoI部位が、グロブリン1プ ロモーター断片内にある。このグロブリン1遺伝子カセットはHindIII部位に挟ま れている。 植物アミノ酸生合成酵素はクロロプラストに位置することが知られており、し たがってこれらはクロロプラスト標的シグナルで合成される。ＤＨＤＰＳのよう な細菌タンパク質はそのようなシグナルを持たない。したがってクロロプラスト のトランジット配列(cts)は、以下に記載するキメラ遺伝子中のcordapAコーディ ング配列に連結されている。トウモロコシ用使用したctsは、トウモロコシ由来 のリブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットのctsに 基づき[Lebrunら、（1987）Nucleic Acids Res.15:4360]、そしてダイズctsと識 別できるようにactsと命名されている。オリゴヌクレオチド配列番号93-98を合 成し、そして本質的に実施例４に記載したように使用した。 オリゴヌクレオチド配列番号93および番号番号94(これらはトウモロコシクロ ロプラスト標的シグナルのカルボキシ末端部分をコードする)をアニールし、Xba ＩおよびNcoI適合部位を生成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、そ してXbaＩおよびNcoI消化pBT492に挿入した(実施例３を参照にされたい)。正し い配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確認し、pBT556を得た。オリゴヌ クレオチド配列番号95および配列番号96(これらはクロロプラスト標的シグナル の中央部分をコードする)をアニールし、BglIIおよびXbaI適合部位を生成し、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、そしてBglIIおよびXbaI消化pBT556に 挿入した。正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確認し、pBT557を 得た。オリゴヌクレオチド配列番号97および配列番号98(これらはクロロプラス ト標的シグナルのアミノ末端部分をコードする)をアニールし、NcoIおよびAflII 適合部位を生成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、そしてNcoIおよ びAflII消化pBT557に挿入した。 正しい配列の挿入をＤＮＡシークエンシングにより確認し、pBT558を得た。この mctsをlysC-M4遺伝子に融合した。 全mctsを含むＤＮＡ断片はPCRを使用して調製した。鋳型ＤＮＡはpBT558であ り、そして使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次のものであった： このmcts断片は、NcoIで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で 処理して5'突出末端を埋めることにより、ecodapA遺伝子にコードされているＤ ＨＤＰＳタンパク質のアミノ末端に連結した。挿入した断片およびベクター／挿 入物連結部は、ＤＮＡシークエンシングにより正しいと決定され、pBT576を生成 した。 キメラ遺伝子：グロブリン１プロモーター／mcts／cordapA／NOS3領域を構築 するために、mcts/ecodapAコーディング配列を含むNcoI−KpnI断片をプラスミド pBT576（実施例６を参照にされたい）から単離し、そしてNcoIおよびKpnI消化pC C50に挿入し、プラスミドpBT662を得た。次にecodapAコーディング配列をcordap A コーディング配列と以下のように置き換えた。cordapAコーディング配列に融合 したmctsの遠位2/3を含むAflII−KpnＩ断片を、AflII−KpnＩ消化pBT662に挿入 し、プラスミドpBT677を作成した。 キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／mcts／cordapA／NOS3'領域を構築 するために、mcts/cordapAコーディング配列を含むNcoI−KpnI 断片をプラスミドpBT677から単離し、そしてNcoI−KpnI消化pML90に挿入し、プ ラスミドpBT679を得た。 キメラ遺伝子：グルテリン２プロモーター／SSP3-5／10kD 3'領域を構築する ために、グルテリン２プロモーターおよび10kD ゼイン3'領域を含むプラスミドp ML103（上記）を、NcoIおよびSmaI部位で開裂した。このSSP3-5コーディング領 域(実施例９)は、XbaＩで開裂し、続いてＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で 粘着末端を埋め、次にNcoIで開裂することによりNcoIから平滑化末端の断片とし て単離された。193塩基対のNcoIから平滑化末端の断片を、NcoIおよびSmaＩ切断 pML103中に連結してpLH104を作成した。 キメラ遺伝子:グロブリン１プロモーター／SSP3-5／グロブリン１ 3'領域を構 築するために、SSP3-5コーディング領域(実施例９)を含む193塩基対のNcoIおよ びXbaI断片を、すでにXbaIで完全に消化し、次にNcoIで部分消化してプラスミド をATG開始コドンで開いたプラスミドpCC50(上記)に挿入し、pLH105を作成した。 実施例１３ 胚および内胚乳中でのコリネバクテリウム(Corynebacterium)DHDPS発現 用のキメラ遺伝子を含有するトウモロコシ植物 トウモロコシを以下のキメラ遺伝子で形質転換した： グロブリン１プロモーター／mcts／cordapA／NOS3領域 または グルテリン２プロモーター／mcts／cordapA／NOS3'領域 選択性マーカーを含む2つのプラスミドベクターのうちのいずれか1つを形質転 換に使用した。１つのプラスミド、pDETRICは除草剤グルホシ ネートに対する耐性を付与するストレプトミセス ヒグロスコピクス(Streptomy ces hygroscopicus)由来のbar遺伝子を含んだ[Thompsonら、(1987)The EMBO Jou rnal 6:2519-2523]。この細菌遺伝子は、植物中での正しい翻訳開始のために、 その翻訳コドンがGTGからATGに変化していた[De Blockら、（1987）The EMBO Jo urnal 6:2513-2518]。このbar遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス由来の35S プロモーターにより駆動され、そしてアグロバクテリウムツメファシエンス(Agr obacterium tumefaciens)のオクトピンシンターゼ遺伝子由来の終止およびポリ アデニレーションシグナルを使用する。あるいは、使用する選択性マーカーは35 S/Ac、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーターおよび3'ターミネ ーター/ポリアデニレーションシグナルの制御下の、合成ホスフィノトリシン-N- アセチルトランスフェラーゼ(pat)遺伝子であった[Eckesら、（1989）J Cell Bi ochem Suppl 13D]。 