JPH0787978A - ポリメラーゼ連鎖反応を介する微生物検出の制御に用いるベクター - Google Patents
ポリメラーゼ連鎖反応を介する微生物検出の制御に用いるベクターInfo
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- JPH0787978A JPH0787978A JP5222858A JP22285893A JPH0787978A JP H0787978 A JPH0787978 A JP H0787978A JP 5222858 A JP5222858 A JP 5222858A JP 22285893 A JP22285893 A JP 22285893A JP H0787978 A JPH0787978 A JP H0787978A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 標本中、特に臨床標本中の微生物の核酸のポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介した検出において陽
性対照として機能するベクターを提供し、誤った陰性結
果の発生を防止する。 【構成】 陽性対照として用いられるベクターは、ポリ
メラーゼ連鎖反応増幅方法において用いられるプライマ
ーの配列と実質的に同一の配列を有する少なくとも１個
のヌクレオチド配列を含む。また、標本中の核酸を検出
する方法は、陽性対照ベクターの存在のもとで、標本に
対してポリメラーゼ連鎖反応を実行することを含む。さ
らに、検出キットは、陽性対照ベクターと、ＤＮＡ抽出
および増幅試薬とを組み合わせてなる。検出に際して、
標的核酸に特異なプライマーが用いられる。
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介した検出において陽
性対照として機能するベクターを提供し、誤った陰性結
果の発生を防止する。 【構成】 陽性対照として用いられるベクターは、ポリ
メラーゼ連鎖反応増幅方法において用いられるプライマ
ーの配列と実質的に同一の配列を有する少なくとも１個
のヌクレオチド配列を含む。また、標本中の核酸を検出
する方法は、陽性対照ベクターの存在のもとで、標本に
対してポリメラーゼ連鎖反応を実行することを含む。さ
らに、検出キットは、陽性対照ベクターと、ＤＮＡ抽出
および増幅試薬とを組み合わせてなる。検出に際して、
標的核酸に特異なプライマーが用いられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応
を用いる増幅を介した、標本中の核酸配列の検出におけ
る陽性調節（ポジティブコントロール）に用いるベクタ
ー、および、核酸配列のこのような検出のプロセスに関
する。
を用いる増幅を介した、標本中の核酸配列の検出におけ
る陽性調節（ポジティブコントロール）に用いるベクタ
ー、および、核酸配列のこのような検出のプロセスに関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、核酸のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）増幅が開発される前に、微生物の同定のための多
数の方法が知られていた。
ＣＲ）増幅が開発される前に、微生物の同定のための多
数の方法が知られていた。
【０００３】１．顕微鏡を用いた直接的視覚化によるも
の。この方法は迅速であるが、陽性結果を得るために
は、たとえば、標本１ｍｌあたりバクテリア１０４個と
いうように、微生物が高濃度に存在しなければならな
い。
の。この方法は迅速であるが、陽性結果を得るために
は、たとえば、標本１ｍｌあたりバクテリア１０４個と
いうように、微生物が高濃度に存在しなければならな
い。
【０００４】２．培養によるもの。ある種の微生物は標
本の培養により同定することができる。ただし、この技
術は、ある種の微生物については非常に時間がかかり、
最低３週間を必要とする。また、微生物によっては危険
をともなうこともある。
本の培養により同定することができる。ただし、この技
術は、ある種の微生物については非常に時間がかかり、
最低３週間を必要とする。また、微生物によっては危険
をともなうこともある。
【０００５】３．ＲＮＡやＤＮＡ標識プローブを用いた
