HU222085B1 - Kiméragének és eljárások kukorica-, szójabab- és repcemagvak lizintartalmának növelésére - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát kiméragének, kiméragéneket tartalmazónukleinsavfragmensek, genomjukban ilyen kiméragéne- ket vagynukleinsavfragmenseket tartalmazó növények és azok magjai, valamint azilyen növények előállítási eljárásai képezik. A találmány tárgyátközelebbről egy olyan kiméragén képezi, amelyben egy – a lizin általkiváltott gátlásra nem érzékeny – dihidrodipikolinsav-szintetáztkódoló nukleinsavfragmens egy növényi kloroplasztisz-tran-zitszekvenciához és egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciáhozműködőképesen kapcsolódik. A találmány szerinti megoldás alkalmasolyan transzgenikus növények előállítására, melyek magvaikban a nemtranszformált növényeknél lényegesen nagyobb mennyiségben halmoznakfel lizint. ŕ

Description

A találmány tárgyát kiméragének, kiméragéneket tartalmazó nukleinsavfragmensek, genomjukban ilyen kiméragéneket vagy nukleinsavfragmenseket tartalmazó növények és azok magjai, valamint az ilyen növények előállítási eljárásai képezik. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi egy kiméragén, amelyben egy - a lizin által kiváltott gátlásra nem érzékeny - dihidrodipikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens egy növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciához és egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához működőképesen kapcsolódik. A találmány tárgyát képezik továbbá a genomjukban ilyen kiméragént tartalmazó növények, valamint azok magjai. Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások olyan egyszikű vagy kétszikű növények (előnyösen repce-, szójabab- vagy kukoricanövények) kialakítására, amelyek magjaikban - a normális növények magjaihoz képest - fokozott mennyiségű lizint tartalmaznak. A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen eljárásokkal kialakított repce-, szójabab- és kukoricanövények. A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan nukleinsavfragmensek, amelyek a fentebb említett kiméragén mellett egy második - nagy lizintartalmú proteint kódoló vagy lizinketoglutarát-reduktázt kódoló -, növényi magspecifikus szabályozószekvenciához működőképesen kapcsolódó kiméragént is tartalmaznak. Szintén a találmány tárgyát képezik a genomjukban ilyen nukleinsavfragmenseket tartalmazó növények, valamint az ilyen növények magjai.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható olyan transzformált növények kialakítására, amelyek magjaiban - a nem transzformált növények magjaihoz képest - legalább 10%-kal, előnyösen 10-400%-kal nagyobb mennyiségben halmozódik fel lizin.

A különböző gabonákból származó élelmiszerek és állati takarmányok az állatok táplálkozásában nélkülözhetetlen tíz esszenciális aminosav közül néhányat nem tartalmaznak kellő mennyiségben. A kukoricában (Zea mays. L.) sok állat táplálkozási szükségletei szempontjából a lizin a legnagyobb mértékben korlátozó aminosav. A kukoricán alapuló állati takarmányokhoz - a lizinhiány kiegészítése érdekében - adalékanyagként egyéb terménynövényekből, például szójababból (Glycine max L.) vagy repcéből (Brassica napus) készült lisztet alkalmaznak. Az állati takarmányokhoz kiegészítőként alkalmaznak mikroorganizmusok fermentálásával előállított lizint is. A növényi forrásokból származó liszt lizintartalmának növelésével csökkenthető vagy kiküszöbölhető lenne a kevert gabonatakarmányok mikrobiális úton előállított lizinnel történő kiegészítésének szükségessége.

A magvak aminosavtartalmát elsősorban (90-99%os mértékben) a magban lévő proteinek aminosavösszetétele, és kisebb mértékben (1-10%-ban) a szabad aminosavraktárak határozzák meg. A magvakban lévő összes protein mennyisége a gabonák száraztömegének kb. 10%-ától a hüvelyesek száraztömegének 20-40%áig terjed. A proteinben kötött aminosavak nagy része a mag raktározóproteinjeiben található, melyek a mag fejlődése során szintetizálódnak, s amelyek a csírázást követően a fő tápanyagtartalékot képezik. Sok mag esetében a raktározóproteinek az összes proteinmennyiség

50%-át vagy még nagyobb részét teszik ki.

A magvak aminosav-összetételének javítása érdekében a raktározóproteineket kódoló gének izolálásához és expresszálásához génsebészeti technikát alkalmaznak. Például, izoláltak egy brazíliai dióból (paradióból) származó gént, amely 26%-ban kéntartalmú aminosavakat tartalmazó mag 2S-albumint kódol [Altenbach és munkatársai: Plánt Mól. Bioi., 8, 239 (1987)], és ezt a gént transzformált dohánynövényben, egy babból származó phaseolin raktározóproteingén szabályozószekvenciái irányítása alatt expresszálták. A dohánynövények magjaiban a nagy kéntartalmú proteinek felhalmozódása a magvakban lévő metionin szintjének egészen 30%-os növekedését eredményezte [Altenbach és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 13, 513 (1989)]. Napjainkig azonban egy olyan növény magjában lévő proteint sem azonosítottak, amely a növényi proteinek átlagos lizintartalmához viszonyítva hasonló mértékben fokozott lizintartalmú lenne, így ez a megoldás a lizin mennyiségének fokozására nem alkalmazható.

Egy másik lehetséges módszer a lizintermelés és lizinfelhalmozódás génsebészeti technikával történő fokozása. A lizin - a treoninnal, metioninnal és izoleucinnal együtt - az aszpartátból származik, és az e családba tartozó aminosavak bioszintézisének szabályozása komplex, szorosan összefüggő, és - különösen a növények esetében - nem teljesen tisztázott. Növényekben a reakcióút anyagcsere-folyamatainak szabályozása, úgy tűnik, elsősorban a végtermékeken keresztül történik. Az aszpartátcsalád reakcióútját az elágazási pontok reakciói is szabályozzák. A lizin esetében ez a reakció az aszpartil-p-szemialdehid piruváttal történő kondenzációja, melyet a dihidrodipikolinsav-szintetáz (DHDPS) katalizál.

Az E. coli dapA-génje olyan DHDPS-enzimet kódol, amely körülbelül hússzor kevésbé érzékeny a lizin által kiváltott gátlásra, mint a tipikus növényi DHDPSenzimek (például a búzacsíra-DHDPS). Az E. colidapA-gént a karfiol-mozaikvírus 35S-promoteréhez és egy növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciához kapcsolták. A kiméragént transzformációval dohánynövénysejtekbe vitték be, és kimutatták, hogy a levelekben a szabad lizin szintjének jelentős növekedését idézte elő [Glassman és munkatársai: WO 89/11789 számú nemzetközi közzétételi irat (1989. 12. 14.) Shaul és munkatársai: Plánt Jour. 2, 203 (1992); Galili és munkatársai: EPO 485970 (1992. 05. 20.) számú EPO szabadalmi leírás; Falco: PCT/US93/02480 számú szabadalmi bejelentés (nemzetközi közzétételi száma: WO 93/19190 1993. 09. 30.)]. Ennek ellenére, az említett forrásokban leírt, transzformált növények egyikében sem nőtt a magvak lizintartalma. Ugyanezt a kiméragént burgonyasejtekbe is bevitték, aminek eredményeként a szabad lizin mennyisége a levelekben, gyökerekben és gumókban kismértékben emelkedett [Galili és munkatársai: EPO 485970 számú EPO szabadalmi leírás; Perl és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 19, 815 (1992)].

Falco [PCT/US93/02480 számú szabadalmi leírás (nemzetközi közzétételi száma: WO 93/19190)] az

HU 222 085 Bl

E. co/i'-dapA-gént - expressziójának magvakban történő fokozása érdekében - bab-phaseolinpromoterhez és egy növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciához kapcsolta, a magvakban a lizinmennyiség növekedését azonban továbbra sem tapasztalta. Amint fentebb említettük, a lizinbioszintézis-reakcióút első lépését az aszpartátkináz (AK) katalizálja, és ez sok organizmusban a szabályozás fontos célpontjának bizonyult. Falco az E. co/i'-lysC-gén egy mutánsát izolálta, amely a lizin által kiváltott „feedback” gátlásra nem érzékeny aszpartátkinázt kódolt, és ezt a mutáns gént phaseolinpromoterhez és egy növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciához kapcsolta. A kapott kiméragén transzformált dohánynövények magjaiban történő expressziója a treonin szintjének jelentős emelkedését eredményezi, azonban a lizinre nincs ilyen hatása. Galili és munkatársai [EPO 485970 EPO szabadalmi leírás (1992)] felvetik annak lehetőségét, hogy a növények - magspecifikus promoterek növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciával és E. co/z'-dapA-génnel, illetve növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciával és mutáns E. co/z-lysC-génnel történő összekapcsolásával létrehozott - kiméragénekkel végzett transzformálásával a magvakban fokozott lizinszint érhető el. Falco [PCT/US93/02480 számú szabadalmi leírás (nemzetközi közzétételi szám: WO 93/19190)] ezt a kísérletet úgy hajtotta végre, hogy a dohánynövényeket mindkét kiméragént (bab-phaseolinpromoter/növényi kloroplasztisztranzitszekvencia/Λ. co/z'-dapA-gén és bab-phaseolinpromoter/növényi kloroplasztisz-tranzitszekvencia/mutánsE. co/z'-lysC-gén) tartalmazó konstrukcióval transzformálta. A két gén egyidejű expressziója nem gyakorolt jelentős hatást a magvak lizintartalmára, azonban megállapítást nyert, hogy a lizin bomlásterméke, az a-aminoadipinsav, felépült a magvakban. Ez azt sugallta, hogy a magvakban a szabad lizin felhalmozódását a lizinkatabolizmus akadályozta meg. A lizin bioszintézise sebességének fokozására tett kísérletben Falco [PCT/US93/02480 számú szabadalmi leírás (nemzetközi közzétételi szám: WO 93/19190)] - a lizinre teljesen érzéketlen DHDPS-enzimet kódoló - Corynebacterium glutamicum-áapA-gétíí izolált. Falco a dohánynövényeket a (bab-phaseolinpromoter/növényi kloroplasztisztianzitszekvencia/Corynebac-terium-glutamicumdapA-gén kiméragént a bab-phaseolinpromoter/növényi kloroplasztisz-tranzitszekvencia/mutáns-E.-co/z'-lysCgén kiméragénhez kapcsolva tartalmazó konstrukcióval transzformálta, azonban e két, lizinre érzéketlen enzim egyidejű expresszálása sem gyakorolt jelentős hatást a magvak lizintartalmára.

Ilyenformán, nyilvánvaló, hogy a növények (különösen a magokban lezajló) lizinbioszintézises reakcióútjának korlátozott ismerete miatt a génsebészeti technikák lizintartalom fokozásában történő alkalmazásának eredménye bizonytalan. A legtöbb növény esetében nem ismert, hogy a lizin a magvakban szintetizálódik-e vagy a levelekből szállítódik-e a magvakba. Ráadásul, a magvakban a lizin tárolásáról és katabolizmusáról is keveset tudunk. Mivel a szabad aminosavak a magvak összes aminosavtartalmának csak kis hányadát teszik ki, a magvak teljes aminosav-összetételének jelentős befolyásolása érdekében a túlfelhalmozásnak sokszorosnak kell lennie. Ezenkívül, egy szabad aminosav (mint például a lizin) túlfelhalmozódásának - magvak fejlődésére és életképességére gyakorolt - hatásait sem ismerjük.

Találmányunk előtt egy eljárás sem volt ismert a magvak lizintartalmának génsebészeti technikával történő fokozására, továbbá egy példa sem volt ismert a lizin - génsebészeti technikával - növelt mennyiségét tartalmazó magvakra.

A találmány tárgyát új kiméragén, valamint az ilyen gén alkalmazásával transzformált növények képezik. A kiméragénben egy - a lizin által kiváltott gátlásra nem érzékeny - dihidrodipikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens egy növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciához és egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához kapcsolódik. Egy előnyös megvalósítási módban a dihidrodipikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens a Corynebacterium glutamicum dihidrodipikolinsav-szintetázát kódoló - a szekvencialista 3. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott nukleinsavszekvenciát tartalmazza. Különösen előnyös megvalósítási módokban a növényi kloroplasztisz-tranzitszekvencia a ribulóz-l,5-difoszfát karboxiláz kis alegységét kódoló génből, a magspecifikus szabályozószekvencia pedig a Phaseolus vulgárisból származó phaseolin magi tartalékprotein β-alegységét kódoló génből, a Glycine max Kunitz-tripszininhibitor-3-génjéből vagy egy egyszikű, embrióspecifikus promoterből, előnyösen a Zea mays globulin-1-génjének promoteréből származik.

Az említett gének például növények, előnyösen kukorica-, repce- vagy szójababnövények transzformálásához alkalmazhatók. A találmány tárgyát képezik továbbá a transzformált növények magjai. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításával olyan transzformált növények állíthatók elő, melyek magjai - a nem transzformált növények magjaihoz képest legalább 10%-kal, előnyösen 10-400%-kal nagyobb mennyiségben halmoznak fel lizint.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás olyan növény, előnyösen kukorica-, repce- vagy szójababnövény előállítására, amelynek magjai - a nem transzformált növények magjaihoz képest - 10-400%kal nagyobb mennyiségben halmoznak fel lizint. Az eljárás során (a) növényi sejteket, előnyösen kukorica-, repcevagy szójababsejteket a fentebb leírt kiméragénnel transzformálunk;

(b) az (a) lépésben kapott, transzformált növénysejtekből - magvak kinyeréséhez alkalmas körülmények között - termőképes, érett növényeket regenerálunk;

(c) a (b) lépésben kapott magvakat lizintartalomra szkríneljük; és (d) kiválasztjuk azokat a vonalakat, amelyek magjai fokozott mennyiségű lizint tartalmaznak. Az ezen eljárással kapott transzformált növények szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy nukleinsavfragmens, amely

HU 222 085 Β1 (a) egy fentebb leírt első kiméragént; és (b) egy második kiméragént tartalmaz, amelyben egy nagy lizintartalmú (legalább 15 m/m% lizint tartalmazó) proteint kódoló nukleinsav működőképesen kapcsolódik egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy nukleinsavfragmens, amely (a) egy fentebb leírt első kiméragént; és (b) egy második kiméragént tartalmaz, amelyben a nagy lizintartalmú proteint kódoló nukleinsavfragmens egy „n” számú heptádegységet (d, e, f, g, a, b, c) tartalmazó proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz, mely heptádok azonosak vagy különbözők, és ahol „n” értéke legalább 4;

„a” és „d” jelentése, egymástól függetlenül,

Met, Leu, Val, Ile vagy Thr;

„e” és „g” jelentése, egymástól függetlenül, a

Glu/Lys, Lys/Glu, Arg/Glu, Arg/Asp, Lys/Asp,

Glu/Arg, Asp/Arg vagy Asp/Lys sav/bázis pár; és „b”, „c” és „f” jelentése, egymástól függetlenül, a Gly és Pro kivételével bármilyen aminosav, és minden egyes heptádban a „b”, „c” és „f ’ aminosavak közül legalább kettő jelentése Glu, Lys, Asp, Arg, His, Thr, Ser, Asn, Alá, Gin vagy Cys;

és az említett nukleinsavfragmens működőképesen egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához kapcsolódik.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy nukleinsavfragmens, amely (a) egy fentebb leírt első kiméragént; és (b) egy második kiméragént tartalmaz, amelyben a nagy lizintartalmú proteint kódoló nukleinsavfragmens egy (MEEKLKA)₆ (MEEKMKA)₂ aminosavszekvenciából álló proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz, amely működőképesen kapcsolódik egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához.

Szintén a találmány tárgyát képezik az említett első és második kiméragének és az említett nukleinsavak különböző megvalósítási módjait tartalmazó növények, valamint az ilyen növényekből nyert magvak.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy nukleinsavfragmens, amely (a) egy fentebb leírt első kiméragént; és (b) egy második kiméragént tartalmaz, amelyben egy lizin-ketoglutarát-reduktázt kódoló nukleinsavfragmens (szensz vagy antiszensz orientációban) működőképesen kapcsolódik egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához. Szintén a találmány tárgyát képezi a genomjában az említett nukleinsavfragmenst tartalmazó növény, valamint az ilyen növényből származó mag.

A találmány szerinti megoldás a részletes leírás és a mellékelt ábrák alapján lesz könnyebben érthető. A következőkben az ábrák és a szekvencialistában szereplő szekvenciák rövid leírását ismertetjük.

Az 1. ábrán egy alfa-hélixszerkezetet mutatunk be (oldal- és felülnézetből).

A 2. ábrán egy alfa-helikális szuperhélix-szerkezet felülnézeti (2A. ábra) és oldalnézeti ábrázolását (2B. ábra) mutatjuk be.

A 3. ábrán a leucin és a metionin kémiai szerkezetét mutatjuk be, kiemelve hasonló alakjukat.

A 4. ábrán egy magspecifikus génexpressziós kazetta sematikus ábrázolását mutatjuk be.

Az 5A. ábrán a biner pZS199-plazmidvektor térképét, az 5B. ábrán pedig a biner pFS926plazmidvektor térképét mutatjuk be.

A 6A. ábrán a pBT603-plazmidvektor térképét, a 6B. ábrán a pBT614-plazmidvektor térképét mutatjuk be.

A 7. ábrán az SSP-génszekvenciák konstruálásához és expresszálásához alkalmazható vektor (pSK5) kialakításának mentetét mutatjuk be.

A 8. ábrán az oligonukleotidszekvenciák - alapgénszekvencia Earl-helyére történő inszertálásának - menetét mutatjuk be.

A 9. ábrán az alapgént képező oligonukleotidok pSK5-plazmid NcoI/EcoRI helyeire történő (pSK6-plazmidot eredményező) inszertálásának menetét mutatjuk be. Ezt az alapgén-szekvenciát a 8. ábrán látható módon, a különböző SSPkódolórégiók egyedi Earl-helyre történő inszertálásához (a felsorolt, klónozott szegmensek kialakítása érdekében) alkalmaztuk.

A 10. ábrán a nem ismétlődő génszekvenciák kialakításához alkalmazott 63 bp-os „szegmens”-oligonukleotidok inszercióját mutatjuk be.

A 11 A. és 11B. ábrán a nem ismétlődő gén-szegmensek” - leolvasási kereten belüli fúziók alkalmazásával végzett sokszorosításának stratégiáját mutatjuk be.

A 12. ábrán a magspecifikus-promoter- és 3’-szekvenciakazettákat tartalmazó vektorokat mutatjuk be. Az SSP-szekvenciákat Ncol- és Asp718-helyek felhasználásával inszertáltuk ezekbe a vektorokba.

A 13. ábrán a biner pZS97-plazmidvektor térképét mutatjuk be.

A 14. ábrán a pML63-plazmidvektor térképét mutatjuk be.

A 15. ábrán a pML102-plazmidvektor térképét mutatjuk be. A plazmidvektor olyan kiméragént hordoz, amelyben a - szójababKunitz-tripszininhibitor-3-génből származó - magspecifikus szabályozószekvenciák - a szójabab-ribulóz-difoszfát karboxiláz kis alegységéből származó - kloroplasztisz-tranzitszekvenciához és a lizinre nem érzékeny dihidrodipikolinsav-szintetáz kódolószekvenciájához (a Corynebacterium glutamicum dapA-génjéhez) kapcsolódnak.

A szekvencialista 1. és 2. azonosító számú szekvenciáját az 1. példában a Corynebacterium-dapA-gén izolálásához PCR-láncindítóként alkalmaztuk.

HU 222 085 Bl

A szekvencialista 3. azonosító számú szekvenciájaként a lizinre érzéketlen DHDPS-enzimet kódoló - 1. példában leírt - vad típusú Corynebacterium dapA-gén kódolórégiójának nukleotidszekvenciáját, illetve az általa kódolt protein aminosavszekvenciáját mutatjuk be.

A szekvencialista 4. azonosító számú szekvenciájaként a 2. példában az E. co/í-dapA-gén transzlációs iniciációs kodonjánál Ncol-hely kialakításához alkalmazott oligonukleotidot mutatjuk be.

A szekvencialista 5. azonosító számú szekvenciájaként a 3. példában leírt vad típusú E. co/z-lysC-gén AKIII-enzimet kódoló - kódolórégiójának nukleotidszekvenciáját, és az általa kódolt protein aminosavszekvenciáját mutatjuk be.

A szekvencialista 6. és 7. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott nukleotidszekvenciákat a 3. példában, az E. co/i-lysC-gén transzlációs iniciációs kodonjánál Ncol-hely kialakításához alkalmaztuk.

A szekvencialista 8., 9., 10. és 11. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott nukleotidszekvenciákat a 4. példában, egy kloroplasztisz-tranzitszekvencia alakításához, és a kapott tranzitszekvencia E. co/z'-lysCM4-, E. coliáapA- és Coryzzeóűcíeri«?n-dapA-génhez történő kapcsolásához alkalmaztuk.

A szekvencialista 12. és 13. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott nukleotidszekvenciákat a 4. példában, közvetlenül az E. co/z-dapA-gén transzlációs stopkodonja utáni Kpnl-hely kialakításához alkalmaztuk.

A szekvencialista 14. és 15. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott nukleotidszekvenciákat PCRláncindítóként egy szójabab-kloroplasztisz-tranzitszekvencia kialakításához, illetve a kapott szekvencia Corynebacterium dapA-génhez történő kapcsolásához alkalmaztuk.

A szekvencialista 16-92. azonosító számú szekvenciáiként - növények magjaiban expresszálható, nagy lizintartalmú szintetikus magi tartalékproteineket kódoló - kiméragének kialakításához alkalmazott nukleinsavfragmenseket, valamint az általuk kódolt polipeptideket mutatjuk be.

A szekvencialista 93-98. azonosító számú szekvenciáiként bemutatott nukleotidszekvenciákat a 12. példában, kukorica-kloroplasztisz-tranzitszekvencia kialakításához alkalmaztuk.

A szekvencialista 99. és 100. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott nukleotidszekvenciákat a 12. példában, PCR-láncindítóként egy szójabab-kloroplasztisz-tranzitszekvencia kialakításához, illetve a kapott szekvencia E. co/z-dapA-génhez történő kapcsolásához alkalmaztuk.

A szekvencialistában a nukleotidszekvenciák leírását egybetűs kóddal, az aminosavszekvenciák leírását pedig hárombetűs kóddal adjuk meg [az IUPAC-IYUB szabványnak megfelelően, lásd: Nucleic Acids Research 13, 3021 (1985) és Biochemical Journal 219 (3), 345 (1984), mely források teljes teijedelmükben a kitanítás részét képezik].

Az alábbi kitanítási részben nukleinsavfragmenseket és eljárásokat írunk le, amelyek alkalmasak a transzformáit növények magjaiban a lizinfelhalmozódás mértékének - nem transzformált növények magjaiban tapasztalható lizinszinthez viszonyított - fokozására. A növények magjaiban a szabad lizin felhalmozódásának génsebészeti módszerekkel történő fokozása érdekében meghatároztuk, hogy a szóban forgó reakcióút enzimjei közül melyek azok, amelyek a növények magjaiban szabályozzák a reakciók lejátszódását. Ennek megvalósítása érdekében baktériumokból olyan géneket izoláltunk, amelyek a reakcióútban lévő enzimeket kódolják. Kiméragének előállításához intracelluláris lokalizációért felelős szekvenciákat és megfelelő expressziós szabályozószekvenciákat kapcsoltunk egymáshoz, majd a kiméragéneket - transzformáció útján - növényekbe vittük be, és értékeltük a gének - magvak lizinfelhalmozását fokozó képességét. A lizinre nem érzékeny dihidrodipikolinsavszintetáz (DHDPS) - erős magspecifikus promoter szabályozása alatti - expressziójáról bebizonyosodott, hogy kukorica-, repce- és szójababmagvakban a szabad lizin mennyiségét 10- 100-szorosára növelik.

Felismertük, hogy a magvakban a felesleges szabad lizin teljes szintű felhalmozódását a lizinkatabolizmus csökkenti. A feleslegben lévő lizin elvesztésének megakadályozására két módszert dolgoztunk ki. Az első megoldás szerint a lizinkatabolizmust - a lizinlebomlás első lépését katalizáló - lizin-ketoglutarát-reduktáz (LKR) aktivitásának csökkentésével akadályozzuk meg. Ennek megvalósítása érdekében eljárást dolgoztunk ki növényi LKR-gének izolálására. A növények magjaiban antiszensz LKR-RNS expresszálásához vagy LKR együttes szuppresszálásához kiméragéneket hozunk létre. A kiméragéneket ezután DHDPS-kiméragénhez kapcsoljuk, és egyidejű transzformációval mindkettőt bevisszük a növényekbe, vagy más módon, a géneket úgy hozzuk össze egymással, hogy az egyes kiméragénekkel külön-külön transzformált növényeket keresztezünk.

A második megoldási mód értelmében a feleslegben lévő szabad lizint olyan alakba foglaljuk (például di-, tri- vagy oligopeptidbe vagy nagy lizintartalmú proteinbe), amely a lebomlással szemben érzéketlen. Olyan polipeptidtípusokat alakítottunk ki, amelyek nagy lizintartalmú magi tartalékproteinekként in vivő expresszálhatók. E megoldási mód gyakorlati megvalósítása során nagy lizintartalmú szintetikus tartalékproteineket („SSP”; „synthetic storage protein”) kódoló géneket szintetizálunk, és kiméragéneket hozunk létre, amelyekben az SSP-gének - növényi magvakban történő expresszióhoz - megfelelő szabályozószekvenciákhoz kapcsolódnak. Az SSP-kiméragént ezután DHDPS-kiméragénhez kapcsoljuk, és egyidejű transzformációval mindkettőt bevisszük a növényekbe, vagy más módon, a géneket úgy hozzuk össze egymással, hogy az egyes kiméragénekkel külön-külön transzformáit növényeket keresztezünk.

A leírásban ismertetünk egy eljárást növények, előnyösen kukorica-, repce- és szójababnövények transzformálására. Az így transzformált növények magjai legalább 10%-kal, előnyösen 10-400%-kal több lizint tartalmaznak, mint nem transzformált növények magjai.

HU 222 085 Β1

A példaként említett, transzformált repcenövények magjai 100%-kal több lizint, a transzformált szójababnövények magjai 400%-kal több lizint, a transzformált kukoricanövények magjai pedig 130%-kal több lizint tartalmaznak, mint a nem transzformált növények magjai.

A találmány leírásában számos kifejezést használunk, melyek jelentését a következőkben adjuk meg. A „nukleinsav” kifejezés, ahogy a leírásban használjuk, olyan nagyméretű - egy- vagy kétszálú - molekulát jelent, amely cukrot, foszfátot és purin- vagy pirimidinbázist tartalmazó monomerekből (nukleotidokból) épül fel. A „nukleinsavfragmens” kifejezés egy adott nukleinsavmolekula egy szakaszát jelenti. A magasabb rendű növényekben a dezoxiribonukleinsav (DNS) képezi a genetikai anyagot, míg a ribonukleinsav (RNS) a genetikai információ proteinekbe történő átvitelében játszik szerepet. A „genom” kifejezés egy organizmus minden egyes sejtjében meglévő teljes genetikai állományt jelent. A „nukleotidszekvencia” kifejezés DNS- vagy RNS-polimerre vonatkozik, amely lehet egyszálú vagy kétszálú, és adott esetben olyan szintetikus, nem természetes vagy módosított nukleotidokat tartalmaz, amelyek képesek beépülni a DNS- vagy RNS-polimerekbe.

A „gén” kifejezés olyan nukleinsavfragmenst jelent, amely specifikus proteint expresszál. Ez a kifejezés magában foglalja a kódolórégiót megelőző (5’ nemkódoló) és a kódolórégió után álló (3’ nemkódoló) szabályozószekvenciákat is. A „természetes gén” kifejezés a természetben találhatóval azonos állapotú génre vonatkozik. A „kiméragén” kifejezés olyan gént jelent, amely heterogén eredetű szabályozó- és kódolószekvenciákat tartalmaz. Az „endogén gén” kifejezés olyan természetes génre vonatkozik, amely a genomban természetes elhelyezkedésében található. Az „idegen gén” kifejezés olyan - a gazdaorganizmusban normális esetben nem található - génre vonatkozik, amely génátvitel útján került a gazdaorganizmusba.

A „kódolószekvencia” kifejezés olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, amely specifikus proteint kódol, és nem tartalmaz nemkódoló szekvenciákat.

Az „iniciációs kodon” és a „terminációs kodon” kifejezés egy kódolószekvencia három szomszédos nukleotidjából álló egységre vonatkozik, melyek meghatározzák a proteinszintézis (mRNS-transzláció) kezdetét, illetve lezárását. A „nyitott leolvasási keret” kifejezés egy kódolószekvencia - transzlációs iniciációs kodon és terminációs kodon közé eső - része által kódolt aminosavszekvenciára vonatkozik.

Ahogy a leírásban használjuk, a „megfelelő szabályozószekvenciák” kifejezés egy kódolószekvenciától „upstream” (3’) és/vagy „downstream” (5’) irányban elhelyezkedő nukleotidszekvenciákra vonatkozik, melyek - lehetőség szerint a sejt proteinbioszintézises apparátusával együttesen - a kódolószekvenciák transzkripcióját és/vagy expresszióját irányítják. A szabályozószekvenciák közé tartoznak a promoterek, transzlációs vezérlőszekvenciák, a transzkripciós terminációs szekvenciák és a poliadenilációs szekvenciák.

A „promoter” kifejezés egy gén - kódolószekvenciájától rendszerint „upstream” (5’) irányban elhelyezkedő - olyan DNS-szekvenciájára vonatkozik, amely az RNS-polimeráz és - a megfelelő transzkripcióhoz szükséges - egyéb faktorok felismerésének biztosítása révén irányítja a kódolószekvencia expresszióját. Egy promoter tartalmazhat olyan DNS-szekvenciákat is, amelyek olyan proteinfaktorok kötésében játszanak szerepet, melyek fiziológiai vagy környezeti körülmények hatására szabályozzák a transzkripció iniciációját. A promoter tartalmazhat erősítő („enhancer”)-elemeket is.

Az „erősítőszekvencia” („enhancer”) kifejezés olyan DNS-szekvenciát jelent, amely serkenti a promoter működését. Ez lehet a promoterben eredetileg meglévő elem, de lehet egy heterológ eredetű, a promoter szintjének és/vagy szövetspecifitásának fokozása érdekében inszertált elemei is. A „konstitutív promoterek” kifejezés azokra a promoterekre vonatkozik, amelyek a génexpressziót mindig, mindegyik szövetben irányítják. Ahogy e leírásban használjuk, a „szervspecifikus” vagy „fejlődésspecifikus” promoterek olyan promoterek, amelyek a génexpressziót majdnem kizárólagosan csak specifikus szervekben, például levelekben vagy magvakban, illetve egy szervben egy specifikus fejlődési stádiumban (például a korai vagy kései embriogenezis során) irányítják.

A „működőképesen kapcsolt” kifejezés egy nukleinsavmolekulán lévő olyan nukleinsavszekvenciákra vonatkozik, amelyek úgy kapcsolódnak az illető molekulához, hogy az egyik működését befolyásolja a másik. Például, egy promoter akkor kapcsolódik működőképesen egy struktúrgénhez, ha képes a struktúrgén expresszióját befolyásolni (vagyis, ha a struktúrgén a promoter transzkripciós szabályozása alatt áll).

Ahogy a leírásban használjuk, az „expresszió” kifejezésen egy gén által kódolt protein termelődését értjük. Közelebbről, az „expresszió” kifejezés a találmány szerinti nukleinsavfragmens(ek)ből származó szensz (mRNS) vagy antiszensz RNS transzkripciójára és stabil felhalmozódására vonatkozik, ami - a sejt proteinbioszintézises apparátusával együttesen - a proteintermékek módosított szintjét eredményezi. Az „antiszensz gátlás” kifejezés olyan antiszensz RNS-transzkriptumok termelődését jelenti, amelyek képesek a célprotein expresszióját megakadályozni. A „túlexpresszálás” kifejezés a transzgenikus organizmusokban egy géntermék olyan mértékű termelődésére vonatkozik, amely meghaladja a géntermék normális vagy nem transzformált organizmusokban megfigyelhető szintet. Az „együttes szuppresszió” („cosuppression”) kifejezésen egy endogén génnel jelentős homológiát mutató idegen gén expresszióját értjük, ami az idegen gén és az endogén gén expressziójának egyidejű szuppresszálását eredményezi. A „módosított szintek” kifejezés géntermék(ek) transzgenikus organizmusokban tapasztalható - normális vagy nem transzformált organizmusokban megfígyelhetőtől eltérő - mennyiségű vagy arányú termelődésére vonatkozik.

A „3’ nemkódoló szekvenciák” kifejezésen egy gén olyan DNS-szekvenciáját értjük, amely poliadenilációs jelet és bármilyen más - az „mRNS-processing”-et vagy a génexpressziót befolyásolni képes - szabályozó6

HU 222 085 Bl jelet tartalmaz. A poliadenilációs jelre általában az jellemző, hogy a poliadenilsavszakaszok - mRNS-prekurzor 3’-végéhez történő - hozzáadására hatnak.

A „transzlációs vezérlőszekvencia” kifejezés egy gén promoter- és a kódolószekvencia között elhelyezkedő - DNS-szekvencia szakaszára vonatkozik, amely a transzkripció során RNS-sé íródik át, és a teljesen érett mRNS-en a transzlációs startkodontól „upstream” (5’) irányban jelenik meg. A transzlációs vezérlőszekvencia befolyásolhatja a primer transzkriptum mRNS-sé érését, az mRNS stabilitását, illetve a transzláció hatékonyságát.

Az „érett protein” kifejezés egy transzláció utáni érési folyamaton átesett polipeptidre vonatkozik, amely már nem tartalmazza célba juttató szignálját. A „prekurzor proteinek” kifejezés az mRNS transzlációjának elsődleges termékeire vonatkozik. A ,Jdoroplasztiszspecifikus szignálszekvencia” olyan aminosavszekvencia, amely egy proteinnel kapcsolódva transzlálódik, és a proteint a kloroplasztiszba irányítja. A „kloroplasztisztranzitszekvencia” kifejezés olyan nukleotidszekvenciára vonatkozik, amely kloroplasztiszspecifikus szignálszekvenciát kódol.

Ahogy a leírásban használjuk, a „transzformáció” kifejezésen egy idegen gén gazdaorganizmus genomjába történő bevitelét és genetikailag stabil öröklődését értjük. A növények transzformációs eljárásainak példái közé tartozik az Agrobacterium közvetítette transzformáció, és a részecskegyorsításos vagy „génágyús” transzformációs technika.