胚形成カルス培養物は、“II型カルス”組織培養反応を与えるように育種され たトウモロコシ系の仁から切断した未成熟胚から始めた(約1.0から1.5mm)。この 胚を受粉後10から12日に切断し、そして軸-側を下向きにして0.5mg/Lの2,4-D(N6 -0.5を補充したアガロース固体N6培地([Chuら、（1974）Sci Sin 18:659-688]に 接触させた。胚を暗室で27℃に維持した。胚柄構造上に維持された体細胞性の前 胚および体細胞性胚を持つ未分化の細胞塊から成る、もろい胚形成カルスが、未 成熟胚の胚盤から増殖した。個々の胚から単離されたクローン性の胚形成カルス を同定し、そしてN6-0.5培地で2-3週間毎に継代培養した。 粒子弾道衝撃法は、遺伝子をカルス培養細胞中に転移させるために使用した。 これらの実験にはBiolistic PDS-1000/He（バイオラッド ラボ ラトリーズ:BioRAD Laboratories、ヘルキュルス、カリフォルニア州)を使用し た。 環状プラスミドＤＮＡまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により直線化したＤ ＮＡを、金粒子上に沈殿させた。２または３つの異なるプラスミドからのＤＮＡ （１つはトウモロコシ形質転換のための選択性マーカーを含み、そしてもう１つ 、または２つは種子中にリシンの蓄積を増大させるためのキメラ遺伝子を含む） を、共沈殿させた。このために、1.5μgの各ＤＮＡ(水中で約1mg/mL濃度)を、水 に懸濁した(mLあたり60mgの金)25mLの金粒子（平均1.5μm）に加えた。塩化カル シウム(2.5M溶液を25mL)およびスペルミジン(1.0M溶液を10mL)を、金−ＤＮＡ懸 濁液に試験管をボルテックス混合しながら加えた。金粒子をマイクロ遠心で10秒 間遠心し、そして上清を除いた。次に金粒子を200mLの無水エタノールに再懸濁 し、再度遠心し、そして上清を除いた。最後に金粒子を25mLの無水エタノールに 再懸濁し、そして１秒間で２回超音波処理した。5μlのDNA-被覆金粒子を、次に 各マクロキャリアーディスクにのせ、エタノールを蒸発させ、ディスク上に乾燥 したDNA−被覆金粒子を残した。 胚形成カルス(＃LH132.5.xと命名されたカルス系から)は、0.25Mのソルビトー ルおよび0.25Mのマンニトールを補充したN6-0.5培地を含む、100×20mm ペトリ 皿の中心の約6cm直径の円状領域に配列した。前処理として組織をこの培地上に 衝撃の２時間前に置き、そして衝撃中にこの培地上に維持した。２時間の前処理 の終わりに、組織を含むペトリ皿をPDS-1000/Heのチャンバー中に置いた。チャ ンバー中の空気を28インチHgの真空状態に吸引した。マクロキャリアーは、ショ ック管中のHe圧が1100psiに達したとき破裂する破裂膜を使用して、ヘリウムシ ョック波で 加速した。組織をストップスクリーンから約8cmのところに置いた。組織の4つの プレートをDNA−被覆金粒子で衝撃した。衝撃の直後、カルス組織をN6-0.5培地( 補充ソルビトールおよびマンニトール無し)に移した。 衝撃の24時間以内に、組織を選択培地(2mg/Lのグルホシネートを含み、そして カゼインまたはプロリンを欠くN6-0.5培地)に移した。この培地でゆっくり成長 し続けた組織を、グルホシネートを補充した新たなN6-0.5培地に２週間毎に移し た。6-12週間後、活発に成長しているカルスのクローンを同定した。次にカルス を植物再生を促進する培地に移した。 形質転換したカルスから再生した植物を、インタクトなトランス遺伝子の存在 について、サザンブロットまたはPCRを介して分析した。植物は自家受粉または 外部交配してエリート系になり、それぞれＲ１またはＦ１種子を生成した。単一 のＲ１種子または６から８つのＦ１種子をプールし、そしてコリネバクテリウム (Corynebacterium)DHDPSタンパク質の発現についてウエスタンブロット分析によ りアッセイした。種子の遊離アミノ酸組成および全アミノ酸組成を、前記実施例 に記載したように測定した。 グロブリンまたはグルテリンプロモーターにより駆動されるコリネバクテリウ ム(Corynebacterium)DHDPSタンパク質の発現が、トウモロコシ種子中で観察され た（表８）。種子中の遊離リシンレベルは、対照種子の遊離アミノ酸の約1.4％ から、グロブリン１プロモーターからコリネバクテリウム(Corynebacterium)DHD PSを発現する種子中の15-27％に増加した。自家受粉種子中のより高いDHDPS発現 およびより高いリシンレベルは、おそらく外部交配系のプールした種子の半分が 分離のためにトランス遺伝子を失ったと予想される事実から生じるのだろう。グ ルテ リン２プロモーターからコリネバクテリウム(Corynebacterium)DHDPSを発現して いる種子中に観察された遊離リシンの増加は少なかった。したがってリシンを増 加させるために、この酵素を内胚乳よりも胚で発現させることがより良いであろ う。高レベルのサッカロピン（リシン異化作用を示す）が高レベルのリシンを含 む種子中で観察された。 リシンは通常、約2.3％の種子アミノ酸含量を表す。したがって表８から、全 種子アミノ酸の割合としてのリシンの実質的な増加（35％−130％）が、グロブ リン１プロモーターからコリネバクテリウム(Corynebacterium)DHDPSを発現する 種子に見い出されることは明らかである。 実施例１４ クニッツトリプシンインヒビター３プロモーター／cts／cordapA キメラ遺伝子でのダイズの形質転換 ダイズクニッツトリプシンインヒビター3(KTI3)遺伝子由来の、プロ モーターおよび転写ターミネーターから成る種子−特異的発現カセット[Jofuku ら、（1989）Plant Cell 1:427-435]を作成した。このKTI3カセットは、クニッ ツトリプシンインヒビター３の翻訳開始コドンから(5')上流に約2000ヌクレオチ ド、および翻訳終止コドンから（3'）下流に約200ヌクレオチドを有する。5'お よび3'領域の間に、制限エンドヌクレアーゼ部位NcoI（これはＡＴＧ翻訳開始コ ドンを含む）およびKpnＩを作成してコリネバクテリウム(Corynebacterium)dapA 遺伝子の挿入を可能にした。全カセットをBamHＩおよびSalＩ部位により平滑化 した。 実施例４に記載したように、クロロプラストのトランジット配列(cts)をキメ ラ遺伝子のdapAコーディング配列に融合した。使用したctsは、ダイズ由来のリ ブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットのctsに基づ いた[Berry-Loweら、（1982）J.Mol．Appl.Genet.1:483-498]。cordapAコーディ ング領域に結合したctsを含む1030bpのNcoI−KpnＩ断片を、電気泳動後のアガロ ースゲルから単離し、そしてKTI3発現カセットに挿入し、プラスミドpML102を生 成した(図１５)。 