ハイブリダイゼーションによるもの。これもやはり当該
バクテリアが高濃度に存在しなければならず、したがっ
て、臨床サンプルにはほとんど応用できない。
ハイブリダイゼーションによるもの。これもやはり当該
バクテリアが高濃度に存在しなければならず、したがっ
て、臨床サンプルにはほとんど応用できない。
【０００６】４．血清学技術によるもの。これは特異性
が低くしたがって信頼性が少ない。
が低くしたがって信頼性が少ない。
【０００７】５．免疫学技術によるもの、たとえば、免
疫蛍光法を用いるもの。
疫蛍光法を用いるもの。
【０００８】ＰＣＲは、標的核酸配列の増幅に広く用い
られている技術である。この技術は、米国特許明細書第
４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に
記載されており、その開示は本明細書中に参考としてと
りいれてある。この技術は、増幅すべき標的核酸配列に
対して付加プライマー配列のハイブリダイゼーションを
行ない、標的の配列と相補型の配列を有するプライマー
の伸長生成物を形成するものである。過剰なプライマー
の存在および２本鎖核酸のコンスタントな分離のゆえ
に、増幅は指数的となる。ＰＣＲは、通常、ＤＮＡ標本
に対して実施されるが、ＲＮＡのＤＮＡ内への転写のた
めのステップを含めることにより、ＲＮＡ配列について
もＰＣＲ技術を用いて増幅することができる。
られている技術である。この技術は、米国特許明細書第
４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に
記載されており、その開示は本明細書中に参考としてと
りいれてある。この技術は、増幅すべき標的核酸配列に
対して付加プライマー配列のハイブリダイゼーションを
行ない、標的の配列と相補型の配列を有するプライマー
の伸長生成物を形成するものである。過剰なプライマー
の存在および２本鎖核酸のコンスタントな分離のゆえ
に、増幅は指数的となる。ＰＣＲは、通常、ＤＮＡ標本
に対して実施されるが、ＲＮＡのＤＮＡ内への転写のた
めのステップを含めることにより、ＲＮＡ配列について
もＰＣＲ技術を用いて増幅することができる。
【０００９】このようにして、他の方法ではごく微量し
か分離できない核酸配列を増幅することができ、後の操
作のためにかなり大量に提供することができる。
か分離できない核酸配列を増幅することができ、後の操
作のためにかなり大量に提供することができる。
【００１０】ＰＣＲ技術は、診断、特に、遺伝因子によ
る疾病、がん、伝染性の疾病などの診断、ならびに、罹
病性の判定において広範に応用されている。しかしなが
ら、ヒト結核菌およびウシ結核菌に起因する伝染病など
の疾病の診断や、歯周病を引き起こす病原体の同定、多
数のウイルス性伝染病の原因の同定などは、いまだに、
重要な臨床上の課題である。
る疾病、がん、伝染性の疾病などの診断、ならびに、罹
病性の判定において広範に応用されている。しかしなが
ら、ヒト結核菌およびウシ結核菌に起因する伝染病など
の疾病の診断や、歯周病を引き起こす病原体の同定、多
数のウイルス性伝染病の原因の同定などは、いまだに、
重要な臨床上の課題である。
【００１１】現在、２本鎖および１本鎖ＲＮＡウィルス
の同定、２本鎖ＲＮＡウィルス転写、細胞生体感染性微
生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の検出・計量を
可能とするＰＣＲ法が数多く知られている。ＰＣＲ同定
は増幅によるものであるため、少量の標本で充分であ
る。したがって、この技術は、血液、痰、尿、脊髄液、
その他の組織の臨床標本から、直接、疾病を診断するの
に特に適している。
の同定、２本鎖ＲＮＡウィルス転写、細胞生体感染性微
生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の検出・計量を
可能とするＰＣＲ法が数多く知られている。ＰＣＲ同定
は増幅によるものであるため、少量の標本で充分であ
る。したがって、この技術は、血液、痰、尿、脊髄液、
その他の組織の臨床標本から、直接、疾病を診断するの
に特に適している。
【００１２】ＰＣＲ技術を用いた病原菌の診断は、たと
えば、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２（１９９０年）