A leírásban az „aminosavak” kifejezésen a természetesen előforduló L-aminosavakat (alanin, arginin, aszparaginsav, aszparagin, cisztein, glutaminsav, glutamin, glicin, hisztidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, prolin, fenil-alanin, szerin, treonin, triptofán, tirozin és valin) értjük. Az „esszenciális aminosavak” azok, amelyeket az állatok nem képesek szintetizálni. Ahogy itt használjuk, a „polipeptid” vagy „protein” kifejezés egymással amidkötésekkel (más néven peptidkötésekkel) kapcsolódó - monomerekből (aminosavakból) álló molekulára vonatkozik.

A leírásban a „szintetikus protein” kifejezésen olyan proteint értünk, amely a természetben nem ismert aminosavszekvenciákból áll. Az aminosavszekvencia származhat természetesen előforduló proteinek együttműködéséből, de lehet teljes egészében új is.

Az „elsődleges (primer) szekvencia” kifejezés egy polipeptidláncban az aminosavak kapcsolódási sorrendjét jelenti, függetlenül a molekula konformációjától. Az elsődleges szekvenciákat (megegyezés szerint) a polipeptidlánc N-terminálisától C-terminálisa irányába írjuk.

A „másodlagos (szekunder) szerkezet” kifejezésen egy polipeptidlánc fizikokémiai szempontból kedvező, szabályos gerincváz-elrendeződését értjük, függetlenül az oldalláncok variációitól vagy a konformációtól. Ahogy a leírásban használjuk, az „alfa-hélix” kifejezés jobbmenetes hélixre vonatkozik, amely csavarmenetenként kb. 3,6 aminosavat tartalmaz. Az „amfipatikus hélix” kifejezés olyan helikális konformációjú polipeptidre vonatkozik, amelyben a hélix egyik oldala döntően hidrofób, másik oldala pedig döntően hidrofil természetű.

A „szuperhélix” kifejezésen két párhuzamos, jobbmenetes alfa-hélix alkotta szerkezetet értünk, amelyben az egyes hélixek balmenetes csavarmentet alkotva csavarodnak egymásra.

A „sóhidak” kifejezésen töltéssel rendelkező aminosav-oldalláncok által alkotott sav-bázis párokat értünk, amelyek térbeli elrendeződése olyan, hogy egy polipeptidlánc két része között vagy két polipeptidlánc között elektrosztatikus (vonzó) kölcsönhatást tartanak fenn.

A „gazdasejt” kifejezésen bevitt genetikai anyaggal transzformált sejtet értünk.

A DHDPS-gének izolálása

Az E. coli-áapA-gésA (ecodapA-gén) E. co/í-DNS 3400 átfedő szakaszából álló, Kohara, Akiyame és Isono által készített, rendezett könyvtárból [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)] bakteriofág lambda-klónként izoláltuk. Az izolálás és az ecodapA-gén módosításának részleteit az 1. példában újuk le. Az ecodapA-gén olyan DHDPS-enzimet kódol, amely legalább 20-szor kevésbé érzékeny a lizin által kiváltott gátlásra, mint egy átlagos növényi enzim (mint például a búza-DHDPS). A találmány szerinti megoldás céljait illetően a lizin által kiváltott gátlásra 20-szor kevésbé érzékeny enzimet lizinre érzéketlen enzimnek nevezzük.

A Corynebacterium-dapA-gént (cordapA-gén) az ATCC 13032 deoponálási számú törzs genomiális DNS-éből polimeráz-láncreakcióval (PCR) izoláltuk. A Corynebacterium-dapA-gén nukleotidszekvenciája publikált forrásból ismert [Bonnassie és munkatársai:? Nucleic Acids Rés. 18, 6421 (1990)]. E gén szekvenciája alapján PCR láncindító oligonukleotidokat terveztünk, melyek lehetővé teszik a gént tartalmazó DNSfragmens amplifikálását, ugyanakkor, a gént magában foglaló további konstrukciók előállítását lehetővé téve, a startkodonhoz és közvetlenül a stopkodon után egyedi restrikciós endonukleázos felismerési helyeket adnak. A Corynebacterium-dapA-gén (cordapA-gén) izolálásának részleteit az 1. példában újuk le. A cordapAgén egy előnyös, lizinre érzéketlen DHDPS-enzimet kódol, amelyet az enzimes reakcióelegyben 70 mM lizin jelenléte sem befolyásol.

A DHDPS-t kódoló egyéb gének izolálásának leírása megtalálható az ide vonatkozó irodalomban. A korábban izolált és szekvenált növényi DHDPS-gének két példája a búzából származó DHDPS-t kódoló cDNS [Kaneko és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 17451 (1990)] és a kukoricából származó DHDPS-t kódoló cDNS [Frisch és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 228, 287 (1991)]. A növényi gének vad típusú, lizinre érzékeny DHDPS-enzimeket kódolnak, azonban Negrutui és munkatársai [Theor. Appl. Génét. 68, 11 (1984)] két olyan AEC-rezisztens dohánynövénymutánst hoztak létre, amelyekben a DHDPS-aktivitás kevésbé volt érzékeny a lizin által kiváltott gátlásra, mint a vad típusú enzim esetében. Ez azt jelzi, hogy ezek a mutáns dohánynövények lizinre rezisztens enzimet kódoló DHDPS7

HU 222 085 Β1 géneket tartalmaznak. Az ilyen gének - a búza és kukorica DHDPS-génjeinek izolálásához korábban leírt eljárások alkalmazásával, vagy más módon, a búza- vagy kukorica-DHDPS-gének heterológ hibridizációs próbaként történő alkalmazásával - könnyen izolálhatok a mutáns dohánynövényekből.

DNS-hibridizációs próbaként E. co/i-dapA-gén, cordapA-gén vagy a növényi DHDPS-gének valamelyikének alkalmazásával további DHDPS-gének izolálhatók. Más lehetőség szerint, a DHDPS-t kódoló egyéb gének E. co/i-dapA-mutáns funkcionális kiegészítésével is izolálhatok, amint azt a cordapA-gén izolálásánál [Yeh és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 212, 105 (1988)j és a kukorica-DHDPS-gén izolálásánál tették. A dapA-kódolórégió növényekben történő expresszálásához alkalmas kiméragének kialakítása

Az idegen gének növényekben történő expresszálása jól ismert módszer [De Blaere és munkatársai: Meth. Enzymol. 147, 277 (1987)]. A dapA-mRNS pontos szintű expresziójához különböző promotereket felhasználó különböző kiméragének alkalmazására lehet szükség. Az ilyen kiméragének közös expressziós vektorban együtt, vagy egynél több vektor alkalmazásával, egymás után vihetők be a gazdanövényekbe. A dapA-gének kódolószekvenciáinak expresszálásához alkalmas heterológ gazdák előnyös csoportját képezik az eukariótagazdák, különösen a magasabb rendű növények sejtjei. A magasabb rendű növények és magjaik közül különösen előnyösek a repce (Brassica napus, B. campestris) és a szójabab (Glycine max).

A kódolószekvencia expressziójának irányításához kiválasztott promoter eredete nem lényeges, feltéve, hogy elégséges transzkripciós aktivitása van a dapAgének lefordítható mRNS-ének kívánt gazdasejtben történő expresszálásához. Azok az előnyös promoterek, amelyek specifikusan a magokban teszik lehetővé a protein expresszióját. Ez különösen előnyös lehet, mivel a magok a növényi aminosavak elsődleges forrását képezik, továbbá a magspecifikus expresszióval kiküszöbölhetők a más szervekben potenciálisan előforduló káros hatások. A magspecifikus promoterek példái közé tartoznak, többek között, a magi tartalékproteinek promoterei. A magi tartalékproteinek expressziója szigorúan szabályozott; ezek a proteinek szinte kizárólag a magvakban, nagymértékben szervspecifikus és fejlődési stádiumspecifikus módon expresszálódnak [Higgins és munkatársai: Ann. Rév. Plánt Physiol. 35, 191 (1984); Goldberg és munkatársai: Cell 56, 149 (1989); Thompson és munkatársai: BioEssays 10, 108 (1989)]. A különböző magi tartalékproteinek a mag fejlődésének különböző stádiumaiban expresszálódhatnak.

A magi tartalékproteineket kódoló gének transzgenikus kétszikű növényekben történő magspecifikus expressziójára jelenleg is számos példa ismeretes. Az ilyen gének közé tartozik (a kétszikű növények génjei közül) a bab β-phaseolinját kódoló gén [Sengupta-Goplalan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3320 (1985); Hofíman és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 717 (1988)] a bab lektinjét kódoló gén [Voelker és munkatársai: EMBO J. 6, 3571 (1987)], a szójabab lektinjét kódoló gén [Okamuro és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8240 (1986)], a szójabab Kunitztripszininhibitorát kódoló gén [Perez-Grau és munkatársai: Plánt Cell 1, 1095 (1989)], a szójabab β-konglicininjét kódoló gén [Beachy és munkatársai: EMBO J. 4, 3047 (1985); Barker és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 458 (1988); Chen és munkatársai: EMBO J. 7, 297 (1988); Chen és munkatársai: Dev. Génét 10, 112 (1989); Naito és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 109 (1988)] a borsó vicilinjét kódoló gén [Higgins és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 683 (1988)], a borsó konvicilinjét kódoló gén [Newbigin és munkatársai: Planta 180, (1990)], a borsó leguminját kódoló gén [Shirsat és munkatársai: Mól. Gén. Genetics 215, (1989)], a repce napinját kódoló gén [Radke és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 75, 685 (1988)], valamint (az egyszikű növények génjei közül) a kukorica 15 kD-os zeinjét kódoló gén [Hofíman és munkatársai: EMBO J. 6, 3213 (1987); Schemthaner és munkatársai: EMBO J. 7, 1249 (1988); Williamson és munkatársai: Plánt Physiol. 88, 1002 (1988)], az árpa β-hordeinjét kódoló gén [Marris és munkatársai: Plánt. Mól. Bioi. 10, 359 (1988)], és a búza gluteninjét kódoló gén [Colot és munkatársai: EMBO J. 6, 3559 (1987)]. A magspecifikus gének promoterei, melyek a kiméragénekben a heterológ kódolószekvenciákhoz működőképesen kapcsolódnak, a transzgenikus növényekben szintén megtartják időbeli és térbeli expressziós mintázatukat. Az ilyen promoterek példáiként említhetjük az Arabidopsis íAa/i'azia-2S-magi-tartalékprotein-gén promoterét (az enkefalinpeptidek Arabidopsis és B. napus magvakban történő expresszálásához) [Vandekerckhove és munkatársai: Bio/Technology 7, 929 (1989)], a bablektin- és a bab^-phaseolin-promotereket (luciferáz expresszálásához) [Riggs és munkatársai: Plánt Sci. 63, 47 (1989)], és a búzaglutenin-promotereket (klóramfenikol-acetil-transzferáz expresszálásához) [Colot és munkatársai: EMBO J. 6, 3559 (1987)].

A találmány szerinti nukleinsavfragmens expressziójának gyakorlati megvalósításában különösen előnyösek a különböző, részletesen karakterizált magi tartalékprotein-génekből származó promoterek, mint például a bab β-phaseolinját kódoló génből [SenguptaGoplalan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3320 (1985); Hofíman és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 717 (1988)], a szójabab Kunitz-tripszininhibitorát kódoló génből [Jofúku és munkatársai: Plánt Cell 1, 1079 (1989); Perez-Grau és munkatársai: Plánt Cell 1, 1095 (1989)], a szójabab β-konglicininjét kódoló génből [Harada és munkatársai: Plánt Cell 1, 415 (1989)] és a repce napinját kódoló génből [Radke és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 75, 685 (1988)] származó promoterek. A bab^-phaseolin és a szójabab^-konglicinint kódoló gének promoterei különösen előnyösen alkalmazhatók a dapA-mRNS sziklevelekben (a magfejlődés közép- és kései stádiumában) történő expresszálására.

A találmány szerinti nukleinsavfragmensek expresszálására szintén igen előnyösen alkalmazhatók a különböző, részletesen karakterizált, kukoricamag-tarta8

HU 222 085 Bl lékproteineket kódoló génekből származó heterológ promoterek, mint például a 10 kD-os zeint kódoló génből [Kirihara és munkatársai: Gene 71, 359 (1988)], a 27 kD-os zeint kódoló génből [Prat és munkatársai: Gene 52, 51 (1987); Gallardo és munkatársai: Plánt Sci. 54, 211 (1988); Reina és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 18, 6426 (1987)] és a 19 kD-os zeint kódoló génből [Marks és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 16451 (1985)] származó endospermiumspecifikus promoterek. Leírták e promoterek kukoricában mutatott relatív transzkripciós aktivitását [Kodrzyck és munkatársai: Plánt Cell 1, 105 (1989)], ami alapul szolgál a kukoricához kialakított kiméragén-konstrukciókban alkalmazható promoterek kiválasztásához. A kukoricaembriókban lejátszódó expresszióhoz a globulin-1(GLBl)-génből származó erős embrióspecifikus promoter [Kriz: Biochemical Genetics 27, 239 (1989); Wallace és munkatársai: Plánt Physiol 95, 973 (1991)] alkalmazható.

Úgy véljük, hogy az erősítőszekvenciák („enhancer”ek) vagy erősítőszekvencia-szerű elemek egyéb promoterkonstrukciókba történő bevitele szintén fokozza a dapA-gének elsődleges transzkripciójának szintjét. Az ilyen szekvenciák közé tartoznak a virális eredetű erősítőszekvenciák, mint például a 35S-promoterben található erősítőszekvencia [Odell és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 10, 263 (1988)], az opingénekből származó erősítőszekvenciák [Fromm és munkatársai: Plánt Cell 1, 977 (1989)], valamint az egyéb forrásokból származó - a találmány szerinti nukleinsavfragmenssel működőképesen kapcsolódó promoteibe helyezve fokozott transzkripciót eredményező - erősítőszekvenciák.

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában különösen előnyösen alkalmazható a βkonglicinin α’-alegységét kódoló génből izolált DNSszekvencia-elem, amely egy konstitutív promoter számára negyvenszeres magspecifikus erősítést biztosít [Chen és munkatársai: EMBO J. 7, 297 (1988); Chen és munkatársai: Dev. Génét. 10, 112 (1989)]. A szakember - transzgenikus növényekben a promoterrel erősített magspecifikus expresszió kialakítása érdekében - könnyen izolálhatja (és bármely gén promoterrégiójába) inszertálhatja ezt az elemet. Ha ezt az elemet olyan magspecifikus génbe inszertáljuk, amely a β-kongliciningéntől eltérő időben expresszálódik, a transzgenikus növényekben a magfejlődés ideje alatt hosszabb időtartamú expresszió következik be.

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában bármilyen - poliadenilációs szignált biztosítani képes - 3’ nemkódoló régió, illetve egyéb, a dapAkódolórégiók pontos expressziójához szükséges szabályozószekvencia is alkalmazható. Az ilyen 3'-szekvenciák közé tartozik a különböző tartalékproteineket kódoló gének 3’-vége, mint például a bab phaseolingénjének 3’-vége, a szójabab β-konglicinin-génjének 3’vége, a virális génekből származó 3’-végek, mint például a 35S- vagy 19S-karfiolmozaikvírus-transzkriptumok 3’-vége, az opinszintézisgének 3’-vége, a ribulóz-l,5-difoszfát-karboxiláz-gén vagy a klorofilla/b-kötőprotein-gén 3’-vége, illetve az egyéb forrásokból származó 3’-végszekvenciák, amelyek nukleinsavszekvenciájukban - a promoter/kódolórégió kombináció (amelyhez működőképesen kapcsolódnak) megfelelő expresszióját eredményező - szabályozóinformációkat hordoznak. A szakirodalomban számos példa található a különböző 3’ nemkódoló régiók alkalmazhatóságára [lásd: pl.: Ingelbrecht és munkatársai: Plánt Cell 1, 671 (1989)].

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során a proteinek megfelelő expresszálása érdekében a dapA-kódolószekvenciához - kívánt esetben intracelluláris lokalizációért felelős szekvenciákat kódoló DNS-szekvenciákat adhatunk. Ismeretes, hogy a növényi aminosav-bioszintézist szabályozó enzimek a kloroplasztiszokban lokalizálódnak, így kloroplasztiszspecifikus szignálszekvenciával együtt szintetizálódnak. A baktériumproteineknek (mint például a Corynebacterium-OHDPS-nek) nincsenek ilyen szignáljai, következésképpen, a dapA-kódolószekvenciához kloroplasztisz-tranzitszekvencia kapcsolható. Az előnyös kloroplasztisz-tranzitszekvenciák közé tartozik, kétszikű növényekben történő alkalmazás esetén, a szójababból származó ribulóz-l,5-difoszfát karboxiláz kis alegysége [Berry-Lowe és munkatársai: J. Mól. Appl. Génét. 1, 483 (1982)], egyszikű növényekben történő alkalmazás esetén pedig a kukoricából származó ribulóz1,5-difoszfát karboxiláz kis alegysége [Lebrun és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 15, 4360 (1987)]. dapA-Kiméragének bevitele növényekbe

Egy DNS-szekvencia magasabb rendű növények sejtjeibe történő bevitelére (vagyis az ilyen sejtek transzformálására) különböző eljárások állnak rendelkezésre, (lásd: 0295959A2 és 0138341Al számú EPO közzétételi irat). Az ilyen eljárások közé tartoznak az Agrobacterium fajok Ti- és Ri-plazmidjain alapuló transzformálóvektorok alkalmazásával végzett eljárások. Különösen előnyösen alkalmazhatók az ilyen vektorok biner típusai. A Ti-eredetű vektorok különféle (egyszikű és kétszikű) magasabb rendű növények - például szójabab, gyapot és repce - transzformálásához alkalmazhatók [Pacciotti és munkatársai: Bio/Technology 3, 241 (1985): Byme és munkatársai: Plánt Cell, Tissue and Organ Culture 8, 3 (1987); Sukhapinda és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 8, 209 (1987); Lorz és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 199, 178 (1985); Potrykus: Mól. Gén. Génét. 199, 183 (1985)].

A találmány szerinti kiméragének - a növényekbe történő bevitel érdekében - biner vektorokba inszertálhatók (lásd: 6-12. példák). A vektorok azAgrobacterium tumefaciens biner Ti-plazmidvektor-rendszer részét képezik [Bevan: Nucl. Acids Rés. 12, 8711 (1984)].

A szakemberek számára egyéb transzformálási eljárások is ismertek, mint például az idegen DNS-konstrukciók közvetlen felvétele [lásd: 0295959A2 számú EPO közzétételi irat], az elektroporációs technikák [lásd: Fromm és munkatársai: Natúré (London) 319, 791 (1986)], valamint a nukleinsavkonstrukciókkal bevont fémrészecskékkel végzett nagy sebességű lövedékbombázási technika [lásd: Kline és munkatársai: Na9

HU 222 085 Bl tűre (London) 327, 70 (1987); és 4,945,050 számú egyesült államokbeli szabadalom]. A sejtek - transzformálásuk után - ismert módszerekkel regenerálhatok.

Különösen jelentősek a gazdasági szempontból jelentős terménynövények idegen génekkel végzett transzformálásának utóbbi időkben leírt eljárásai, például a repce [DeBloxk és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 694 (1989)], napraforgó [Everett és munkatársai: Bio/Technology 5, 1201 (1987)], szójabab [McGrabe és munkatársai: Bio/Technology 6, 923 (1988); Hinchee és munkatársai: Bio/Technology 6, 915 (1988); Chee és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 1212 (1989); Christou és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7500 (1989); 0301749A2 számú EPO közzétételi irat], és a kukorica esetében [Gordon-Kamm és munkatársai: Plánt Cell 2, 603 (1990); Fromm és munkatársai: Biotechnology 8, 833 (1990)].

A találmány szerinti kiméragéneket a nagy sebességű lövedékbombázásos technikával történő bevitel érdekében megfelelő vektorokba inszertálhatjuk (lásd: 6. példa).

dapA-Kiméragének expresszálása repce-, szójabab- és kukoricanövényekben

A dapA-kiméragének magvakban lejátszódó expressziójának vizsgálata, és az expresszióból a magvak aminosavtartalmára utaló következtetések levonása érdekében - az 5. vagy 6. példában leírtak szerint vagy más, alkalmas eljárással - maglisztet készíthetünk. A maglisztet - kívánt esetben -, például hexános extrakcióval, részlegesen vagy teljesen zsírtalaníthatjuk. A lisztből proteinkivonatokat készíthetünk, melyeket DHDPS-enzimaktivitásra vizsgálhatunk. Más lehetőség szerint, a DHDPS-protein jelenlétét a szakemberek számára jól ismert eljárásokkal immunológiailag is tesztelhetjük. Csaknem valamennyi transzformáns expresszálta az idegen DHDPS-proteint (lásd: 5., 6. és 13. példa). A magvak szabad aminosav-összetételének mérése érdekében a szabad aminosavakat kivonhatjuk a lisztből, és a szakemberek számára ismert eljárásokkal vizsgálhatjuk (az alkalmas eljárásokat illetően lásd: az 5. és 6. példát).

A DHDPS-proteint expresszáló transzformáns repcenövények magjaikban a szabad lizinszint több mint százszoros növekedését figyeltük meg. A nagyobb mennyiségű DHDPS-proteint expresszáló transzformánsok és a nagyobb mennyiségű szabad lizint tartalmazó transzformánsok között egyenes összefüggést tapasztaltunk. A transzformánsokban a szabad lizin felhalmozódása nem volt nagyobb szintű a lizinre nem érzékeny AKenzim és a lizinre nem érzékeny DHDPS együttes expressziója esetében, mint a lizinre nem érzékeny DHDPS egyedüli expressziója esetén. Ennek megfelelően, a repcében a lizinre nem érzékeny DHDPS magvakban bekövetkező expressziója szükséges és elégséges feltétele a szabad lizinszint nagymértékű fokozódásának. A fokozott szabad lizinszintet mutató valamennyi transzformált vonal esetében nagy mennyiségű (lizinkatabolizmusra utaló) α-amino-adipinsav jelenlétét figyeltük meg.

Az érett repcemagvak teljes aminosav-összetételének mérése érdekében zsírtalanított lisztet analizáltunk (lásd: 5. példa). A magvakban a relatív aminosavszinteket a lizin összes aminosavhoz viszonyított százalékos arányaként hasonlítottuk össze. A legmagasabb szintű expressziót mutató vonalakban a magvak lizinszintjének csaknem kétszeres emelkedését figyeltük meg, ami azt jelenti, hogy a magvakban a lizin az összes aminosavtartalom kb. 12%-át teszi ki.

szójabab-transzformáns közül 21 expresszálta a DHDPS-proteint. Az e transzformánsokból származó egyes magvak analízise kiváló összefüggést mutatott a GUS-transzformációs-markergén és a DHDPS expressziója között. Ez azt jelenti, hogy a GUS- és a DHDPS-gén a szójababgenom azonos helyére integrálódott.

A Coryneöacten'Mffi-DHDPS-proteint expresszáló transzformánsok és a nagyobb mennyiségű szabad lizint tartalmazó transzformánsok között kiváló összefüggést találtunk. A Corynebacterium-DHDPS-t expresszáló magvakban a szabad lizinszint 20-120-szoros növekedését figyeltük meg.

A transzformánsokból (melyekben a transzgének egyedi lokuszként szegregálódtak) származó egyes magvak szabad lizinszintjének vizsgálatával kimutattuk, hogy a szabad lizinszint emelkedése a magvak kb. 1/4 részénél lényegesen magasabb szintű volt. Mivel várható, hogy a magvak 1/4 része a transzgénre nézve homozigóta, valószínű, hogy a magasabb lizinszintet mutató magvak a homozigóták. Ez azt is jelenti, hogy a szabad lizinszint fokozódásának mértéke a DHDPS-gén kópiaszámától függ, következésképpen, a lizinszint tovább növelhető, ha két különböző transzformánsból hibrideket hozunk létre, és olyan utódokat nyerünk, amelyek mindkét transzgén lokuszra homozigóták, s ezáltal a DHDPS-gén kópiaszáma kettőről négyre nő.

A nagy mennyiségű lizint tartalmazó magvakban nagy mennyiségű (a lizinkatabolizmusra utaló) szacharopin jelenlétét figyeltük meg. Ennek megfelelően, a lizinkatabolizmus - lizin-ketoglutarát-reduktáz inaktiválásával történő - megakadályozásával tovább fokozhatjuk a magvakban a szabad lizin felhalmozódását. Más lehetőség szerint, a lizin egy pepiidbe vagy nagy lizintartalmú proteinbe történő beépítése meggátolhatja a lizin katabolizmusát, és a magvakban a lizin felhalmozódásának fokozódását eredményezheti.

A Corynebacterium-DHDPS-proteint expresszáló magvakban jelentős mértékben emelkedett az összes lizinszint; a nem transzformált kontroll-lizin szintjéhez képest 10-260%-os emelkedést mutató magvakat figyeltünk meg. A DHDPS - lizinre nem érzékeny aszpartátkináz-enzimmel együttes expresszálása a lizinszint több mint 400%-os emelkedését eredményezte, ami azt jelenti, hogy ezek a magvak sokkal több lizint tartalmaznak, mint a korábbi szójababmagvak bármelyike.

Kukoricamagvakban megfigyeltük a Corynebacterz'u/n-DHDPS-protein expresszióját, melyet embrióban lejátszódó expresszió esetében a kukorica-globulin-1promoter, endospermiumban lejátszódó expresszió esetében pedig a kukorica-glutelin-2-promoter irányított. A globulin-1-promoter irányítása alatt Corynebacte10

HU 222 085 Β1 rzuzn-DHDPS-t expresszáló magvakban a szabad lizinszint a kontrollmagvakban tapasztalható (szabad aminosavakra vonatkoztatott) 1,4%-ról 15-27%-ra emelkedett. A glutelin-2-promoter irányítása alatt Corynebacterium-DHDPS-t expresszáló magvakban a szabad lizinszint kisebb mértékű emelkedését tapasztaltuk. Ennek megfelelően, a lizinszint fokozása érdekében a DHDPS-enzimet előnyösebb az embrióban, mintsem az endospermiumban expresszálni. A nagy mennyiségű lizint tartalmazó magvakban (lizinkatabolizmusra utaló) szacharopin jelenlétét figyeltük meg. A globulin-1promoter irányítása alatt Corynebacterium-DHDPS-t expresszáló magvakban a szabad lizin fokozott mértékű felhalmozódása elégséges volt ahhoz, hogy a magvak összes lizintartalmának jelentős (35-130%-os) növekedését eredményezze.

Növényi lizin-ketoglutarát-reduktáz-gén izolálása

A szabad lizin nagyobb mértékű felhalmozása érdekében kívánatos lehet a lizinkatabolizmus megakadályozása. Bizonyítékok igazolják, hogy a növényekben a lizin katabolizmusa a szacharopin-reakcióúton keresztül történik. E reakcióút első enzimatikus bizonyítékát fejlődő kukoricamagvak éretlen endospermiumában a lizinketoglutarát-reduktáz (LKR)-aktivitás kimutatása szolgáltatta [Arruda és munkatársai: Plánt Physiol. 69, 988 (1982)]. Az LKR a lizinkatabolizmus első lépését, vagyis az L-lizin - α-ketoglutaráttal kofaktorként NADH alkalmazásával - szacharopinná történő kondenzációját katalizálja. Kukoricában az LKR-aktivitás az endospermium fejlődésének beindulásától kezdve erőteljesen fokozódik; kb. a beporzás utáni 20. napon maximumot ér el, majd csökken [Arruda és munkatársai: Phytochemistry 22, 2687 (1983)]. A lizin lebomlásának megakadályozása érdekében kívánatos lehet az LKR-aktivitás vagy -expresszió csökkentése. Ezt az LKR-gén klónozásával, az LKR együttes szuppresszálásához kiméragén előállításával vagy az LKR számára antiszensz RNS expresszálását irányító kiméragén előállításával (és az előállított kiméragént transzformációval növényekbe juttatva) valósíthatjuk meg.

Több eljárás is ismert növényi LKR-gén klónozására. A protein kukoricaendospermiumból tisztítható [lásd: Brochetto-Braga és munkatársai: Plánt Physiol. 98, 1139 (1992)], és antitestek kialakításához alkalmazható, s az így kapott antitesteket cDNS expressziós könyvtár LKR-klónokra történő szkrinelésére használhatjuk. Más módon, a tisztított proteint felhasználhatjuk a protein (vagy a proteázzal kapott belső peptidfragmensek) N-terminálisának aminosavszekvenciája meghatározására. Az aminosavszekvencia alapján degenerált oligonukleotidpróbákat állíthatunk elő, melyeket hibridizációval növényi cDNS- vagy genomiális DNSkönyvtár szkríneléséhez alkalmazhatunk. Egy másik eljárás során olyan E. coli törzset alkalmazunk, amely 20 pg/ml L-lizint tartalmazó szintetikus tápközegben nem képes növekedni. Ebben a törzsben a teljes hosszúságú LKR-cDNS expressziója - a lizinkoncentráció csökkentésével - visszavonja a növekedés gátlását. Egy alkalmas E. coli törzs kialakítását, és e törzs - lizinrezisztens növekedést eredményező kiónok növényi cDNS-könyvtárból történő szelektálásában való - felhasználását a 7. példában írjuk le.

Az LKR-gén expressziójának transzformált növényekben történő blokkolása érdekében - az LKR-gén vagy - génfragmens bármilyen, fentebb leírt növényi promoterszekvenciához történő kapcsolásával - egy LKR-gén koszuppressziójához tervezett kiméragént állíthatunk elő (5,231,020 számú egyesült államokbeli szabadalom). Más módon - az LKR-gén vagy génfragmens bármilyen, fentebb leírt növényi promoterszekvenciához fordított orientációban történő kapcsolásával - az LKR-gén egésze vagy egy része számára antiszensz RNS expresszálásához tervezett kiméragént hozhatunk létre EPO 140308 számú európai szabadalmi leírás (1985. 05. 08.). A koszuppresszióhoz tervezett kiméragének, illetve az antiszensz kiméragének egyaránt transzformáció útján vihetők be a növényekbe. Azokat a transzformánsokat választjuk ki, amelyekben az endogén LKR-gén expressziója csökkent szintű vagy megszűnt.

A kiméragének előállításához előnyösen alkalmazható promoterek közé tartoznak a magspecifikus promoterek. A szójabab, repce és más kétszikű növények esetében a bab phaseolingénjéből, a szójabab β-kongliciningénjéből, gliciningénjéből, Kunitz-tripszininhibitor-génjéből vagy a repce napingénjéből származó erős, magspecifikus promoterek alkalmazhatók előnyösen. A kukorica és más egyszikű növények esetében erős endospermiumspecifikus promoter, például a 10 kD-os vagy a 27 kD-os zeinpromoter alkalmazható előnyösen.

Az LKR-kiméragének bármelyikét tartalmazó transzformált növények a fentebb leírt eljárásokkal nyerhetők. Annak érdekében, hogy olyan transzformált; növényeket nyerjünk, amelyek az LKR koszuppressziójához vagy antiszensz LKR kialakításához tervezett kiméragént, valamint lizinre nem érzékeny DHDPS-t kódoló kiméragént expresszálnak, a koszuppressziós vagy antiszensz LKR-gént lizinre nem érzékeny DHDPS-t kódoló kiméragénhez kapcsolhatjuk, és a két gént transzformáció útján bevisszük a növényekbe. Egy másik megoldási mód szerint az LKR koszuppressziójához vagy antiszensz LKR-hez tervezett kiméragént olyan, korábban transzformált növényekbe vihetjük be, amelyek lizinre nem érzékeny DHDPS-t expresszálnak; vagy a koszuppressziós vagy antiszensz LKR-gént normális növényekbe is bevihetjük, és a kapott transzformánsokat lizinre nem érzékeny DHDPS-t expresszáló növényekkel keresztezhetjük.

Nagy lizintartalmú polipeptidek tervezése

Kívánt esetben előnyös lehet, ha a termelődött nagy mennyiségű lizint lebomlásnak ellenálló formává alakítjuk, például oly módon, hogy di-, tri- vagy oligopeptidbe, illetve nagy lizintartalmú tartalékproteinbe foglaljuk. Nagy lizintartalmú természetes proteinek nem ismeretesek.

A találmány tárgyát képezi az in vivő expresszálható, nagy lizintartalmú magi tartalékproteinekként szolgáló polipeptidek tervezése. A polipeptidek aminosavakból álló lineáris polimerek, melyekben az

HU 222 085 Β1 egyik aminosav α-karboxilcsoportja kovalensen kötődik a láncban következő aminosav a-aminocsoportjához. A molekula végleges konformációját a láncban lévő aminosavak egymás közötti, illetve a környező oldószerrel kialakult, nem kovalens kölcsönhatások határozzák meg. Egy stabilan feltekeredett polipeptidlánc tervezésekor elektrosztatikus erőket, hidrogénkötéseket, Van dér Waals-erőket, hidrofób kölcsönhatásokat, és az egyes aminosavak konformációs elsőbbségét kell figyelembe venni [lásd: pl.: Creighton: „Proteins, Structures and Molecular Properties”, W. H. Freeman and Company, New York, 133-197. old. (1984); vagy Schulz és munkatársai: „Principles of Protein Structure”, Springer Verlag, New York, 27-45. old. (1979)]. A kölcsönhatások száma és komplexitása azt sugallja, hogy a tervezést - ahol lehetséges - természetes proteinmodellek felhasználásával segíthetjük.

A találmány szerinti megoldás értelmében kialakított szintetikus tartalékproteineket (SSP) olyan polipeptidekként valósítottuk meg, amelyekben lehetőség nyílik arra, hogy a növényi magvakban lévő proteinek átlagos lizinszintjéhez képest fokozott mennyiségű lizint tartalmazzanak. A lizin fiziológiai pH-η töltéssel rendelkező aminosav, ezért leggyakrabban a proteinmolekulák felszínén található [Chotia: Journal of Molecular Biology 105, 1 (1976)]. A lehető legnagyobb lizintartalom elérése érdekében a találmány szerinti szintetikus tartalékproteinek számára nagy felület/térfogatarányt mutató molekulaalakot választunk. A rendelkezésre álló lehetőségek közül (a legtöbb proteinre általánosan jellemző globuláris alakot kinyújtva pálcikaszerű, hosszúkás szerkezet kialakítása vagy a globuláris alak lelapításával korongszerű szerkezet kialakítása) az előbbi konfigurációt választjuk, mivel a fibrilláris proteinek csoportjában a hosszú, pálcikaszerű proteinek több természetes modellje található [Creighton: „Proteins, Structures and Molecular Properties”, W. H. Freeman and Company, New York, 191. old. (1984)].

