JPH0884594A - Ｌ−アスパラギン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高収率で効率のよいＬ−アスパラギン酸製造
法を提供する。 【構成】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物
又はその処理物と、アスパルターゼ活性を有する微生物
又はその処理物と、マレイン酸及びアンモニアとを水性
溶液中で混合し、好ましくはマレイン酸の異性化により
生成する反応液中のフマル酸濃度を０．５％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）以下に維持しながらＬ−アスパラギン酸を生成せ
しめ、この反応液よりＬ−アスパラギン酸を採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マレイン酸から効率よ
くＬ−アスパラギン酸を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸は、主に酵素法によ
りフマル酸とアンモニアより製造され、食品添加物、輸
液等に広く利用されている。酵素法によるフマル酸から
のアスパラギン酸製造法としては、大腸菌を用いる方法
〔北原ら；Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ 発酵と代謝；１
巻、ｐ１０２（１９５９）〕、シュードモナス属細菌を
用いる方法〔高橋ら；Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ 発酵と
代謝；７巻、ｐ２３（１９６３）、米国特許第３，３１
０，４７５号〕、ブレビバクテリウム属細菌を用いる方
法〔渡辺ら；日本農芸化学会誌；３８巻、ｐ４３４（１
９６４）、特公昭６１−２９７１８〕等が知られる。

【０００３】マレイン酸は、フマル酸よりも安価に得ら
れ、アスパラギン酸の原料としてより有利である。マレ
インからのアスパラギン酸の製造法としては、マレイン
酸よりアスパラギン酸を生成する微生物菌体を用いてア
スパラギン酸を得る方法（特公昭４２−１１９９３号公
報、同１１９９４号公報、同１１９９６号公報、米国特
許第３，３９１，０５９号）が知られているが、アスパ
ラギン酸の対原料収率、生成速度は十分とはいえなかっ
た。尚、米国特許第３，３９１，０５９号に記載されて
いるＬ−アスパラギン酸の理論収量に対するモル収率は
９２％である。

【０００４】また、マレイン酸からＬ−アスパラギン酸
を製造する方法として、マレイン酸をＢｒ触媒で異性化
し、生成したフマル酸にアスパラギン酸生成微生物を作
用させる方法（米国特許第２，９５５，１３６号、同
３，３３２，９９２号）があるが、一般的に化学触媒に
よる異性化では、収率が十分でなく、異性化の際に加熱
を伴うため不純物を生じ易い等の問題点があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新たな観点
から高収率で効率のよいＬ−アスパラギン酸製造法の提
供を目的としてなされたものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
Ｌ−アスパラギン酸を製造する方法を確立すべく、鋭意
検討を行った結果、マレイン酸イソメラーゼ活性を有す
る微生物又はその処理物と、アスパルターゼ活性を有す
る微生物又はその処理物を水性溶液中で混合し、２種類
の酵素反応を同時に行うことにより、高収率で効率よく
Ｌ−アスパラギン酸が生成することを見いだし、さら
に、マレイン酸の異性化により生成する反応液中のフマ
ル酸濃度を０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）以下に維持する
と、さらに収率及び効率を向上させることができること
を見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００７】かくして本発明によれば、マレイン酸イソ
メラーゼ活性を有する微生物又はその処理物と、アスパ
ルターゼ活性を有する微生物又はその処理物と、マレイ
ン酸及びアンモニアとを水性溶液中で混合し、マレイン
酸及びアンモニアから酵素反応によりＬ−アスパラギン
酸を生成せしめ、この反応液よりＬ−アスパラギン酸を
採取することを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造法
が提供される。

【０００８】さらに、本発明の好ましい態様として、上
記方法において、マレイン酸の異性化により生成する反
応液中のフマル酸濃度を０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）以下
に維持することを特徴とする方法が提供される。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
用いられる微生物のうち、マレイン酸イソメラーゼ活性
を有する微生物としては、マレイン酸を異性化してフマ
ル酸を生成しうる能力を有する微生物であれば特に制限
がなく、例えば、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する
アルカリゲネス属、シュードモナス属、キサントモナス
属に属する微生物が挙げられる。具体的には、アルカリ
ゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅ
ｃａｌｉｓ）ＩＦＯ １２６６９、同ＩＦＯ １３１１
１、同ＩＡＭ １４７３、アルカリゲネス・ユウトロフ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、
シュウドモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ ２３７２
８、キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）ＡＴＣＣ １３２
７０等を例示することができる。

【００１０】アスパルターゼ活性を有する微生物として
は、フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を生
成しうる能力を有する微生物であれば特に制限がなく、
例えば、アスパルターゼ活性を有するブレビバクテリウ
ム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、バチルス属
等の微生物が挙げられる。具体的には、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌ
ａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ＡＴＣＣ ６８７２、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１３０３、同Ａ
ＴＣＣ ２７３２５等を例示することができる。