１７８ページにＥｉｓｅｎｓｔｅｉｎにより述べられて
いる。さらに、種々の遺伝子のＰＣＲ増幅によるヒト結
核菌およびウシ結核菌の菌株の同定について、文献に述
べられている。すなわち、ＥＬｇｒｏ遺伝子の増幅が、
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（１９８９）８４３ペ
ージにＨａｎｃｅ ｅｔ ａｌにより記述されている。
ｂ抗原の増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
２８（１９９０）２２００ページにＳｊｏｂｒｉｎｇ
ｅｔ ａｌにより述べられている。オリゴヌクレオチド
ＩＳ６１１０の増幅が、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ
ｉｓ．１６１（１９９０）９７７ページにＥｉｓｅｎａ
ｃｈ ｅｔ ａｌにより記述されている。ＩＳ９８６の
増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（１
９９０）２０５１ページにＨｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ
により述べられている。６５ＫＤａ抗原の増幅が、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（１９９０）１８
７７ページにＰａｏ ｅｔ ａｌにより記述されてい
る。ｒＲＮＡの増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．２８（１９９０）１７５１ページにＢｏｄｄｉｎ
ｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌにより述べられている。ＰＨ７
３１１の増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２８（１９９０）１２０４ページにＨｅｒｍａｎｓ ｅ
ｔ ａｌにより述べられている。
えば、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２（１９９０年）
１７８ページにＥｉｓｅｎｓｔｅｉｎにより述べられて
いる。さらに、種々の遺伝子のＰＣＲ増幅によるヒト結
核菌およびウシ結核菌の菌株の同定について、文献に述
べられている。すなわち、ＥＬｇｒｏ遺伝子の増幅が、
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（１９８９）８４３ペ
ージにＨａｎｃｅ ｅｔ ａｌにより記述されている。
ｂ抗原の増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
２８（１９９０）２２００ページにＳｊｏｂｒｉｎｇ
ｅｔ ａｌにより述べられている。オリゴヌクレオチド
ＩＳ６１１０の増幅が、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ
ｉｓ．１６１（１９９０）９７７ページにＥｉｓｅｎａ
ｃｈ ｅｔ ａｌにより記述されている。ＩＳ９８６の
増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（１
９９０）２０５１ページにＨｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ
により述べられている。６５ＫＤａ抗原の増幅が、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（１９９０）１８
７７ページにＰａｏ ｅｔ ａｌにより記述されてい
る。ｒＲＮＡの増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．２８（１９９０）１７５１ページにＢｏｄｄｉｎ
ｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌにより述べられている。ＰＨ７
３１１の増幅が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２８（１９９０）１２０４ページにＨｅｒｍａｎｓ ｅ
ｔ ａｌにより述べられている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＰＣＲ
がこれらの応用のすべてにおいて成功裡に用いられたと
しても、診断、特に感染症の診断におけるそのルーチン
使用には１つの大きな欠点がある。この欠点は、誤った
陽性または誤った陰性結果を得る可能性である。誤った
陽性結果は、通常、標本と増幅生成物との交差汚染に起
因する。このような交差汚染は、たとえば、増幅生成物
の操作からＤＮＡ抽出過程を物理的に分離するなどの良
好な実験手法を用いることにより、あるいは、使い捨て
ピペットその他の使い捨て物質を用いることにより、比
較的容易に回避できる。
がこれらの応用のすべてにおいて成功裡に用いられたと
しても、診断、特に感染症の診断におけるそのルーチン
使用には１つの大きな欠点がある。この欠点は、誤った
陽性または誤った陰性結果を得る可能性である。誤った
陽性結果は、通常、標本と増幅生成物との交差汚染に起
因する。このような交差汚染は、たとえば、増幅生成物
の操作からＤＮＡ抽出過程を物理的に分離するなどの良
好な実験手法を用いることにより、あるいは、使い捨て
ピペットその他の使い捨て物質を用いることにより、比
較的容易に回避できる。
【００１４】一方、誤った陰性結果、すなわち、標本中
に標的核酸が存在しないという誤った試験結果は、ＰＣ
Ｒ反応自体が正しく働かなかったときに得られる。この
ような結果は、たとえば、反応がうまくいかなかったと
き、操作を誤ったとき、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）標本にＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）が存在する
とき、もっとも頻繁には反応標本にＰＣＲの阻害因子が
存在するときに生じる。たとえば、ミコバクテリアなど
の微生物についてもっとも頻繁に試験される臨床標本で
ある痰は、ＰＣＲの阻害因子を含むことが知られてい
る。
に標的核酸が存在しないという誤った試験結果は、ＰＣ
Ｒ反応自体が正しく働かなかったときに得られる。この
ような結果は、たとえば、反応がうまくいかなかったと
き、操作を誤ったとき、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）標本にＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）が存在する
とき、もっとも頻繁には反応標本にＰＣＲの阻害因子が
存在するときに生じる。たとえば、ミコバクテリアなど
の微生物についてもっとも頻繁に試験される臨床標本で
ある痰は、ＰＣＲの阻害因子を含むことが知られてい
る。
【００１５】感染性微生物のＰＣＲを介した診断におい
て誤った陰性結果を得る可能性があることは、明らか
に、この技術の使用に対する重大な妨害である。このよ
うな結果を得る虞れがあるため、結果が陰性なのは標本
中に標的核酸がないからなのか、それとも増幅プロセス
がなにかしら阻害されたからなのかについて、試験者に
はわからないことになる。
て誤った陰性結果を得る可能性があることは、明らか
に、この技術の使用に対する重大な妨害である。このよ
うな結果を得る虞れがあるため、結果が陰性なのは標本
中に標的核酸がないからなのか、それとも増幅プロセス
がなにかしら阻害されたからなのかについて、試験者に
はわからないことになる。
【００１６】核酸標本のＰＣＲ増幅において誤った陰性
結果が生じることは頻繁にあり、文献にも多く述べられ
ているが、いまだに、このような結果を防ぐための信頼
性ある方法はない。
結果が生じることは頻繁にあり、文献にも多く述べられ
ているが、いまだに、このような結果を防ぐための信頼
性ある方法はない。
【００１７】本発明の目的は、核酸標本のＰＣＲ増幅に
おける誤った陰性結果の発生を防ぐことである。
おける誤った陰性結果の発生を防ぐことである。
【００１８】本発明のさらなる目的は、臨床標本から直
接、感染性微生物の同定を行なうことを可能とすること
である。
接、感染性微生物の同定を行なうことを可能とすること
である。
【００１９】本発明のさらなる目的は、誤った陰性結果
を得る虞れなしに、ＰＣＲ増幅技術を用いた微生物の同
定のためのプロセスを提供することである。
を得る虞れなしに、ＰＣＲ増幅技術を用いた微生物の同
定のためのプロセスを提供することである。