A szuperhélix-szerkezetű proteinek a fibrilláris proteinek részletesen tanulmányozott alcsoportját képezik [lásd: Cohen és munkatársai: Trends Biochem. Sci. 11, 245 (1986)]. A természetben fellelhető példák közé tartoznak az α-keratinok, a paramiozin, a könnyű meromiozin és a tropomiozin. Ezek a proteinmolekulák két párhuzamos α-hélixből állnak, melyek balmenetes szuperhélixben egymásra csavarodnak. A szuperhélixben a csavarmenetek ismétlődési távolsága 140 angström (szemben az egyszeres α-hélix csavarmenetei közötti 5,4 angström távolsággal). A szuperhelikális szerkezet a két α-hélix tengelye között csekély (10°-os) elhajlást okoz.

Egy szuperhélixben az egyes α-hélixek egy csavarmenetére 3,5 aminosav jut, ami a szuperhélix tengelyére vonatkoztatva pontosan hét aminosavas periodicitást jelent (lásd: 1. ábra). A polipeptidláncban - a hélix tengelyéhez képest - minden hetedik aminosav azonos helyet foglal el. A találmány szerinti heptádegységben a hét helyet (d, e, f, g, a, b, c) jelöléssel azonosítjuk (lásd:

1. és 2A. ábra). Ez megfelel a szuperhélixekkel kapcsolatban hagyományosan alkalmazott jelölésnek.

A heptád „a” és „d” aminosava a primer szekvenciában 4,3 ismétlődési mintázatot követ, és az egyik a-hélix egyik oldalán helyezkednek el (lásd: 1. ábra). Amennyiben egy α-hélix egyik oldalán elhelyezkedő aminosavak mindegyike apoláris, a hélixnek ez az oldala hidrofób, és más hidrofób felületekkel, például, egy másik, hasonló hélix apoláris oldalával fog asszociálódni. Amikor két hélix úgy dimerizálódik, hogy hidrofób oldaluk egymás mellé rendeződik, szuperhélixszerkezet jön létre (lásd: 2A. ábra).

A szuperhélixet képező egyes alfa-hélixek külső oldalán elhelyezkedő aminosavak (b, c, e, f, g) a természetes szuperhélixekben - a globuláris proteinekben a szabad és beágyazott típusú gyökök várt mintázata szerint - rendszerint polárisak [Schulz és munkatársai: „Principles of Protein Structure”, Springer Verlag, New York, 12. old. (1979); Talbot és munkatársai: Acc. Chem. Rés. 15, 224 (1982); Hodges és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 256, 1214 (1981)]. A töltéssel rendelkező aminosavak a szemközti láncok „e” és „g”’, illetve „g” és „e”’ helyei között néha sóhidakat képeznek (lásd: 2A. ábra).

Ilyenformán, két amfipatikus hélixet (mint amilyen az 1. ábrán látható) az „a” és ,,a’”, illetve a „d” és „d”’ aminosavak közötti hidrofób kölcsönhatások, valamint az „e” és ,,g’”, és/vagy a „g” és „e”’ aminosavak közötti sóhidak tartanak együtt. A szuperhélixben a hidrofób aminosavak elhelyezkedése fenntartja a láncok illeszkedését. Az alfa-helikális láncok csupán néhány csavarulatából álló, rövid polipeptidek esetében a hélixek tengelyei közötti 10°-os elhajlás elhanyagolható, és a két lánc párhuzamosnak tekinthető (lásd: 2B. ábra).

A tudományos irodalomban számos szintetikus szuperhélixet írtak le [Lau és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 259, 13253 (1984); Hodges és munkatársai: Peptide Research 1, 19 (1988); DeGrado és munkatársai: Science 243, 622 (1989); O’Neil és munkatársai: Science 250, 646 (1990)]. Bár ezek a polipeptidek - méretüket tekintve - változók, Lau és munkatársai azt találták, hogy 29 aminosav elegendő volt a szuperhélixet kialakító dimerizációhoz [Lau és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 259, 13253 (1984)]. A találmány szerinti polipeptideket - a konformációs stabilitás érdekében - 28 vagy több aminosavat tartalmazó láncokból állítottuk össze.

A találmány szerinti polipeptideket úgy terveztük, hogy vizes környezetben szuperhelikális motívummal dimerizálódjanak. A szuperhelikális konformáció stabilitása érdekében hidrofób és elektrosztatikus kölcsönhatásokat alkalmaztunk. A legtöbb apoláris aminosav az „a” és „d” helyzetben található, miáltal a hélix tengelyével párhuzamosan egy hidrofób sáv jön létre, amely a dimerizációs felületet képezi. A dimerizáció helyigény miatti akadályozásának elkerülése, illetve a stabil szuperhélixszerkezet kialakulásának elősegítése érdekében a dimerizációs felület mentén nem helyezünk el nagyméretű aminosavakat.

Az utóbbi években néhány cikkben felvetették annak lehetőségét, hogy az „a” és „d” helyzetben lévő metionin a „leucin cipzár alcsoportban” destabilizáló ha12

HU 222 085 Bl tást gyakorol a szuperhélixre [Landschulz és munkatársai: Science 243, 1681 (1989); és Hu és munkatársai : Science 250, 1400 (1990)], ennek ellenére, az SSP-polipeptidek hidrofób felületén leucin helyett metionint alkalmazunk. A metionin és a leucin - molekulaalakjukat tekintve - hasonlóak (3. ábra). Bebizonyítottuk, hogy a hidrofób magban a metionin által esetlegesen okozott destabilizáció kiegyenlített azokban a szekvenciákban, ahol a hélix minden egyes lehetséges helyzetében (vagyis heptádonként két helyen) sóhidak (e-g’ és g-e’) alakulnak ki.

A polipeptidben olyan mértékben csökkentettük a kiegyenlítetlen töltések mennyiségét, amely még elfogadható a nagy lizintartalmú polipeptid kialakítása szempontjából. Ez - a polipeptidek in vivő expresszálása esetén - segíthet megakadályozni a szintetikus tartalékproteinek és más növényi proteinek közötti nemkívánatos kölcsönhatásokat.

A találmány szerinti polipeptideket úgy terveztük, hogy spontán módon, meghatározott, konformációs szempontból stabil szerkezetben (alfa-helikális szuperhélixben) „hajtogatódjanak” össze (az elsődleges szerkezetre vonatkozó minimális megszorításokkal). Ez lehetővé teszi, hogy a szintetikus tartalékproteinek speciális, egyedi igényekhez legyenek alakíthatók. Az ismétlődő egységet alkotó heptád „b”, „c” és „f helyein bármely aminosav legfeljebb 1/7 gyakorisággal fordulhat elő. Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti szintetikus tartalékproteinekbe legfeljebb 43%-os arányban építhetők be az esszenciális aminosavak izoleucin, leucin, lizin, metionin, treonin és valin alkotta csoportjából származó aminosavak, éspedig legfeljebb 14%-os arányban építhetők be az esszenciális aminosavak fenil-alanin, triptofán és tirozin alkotta csoportjából származó aminosavak.

Az SSP-polipeptidekben csak a metionin, leucin, izoleucin, valin vagy treonin helyezkedik el a hidrofób magban. Ezenfelül, SSP-polipeptidekben az „e”, „g”, illetve „e”’ és „g”’ helyeken olyan aminosavaknak kell lenni, amelyek az SSP-dimer két polipeptidlánca között vonzó elektrosztatikus kölcsönhatást biztosítanak (ami az SSP-polipeptideket dimerekként még stabilabbá teszi).

A találmány szerinti szintetikus tartalékproteinek a lehetséges szuperhelikális polipeptidek egy adott alcsoportját képezik. Az itt leírt alkalmazásokban a vizes környezetben amfipatikus alfa-helikális konformációt felvevő polipeptidek közül nem mindegyik alkalmas.

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során alkalmazott SSP-polipeptideket az alábbi - korábbi munkánkból származó - szabályokkal definiáljuk.

A szintetikus polipeptid ,41” számú heptádegységet tartalmaz (d, e, f, g, a, b, c), mely heptádegységek azonosak vagy különbözők, és ahol „n” értéke legalább 4;

„a” és „d” jelentése, egymástól függetlenül,

Met, Leu, Val, Ile vagy Thr;

„e” és „g” jelentése, egymástól függetlenül, a

Glu/Lys, Lys/Glu, Arg/Glu, Arg/Asp, Lys/Asp,

Glu/Arg, Asp/Arg vagy Asp/Lys sav/bázis pár; és „b”, „c” és „f” jelentése, egymástól függetlenül, a Gly és Pro kivételével, bármilyen aminosav, és minden egyes heptádban a „b”, „c” és „f” aminosavak közül legalább kettő jelentése Glu, Lys, Asp,

Arg, His, Thr, Ser, Asn, Gin, Cys vagy Ala.

Nagy lizintartalmú polipeptideket kódoló kiméragének A fentiekben leírt polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák a genetikai kódszótár alapján tervezhetők meg. Amennyiben egy bizonyos aminosavhoz több kodon létezik, a növényekben lejátszódó transzláció szempontjából előnyös kodonokat kell kiválasztani. Az ilyen DNSszekvenciáknak megfelelő oligonukleotidokat „ABI” típusú DNS-szintetizáló készülék alkalmazásával szintetizálhatjuk, a komplementer szálnak megfelelő oligonukleotidokkal hibridizálhatjuk, majd ismert eljárásokkal plazmidvektorba inszertálhatjuk. A kódolt polipeptidszekvenciák úgy hosszabbíthatok meg, hogy a szintetikus génbe génsebészeti módszerekkel beépített restrikciós endonukleázos hasítási helyekre további, hibridizált oligonukleotidokat inszertálunk. A találmány szerinti, nagy lizintartalmú polipeptideket kódoló gének kialakításának néhány jellemző stratégiáját, valamint az előnyös megvalósítási módokban alkalmazott DNS- és aminosavszekvenciákat a 8. példában írjuk le.

Nagy lizintartalmú polipeptidet kódoló, szintetikus tartalékprotein-gén számára RNS-t expresszáló kiméragént úgy állíthatunk elő, hogy a gént a fentebb leírt növényi promoterszekvenciák bármelyikéhez, előnyösen magspecifikus promoterhez kapcsoljuk. A szójabab, repce és más kétszikű növények esetében a bab phaseolingénjéből, a szójabab β-kongliciningénjéból, glicingénjéből Kunitz-tripszininhibitor-génjéből vagy a repce napingénjéből származó erős, magspecifikus promoterek alkalmazhatók előnyösen. A kukorica és egyéb egyszikű növények esetében erős endospermiumspecifikus promoter (például a 10 kD-os vagy a 27 kD-os zeinpromoter) vagy erős embrióspecifikus promoter, például a globulin-l-promoter alkalmazható előnyösen.

A - nagy lizintartalmú polipeptidet kódoló, szintetikus - tartalékprotein-gént tartalmazó kiméragént expresszáló növények előállítása érdekében a növényeket a fentebb leírt eljárások bármelyikével transzformálhatjuk. Kiméra-SSP-gént és lizinre nem érzékeny DHDPS-t kódoló kiméragént egyaránt expresszáló növények előállítása érdekében az SSP-gént a lizinre nem érzékeny DHDPS-t kódoló kiméragénhez kapcsolhatjuk, és a két gént transzformáció útján vihetjük be a növényekbe. Más lehetőség szerint, a kiméra-SSP-gént korábban transzformált (lizinre nem érzékeny DHDPS-t expresszáló) növénybe vihetjük be, továbbá bevihetjük normális növénybe is, mely esetben a kapott transzformánsokat lizinre nem érzékeny DHDPS-t expresszáló növényekkel keresztezzük.

A lizinbioszintézis-géneket tartalmazó, transzformáit növények - nagy lizintartalmú proteint kódoló gént tartalmazó - transzformált növényekkel végzett keresztezésével kapott eredmények (lásd: 10. példa) azt bizonyítják, hogy a magvak összes lizintartalma e gének összehangolt expressziójával növelhető. Ez az eredmény különösen meglepő, mivel a hibridben vala13

HU 222 085 Β1 mennyi transzgén kópiaszáma csökkent. Várható, hogy a lizinszint tovább emelkedne, ha a bioszintézis-gének és a nagy lizintartalmú proteint kódoló gének mindegyike homológ lenne.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a példák segítségével mutatjuk be, melyekben a százalékos arányokat - hacsak másképpen nem jelezzük - tömeg%-ban adjuk meg.

1. példa

E. coli és Corynebacterium glutamicum-dapAgének izolálása

Az E. co/i-dapA-gén (ecodapA) klónozását, restrikciós endonukleázos térképezését és szekvenálását korábban leírták [Richaud és munkatársai: J. Bacteriol. 166, 297 (1986)]. A találmány szerinti megoldás céljaira a dapA-gént klónozott E. co/z'-DNS 3400 átfedő szegmenséből álló, Kohara, Akiyama és Isono által előállított, rendezett DNS-könyvtárból [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)], bakteriofág lambda-klónon kaptuk. A dapA-gén - E. coli géntérképen 53 percnél való - géntérképi elhelyezkedésének [Bachman: Microbiol. Rév. 47, 180 (1987)], a klónozott gén restrikciós endonukleázos térképének [Richaud és munkatársai: J. Bacteriol. 166, 297 (1986)], és az E. coli könyvtárban a klónozott DNS-ffagmensek restrikciós endonukleázos térképének [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)] ismeretében a dapA-gén lehetséges hordozójaként a 4C11- és 5A8-lamda-fágot [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)] választottuk ki. A fágokat ismert eljárással [lásd: „Current Protocols in Molecular Biology” szerk.: Ausubel és munkatársai, John Wiley and Sons, New York (1987)], gazdaként LE392 alkalmazásával [lásd: Sambrook és munkatársai : „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] különálló plakkokból, folyadéktenyészetben növesztettük. Fág DNS-t ismert eljárással [lásd: „Current Protocols in Molecular Biology” szerk.: Ausubel és munkatársai, John Wiley and Sons, New York (1987)], fenolos extrakcióval állítottunk elő. Mindkét fág hozzávetőleg 2,8 kb-os PstlDNSffagmenst tartalmazott, amely feltételezhetően a dapA-génből származott [Richaud és munkatársai: J. Bacteriol. 166, 297 (1986)]. A fragmenst az 5A8-fág emésztményéből izoláltuk, majd Pstl-gyel emésztett pBR322-vektorba inszertáltuk, miáltal a pBT427-plazmidot kaptuk.

A Corynebacterium-dopA-gétít (cordapA) az ATCC 13 032 deponálási számú törzs genomiális DNS-éből, polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazásával izoláltuk. A Corynebacterium-dapA-géa nukleotidszekvenciáját korábban leírták [Bonnassie és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 18, 6421 (1990)]. A szekvencia alapján a polimeráz-láncreakcióhoz olyan láncindító oligonukleotidokat tervezhettünk, amelyek lehetővé teszik a gént tartalmazó DNS-fragmens amplifikációját, és ugyanakkor - a gén startkodonjánál és közvetlenül stopkodonja után - egyedi Ncol, illetve EcoRI restrikciós endonukleázos helyeket adnak hozzá. Az alkalmazott láncindító oligonukleotidok a következők voltak:

1. azonosító számú szekvencia:

CCCGGGCCAT GGCTACAGGT TTAACAGCTA AGACCGGAGT AGAGCACT

2. azonosító számú szekvencia:

GATATCGAAT TCTCATTATA GAACTCCAGC TTTTTTC

A polimeráz-láncreakciót „Perkin-Elmer Cetus” reagenskészlet alkalmazásával (ugyanezen cég által gyártott PCR-készüléken), a forgalmazó útmutatásai alapján végeztük. A reakciótermék - agarózgélen futtatva és etídium-bromiddal festve - a Corynebacteritzzn-dapA-génre várt méretű (kb. 900 bázispár) erős DNS-sávot mutatott. A polimeráz-láncreakcióval kialakított fragmenst Ncol és EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztettük, és az ugyanezen enzimekkel emésztett pBT430-expressziós-vektorba inszertáltuk (lásd: 2. példa). A PCR-láncindítók - a transzlációs startkodonnál az Ncol-hely bevitelén kívül - a második kodon (szerint kódoló „AGC”-ről alanint kódoló ,,GCT”-re) változtatását is eredményezték. Számos olyan kiónt izoláltunk, amelyek aktív, lizinre nem érzékeny DHDPS-t expresszáltak (lásd: 2. példa), ami azt jelzi, hogy a második kodonnál az aminosavszubsztitúció nem befolyásolta az aktivitást. Az egyik kiónt FS766-nak neveztük el.

A polimeráz-láncreakcióval létrehozott Corynebacterium-dapA-gént hordozó NcoI/EcoRI-fragmenst pGEM-9Zf(-) fágemidvektorba (Promega) klónoztuk, egyszálú DNS-t alakítottunk ki, és ezt megszekvenáltuk. Ezt a szekvenciát a „Szekvencialista” 3. azonosító számú szekvenciájaként mutatjuk be.

A már említett második kodonban megfigyelhető eltérésektől eltekintve a szekvencia a 798. és 799. nukleotidok kivételével megegyezett a korábban közrebocsátott szekvenciával (a közrebocsátott szekvenciában ez a két nukleotid timin, illetve citozin, míg a 3. azonosító számú szekvenciában citozin, illetve timin). E változás eredményeként a szerint leucin helyettesíti. A két szekvenciában mutatkozó különbség oka ismeretlen; származhat a közrebocsátott szekvenciában lévő hibából, a gén izolálásához alkalmazott törzsek közötti különbségekből, illetve lehet egy, a polimeráz-láncreakció okozta hiba is, mely utóbbi valószínűtlennek tűnik, mivel legalább három, függetlenül izolált, polimeráz-láncreakcióval előállított dapA-gén esetében megfigyeltük. A szekvenciák e különbségének nincs észlelhető hatása a DHDPS-enzimaktivitásra (lásd: 2. példa).

2. példa

Az E. coli- és Corynebacterium-glutamicumdapA-gének magas szintű expressziója E. coli-ban Az E. co/z'-dapA-gén transzlációs kezdőkodonjához

- oligonukleotid irányította mutagenezissel - Ncolhelyet (CCATGG) inszertáltunk. A pBT427-plazmidban a dapA-gént hordozó 2,8 kb-os Pstl-DNS-fragmenst (lásd: 1. példa) a pTZ18R-fágemidvektor (Pharmacia) Pstl-helyére inszertáltuk, miáltal a pBT431-plazmidot kaptuk. A dapA-gén orientációja olyan volt, hogy a kódolószál az egyszálú fágemid-DNS-en helyezkedhetett el. Az oligonukleotid irányította mutagene14

HU 222 085 Bl zist „Muta-Gene” reagenskészlet (BioRad) alkalmazásával, a gyártó által megadott eljárás szerint, a következő mutagén-láncindítóval végeztük:

4. azonosító számú szekvencia:

CTTCCCGTGA CCATGGGCCA TC.

A feltételezett mutánsokat Ncol-hely jelenlétére vizsgáltuk, és az egyik plazmidról (pBT437) DNS-szekvenálással kimutattuk, hogy a mutáció környezetében a megfelelő szekvenciát tartalmazza. A transzlációs kezdőkodonnál az Ncol-hely beépítése a második - fenil-alanint kódoló - „TTC” kodont - valint kódoló „GTC” kodonra változtatta.

E. coli-ban a dapA-gének magas szintű expressziójának megvalósításához a bakteriális pBT430-expressziós-vektort alkalmaztuk. Ez az expressziós vektor a pET-3a [Rosenberg és munkatársai: Gene 56, 125 (1987)] származéka, amely a T7-RNS-polimeráz/T7promoter rendszert alkalmazza. A pBT430-plazmid előállítása érdekében a pET-3a-vektorban először - eredeti helyükön - megszüntettük az EcoRI- és a HindlIIhelyet. A pET-3a-vektor BamHI-helyére EcoRI- és HindlII-helyet tartalmazó oligonukleotidadaptort inszertáltunk, ezáltal a pET-3aM-plazmidot kaptuk, amely a gének expressziós vektorba történő inszertálásához újabb egyedi klónozóhelyeket tartalmaz. Ezután a transzlációs kezdőhelyen lévő Ndel-helyet - oligonukleotid irányította mutagenezissel - Ncol-hellyé alakítottuk. Ebben a régióban a pET-3aM DNS-szekvenciáját (5’-CATATGG) a pBT430-expressziós-vektorban 5’-CCCATGG-re változtattuk.

Az E. co/z'-dapA-gént a pBT437-plazmidból 1150 bp-os NcoI-HindlII fragmensként kivágtuk, és az Ncol- és HindlII-enzimmel emésztett pBT430-expressziós-vektorba inszertáltuk, miáltal a pBT442-plazmidot kaptuk. A Corynebacterium-dapA-gén expressziójához a 917 bp hosszúságú - pBT430-ba inszertált - NcoI-EcoRI fragmenst (3. azonosító számú szekvencia) alkalmaztuk (pFS766, lásd: 1. példa).

A magas szintű expresszió érdekében valamennyi plazmiddal E. coli BL21(DE3)-törzset [Studier és munkatársai: J. Mól. Bioi. 189, 113 (1986)] transzformáltunk. A tenyészeteket ampicillint (100 mg/1) tartalmazó LB-tápközegben, 25 °C-on növesztettük. 600 nm-nél mért, hozzávetőleg 1-es optikai denzitásértéknél a tenyészethez indukálószerként, 0,4 mM végkoncentrációban izopropil-tio-p-galaktozidot (IPTG-t) adtunk, és az inkubálást 25 °C-on 3 óra hosszat folytattuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és az eredeti tenyészet térfogata 1/20 (vagy 1/100) részének megfelelő térfogatú pufferben (50 mM NaCl, 50 mM trisz-Cl (pH=7,5) és 1 mM EDTA) újraszuszpendáltuk, és a kapott szuszpenziót -20 °C-on lefagyasztottuk. 1 ml-es fagyasztott adagokat 37 °C-on felolvasztottunk, és a sejtek feltárása érdekében (jeges vízfürdőben) ultrahangkezelést végeztünk. A kapott lizátumot 4 °C-on, percenként 15 000-es fordulatszámmal 5 percig centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és az üledéket a fenti puffer 1 ml-ében újraszuszpendáltuk.

A BL21(DE3)/pBT442, illetve BL21(DE3)/pFS766 (indukálás nélküli vagy IPTG-vel indukált) tenyészetek felülúszóit és üledékfrakcióit SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel analizáltuk. A „Coomasssie blue” festéssel láthatóvá vált fő protein molekulatömege - mindkét indukált tenyészet esetében - 32-34 kD volt, ami a DHDPS várt méretének felel meg. Még a nem indukált tenyészetekben is ez a protein volt a legszembetűnőbb termelődött protein.

Az IPTG-vel indukált BL21(DE3)/pBT442 tenyészetben a DHDPS-protein kb. 80%-a a felülúszóban volt, és a kivonatban található összes protein 10-20%át a DHDPS képviselte. Az IPTG-vel indukált BL21(DE3)/pFS766 tenyészetben a DHDPS-protein több mint 50%-a az üledékfrakcióban volt. Az üledékfrakció mindkét esetben 90-95% tiszta DHDPS-t tartalmazott, miközben más, különálló proteinek nem voltak jelen nagyobb mennyiségben, következésképpen, ezek a frakciók elég tiszták voltak az antitestek kialakításához. A 2-4 pg E. co/z'-DHDPS-t vagy CorynebacteriumDHDPS-t tartalmazó üledékfrakciókat 50 mM NaCl, 50 mM trisz-Cl (pH=7,5), 1 mM EDTA, 0,2 mM ditiotreitol és 0,2% SDS oldatában szolubilizáltuk, és a proteinek elleni nyúlantitestek kialakítása érdekében a „Hazelton Research Facility” intézetbe (310 Swampridge Road, Denver, PA 17517) küldtük.

A DHDPS-enzimaktivitást a következők szerint vizsgáltuk. Közvetlenül a felhasználás előtt vizsgálati elegyet készítettünk (10x1,0 ml-es Eppendorf-csőhöz

vagy 40x0,25 ml-es mikrotitertálcához). A vizsgálati
elegy összetétele:
2,5 ml	H2O;
0,5 ml	l,0Mtrisz-HCl(pH=8,0);
0,5 ml	0,1 M Na-piruvát;
0,5 ml	o-amino-benzaldehid (10 mg/1 koncentrációjú etanolos oldat);
25 pl	1,0 M DL-aszpartát-P-szemialdehid (ASA) (1,0 N sósavban);

	Eppendorf-cső (1,0 ml)	Mikrotitertálca (0,25 ml)
DHDPS vizsgálati elegy	0,40 ml	0,10 ml
Enzimkivonat+víz	0,10 ml	0,025 ml
10 mM L-lizin	5 μΐ v. 20 μΐ	1 μΐ v. 5 μΐ
1 (Inkubálás kívánt ideig 30 °C-on.) A reakció leállításához:
1,0 N sósav	0,50 ml	0,125 ml

Az elegy színét 30-60 percig hagytuk kifejlődni. A csapadékot Eppendorf-centrifugában lecentrifugáltuk. Vakpróbaként az optikai denzitást (OD) 540 nmnél, a 0. percnél olvastuk le. A mikrotitertálcás vizsgálat esetében egy üregben 0,2 ml-es aliquot OD₅₃₀-értékét olvastuk le.

Az indukált tenyészetek kivonatainak felülúszófrakciójában az E. co/Z-DHDPS-enzim specifikus aktivitása (az 1,0 ml térfogatban végzett vizsgálatban) percenként 50 OD₅₄₀-egység/mg protein volt. Az E. coliDHDPS érzékeny volt az L-lizin jelenlétére; az 50%-os gátlást kb. 0,5 mM koncentrációnál figyeltük meg. A Corynebacterium-DWiPS esetében az aktivitást az indukálás nélküli (és nem az indukált) tenyészetből ké15

HU 222 085 Β1 szített kivonat felülúszó-ftakciójában mértük. Az enzimaktivitás (a 0,25 ml térfogatban végzett vizsgálatban) percenként kb. 4 OD₅₃₀-egység/mg protein volt. Az E. co/i'-DHDPS-sel ellentétben, a CorynebacteriumDHDPS-t az L-lizin egyáltalán nem gátolta (még 70 mM koncentrációnál sem).

3. példa

Az E. coli-lysC-gén és a lysC (lizinre nem érzékeny

AKIII-at eredményező) mutációinak izolálása

Az E. coh-lysC-gén klónozásáról, restrikciós endonukleázos térképezéséről és szekvenálásáról korábban már beszámoltak [Cassan és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)]. A találmány szerinti megoldás céljaira a lysC-gént klónozott E. co/i-DNS 3400 átfedő szegmenséből álló, Kohara, Akiyama és Isono által előállított, rendezett DNS-könyvtárból [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)], bakteriofág lambda-klónon kaptuk. Ez a könyvtár a teljes E. colikromoszóma fizikai térképét adja, és a fizikai térképet a genetikai térképhez kapcsolja. A lysC-gén - E. coli géntérképen 90 percnél való - géntérképi elhelyezkedésének [Theze és munkatársai: J. Bacteriol. 117, 133 (1974)], a klónozott gén restrikciós endonukleázos térképének [Cassan és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 1052 (1986)], és az E. co/i'-könyvtárban a klónozott DNS-ffagmensek restrikciós endonukleázos térképének [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)] ismeretében a lysC-gén lehetséges hordozójaként a 4E5- és 7A4-lamda-fágot [Kohara és munkatársai: Cell 50, 595 (1987)] választottuk ki. A fágokat ismert eljárással [lásd: „Current Protocols in Molecular Biology” szerk.: Ausubel és munkatársai, John Wiley and Sons, New York (1987)], gazdaként LE392 alkalmazásával [lásd: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] különálló plakkokból, folyadéktenyészetben növesztettük. Fág-DNS-t ismert eljárással [lásd: „Current Protocols in Molecular Biology” szerk.: Ausubel és munkatársai, John Wiley and Sons, New York (1987)], fenolos extrakcióval állítottunk elő.

A gén szekvenciájából több, a lysC-génre utaló restrikciós endonukleázos fragmenst azonosítottunk, köztük egy 1860 bp-os EcoRI-Nhel fragmenst, egy 2140 bpos EcoRI-XmnI fragmenst és egy 1600 bp-os EcoRIBamHI fragmenst. E fragmensek mindegyikét kimutattuk mindkét fág-DNS-ben, ami azt bizonyítja, hogy ezek hordozták a lysC-gént. Az EcoRI-Nhel fragmenst izoláltuk és EcoRI-gyel és Nhel-gyel emésztett pBR322-plazmidba szubklónoztuk, miáltal egy ampicillinrezisztens, tetraciklinre érzékeny E. co/i-transzformánst kaptunk. A plazmidot pBT436-nak neveztük el.

A klónozott lysC-gén működőképességének megállapítása érdekében a pBT436-plazmidot (mindhárom E. coli AK-génjében mutációt tartalmazó) E. coli GiflOóMl-törzsbe („E. coli Genetic Stock Center” CGSC-5074 törzs) [Theze és munkatársai: J. Bacteriol. 117, 133 (1974)] transzformáltuk. E törzs AK-aktivitása teljesen hiányzik, így diamino-pimelátot (a lizin egyik kiindulási vegyülete, amely szintén kulcsfontosságú a sejtfal-bioszintézis szempontjából), treonint és metionint igényel. A transzformált törzsben valamennyi felsorolt tápanyagigény mérséklődött, ami azt bizonyítja, hogy a klónozott lysC-gén működőképes

ΑΚΙΠ-at kódolt.

A növesztő tápközeghez hozzávetőleg 0,2 mM koncentrációban a lizin (vagy diamino-pimelinsav, amely in vivő könnyen átalakul lizinné) hozzáadása gátolja a pBT436-plazmiddal transzformált GiflOóMl-törzs növekedését. A pBT436-plazmid szelekciójának fenntartásához - a GiflO6Ml-törzs növekedéséhez szükséges argininnal és izoleucinnal kiegészített - M9-tápközeget [lásd: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: a Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] alkalmaztunk. A szekvenálás elősegítése érdekében a publikált lysC-szekvencia alapján, egymástól kb. 200 bp távolságra elhelyezkedő, láncindító oligonukleotidokat szintetizáltunk. A pBT436-plazmidba klónozott, vad típusú lysC-gén (5. azonosító számú szekvencia) szekvenciája öt helyen tért el a publikált lysC-gén kódolószekvenciájától. Az öt eltérés közül négy egy-egy kodon harmadik nukleotidját érintette, és az AKIII-protein aminosavszekvenciájában nem okozott változást. Az ötödik eltérés az AKIII 58 aminosavát risztemről glicinre változtatta. Ezek az eltérések feltételezhetően a lysC-gén klónozásához alkalmazott törzsek különbségéből adódnak.

A lizinre nem érzékeny aszpartátkinázt kódoló három mutáns lysC-gén mindegyikének szekvenciája egyetlen nukleotidban különbözött a vad típusú szekvenciától, ami a proteinben egy aminosavas szubsztitúciót eredményezett. Az M2-mutáns az 5. azonosító számú szekvencia 954. helyén G—>A szubsztitúciót tartalmazott, ami a 318. aminosavat metioninról izoleucinra változtatta. Az M3- és M4-mutáns az 5. azonosító számú szekvencia 1055. helyén C-»T szubsztitúciót hordozott, ami a 352. aminosavat treoninról izoleucinra változtatta. Ilyenformán, a fenti aminosavszubsztitúciók bármelyike elégséges ahhoz, hogy az ΑΚΙΠ-enzimet érzéketlenné tegye a lizin által kiváltott gátlással szemben.

A lysC-gén transzlációs kezdőkodonjához Ncolhelyet (CCATGG) inszertáltunk, amihez a következő oligonukleotidokat alkalmaztuk:

6. azonosító számú szekvencia:

GATCCATGGC TGAAATTGTT GTCTCCAAAT TTGGCG

7. azonosító számú szekvencia:

GTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG.

Hibridizáláskor ezek az oligonukleotidok BamHI és Asp718 ragadós végeket tartalmaznak. A pBT436-plazmidot BamHI-gyel (amely a lysC-kódolószekvenciától „upstream” irányban hasít) és Asp718-cal (amely a kezdőkodontól „downstream” irányban, 31 nukleotid távolságra hasít) emésztettük. A hibridizálódott oligonukleotidokat a plazmidvektorhoz ligáltuk, és E. coli transzformánsokat kaptunk. Ezekből plazmid-DNS-t készítettünk, melyet - Ncol-hely jelenléte alapján - az oligonukleotidok inszerciójára szkríneltük. Az inszerció helyességének meghatározása érdekében egy Ncol-helyet

HU 222 085 Β1 tartalmazó plazmidot megszekvenáltunk, és ezt a plazmidot pBT457-nek neveztük el. Az oligonukleotid inszerciója - amellett, hogy a lysC-gén kezdőkodonjánál Ncol-helyet alakított ki - a második kodont, a szerint kódoló „TCT”-t, alanint kódoló „TCT”-re változtatta, azonban ez az aminosavszubsztitúció nem gyakorol látható hatást az AKIII enzimaktivitására.

A lysC-gént egy 1560 bp hosszúságú NcoI-EcoRI fragmensként kivágtuk a pBT457-plazmidból, és az Ncol-gyel és EcoRI-gyel emésztett pBT430-expressziós-vektorba inszertáltuk, miáltal a pBT461-plazmidot kaptuk. A mutáns lysCM4-gén expresszálásához a pBT461-plazmidot KpnI-gyel és EcoRI-gyel emésztettük (miáltal a lysC-gént a transzlációs kezdőkodontól „downstream” irányban kb. 30 nukleotid távolságra vágtuk ki), és a mutáns génekből származó, analóg KpnI-EcoRI fragmenseket a plazmidba inszertálva a pBT492-plazmidot kaptuk.

4. példa

Kiméra-dapA-gének kialakítása növényi magvakban lejátszódó expresszióhoz A bab (Phaseolus vulgáris) phaseolin nevű magi tartalékproteinjének β-alegységét kódoló gén promoteréből és terminátorából magspecifikus expressziós kazettát (4. ábra) alakítottunk ki [Doyle és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 9228 (1986)]. A phaseolinkazetta a phaseolin transzlációs kezdőkodonjától „uptream” (5’) irányban kb. 500 nukleotidot, és a phaseolin transzlációs stopkodonjától „downstream” irányban (3’) kb. 1650 nukleotidot foglal magában. Az 5’- és 3’-régió között helyezkedik el az Ncol-hely (amely magában foglalja az ATG transzlációs kezdőkodont), valamint az Smal-, KpnI- és Xbal-hely. A teljes kazettát HindlIIhelyek szegélyezik.