【００１１】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物の培養は、それ自体既知の通常用いられる、肉エキ
ス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した培
地で行うことができる。該培地には、必要に応じ、窒素
源として、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、
硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニ
アや、無機物として、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄、マンガン、亜鉛、銅等を添加することができ
る。

【００１２】また、マレイン酸イソメラーゼ活性を高め
るためには、培地中にマレイン酸、又はマロン酸を添加
することが望ましい。マレイン酸、マロン酸の添加濃度
は１０〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭの範
囲内が適当である。

【００１３】アスパルターゼ活性を有する微生物の培養
も同様に、それ自体既知の通常用いられる、肉エキス、
酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した培地を
用いて行うことができる。炭素源として、グルコースや
エタノールを添加することもできる。該培地には、必要
に応じ、窒素源として、塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸
塩、アンモニア；無機物として、リン酸カリウム、硫酸
マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅等を添加するこ
とができる。

【００１４】上記マレイン酸イソメラーゼ活性を有する
微生物及びアスパルターゼ活性を有する微生物の培養
は、通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温度
は２５〜４０℃、好ましくは２８〜３５℃が適当であ
る。培養途中のｐＨは６〜９付近とすることができ、培
養中のｐＨの調整は、酸又はアルカリを添加して行うこ
とができる。

【００１５】本発明の方法は、上記の如く２種の微生物
を培養することにより得られる、マレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する微生物又はその処理物と、アスパルター
ゼ活性を有する微生物又はその処理物と、マレイン酸及
びアンモニアとを水性溶液中で混合し、マレイン酸及び
アンモニアから酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を生
成せしめ、この反応液よりＬ−アスパラギン酸を採取す
る方法である。

【００１６】菌体は、培養物から回収されたまま、ある
いは適当な緩衝液、例えば０．０５〜０．２Ｍ程度のリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）で洗浄された洗浄菌体であっ
てもよい。さらに、上記微生物の培養と酵素反応とを並
行して行なうこともできる。

【００１７】上記「処理物」とは、培養物又はそれから
回収された菌体を固定化して得られる固定化物、該菌体
を超音波、圧擦等の手段で粉砕した粉砕物、該粉砕物を
水等で抽出した抽出物、該抽出物をさらに硫安塩析、カ
ラムクロマトグラフィー等の処理により得られる酵素成
分、さらにこれら粉砕物、抽出物、酵素成分等を固定化
して得られる固定化物を意味するものである。菌体等の
固定化は、それ自体既知の通常用いられる方法に従い、
アクリルアミドモノマー、アルギン酸又はカラギーナン
等の適当な担体に固定化させる方法により行うことがで
きる。

【００１８】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物又はその処理物及びアスパルターゼ活性を有する微生
物又はその処理物を、マレイン酸とアンモニアを含有す
る水性溶液に作用させる方法としては、発酵法または酵
素法が挙げられる。ここで、「発酵法」とは、少なくと
も、使用する微生物が増殖可能な成分を含む水性培地中
で、その微生物が増殖可能な条件（温度、ｐＨ）で微生
物の増殖を伴いながら、目的物質を生成させる方法であ
る。また、「酵素法」とは、使用する微生物を適当な培
養方法で培養し、得られた菌体またはその処理物を用い
て、必ずしも増殖に必要な成分を含有しない水溶液中で
目的物質を生成させる方法である。

【００１９】発酵法の場合、マレイン酸イソメラーゼ活
性を有する微生物及びアスパルターゼ活性を有する微生
物として、前記培養物又は菌体が用いられ、水性溶液と
して、前記培地にマレイン酸とアンモニアを添加した培
地が用いられる。

【００２０】培地中のマレイン酸及びアンモニア濃度
は、前記２種の微生物が、Ｌ−アスパラギン酸を生成し
得る濃度であれば特に制限されないが、マレイン酸濃度
は通常１〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは５〜２
０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内、アンモニア濃度は通常
０．２〜８Ｍ、好ましくは１〜４Ｍの範囲内が適当であ
る。マレイン酸及びアンモニアは培地中へ一括あるいは
逐次添加することができる。また、連続反応において
は、マレイン酸濃度を０．０１〜１％程度に維持して反
応させることもできる。

【００２１】培養温度は、２５〜４０℃、好ましくは２
８〜３５℃が適当であり、培養中の培地のｐＨは６〜９
付近とすることができ、ｐＨの調整は、酸又はアルカリ
を添加して行うことができる。培養は、通気撹拌、振盪
等の好気的条件下で、通常約１０〜約７２時間行うこと
ができる。

