JP2582805B2

JP2582805B2 - Ｌ−スレオニンの製造法

Info

Publication number: JP2582805B2
Application number: JP26055687A
Authority: JP
Inventors: 真人寺沢; 昭一奈良; 真樹子福島; 幸江佐藤; 光伸島津; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1987-10-15
Filing date: 1987-10-15
Publication date: 1997-02-19
Anticipated expiration: 2012-02-19
Also published as: JPH01101891A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、Ｌ−スレオニンの製造法に関するものであ
る。

本発明によればＬ−もしくはDL−アスパラギン酸又は
その塩から効率よくＬ−スレオニンを製造することがで
きる。

Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸として人間および動
物の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医療、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。

先行技術Ｌ−スレオニンの工業的製造法としては、他のアミノ
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成で
はＬ体のみの製造は困難であり、主に発酵法により生産
が行われている。発酵法により製造する方法としてはア
ミノ酸要求株を用いる方法（特公昭46−3319号、同46−
34193号、同46−34194号公報等）、また前駆体発酵法に
よる製造法としては、ホモセリンを前駆体とする製造法
（特公昭36−2896号、同38−6590号、同43−8715号公報
等）等が挙げられる。

このような発酵法は、培地の滅菌等の煩雑な操作が必
要であり、また生産管理も極めて難しく、更に副生成物
の問題等があり、工業的に有利な方法とは言い難い。

また、発酵法よりも固定費等が安く、生産管理がより
容易な発酵法による製造法には、グリシンとアセトアル
デヒドを前駆体とする方法（特開昭56−121491号、同58
−116681号各公報等）などが提案されているが、これら
はアロ体のスレオニンの副生があり実用的な方法とはな
つていない。

この他にも酵素法による製造法には、各種の微生物菌
体を用いてDL−ホモセリンを存在させた反応液にて、Ｌ
−スレオニンを生成させることが報告されている（Amin
o Acids、第１号、P71〜74（1959））。しかしながら、
これら公知の方法では、Ｌ−スレオニンの生成量は未だ
十分ではない状況にあつた。

発明の要旨本発明者らは、上記課題を解決すべくＬ−又はDL−ア
スパラギン酸又はその塩を主原料とし、酵素的製法によ
るＬ−スレオニンの製造法につき鋭意検討を行い本発明
を完成した。

即ち、本発明は、微生物菌体の存在下、Ｌ−又はDL−
アスパラギン酸又はその塩を水溶液中で酵素反応させ、
該溶液中にＬ−スレオニンを生成せしめ、これからＬ−
スレオニンを採取する方法において、微生物菌体がビオ
チン要求性のブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
に属するものであることを特徴とするＬ−スレオニンの
製造法を提供するものである。

発明の効果本発明の方法によれば、Ｌ−スレオニンが高収量で製
造できる。又、エタノール及び／又はグルコースを含む
反応液を酵素反応の水溶液として使用した場合には、Ｌ
−スレオニンが高収量に製造でき、発酵法における培地
の滅菌等の煩雑な操作が必要でなく、生産管理が極めて
容易となる。

発明の具体的説明本発明に使用されるビオチン要求性のブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌体として
は、以下の様なものがあり、Ｌ−スレオニン生産菌が含
まれる。

エタノール資化性のもの、例えばブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM
BP−1497）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibac
terium flavum）MJ−233−AB−41（FERM BP−1498）、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABT−11（FERM BP−1500）及びブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−2
33−ABD−21（FERM BP−149）等がある。これらの他に
もブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacte
rium ammoniagenes）ATCC 6871、同13745、同13746、
ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacterium d
ivaricatum）ATCC 14020等が例示できる。

これらの微生物菌体の中でもエタノール資化性のもの
が好ましく、特にブレビバクテリウム・フラバム MJ−
233、ブレビバクテリウム・フラバム MJ−233−AB−4
1、ブレビバクテリウム・フラバム MJ−233−ABT−1
1、ブレビバクテリウム・フラバム MJ−233−ABD−21
が好ましい。

なお、上記の（FERM BP−1498）は（FERM BP−149
7）を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与されたエタノール資化性微生物である（特公昭59−28
398号公報３〜４欄参照）。（FERM BP−1500）は、（F
ERM BP−1497）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トラ
ンスアミナーゼ高活性変異株である（特願昭60−190609
号明細書３〜５頁参照）。また、（FERM BP−1499）は
（FERM BP−1497、特公昭57−26755号公報参照）を親
株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭61−176607号公報参照）。

本発明における上記「微生物菌体」には、その固定化
物を含むものとする。ここで「固定化」は、該微生物菌
体を公知の固体化法、例えばアクリルアミド、アルギン
酸塩、カラギーナン等による包括法、DEAE−セフアデツ
クス、DEAE−セルロース等によるイオン結合法などから
適宜選択して行える。

本発明の方法は、微生物の増殖が起こらない条件での
酵素反応であり水溶液中で行われる。この水溶液として
は、水あるいはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液が用い
られるが、更に好ましくはエタノール及び／又はグルコ
ースを含有する反応液が用いられる。

この反応液は、ビオチンを含有しない窒素源、無機塩
等をさらに含有して用いることも出来る。この場合窒素
源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が例示でき、無機
塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン等が例
示できる。

上記反応液に添加されるエタノール及び／又はグルコ
ースの濃度は、エタノールでは１〜20容量％、グルコー
スでは0.5〜20重量％であり、エタノールとグルコース
併用の場合は前記範囲内でそれぞれ用いられる。