Ismert, hogy a növényi aminosavak bioszintézisét katalizáló enzimek a kloroplasztiszokban helyezkednek el, s ezért kloroplasztiszba irányító úgynevezett kloroplasztiszspecifikus szignálszekvenciával együtt szintetizálódnak. A bakteriális proteinek, mint például a DHDPS és AKIII, nem tartalmaznak ilyen szignált, így a kiméragénekben a dapA- és lysC-M4-kódolószekvenciához kloroplasztisz-tranzitszekvenciát (cts) kapcsoltunk. Ilyen cts-ként a szójababból származó ribulóz1,5-difoszfát karboxiláz kis alegységén alapuló cts-t alkalmaztuk [Berry-Lowe és munkatársai: J. Mól. Appl. Génét. 1, 483 (1982)]. A 8-11. azonosító számú szekvenciákként bemutatott oligonukleotidokat az alábbiakban leírtak szerint szintetizáltuk és alkalmaztuk.

Három kiméragént hoztunk létre, ezek a következők.

1. : phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’-régió;

2. : phaseolin-5’-régió/cts/ecodapA/phaseolin-3’-régió;

3. : phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3’-régió.

A 8. és 9. azonosító számú szekvenciaként bemutatott oligonukleotidokat - melyek a kloroplasztiszspecifikus szignálszekvencia C-terminális végét kódolják hibridizáltuk, miáltal Ncol-kompatibilis végeket kaptunk, majd a hibridizálódott oligonukleotidokat poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítottuk, és Ncol-gyel emésztett pBT461-plazmidba inszertáltuk. A megfelelő szekvencia megfelelő orientációban történő inszercióját DNS-szekvenálással ellenőriztük, és a pBT496-plazmidot kaptuk. A kloroplasztiszspecifikus szignálszekvencia N-terminális végét kódoló - 10. és 11. azonosító számú szekvenciaként bemutatott - oligonukleotidokat hibridizálva Ncol-kompatibilis végeket kaptunk, a hibridizálódott oligonukleotidokat poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítottuk, és Ncol-gyel emésztett pBT496-plazmidba inszertáltuk. A megfelelő szekvencia megfelelő orientációban történő inszercióját DNSszekvenálással ellenőriztük, és a pBT521-plazmidot kaptuk. E műveletek eredményeként a cts-t a lysC-génhez kapcsoltuk.

A cts lysC-M4-génhez történő kapcsolása érdekében a pBT521-plazmidot Sall-gyel emésztettük, és egy hozzávetőleg 900 bp-os DNS-fragmenst izoláltunk, amely a cts-t és a lysC N-terminális kódolórégióját tartalmazta. Ezt a fragmenst Sall-gyel emésztett pBT492plazmidba inszertáltuk, miáltal a lysC-M4 N-terminális kódolórégióját eredményesen helyettesítettük a cts-sel és a lysC N-terminális kódolórégiójával. Mivel a lizinérzéketlenséget eredményező mutáció nem a helyettesített fragmensben volt, az új plazmid (pBT523) a lysC-M4-génhez kapcsolt cts-t tartalmazta.

A lysC-M4-génhez kapcsolt cts-t és a 3’ nemkódoló szekvencia kb. 90 bázispáiját tartalmazó, 1600 bp-os Ncol-Hpal fragmenst izoláltuk és az - Ncol-gyel és Smal-gyel emésztett - magspecifikus expressziós kazettába (1. kiméragén) inszertáltuk, miáltal a pBT544plazmidot kaptuk.

Az expressziós kazettába történő inszerció előtt az ecodapA-gént úgy módosítottuk, hogy közvetlenül a transzlációs stopkodon után egy KpnI-helyet inszertáltunk. Erre a célra a 12. és 13. azonosító számú szekvenciaként bemutatott oligonukleotidokat szintetizáltuk:

12. azonosító számú szekvencia:

CCGGTTTGCT GTAATAGGTA CCA

13. azonosító számú szekvencia:

AGCTTGGTAC CTATTACAGC AAACCGGCAT G

A 12. és 13. azonosító számú oligonukleotidszekvenciát hibridizáltuk, miáltal az egyik végén Sphl-kompatibilis, a másik végén pedig HindlII-kompatibilis véget tartalmazó fragmenst kaptunk, amelyet SphI-gyel és HindlII-mal emésztett pBT437-plazmidba inszertáltunk. A megfelelő szekvencia inszercióját DNS-szekvenálással igazoltuk, és a pNT443-plazmidot kaptuk.

Agaróz-gélelektroforézissel pBT443-plazmidból származó, 880 bp-os - a teljes ecodapA-kódolórégiót tartalmazó - NcoI-KpnI fragmenst izoláltunk, melyet az Ncol-gyel és KpnI-gyel emésztett magspecifikus expressziós kazettába inszertáltunk, miáltal a pBT494plazmidot kaptuk. A 8-11. azonosító számú oligonukleotidszekvenciákat a fentebb leírtak szerint arra használtuk, hogy a magspecifikus expressziós kazettában az ecodapA-kódolórégióhoz cts-t kapcsoljunk, s ezáltal pBT520-plazmidban a 2. kiméragént kaptuk.

Agaróz-gélelektroforézissel pFS766-plazmidból származó, 870 bp-os - a teljes cordapA-kódolórégiót tartalmazó - NcoI-EcoRI fragmenst izoláltunk, és ezt a fragmenst az Ncol-gyel és EcoRI-gyel emésztett levél17

HU 222 085 Bl expressziós kazettába inszertáltuk, miáltal a pFS789plazmidot kaptuk. A cts cordapA-génhez történő kapcsolása érdekében - polimeráz-láncreakcióval teljes cts-t tartalmazó DNS-fragmenst állítottunk elő. Templát-DNS-ként a pBT544-plazmidot, láncindító oligonukleotidokként pedig a következő oligonukleotidokat alkalmaztuk:

14. azonosító számú szekvencia:

GCTTCCTCAA TGATCTCCTC CCCAGCT

15. azonosító számú szekvencia:

CATTGTACTC TTCCACCGTT GCTAGCAA

A polimeráz-láncreakciót Perkin-Elmer Cetus reagenskészlet alkalmazásával, szintén a Perkin-Elmer Cetus által gyártott PCR-készüléken, a forgalmazó útmutatásai szerint végeztük. A polimeráz-láncreakcióval kialakított 160 bp-os fragmenst a négy dezoxiribonukleotid-trifoszfát jelenlétében T4-DNS-polimerázzal kezeltük, miáltal tompa végű fragmenst kaptunk. A cts-fragmenst a cordapA-gén kezdőkodonját tartalmazó Ncol-helyre inszertáltuk, melyet előzőleg - az 5’-túlnyúló szálak feltöltése érdekében - a DNS-polimeráz „Klenow”-fragmensével kezeltünk. Az inszertált fragmens és a vektor/inszert kapcsolódások - DNSszekvenálás alapján - megfelelőnek bizonyultak.

Elektroforézis után agarózgélről cordapA-kódolórégióhoz kapcsolódott cts-t tartalmazó, 1030 bp-os NcolKpnl fragmenst izoláltunk, és ezt Ncol-gyel és Kpnlgyel emésztett magi phaseolin expressziós kazettába inszertáltuk, miáltal a 3. kiméragént tartalmazó pFS889plazmidot kaptuk.

5. példa

Repcenövény transzformálása phaseolinpromoter/cts/cordapA és phaseolinpromoter/cts/lysCM4 kiméragénnel

A 4. példában leírtak szerint előállított kiméragénkazettákat (phaseolin-5 ’-régió/cts/cordapA/phaseolin3 ’-régió; phaseolin-5 ’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3 ’régió; és phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin3’régió+phaseolin- 5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’régió) a biner pZS 199-vektorba (5/A ábra) inszertáltuk. A pZS 199-vektorban az NPT-II expresszióját a karfiolmozaikvírusból származó 35S-promoter irányítja.

A phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3’-régió kiméragén-kazettát oligonukleotidadaptorok alkalmazásával úgy módosítottuk, hogy a két végen a HindlII-helyeket BamHI-helyekké alakítsuk át. A génkazettát ezután 2,7 kb-os BamHI-fragmensként izoláltuk, és BamHI-gyel emésztett pZS 199-vektorba inszertáltuk, miáltal a pFS926-plazmidot (5B. ábra) kaptuk. Ez a biner vektor - a 35S/NPT-II/nos-3’ markergénnel azonos orientációban inszertálva - a phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3’-régió kiméragént tartalmazza.

A phaseolin-5 ’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3 ’-régió inszertálása érdekében a génkazettát 3,3 kb-os EcoRI-Spel fragmensként izoláltuk, és EcoRI-gyel és Xbal-gyel emésztett pZS 199-vektorba inszertáltuk, miáltal a pBT593-plazmidot kaptuk. Ez a biner vektor - a 35S/NPT-II/nos-3’ markergénnel azonos orientációban inszertálva - a phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’-régió kiméragént tartalmazza.

A két kazetta egyesítése érdekében a pBT593-plazmid EcoRI-helyét - oligonukleotidadaptorok alkalmazásával - BamHI-hellyé alakítottuk, az így kapott vektort BamHI-gyel hasítottuk, és a phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3’-régió génkazettát 2,7 kb-os BamHIfragmensként izoláltuk, majd az inszerció után a pBT597-plazmidot kaptuk. Ez a biner vektor mindkét kiméragént (phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/ phaseolin-3’régió és phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/ phaseolin-3’-régió) a 35S/NPT-II/nos-3’-régió markergénnel azonos orientációban inszertálva tartalmazza.

A Brassica napos „Westar’-változatát úgy transzformáltuk, hogy csíranövénydarabokat a megfelelő biner vektort hordozó, ártalmatlanná tett Agrobacterium tumefaciens LBA4404-törzzsel tenyésztettük együtt.

A B. napos magvakat 10% „Chlorox” és 0,1% SDS elegyében 30 percig keverve sterilizáltuk, majd steril desztillált vízzel alaposan leöblítettük. A magvakat 30 mM CaCl₂-ot és 1,5% agart tartalmazó steril táptalajon csíráztattuk, majd 24 °C-on hat napig sötétben növesztettük.

A növénytranszformációhoz alkalmazott Agrobacterzum-folyadéktenyészeteket 28 °C-on, egy éjszakán keresztül - 100 mg/1 kanamicint tartalmazó - „Minimál A” tápközegben növesztettük. A baktériumsejteket centrifugálással leülepítettük, majd 100 μΜ „acetosyringone”-t tartalmazó folyékony „Murashige and Skoog Minimál Organic Médium” tápoldatban - 10⁸ sejt/ml koncentrációban - újraszuszpendáltuk.

A B. napus csíranövények sziklevél alatti szárát (hypocotyl) 5 mm-es darabokra vágtuk, majd haladéktalanul a baktériumszuszpenzióba helyeztük. 30 perc elteltével a hypocotyldarabokat kivettük a szuszpenzióból, és 100 „acetosyringone”-t tartalmazó BC-35-kallusz táptalajra tettük. A növényi szövetet és az Agrobacteriumökat három napig 24 °C-on, gyenge megvilágítás mellett tenyésztettük együtt.

Az együttes tenyésztést úgy fejeztük be, hogy a hypocotyldarabokat - az Agrobacteriumok elpusztítása érdekében - 200 mg/1 karbenicillint és - a transzformáit növényi sejtek szelektálása érdekében - 25 mg/1 kanamicint tartalmazó BC-35-kallusz táptalajra helyeztük. A csíranövénydarabokat ezen a táptalajon 24 °C-on, folytonos megvilágítás mellett, három hétig inkubáltuk.

Három hét elteltével a csíranövénydarabokat 200 mg/1 karbenicillint és 25 mg/1 kanamicint tartalmazó BS-84 regeneráló táptalajra tettük át. A növényi szövetet kéthetenként friss, szelektív, regeneráló táptalajra áthelyezve - a kallusz táptalajon végzett tenyésztéshez leírt körülmények között - folytattuk a tenyésztést. A feltételezett transzformáns kalluszok a regeneráló táptalajon gyorsan növekedtek; amikor kb. 2 mm-es átmérőt értek el, eltávolítottuk őket a hypocotyldarabokról, és azonos összetételű, de kanamicint nem tartalmazó táptalajra helyeztük.

A hajtások a BS-84 regeneráló táptalajra történt áthelyezés után néhány héten belül kezdtek megjelenni.

HU 222 085 Bl

Amikor a hajtások jól látható szárakat alakítottak ki, levágtuk őket a kalluszokról, hossznövekedést elősegítő MSV-1A táptalajra helyeztük, és 24 °C-on 16:8 órás megvilágítási periódussal inkubáltuk.

Amikor a hajtások több nódusz közötti távolságnak 5 megfelelő hosszúságúra nőttek, levágtuk őket az agaróz táptalaj felületéről, és a vágott végeket „Rootone”ba mártottuk. A kezelt hajtásokat közvetlenül nedves „Metro-Mix 350” talajnélküli táptalajt tartalmazó cserepekbe ültettük. A cserepeket műanyag zsákokkal lefed- 10 tűk, melyeket a növények növekedésének egyértelmű megindulása után - körülbelül 10 nap múlva - eltávolítottunk. A transzformáció eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be. A transzformált növényeket az egyes biner vektorokkal kaptuk.

A transzformáció során alkalmazott tápoldatok, illetve táptalajok összetétele a következő volt:

„Minimál A” baktériumnövesztő tápközeg

Desztillált vízben oldva:

10,5 g kálium-foszfát (kétbázisú);

4,5 g kálium-foszfát (egybázisú);

1,0 g ammónium-szulfát;

0,5 g nátrium-citrát (dihidrát);

(az oldatot desztillált vízzel 979 ml-re egészítettük ki, autoklávoztuk, majd 20 ml - szűréssel sterilizált - 25 10%-os szacharózoldatot és 1 ml - szűréssel sterilizált 1 M MgSO₄-oldatot adtunk hozzá).

BC-35 Rrassica-kallusz táptalaj

Egy liter össztérfogatban:

„Murashige and Skoog Minimál Organic Médium” (MS-sók, 100 mg/1 i-inozitol, 0,4 mg/1 tiamin; GIBCO 510-3118); 30 g szacharóz;

18gmannitol;

0,5 mg/12,4-D;

0,3 mg/1 kinetin;

0,6% agaróz;

(pH=5,8).

BS-48 Rrotttca-regeneráló táptalaj:

„Murashige and Skoog Minimál Organic Médium”; „Gamborg” B₅-vitaminok (SIGMA 1019);

g glükóz;

250mgxilóz;

600 mg MES;

0,4% agaróz;

(pH=5,7);

filtersterilizálás, majd autoklávozás után 20 2,0 mg/1 zeatint és

0,1 mg/1 IAA-t adunk hozzá.

MSV-1A Rrasízcn-hajtás-növesztő táptalaj:

„Murashige and Skoog Minimál Organic Médium”; „Gamborg” B_s-vitaminok;

g szacharóz;

0,6% agaróz;

(pH=5,8).

1. táblázat

Canolatranszformánsok

Biner vektor	Vágott végek száma	KANR-kalluszok száma	Kihajtott kalluszok száma	Növények száma
pZS199	120	41	5	2
pZS926	600	278	52	28
pBT593	600	70	10	3
pBT597	600	223	40	23

A növényeket 16:8 órás megvilágítási periódussal, nappal 23 °C, éjjel 17 °C hőmérsékleten növesztettük. Amikor az elsődleges virágzati hajtás hossznövekedése megkezdődött - a más növényekkel történő kereszteződés elkerülése érdekében - polleneket távol tartó zsák- 45 kai borítottuk be. Az önbeporzást úgy segítettük elő, hogy a növényeket naponta többször megráztuk. Az önmegtermékenyítésből származó, érett magvakat kb. három hónappal az elültetés után gyűjtöttük be.

A következők szerint részlegesen zsírtalanított mag- 50 lisztet készítettünk. Mozsárban, mozsártörővei - folyékony nitrogén alatt - 40 mg érett, száraz magot finom porrá törtünk, majd 1 ml hexánt adtunk hozzá, és az elegyet szobahőmérsékleten 15 percig rázattuk. A lisztet Eppendorf-centrifúgában leülepítettük, a hexánt eltávo- 55 lítottuk, majd a hexános kivonást megismételtük. Ezután a lisztet 65 °C-on 10 percig szárítottuk (a hexán teljes elpárolgásáig), miáltal száraz port kaptunk. Az érett magvakból az összes proteint a következők szerint vontuk ki. 1,5 ml-es eldobható műanyag mikrocentrifuga- 60 csövekbe hozzávetőleg 30-40 mg magot tettünk, s a magokat 50 mM trisz-HCl (pH=6,8), 2 mM EDTA, 1% SDS és 1% β-merkapto-etanol 0,25 ml térfogatú elegyében összezúztuk, amihez a mikrocentrifugacsövekhez alkalmazható, eldobható műanyag tengelyekkel felszerelt motoros zúzógépet alkalmaztunk. A kapott szuszpenziókat - a szemcsék eltávolítása érdekében szobahőmérsékleten 5 percig mikrocentrifúgában centrifugáltuk. Három térfogat kivonatot egy térfogat 4xSDS-gél mintapufferrel (0,17 M trisz-HCl, pH=6,8; 6,7% SDS; 16,7% β-merkapto-etanol; 33% glicerin) elegyítettünk, és SDS-poliakrilamid gélen minden egyes kivonatból sávonként 5 μΐ-t futtattunk, melynek során méretstandardként bakteriálisán termelt DHDPS-t és AKIII-at, negatív kontrollként pedig transzformálatlan dohánymagvakból kivont proteint alkalmaztunk. A proteineket ezután elektroforézissel nitro-cellulóz-membránra blotoltuk. A membránokat BioRad „Immun-Biot” reagenskészlet alkalmazásával - a gyártó útmutatásai szerint - 1:5000 hígítású nyúlszé19

HU 222 085 Β1 rumban lévő DHDPS- vagy AKIII-antitestekkel kezeltük. A membránokat - a nem kötődött primer antitest eltávolítása érdekében - leöblítettük, majd 1:3000 hígításban a szekunder antitesttel (torma-peroxidázhoz konjugált majom-antinyúl lg; Amersham) kezeltük. A nem kötődött szekunder antitest eltávolítása érdekében végzett öblítés után a membránokat Amersham kemilumineszcens reagens alkalmazásával röntgenfilmre exponáltuk.

A nyolc FS926-transzformáns közül nyolc, a hét BT597-transzformáns közül pedig hét expresszálta a DHDPS-proteint. Az egyetlen BT593-transzformáns és a hét BT597-transzformáns közül öt expresszálta az AKIII-M4-proteint (2. táblázat).

A magvak szabad aminosav-összetételének mégha- 15 tározása érdekében 40 mg zsírtalanított lisztből (metanol/kloroform/víz 12:5:3 térfogatarányú, 0,6 ml térfogatú elegyében) szobahőmérsékleten kivontuk a szabad aminosavakat. Az elegyet vortexeztük majd Eppendorf-mikrocentrifugában kb. 3 percig centrifugáltuk. Hozzávetőleg 0,6 ml felülúszót leöntöttünk, és az üledékhez további 0,2 ml metanol/kloroform/víz elegyet adtunk, majd az előbbi módon vortexeztük és centrifugáltuk. A második centrifiigálás után kapott felülúszót (kb. 0,2 ml) az elsőhöz adtuk, és ehhez 0,2 ml kloroformot, majd 0,3 ml vizet adtunk. Az elegyet az előbbiek szerint vortexeztük és centrifugáltuk, a felső vizes fázist - hozzávetőleg 1,0 ml-t - eltávolítottuk, majd „Savant Speed Vác Concentrator” készüléken beszárítottuk. A mintákat 110-120 °C-on, nitrogéngáz alatt,

N sósav és 0,4% β-merkapto-etanol elegyében 24 óra hosszat hidrolizáltuk. A minta 1/4 részét „Beckmann Model 6300” aminosavanalizáló készüléken futtattuk („oszlop utáni” ninhidrinreakciós kimutatás alkalmazásával). A magvakban a szabad aminosavak relatív szint- 35 jét a lizin vagy a treonin leucinhoz viszonyított arányaként határoztuk meg (vagyis belső standardként a leucint alkalmaztuk).

A nagyobb mennyiségű DHDPS-proteint expresszáló transzformánsok és a nagyobb mennyiségű sza- 40 bad lizint tartalmazó transzformánsok között egyenes összefüggést figyeltünk meg. A legmagasabb szintű expressziét mutató vonalak esetében a magvak szabad lizinszintjében 100-szorosnál is nagyobb növekedést ta5 pasztaltunk. Az ΑΚΙΠ-Μ4 Corynebacterium-DHDPSsel együttes expressziója nem eredményezett magasabb szintű szabad lizinfelhalmozódást, mint a Coiynebacterium-DHDPS egyedüli expressziója. A Corynebacterium-DHDPS nélkül AKIII-M4-et expresszáló transz10 formáns magjaiban a szabad treonin szintjének ötszörös emelkedését figyeltük meg. Sok transzformált vonalban - a lizinkatabolizmusra utaló - a-amino-adipinsav magas szinten volt jelen. Ilyenformán, a lizinkatabolizmus - lizin-ketoglutarát-reduktáz inaktiválásával történő - megakadályozása a magvakban tovább fokozhatja a szabad lizin felhalmozódását. Más módon, a lizin peptidbe vagy nagy lizintartalmú proteinbe történő beépítése megakadályozhatja a katabolizmust, és a magvakban a lizin felhalmozódásának fokozódását 20 eredményezheti.

Az érett magvak összes aminosav-összetételének mérése érdekében 2 mg zsírtalanított lisztet 110-120 °C-on, nitrogéngáz alatt, 6 N sósav és 0,4% β-merkapto-etanol elegyében 24 óra hosszat hidrolizál25 tünk. A minta 1/100 részét „Beckmann Model 6300” aminosavanalizáló készüléken futtattuk („oszlop utáni” ninhidrinreakciós kimutatás alkalmazásával). A magvakban a szabad aminosavak relatív szintjét a lizin, treonin vagy α-amino-adipinsav összes proteinhez viszonyí30 tott arányaként határoztuk meg (vagyis belső standardként a leucint alkalmaztuk). A DHDPS-proteint expresszáló transzformánsok és a nagy mennyiségű lizint tartalmazó transzformánsok között egyenes összefüggést figyeltünk meg. A lizinszint tekintetében (a nem transzformált kontrolihoz viszonyítva) 5-100%-os növekedést mutató magvakat találtunk. A legnagyobb mennyiségű lizint tartalmazó magvakban a lizin a magban található összes aminosav 11-13%-át teszi ki, ami lényegesen nagyobb arány, mint ami a korábban ismert repcemagvakra jellemző.

2. táblázat

FS926-transzformánsok: phaseolin-5 ’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3 ’-régió;

BT593-transzformánsok: phaseolin-5 ’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3 ’-régió;

BT597-transzformánsok: phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’-régió+phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3’-régió

Vonal	Szabad aminosavak	Western Coryne- DHDPS	Western E. coliΑΚΠΙ-Μ4	Összes aminosav (%)
K/L	T/L	AA/L	K	T	AA
I WESTAR	0,8	2,0	0	-	-	6,5	5,6	0
ZS199	1,3	3,2	0	-	-	6,3	5,4	0
FS926-3	140	2,0	16	+ + + +	-	12	5,1	1,0
FS926-9	110	1,7	12	+ + + +	-	11	5,0	0,8
I FS926-11	7,9	2,0	5,2	+ +	-	7,7	5,2	0

HU 222 085 Bl

2. táblázat (folytatás)

Vonal	Szabad aminosavak	Western Coryne- DHDPS	Western E. coliΑΚΙΗ-Μ4	Összes aminosav (%)
K/L	T/L	AA/L	K	T	AA
FS926-6	14	1,8	4,6	+ + +	-	8,2	5,9	0
FS926-22	3,1	1,3	0,3	+	-	6,9	5,7	0
FS926-27	4,2	1,9	1,1	+ +	-	7,1	5,6	0
FS926-29	38	1,8	4,7	+ + + +	-	12	5,2	1,6
FS926-68	4,2	1,8	0,9	+ +	-	8,3	5,5	0
BT593-42	1,4	11	0	-	+ +	6,3	6,0	0
BT597-14	6,0	2,6	4,3	+ +	+ /-	7,0	5,3	0
BT597-145	1,3	2,9	0	+	-
BT597-4	38	3,7	4,5	+ + + +	+ + + +	13	5,6	1,6
BT597-68	4,7	2,7	1,5	+ +	+	6,9	5,8	0
BT597-100	9,1	1,9	1,7	+ + +	+ +	6,6	5,7	0
BT597-148	7,6	2,3	0,9	+ + +	+	7,3	5,7	0
BT597-169	5,6	2,6	1,7	+ + +	+ + +	6,6	5,7	0

AA=a-amin-adipinsav ♦ A vizsgált aminosavak mennyiségének összes aminosavra vonatkoztatott %-os aránya.

6. példa

Szójabab transzformálása phaseolinpromoter/cts/cordapA és phaseolinpromoter/cts/lysCM4 kiméragénnel

A phaseolin-5 ’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3 '-régió- és a phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’régió kiméragén-kazettát (4. példa) a pBT603 (szójabab-transzformációs) vektorba (6A. ábra) inszertáltuk. Ez a vektor egy módosított pGEM9Z-plazmidban - az E. co/í-P-glükuronidáz (GUS)-gén [Jefferson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8447 (1986)] expresszióját irányító karfiol-mozaikvírusból származó 35S-promoterből és Nos-3'-régióból álló szójababtranszformációs markergént tartalmaz.

A phaseolin-5 ’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3 '-régió génkazetta inszertálása érdekében a kazettát 3,3 kb-os HindlII-ffagmensként izoláltuk, és HindlII-mal emésztett pBT603-plazmidba inszertáltuk, miáltal a pBT609plazmidot kaptuk. Ez a vektor a 35S/GUS/Nos-3’ markergénnel ellentétes orientációban inszertált phaseolin5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’-régió kiméragént tartalmazza.

A phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin-3’-régió kiméragén-kazettát oligonukleotidadaptorok alkalmazásával úgy módosítottuk, hogy a két végen lévő HindlII-helyet BamHI-helyre alakítottuk át. A génkazettát ezután 2,7 kb-os BamHI-fragmensként izoláltuk, és BamHI-gyel emésztett pBT609-plazmidba inszertáltuk, miáltal a pBT614-plazmidot (6B. ábra) kaptuk. Ez a vektor a phaseolin-5’-régió/cts/cordapA/phaseolin3'-régió és a phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3'-régió kiméragént egymással azonos orientációban - a 35S/GUS/Nos-3’ markergénnel ellentétes orientációban - tartalmazza.

A pBT614-plazmidot az „Agracetus Company”-nál (Middleton, WI) transzformációval (melyet az 5,015,580 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással végeztünk) vittük be a szójababba. Öt transzformált vonalból kaptunk magvakat, s ezeket analízisnek vetettük alá.

Azt vártuk, hogy a transzgének a transzformált növények Rj magjaiban szegregálódnak. A transzformációs markergént hordozó magok azonosítása érdekében a magokból borotvapengével kivágtunk egy kis darabot, amit eldobható műanyag mikrotitertálca üregébe helyeztünk. GUS-vizsgálati elegyet (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM EDTA, 0,5 mM K₄Fe(CN)₆, 0,1% Triton X-100, 0,5 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-PD-glükuronsav) készítettünk, melyből mindegyik mikrotiterüreghez 0,15 ml-t adtunk. A mikrotitertálcát 45 percig 37 °C-on inkubáltuk. A magban a GUS expresszióját kék szín megjelenése jelezte.

Öt transzformált vonal közül négy a GUS-expresszió 3:1 arányú szegregációját mutatta (3. táblázat). Ez azt jelenti, hogy a GUS-gén a szójababgenomba egyetlen helyen inszertálódott. A másik transzformáns 9:1 arányú szegregációt mutatott, ami arra utal, hogy a GUS-gén két helyre inszertálódott.

Az egyes magvak egy részét finom porrá őrölve lisztet készítettünk. Az összes protein kivonása érdekében

HU 222 085 BI liszt 1 mg-jához 43 mM trisz-HCl (pH=6,8), 1,7% SDS, 4,2% β-merkapto-etanol és 8% glicerin 0,1 ml térfogatú elegyét adtuk, a szuszpenziót vortexeztük, majd 2-3 percig forraltuk és ismét vortexeztük. A kapott szuszpenziókat - a szemcsék eltávolítása érdekében szobahőmérsékleten öt percig mikrocentrifugában centrifugáltuk, majd SDS-poliakrilamid gélen mindegyik kivonatból 10 μΐ-t futtattunk (méretstandardként bakteriálisán termelt DHDPS-t vagy AKIII-at alkalmaztunk). A proteineket ezután elektroforetikusan nitro-cellulózmembránra biotoltuk. A membránokat BioRad „Immun-Blot” reagenskészlet alkalmazásával - a gyártó útmutatásai szerint - DHDPS-, illetve AKIII-antitestekkel (1:5000, illetve 1:1000 hígítású nyúlszérumban) kezeltük. A membránokat - a nem kötődött primer antitest eltávolítása érdekében - leöblítettük, majd 1:3000 hígításban a szekunder antitesttel (tormaperoxidázhoz konjugált szamár-antinyúl lg; Amersham) kezeltük. A nem kötődött szekunder antitest eltávolítása érdekében végzett öblítés után a membránokat Amersham kemilumineszcens reagens alkalmazásával röntgenfilmre exponáltuk.

Az öt transzformáns közül négy expresszálta a DHDPS-proteint. E négy transzformáns esetében kiváló összefüggés volt az egyes magvakban a GUS-gén és a DHDPS-gén expressziója között (3. táblázat), ami arra utal, hogy a két gén a szójababgenom azonos helyére épül be. Az öt transzformáns közül kettő expresszálta az AKIII-proteint, és ezek esetében is kiváló összefüggés volt az egyes magvakban megfigyelhető AKIII-, GUS- és DHDPS-expresszió között (3. táblázat). Ez itt is arra utal, hogy a GUS-, AKIII- és DHDPS-gén a szójababgenom azonos helyére épül be. Az egyik transzformáns magjaiban csak GUS expresszálódott.

A magvak szabad aminosav-összetételének meghatározása érdekében 1,0 ml metanol/kloroform/víz (12:5:3 térfogatarányú) elegyben, 8-10 mg lisztből, szobahőmérsékleten kivontuk a szabad aminosavakat. Az elegyet vortexeztük, Eppendorf-mikrocentrifugában kb. 3 percig centrifugáltuk, majd hozzávetőleg

0,8 ml felülúszót leöntöttünk, amihez 0,2 ml kloroformot, majd 0,3 ml vizet adtunk. A kapott elegyet vortexeztük, Eppendorf-centrifugában kb. 3 percig centrifugáltuk, a felső - kb. 1,0 ml térfogatú - vizes fázist eltávolítottak, és „Savant Speed Vác Concentrator”ban beszárítottuk. A mintákat 110-120 °C-on, nitrogéngáz alatt, 6 N sósav és 0,4% β-merkapto-etanol elegyében 24 óra hosszat hidrolizáltuk. A minta 1/10 részét „Beckmann Model 6300” aminosavanalizáló készüléken futtattuk („oszlop utáni” ninhidrinreakciós kimutatás alkalmazásával). A magvakban a szabad aminosavak relatív szintjét a lizin vagy a treonin leucinhoz viszonyított arányaként határoztuk meg (vagyis belső standardként a leucint alkalmaztuk).

A Cozyneóacferium-DHDPS-proteint expresszáló transzformánsok és a nagyobb mennyiségű szabad lizint tartalmazó transzformánsok között kiváló összefüggés volt. A Corynebacterium-DHDPS-t expresszáló magvakban a szabad lizinszint 20-120-szoros növekedését figyeltük meg. A nagy mennyiségű lizint tartalmazó magvakban a lizinkatabolizmusra utaló szacharopin magas szintjét figyeltük meg.

Az érett magvak aminosav-összetételének meghatározása érdekében a magból készült liszt 1-1,4 mg-ját 110-120 °C-on, nitrogéngáz alatt, 6 N sósav és 0,4% β-merkapto-etanol elegyében 24 óra hosszat hidrolizáltuk. A minta 1/10 részét „Beckmann Model 6300” aminosavanalizáló készüléken futtattuk („oszlop utáni” ninhidrinreakciós kimutatás alkalmazásával). A magban a lizin (és más aminosavak) mennyiségét az összes aminosavhoz viszonyítottuk.

A Corynehacteri«/«-DHDPS-proteint expresszáló magvak és a nagy mennyiségű lizint tartalmazó magvak között kiváló összefüggést találtunk. A lizinszint tekintetében - a nem transzformált kontrolihoz képest 5-35%-os növekedést mutató magvakat figyeltünk meg; az ilyen magvakban a lizin az összes magi aminosav 7,5-7,7%-át teszi ki, ami lényegesen nagyobb arány, mint ami a korábban ismert szójababmagvak esetében tapasztalható.