【００２２】上記の如く培養することにより、培地中に
Ｌ−アスパラギン酸を著量生成蓄積させることができ
る。酵素法の場合、マレイン酸イソメラーゼ活性を有す
る微生物又はその処理物及びアスパルターゼ活性を有す
る微生物又はその処理物として、前記菌体又はその処理
物が用いられ、水性溶液としては、少くともマレイン酸
とアンモニアを含有する水溶液又は適当な緩衝液、例え
ば０．０５〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液が用いられ
る。

【００２３】前記の如く調製された菌体又はその処理物
の使用量は特に制限されるものではないが、水性溶液の
容量を基準として、各々０．５〜３０％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）が適当である。

【００２４】水性溶液中のマレイン酸及びアンモニア濃
度は、マレイン酸とアンモニアが酵素反応により変換せ
しめられ、Ｌ−アスパラギン酸を生成し得る濃度であれ
ば特に制限されないが、マレイン酸濃度は通常１〜４０
％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは５〜２０％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）の範囲内、アンモニア濃度は通常０．２〜８Ｍ、
好ましくは１〜４Ｍの範囲内が適当である。マレイン酸
及びアンモニアは水性溶液中へ一括あるいは逐次添加す
ることができる。

【００２５】水性溶液には、必要に応じて、カルシウム
塩、マグネシウム塩、マンガン塩等の２価金属塩を添加
することができる。上記した水性溶液における酵素反応
温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の
範囲内が適当であり、反応中の水性溶液のｐＨは６〜１
０、好ましくは７〜９付近とすることができ、ｐＨの調
整は、酸又はアルカリを水性溶液に添加して行うことが
できる。酵素反応は、通気撹拌、振盪等の好気的条件下
で、通常１０〜７２時間行うことができる。

【００２６】上記の如く酵素反応させることにより、水
性溶液中にＬ−アスパラギン酸を著量生成蓄積させるこ
とができる。本発明においては、マレイン酸からフマル
酸への異性化反応と、フマル酸とアンモニアからＬ−ア
スパラギン酸を生成する反応とが並行して進行するた
め、反応液中のフマル酸濃度を一定の範囲に抑えること
ができ、効率よくＬ−アスパラギン酸が生成される。特
に、反応液中のフマル酸の濃度は、０．５％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）以下に維持されることがこのましい。このフマル
酸の濃度は、反応中に大部分の時間において０．５％
（ｗｔ／ｖｏｌ）以下に維持されればよく、瞬時この濃
度を越えることがあっても差し支えない。フマル酸濃度
を０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）以下に維持する為には、ア
スパルターゼの活性をマレイン酸イソメラーゼ活性に対
して相対的に過小にならないようにすればよく、例え
ば、ｐＨをアルカリ側に維持する、アンモニア濃度を上
げる、アスパルターゼ活性を有する微生物をマレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物に対して過剰に添加す
る等の方法が挙げられる。

【００２７】上記のようにして水性溶液にＬ−アスパラ
ギン酸を生成蓄積させた後、水性溶液からＬ−アスパラ
ギン酸を採取するには、それ自体既知の通常用いられる
分離精製法に従って行うことができ、例えば硫酸等電点
沈澱法等により沈澱分離し、水洗、乾燥することによ
り、Ｌ−アスパラギン酸を結晶として採取することがで
きる。

【００２８】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げるものであり、
これによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。

【００２９】〔実施例１〕 （１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培
養 肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、マ
レイン酸１０ｇ及び蒸留水１０００ｍｌ（苛性ソーダで
ｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の
三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間滅菌処理し
た。該培地に、アルカリゲネス・フェカリスＩＦＯ １
２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養し
た。

【００３０】また、上記と同様の培地１５００ｍｌを３
Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分
間滅菌処理したものに、上記振盪培養液３０ｍｌを接種
し、これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養
液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集
菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
１回洗浄し、以下の反応に供試した。

【００３１】（２）アスパルターゼ活性を有する微生物
の培養 尿素４ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １４ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．
５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．
５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・ｎＨ
₂Ｏ ２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン
１００μｇ、酵母エキス１ｇ及びカザミノ酸１ｇに蒸留
水を加えて全量を１０００ｍｌとした培地（ｐＨ６．
６）１００ｍｌを、５００ｍｌ容の三角フラスコに分注
し、１２０℃で１５分間滅菌処理した。この培地に滅菌
済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４９８）を植菌し、３３℃にて２４時
間振盪培養した。