Ｌ−又はDL−アスパラギン酸又はその塩の反応時の濃
度は、一般には0.1〜20％（wt/vol）の濃度範囲で使用
するのが適当である。又、該菌体の使用量も特に制限さ
れるものではないが、一般に１〜50％（wt/vol）の濃度
で使用することが出来る。

酵素反応は、約20〜約50℃、好ましくは約30〜約40℃
の温度で、通常約10〜約72時間行われる。

上記のような反応方法によつて得られる反応液中に生
成したＬ−スレオニンの分離・精製は、イオン交換樹脂
処理法あるいは、沈澱法等により容易に行うことができ
る。

本発明に用いられる微生物、即ち、アスパラギン酸か
らＬ−スレオニンを生成する能力を有する微生物の調製
法を以下に述べる。

炭素源としては例えばグルコース、エタノール、メタ
ノール、溌糖蜜等が、窒素源としてはアンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出
来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加して用いることが出来る。

培養は通気撹拌、振とう等の好気的条件下で行ない、
培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行なう。培
養途中のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行な
い、培養中のpHの調整には酸、アルカリを添加して行な
うことができる。

培養開始時のエタノール濃度は、好ましくは１〜５容
量％、更に好ましくは２〜３容量％である。培養期間は
２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

この様にして得られた培養物から菌体を集めて、水又
は適当な緩衝液で洗浄し、その洗浄菌体を本発明の酵素
反応に使用する。

実験例以下の実施例において、Ｌ−スレオニンの定性は、ペ
ーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法の移動度、微
生物定量法による生物活性値により確認した。定量はロ
イコノストツク・メセンテロイデス（Leuconostoc mese
nteroides）ATCC 8042を用いるマイクロバイオアツセ
イ法と高速液体クロマトグラフイー（島津LC−5A）とを
併用して行つた。また、下記の実施例において％と表し
たのは重量％を意味する。

実施例−１培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・
2H₂O 2ppm、FeSO₄・7H₂O 2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O 2pp
m、ZnSO₄・7H₂O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.1％、酵母
エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM BP−149
7）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30℃にて
２日間振盪培養を行つた。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・
7H₂O 20ppm、MnSO₄・nH₂O 20ppm、ビオチン200μg/、
チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.3％、酵母エキ
ス0.3％）の1000mlを２容通気撹拌槽に仕込み、滅菌
（120℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養
物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温
度33℃ pH7.6にて48時間培養を行つた。

尚、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％を越
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物300mlから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液〔DL−アスパ
ラギン酸2mg、ピリドキサールリン酸５μｇ、リン酸緩
衝液100μmoles、エタノール10mg、pH7.6を反応液1ml中
に含有〕1000mlに懸濁後、該懸濁液を２容通気撹拌槽
に仕込み、エタノール20mlを添加して、回転数300rpm、
通気量0.1vvm、温度33℃、pH7.6にて10時間反応を行つ
た。

反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＬ−スレオニンを定量した。

また、反応終了後の反応液500mlを、強酸性陽イオン
交換樹脂（H⁺型）のカラムに通してＬ−スレオニンを吸
着させ、水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出させたのち、
Ｌ−スレオニン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−スレ
オニンの結晶を析出させ、精製した。結果を後に掲げる
第１表に示した。

実施例−２実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41（FE
RM BP−1498）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量し
た。また、実施例−１と同様にしてＬ−スレオニンの結
晶を析出させ、精製した。結果は第２表に示した。

実施例−３実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11（F
ERM BP−1500）を培養し、また実施例−１と同様の条
件にて反応させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量し
た。また、実施例−１と同様にしてＬ−スレオニンの結
晶を析出させ、精製した。結果は第３表に示した。

実施例−４実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21（F
ERM BP−1499）を培養し、また実施例−１と同様の条
件にて反応させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量し
た。また、実施例−１と同様にしてＬ−スレオニンの結
晶を析出させ、精製した。結果を第４表に示した。

実施例−５実施例−１で反応時に添加するエタノールをグルコー
スに変えた以外は実施例−１と同様の操作を実施した。
尚、グルコース濃度は、２重量％とした。反応終了後の
上清液中のＬ−スレオニン生成量および精製量を第５表
に示した。

実施例−６実施例−１で反応時に用いた反応液を（NH₄）₂SO₄ 2
g/;KH₂PO₄ 0.5g/;KH₂PO₄ 0.5g/;MgSO₄・7H₂O
0.5g/;FeSO₄・7H₂O 20ppm;MnSO₄・４〜6H₂O 20ppm;
チアミン−HCl 100μg/;DL−アスパラギン酸 2g/
（pH7.6）に変えた以外は実施例−１と同様の操作を実
施した。

反応終了後の上清液中のＬ−スレオニン生成量および
精製量を第６表に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者佐藤幸江茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者島津光伸茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物菌体の存在下、Ｌ−又はDL−アスパ
ラギン酸又はその塩を水溶液中で酵素反応させ、該溶液
中にＬ−スレオニンを生成せしめ、これからＬ−スレオ
ニンを採取する方法において、微生物菌体がビオチン要
求性のブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属す
るものであることを特徴とするＬ−スレオニンの製造
法。
【請求項２】水溶液がエタノール及び／又はグルコース
を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製
造法。
【請求項３】ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体がエタノール資化
性のものである特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
製造法。
【請求項４】ビオチン要求性のプレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233、ブレビバク
テリウム・フラバムMJ−233−AB−41、ブレビバクテリ
ウム・フラバムMJ−233−ABT−11、ブレビバクテリウム
・フラバムMJ−233−ABD−21から選ばれるものである特
許請求の範囲第１項又は第２項記載の製造法。