【００２０】これらのおよびその他の目的は以下の説明
から明らかになる。
から明らかになる。
【００２１】
【課題を解決するための手段】上記に鑑み、本発明によ
れば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅法による標本中の特定
の核酸配列の検出における陽性調節として用いるベクタ
ーにおいて、上記ポリメラーゼ連鎖反応増幅法に用いら
れるプライマーの配列と実質的に同一の配列をもつ少な
くとも１つのヌクレオチド配列を含むベクターが得られ
る。
れば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅法による標本中の特定
の核酸配列の検出における陽性調節として用いるベクタ
ーにおいて、上記ポリメラーゼ連鎖反応増幅法に用いら
れるプライマーの配列と実質的に同一の配列をもつ少な
くとも１つのヌクレオチド配列を含むベクターが得られ
る。
【００２２】また、本発明によれば、ポリメラーゼ連鎖
反応を用いた核酸配列の検出において、ポリメラーゼ連
鎖反応増幅法に用いられるプライマーの配列と実質的に
同一配列をもつ少なくとも１つのヌクレオチド配列を含
むベクターの使用が得られる。
反応を用いた核酸配列の検出において、ポリメラーゼ連
鎖反応増幅法に用いられるプライマーの配列と実質的に
同一配列をもつ少なくとも１つのヌクレオチド配列を含
むベクターの使用が得られる。
【００２３】さらに、本発明によれば、歯周炎病原体の
ＰＣＲを介した検出に適したプライマーが得られる。
ＰＣＲを介した検出に適したプライマーが得られる。
【００２４】さらに、本発明によれば、標本中の特定の
核酸の検出方法において、陽性調節ベクターの存在のも
とで、上記特定の核酸配列を含む疑いのある標本に対し
てポリメラーゼ連鎖反応を実行することを含む方法が得
られる。
核酸の検出方法において、陽性調節ベクターの存在のも
とで、上記特定の核酸配列を含む疑いのある標本に対し
てポリメラーゼ連鎖反応を実行することを含む方法が得
られる。
【００２５】本発明の第１の態様によれば、核酸標本の
ＰＣＲ増幅における陽性調節として用いられるベクター
が得られる。ＰＣＲ増幅の陽性調節として機能すること
により、ベクター中の特定のヌクレオチド配列は、標的
核酸と同時に、標的核酸の増幅に用いられるのと同じＰ
ＣＲ条件を用いて、増幅される。しかしながら、ベクタ
ー中の配列を増幅すると、標的核酸の増幅生成物とは異
なる大きさの増幅生成物が得られる。このようにして、
本発明のベクターによれば、標本中の核酸のＰＣＲを介
した検出において、誤った陰性結果の発生を実質的に完
全に防止することができる。
ＰＣＲ増幅における陽性調節として用いられるベクター
が得られる。ＰＣＲ増幅の陽性調節として機能すること
により、ベクター中の特定のヌクレオチド配列は、標的
核酸と同時に、標的核酸の増幅に用いられるのと同じＰ
ＣＲ条件を用いて、増幅される。しかしながら、ベクタ
ー中の配列を増幅すると、標的核酸の増幅生成物とは異
なる大きさの増幅生成物が得られる。このようにして、
本発明のベクターによれば、標本中の核酸のＰＣＲを介
した検出において、誤った陰性結果の発生を実質的に完
全に防止することができる。
【００２６】本発明のベクターは、標本中の核酸のＰＣ
Ｒを介した検出のコントロールを可能とする。検出され
る核酸標本は、通常、微生物または感染細胞に由来す
る。ＰＣＲ増幅法を用いて検出され、本発明のベクター
を用いた陽性調節が適用される典型的な核酸には、ＤＮ
ＡとＲＮＡの両方が含まれ、たとえば、感染性微生物の
ゲノムに由来するもの、がん細胞の総核酸に由来するも
の、１本鎖または２本鎖ウィルスたとえばＲＮＡやＤＮ
Ａウィルスのゲノムに由来するもの、もしくは、２本鎖
ＲＮＡウィルス転写物などが挙げられる。あるいは、ま
たはさらに、核酸は、生体感染性微生物や真核細胞のメ
ッセンジャーＲＮＡでもよい。
Ｒを介した検出のコントロールを可能とする。検出され
る核酸標本は、通常、微生物または感染細胞に由来す
る。ＰＣＲ増幅法を用いて検出され、本発明のベクター
を用いた陽性調節が適用される典型的な核酸には、ＤＮ
ＡとＲＮＡの両方が含まれ、たとえば、感染性微生物の
ゲノムに由来するもの、がん細胞の総核酸に由来するも
の、１本鎖または２本鎖ウィルスたとえばＲＮＡやＤＮ
Ａウィルスのゲノムに由来するもの、もしくは、２本鎖