【００３２】また、上記と同様の培地１０００ｍｌを２
Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分
間滅菌処理したものに、上記振盪培養液２０ｍｌと滅菌
済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これを
３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分
離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。次
に、アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア１８０ｍｌ、
塩化カルシウム２．２ｇ及びポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）０．８
ｇに水を加えて全量を１０００ｍｌとした水溶液に、上
記の集菌した菌体を懸濁し、４５℃で３時間振盪した
後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌
体を回収することにより、菌体に夾雑するリンゴ酸副生
活性を除去した。

【００３３】（３）マレイン酸とアンモニアからのＬ−
アスパラギン酸の製造 上記（１）及び（２）項で回収した両菌体（ＩＦＯ １
２６６９菌株４０ｇ、ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株１
２０ｇ）を、反応液〔マレイン酸１００ｇ及び２５％ア
ンモニア水１３２ｍｌに水を加えて全量を５００ｍｌと
した水溶液（ｐＨ８）〕に添加し、３０℃で２４時間反
応させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）に維持された。

【００３４】反応液中のＬ−アスパラギン酸量を高速液
体クロマトグラフィーで定量した結果、１００ｇのマレ
イン酸から、理論収量の９９％以上のモル収率で、Ｌ−
アスパラギン酸が得られた。反応後、Ｌ−アスパラギン
酸アンモニウムに、硫酸を加えてアスパラギン酸を沈澱
させ、水洗後乾燥させ、Ｌ−アスパラギン酸結晶を得
た。得られた結晶は１１２ｇであった。 〔参考例１〕 （１）マレイン酸異性化能を有する微生物の培養 実施例１と同様にして、アルカリゲネス・フェカリスＩ
ＦＯ １２６６９菌株を培養して菌体を得た。

【００３５】（２）アスパルターゼ活性を有する微生物
の培養 尿素４ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １４ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．
５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．
５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・ｎＨ
₂Ｏ ２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン
１００μｇ、酵母エキス１ｇ及びカザミノ酸１ｇに蒸留
水を加えて全量を１０００ｍｌとした培地（ｐＨ６．
６）１００ｍｌを、５００ｍｌ容の三角フラスコに分注
し、１２０℃で１５分間滅菌処理した。この培地に滅菌
済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４９８）を植菌し、３３℃にて２４時
間振盪培養した。

【００３６】また、上記と同様の培地１０００ｍｌを２
Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分
間滅菌処理したものに、上記振盪培養液２０ｍｌと滅菌
済み５０％グルコース水溶液１００ｍｌを加え、これを
３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分
離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。次
に、アスパラギン酸１００ｇ、アンモニア１８０ｍｌ、
塩化カルシウム２．２ｇ及びポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）０．８
ｇに水を加えて全量を１０００ｍｌとした水溶液に、上
記の集菌した菌体を懸濁し、４５℃で３時間振盪した
後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌
体を回収することにより、、菌体に夾雑するリンゴ酸副
生活性を除去した。

【００３７】（３）マレイン酸とアンモニアからのＬ−
アスパラギン酸の製造 上記（１）及び（２）項で回収した両菌体（ＩＦＯ １
２６６９菌株４０ｇ、ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株６
０ｇ）を、反応液〔マレイン酸１００ｇ及び２５％アン
モニア水１３２ｍｌに水を加えて全量を５００ｍｌとし
た水溶液（ｐＨ８）〕に添加し、３０℃で２４時間反応
させた。この時、反応液中のフマル酸濃度はおおむね
０．６％（ｗｔ／ｖｏｌ）に維持された。

【００３８】反応液中のＬ−アスパラギン酸量を高速液
体クロマトグラフィーで定量した結果、１００ｇのマレ
イン酸から、理論収量の９５％のモル収率で、Ｌ−アス
パラギン酸が得られた。反応後、Ｌ−アスパラギン酸ア
ンモニウムに、硫酸を加えてアスパラギン酸を沈澱さ
せ、水洗後乾燥させ、Ｌ−アスパラギン酸結晶を得た。
得られた結晶は１０５ｇであった。

【００３９】

【発明の効果】本発明の方法によれば、効率よく、かつ
高収率でマレイン酸とアンモニアからＬ−アスパラギン
酸を製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央８−３−１三菱化 学株式会社筑波研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８−３−１三菱化 学株式会社筑波研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微
   生物又はその処理物と、アスパルターゼ活性を有する微
   生物又はその処理物と、マレイン酸及びアンモニアとを
   水性溶液中で混合し、マレイン酸及びアンモニアから酵
   素反応によりＬ−アスパラギン酸を生成せしめ、この反
   応液よりＬ−アスパラギン酸を採取することを特徴とす
   るＬ−アスパラギン酸の製造法。
2. 【請求項２】 請求項１において、マレイン酸の異性化
   により生成する反応液中のフマル酸濃度を０．５％（ｗ
   ｔ／ｖｏｌ）以下に維持することを特徴とするＬ−アス
   パラギン酸の製造法。