3. táblázat

Vonal - mag	GUS	Szabad lys/leu	DHDPS	AKIII	Lys(%)
A2396-145-4	-	0,9	-	-	5,75
A2396-145-8	-	1	-	-
A2396-145-5	-	0,8			5,85
A2396-145-3	-	1
A2396-145-9	+	2
A2396-145-6	+	4,6
A2396-145-1	+	8,7
A2396-145-10	+	18,4			7,54
A2396-145-7	+	21,7	+	-	6,68
A2396-145-2 1	+	45,5	+	-	7,19

HU 222 085 Bl

3. táblázat (folytatás)

Vonal - mag	GUS	Szabad lys/leu	DHDPS	AKIII	Lys(%)
A5403-175-9	-	1,3
A5403-175-4	-	1,2	-	-	6,01
A5403-175-3	-	1	-	-	6,02
A5403-175-7	+	1,5
A5403-175-5	+	1,8
A5403-175-1	+	6,2
A5403-175-2	+	6,5			6,3
A5403-175-6	+	14,4
A5403-175-8	+	47,8	+	-	7,67
A5403-175-10	+	124,3	+	-	7,49
A5403-181-9	+	1,4
A5403-181-10	+	1,4	-	-	5,68
A5403-181-8	+	0,9
A5403-181-6	+	1,5
A5403-181-4	-	0,7	-	-	5,85
A5403-181-5	+	1,1
A5403-181-2	-	1,8	-	-	5,59
A5403-181-3	+	2,7	-	-	5,5
A5403-181-7	+	1,9
A5403-181-1	-	2,3
A5403-183-9	-	0,8
A5403-183-6	-	0,7	-	-	6,03
A5403-183-8	-	1,3
A5403-183-4	-	1,3	-	-	6,04
A5403-183-5	+	0,9
A54O3-183-3	+	3,1
A5403-183-1	+	3,3
A5403-183-7	+	9,9
A5403-183-10	+	22,3	+	+	6,74
1 A5403-183-2	+	23,1	+	+	7,3
A5403-196-8	-	0,9	-	-	5,92
A5403-196-6	+	8,3
A5403-196-1	+	16,1	+	+	6,83
A5403-196-7	+	27,9
A5403-196-3	+	52,8
A5403-196-5	+	26
A5403-196-2	+	16,2	+	+
A5403-196-10	+	29	+	+	7,53
A5403-196-4	+	58,2	+	+	7,57
| A5403-196-9	+	47,1
Vad típ. kontr.	-	0,9	-	-	5,63

HU 222 085 Bl

Tizennyolc további transzfonnáns szójababvonalat kaptunk. A vonalakból származó különálló magvakat a fentebb leírtak szerint vizsgáltuk, s megállapítottuk, hogy valamennyi vonal mutatott GUS-aktivitást. Az egyes magvakból - vagy néhány esetben több, összegyűjtött magból - lisztet készítettünk, és „Westem-blot”-analízissel a DHDPS- és ΑΚΙΠ-protein expresszióját vizsgáltuk. A 18 vonal közül 17 expresszált DHDPS-t, 15 pedig ΑΚΠΙ-at. Ebben az esetben is kiváló összefüggést találtunk a GUS-t, DHDPS-t és ΑΚΠΙ-at expresszáló magvak között, ami azt jelzi, hogy ezek a gének a transzformált vonalakban kapcsoltan vannak jelen.

Az e vonalakból származó magvak aminosav-összetételét a fentebb leírtak szerint határoztuk meg. A Coryneóacíeriuzn-DHDPS-protemt expresszáló magvak fokozott mennyiségű lizint tartalmaztak. A DHDPS egye5 dűli expressziója az összes magi lizin mennyiségének 5-40%-os növekedését eredményezte. A DHDPS AKIII-M4-gyel együttes expressziója a lizin mennyiségének több mint 400%-os növekedését eredményezi. A különböző transzformált vonalakkal kapott eredmé10 nyékét a 3 A. táblázatban mutatjuk be.

3A. táblázat

Vonal - mag	GUS+—	DHDPS	AKIII	Lizin (%)
A2396-145	6—>4	+	-	7,5
A2396-233	3->l	+	+	25
A2396-234	15—>1	+	+	16
A2396-248	4->10	+	-	6,3
A2396-263	14—>2	-	-
A2396-240	7—»1	+	+	11
A2396-267	2—>53	+	+	8,9
A2242-273	11—>5	+	+	13
A2242-315	6—>2	+	+	16
A2242-316	1—>15	+	+	12
A5403-175	7—>3	+	+	7,6
A5403-181	7—>3	-	-	5,7
A5403-183	6—>4	+	+	6
A5403-185	9—>11	+	+	7,6 P
A5403-196	9—>1	+	+	7,6
A5403-203	6->36	+	+	6,1 P
A5403-204	17—>3	+	+	8,8 P
A5403-212	13->5	+	+	9,4 P
A5403-214	21—>16	+	+	32
A5403-216	14->4	+	-	8,2 P
A5403-218	13—>9	+	+	9,8 P
A5403-222	12—>27	+	+	15
| A5403-225	14—>12	+	+	13

„P” azt jelenti, hogy több, összegyűjtött magból készítettünk lisztet, és a „Western-blot” analízist az így kapott liszttel végeztük.

7. példa

Növényi lizin-ketoglutarát-reduktáz-gén izolálása A lizin-ketoglutartát-reduktáz (LKR)-enzim aktivitását fejlődő kukoricamagvak éretlen endospermiumában figyelték meg [Arruda és munkatársai: Plánt Physiol. 69, 988 (1982)]. Az LKR-aktivitás az endospermium fejlődésének beindulása után hirtelen fokozódik, a beporzás után kb. 20 nappal maximumot ér el, majd csökken [Arruda és munkatársai: Pnytochemistry 22, 2687 (1983)].

A kukorica-LKR-gén klónozása érdekében a fejlődő magvakból - a beporzás utáni 19. napon - RNS-t izoláltunk. A kapott RNS-t - lambda-Zap-II-vektorban cDNS-könyvtár szintézise érdekében - a Clontech La55 boratories, Inc. laboratóriumba küldtük. A lambdaZap-II-könyvtár fágemidkönyvtárrá, majd plazmidkönyvtárrá történő átalakítását a Clontech által rendelkezésünkre bocsátott eljárással végeztük. A plazmidkönyvtár kialakítása után az ampicillinrezisztens kló60 nők hordozzák - pBluescript-SK(-)-vektorban - a

HU 222 085 Bl cDNS-inszertet. A cDNS expressziója a vektorban lévő lacZ-promoter irányítása alatt áll.

A fágemidkönyvtárakat a lambda-Zap-II-fág (100 μΐ) és a szálas „helper”-fág (1 μΐ) elegyének felhasználásával készítettük. Két másik könyvtárat is előállítottunk, melyekhez 100 μΐ lambda-Zap-II-fágot és 10 μΐ ,4ielper”-fágot, illetve 20 μΐ lambda-Zap-II-fágot és 10 μΐ ,jielper”-fágot alkalmaztunk. A fágemidkészítmények titere független volt az alkalmazott elegytől; gazdasejtként az E. coli „XLl-Blue” törzset alkalmazva milliliterenként kb. 2 χ 10³ ampicillinrezisztens transzfektánst, DE126-törzs (lásd: lentebb) alkalmazásával pedig milliliterenként kb. lxlO³ ampicillinrezisztens transzfektánst kaptunk.

Az LKR-gént hordozó kiónok kiszelektálása érdekében egy speciális tervezésű E. coli gazdát (DE126) alakítottunk ki. A DE126-törzs kialakítása több lépésben történt.

(1) TSTl-törzs [F-, araD139, delta(argF-lac)205, flb5301, ptsF25, relAl, rpsL150, malE52: :Tnl0, deoCl, λ~] („E. coli Genetic Stock Center” No. 6137) tenyészetének - standard eljárással (lásd: J. Miller: „Experiments in Molecular Genetics”) végzett - infekciójával a Plvir-„colifág” általános transzdukáló törzsét hoztuk létre.

(2) Ezt a fágtörzset használtuk donorként a következő transzdukciós keresztezéshez (az eljárást lásd: J. Miller: „Experiments in Molecular Genetics”), melynek során recipiensként a GIF106Ml-törzset [F~, arg-, ilvA296, lysCIOOl, thrAllOl, metLIOO, λ-, rpsL9, malTl, xyl-7, mtl-2, thil(?), supE44(?)] („E. coli Genetic Stock Center” No. 5074). A rekombinánsokat DAP-pal kiegészített, tetraciklint tartalmazó L-táptalajon szelektáltuk. A tetraciklinrezisztenciát biztosító TnlO-transzpozon a TSTl-törzs malE-génjébe inszertálva van jelen. Valószínű, hogy az e keresztezésből származó tetraciklinrezisztens transzduktánsok - a malE-gén szomszédságában - az E. co/z'-kromoszóma két percig terjedő szakaszát tartalmazzák. A malE- és lysC-gén között 0,5 percnél kisebb távolság van, ami belül esik a kotranszdukciós távolságon.

(3) 200 tetraciklinrezisztens transzduktáns fenotípusát részletesen meghatároztuk, és értékeltük a megfelelő fermentációs, illetve tápanyagigényre vonatkozó sajátságokat. A recipiens GI106Ml-törzsben - a thrA-, metL- és lysC-gének mutáció következtében - egyáltalán nincsenek aszpartátkináz-izoenzimek, következésképpen, ez a törzs a növekedéshez treonint, metionint, lizint és mezo-diamino-pimelinsavat (DAP) igényel. Azok a transzduktánsok, amelyek a TST1-törzstől lysC⁺ és malE:Tnl0 sajátságot örököltek, várhatóan növekedni fognak a Bl-vitamint, L-arginint, L-izoleucint, L-valint és - szén- és energiaforrásként - glükózt tartalmazó minimáltáptalajon. A lysC+, metL- és thrA^- genetikai összetételű törzsek csak lizinre érzékeny aszpartátkinázt expresszálnak, így, ha a minimáltáptalajhoz lizint adunk, a lysC⁺-rekombináns nem lesz képes növekedni (a treonin-, metionin- és DAP-éhség miatt). A vizsgált 200 tetraciklinrezisztens transzduktáns közül 49 növekedett a treonin, metionin és DAP nélküli minimáltáptalajon, és ezek mindegyike gátolható volt, ha a táptalajhoz L-lizint adtunk. E transzduktánsok egyikét DE125-nek neveztük el. A DE125 - fenotípusát tekintve - tetraciklinrezisztens, növekedéséhez arginint, izoleucint és valint igényel, továbbá érzékeny a lizinre. E törzs genotípusa a következő: F~, malE52: TnlO, arg-, ilvA296, thrAllOl, metLIOOO, lambdarpsl9, malTl, xyl-7, mtl-2, thil(?), supE44(?).

(4) Ebben a lépésben a DE125-törzs hímivarú származékának előállítását írjuk le. A DE125-törzset a hímivarú AB1528-törzzsel [F’16/delta(gpt-proA)62, lacYl vagy lacZ4, glnV44, galK2, rac-(?), hisG4, rfbdl, mgl-51, kdgK51(?), ilvC7, argE3, thi-1] („E. coli Genetic Stock Center” No. 1528) konjugációval párosítottuk. Az F’16 az ilvGMEDAYC-génklasztert hordozza. A két törzset egymást keresztező csíkokban - az egyes törzsek növekedését elősegítő - gazdag táptalajra kentük. Inkubálás után a lemezt replikatechnikával - tetraciklint, arginint, Bj-vitamint és glükózt tartalmazó - szintetikus táptalajra másoltuk. A DE125törzs ezen a táptalajon nem képes növekedni, mivel nem tud izoleucint szintetizálni. Az AB1528-törzs növekedését a tetraciklin jelenléte, valamint a prolin és hisztidin hiánya gátolja. Ezen a szelektív táptalajon egy, sejtekből álló folt nőtt. Ezekkel a rekombináns sejtekkel, azonos táptalajon, egyszeri telepizolálást végeztünk. Az egyik klón fenotípusát meghatároztuk: Ilv+, Arg-, Tet^R, lizinszenzitív, hímspecifikus-fég(MS2)-szenzitív, ami összhangban áll, az F’16 AB1528-törzsből DE125törzsbe történő egyszerű átvitelével kapott fenotípussal. Ezt a kiónt DE126-nak neveztük el, és genotípusa a következő: F’16/malE52:TnlO, arg-, ilvA296, thrAllOl, metLIOO, lysC⁺, λ-, rpsL9, malTl, xyl-7, mtl-2, thi—1(?), supE44(?). Ezt a kiónt szintetikus táptalajban lévő 20 pg/ml koncentrációjú L-lizin gátolja.

A kukorica-cDNS-könyvtárból LKR-gént hordozó kiónok kiválasztása érdekében 100 μΐ fágemid-könyvtárat L-tápoldatban növesztett DE126-törzs egyéjszakás tenyészetének 100 μΐ-ével elegyítettük, és a sejteket - B_rvitamint, L-arginint, (szén- és energiaforrásként) glükózt, 100 pg/ml ampicillint és 20, 30 vagy 40 pg/ml L-lizint tartalmazó - szintetikus táptalajra kentük. A három különböző lizinkoncentrációt tartalmazó táptalajból négy-négy lemezt készítettünk. A fágemid és a DE126-sejtek mennyiségétől azt vártuk, hogy lemezenként kb. 1 χ 10⁵ ampicillinrezisztens transzfektánst eredményez. Lemezenként 10-30 lizinrezisztens telep nőtt ki. (kb. 5000 ampicillinrezisztens telepenként 1 lizinrezisztens telep).

Tíz független kiónból plazmid-DNS-t izoláltunk, mellyel ismét DE126-sejteket transzformáltunk. A tíz DNS közül hét eredményezett lizinrezisztens kiónokat, ami azt bizonyítja, hogy a lizinrezisztens sajátságot a plazmid hordozza. A klónozott DNS-ek közül többet megszekvenáltunk, és elvégeztük biokémiai vizsgálatukat is. Azt találtuk, hogy az inszertált DNS-fragmensek inkább az E. co/i-genomból származnak, mintsem a kukorica-cDNS-ből, ami azt jelenti, hogy a Clontechtől kapott cDNS-könyvtár szennyezett volt, ezért új cDNS-könyvtárat készítünk és szkrínelünk, a fentebb leírt módon.

HU 222 085 Bl

8. példa

Szintetikus gének kialakítása a pSK5-expressziósvektorban

Az alábbiakban leírt szintetikus gének kialakításának és expresszálásának elősegítése érdekében olyan plazmidvektort kellett előállítani, amely a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

1. nem tartalmaz Earl-restrikciós endonukleázhelyet, hogy a szekvenciák inszerciója egyedi helyet biztosíthasson;

2. tetraciklinrezisztencia-gént tartalmaz, hogy a növesztés és a toxikus proteinek expressziója során megakadályozzuk a plazmid elvesztését;

3. a pBT430-plazmidból hozzávetőleg 290 bp hosszúságú szakaszt tartalmaz, amely magában foglalja - az inszertált szekvenciák E. coliban történő expresszióját szabályzó - T7-promotert és terminátorszegmenst;

4. a T7-promoter mögött, megfelelő helyen, az oligonukleotidszekvenciák inszercióját elősegítő egyedi EcoRI- és Ncol-helyet tartalmaz.

Az 1. és 2. tulajdonság megvalósítása érdekében a pSKl-plazmidot alkalmaztuk, amely a pBR322-plazmid spontán mutánsa, melyből az ampicillingén és az Earl-hely deléció következtében hiányzik. A pSKl-plazmidban megmaradt a tetraciklinrezisztencia-gén, az 1. bázisnál az egyedi EcoRI-hely, és a 2353. bázisnál egy egyedi Earl-hely. A pSKl-plazmid 2353. bázisnál lévő Earl-helyének eltávolítása érdekében - templátként a pSKl-plazmid alkalmazásával - polimeráz-láncreakciót végeztünk. Hozzávetőleg 10 „femtomole” pSKlplazmidot - ΑΒΠ306Β DNS-szintetizáló készüléken, a gyártó által megadott eljárással szintetizált - 1-1 pg SM70- és SM71-oligonukleotiddal elegyítettünk.

SM70: 5’-CTGACTCGCTGCGCTCGGTC-3’ (16. azonosító számú szekvencia.)

SM71: 5’-TATTTTCTCCTTACGCATCTGTGC-3’ (17. azonosító számú szekvencia).

A 7. ábrán, a pSKl-templáton bejelöltük a SM70és SM71-oligonukleotid láncindító helyeit. A polimeráz-láncreakciót Perkin-Elmer Cetus reagenskészlet (Emeryville, CA) alkalmazásával, a forgalmazó útmutatása szerint, szintén a Perkin-Elmer Cetus által gyártott PCR-készüléken, 25 ciklussal (95 °C-on egy perc, 42 °C-on két perc és 72 °C-on 12 perc) végeztük. Az oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy - az Earl-hely körül elhelyezkedő 30 bázisos fragmens kivételével a teljes pSKl-plazmid replikációját indítsa (lásd: 7. ábra). A 100 pl reakciótermékből 10 μΐ-t 1%-os agarózgélen futtattunk, és a gélt etídium-bromiddal festettük, miáltal egy kb. 3,0 kb-os sávot mutattunk ki, amely a replikáit plazmid várt méretének felel meg.

A PCR-reakcióelegy maradékát (90 μΐ) 20 μΐ 2,5 mM koncentrációjú dezoxinukleotid-trifoszfátok (dATP, dTTP, dGTP és dCTP) 20 μΐ oldatával elegyítettük, 30 egység „Klenow”-enzimet adtunk hozzá, és az elegyet 37 °C-on 30 percig, majd 65 °C-on 10 percig inkubáltuk. A ,Klenow”-enzimet a polimeráz-láncreakció során képződött ragadós végek feltöltésére használtuk. A DNS-t etanollal kicsaptuk, 70%-os etanollal mostuk, vákuum alatt szárítottuk, majd vízben újraszuszpendáltuk. A DNS-t ezután - kinázpufferben, 1 mM ATP jelenlétében - T4-DNS-kinázzal kezeltük. Ezt az elegyet 37 °C-on 30 percig, majd 65 °C-on 10 percig inkubáltuk. A kinázzal kezelt elegy 10 μΐ-éhez 2 μΐ 5 χ ligálópuffert és 10 egység T4-DNS-ligázt adtunk. A ligálást 15 °C-on 16 óra hosszat végeztük, majd a DNS-t megfeleztük, és az egyik felét Earl-enzimmel emésztettük. A „Klenow”-enzimes, a kinázenzimes, a ligálási, valamint a restrikciós endonukleázos kezelést Sambrook és munkatársai által leírt eljárásokkal végeztük [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]. A „Klenow”-, kináz-, ligáz-, valamint a legtöbb restrikciós endonukleázenzimet a BRL-től vásároltuk. Néhány restrikciós endonukleázt a NEN Biolabstól (Beverly, MA), illetve a Boehringer Mannheimtől (Indianapolis, IN) szereztünk be. A két ligáit DNS-mintát CaCl₂os módszerrel [lásd: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)], külön-külön, kompetens JM103-sejtekbe [supE thi dél (lac-proAB) F’ [traD36 porAB, laclq lacZ dél M15] restrikció mínusz] transzformáltuk, és a sejteket 12,5 pg/ml tetraciklint tartalmazó táptalajra kentük. Earl-gyel végzett emésztéssel és anélkül egyaránt azonos számú transzformánst kaptunk, ami arra utal, hogy ezekből a konstrukciókból az Earl-helyet sikeresen eltávolítottuk. A kiónok szkrineléséhez Sambrook és munkatársai által leírt lúgos lízises ,yniniprep”-eljárással [lásd: Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] DNS-t készítettünk, majd restrikciós endonukleázenzimes emésztési vizsgálatot végeztünk. Egyetlen olyan kiónt választottunk ki, amely tetraciklinrezisztens volt, és nem tartalmazott egy Earl-helyet sem. Ezt a vektort pSK2-nek neveztük el. A pSK2 megmaradt EcoRI-helyét EcoRI-enzimmel végzett teljes emésztéssel, a végek „Klenow”fragmenssel végzett feltöltésével és ligálással távolítottuk el. Az EcoRI-helyet nem tartalmazó kiónt pSK3-nak neveztük el.

A fentebb említett 3. és 4. tulajdonság megvalósítása érdekében a pBT430-plazmidból (lásd: 2. példa) származó bakteriofág T7-RNS-polimeráz-promoter/terminátor szegmenst polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk. Az SM78 (18. azonosító számú szekvencia) és SM79 (19. azonosító számú szekvencia) láncindító oligonukleotidot a pBT430-plazmidból származó - a T7promoter/terminátor szekvenciákat átívelő (lásd: 7. ábra) - 300 bázisos fragmens replikációjának beindításához terveztük.

SM78: 5’-TTCATCGATAGGCGACCACACCCGTCC-3’ (18. azonosító számú szekvencia);

SM79: 5 ’-AATATCGATGCC ACGATGCGTCCGGCG-3’ (19. azonosító számú szekvencia).

A polimeráz-láncreakciót a fentebb leírtak szerint - templátként pBT430-plazmid alkalmazásával - végeztük, és egy 300 bp-os fragmenst állítottunk elő. A fragmens végeit „KIenow”-enzim alkalmazásával feltöltöttük, majd a fentiek szerint kinázzal kezeltük. A pSK3-plazmidból származó DNS-t PvuII-enzimmel

HU 222 085 Bl teljesen megemésztettük, majd - az 5’-foszfátcsoport eltávolítása érdekében - boíjúbél-alkalikusfoszfatázzal (Boehringer Mannheim) kezeltük. Az eljárás leírását lásd: Sambrook és munkatársai: ,,Molecular Cloning,

A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). A hasított és foszfatázzal kezelt pSK3-DNS-t etanolos kicsapással tisztítottuk, és a DNS egy részét T7-promoterszekvenciát tartalmazó, polimeráz-láncreakcióval kialakított fragmenssel ligáltuk. A ligálási elegyet JM103-törzsbe [supE thi dél (lac-proAB) F’ [traD36 porAB, laclq lacZ dél M15] restrikció mínusz] transzformáltuk, és tetraciklinrezisztens telepeket szkríneltünk. A lúgoslízis „miniprep”eljárással plazmid-DNS-t készítettünk, és a PCR-termék inszertálódásának és orientációjának kimutatása ér- 15 dekében restrikciós endonukleázos vizsgálatot végeztünk. A szekvenciaanalízishez két kiónt választottunk ki: a pDK5-plazmid a fragmenst a 7. ábrán bemutatott orientációban tartalmazta. A lúgos közegben denaturált kétszálú DNS - „Sequenase®” T7-DNS-polimeráz (US Biochemical Corp.) és a gyártó által ajánlott eljárás alkalmazásával végzett - szekvenciaanalízise azt 5 mutatta, hogy a pSK5-plazmid a T7-promoter/terminátor szekvencián belül nem tartalmaz PCR-replikációs hibákat.

Az Earl-helyen alapuló, ismétlődő szintetikus génszekvenciák kialakításának menetét a 8. ábrán mutatjuk 10 be. Az első lépésben egy 14 aminosavat kódoló alapgén oligonukleotidszekvenciájának inszercióját végeztük el. Ez az oligonukleotidinszert - az egy vagy több ismétlődő heptádot kódoló oligonukleotidok későbbi inszerciójához - egyedi Earl-helyet, továbbá - a génszekvenciák növényi vektorokba történő átviteléhez - egyedi Asp718-helyet tartalmazott. Az oligonukleotidok túlnyúló végei lehetővé tették a pSK5-vektor egyedi Ncolés EcoRI-helyeire történő inszerciót.

MEEKMKAMEEK SM815’-CATGGAGGAGAAGATGAAGGCGATGGAAGAGAAG SM80 3’-CCCTCTTCTACTTCCGCTACCTTCTCTTC

Ncol. EarI

Μ K A (22. azonosító számú szekvencia)

SM81 ATGAAGGCGTGATAGGTACCG-3 ’ (20. azonosító számú szekvencia) SM80 TACTTCCGCACTATCCATGGCTTAA-5 ’ (21. azonosító számú szekvencia)

Asp718 EcoRI

A pSK5-plazmidból származó DNS-t Ncol-gyel és EcoRI-gyel teljesen megemésztettük, majd agaróz- 30 gélelektroforézissel tisztítottuk. A tisztított DNS-t (0,1 pg) az SM80- (14. azonosító számú szekvencia) és az SM81-oligonukleotid (15. azonosító számú szekvencia) 1-1 pg-jával ligáltuk. A ligálóeleggyel E. coli JM103-törzset [supE thi dél (lac-proAB) F’ 35 [traD36 porAB, laclq lacZ dél Ml5] restrikció mínusz] transzformáltuk, és a tetraciklinrezisztens transzformánsokat gyors plazmid-DNS-preparátumokkal, majd restrikciós emésztéses analízissel szkríneltük. Kiválasztottunk egy kiónt, amely egy-egy EarI-, Ncol-, 40 Asp718- és EcoRI-helyet tartalmazott, ami az oligonukleotidok pontos inszertálódását jelzi. Ezt a kiónt pSK6nak neveztük el (9. ábra). A T7-promoter utáni DNS-régió szekvenálásával megerősítettük, hogy a várt szekvenciájú oligonukleotidok inszertálódtak.

A fentebb leírt alap-génkonstrukcióhoz ismétlődő heptád-kódolószekvenciákat adtunk, oly módon, hogy az alapgén egyedi Earl-helyére közvetlenül ligálható oligonukleotidpárokat hoztunk létre. Az SM84- és SM85-oligonukleotid (23., illetve 24. azonosító számú szekvencia) az SSP5-heptád ismétlődéseit, míg az SM82- és SM83-oligonukleotid (25., illetve 26. azonosító számú szekvencia) az SSP7-heptád ismétlődéseit kódolja.

SSP5 Μ E E K Μ K A

SM84 5’-GATGGAGGAGAAGATGAAGGC- 3 ’ SM85 3’-CCTCCTCTTCTACTTCCGCTA- 5’ SSP7 Μ E E K L K A

SM82 5 ’-GATGGAGGAGAAGCTGAAGGC- 3’ SM83 3 ’-CCTCCTCTTCGACTTCCGCTA- 5’ (28. azonosító számú szekvencia) (23. azonosító számú szekvencia) (24. azonosító számú szekvencia) (27. azonosító számú szekvencia) (26. azonosító számú szekvencia)

Az expressziós vektorba inszertálható - sok hep- 50 tádismétlődést kódoló - DNS-ffagmensek előállítása érdekében oligonukleotidpárokat ligáltunk össze, illetve tisztítottunk. Az egyes párokat alkotó (összesen kb.

pg tömegű) oligonukleotidokat kinázzal kezeltük, és szobahőmérsékleten két órán át ligáltuk. Az oligonuk- 55 leotidpárok ligáit multimereit 18%-os, nem denaturáló 20 cmx20 cm χ 0,015 cm méretű poliakrilamid gélen (akrilamid:biszakrilamid=19:l) különítettük el. A gélen 168 bp-os (8n) vagy nagyobb fragmensként elkülönült multimer formákat úgy tisztítottuk, hogy a poliak- 60 rilamid gél - megfelelő sávot tartalmazó - kis részletét apró darabokra vágtuk, 0,5 M ammónium-acetát és 1 mM EDTA (pH=7,5) 1,0 ml térfogatú elegyét adtuk hozzá, és a csövet 37 °C-on egy éjszakán keresztül forgattuk. A poliakrilamidot lecentrifugáltuk, a felülúszóhoz 1 pg tRNS-t adtunk, a DNS-ffagmenseket kétszeres térfogatnyi etanollal -70 °C-on kicsaptuk, 70%-os etanollal mostuk, szárítottuk, majd 10 pl vízben újraszuszpendáltuk.

A pSK6-DNS 10 pg-ját Earl-enzimmel teljesen megemésztettük, és boíjúbél-alkalikusfoszfatázzal kezeltük.

HU 222 085 Β1

A hasított és foszfatázzal kezelt vektor-DNS-t alacsony olvadáspontú agarózgélen elektroforézisnek vetettük alá, majd a DNS-sávot kivágtuk, az agarózgélt 55 °C-ra melegítve felolvasztottuk, és a DNS-t „NACS PREPAC™”-oszlopokon (BRL), a gyártó által javasolt eljárással tisztítottuk. Hozzávetőleg 0,1 pg - tisztított, Earlgyel emésztett és foszfatázzal kezelt - pSK6-DNS-t a gélen tisztított multimer oligonukleotidpárok 5 μΐ-ével elegyítettünk, és ligálási reakciót végeztünk. A ligáit eleggyel E. coli JM103-törzset [supE thi dél (lac- 10 proAB) F’ (traD36 porAB, laclq lacZ dél M15) restrikció mínusz] transzformáltunk, és tetraciklinrezisztens telepeket szelektáltunk. A kiónokat (az inszertált DNS hosszúságának meghatározása érdekében) gyors plazmid-DNS-preparátumok restrikciós emésztésével szkrí- 15 neltük. A restrikciós endonukleázos vizsgálatot rendszerint úgy végeztük, hogy a plazmid-DNS-eket Asp718és BglII-enzimmel emésztettük, majd a kapott fragmenseket 18%-os, nem denaturáló poliakrilamid gélen elkü5 lönítettük. A ffagmenseket etídium-bromidos festéssel tettük láthatóvá, s ennek eredményeként megállapítottuk, hogy amennyiben csak az alapgén-szekvencia volt jelen, 150 bp-os fragmens képződött. Az oligonukleotidfragmensek inszertjei ezt a méretet 21 bázis többszöröseivel növelték. E szkrinelésből több kiónt választottunk ki a DNS-szekvencia-analízishez és a kódolt szekvenciák E. coliban történő expresszálásához. Az egyes konstrukciók szekvenciáját szegélyező első és utolsó SSP5-heptádok a fentebb leírt alapgénből származnak. Az inszerteket aláhúzással jelöltük (4. táblázat).

4. táblázat

Klón	Szekvenciaazonosító szám	Szekvencia a hcptád-aminosav-ísmétlődés alapján (SSP)	Szekvenciaazonosító szám
C15	29.	5.7.7.7.7.7.5	30.
C20	31.	5.7.7.7.7.7.5	32.
C30	33.	5.7.7.7.7.5	34.
D16	35.	5.5.5.5	36.
D20	37.	5.5.5.5.5	38.
D33	39.	5.5.5.5	40.

Mivel az oligonukleotidok oligomerformáinak géltisztítása nem eredményezte a hosszabb (>8n) inszertek várt felszaporodását, az inszerciós konstrukciók egy újabb sorozatához egy másik eljárást alkalmaztunk. Erre a célra négy újabb oligonukleotidpárt alakítottunk ki, melyek az SSP8-, SSP9-, SSP10-, illetve SSPll-aminosavszekvenciát kódolják:

SSP8

SM86 5’ SM87 3 ’ SSP9

SM88 5 ’ SM89 3 ’ SSP10 SM90 5 ’ SM91 3 ’ SSP11 SM92 5 ’ SM93 3 ’

Μ E E K L K K -GATGGAGGAGAAGCTGAAGAA-3’ -CCTCCTCTTCGACTTCTTCTA-5’

Μ E E K L K W -GATGGAGGAGAAGCTGAAGTG-3’ -CCTCCTCTTCGACTTCACCTA-5’

Μ E E K Μ K K -GATGGAGGAGAAGATGAAGAA-3’ -CCTCCTCTTCTACTTCTTCTA-5’

Μ E E K Μ K W -GATGGAGGAGAAGATGAAGTG-3’ -CCTCCTCTTCTACTTCACCTA-5’ (49. azonosító számú szekvencia) (41. azonosító számú szekvencia) (42. azonosító számú szekvencia) (50. azonosító számú szekvencia) (43. azonosító számú szekvencia) (44. azonosító számú szekvencia) (51. azonosító számú szekvencia) (45. azonosító számú szekvencia) (46. azonosító számú szekvencia) (52. azonosító számú szekvencia) (47. azonosító számú szekvencia) (48. azonosító számú szekvencia)

Az oligonukleotidpárok multimer alakjainak tisztításához (az oligonukleotidok fentebb leírt kinázos kezelése és ligálása után) a következő, nagy teljesítményű vékonyréteg-kromatográfiás (HPLC) eljárást alkalmaztuk. A kromatográfiát „Hewlett Packard Liquid Chromatograph” készüléken (1090M modell) végeztük. Az effluens abszorbanciáját 260 nm-nél mértük. A ligáit oligonukleotidokat 12 OOOxg-vel 5 percig centrifugáltuk, majd 0,5 pm-es „in-line” szűrővel (Superco) felszerelt 2,5 μ TSK DEAE-NPR ioncserélő oszlopra (35 cm χ 4,6 mm [belső átmérő]) injektáltuk. Az oligonukleotidok - gradienselúcióval és kétpufferes mobilfázissal [„A”puffer: 25 mM trisz-Cl, (pH=9,0); „B” puffer: „A” puffer+1 M NaCl], A két puffért - felhasználás előtt - 0,2 pm-es szűrőn engedtük át. 30 °C-on 1 ml/perc átfolyási sebességgel a következő gradiensprogramot alkalmaztuk:

I Idő	, A puffer (%)	„B” puffer (%)
Kezdés	75	25
0,5 perc	55	45
5 perc	50	50

HU 222 085 Bl

Táblázat (folytatás)

Idő	, A” puffer (%)	„B” puffer (%)
20 pere	38	62
23 perc	0	100
30 perc	0	100
31 perc	75	25

A 3. és 9. perc között 500 μΐ-es frakciókat gyűjtöttünk. A plazmid-DNS-ek restrikciós emésztményeinek kontrollelválasztása alapján meghatározott, 120 bp és 2000 bp közötti hosszúságnak megfelelő frakciókat egyesítettük.

Az egyes oligonukleotidpárok egyesített frakcióinak 4,5 ml-ét 10 pg tRNS és 9,0 ml etanol hozzáadásával kicsaptuk, 70%-os etanollal kétszer öblítettük, és 50 μΐ vízben újraszuszpendáltuk. A HPLC-vel tisztított, újraszuszpendált oligonukleotidok 10 pl-ét a fentebb leírt, 20 Earl-gyel hasított, foszfatázzal kezelt pSK6-DNS 0,1 pg-jához adtuk, és 15 °C-on egy éjszakán át ligáitok.

Mind a hat - fentebb leírt, kinázzal kezelt és önmagával ligáit (de gélen vagy HPLC-vel nem tisztított) - oligonukleotidpárt szintén felhasználtuk a pSK6-vektorral végzett külön ligálási reakciókban. A ligálási eleggyel 5 E. co//-DH5a-[supE44 dél lacU169 (phi 80 lacZ dél M15) hsdR17 recAl endAl gyrl96 thil relAl] törzset transzformáltunk, és tetraciklinrezisztens telepeket szelektáltunk. Valamennyi későbbi munkához a DH5a [supE44 dél lacU169 (phi 80 lacZ dél Ml5) 10 hsdR17 recAl endAl gyrl96 thil relAl] törzset választottuk ki, mivel ez a törzs nagyon nagy transzformációs gyakoriságot mutat, és recA- fenotípusú. A recA~-fenotípus elveti annak lehetőségét, hogy ezek az ismétlődő DNS-struktúrák (multimer szekvenciák deléciójához ve15 zető) homológ rekombináció szubsztrátjai lennének.

A kiónokat a fentebb leírtak szerint szkríneltük. Több kiónt választottunk ki, melyek a hat oligonukleotidpár inszercióit reprezentálják. A szekvenciát szegélyező első és utolsó SSP5-heptád az alapgén-szekvenciát reprezentálja. Az inszertszekvenciákat aláhúzással jelöltük. A kiónok azonosító számában a „H” HPLCvel tisztított oligonukleotidokat jelöl (5. táblázat).