プラスミドpML102をダイズに、米国特許第5,015,580号明細書に記載された方 法に従い、アグラシータス カンパニー（Agracetus Company）(ミドレトン、ウ ィスコンシン州)による粒子−媒介衝撃により導入した。形質転換した細胞をス クリーニングするために、プラスミドpML102は、大腸菌β-グルクロニダーゼ(GU S)遺伝子の発現を駆動するカリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモータ ーから成るダイズ形質転換マーカー遺伝子を持つ別のプラスミド(Nos3'領域を持 つ)とともに同時-衝撃(co-bombarded)された[Jeffersonら、（1986）Proc.Natl. Acad.Sci.USA 83:8447-8451]。 トランス遺伝子は形質転換した植物のR1種子中で分離していることが予想され た。形質転換マーカー遺伝子を持つ種子を同定するために、種子の小片をカミソ リで切り取り、そして使い捨てのマイクロタイタープレートのウェル中に入れた 。100mM NaH2PO4、10mM EDTA、0.5mM K4Fe(CN)6、0.1％ Triton X-100、0.5mg/m L 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-グルクロン酸から成るGUSアッセイ混 合物を調製し、そして0.15mLを各マイクロタイターウェルに入れた。このマイク ロタイタープレートを37℃で45分間インキューベーションした。青色の発色は種 子中のGUSの発現を示していた。 成熟種子中の全アミノ酸組成を測定するために、1-1.4ミリグラムの種子ミー ルを6N 塩酸、0.4％β-メルカプトエタノール中で窒素下、110-120℃で24時間加 水分解し；1/50の試料をベックマンモデル6300アミノ酸分析機で、ポスト-カラ ムニンヒドリン検出を使用して分析した。これらの種子中のリシン（および他の アミノ酸）レベルは、全アミノ酸の割合として比較した。野生型ダイズ種子は5. 7-6.0％リシンを含有する。 16の独立した形質転換系から、個々の150個の種子を分析した(表９)。16の系 のうちの10が全種子アミノ酸の7％以上のリシン含量を有し、野生型種子よりも1 6-22％増加した。したがって形質転換したうちの62％より多くが、マーカーGUS 遺伝子を持つプラスミドと一緒にcordapAを持つプラスミドを同時に組み込んだ 。高リシン種子の約80％がGUS陽性であり、これはcordapA遺伝子を持つプラスミ ドが、通常はGUS遺伝子を持つプラスミドと同じ染色体部位に組み込まれること を示唆していた。しかし幾つかの形質転換系、例えば260-05では、GUS陽性と高 リシン表現型との間に相関はなく、２つのプラスミドが異なる部位に組み込まれ た ことを示していた。これらの種類の形質転換の結果は、この形質転換のために使 用された手順に基づいて予想されたことだった。 全種子アミノ酸の20％よりも高いリシン含量の種子を得た。これは種子中のリ シン含量がほぼ300パーセント増加したことを示している。
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年１月２９日 【補正内容】 請求の範囲 １．リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジピコリン酸シンターゼ をコードする断片が、単子葉クロロプラストのトランジット配列および単子葉種 子−特異的調節配列に操作可能に連結されているキメラ遺伝子。２．単子葉種子 −特異的調節配列が単子葉胚−特異的プロモーターである、請求の範囲第１項に 記載のキメラ遺伝子。 ３．ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片が、コリネバクテリ ウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来のジヒドロジピコリン酸 シンターゼをコードする配列番号３に示すヌクレオチド配列を含んで成り、なら びに植物クロロプラストのトランジット配列がゼア メイズ(Zea maize)由来のリ ブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットをコードする 遺伝子に由来し、そして種子−特異的調節配列がゼア メイズ(Zea maize)由来の グロブリン１遺伝子に由来する、請求の範囲第２項に記載のキメラ遺伝子。 ４．（ａ）リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジピコリン酸シン ターゼをコードする核酸断片が、植物クロロプラストのトランジット配列および 植物種子−特異的調節配列に操作可能に連結されている第一キメラ遺伝子、およ び （ｂ）リシンの重量パーセントが少なくとも15％であるリシンに富むタンパク質 をコードする核酸断片が、種子−特異的調節配列に操作可能に連結されている第 ２キメラ遺伝子、 を含んで成る核酸断片。 ５．第２キメラ遺伝子が、 それぞれの７つ揃が同じ、または異なるｎ個の７つ揃の単位（ｄ ｅ ｆ ｇ ａ ｂ ｃ）、ここで ｎは少なくとも４であり、 ａおよびｄは独立してMet、Leu、Val、IleおよびThrから成る群から選択さ れ、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対 Glu/Lys、Lys/Glu、Arg/Glu、Arg/Asp、 Lys/Asp、Glu/Arg、Asp/Arg、およびAsp/Lysから成る群から選択され；そして ｂ、ｃおよびｆは独立してGlyまたはProを除く任意のアミノ酸であり、そし て各７つ揃のうちの少なくとも２つのアミノ酸ｂ、ｃおよびｆがGlu、Lys、Asp 、Arg、His、Thr、Ser、ASn、Ala、GlnおよびCysから成る群から選択される、 を含んで成るタンパク質をコードする核酸配列を含んで成る、リシン−リッチ タンパク質をコードする核酸断片、 を含んで成る核酸断片であって、該核酸断片が植物−種子特異的調節配列に操作 可能に連結されている、請求の範囲第４項に記載の核酸断片。 ６．第２キメラ遺伝子が、アミノ酸配列（ＭＥＥＫＬＫＡ）6（ＭＥＥＫＭＫＡ ）2を有するタンパク質をコードする核酸配列を含んで成るリシンに富むタンパ ク質をコードする、種子−特異的調節配列に操作可能に連結されている核酸断片 を含んで成る、請求の範囲第４項に記載の核酸断片。 ７．第２キメラ遺伝子が、植物種子−特異的調節配列にセンスまたはアンチセン ス方向で操作可能に連結されている、リシンケトグルタル酸レダクターゼをコー ドする核酸断片を含んで成る、請求の範囲第４項に記載の核酸断片。 ８．ゲノム中に請求の範囲第１に記載のキメラ遺伝子を含んで成る植物。 ９．請求の範囲第１項に記載のキメラ遺伝子を含んで成る、請求の範囲第８項に 記載の植物から得た種子。 １０．