ＲＮＡウィルス転写物などが挙げられる。あるいは、ま
たはさらに、核酸は、生体感染性微生物や真核細胞のメ
ッセンジャーＲＮＡでもよい。
【００２７】本発明のベクターとしては、遺伝子操作に
通常用いられ、簡単な操作で特定のヌクレオチド配列を
含ませて陽性調節ベクターにできるものであれば、どん
なベクターでもよい。典型的な基本ベクター、すなわ
ち、陽性調節ベクターとなすために特定のヌクレオチド
配列を含ませる操作を行なう前のベクターとしては、プ
ラスミド、ウィルス、およびバクテリオファージなどが
用いられる。これらは、自律的複製物でも、あるいは、
標準的な遺伝子工学技術を用いて人工的に製造されたも
のでもよい。
通常用いられ、簡単な操作で特定のヌクレオチド配列を
含ませて陽性調節ベクターにできるものであれば、どん
なベクターでもよい。典型的な基本ベクター、すなわ
ち、陽性調節ベクターとなすために特定のヌクレオチド
配列を含ませる操作を行なう前のベクターとしては、プ
ラスミド、ウィルス、およびバクテリオファージなどが
用いられる。これらは、自律的複製物でも、あるいは、
標準的な遺伝子工学技術を用いて人工的に製造されたも
のでもよい。
【００２８】基本ベクターの選択は、本発明にとって重
要な要素ではない。しかしながら、この選択は、たとえ
ば、検出すべき核酸の種類および／またはその核酸の起
源に依存する。たとえば、ＰＣＲ増幅法においてＤＮＡ
標的配列を検出するためには、ベクターとしてプラスミ
ドを用いることが好ましい。一方、ＲＮＡ標的配列の検
出には、組換えＲＮＡウィルスを用いるのが好適であ
る。ベクターの選択に影響するさらなる因子には、特定
のベクターの入手しやすさ、ベクターの大きさ、ベクタ
ーの操作の簡便性などがある。
要な要素ではない。しかしながら、この選択は、たとえ
ば、検出すべき核酸の種類および／またはその核酸の起
源に依存する。たとえば、ＰＣＲ増幅法においてＤＮＡ
標的配列を検出するためには、ベクターとしてプラスミ
ドを用いることが好ましい。一方、ＲＮＡ標的配列の検
出には、組換えＲＮＡウィルスを用いるのが好適であ
る。ベクターの選択に影響するさらなる因子には、特定
のベクターの入手しやすさ、ベクターの大きさ、ベクタ
ーの操作の簡便性などがある。
【００２９】本発明においては、ベクターとして、プラ
スミドまたはＲＮＡウィルスを用いることが特に好まし
い。陽性調節プラスミドに転換するために操作できる好
適なプラスミドには、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩ
Ｉ＋（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手でき
る）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９などが挙げられる。こ
こではｐＢＬＵＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋が特に好まし
い。
スミドまたはＲＮＡウィルスを用いることが特に好まし
い。陽性調節プラスミドに転換するために操作できる好
適なプラスミドには、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩ
Ｉ＋（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手でき
る）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９などが挙げられる。こ
こではｐＢＬＵＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋が特に好まし
い。
【００３０】本発明の陽性調節ベクターに転換するため
に操作できる好適なＲＮＡウィルスとしては、目的が２
本または１本鎖ＲＮＡを検出することであるかに応じ
て、２本または１本鎖ＲＮＡウィルスのいずれかが用い
られる。通常、２本鎖ＲＮＡウィルス分子が、２本鎖ウ
ィルスの同定における陽性調節として用いられる。一
方、１本鎖ＲＮＡウィルス転写物が、１本鎖ＲＮＡウィ
ルスやメッセンジャーＲＮＡを検出するために用いられ
る。ここでは、酵母菌やその他の細胞を汚染できない、
そして、介助ファージの助けなしには酵母菌中に複製で