5. táblázat

Klón	Szekvenciaazonositó szám	Szekvencia a heptád-aminosav-ismétlődés alapján (SSP)	Szekvenciaazonosító szám
82-4	53.	7.7.7.7.7.7.5	54.
84-H3	55.	5.S.5.5	56.
86-H23	57.	5.8.8.5	58.
88-2	59.	5.9.9.9.5	60.
90-H8	61.	5.10.10.10.5	62.
92-2	63.	5.11.11.5	64.

A 82-4-klónban az első alapgén-ismétlődés eltűnése az 5.5-alapgén-ismétlődések közötti - a pSK6-vektor recA~ - törzsbe történő bevitele előtti - homológ rekombináció eredménye lehet. A HPLC-eljárás nem növelte az oligonukleotidpárok hosszabb multimer alakjainak alapgénbe történő inszerciójának mértékét, azonban a ligáit oligonukleotidok hatásos tisztítási módját biztosította.

Olyan oligonukleotidokat terveztünk, amelyek az SSP-szekvenciák keverékét kódolják, és amelyekben a kodonfelhasználást a lehető legnagyobb mértékben variáltuk. Ezt annak érdekében tettük, hogy a szintetikus gének növényekbe történő transzformálása után csökkentsük az ismétlődő inszertek rekombináció útján bekövetkező deléciójának lehetőségét, és hogy növeljük a kialakított génszegmensek hosszát. Ezek az oligonukleotidok négy, ismétlődő heptádegységet (28 aminosavat) kódolnak, és a korábban kialakított kiónok bármelyikének egyedi Earl-helyére inszertálhatók. Az SM96- és SM97oligonukleotid SSP(5)₄-proteint, az SM98- és SM99-oligonukleotid SSP(7)₄-proteint, az SM100- és SMlOl-oligonukleotid pedig az SSP8.9.8.9-proteint kódolja.

ΜΕ EKMKAME EKMKAME E SM96 5 ’ -GATGGAGGAAAAGATGAAGGCGATGGAGGAGAAAATGAAAGCTATGGAG GA SM97 3’-CCTCCTTTTCTACTTCCGCTACCTCCTCTTTTACTTTCGATACCTCCT (67. azonosító számú szekvencia) (65. azonosító számú szekvencia) (66. azonosító számú szekvencia) K A Μ E E

KMKAMEEKMKA AAAGATGAAAGCGATGGAGGAGAAAATGAAGGC-3’ TTTCTACTTTCGCTACCTCCTCTTTTACTTCCGCTA- 5’

MEEKLKAMEEKL

SM98 5 ’ -GATGGAGGAAAAGCTGAAAGCGATGGAGGAGAAACTCAAGGCTATGGAAGA SM99 3 ’ -CCTCCTTTTCGACTTTCGCTACCTCCTCTTTGAGTTCCGATACCTTCT

HU 222 085 Β1 (70. azonosító számú szekvencia) (68. azonosító számú szekvencia) (69. azonosító számú szekvencia) L K W Μ E E

KLKAMEEKLKA AAAGCTTAAAGCGATGGAGGAGAAACTGAAGGC-3’ TTTCGAATTTCGCATCCTCCTCTTTGACTTCCGCTA-5’

MEEKLKKMEEK

SM100 5 ’ -GATGGAGGAAAAGCTTAAGAAGATGGAAGAAAAGCTGAAATGGATGGAGGA SM101 3’-CCTCCTTTTCGAATTCTTCTACCTTCTTTTCGACTTTACCTACCTCCT

KLKKME EKLKW (73. azonosító számú szekvencia)

GAAACTCAAAAAGATGGAGGAAAAGCTTAAATG- 3 ’ (71. azonosító számú szekvencia)

CTTTGAGTTTTTCATCCTCCTTTTCGAATTTACCTA - 5 ’ (72. azonosító számú szekvencia)

A 82-4- és 84-H3-klónból származó DNS-t Earlenzimmel teljesen megemésztettük, foszfatázzal kezeltük, majd géltisztításnak vetettük alá. A kapott DNS kb.

0,2 pg-ját az SM96 és SM97; SM98 és SM99; vagy az SM100 és SMIOl-oligonukleotidpárok (melyeket előző- 15 lég kinázzal kezeltünk) 1,0-1,0 pg-jával elegyítettük.

Az DNS-t és az oligonukleotidokat egy éjszakán át ligáltuk, majd a ligálási eleggyel E. coli DH5a-törzset transzformáltunk. A tetraciklinrezisztens telepeket a fentebb leírtak szerint, az oligonukleotidinszertek jelenlétére szkríneltük. A kiónok restrikciós endonukleázos emésztési mintázatán alapuló szekvenciaanalízishez az alábbi kiónokat választottuk ki (lásd: 6. táblázat; az inszertált oligonukleotidszegmenseket aláhúzással jelöltük).

6. táblázat

Klón	Szekvenciaazonosító szám	Szekvencia a hcptád-aminosav-ismétlödcs alapján (SSP)	Szekvenciaazonosító szám
2-9	74.	7.7.7.7.7.7.8.9.8.9.5	75.
3-5	78.	7.7.7.7.7.7.5.5	79.
5-1	76.	5.5.5.7.7.7.7.5	77.

A 2-9-klón a 82-4-klón (lásd: fentebb) Earl-helyére ligáit SM100- (71. azonosító számú szekvencia) és SMlOl-oligonukleotidból (72. azonosító számú szekvencia) származott. A 3-5-klón a SM96- (65. azonosító számú szekvencia) és SM97-oligonukleotid alkotta oligonukleotidpár első 22 bázisának 82-4-klón (53. azonosító számú szekvencia) Earl-helyére történő inszerciójából származott. Ez a részleges inszerció az ismétlődő oligonukleotidok nem megfelelő hibridizációjából eredhet. Az 5-1-klón (76. azonosító számú szekvencia) a 84-H3-klónt (55. azonosító számú szekvencia) Earlhelyére ligáit SM98- (68. azonosító számú szekvencia) és SM99-oligonukleotidból (69. azonosító számú szekvencia) származik.

A DNS- és aminosavszekvencia nagyobb flexibilitásának elérése érdekében a szintetikus génszekvenciák kialakításának egy másik stratégiáját valósítottuk meg, melyet a 10. és 11. ábrán mutatunk be. Az első lépésben egy 16 aminosavat kódoló alapgént alkotó oligonukleotidszekvenciát az eredeti pSK5-vektorba inszertáltunk. Ez az oligonukleotidinszert - a korábbi alapgén-konstrukcióhoz hasonlóan - tartalmazott egy egyedi Earl-helyet, amely egy vagy több heptádismétlődést kódoló oligonukleotidok inszertálásához alkalmas. Az alapgén a 3’-végén BspHI-helyet is tartalmazott. E hasítási hely túlnyúló végeit úgy terveztük, hogy Ncoltúlnyúló végek felhasználásával leolvasási kereten belüli („in ffame”) proteinfúziókat tegyen lehetővé. Ennek megfelelően, a génszegmensek all. ábrán bemutatott duplikációs séma szerint sokszorosíthatók. Az oligonukleotidpár túlnyúló végeit a pSK5-vektor egyedi Ncol- és EcoRI-helyére inszeráltuk.

MEEKMKKLEEK SM107 5’-CATGGAGGAGAAGATGAAAAAGCTCGAAGAGAAG SM106 3’-CTCCTCTTCTACTTTTTCGAGCTTCTCTTC

Ncol. EarI

Μ K V Μ K (82. azonosító számú szekvencia)

ATGAAGGTCATGAAGTGATAGGTACCG- 3 ’ (80. azonosító számú szekvencia)

TACTTCCAGTACTTCACTATCCATGGCTTAA- 5 ’ (81. azonosító számú szekvencia)

BspHI Asp718

Az oligonukleotidpárt az első stratégiában leírtak szerint pSK5-vektorba inszertáltuk, és a kapott plazmidot pSK34-nek neveztük el.

A pSK34-plazmid egyedi Earl-helyére - a fentebb leírt eljárás alkalmazásával - 35 aminosavas „szegmen- 60 seket” kódoló oligonukleotidpárokat ligáltunk. Ebben az esetben az oligonukleotidokat nem tisztítottuk gélen vagy HPLC-vel, hanem egyszerűen hibridizáltuk, és úgy használtuk fel a ligálási reakcióban. A következő oligonukleotidpárokat alkalmaztuk:

HU 222 085 Β1

SEG3 LEEKMKAMEDKMKW

SM110 5’-GCTGGAAGAAAAGATGAAGGCTATGGAGGACAAGATGAAATGG SM111 3’-CCTTCTTTTCTACTTCCGATACCTCCTGTTCTACTTTACC

L Ε Ε K Μ K K CTTGAGGAAAAGATGAAGAA-3’ GAACTCCTTTTCTACTTCTTCGA-5’ SEG4

L Ε Ε K Μ K SM112 5’-GCTCGAAGAAAGATGAAGGCAATGGAAGACAAAATGAAGTGG SM113 3’-GCTTCTTTCTACTTCCGTTACCTTCTGTTTTACTTCACC

L Ε Ε K Μ K K CTTGAGGAGAAAATGAAGAA-3’ GAACTCCTCTTTTACTTCTTCGA-5’ SEG5 L K Ε Ε M A

SM114 5 ’ -GCTCAAGGAGGAAATGGCTAAGATGAAAGACGAAATCTGGAAA SM115 3’-GTTCCTCCTTTACCGATTCTACTTTCTGCTTTACACCTTT

L K Ε Ε Μ K K

CTGAAAGAGGAAATGAAGAA

GACTTTCTCCTTTACTTCTTCGA (85. azonosító számú szekvencia) (8-28. aminosav) (83. azonosító számú szekvencia) (84. azonosító számú szekvencia) AMEDKMKW (86. azonosító számú szekvencia) (8-28 aminosav) (87. azonosító számú szekvencia) (88. azonosító számú szekvencia) KMKDEMWK (89. azonosító számú szekvencia) (8-28. aminosav) (90. azonosító számú szekvencia) (91. azonosító számú szekvencia)

A kiónokat restrikciós emésztéssel, majd a kapott fragmensek 6%-os akrilamid géleken végzett elválasztásával az inszertálódott szegmensek jelenlétére szkríneltük. Az oligonukleotidok pontos inszercióját DNS-szekvencia-analízissel igazoltuk. A 3., 4. és 5. szegmenst tartalmazó kiónokat pSKseg3-nak, pSKseg4-nek, illetve pSKseg5-nek neveztük el.

Ezeket a „szegmens”-klónokat all. ábrán bemutatott duplikációs eljárásban alkalmaztuk. A pSKseg3plazmid 10 pg-ját Nhel-gyel és BspHI-gyel teljesen megemésztettük, és az 1503 bp-os fragmenst „Whatmann”-papíros-technika alkalmazásával, agarózgélről izoláltuk. A pSKseg4-plazmid 10 pg-ját Nhel-gyel és Ncol-gyel teljesen megemésztettük, és 2109 bp-os fragmenst izoláltunk. A kapott fragmenseket ligáltuk, és tetraciklinrezisztencia alapján rekombinánsokat szelektáltunk. A kiónokat restrikciós emésztéssel szkríneltük, és ellenőriztük szekvenciájukat. A kapott plazmidot pSKseg34-nek neveztük el.

A pSKseg34 és pSKseg5-plazmid-DNS-t megemésztettük, a kapott fragmenseket izoláltuk, és az előbbivel azonos módon ligáltuk, miáltal olyan plazmidot kaptunk, amely az egymáshoz fuzionált 3., 4. és 5. szegmenst kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazta. Ezt a konstrukciót pSKseg534-nek neveztük el, s az általa kódolt aminosavszekvencia a következő:

SSP534: NH₂-MEEKMKKLKEEMAKMKDEMWKLKEEMKKLE EKMKVMEEKMKKLEEKMK AMEDKMKWLEEKMKKLEKMKAMEDKMKWLEEKMKK LEEKMKVMK-COOH (92. azonosító számú szekvencia).

9. példa

SSP-kiméragének kialakítása növényi magvakban történő expresszióhoz

A 8. példában leírt szintetikus géntermékek növényi magvakban történő expresszálása érdekében a szekvenciákat a magi promotereket tartalmazó CW108-, CW109-, illetve ML113-vetorba inszertáltuk. A CW108- és ML113-vektor a bab-phaseolinpromotert (a +1 bázistól a -494. bázisig) és a bab-phaseolingén 3'-szekvenciáinak 1191 bázisát tartalmazza. A CW109-vektor a szójabab-P-konglicinin-promotert (a +1 bázistól a -619. bázisig) és a bab-phaseolingén 3'-szekvenciáinak előzővel azonos 1191 bázisát tartalmazza. Ezeket a vektorokat úgy terveztük, hogy lehetővé váljon a kódolószekvenciák egyedi Ncol- és Asp718-helyre történő közvetlen klónozása. E vektorok az 5’- és 3’-végen olyan helyeket tartalmaznak (HindlII vagy Sáli), amelyek lehetővé teszik a promoter/kódolórégió/3'-szekvenciák közvetlenül megfelelő biner vektorokba történő bevitelét.

A szintetikus tartalékprotein-génszekvenciák inszertálása érdekében 10 pg vektor-DNS-t Asp718- és Ncol-enzimmel teljesen megemésztettünk, majd a linearizált vektort 1,0%-os agarózgélen, 15 V feszültséggel, egy éjszakán át végzett elektroforézissel tisztítottuk. A gélt a sáv előtt elvágtuk, 10 mmx5 mm-es „Whatman 3 MM”-papírt helyeztünk rá, majd a fragmenst a papírra elektroforizáltuk [Errington: Nucleic Acids Research 18, 17 (1990)]. A fragmenst és a puffért lecentrifúgáltuk a papírról, és a kapott, kb. 100 pl térfogatú felülúszóban lévő DNS-t 10 pg tRNS, 10 pl 3 M nátrium-acetát-oldat és 200 pl etanol hozzáadásával kicsaptuk. A kicsapott DNS-t 70%-os etanollal kétszer mostuk és vákuum alatt megszárítottuk. A DNS-fragmenst 20 pl vízben újraszuszpendáltuk, és egy részét a ligálási reakciókban történő felhasználáshoz - 10szeres térfogatra hígítottuk.

A 3-5- és pSK534-klónból származó plazmid-DNSt (10 mg) Asp718- és Ncol-enzimmel teljes emésztésnek vetettük alá. Az emésztési termékeket - a 8. példában leírtak szerint - 18%-os, nem denaturáló poliakrilamid gélen elválasztottuk. A kívánt fragmenseket tartalmazó géldarabokat kivágtuk a gélből. A fragmensek tisztítása érdekében a géldarabokat 1%-os agarózgélbe helyeztük, majd 20 percig 100 V feszültséggel elektroforizáltuk. A DNS-fragmenseket 10x5 mm-es „Whatman 3 MM”-papíron összegyűjtöttük, a puffért és a fragmenseket lecentrifúgáltuk, majd a DNS-t etanollal kicsaptuk. A fragmenseket 6 pl vízben újraszusz31

HU 222 085 Bl pendáltuk, és a kapott szuszpenzióhoz a fentebb leírt, hígított vektorfragmens 1 μΐ-ét, 2 μΐ 5 x ligálópuffert és 1 μΐ T4-DNS-ligázt adtunk, és az elegyet 15 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk.

A ligálási eleggyel E. co/z-DH5a [supE44 dél 5 lacU169 (phi 80 lacZ dél M15) hsdR17 recAl endAl gyrl96 thil relAl] törzset transzformáltunk, és ampicillinrezisztens telepeket szelektáltunk. A klóno- kát gyors plazmid-DNS-ek restrikciós endonukleázos emésztési vizsgálatával és DNS-szekvenálással szkrí- 10 neltük.

70. példa

Phaseolinpromoter/cts/ecodapA, phaseolinpromoter/cts/lysC-M4 és P-konglicinin-promo- 15 ter/SSP3-5 kiméragéneket tartalmazó dohánynövények

A 9. példában kialakított SSP3-5-kiméragén és a 4. példában előállított E. co/r-dapA- és lysC-M4-kiméragének dohánynövényekbe történő beviteléhez a biner 20 pZS97-vektort alkalmaztuk. A biner pZS97-vektor (13. ábra) az Agrobacterium tumefaciens biner Ti-plazmidvektor-rendszerének [Bevan: Nucl. Acids Rés. 72,

8711 (1984)] része. A vektor a következő komponenseket tartalmazza: (1) transzformált növényi sejtek sze- 25 lektálható markereként a nopalin-szintáz: neomicinfoszfo-transzferáz kiméragént (nos:NPTII) [Beevan és munkatársai: Natúré, 304, 184 (1983)]; (2) a Ti-plazmid T-DNS-ének jobb és bal oldali határát [Bevan: Nucl. Acids Rés. 72, 8711 (1984)]; (3) az E. coli-lacZ 30 a-kiegészítőszegmensét [Viering és munkatársai: Gene 19, 259 (1982)] (a polilinkerrégióban egyedi Sallhellyel (pSK97K) vagy egyedi HindlII-hellyel (pZS97); (4) a T’seiií/omonűs-pVSl-plazmid bakteriális replikációs kezdőhelyét [Itoh és munkatársai: Plasmid 35 77, 206 (1984)]; és (5) - a transzformált A. tumefaciens számára szelektálható markerként - bakteriális β-laktamáz-gént.

A pZS97-plazmid-DNS-t HindlII-enzimmel teljes emésztésnek vetettük alá, és az emésztett plazmidot gé- 40 len tisztítottuk. A HindlII-mal emésztett pZS97-DNS-t - HindlII-mal emésztett és gélen izolált kiméragénfragmensekkel elegyítettük, ligáltuk, a fentiek szerint transzformáltuk, és a telepeket ampicillinrezisztenciára szelektáltuk. 45

A kiméragéneket tartalmazó biner vektorokat háromszülős párosításokkal [Ruvkin és munkatársai: Natúré 289, 85 (1981)] Agrobacterium LBA4404/pAL4404 törzsbe [Hockema és munkatársai: Natúré 303, 179 (1983)] vittük be, és a baktériumokat karbenicillinrezisz- 50 tenciára szelektáltuk. A biner vektort tartalmazó Agroóacteriu/M-tenyészeteket dohánylevélkorongok transzformálásához alkalmaztuk [Horsch és munkatársai: Science 227, 1229 (1985)]. Kanamicint tartalmazó szelektív táptalajon transzgenikus növényeket regenerál- 55 tünk.

A fenti eljárással β-konglicinin-promoter/SSP35/phaseolin-3’-régió kiméragént tartalmazó, transzformáit dohánynövényeket kaptunk. A markergén - kanamicinrezisztenciára vonatkozó -3:1 arányú szegregá- 60 ciója alapján két transzformált vonalat (pSJ44-3A és pSK44-9A) azonosítottunk, melyek az SSP3-5-gént egyetlen helyre inszertálva tartalmazták. Az elsődleges transzformánsok utódait (pSK44-3A-6 és pSK44-9A5), melyek a transzgénre nézve homozigóták voltak, e növények magjaiban a kanamicinrezisztencia 4:0 arányú szegregációja alapján azonosítottuk.

Hasonlóan, a phaseolin-5’-régió/cts/lysC-M4/phaseolin-3’-régió, illetve phaseolin-5’-ré-gió/cts/ecodapA/phaseolin-3’-régió kiméragént tartalmazó, transzformált dohánynövényeket állítottunk elő. A markergén - kanamicinrezisztenciára vonatkozó 3:1 arányú szegregációja alapján egy transzformált vonalat (BT570-45A) azonosítottunk, amely a DHDPS- és AK-gént egyetlen helyre inszertálva tartalmazta. Az elsődleges transzformánsok utódait (BT570-45A-3 és BT570-45A-4), melyek a transzgénre nézve homozigóták voltak, e növények magjaiban a kanamicinrezisztencia 4:0 arányú szegregációja alapján azonosítottuk.

A mindhárom kiméragént hordozó növények kialakítása érdekében a homozigóta szülők felhasználásával genetikai keresztezéseket végeztünk. A növényeket melegházi körülmények között érett állapot eléréséig neveltük. A porzós, illetve termős virágokként alkalmazni kívánt virágokat a kinyílás előtt egy nappal választottuk ki, és a virágzat idősebb virágait eltávolítottuk. A keresztezéshez a nőivarú virágokat közvetlenül a kinyílás előtt választottuk ki, amikor a portokok még nem nyíltak fel. A pártát egyik oldalán felnyitottuk, és a porzókat eltávolítottuk. Porzós virágokként olyan virágokat választottunk ki, amelyek ugyanazon a napon nyíltak ki, és amelyekben a felnyílt portokokból érett pollen szabadult ki. A porzókat eltávolítottuk, és a kivágott porzójú termős virágok bibéinek beporzásához alkalmaztuk. A bibéket ezután - a további beporzás elkerülése érdekében - műanyag csövekkel borítottuk be. A tokterméseket - kifejlődésük után - 4-6 hétig hagytuk száradni, majd összegyűjtöttük. Mindegyik keresztezésből 2-3 külön toktermést kaptunk. A következő keresztezéseket végeztük:

Porzós

BT570-45A-3

BT570-45A-4 pSK44-3A-6

BT570-45A-5

Termős pSK44-3A-6 pSK44-3A-6

BT570-45A-4 pSK44-9A-5 pSK44-9A-5 BT570-45A-5

A szárított tokterméseket feltörtük, a magvakat összegyűjtöttük, és az egyes keresztezésekből származókat csoportosítottuk. Az egyes keresztezésekből, valamint minden egyes szülő önmegtermékenyített virágából származó kontrollmagvakból 30-30 darabot tettünk egy-egy csoportba. A magmintákat - kétszeri ismétléssel - az 5. példában leírtak szerint hidrolizáltuk és összes aminosavtartalomra vizsgáltuk. Az összes aminosavmennyiségre vonatkoztatott lizintartalom vad típusú magvak 2,56% lizintartalmához viszonyított - növekedését, valamint a magvak endospermiumában az egyes gének kópiaszámát, a 7. táblázatban mutatjuk be.

HU 222 085 Β1

7. táblázat

Porzósxtetmős	Gének kópiaszáma az endospermiumban	Lizintartalom növekedése
AKésDHDPS	SSP
BT570-45AxBT570-45A	1,5*	0	0
pSK44-9AxpSK44-9A	0	1,5*	0,12
pSK44-9 A-5 χ pSK44-9A-5	0	3,0	0,29
pSK44-9A-5 χ BT570-45A-5	2	1	0,6
BT570-45A-5 χ pSK44-9 A-5	1	2	0,29
pSK44-3AxpSK44-3A	0	1,5*	0,28
pSK44-3 A-6 χ pSK44-3 A-6	0	3,0	0,5
pSK44-3A-6x BT570-45A-4	2	1	0,62
BT570-45A-3 x pSK44-3 A-6	1	2	0,27
BT570-45A-4 χ pSK44-3 A-6	1	2	0,29

* több mag kópiaszámának átlaga

E keresztezések eredményei azt bizonyítják, hogy a magvakban - a lizinbioszintézis-gének és a nagy lizintartalmú SSP3-5-protein összehangolt expressziójával - az összes lizinmennyiség 10-25%-kal fokozható. A hibridnövényekből származó magvakban ez a szinergizmus akkor a legerősebb, ha a bioszintéziségének a termős szülőből származnak (feltehetően az endospermiumban lévő génmennyiség miatt). Várható, hogy - amennyiben a bioszintézisgének és a nagy lizintartalmú proteingének mindegyike homozigóta - a lizinszint tovább növelhető.

11. példa

A phaseolinpromoter/cts/cordapA és phaseolinpromoter/SSP3-5 kiméragént tartalmazó szójababnövények

A phaseolinpromoter/cts/cordapA/phaseolin-3'-régió kiméragént expresszáló, transzformált szójababnövényeket a 6. példában írtuk le. A phaseolinpromoter/SSP3-5/phaseolin-3’-régió kiméragént expresszáló, transzformált szójababnövényeket úgy kaptuk, hogy a kiméragént - izolált HindlII-fragmensként - megfelelő szójabab-transzformáló vektorba (pML63; 14. ábra, 6. példa) inszertáltuk, és a kapott plazmiddal a 6. példában leírtak szerint elvégeztük a transzformációt.

Az elsődleges transzformánsok magjaiból úgy vettünk mintát, hogy a magvak embriótengelytől távoli oldaláról kis szeleteket vágtunk ki. Ezeket a szeleteket a 6. példában leírt módon GUS-aktivitásra vizsgáltuk, hogy meghatározzuk, a szegregálódó magvak közül melyek hordozzák a transzgéneket. A magvak felét lisztté őröltük, és ELISA-vizsgálattal SSP3-5-protein expressziójára vizsgáltuk. Az ELISA-vizsgálatot a következők szerint végeztük.

„Pharmacia™ pGEX GST Gene Fusion System” [„Current Protocols in Molecular Biology”, 2. kötet,

16.7.1-8 oldal, John Wiley and Sons (1989)] alkalmazásával a glutation-S-transzferáz és az SSP3-5-géntermék fúziós proteinjét hoztuk létre. A fúziós proteint glutationagaróz (Sigma) vagy glutation-„Sepharose”gyöngyökön (Pharmacia) tisztítottuk, „Centricon 10™”-filterek (Amicon) alkalmazásával bekoncentráltuk, majd - további tisztítás érdekében - SDS-poliakrilamid gélelektroforézist végeztünk (15% akrilamid, akrilamid:biszakrilamid=19:1). A gélt „Coomassie Blue” festékkel 30 percig festettük, a nem kötődött festéket 50%-os metanol és 10%-os ecetsav elegyével eltávolítottuk, és a proteinsávokat „Amicon™ Centiluter Microelectroeluter” alkalmazásával elektroeluáltuk [Paul T. Matsudaira(szerk.): „APractical Guideto Protein and Peptide Purification fór Microsequencing”, Academic Press, Inc. New York (1989)]. Egy második

- az előzővel azonos módon készített és futtatott - gélt ecetsavat nem tartalmazó festékkel [9 rész - 50%-os metanolban készített - 0,1%-os „Coomassie Blue G250” (Bio-Rad) és 1 rész - desztillált vízben készített

- „Serva Blue” (Serva, Westbury, NY)] egy-két órán át festettünk. A gélről a nem kötődött festéket 20%-os metanol és 3%-os glicerin elegyével 0,5-1 órán át végzett kezeléssel távolítottuk el (melynek eredményeként csak a GST-SSP3-5 sáv volt látható a gélen). Ezt a sávot kivágtuk a gélről, és az elektroeluált anyaggal együtt a „Hazelton Laboratories” laboratóriumba küldtük („New-Zealand” nyúl immunizálásához antigénként történő alkalmazáshoz). Összesen 1 mg antigént alkalmaztunk (0,8 mg a gélben, 0,2 mg az oldatban). A tesztelő vérvételeket a „Hazelton Laboratories” három hetenként végezte. A hozzávetőleges titert

- a T7-promoter szabályozása alatt álló SSP3-5-gént tartalmazó - sejtekből készített E. co/Z-kivonatok „Westem-blot”-analízisével teszteltük (különböző protein- és szérumhígításoknál).

HU 222 085 Bl

A szérumból „Protein A sepharose”-oszlop alkalmazásával IgG-t izoláltunk, és az IgG-t - 5 pg/üreg mennyiségben - mikrotitertálcákra vittük. Az IgG egy másik részét biotiniláltuk.

A transzgenikus növényekből készített vizes kivonatokat hígítottuk és az üregekbe töltöttük, rendszerint 1 pg összes proteint tartalmazó mintával kezdve. A mintát többször hígítottuk, annak biztosítása érdekében, hogy a hígítások legalább egyike olyan eredményt adjon, amely az azonos tálcán készített standard görbe tartományába esik. A standard görbét kémiai úton szintetizált SSP3-5-protein alkalmazásával készítettük. A mintákat 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk, majd lemostuk a tálcát, és ezután az üregekhez hozzáadtuk a biotinilált IgG-t. A tálcát 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk és mostuk, majd az üregekhez sztreptavidinnel konjugált alkalikus foszfatázt adtunk, 37 °C-on ismét egy órás inkubálást végeztünk, majd a tálcát lemostuk. Ezután az üregekhez - 1 M dietanol-aminban 1 mg/ml p-nitro-fenil-foszfátot tartalmazó oldatból álló - szubsztrátot adtunk, és a tálcákat 37 °C-on újabb egy óra hosszat inkubáltuk. Az üregekhez 5%-os EDTA leállítóoldatot adtunk, és a 405 nm-nél mért abszorbanciaértékből levontuk a 650 nm-nél leolvasott értéket. A transzgenikus szójababmagvak az SSP3-5-proteinként 0,5-2,0% vízzel kivonható proteint tartalmaztak.

A GUS- és SSP3-5-proteinre pozitív magvak másik felét elültettük, és a kikelt növényeket melegházi körülmények között beérésig neveltük. A GUS-fenotípusra nézve homozigóta növények meghatározása érdekében ezekből az Rj növényekből származó magvakat a fentiek szerint a GUS-aktivitás szegregálódására szkríneltük. A phaseolin/SSP3-5 génre nézve homozigóta növényeket a Corynebacterium-dapA-génterméket expresszáló transzgenikus szójababnövényekkel kereszteztük.

Az SSP-kiméragén és a cordapA-kiméragén genetikai keresztezés útján történő összehozásának előnyös megvalósítási módja értelmében olyan szójababtranszformáló vektort készítettünk, amely mindkét gént tartalmazta. A phaseolinpromoter/SSP3-5/phaseolin3’-régió kiméragént hordozó, fentebb leírt pML63-plazmidot BamHI-enzimmel emésztettük, és a plazmidba phaseolinpromoter/cts/cordapA/phaseolin-3 ’-régió kiméragént (5. példa) tartalmazó BamHI-fragmenst inszertáltunk. A kapott vektorral - a 6. példában leírt módon - szójababot transzformálhatunk.

12. példa

Kiméragének kialakítása CorynebacteriumDHDPS és -SSP3-5 (transzformált kukorica embriójában és endospermiumában történő) expresszálásához

Kukorica transzformálásához a következő kiméragéneket állítottuk elő:

globulin-1 -promoter/mcts/cordapA/NOS-3 ’ -régió; glutelin-2-promoter/mcts/cordapA/NOS-3’-régió; globulin-l-promoter/SSP3-5/globulin-l-3’-régió; glutelin-2-promoter/SSP3-5/10kD-3’-régió.

A glutelin-2-promotert - publikált szekvencián [Reina és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 18, 6426 (1990)] alapuló láncindítók alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakcióval - genomiális kukorica-DNS-ből klónoztuk. A promoterfragmens - az „ATG” transzlációs startkodontól „upstream” irányban - 1020 nukleotidot foglal magában. Az, ATG” starthelyre - a közvetlen transzlációs fúziók elősegítése érdekében - polimeráz-láncreakcióval Ncol-helyet vittünk be. A promoter 5’-végére BamHI-helyet vittünk be. Az 1,02 kb-os BamHI-NcoI promoterffagmenst a pML63 növényi expressziós vektor (lásd: 11. példa) BamHI/NcoI helyére klónoztuk (kicserélve a 35S-promotert), miáltal a pML90-vektort kaptuk. Ez a vektor a glutelin-2-promotert a GUS-kódolórégióhoz és a NOS-3’-régióhoz kapcsolva tartalmazza.

A 10 kD-os zein 3’-régiója genomiális DNS-ből

- publikált szekvencián [Kirihara és munkatársai: Gene 71, 359 (1988)] alapuló láncindító oligonukleotid alkalmazásával végzett - polimeráz-láncreakcióval kialakított 10 kD-os zeingénklónból származik. A 3’-régió a stopkodontól számítva 940 nukleotidot foglal magában. A klónozás elősegítése érdekében, közvetlenül a „TAG” stopkodon után, oligonukleotidinszercióval KpnI-, Smal- és Xbal-helyeket építettünk be. A 10kD-3’-régiót tartalmazó Smal-HindHl szegmenst izoláltuk, és - Smal-gyel és HindlII-mal emésztett - pML90-vektorba ligáltuk, hogy a NOS3'-szekvenciát a lOkD 3’-régióval helyettesítsük, s ezáltal a pML103-plazmidot kaptuk, amely a glutelin-2promotert, a GUS-gén „ATG” startkodonja előtt egy Ncol-helyet, a stopkodon után Smal- és Xbal-helyet, valamint a 10 kD-os zein-3’-szekvencia 940 nukleotidját tartalmazza.

A globulin-1-promotert és a 3'-szekvenciákat - a globulin-1-gén publikált szekvenciáján [Kriz és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 636 (1989)] alapuló oligonukleotidpróbák alkalmazásával - Clontech genomiális kukorica-DNS-könyvtárból izoláltuk. A klónozott szegmens az ,ATG” transzlációs startkodontól „upstream” irányban 1078 nukleotidot magában foglaló promoterffagmenst, a teljes globulin-kódolószekvenciát (beleértve az intronokat is), és a transzlációs stopkodontól 803 bázist kitevő 3’-szekvenciát tartalmazza. A globulin-1-kódolószekvencia más kódolószekvenciákkal történő helyettesítésének elősegítése érdekében

- polimeráz-láncreakcióval - az ,ATG” startkodonhoz egy Ncol-helyet, a transzlációs stopkodon után pedig KpnI- és Xbal-helyet építettünk be, miáltal a pCC50-vektort kaptuk. A globulin- 1-promoterfragmensen belül van egy másik Ncol-hely is. A globulin-1-génkazettát HindlII-helyek szegélyezik.

Ismert, hogy a növényi aminosavbioszintézis-enzimek a kloroplasztiszokban helyezkednek el, s így kloroplasztiszspecifikus szignálszekvenciával együtt szintetizálódnak. A bakteriális proteinek (mint például a DHDPS) nem tartalmaznak ilyen szignálszekvenciákat, ezért - az alábbiakban leírt kiméragénekben - a cordapA-kódolószekvenciához egy kloroplasztisz-tranzitszekvenciát (cts) kapcsoltunk. A kukoricához a ku34

HU 222 085 Bl korica-ribulóz-l,5-difoszfát karboxilázenzime kis alegységének kloroplasztisz-tranzitszekvenciájából származó cts-t alkalmaztuk [Lebrun és munkatársai: Nucleic. Acids Rés. 75, 4360 (1987)], melyet - a szójababcts-től történő megkülönböztetés céljából - „acts”-nek nevezünk. A 93-98. azonosító számú oligonukleotidszekvenciákat lényegében a 4. példában leírtak szerint szintetizáltuk, illetve alkalmaztuk.