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセ ント高いレベルでリシンを蓄積する植物を得る方法であって、 （ａ）植物クロロプラストのトランジット配列および植物種子−特異的調節配列 に操作可能に連結されている、リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒド ロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で植 物細胞を形質転換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換植物細胞 に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセントの 範囲で高く増加したリシンレベルを含む植物を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 １１．植物細胞が双子葉細胞であり、そして種子が増加したリシンレベルを含む 選択された植物が双子葉系である、請求の範囲第１０項に記載の植物を得る方法 。 １２．植物細胞がナタネ細胞であり、そして種子が増加したリシンレベルを含む 選択された植物がナタネ系である、請求の範囲第１０項に記載の植物を得る方法 。 １３．植物細胞がダイズ細胞であり、そして種子が増加したリシンレベルを含む 選択された植物がダイズ系である、請求の範囲第１０項に記載の植物を得る方法 。 １４．植物細胞が単子葉細胞であり、種子が増加したリシンレベルを含む選択さ れた植物が単子葉系であり、そして種子中のリシンの増加が非形質転換植物の種 子よりも10パーセントから130パーセント高い、請求の範囲第１０項に記載の植 物を得る方法。 １５．単子葉植物細胞がトウモロコシ植物細胞である、請求の範囲第１４項に記 載の方法。 １６．工程（ａ）キメラ遺伝子が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebac terium glutamicum)由来のジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする配列番 号３に示すヌクレオチド配列を含んで成り、ならびに植物クロロプラストのトラ ンジット配列がグリシンマックス(Glycine max)由来のリブロース1,5-ビスホス フェートカルボキシラーゼの小サブユニットをコードする遺伝子に由来し、そし て種子−特異的調節配列がインゲンのファセオラス ブルガリス(Phaseolus vulg aris )由来の種子貯蔵タンパク質ファゼオリンのβ-サブユニットをコードする遺 伝子に由来するか、または種子-特異的調節配列がグリシンマックス(Glycine ma x )由来のクニッツ トリプシンインヒビター３遺伝子に由来する、請求の範囲第 １０、１１、１２または１３項のいずれか１項に記載の方法。 １７．種子−特異的調節配列が単子葉胚−特異的プロモーターである、請求の範 囲第１０、１４または１５項のいずれか１項に記載の方法。 １８．工程（ａ）のキメラ遺伝子が、コリネバクテリウムグルタミカム(Coryneb acterium glutamicum)由来のジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする配列 番号３に示すヌクレオチド配列を含んで成り、ならびに植物クロロプラストのト ランジット配列がゼアメイズ(Zea maiz e )由来のリブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットを コードする遺伝子に由来し、そして種子−特異的調節配列がゼア メイズ(Zea ma ize )由来のグロブリン１遺伝子に由来する、請求の範囲第１０、１４または１５ 項のいずれか１項に記載の方法。 １９．ゲノム中に請求の範囲第４、５、６または７項のいずれか１項に記載の核 酸断片を有する植物。 ２０．請求の範囲第４、５、６または７項のいずれか１項に記載の核酸断片を含 む種子。 ２１．植物から得た種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400 パーセント高いレベルでリシンを蓄積する、形質転換した植物。 ２２．植物クロロプラストのトランジット配列および植物種子−特異的調節配列 に操作可能に連結された、リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジ ピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片をゲノム中に有する、請求の範囲第 ２１項に記載の植物。 ２３．単子葉類である、請求の範囲第２１または第２２項に記載の植物。 ２４．トウモロコシである、請求の範囲第２３項に記載の植物。 ２５．双子葉類である、請求の範囲第２１または第２２項に記載の植物。 ２６．ダイズおよびナタネ群から選択される、請求の範囲第２５項に記載の植物 。 ２７．非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセント高いレベル でリシンを含有する、形質転換した植物から得た種子。 ２８．植物クロロプラストのトランジット配列および植物種子−特異的調節配列 に操作可能に連結された、リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジ ピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片を含有す る、請求の範囲第２７項に記載の種子。 ２９．トウモロコシ、ダイズおよびナタネ群から選択される植物から得た、選択 の範囲第２７または第２８項に記載の種子。 ３０．形質転換した植物細胞から再生した植物から得た種子が、非形質転換植物 細胞から再生した植物から得た種子よりも、10パーセントから400パーセント高 いレベルでリシンを蓄積する、形質転換植物細胞。 ３１．植物クロロプラストのトランジット配列および植物種子−特異的調節配列 に操作可能に連結された、リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジ ピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片をゲノム中に有する、請求の範囲第 ３０項に記載の植物細胞。 ３２．単子葉植物細胞である、請求の範囲第３０または第３１項に記載の植物細 胞。 ３３．トウモロコシ細胞である、請求の範囲第３２項に記載の植物細胞。 ３４．双子葉細胞である、請求の範囲第３０または第３１項に記載の植物細胞。 ３５．ダイズおよびナタネ植物細胞群から選択された、請求の範囲第３４項に記 載の植物細胞。 ３６．請求の範囲第２７、２８および２９のいずれか１項に記載の種子に由来す る種子ミール。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＰＬ，ＵＳ (72)発明者 ライス，ジヤネツト・アン アメリカ合衆国デラウエア州19803ウイル ミントン・メデイアンドライブ126