きない、欠損酵母菌２本鎖ＲＮＡウィルスを用いること
が好ましい。このようなウィルスには、２本鎖ＲＮＡ酵
母菌ウィルスであるＸウィルス、Ｌ−Ａ、Ｌ−ＢＣ、Ｍ
１ウィルスなどがある。ここでは特にＸウィルスが好ま
しい。
に操作できる好適なＲＮＡウィルスとしては、目的が２
本または１本鎖ＲＮＡを検出することであるかに応じ
て、２本または１本鎖ＲＮＡウィルスのいずれかが用い
られる。通常、２本鎖ＲＮＡウィルス分子が、２本鎖ウ
ィルスの同定における陽性調節として用いられる。一
方、１本鎖ＲＮＡウィルス転写物が、１本鎖ＲＮＡウィ
ルスやメッセンジャーＲＮＡを検出するために用いられ
る。ここでは、酵母菌やその他の細胞を汚染できない、
そして、介助ファージの助けなしには酵母菌中に複製で
きない、欠損酵母菌２本鎖ＲＮＡウィルスを用いること
が好ましい。このようなウィルスには、２本鎖ＲＮＡ酵
母菌ウィルスであるＸウィルス、Ｌ−Ａ、Ｌ−ＢＣ、Ｍ
１ウィルスなどがある。ここでは特にＸウィルスが好ま
しい。
【００３１】本発明のベクターには、特定の核酸のＰＣ
Ｒ増幅に用いられるプライマーの配列と実質的に同一
の、少なくとも１つのヌクレオチド配列が含まれる。ベ
クターに含まれるこのようなヌクレオチド配列の数は、
本発明にとって重要な要素ではない。通常、ベクター
は、ＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの配列と同一の
ヌクレオチド配列を、誤った陰性結果の発生を充分防止
できるだけ含んでいればよい。本発明者らは、ベクター
が１〜１０個のこのような配列を含む場合にこの目的が
達成されることを発見した。しかしながら、ベクター
は、１個または２個のヌクレオチド配列を含むことが好
ましい。
Ｒ増幅に用いられるプライマーの配列と実質的に同一
の、少なくとも１つのヌクレオチド配列が含まれる。ベ
クターに含まれるこのようなヌクレオチド配列の数は、
本発明にとって重要な要素ではない。通常、ベクター
は、ＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの配列と同一の
ヌクレオチド配列を、誤った陰性結果の発生を充分防止
できるだけ含んでいればよい。本発明者らは、ベクター
が１〜１０個のこのような配列を含む場合にこの目的が
達成されることを発見した。しかしながら、ベクター
は、１個または２個のヌクレオチド配列を含むことが好
ましい。
【００３２】上述したように、本発明のベクターは、核
酸標的のＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの配列と実
質的に同一の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含
む。それぞれ異なる配列をもつ２つ以上のプライマー
を、核酸のＰＣＲ増幅に用いてもよい。この場合には、
各プライマーの配列を、陽性調節ベクターにも挿入する
必要はない。
酸標的のＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの配列と実
質的に同一の、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含
む。それぞれ異なる配列をもつ２つ以上のプライマー
を、核酸のＰＣＲ増幅に用いてもよい。この場合には、
各プライマーの配列を、陽性調節ベクターにも挿入する
必要はない。
【００３３】たとえば、１つ以上の微生物またはヌクレ
オチド配列の存在を検出するために多重ポリメラーゼ連
鎖反応が実施される場合、検出すべき微生物のおのおの
に特異なプライマーを数組用いることができる。この場
合、ＰＣＲ反応を監視するためには、１つの陽性調節ベ
クターで充分である。たとえば、複合歯周炎病原体の検
出において、４つのプライマーを用いることができる。
この場合、１つのプライマーはすべての病原体に共通で
あり、他の３つは各微生物に特異である。このような多
重ＰＣＲ反応に用いる陽性調節ベクターは、共通のプラ
イマーの配列だけを含んでもよく、このプライマーはベ
クター核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に挿
入される。
オチド配列の存在を検出するために多重ポリメラーゼ連
鎖反応が実施される場合、検出すべき微生物のおのおの