A kukorica kloroplasztiszspecifikus szignálszekvenciájának C-terminális részét kódoló - 93. és 94. azonosító számú - oligonukleotidszekvenciát hibridizáltuk egymással, miáltal Xbal- és Ncol-kompatibilis végeket kaptunk, majd a kapott, kétszálú oligonukleotidot poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk, és az Xbal-gyel és Ncol-gyel emésztett pBT492-plazmidba inszertáltuk (lásd: 3. példa). A megfelelő szekvencia inszercióját DNS-szekvenálással igazoltuk, és végeredményként a pBT556-plazmidot kaptuk. A kloroplasztiszspecifikus szignálszekvencia középső részét kódoló - 95. és 96. azonosító számú - oligonukleotidszekvenciát hibridizáltuk egymással, miáltal BglII- és Xbal-kompatibilis végeket kaptunk, majd a kapott, kétszálú oligonukleotidot poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk, és a BglII-vel és Xbal-gyel emésztett pBT556-plazmidba inszertáltuk. A megfelelő szekvencia inszercióját DNS-szekvenálással igazoltuk, s végeredményként a pBT557-plazmidot kaptuk. A kloroplasztiszspecifikus szignálszekvencia N-terminális részét kódoló - 97. és 98. azonosító számú - oligonukleotidszekvenciát hibridizáltuk egymással, miáltal Ncol- és AflII-kompatibilis végeket kaptunk, majd a kapott, kétszálú oligonukleotidot poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk, és az Ncol-gyel és AflIIvel emésztett pBT557-plazmidba inszertáltuk. A megfelelő szekvencia inszercióját DNS-szekvenálással igazoltuk, s végeredményként a pBT558-plazmidot kaptuk. E műveletek eredményeként az mcts-t a lysC-M4génhez fuzionáltuk.

Polimeráz-láncreakcióval a teljes mcts-t tartalmazó DNS-fragmenst állítottunk elő. Templát-DNS-ként a pBT558-plazmidot, láncindítóként pedig a következő oligonukleotidokat alkalmaztuk:

99. azonosító számú szekvencia: GCGCCCACCG TGATGA

100. azonosító számú szekvencia: CACCGGATTC TTCCGC

Az mcts-fragmenst az ecodapA-gén - DHDPS-protein N-terminálisát kódoló - részéhez kapcsoltuk, oly módon, hogy Ncol-gyel emésztettük, majd - az 5’túlnyúló szálak feltöltése érdekében - DNS-polimeráz „Klenow”-fragmensével kezeltük. Az inszertált fragmens és a vektor/inszert kapcsolódások - DNS-szekvenálás alapján - megfelelőnek bizonyultak. A kapott plazmidot pBT576-nak neveztük el.

A globulin-l-promoter/mcts/cordapA/NOS-3’-régió kiméragén kialakítása érdekében a pBT576-plazmidból mcts/ecodapA kódolószekvencia-szegmenst tartalmazó NcoI-KpnI fragmenst izoláltunk (lásd: 6. példa), és a kapott fragmenst Ncol-gyel és KpnI-gyel emésztett pCC50-plazmidba inszertáltuk, miáltal a pBT662-plazmidot kaptuk. Ezután az ecodapA-kódolószekvenciát cordapA-kódolószekvenciával helyettesítettük, melynek során az mcts - cordapA-kódolószekvenciához fuzionált - disztális kétharmad részét tartalmazó AflII-Kpnl fragmenst AflII-vel és KpnI-gyel emésztett pBT662-plazmidba inszertáltuk, miáltal a pBT677-plazmidot kaptuk.

A glutelin-2-promoter/mcts/cordapA/NOS-3’-régió kiméragén kialakítása érdekében a pBT677-plazmidból mcts/cordapA kódolószekvencia-szegmenst tartalmazó NcoI-KpnI fragmenst izoláltunk, majd a kapott fragmenst Ncol-gyel és KpnI-gyel emésztett pML90plazmidba inszertáltuk, miáltal a pBT679-plazmidot kaptuk.

A glutelin-2-promoter/SSP3-5/10kD-3’-régió kiméragén kialakítása érdekében a glutelin-2-promotert és a 10 kD-os zein-3’-régiót tartalmazó pML103-plazmidot (lásd: fentebb) Ncol-gyel és Smal-gyel hasítottuk. Az SSP3-5-kódolórégiót (9. példa) - Xbal-gyel végzett hasítással, majd a ragadós vég DNS-polimeráz „Klenow”-fragmensével történő feltöltésével és Ncolgyel végzett hasítással - Ncol-tompavégfragmensként izoláltuk. A 1933 bp-os Ncol-tompavégfragmenst Ncol-gyel és Smal-gyel hasított pML103-plazmidba ligáltuk, miáltal a pLH104-plazmidot kaptuk.

A globulin- l-promoter/SSP3-5/globulin-l-3’-régió kiméragén kialakítása érdekében az SSP3-5-kódolórégiót (9. példa) tartalmazó 193 bp-os Ncol-Xbal fragmenst - Xbal-gyel teljesen megemésztett, majd a plazmid-, ,ATG” startkodonnál történő felnyitása érdekében részlegesen Ncol-gyel hasított - pCC50-plazmidba (lásd: fentebb) inszertáltuk, miáltal a pLH105-plazmidot kaptuk.

13. példa

Corynebacterium-DHDPS - embrióban és endospermiumban történő — expresszálásához alkalmas kiméragéneket tartalmazó kukoricanövények

A globulin- l-promoter/mcts/cordapA/NOS-3 '-régió vagy a glutelin-2-promoter/mcts/cordapA/NOS3'-régió kiméragénnel kukoricát transzformáltunk.

A transzformációk során szelektálható markereket tartalmazó plazmidvektorokat alkalmaztunk. Az egyik plazmid, a pDETRIC, a Streptomyces hygroscopicusból származó bar-gént tartalmazta, amely glufozinátherbiciddel szembeni rezisztenciát biztosít [Thompson és munkatársai: The EMBO Journal 6, 2519 (1987)]. E baktériumgében a „GTG” transzlációs startkodont - növényekben a megfelelő transzlációs iniciáció érdekében - „ATG”-re változtatták [DeBlock és munkatársai: The EMBO Journal 6, 2513 (1987)]. A bar-gént a karfiol-mozaikvírusból származó 35S-promoter irányítja, és transzlációjához az Agrobacterium tumefaciensből származó oktopinszintetáz-gén terminációs és poliadenilációs szignálját használja fel. Más módon, a 35S/Ac szelektálható markért alkalmaztuk, amely a karfiol-mozaikvírus 35S-promotere és 3’-terminátor/poliadenilációs szignáljának szabályozása alatt álló, szintetikus foszfinotricin-N-acetil-transzferáz-gén (pat)

HU 222 085 Β1 [Eckes és munkatársai: J. Cell Biochem. Suppl. 13 D (1989)].

Az embriogén kallusztenyészeteket éretlen (kb. 1,0-1,5 mm-es) embriókból indítottuk be, melyeket „II. típusú kallusz” szövettenyészeti reakció adása érdekében nemesített kukoricavonal magjaiból vágtunk ki. Az embriókat a beporzás után 10-12 nappal vágtuk ki, és csíratengelyi oldalukkal lefelé, agarózzal szilárdított N6 táptalajra [Chu és munkatársai: Sci. Sin. 18, 659 (1974)] (melyet 0,5 mg/1 2,4-D-vel egészítettünk ki; N6-0.5) helyeztük. Az embriókat 27 °C-on, sötétben tartottuk. Az éretlen embriók szkutellumából proliferálódott szuszpenzorstruktúrákon törékeny embriogén kallusz keletkezett, amely szomatikus proembriókkal és szomatikus embriókkal együtt differenciálatlan sejttömegből állt. Két-három hetenként az egyes embriókból izolált klonális, embriogén kalluszokat azonosítottuk és N6-0,5 táptalajon továbbtenyésztettük őket.

A gének kalluszsejtekbe történő beviteléhez a részecskebombázásos eljárást alkalmaztuk, melynek gyakorlati megvalósításához „Biolistic, PDS-1000/He” készüléket (BioRad Laboratories, Hercules, CA) alkalmaztunk.

Aranyrészecskék felületére cirkuláris plazmidDNS-t vagy restrikciós endonukleázos emésztéssel linearizált DNS-t precipitáltunk. A részecskékre két vagy három különböző plazmidból származó DNS-t precipitáltunk; az egyik a kukorica transzformálásához szelektálható markert tartalmazott, a második vagy harmadik pedig a magvakban a fokozott lizinfelhalmozódást biztosító kiméragéneket tartalmazta. Ennek gyakorlati kivitelezéséhez mindegyik DNS 1,5 pg-ját (vízben, kb. 1 mg/ml koncentrációban) aranyrészecskék (1,5 pm-es átlagos átmérő) 25 ml vizes szuszpenziójához (60 mg arany/ml) adtuk, majd - a kémcső vortexezése közben - az arany-DNS-szuszpenzióhoz kalcium-kloridot (25 ml 2,5 M oldat) és spermidint (10 ml 1,0 M oldat) adtunk. Az aranyrészecskéket mikrocentrifugában 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítottuk. Ezután az aranyrészecskéket 200 ml abszolút etanolban újraszuszpendáltuk, majd ismét centrifugáltuk, és a felülúszót eltávolítottuk. Végül, az aranyrészecskéket 25 ml abszolút etanolban újraszuszpendáltuk, és kétszer egy másodpercig ultrahanggal kezeltük. Mindegyik makrohordozó tányérra („macro carrier disc” 5 pl (DNS-sel bevont) aranyrészecskét tettünk, és az etanolt elpárologtattuk, miáltal a tányéron a DNS-sel bevont, száraz aranyrészecskék maradtak vissza.

0,25 M szorbitollal és 0,25 M mannitollal kiegészített N6-0,5 táptalajt tartalmazó 100x20 mm-es Petricsésze közepére, kb. 6 cm átmérőjű körben - az LH132.5.X jelzésű kalluszvonalból származó - embriogén kalluszt helyeztünk. A szövetet - előkezelésként - a részecskebombázás előtt két órával helyeztük a táptalajra, s egészen a bombázásos kezelésig rajta hagytuk. A két órás előkezelés után a szövetet tartalmazó Petri-csészét a PDS-1000/He készülék kamrájába helyeztük, majd a kamrából a levegőt 948 kPa („28 inch of Hg”) nyomású vákuummal kiürítettük. A makrohordozót hélium lökéshullámmal felgyorsítottuk, melynek során szakadómembránt alkalmaztunk, amely szétreped, ha a lökéshullám-csatornában a héliumnyomás 7,625x10* kPa (1100 psi) értéket ér el. A szövetet a fékezőemyőtől hozzávetőleg 8 cm távolságban helyeztük el. A DNS-sel bevont aranyrészecskékkel négy szövettálcát bombáztunk. A kalluszszövetet a bombázás után azonnal szorbitol és mannitol nélküli N6-0.5 táptalajra vittük.

A szövetet a bombázás után 24 órán belül szelektív táptalajra (2 mg/1 glufozinátot tartalmazó, kazein vagy prolin nélküli N6-0,5 táptalajra) helyeztük, s az e táptalajon lassú növekedésnek indult szövetet kéthetenként (glufozináttal kiegészített) friss N6-0,5 táptalajra tettük át. 6-12 hét elteltével azonosítottuk az aktív növekedést mutató kalluszok kiónjait. A kalluszt ezután olyan táptalajra vittük át, amely elősegíti a növény regenerálódását.

A transzformált kalluszból regenerálódott növényeket „Southern-blot”-analízissel vagy polimerázláncreakcióval a teljes transzgének jelenlétére vizsgáltuk. A növényeket önmegtermékenyítéssel vagy egy kiváló tulajdonságú (elit) vonallal keresztezve szaporítottuk, miáltal R_r, illetve Fj-magvakat kaptunk. Az egyedi R_rmagvakat vagy 6-8 F_rmagot csoportokba gyűjtöttünk, és „Westem-blot”-analízissel Corynebacteri«»i-DHDPS-protein expresszióját vizsgáltuk. A magvak szabad aminosav-összetételét és összes aminosavösszetételét a korábbi példákban leírtak szerint határoztuk meg.

A kukoricamagvakban megfigyeltük a Corynebacterium-DHDPS-protein (globulin- vagy glutelinpromoter irányítása alatti) expresszióját (8. táblázat). A globulin-1-promo tér irányítása alatt CorynebacteriumDHDPS-proteint expresszáló magvakban a szabad lizin mennyisége - a kontrollmagvakban a szabad aminosavak 1,4%-át kitevő szintről - 15-27%-ra növekedett. Az önmegtermékenyítéssel kapott magban a magasabb szintű DHDPS-expresszió és a nagyobb lizinmennyiség feltehetően abból származik, hogy a más vonallal keresztezett növények összegyűjtött magjainak felében a transzgén - a szegregáció következtében - várhatóan hiányzik. A Coryneóacíerzüzn-DHDPS-proteint a glutelin-2-promoter irányítása alatt expresszáló magvakban a szabad lizin mennyiségének kisebb növekedését figyeltük meg. Ennek megfelelően, a lizin mennyiségének fokozása érdekében ezt az enzimet előnyösebb az embrióban, mint az endospermiumban expresszálni. A nagy mennyiségű lizint tartalmazó magvakban a lizinkatabolizmusra utaló szacharopin magas szintjét figyeltük meg.

Normális esetben a lizin a mag aminosavtartalmának kb. 2,3%-át teszi ki. Ilyenformán, a 8. táblázatban felsorolt eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a globulin-1-promoter irányítása alatt Corynebacterz'Mffj-DHDPS-proteint expresszáló magvakban a lizin - összes magi aminosavra vonatkoztatott - százalékos aránya jelentős mértékben (25-130%-kal) növekedett.

HU 222 085 Bl

8. táblázat

1088.1.2-vonal: globulin-1 -promoter/mcts/cordapA/NOS-3 ’-régió

1099.2.1- vonal: globulin-l-promoter/mcts/cordapA/NOS-3’-régió

1090.2.1- vonal: glutelin-2-promoter/mcts/cordapA/NOS-3 ’-régió

Transzgenikus vonal	DHDPS („Westem-blot”)	Lys/szabad magi aminosavak (%)	Lys/összes magi aminosav (%)
1088.1.2xelit	+	15	3,1
1099.2.1 önmegterm.	+ +	27	5,3
1090.2.1 χ elit	+	2,3	1,7

14. példa 15

Szójabab transzformálása Kunitz-tripszininhibitor3-promoter/cts/cordapA kiméragénnel

Szój abab-Kunitz-tripszininhibitor-3 -gén (KT13) [Jofuku és munkatársai: Plánt Cell 1, 427 (1989)] promoteréből és transzkripciós terminátorából álló magspe- 20 cifikus expressziós kazettát készítettünk. A KTI3-kazetta a Kunitz-tripszininhibitor-3-gén transzlációs iniciációs kodonjától „upstream” (5’) irányban kb. 2000 nukleotidot, transzlációs stopkodonjától „downstream” (3’) irányban pedig kb. 200 nukleotidot foglal magában. Az 25 5’- és 3’-régió között - a Corynebacterium-dapA-gén inszertálásának elősegítése érdekében - Ncol-helyet (amely magában foglalja az „ATG” transzlációs iniciációs kodont) és KpnI-helyet alakítottunk ki. A teljes kazettát BamHI- és Sall-hely szegélyezi. 30

A kiméragénben a dapA-kódolószekvenciához kloroplasztisz-tranzitszekvenciát (cts) kapcsoltunk (lásd:

4. példa). Kloroplasztisz-tranzitszekvenciaként a szójabab ribulóz-l,5-difoszfát karboxiláza [Berry-Lowe és munkatársai: J. Mól. Appl. Génét. 1, 483 (1982)] kis 35 alegységének kloroplasztisz-tranzitszekvenciáján alapuló cts-t alkalmaztunk. Agarózgélről, elektroforézis után - a cordapA-kódolórégióhoz kapcsolt cts-t tartalmazó - 1030 bp-os NcoI-KpnI fragmenst izoláltunk, és ezt a fragmenst a KTI3-expressziós kazettába inszer- 40 tálva a pML102-plazmidot kaptuk (15. ábra).

A pML102-plazmidot az „Agracetus Company”nál (Middleton, WI) - az 5,015,580 számú egyesült államokbeli szabadalomban leírt eljárással végzett - részecskebombázással vittük be a szójababba. A transz- 45 formált sejtek szkrínelése érdekében a pML102-plazmiddal együtt egy másik plazmidot is bevittünk, amely a karfiol-mozaikvírusból származó - az E. co/z'-p-glükuronidáz-gén (GUS) [Jefferson és munkatársai: Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83, 8447 (1986)] expresszióját 50 irányító - 35S-promoterből és Nos-3'-régióból álló szójabab-transzformációs markert tartalmazott.

Azt vártuk, hogy a transzformált növények R_t-magjaiban a transzgének szegregálódni fognak. A transzformációs markergént hordozó magok azonosítása érdé- 55 kében a magokból borotvával kis darabokat vágtunk ki, melyeket eldobható műanyag mikrotitertálca üregeibe helyeztünk. GUS-vizsgálati elegyet (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM EDTA, 0,5 mM iqFeíCNjg, 0,1% Triton X-100, 0,5 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-p- 60

D-glükuronsav) készítettünk, és ebből az elegyből a tálca mindegyik üregébe 0,15 ml-t tettünk. A mikrotitertálcát 37 °C-on 45 percig inkubáltuk. A kék szín megjelenése a magvakban lejátszódó GUS-expressziót jelezte.

Az érett magvak összes aminosavtartalmának mérése érdekében a magliszt 1-1,4 mg-ját 6 N sósav és 0,4% β-merkapto-etanol elegyében, nitrogéngáz alatt, 110-120 °C-on 24 óra hosszat hidrolizáltuk. A minta 1/50 részét „Beckmann Model 6300” aminosavanalizáló készülékbe, oszlop utáni ninhidrinreakciós kimutatás alkalmazásával vizsgáltuk. A magvakban a lizin (és más aminosavak) szintjét az összes aminosavra vonatkoztatott százalékos arányként határoztuk meg. A vad típusú szójababmagvak 5,7-6,0% lizint tartalmaznak.

A 16 független, transzformált vonalból 150 magvat vizsgáltunk (9. táblázat). A16 vonal közül tíz olyan magokat adott, melyek az összes magi aminosavra vonatkoztatva 7% vagy több lizint tartalmaztak (ami a vad típusú magvak lizintartalmához képest 16-22%-os növekedést jelent). Ilyenformán, a transzformációs események több, mint 62%-ában a cordapA-gént hordozó plazmid a GUS-markergént hordozó plazmiddal együtt integrálódott. A nagy lizintartalmú magvak kb. 80%-a GUS-pozitív volt, ami arra utal, hogy a cordapA-gént hordozó plazmid rendszerint a kromoszóma ugyanazon helyére integrálódik, mint a GUS-gént hordozó plazmid. Néhány transzformált vonalban (például 260-05) gyenge összefüggés volt a GUS-pozitív és a nagy lizintartalmú fenotípus között, ami azt jelzi, hogy a két plazmid egymással nem kapcsolódó helyre épült be. A transzformációhoz alkalmazott eljárás alapján mindkét típusú transzformációs esemény várható volt.

Olyan magvakat is kaptunk, melyek lízintartalma az összes magi aminosav 20%-ánál is nagyobb volt. Ez a mag lizintartalmának közel 300%-os növekedését jelenti.

9. táblázat

Vonal	Mag	GUS	Lizin (%)
257-1	G1	+	8,30
	G2	+	7,99
	G3	+	11,51
	G4	+	8,52

HU 222 085 BI

9. táblázat (folytatás)

Vonal	Mag	GUS	Lizin (%)
	G33	+	7,68
	G34	+	9,93
	G35	-	5,97
	G36	-	5,71
	G37	+	7,48
	G38	+	9,42
	G39	+	10,44
	G40	+	8,63
	G41	+	9,42
	G42	+	8,53
	G43	+	10,54
	G44	-	5,83
	G45	+	7,15
	G46	+	7,85
	G47	+	7,34
257-21	G21	+	12,90
	G22	+	11,52
	G23	+	9,34
	G24	-	5,82
	G25	-	5,61
	G26	-	5,70
	G27	-	5,84
	G28	-	14,27
	G48	+	15,23
	G49	+	18,79
	G50	+	13,82
	G51	-	5,94
	G52	+	13,29
	G53	+	14,61
257-41	G54	+	6,28
	G55	+	6,27
	G56	+	6,32
	G57	+	6,4
	G180	+	5,75
	G181	+	7,42
257-46	G60	+	6,76
	G61	+	6,73
	G62	-	6,18
	G63	+	6,13
	G182	+	6,83
	G183	+	6,23
257-49	G78	-	6,40
	G79	+	6,46
	G184	+	6,37

Vonal	Mag	GUS	Lizin (%)
	G185	+	6,15
	G186	+	6,41
	G187	+	7,90
257-50	G88	-	6,15
	G89	-	6,12
	G188	-1-	6,19
	G189	+	6,07
	G190	+	6,09
	G191	+	6,30
257-51	G228	-	5,81
	G229	-	5,74
	G230	-	5,59
	G231	-	6,00
	G232	-	5,89
	G233	+	21,49
	G234	+	20,30
	G235	+	11,89
	G236	+	12,40
	G237	+	15,09
	G238	+	12,79
	G239	+	17,19
260-05	G90	-	5,41
	G91	-	7,65
	G95	-	6,39
	G96	-	5,80
	G97	-	6,12
	G98	-	5,90
	G99	-	6,17
	G160	-	8,04
	G161	-	12,64
	G162	-	6,91
	G163	-	5,83
	G164	-	8,28
	G165	-	12,52
	G166	-	5,68
	G167	-	9,92
	G168	-	5,89
	G169	-	6,10
	G170	+	6,49
	G171	+	6,10
	G172	-	12,83
	G173	-	6,55
	G174	-	6,62
	G175	+	13,02
I	G176	-	10,13

HU 222 085 Β1

9. táblázat (folytatás)

Vonal	Mag	GUS	Lizin (%)
	G177	-	5,97
	G178	-	11,37
	G179	-	12,63
260-13	G108	+	6,64
	G109	+	7,92
	G192	+	10,29
	G193	+	7,37
	G194	+	6,73
	G195	+	10,35
260-16	G29	+	11,64
	G30	+	14,87
	G31	+	15,02
	G32	-	6,24
260-17	G115	+	11,91
	G116	-	6,21
	G117	-	6,08
	G118	-	6,28
	G119	-	6,30
	G196	+	7,76
260-23	G129	+	5,93
	G197	+	6,04
	G198	+	5,99
	G199	+	6,11
	G200	+	6,35
	G201	+	6,19
260-31	G202	+	6,19
	G203	+	6,19

Vonal	Mag	GUS	Lizin (%)
	G204	+	6,13
	G205	+	6,40
	G206	+	6,73
	G207	+	6,23
260-33	G217	+	6,80
	G218	-	7,00
	G219	-	6,80
	G220	-	6,10
	G221	-	6,83
	G222	-	6,18
	G223	+	5,92
	G224	+	6,61
	G226	+	6,17
	G227	+	6,43
	G240	+	6,25
1	G241	+	6,13
260-44	G148	+	6,51
	G149	+	6,21
	G208	+	6,02
	G209	+	6,17
	G210	+	6,12
	G211	+	6,09
260-46	G158	-	6,00
	G159	+	6,30
	G212	+	6,40
	G213	+	6,50
	G214	+	6,40
	215	+	6,60

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 48 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCGGGCCAT GGCTACAGGT TTAACAGCTA AGACCGGAGT AGAGCACT 48

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 37 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATATCGAAT TCTCATTATA GAACTCCAGC TTTTTTC 37

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

HU 222 085 Bl

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 917 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 3...911

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CC ATG GCT ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC TTC GGC 47

Me t Alá Thr Gly Leu Thr Alá Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly

10 15

ACC GTT GGA GTA

GCA Al a 20

ATG Me t

GTT Val

ACT Thr

CCA TTC ACG GAA TCC GGA GAC ATC

95

Thr

Val

Gly

Val

Pro

Phe 25

Thr

Glu

Ser

Gly

Asp 30

Ile

GAT

ATC

GCT

GCT

GGC

CGC

GAA

GTC

GCG

GCT

TAT

TTG

GTT

GAT

AAG

GGC

143

Asp

Ile

Alá

Al a 35

Gly

Arg

Glu

Val

Al a 40

Al a

Tyr

Leu

Val

As p 45

Lys

Gly

TTG

GAT

TCT

TTG

GTT

CTC

GCG

GGC

ACC

ACT

GGT

GAA

TCC

CCA

ACG

ACA

191

Leu

As p

Ser 50

Leu

Val

Leu

Al a

Gly 55

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser 60

Pro

Thr

Thr

ACC

GCC

GCT

GAA

AAA

CTA

GAA

CTG

CTC

AAG

GCC

GTT

CGT

GAG

GAA

GTT

239

Thr

Al a 65

Al a

Glu

Lys

Leu

Glu 70

Leu

Leu

Lys

Al a

Val 75

Arg

Glu

Glu

Val

GGG

GAT

CGG

GCG

AAG

CTC

ATC

GCC

GGT

GTC

GGA

ACC

AAC

AAC

ACG

CGG

287

Gly 80

Asp

Arg

Al a

Lys

Leu 85

Ile

Al a

Gly

Val

G1 y 90

Thr

Asn

Asn

Thr

Arg 95

ACA

TCT

GTG

GAA

CTT

GCG

GAA

GCT

GCT

GCT

TCT

GCT

GGC

GCA

GAC

GGC

335

Thr

Ser

Val

Glu

Leu 100

Al a

Glu

Al a

Al a

Al a 105

Ser

Al a

Gly

Al a

Asp 110

Gly

CTT

TTA

GTT

GTA

ACT

CCT

TAT

TAC

TCC

AAG

CCG

AGC

CAA

GAG

GGA

TTG

383

Leu

Leu

Val

Val 115

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Ser 120

Lys

Pro

Ser

Gin

Glu 125

Gly

Leu

CTG

GCG

CAC

TTC

GGT

GCA

ATT

GCT

GCA

GCA

ACA

GAG

GTT

CCA

ATT

TGT

431

Leu

Al a

Hi s 130

Phe

Gly

Al a

Ile

Al a 135

Al a

Al a

Thr

Glu

Val 140

Pro

Ile

Cy s

CTC

TAT

GAC

ATT

CCT

GGT

CGG

TCA

GGT

ATT

CCA

ATT

GAG

TCT

GAT

ACC

479

Leu

Tyr 145

Asp

Ile

Pro

Gly

Arg 150

Ser

Gly

Ile

Pro

Ile 155

Glu

Ser

Asp

Thr

ATG

AGA

CGC

CTG

AGT

GAA

TTA

CCT

ACG

ATT

TTG

GCG

GTC

AAG

GAC

GCC

527

Me t 160

Arg

Arg

Leu

Ser

Glu 165

Leu

Pro

Thr

Ile

Leu 170

Al a

Val

Ly s

As p

Al a 175

AAG

GGT

GAC

CTC

GTT

GCA

GCC

ACG

TCA

TTG

ATC

AAA

GAA

ACG

GGA

CTT

575

Lys

Gly

Asp

Leu

Val

Al a

Al a

Thr

Ser

Leu

Ile

Lys

Glu

Thr

Gly

Leu

180 185 190

HU 222 085 Β1

GCC TGG TAT

TCA GGC GAT

GAC Asp

CCA CTA AAC

CTT Leu

GTT Val

TGG Trp

CTT GCT Leu Alá 205

TTG Leu

623

Al a

Trp

Tyr

Ser 195

Gly

Asp

Pro

Leu 200

Asn

GGC

GGA

TCA

GGT

TTC

ATT

TCC

GTA

ATT

GGA

CAT

GCA

GCC

CCC

ACA

GCA

671

Gly

Gly

Ser

Gly

Phe

Ile

Ser

Val

Ile

Gly

Hi s

Al a

Al a

Pro

Thr

Alá

210

215

220

TTG

GGT

GGA

GTC

AGC

TTG

GCA

AAA

GCT

GCT

CTG

CGT

CTG

CAG

GGC

ATC

815

Leu

Gly

Gly

Val

Ser

Leu

Al a

Lys

Al a

Alá

Leu

Arg

Leu

Gin

Gly

Ile

260

265

270

AAC

GTA

GGA

GAT

CCT

CGA

CTT

CCA

ATT

ATG

GCT

CCA

AAT

GAG

CAG

GAA

863

Asn

Val

Gly

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Me t

Al a

Pro

Asn

Glu

Gin

Glu

275

280

285

CTT

GAG

GCT

CTC

CGA

GAA

GAC

ATG

AAA

AAA

GCT

GGA

GTT

CTA

TAA

TGAGAATTC

918

Leu

Glu

Alá

Leu

Arg

Glu

Asp

Me t

Lys

Lys

Al a

Gly

Val

Leu

290

295

300

TTA

CGT

GAG

TTG

TAC

ACA

AGC

TTC

GAG

GAA

GGC

GAC

CTC

GTC

CGT

GCG

719

Leu

Arg

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ser

Phe

Glu

Glu

Gly

Asp

Leu

Val

Arg

Al a

225

230

235

CGG

GAA

ATC

AAC

GCC

AAA

CTA

TCA

CCG

CTG

GTA

GCT

GCC

CAA

GGT

CGC

767

Arg

Glu

Ile

Asn

Al a

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Al a

Al a

Gin

Gly

Arg

240

245

250

255

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTCCCGTGA CCATGGGCCA TC 22

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1350 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 1...1350

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG GCT GAA

ATT GTT GTC

TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT

GAT Asp

48

Me t 1

Alá Glu

Ile

Val 5

Val

Ser

Lys

Phe

Gly 10

Gly

Thr

Ser

Val

Al a 15

TTT

GAC

GCC

ATG

AAC

CGC

AGC

GCT

GAT

ATT

GTG

CTT

TCT

GAT

GCC

AAC

96

Phe

As p

Al a

Me t

Asn

Arg

Ser

Al a

Asp

Ile

Val

Leu

Ser

Asp

Al a

Asn

20

25

30

GTG

CGT

TTA

GTT

GTC

CTC

TCG

GCT

TCT

GCT

GGT

ATC

ACT

AAT

CTG

CTG

144

Val

Arg

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Al a

Ser

Al a

Gly

Ile

Thr

Asn

Leu

Leu

35

40

45

HU 222 085 Bl

GTC GCT TTA GCT GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC

GAA Glu

AAA Lys

CTC Leu

192

Val

Al a 50

Leu Ala

Glu Gly

Leu 55

Glu

Pro Gly

Glu

Arg 60

Phe

GAC

GCT

ATC

CGC

AAC

ATC

CAG

TTT

GCC

ATT

CTG

GAA

CGT

CTG

CGT

TAC

240

Asp

Al a

Ile

Arg

Asn

Ile

Gin

Phe

Al a

Ile

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Tyr

65

70

75

80

CCG

AAC

GTT

ATC

CGT

GAA

GAG

ATT

GAA

CGT

CTG

CTG

GAG

AAC

ATT

ACT

288

Pro

Asn

Val

Ile

Arg

Glu

Glu

Ile

Glu

Arg

Leu

Leu

Glu

Asn

Ile

Thr

85

90

95

GTT

CTG

GCA

GAA

GCG

GCG

GCG

CTG

GCA

ACG

TCT

CCG

GCG

CTG

ACA

GAT

336

Val

Leu

Al a

Glu

Al a

Al a

Al a

Leu

Ala

Thr

Ser

Pro

Al a

Leu

Thr

Asp

100

105

110

GAG

CTG

GTC

AGC

CAC

GGC

GAG

CTG

ATG

TCG

ACC

CTG

CTG

TTT

GTT

GAG

384

Glu

Leu

Val

Ser

His

Gly

Glu

Leu

Me t

Ser

Thr

Leu

Leu

Phe

Val

Glu

115

120

125

ATC

CTG

CGC

GAA

CGC

GAT

GTT

CAG

GCA

CAG

TGG

TTT

GAT

GTA

CGT

AAA

432

Ile

Leu

Arg

Glu

Arg

Asp

Val

Gin

Al a

Gin

Trp

Phe

Asp

Val

Arg

Lys

130

135

140

GTG

ATG

CGT

ACC

AAC

GAC

CGA

TTT

GGT

CGT

GCA

GAG

CCA

GAT

ATA

GCC

480

Val

Me t

Arg

Thr

Asn

Asp

Arg

Phe

Gly

Arg

Al a

Glu

Pro

As p

Ile

Al a

145

150

155

160

GCG

CTG

GCG

GAA

CTG

GCC

GCG

CTG

CAG

CTG

CTC

CCA

CGT

CTC

AAT

GAA

528

Al a

Leu

Al a

Glu

Leu

Al a

Al a

Leu

Gin

Leu

Leu

Pro

Arg

Leu

Asn

Glu

165

170

175

GGC

TTA

GTG

ATC

ACC

CAG

GGA

TTT

ATC

GGT

AGC

GAA

AAT

AAA

GGT

CGT

576

Gly

Leu

Val

Ile

Thr

Gin

Gly

Phe

Ile

Gly

Ser

Glu

Asn

Lys

Gly

Arg

180

185

190

ACA

ACG

ACG

CTT

GGC

CGT

GGA

GGC

AGC

GAT

TAT

ACG

GCA

GCC

TTG

CTG

624

Thr

Thr

Thr

Leu

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Tyr

Thr

Al a

Al a

Leu

Leu

195

200

205

GCG

GAG

GCT

TTA

CAC

GCA

TCT

CGT

GTT

GAT

ATC

TGG

ACC

GAC

GTC

CCG

672

Al a

Glu

Al a

Leu

Hi s

Al a

Ser

Arg

Val

Asp

Ile

Trp

Thr

Asp

Val

Pro

210

215

220

GGC

ATC

TAC

ACC

ACC

GAT

CCA

CGC

GTA

GTT

TCC

GCA

GCA

AAA

CGC

ATT

720

Gly

Ile

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Arg

Val

Val

Ser

Al a

Al a

Ly s

Arg

Ile

225

230

235

240

GAT

GAA

ATC

GCG

TTT

GCC

GAA

GCG

GCA

GAG

ATG

GCA

ACT

TTT

GGT

GCA

768

Asp

Glu

Ile

Al a

Phe

Al a

Glu

Al a

Al a

Glu

Me t

Al a

Thr

Phe

Gly

Al a

245

250

255

AAA

GTA

CTG

CAT

CCG

GCA

ACG

TTG

CTA

CCC

GCA

GTA

CGC

AGC

GAT

ATC

816

Lys

Val

Leu

Hi s

Pro

Al a

Thr

Leu

Leu

Pro

Al a

Val

Arg

Ser

Asp

Ile

260

265

270

CCG

GTC

TTT

GTC

GGC

TCC

AGC

AAA

GAC

CCA

CGC

GCA

GGT

GGT

ACG

CTG

864

Pro

Val

Phe

Val

Gly

Ser

Ser

Lys

Asp

Pro

Arg

Al a

Gly

Gly

Thr

Leu

275

280

285

HU 222 085 BI

GTG

TGC

AAT

AAA

ACT

GAA

AAT

CCG

CCG

CTG

TTC

CGC

GCT

CTG

GCG

CTT

Val

Cys 290

Asn

Lys

Thr

Glu

Asn 295

Pro

Pro

Leu

Phe

Arg 300

Alá

Leu

Al a

Leu

CGT

CGC

AAT

CAG

ACT

CTG

CTC

ACT

TTG

CAC

AGC

CTG

AAT

ATG

CTG

CAT

Arg 305

Arg

Asn

Gin

Thr

Leu 310

Leu

Thr

Leu

Hi s

Ser 315

Leu

Asn

Me t

Leu

Hi s 320

TCT

CGC

GGT

TTC

CTC

GCG

GAA

GTT

TTC

GGC

ATC

CTC

GCG

CGG

CAT

AAT

Ser

Arg

Gly

Phe

Leu 325

Al a

Glu

Val

Phe

Gly 330

Ile

Leu

Al a

Arg

Hi s 335

Asn

ATT

TCG

GTA

GAC

TTA

ATC

ACC

ACG

TCA

GAA

GTG

AGC

GTG

GCA

TTA

ACC

Ile

Ser

Val

Asp 340

Leu

Ile

Thr

Thr

Ser 345

Glu

Val

Ser

Val

Al a 350

Leu

Thr

CTT

GAT

ACC

ACC

GGT

TCA

ACC

TCC

ACT

GGC

GAT

ACG

TTG

CTG

ACG

CAA

Leu

Asp

Thr 355

Thr

Gly

Ser

Thr

Ser 360

Thr

Gly

Asp

Thr

Leu 365

Leu

Thr

Gin

TCT

CTG

CTG

ATG

GAG

CTT

TCC

GCA

CTG

TGT

CGG

GTG

GAG

GTG

GAA

GAA

Ser

Leu 370

Leu

Me t

Glu

Leu

Ser 375

Al a

Leu

Cys

Arg

Val 380

Glu

Val

Glu

G1 u

GGT

CTG

GCG

CTG

GTC

GCG

TTG

ATT

GGC

AAT

GAC

CTG

TCA

AAA

GCC

TGC

Gly 385

Leu

Al a

Leu

Val

Al a 390

Leu

Ile

Gly

Asn

As p 395

Leu

Ser

Lys

Al a

Cys 400

GCC

GTT

GGC

AAA

GAG

GTA

TTC

GGC

GTA

CTG

GAA

CCG

TTC

AAC

ATT

CGC

Al a

Val

Gly

Lys

Glu 405

Val

Phe

Gly

Val

Leu 410

Glu

Pro

Phe

Asn

Ile 415

Arg

ATG

ATT

TGT

TAT

GGC

GCA

TCC

AGC

CAT

AAC

CTG

TGC

TTC

CTG

GTG

CCC

Me t

Ile

Cys

Tyr 420

Gly

Alá

Ser

Ser

Hi s 425

Asn

Leu

Cys

Phe

Leu 430

Val

Pro

GGC

GAA

GAT

GCC

GAG

CAG

GTG

GTG

CAA

AAA

CTG

CAT

AGT

AAT

TTG

TTT

Gly

Glu

Asp 435

Al a

G1 u

Gin

Val

Val 440

Gin

Lys

Leu

Hi s

Ser 445

As n

Leu

Phe

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

GAG TAA

Glu *

450

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCCATGGC TGAAATTGTT GTCTCCAAAT TTGGCG