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．リシンによる阻害に対して非感受性であるジヒドロジピコリン酸シンターゼ をコードする断片が、植物クロロプラストのトランジット配列および種子−特異 的調節配列に操作可能に連結されているキメラ遺伝子。 ２．ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片が、コリネバクテリ ウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来のジヒドロジピコリン酸 シンターゼをコードする配列番号３に示すヌクレオチド配列を含んで成り、なら びに植物クロロプラストのトランジット配列がグリシン マックス(Glycine max) 由来のリブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットをコ ードする遺伝子に由来し、そして種子−特異的調節配列がインゲンのファセオラ ス ブルガリス(Phaseolus vulgaris)に由来する種子貯蔵タンパク質ファゼオリ ンのβ-サブユニットをコードする遺伝子に由来するか、または種子−特異的調 節配列がグリシン マックス(Glycine max)に由来するクニッツトリプシンインヒ ビター３遺伝子に由来する、請求の範囲第１項に記載のキメラ遺伝子。 ３．ゲノムに、請求の範囲第１または第２項に記載のキメラ遺伝子を含んで成る 植物。 ４．請求の範囲第３項に記載の植物から得られた種子。 ５．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセン ト高いレベルでリシンを蓄積する植物を得る方法であって、 （ａ）植物細胞を請求の範囲第１項に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換した植物 細胞に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が増加したリシンレベルを含む系を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 ６．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから100パーセン ト高いレベルでリシンを蓄積する双子葉植物を得る方法であって、 （ａ）双子葉細胞を請求の範囲第１または第２項に記載のキメラ遺伝子で形質転 換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換した植物 細胞に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が増加したリシンレベルを含む系を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 ７．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから100パーセン ト高いレベルでリシンを蓄積するナタネ植物を得る方法であって、 （ａ）ナタネ細胞を請求の範囲第１または第２項に記載のキメラ遺伝子で形質転 換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換した植物 細胞に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が増加したリシンレベルを含む系を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 ８．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセン ト高いレベルでリシンを蓄積するダイズ植物を得る方法であって、 （ａ）ダイズ細胞を請求の範囲第１または第２項に記載のキメラ遺伝子で形質転 換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換した植物 細胞に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が増加したリシンレベルを含む系を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 ９．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも少なくとも10パーセント高いレ ベルでリシンを蓄積する形質転換植物。 １０．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセ ント高いレベルでリシンを蓄積する、請求の範囲第９項に記載の形質転換植物。 １１．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから100パーセ ントの間で、より高いレベルでリシンを蓄積する形質転換ナタネ植物。 １２．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから400パーセ ントの間で、より高いレベルでリシンを蓄積する形質転換ダイズ植物。 １３．種子−特異的調節配列が単子葉胚−特異的プロモーターである、請求の範 囲第１項に記載のキメラ遺伝子。 １４．ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする核酸断片が、コリネバクテ リウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来のジヒド ロジピコリン 酸シンターゼをコードする配列番号３に示すヌクレオチド配列を含んで成り、な らびに植物クロロプラストのトランジット配列がゼア メイズ(Zea maize)由来の リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットをコードす る遺伝子に由来し、そして種子−特異的調節配列がゼア メイズ(Zea maize)由来 のグロブリン１遺伝子に由来する、請求の範囲第１項に記載のキメラ遺伝子。 １５．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから130パーセ ント高いレベルでリシンを蓄積する単子葉植物を得る方法であって、 （ａ）単子葉細胞を請求の範囲第１３または第１４項に記載のキメラ遺伝子で形 質転換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換植物細胞 に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が増加したリシンレベルを含む系を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 １６．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも10パーセントから130パーセ ント高いレベルでリシンを蓄積するトウモロコシ植物を得る方法であって、 （ａ）トウモロコシ細胞を請求の範囲第１３または第１４項に記載のキメラ遺伝 子で形質転換し、 （ｂ）種子を得るために適する条件下で、工程（ａ）から得た形質転換植物細胞 に由来する受精した成熟植物を再生し、 （ｃ）工程（ｂ）の子孫種子をリシン含量に関してスクリーニングし、そして （ｄ）種子が増加したリシンレベルを含む系を選択する、 工程を含んで成る上記方法。 １７．ゲノムに請求の範囲第１３または１４項に記載のキメラ遺伝子を含んで成 る、単子葉植物。 １８．請求の範囲第１７項に記載の植物から得た種子。 １９．植物の種子が、非形質転換植物の種子よりも35パーセントから130パーセ ントの間で、より高いレベルでリシンを蓄積する、形質転換単子葉植物。 ２０．植物がトウモロコシである、請求の範囲第１９項に記載の形質転換した単 子葉植物。 ２１．（ａ）請求の範囲第１、２、１３または１４項に記載の第１キメラ遺伝子 、および （ｂ）リシンの重量パーセントが少なくとも15％であるリシンに富むタンパク質 をコードする核酸断片が、種子−特異的調節配列に操作可能に連結されている第 ２キメラ遺伝子、 を含んで成る核酸断片。 ２２．（ａ）請求の範囲第１、２、１３または１４項に記載の第１キメラ遺伝子 、および （ｂ）リシンに富むタンパク質をコードする核酸断片が、それぞれの７つ揃が同 じ、または異なるｎ個の７つ揃の単位（ｄ ｅ ｆ ｇ ａ ｂ ｃ）、ここで ｎは少なくとも４であり、 ａおよびｄは独立してMet、Leu、Val、IleおよびThrから成る群から選択さ れ、 ｅおよびｇは独立して酸／塩基対 Glu/Lys、Lys/Glu、Arg/Glu、Arg/Asp、 Lys/Asp、Glu/Arg、Asp/Arg、およびAsp/Lysから成る群から選択され；そして ｂ、ｃおよびｆは独立してGlyまたはProを除く任意のアミノ酸であり、そし て各７つ揃のうちの少なくとも２つのアミノ酸ｂ、ｃおよびｆがGlu、Lys、Asp 、Arg、His、Thr、Ser、Asn、Ala、GlnおよびCysから成る群から選択される、 を含んで成るタンパク質をコードする核酸配列を含んで成り、該核酸断片が植 物−種子 特異的調節配列に操作可能に連結されている、第２キメラ遺伝子 を含んで成る、核酸断片。 ２３．（ａ）請求の範囲第１、２、１３または１４項に記載の第１キメラ遺伝子 、および （ｂ）リシンに富むタンパク質をコードする核酸断片が、アミノ酸配列（ＭＥＥ ＫＬＫＡ）6（ＭＥＥＫＭＫＡ）2を有するタンパク質をコードする、種子−特異 的調節配列に操作可能に連結されている核酸配列を含んで成る第２キメラ遺伝子 、 を含んで成る核酸断片。 ２４．ゲノム中に請求の範囲第１、２、１３または１４項に記載のキメラ遺伝子 、および請求の範囲第２１、２２または２３項に記載の第２キメラ遺伝子を含ん で成る植物。 ２５．ゲノム中に請求の範囲第２１、２２または２３項に記載の核酸断片を含ん で成る植物。 ２６．請求の範囲第２４項に記載の植物から得た種子。 ２７．請求の範囲第２５項に記載の植物から得た種子。 ２８．（ａ）請求の範囲第１、２、１３または１４項に記載の第１キメラ遺伝子 、および （ｂ）リシンケトグルタル酸レダクターゼをコードする核酸断片が、植物種子− 特異的調節配列にセンスまたはアンチセンス方向で操作可能に連結されている第 ２キメラ遺伝子、 を含んで成る核酸断片。 ２９．ゲノム中に、請求の範囲第１、２、１３または１４項に記載の第１キメラ 遺伝子、およびリシンケトグルタル酸レダクターゼをコードする核酸断片が、植 物種子−特異的調節配列にセンスまたはアンチセンス方向で操作可能に連結され ている第２キメラ遺伝子を含んで成る植物。 ３０．ゲノム中に請求の範囲第２８項に記載の核酸断片を含んで成る植物。 ３１．請求の範囲第３０項に記載の植物から得た種子。
JP7515636A 1993-11-30 1994-11-21 キメラ遺伝子ならびにトウモロコシ、ダイズおよびナタネ植物 Pending JPH09511124A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16011793A 1993-11-30 1993-11-30
US08/160,117 1993-11-30
US26166194A 1994-06-17 1994-06-17
US08/261,661 1994-06-17
PCT/US1994/013190 WO1995015392A1 (en) 1993-11-30 1994-11-21 Chimeric geens and methods for increasing the lysine content of the seeds of corn, soybean and rapeseed plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH09511124A true JPH09511124A (ja) 1997-11-11

Family

ID=26856615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7515636A Pending JPH09511124A (ja) 1993-11-30 1994-11-21 キメラ遺伝子ならびにトウモロコシ、ダイズおよびナタネ植物

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0734445B1 (ja)
JP (1) JPH09511124A (ja)
KR (1) KR960706564A (ja)
AU (1) AU704510B2 (ja)
BR (1) BR9408228A (ja)
CA (1) CA2177351C (ja)
DE (1) DE69434786T2 (ja)
ES (1) ES2268688T3 (ja)
HU (1) HU222085B1 (ja)
IL (1) IL111717A0 (ja)
PL (1) PL314696A1 (ja)
WO (1) WO1995015392A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007513629A (ja) * 2003-12-11 2007-05-31 モンサント テクノロジー エルエルシー 高リジントウモロコシ（ｍａｉｚｅ）組成物およびその検出のための方法

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773691A (en) 1992-03-19 1998-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
CN1195377A (zh) * 1995-05-31 1998-10-07 先锋高级育种国际公司 在种子中增加必需氨基酸积累的方法
AU6899796A (en) 1995-08-29 1997-03-19 University Of Hawaii Production of transgenic plants comprising the winged bean lysine- rich protein
US5850016A (en) * 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
JP4088982B2 (ja) * 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