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

1350

HU 222 085 Β1

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTACCGCCAA ATTTGGAGAC AACAATTTCA GCCATG

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 75 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGGCTTGC TTCCCCACGA GGAAGACCAA CAATGACATT ACCTCCATTG CTAGCAACGG TGGAAGAGTA CAATG

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 75 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGCATTGT ACTCTTCCAC CGTTGCTAGC AATGGAGGTA ATGTCATTGT TGGTCTTCCT CGTGGGGAAG CCAGC

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 90bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGGCTTCC TCAATGATCT CCTCCCCAGC TGTTACCACC GTCAACCGTG CCGGTGCCGG CATGGTTGCT CCATTCACCG GCCTCAAAAG All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 90bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA :

CATGCTTTTG AGGCCGGTGA ATGGAGCAAC CATGCCGGCA CCGGCACGGT TGACGGTGGT AACAGCTGGG GAGGAGATCA TTGAGGAAGC A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : genomi DNS

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCGGTTTGCT GTAATAGGTA CCA

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ : egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCTTGGTAC CTATTACAGC AAACCGGCAT G

HU 222 085 Β1

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 27bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTTCCTCAA TGATCTCCTC CCCAGCT 27

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATTGTACTC TTCCACCGTT GCTAGCAA 28

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 20bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...20

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM70”

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGACTCGCT GCGCTCGGTC 20

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...24

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM71”

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TATTTTCTCC TTACGCATCT GTGT 24

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 27bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...27

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM78”

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTCATCGATA GGCGACCACA CCCGTCC 27

HU 222 085 Bl

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 27bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...27

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM79”

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AATATCGATG CCACGATGCG TCCGGCG 2 7

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...55

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM81”

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGGAGGAG AAGATGAAGG CGATGGAAGA GAAGATGAAG GCGTGATAGG TACCG 55

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...55

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM80”

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AATTCGGTAC CTATCACGCC TTCATCTTCT CTTCCATCGC CTTCATCTTC TCCTC 55

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: fehéqe

ELHELYEZKEDÉS: 1...14

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=név /megjegyzés=„alapgén [(SSP5)2]”

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Met Lys Alá 1 5 10

HU 222 085 Β1

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM84”

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAG AAGATGAAGG C 21

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ : egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM85”

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCGCCTTCA TCTTCTCCTC C 21

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM82”

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAG AAGCTGAAGG C 21

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=szintetikus „oligonukleotid” /standard név=„SM83”

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCGCCTTCA GCTTCTCCTC C 21

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HU 222 085 Β1

HÁNY SZÁLÚ : ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Leu Lys Ala

5

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Met Lys Ala

5

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 160 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: C15

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...151

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /fúnkció=szintetikus tároló fehéqe /termék=„fehéqe” /gén=„ssp” /standard név=„5.7.7.7.7.7.5”

A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG Me t Glu Glu Lys Me t Lys Ala Me t Glu Glu Lys Leu Lys Ala Me t 15 10 15

GAG Glu

GAG AAG

CTG AAG

GCG ATG GAG GAG AAG

CTG AAG

GCG ATG Ala Me t

GAG Glu 30

GAG Glu

Glu

Lys

Leu

Lys 20

Al a

Me t

G1 u

Glu

Lys 25

Leu

Lys

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Ala

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

35

40

45

142

AAG GCG TGATAGGTAC CG

Lys Ala

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

160

HU 222 085 Bl

A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

1

5

10

15

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Ly s

Ala

Me t

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

35

40

45

Al a

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 160 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: C20

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...151

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehéije” /gén=„ssp” /standard név=„5.7.7.7.7.7.5”

A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Leu Lys Ala Met 15 10 15

GAG Glu

GAG AAG CTG

AAG Lys 20

GCG Al a

ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG

ATG Me t

GAG Glu 30

GAG Glu

Glu

Lys

Leu

Me t

Glu Glu Lys 25

Leu

Lys

Al a

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Ly s

Leu

Lys

Ala

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

35

40

45

142

AAG GCG TGATAGGTAC CG

Lys Ala

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehéije

A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

160

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

G1 u

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

1

5

10

15

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

20

25

30

HU 222 085 BI

Leu Lys Alá Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met Glu Glu Lys Met Lys 35 40 45

Al a

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 139 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN : C30

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...130

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.7.7.7.7.5”

A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met

10 15

GAG Glu

GAG Glu

AAG Lys

CTG Leu

AAG Lys 20

GCG Al a

ATG Me t

GAG GAG

AAG CTG AAG GCG ATG GAG GAG

94

Glu

Glu

Ly s 25

Leu

Lys

Alá Met

Glu 30

Glu

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAGGTAC CG

139

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

35

40

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI : A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Glu

Glu

Lys

Me t 5

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu 10

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t 15

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Ly s

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Ly s

Al a

35

40

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 97 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomiDNS EREDETI FORRÁS:

HU 222 085 Bl

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: D16

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS :2...88

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /fiinkció=szintetikus tároló fehéqe /termék=„fehéqe” /gén=„ssp” /standard név=„5.5.5.5”

A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met

1

5

10

15

GAG

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAGGTAC

95

Glu

Glu

Ly s

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

25

CG 97

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 28 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehéqe

A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys Ala Met Glu

1

5

10

15

Glu

Ly s

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

25

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 118 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: D20

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...109

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehéqe /termék=„fehéqe” /gén=„ssp” /standard név=„5.5.5.5.5”

A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met Glu Glu Lys Met Lys Ala Met

10 15

HU 222 085 Bl

GAG

GAG

AAG

ATG

AAG GCG ATG GAG

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

94

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys Alá Met Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

20

25

30

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAGGTAC CG

118

Lys

Me t

Lys

Al a

35

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Glu

Glu

Ly s Me t 5

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu 10

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t 15

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Alá

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Met Lys Alá 35

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 97bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS : Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: D33

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...88

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.5.5.5”

A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met

10 15

GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAA GAG AAG ATG AAG GCG TGATAGGTAC 95

Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Met Lys Alá

25

CG 97

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

HU 222 085 Bl

A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t Glu Glu Lys Me t Lys Alá Me t Glu Glu Lys Me t Lys Alá Me t Glu 15 10 15

Glu Lys Me t Lys Alá Me t Glu Glu Lys Me t Lys Alá 20 25

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM86”

A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAG AAGCTGAAGA A 21

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM87”

A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCTTCTTCA GCTTCTCCTC C 21

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM88”

A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAG AAGCTGAAGT G 21

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid”

HU 222 085 Β1 /standard név=„SM89”

A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCCACTTCA GCTTCTCCTC C 21

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM90”

A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAG AAGATGAAGA A 21

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM91”

A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCTTCTTCA TCTTCTCCTC C 21

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ : egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM92”

A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAG AAGATGAAGT G 21

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...21

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM93”

A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCCACTTCA TCTTCTCCTC C 21

HU 222 085 Β1

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Leu Lys Lys 1 5

A 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Leu Lys Trp 1 5

A 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ : ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Met Lys Lys 1 5

A 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Met Lys Trp 1 5

A 53. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 160 aminosav TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli SEJTTÍPUS : DH5 alfa KÖZVETLEN FORRÁS: 82-4 SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...151

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehérje”

HU 222 085 Β1 /gén=„ssp” /standard név=„7.7.7.7.7.7.5”

A 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met

10 15

GAG Glu

GAG AAG Glu Lys

CTG Leu

AAG Lys 20

GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG

GAG Glu 30

GAG Glu

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys 25

Leu

Ly s

Al a

Me t

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

35

40

45

AAG GCG TGATAGGTAC CG 160

Lys Alá

A 54. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 49 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Ly s

Al a

Me t

Glu

1

5

10

15

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Alá

Me t

Glu

Glu

Ly s

20

25

30

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Ly s

35

40

45

Al a

A 55. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 97 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

EREDETI FORRÁS :

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS :

KLÓN: 84-H3

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS :2...88

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.5.5.5”

A 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met

10 15

HU 222 085 Β1

GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAA GAG AAG ATG Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Met

25

AAG GCG Lys Alá

TGATAGGTAC

CG

A 56. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Glu

Glu

Lys Met 5

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu 10

Lys

Me t

Lys Ala Me t Glu 15

Glu

Lys

Me t

Lys

Alá

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

20

25

A 57. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 97 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 86-H23

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS :2...88

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.8.8.5”

A 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG AAG ATG Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Leu Lys Lys Met 15 10 15

GAG GAG AAG CTG AAG AAG ATG GAA GAG AAG ATG AAG GCG Glu Glu Lys Leu Lys Lys Met Glu Glu Lys Met Lys Alá

25

TGATAGGTAC

CG

A 58. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 28 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehéije A 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1	Glu Glu Lys	Me t 5	Lys	Al a	Me t	Glu	Glu 10	Lys	Leu Lys Lys Met Glu 15
Glu	Ly s	Leu	Lys	Lys	Me t	Glu	Glu	Lys	Me t	Lys	Al a
			20					25

HU 222 085 Bl

A 59. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 112 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS :

KLÓN: 88-2

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...103

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.9.9.9.5”

A 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG AAG AAG CTG AAG TGG ATG GAG GAG Me t Glu Glu Lys Met Lys Alá Lys Lys Leu Lys Trp Met Glu Glu 15 10 15

AAG CTG AAG TGG ATG GAG GAG AAG CTG AAG TGG ATG GAA GAG AAG ATG Lys Leu Lys Trp Me t Glu Glu Lys Leu Lys Trp Me t Glu Glu Lys Me t

25 30

AAG GCG TGATAGGTAC CG

Lys Alá

A 60. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

112

Me t 1

Glu Glu

Lys

Me t 5

Lys

Al a

Lys

Lys

Leu 10

Ly s

Trp

Me t

Glu

Glu 15

Lys

Leu

Lys

Trp

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Trp

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

20

25

30

Al a

A 61. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 118 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS EREDETI FORRÁS :

TÖRZS: Escherichia coli SEJTTÍPUS: DH5 alfa KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 90-H8

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2...109

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje

HU 222 085 Β1 /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.10.10.10.5”

A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG AAG ATG 46

Me t Glu Glu Lys Me t Lys Ala Me t Glu Glu Lys Me t Lys Lys Me t

10 15

GAG

GAG

AAG

ATG

AAG AAG ATG GAG

GAG

AAG

ATG

AAG

AAG

ATG

GAA

GAG

94

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys Lys Me t Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Lys

Me t

Glu

Glu

20

25

30

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAGGTAC CG

118

Ly s

Me t

Lys

Ala

35

A 62. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Glu Glu

Lys Me t 5

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu 10

Lys

Me t

Lys

Lys

Me t 15

Glu

Glu

Lys

Me t

Ly s

Lys

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Ly s

Lys

Me t

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Me t Lys Ala 35

A 63. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 97 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

EREDETI FORRÁS :

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 92-2

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS :2...88

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehéqe /termék=„fehéqe” /gén-„ssp” /standard név=„5.11.11.5”

A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG TGG ATG 46

Me t Glu Glu Lys Me t Lys Ala Me t Glu Glu Lys Me t Lys Trp Me t

10 15

HU 222 085 BI

GAG GAG AAG ATG AAG TGG ATG GAA GAG AAG ATG AAG GCG TGATAGGTAC 9 5

Glu Glu Lys Met Lys Trp Met Glu Glu Lys Met Lys Alá

25

CG 9 7

A 64. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1	Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu	Lys	Me t	Lys Trp Me t Glu 15
5	10
Glu	Lys Me t Lys	Trp Me t Glu	Glu	Ly s	Me t	Ly s	Al a
	20			25

A 65. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...84

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM96”

A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAA AAGATGAAGG CGATGGAGGA GAAAATGAAA GCTATGGAGG AAAAGATGAA 60 AGCGATGGAG GAGAAAATGA AGGC 84

A 66. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1... 84

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM97”

A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCGCCTTCA TTTTCTCCTC CATCGCTTTC ATCTTTTCCT CCATAGCTTT CATTTTCTCC 60 TCCATCGCCT TCATCTTTTC CTCC 84

A 67. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: fehérje

ELHELYEZKEDÉS: 1...28

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=név /megjegyzés=„(SSP 5)4”

HU 222 085 Bl

A 67.	SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t	Glu Glu Lys Met Lys Ala	Me t	Glu	Glu	Lys	Me t	Lys Ala Me t Glu
1	5			10			15
Glu	Lys Met Lys Ala Met Glu	Glu	Lys	Me t	Ly s	Ala
	20			25
A 68.	AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA	TAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...84

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM98”

A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAA AAGCTGAAAG CGATGGAGGA GAAACTCAAG GCTATGGAAG AAAAGCTTAA AGCGATGGAG GAGAAACTGA AGGC A 69. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomiDNS SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature ELHELYEZKEDÉS: 1...84

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM99”

A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCGCCTTCA GTTTCTCCTC CTACGCTTTA AGCTTTTCTT CCATAGCCTT GAGTTTCTCC TCCATCGCTT TCAGCTTTTC CTCC A 70. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen MOLEKULATÍPUS: fehérje SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: fehéije ELHELYEZKEDÉS: 1...28 EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=név /megjegyzés=„(SSP 7)4”

A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Glu

Glu

Lys

Leu 5

Lys

A1 a Me t

Glu

Glu 10

Lys

Leu

Lys Ala Met Glu 15

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

G1 u

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

20

25

A 71. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84bázispár TÍPUSA: nukleinsav

HU 222 085 Bl

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...84

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM100”

A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATGGAGGAA AAGCTTAAGA AGATGGAAGA AAAGCTGAAA TGGATGGAGG AGAAACTCAA AAAGATGGAG GAAAAGCTTA AATG A 72. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...84

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM101”

A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCCATTTAA GCTTTTCCTC CTACTTTTTG AGTTTCTCCT CCATCCATTT CAGCTTTTCT TCCATCTTCT TAAGCTTTTC CTCC A 73. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 28 aminosav

TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 73.	SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t	Glu	Glu Lys Leu Lys Lys	Me t	Glu	Glu	Lys	Leu Lys Trp Met Glu
1		5			10		15
Glu	Lys	Leu Lys Lys Me t Glu	G1 u	Lys	Leu	Lys	Trp
		20		25
A 74.	AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA	TAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 243 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi

DNS EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS : DH5 alfa

KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 2-9

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2.. .235

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /fúnkció=szintetikus tároló fehéije /termék=„fehérje” /gén=„ssp /standard név=„7.7.7.7.7.7.8.9.8.9.5.”

HU 222 085 Β1

A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met

10 15

GAG GAG AAG

CTG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG GAG GAG

94

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys 20

Al a

Me t

Glu Glu

Lys 25

Leu

Lys

Alá

Me t

Glu 30

Glu

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAA

AAG

CTT

142

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Alá

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

35

40

45

AAG

AAG

ATG

GAA

GAA

AAG

CTG

AAA

TGG

ATG

GAG

GAG

AAA

CTC

AAA

AAG

190

Lys

Lys

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Trp

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

50

55

60

ATG

GAG

GAA

AAG

CTT

AAA

TGG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAGGTAC

242

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Trp

Me t

Glu

Glu

Ly s

Me t

Lys

Al a

70 75

C 243

A 75. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 77 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

1

5

10

15

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Ly s

Leu

Ly s

Al a

Me t

Glu

Glu

Ly s

20

25

30

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Alá

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

35

40

45

Lys

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Trp

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Lys

Me t

50

55

60

Glu

Glu

Lys

Leu

Ly s

Trp

Me t

Glu

Glu

Ly s

Me t

Lys

Al a

70 75

A 76. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 175 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS : genomi DNS EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli SEJTTÍPUS: DH5 alfa KÖZVETLEN FORRÁS:

KLÓN: 5-1

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 2... 172

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehérje

HU 222 085 Β1 /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„5.5.5.7.7.7.7.5.”

A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

C ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG GAG GAG AAG ATG AAG GCG ATG 46

Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu Glu Lys Met Lys Alá Met

10 15

GAG Glu

GAG AAG ATG

AAG Lys 20

GCG Alá

ATG GAG GAA AAG

CTG Leu

AAA Lys

GCG ATG GAG GAG

Glu

Lys Met

Me t

Glu

Glu

Lys 25

Al a

Met

Glu 30

Glu

AAA

CTC

AAG

GCT

ATG

GAA

GAA

AAG

CTT

AAA

GCG

ATG

GAG

GAG

AAA

CTG

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Ly s

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

35

40

45

AAG

GCC

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAG

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

55

A 77. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 56 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 77. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Alá

Me t

G1 u

Glu

Ly s

Me t

Lys

Alá

Me t

Glu

1

5

10

15

Glu

Lys

Me t

Ly s

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Ly s

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Ly s

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

35

40

45

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

55

A 78. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 187 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

EREDETI FORRÁS:

TÖRZS: Escherichia coli

SEJTTÍPUS: DH5 alfa

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 3...173

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /funkció=szintetikus tároló fehéqe /termék=„fehérje” /gén=„ssp” /standard név=„SSP-3-5

A 78. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CC ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG GAG GAG AAG CTG AAG GCG ATG 47

Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met Glu Glu Lys Leu Lys Alá Met

10 15

HU 222 085 Bl

GAG Glu

GAG Glu

AAG CTG AAG GCG

ATG GAG GAG

AAG Lys 25

CTG Leu

AAG Lys

GCG Al a

ATG Me t

GAG Glu 30

GAG Glu

Lys

Leu

Lys Alá 20

Me t

Glu

Glu

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAG

AAG

CTG

AAG

GCG

ATG

GAG

GAA

AAG

ATG

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

35

40

45

AAG

GCG

ATG

GAA

GAG

AAG

ATG

AAG

GCG

TGATAGGTAC CGAATTC

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

55

A 79. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 56 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje A 79. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Ly s

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Ly s

Al a

Me t

Glu

1

5

10

15

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Met

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Leu

Lys

Al a

Me t

Glu

Glu

Ly s

Me t

Lys

35

40

45

Al a

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Al a

55

A 80. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 61 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...61

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /gén=„ssp” /standard név=„SM107”

A 80. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGGAGGAG AAGATGAAAA AGCTCGAAGA GAAGATGAAG GTCATGAAGT GATAGGTACC 60 G 61

A 81. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 61 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...61

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM106”

HU 222 085 Bl

A 81. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AATTCGGTAC CTATCACTTC ATGACCTTCA TCTTCTCTTC GAGCTTTTTC

ATCTTCTCCT

C

A 82. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: fehérje

ELHELYEZKEDÉS: 1...16

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jelzés=név /megjegyzés=„pSK34 bázisgén”

A 82. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Glu Glu Lys Met Lys Val Met Lys 15 10 15

A 83. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 63 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...63

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SMl 10”

A 83. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTGGAAGAA AAGATGAAGG CTATGGAGGA CAAGATGAAA TGGCTTGAGG AAAAGATGAA 60 GAA 63

A 84. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 63 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ : egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...63

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SMl 11”

A 84. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCTTCTTCA TCTTTTCCTC AAGCCATTTC ATCTTGTCCT CCATAGCCTT CATCTTTTCT 60 TCC 63

A 85. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 37 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 85. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Glu Glu Lys Met Lys Alá Met Glu 15 10 15

HU 222 085 Β1

Asp Lys Met Lys Trp Leu Glu Glu Lys Met Lys Lys Leu Glu Glu Lys 20 25 30

Met Lys Val Met Lys

A 86. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 37 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 86. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Glu

Glu

Lys

Me t 5

Lys

Lys

Leu Glu

Glu 10

Lys Met

Lys

Al a

Me t 15

Glu

Asp

Lys

Me t

Lys

Trp

Leu

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Met Lys Val Met Lys 35

A 87. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 62 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...62

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SMl 12”

A 87. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTCGAAGAA AGATGAAGGC AATGGAAGAC AAAATGAAGT GGCTTGAGGA GAAAATGAAG AA

A 88. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 62 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature

ELHELYEZKEDÉS: 1...62

EGYÉB INFORMÁCIÓK :/termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM113”

A 88. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCTTCTTCA TTTTCTCCTC AAGCCACTTC ATTTTGTCTT CCATTGCCTT CATCTTTCTT CG

A 89. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 37 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

HU 222 085 Bl

A 89.

SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys Lys

Leu

Lys

Glu

Glu

Me t

Al a

Lys

Me t

Lys

1

5

10

15

Asp

Glu

Me t

Trp

Ly s

Leu Lys

Glu

Glu

Me t

Lys

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Me t

Lys

Val

Me t

Ly s

35

A 90. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 63 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SA1ÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...63

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SMl 14”

A 90. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTCAAGGAG GAAATGGCTA AGATGAAAGA CGAAATCTGG AAACTGAAAG AGGAAATGAA GAA

A 91. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 63 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature

ELHELYEZKEDÉS: 1...63

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„szintetikus oligonukleotid” /standard név=„SM 115”

A 91. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCTTCTTCA TTTCCTCTTT CAGTTTCCAC ATTTCGTCTT TCATCTTAGC CATTTCCTCC TTG

A 92. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 107 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehéqe

A 92.

SZÁMÚ SZÍ

EKVENCIA!

LEÍRÁ

.SA:

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Lys

Leu

Lys

Glu

Glu

Me t

Al a

Lys

Me t

Lys

1

5

10

15

Asp

Glu

Me t

Trp

Lys

Leu

Lys

Glu

Glu

Me t

Lys

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

20

25

30

Me t

Lys

Val

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Ly s

Ly s

Leu

Glu

G1 u

Lys

Me t

Lys

35

40

45

Al a

Me t

Glu

As p

Ly s

Me t

Lys

Trp

Leu

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Lys

Leu

50

55

60

HU 222 085 Bl

Glu

Glu

Lys

Me t

Ly s

Val

Me t

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Lys

Leu

Glu

Glu

65

70

75

80

Lys

Me t

Lys

Al a

Me t

Glu

Asp

Lys

Me t

Lys

Trp

Leu

Glu

Glu

Lys

Me t

85

90

95

Lys

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Me t

Lys

Val

Me t

Lys

100

105

A 93. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 43 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 93. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGAAGCCT CGGCAACGTC AGCAACGGCG GAAGAATCCG GTG 43

A 94. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 43 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : genomi DNS

A 94. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGCACCGG ATTCTTCCGC CGTTGCTGAC GTTGCCGAGG CTT 43

A 95. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 95. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCCCATGG CGCCCCTTAA GTCCACCGCC AGCCTCCCCG TCGCCCGCCG CTCCT 55

A 96. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 96. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGAGGAGC GGCGGGCGAC GGGGAGGCTG GCGGTGGACT TAAGGGGCGC CATGG 55

A 97. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 59 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 97. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGGCGCCC ACCGTGATGA TGGCCTCGTC GGCCACCGCC GTCGCTCCGT TCCAGGGGC 59 A 98. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 59 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egyszálú

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HU 222 085 Bl

MOLEKULATIPUS: genomi DNS

A 98. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTAAGCCCCT GGAACGGAGC GACGGCGGTG GCCGACGAGG CCATCATCAC GGTGGGCGC 59

A 99. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS A 99. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GCGCCCACCG TGATGA

A 100. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS A 100. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CACCGGATTC TTCCGC

Claims (23)

1. Kiméragén alkalmazása növény lizintartalmának fokozására, amely kiméragén tartalmaz egy lizin által kiváltott gátlásra nem érzékeny dihidrodipikolinsavszintetázt kódoló nukleinsavíragmenst, és működőképesen hozzá van kapcsolva egy növényi kloroplasztisztranzitszekvenciához és legalább egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott kiméragénben a dihidropikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens a Corynebacterium glutamicumból származó dihidropikolinsav-szintetázt kódoló,

3. azonosító számú nukleotidszekvenciát, növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciaként a Glycine max-ribulóz-l,5-difoszfát karboxilázának kis alegységét kódoló génből származó kloroplasztisz-tranzitszekvenciát, egy magspecifikus szabályozószekvenciaként pedig a Phaseohts vulgáris phaseolin elnevezésű magi tartalékproteinjének β-alegységét kódoló génből származó magspecifikus szabályozószekvenciát vagy a Glycine max Kunitz-tripszininhibitor-3-génjéből származó magspecifikus szabályozószekvenciát tartalmaz.

3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott kiméragén egy magspecifikus szabályozószekvenciaként egyszikű embrióspecifikus promotert tartalmaz.

4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott kiméragénben a dihidropikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens a Corynebacterium glutamicumból származó dihidropikolinsav-szintetázt kódoló,

3. azonosító számú nukleotidszekvenciát, növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciaként a Zea ffzqyí-ribulóz1,5-difoszfát karboxilázának kis alegységét kódoló génből származó kloroplasztisz-tranzitszekvenciát, magspecifikus szabályozószekvenciaként pedig a Zea mays globulin-l-génjéből származó magspecifikus szabályozószekvenciát tartalmaz.

5. Nukleinsavfragmens, amely tartalmaz:

(a) egy, az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti első kiméragént; és (b) egy második kiméragént, amely tartalmaz egy nagy lizintartalmú - legalább 15 tömeg% lizint tartalmazó - proteint kódoló nukleinsavíragmenst, amely működőképesen kapcsolódik legalább egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához.

6. Az 5. igénypont szerinti nukleinsavfragmens, amely második kiméragénként olyan kiméragént tartalmaz, melyben a nagy lizintartalmú proteint kódoló nukleinsavfragmens egy ,41” számú heptádegységet (d, e, f, g, a, b, c) tartalmazó proteint kódoló ríukleinsavszekvenciát tartalmaz, mely proteinben a heptádok azonosak vagy különbözőek, és ahol „n” értéke legalább 4;

„a” és „d” jelentése, egymástól függetlenül,

Met, Leu, Val, Ile vagy Thr;

„e” és „g” jelentése, egymástól függetlenül, a

Glu/Lys, Lys/Glu, Arg/Glu, Arg/Asp, Lys/Asp,

Glu/Arg, Asp/Arg vagy Asp/Lys sav/bázis pár; és „b”, „c” és „f jelentése, egymástól függetlenül, a Gly és Pro kivételével bármilyen aminosav, és minden egyes heptádban a „b”, „c” és „f” aminosavak közül legalább kettő jelentése Glu, Lys, Asp, Arg, His, Thr, Ser, Asn, Ala, Gin vagy Cys;

és a nukleinsavfragmens működőképesen legalább egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához van kapcsolva.

7. Az 5. igénypont szerinti nukleinsavfragmens, amely második kiméragénként olyan kiméragént tartalmaz, melyben a nagy lizintartalmú proteint kódoló nukleinsavfragmens egy (MEEKLKA)₆(MEEKMKA)₂ aminosavszekvenciájú proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz, amely működőképesen hozzá van kapcsolva legalább egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához.

HU 222 085 Β1

8. Az 5. igénypont szerinti nukleinsavfragmens, amely második kiméragénként olyan kiméragént tartalmaz, melyben egy lizin-ketoglutarát-reduktázt kódoló nukleinsavfragmens működőképesen hozzá van kapcsolva - szensz vagy antiszensz orientációban - legalább egy növényi magspecifikus szabályozószekvenciához.

9. Növény, amely genomjában az 1. vagy 2. igénypontban leírt kiméragént tartalmaz, és amelynek magjai fokozott mennyiségű felhalmozott lizint tartalmaznak.

10. Növényi mag, amely 9. igénypont szerinti növényből lett kinyerve, és amely genomjában az 1. vagy 2. igénypontban leírt kiméragént, valamint fokozott mennyiségű felhalmozott lizint tartalmaz.

11. Eljárás olyan növény előállítására, melynek magjai 10-400%-kal nagyobb mennyiségű felhalmozott lizint tartalmaznak, mint egy nem transzformált növény magjai, azzal jellemezve, hogy (a) növényi sejteket az 1. igénypont szerinti kiméragénnel transzformálunk;

(b) az (a) lépés szerinti transzformált növényi sejtekből - magvak kinyerésére alkalmas körülmények között - termőképes, érett növényeket regenerálunk;

(c) a (b) lépés szerinti utódnövények magjait lizintartalomra szkrineljük; és (d) kiválasztjuk azokat a növényeket, melyeknek magjai fokozott mennyiségű lizint tartalmaznak.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtekként kétszikű sejteket transzformálunk, és fokozott mennyiségű lizint tartalmazó magvú növényekként kétszikű leszármazási vonalakat választunk ki.

13. All. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy növényi sejtekként repcesejteket transzformálunk, és fokozott mennyiségű lizint tartalmazó magvú növényekként repceleszármazási vonalakat választunk ki.

14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtekként szójababsejteket transzformálunk, és fokozott mennyiségű lizint tartalmazó magvú növényekként szójabab-leszármazási vonalakat választunk ki.

15. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtekként egyszikű sejteket transzformálunk, és fokozott mennyiségű lizint tartalmazó magvú növényekként olyan egyszikű-leszármazási vonalakat választunk ki, melyek magvaiban a lizintartalom - a transzformálatlan növények magvainak lizintartalmához képest - 10-130%-kal nagyobb.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtekként kukoricasejteket transzformálunk.

17. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejteket olyan 1. igénypontban leírt kiméragénnel transzformáljuk, mely kiméragénben a dihidropikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens a Corynebacterium glutamicumból származó dihidropikolinsav-szintetázt kódoló, 3. azonosító számú nukleotidszekvenciát, növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciaként a Glycine mox-ribulóz-1,5difoszfát karboxilázának kis alegységét kódoló génből származó kloroplasztisz-tranzitszekvenciát, egy magspecifikus szabályozószekvenciaként pedig a Phaseolus vulgáris phaseolin elnevezésű magi tartalékproteinjének β-alegységét kódoló génből származó magspecifikus szabályozószekvenciát vagy a Glycine max Kunitz-tripszininhibitor-3-génjéből származó magspecifikus szabályozószekvenciát tartalmaz.

18. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejteket olyan 1. igénypontban leírt kiméragénnel transzformáljuk, mely kiméragén magspecifikus szabályozószekvenciaként egyszikű embrióspecifikus promotert tartalmaz.

19. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejteket olyan 1. igénypontban leírt kiméragénnel transzformáljuk, mely kiméragén a dihidropikolinsav-szintetázt kódoló nukleinsavfragmens a Corynebacterium glutamicumból származó dihidropikolinsav-szintetázt kódoló, 3. azonosító számú nukleotidszekvenciát, növényi kloroplasztisz-tranzitszekvenciaként a Zea mays-ribulóz-l,5-difoszfát karboxilázának kis alegységét kódoló génből származó kloroplasztisz-tranzitszekvenciát, egy magspecifikus szabályozószekvenciaként pedig a Zea mays globulin-1-génjéből származó magspecifikus szabályozószekvenciát tartalmaz.

20. Növény, amely a 11-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárással lett előállítva, és 1. igénypontban leírt kiméragént tartalmaz.

21. Növényi mag, amely 20. igénypont szerinti növényből lett kinyerve és 1. igénypontban leírt kiméragént tartalmaz.

22. Növény, amely genomjában 5-8. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavfragmenst tartalmaz.

23. Növényi mag, amely 22. igénypont szerinti növényből származik és genomjában 5-8. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavfragmenst tartalmaz.