CA2272564A1 (en) * 1996-11-18 1998-05-28 Avebe Transgenic plant or plants with a naturally high water content overproducing at least two amino acids of the aspartate family
AU747997B2 (en) * 1997-03-27 2002-05-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Chimeric genes and methods for increasing the lysine content of the seeds of plants
ZA981569B (en) * 1997-04-08 1999-08-25 Du Pont An engineered seed protein having a higher percentage of essential amino acids.
US6169232B1 (en) 1997-07-15 2001-01-02 Dow Agrosciences Llc Nucleotide sequences of genes encoding sink protein and uses thereof for improving the nutritional quality of feeds
ATE346944T1 (de) 1997-09-30 2006-12-15 Univ California Herstellung von proteinen in pflanzensamen
US7053282B1 (en) * 1998-02-09 2006-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
AU3171700A (en) * 1999-03-05 2000-09-28 Transgene Nucleotide fragment, probe, primer, reagent and method for detecting a nucleotide sequence derived from pbr322 replication origin
WO2005014828A2 (en) 2003-08-01 2005-02-17 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals in plants
US8008545B2 (en) 2003-04-15 2011-08-30 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
US7951565B2 (en) 2004-04-06 2011-05-31 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
CA2559760A1 (en) 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
US7622142B2 (en) 2004-09-14 2009-11-24 New Chapter Inc. Methods for treating glioblastoma with herbal compositions
CA2585798A1 (en) 2004-12-17 2006-06-17 Metanomics Gmbh Process for the control of production of fine chemicals
WO2006092449A2 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
EP2573188A2 (en) 2005-03-02 2013-03-27 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
RU2460281C2 (ru) * 2005-10-03 2012-09-10 Монсанто Текнолоджи Ллс Семена трансгенных растений с повышенным содержанием лизина
WO2008034648A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
US7947877B2 (en) 2008-05-14 2011-05-24 Monosanto Technology LLC Plants and seeds of spring canola variety SCV328921
US8829282B2 (en) 2008-05-14 2014-09-09 Monsanto Technology, Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV425044
US7964774B2 (en) 2008-05-14 2011-06-21 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV384196
US7935870B2 (en) 2008-05-14 2011-05-03 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV354718
BRPI0914933B1 (pt) * 2008-06-30 2018-09-25 Monsanto Technology Llc Polipeptídeo exibindo atividade de aspartato quinase (ak) que não é sujeito a inibição por produto final, polinucleotídeo codificando o mesmo, construto de dna recombinante,microrganismo transformado, produto alimentício, farelo ou farinha, bem como métodos de transformação de uma célula de planta, de produção de uma planta transformada e de aumento do teor de aminoácido livre total de uma planta.
MX2011013224A (es) 2009-06-09 2012-06-01 Pioneer Hi Bred Int Promotor de endospermo temprano y metodos de uso.
US8071848B2 (en) 2009-06-17 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV218328
MX2012004819A (es) 2009-10-26 2012-06-25 Pioneer Hi Bred Int Promotor especifico de ovulo somatico y metodos de uso.
US8143488B2 (en) 2010-02-26 2012-03-27 Monsanto Technoloy LLC Plants and seeds of spring canola variety SCV470336
US8148611B2 (en) 2010-02-26 2012-04-03 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV453784
US8138394B2 (en) 2010-02-26 2012-03-20 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV431158
US8581048B2 (en) 2010-03-09 2013-11-12 Monsanto Technology, Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV119103
US8153865B2 (en) 2010-03-11 2012-04-10 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV152154
US8513487B2 (en) 2011-04-07 2013-08-20 Zenon LISIECZKO Plants and seeds of spring canola variety ND-662c
US8513494B2 (en) 2011-04-08 2013-08-20 Chunren Wu Plants and seeds of spring canola variety SCV695971
US8507761B2 (en) 2011-05-05 2013-08-13 Teresa Huskowska Plants and seeds of spring canola variety SCV372145
US8513495B2 (en) 2011-05-10 2013-08-20 Dale Burns Plants and seeds of spring canola variety SCV291489
WO2013096810A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11482
US20130167262A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11268
US9006515B2 (en) 2012-01-06 2015-04-14 Pioneer Hi Bred International Inc Pollen preferred promoters and methods of use
BR112014016791A2 (pt) 2012-01-06 2019-09-24 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucléico isolada, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente transgénica, método para expressão de um polinucleotídeo em uma planta ou célula vegetal, método para expressão de um polinucleotídeo, preferencialmente em tecidos de óvulo de uma planta
US8802935B2 (en) 2012-04-26 2014-08-12 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV942568
US8859857B2 (en) 2012-04-26 2014-10-14 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV259778
US8878009B2 (en) 2012-04-26 2014-11-04 Monsanto Technology, LLP Plants and seeds of spring canola variety SCV318181
US8835720B2 (en) 2012-04-26 2014-09-16 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of spring canola variety SCV967592
US20150259696A1 (en) 2012-10-11 2015-09-17 Shane E. Abbitt Guard cell promoters and uses thereof
WO2014159306A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
MX369750B (es) 2013-03-14 2019-11-20 Pioneer Hi Bred Int Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos.
CA2901316A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Phi-4 polypeptides and methods for their use
CA2920339C (en) 2013-08-16 2023-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3223359A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
MX2016010187A (es) 2014-02-07 2017-07-11 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
WO2016022516A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ubiquitin promoters and introns and methods of use
WO2016044092A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods to control insect pests
CN113372421B (zh) 2014-10-16 2024-08-06 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
WO2016099916A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
UA126544C2 (uk) 2015-01-15 2022-11-02 Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. Рекомбінантний полінуклеотид, що кодує інсектицидний поліпептид, та спосіб його застосування
BR112017024948A2 (pt) 2015-05-19 2018-07-31 Pioneer Hi Bred Int proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
CN107771181A (zh) 2015-06-16 2018-03-06 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
RU2762832C2 (ru) 2015-08-06 2021-12-23 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки растительного происхождения и способы их применения
ES2773072T3 (es) 2015-08-28 2020-07-09 Pioneer Hi Bred Int Transformación de plantas mediada por Ochrobactrum
WO2017105987A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3004056C (en) 2015-12-22 2024-01-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Tissue-preferred promoters and methods of use
EP3960863B1 (en) 2016-05-04 2024-11-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3472323A1 (en) 2016-06-16 2019-04-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CA3026653A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
WO2018005411A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
WO2018013333A1 (en) 2016-07-12 2018-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
MX387927B (es) 2016-11-01 2025-03-19 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
CA3076831A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Tissue-preferred promoters and methods of use
CN111868247B (zh) 2018-03-12 2025-01-10 先锋国际良种公司 用于植物转化的方法
WO2019178038A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US11525144B2 (en) 2018-03-14 2022-12-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
BR112020023800A2 (pt) 2018-05-22 2021-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos
EP3833747A1 (en) 2018-06-28 2021-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for selecting transformed plants
BR112021008329A2 (pt) 2018-10-31 2021-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. composições e métodos para transformação de plantas mediada por ochrobactrum
CN115867564A (zh) 2020-07-14 2023-03-28 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5258300A (en) * 1988-06-09 1993-11-02 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Method of inducing lysine overproduction in plants
JPH07502163A (ja) * 1991-08-09 1995-03-09 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物の栄養価改良用のプログラム可能水準の必須アミノ酸類を含有する規定された構造を有する合成貯蔵蛋白質
WO1993019190A1 (en) * 1992-03-19 1993-09-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
US5545545A (en) * 1993-04-27 1996-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007513629A (ja) * 2003-12-11 2007-05-31 モンサント テクノロジー エルエルシー 高リジントウモロコシ（ｍａｉｚｅ）組成物およびその検出のための方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL314696A1 (en) 1996-09-16
AU704510B2 (en) 1999-04-22
WO1995015392A1 (en) 1995-06-08
ES2268688T3 (es) 2007-03-16
IL111717A0 (en) 1995-01-24
HU9601400D0 (en) 1996-07-29
CA2177351C (en) 2007-04-24
AU1255995A (en) 1995-06-19
CA2177351A1 (en) 1995-06-08
BR9408228A (pt) 1997-08-26
EP0734445A1 (en) 1996-10-02
DE69434786D1 (de) 2006-08-17
EP0734445B1 (en) 2006-07-05
HU222085B1 (hu) 2003-04-28
KR960706564A (ko) 1996-12-09
HUT75078A (en) 1997-04-28
DE69434786T2 (de) 2007-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH09511124A (ja) キメラ遺伝子ならびにトウモロコシ、ダイズおよびナタネ植物
US7071383B2 (en) Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
AU747997B2 (en) Chimeric genes and methods for increasing the lysine content of the seeds of plants
CA2104022C (en) High sulfur seed protein gene and method for increasing the sulfur amino acid content of plants
US5633436A (en) Feedcrops enriched in sulfur amino acids and methods for improvements
CA2132414C (en) Nucleic acid fragments and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
CA2114788C (en) Synthetic storage proteins with defined structure containing programmable levels of essential amino acids for improvement of the nutritional value of plants
US5545545A (en) Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase
US6617493B1 (en) Nucleotide sequence encoding soybean vestitone reductase
EP0687303B1 (en) Increase of the level of methionin in plant seeds by expression of 10kd zein from corn
WO1999055887A2 (en) Carotenoid biosynthesis enzymes
US20050005330A1 (en) Chimeric genes and methods for increasing the lysine content of the seeds of plants

Legal Events

Date Code Title Description
A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20040518