に特異なプライマーを数組用いることができる。この場
合、ＰＣＲ反応を監視するためには、１つの陽性調節ベ
クターで充分である。たとえば、複合歯周炎病原体の検
出において、４つのプライマーを用いることができる。
この場合、１つのプライマーはすべての病原体に共通で
あり、他の３つは各微生物に特異である。このような多
重ＰＣＲ反応に用いる陽性調節ベクターは、共通のプラ
イマーの配列だけを含んでもよく、このプライマーはベ
クター核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に挿
入される。
【００３４】しかしながら、本発明のベクターは、宿主
特異的に、すなわち、特定の微生物に由来する核酸配列
の検出を可能とするように、組み立てられることが好ま
しい。
特異的に、すなわち、特定の微生物に由来する核酸配列
の検出を可能とするように、組み立てられることが好ま
しい。
【００３５】本発明のベクターに含ませて、そのベクタ
ーを陽性調節ベクターとなすヌクレオチド配列は、核酸
配列のＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの配列と実質
的に同一である。ベクターに挿入される配列とＰＣＲプ
ライマー中に存在する配列に些細な相違があっても、ベ
クターの陽性調節として作用する能力に実質的に影響す
ることはないが、これらの配列は同一であることが好ま
しい。ベクターの活動に実質的な影響をもたない相違に
は、ＰＣＲプライマーの配列とベクターに挿入される対
応するヌクレオチド配列との長さの違いが含まれる。た
とえば、プライマーの配列はベクターに挿入される配列
より短くてもよく、あるいは、ＰＣＲプライマーの配列
がベクターに挿入される配列より長くてもよい。しかし
ながら、ここでは、ＰＣＲプライマーの配列とベクター
に挿入される対応する配列が同じ長さをもつことが一般
に好ましい。
ーを陽性調節ベクターとなすヌクレオチド配列は、核酸
配列のＰＣＲ増幅に用いられるプライマーの配列と実質
的に同一である。ベクターに挿入される配列とＰＣＲプ
ライマー中に存在する配列に些細な相違があっても、ベ
クターの陽性調節として作用する能力に実質的に影響す
ることはないが、これらの配列は同一であることが好ま
しい。ベクターの活動に実質的な影響をもたない相違に
は、ＰＣＲプライマーの配列とベクターに挿入される対
応するヌクレオチド配列との長さの違いが含まれる。た
とえば、プライマーの配列はベクターに挿入される配列
より短くてもよく、あるいは、ＰＣＲプライマーの配列
がベクターに挿入される配列より長くてもよい。しかし
ながら、ここでは、ＰＣＲプライマーの配列とベクター
に挿入される対応する配列が同じ長さをもつことが一般
に好ましい。
【００３６】ベクターに含ませて陽性調節ベクターとな
すヌクレオチド配列と、ＰＣＲプライマーの配列とは実
質的に同一であるので、ＰＣＲプライマーに対する制約
は、ベクターに含まれる配列にも同様に適用される。Ｐ
ＣＲプライマー配列の組み立てや獲得は当業者の技術の
範囲内であり従来文献にも詳しく記載されている。たと
えば、ＭｅｄｐｒｏｂｅのＯｌｉｇｏ（登録商標）プラ
イマー分析ソフトウェアに詳述されている。
すヌクレオチド配列と、ＰＣＲプライマーの配列とは実
質的に同一であるので、ＰＣＲプライマーに対する制約
は、ベクターに含まれる配列にも同様に適用される。Ｐ
ＣＲプライマー配列の組み立てや獲得は当業者の技術の
範囲内であり従来文献にも詳しく記載されている。たと
えば、ＭｅｄｐｒｏｂｅのＯｌｉｇｏ（登録商標）プラ
イマー分析ソフトウェアに詳述されている。
【００３７】上述したように、本発明のベクターは、Ｐ
ＣＲ増幅法に用いられるプライマーと同一の、少なくと
も１つのヌクレオチド配列を含んでいればよい。２つ以
上のこのような配列がベクターに挿入された場合、配列
は互いに所定の距離をおいて好適に挿入される。ベクタ
ー内でのヌクレオチド配列間の正確な距離は、本発明に
とって重要な要素ではないが、この距離は、塩基対の数
において、ヌクレオチド配列の長さよりも長くするべき
である。この距離の決定においてさらに考慮すべきこと
は、より小さな増幅生成物すなわち標的配列がＰＣＲ増
幅法には好まれるという事実である。したがって、特定
の核酸配列を検出することが目的であるので、標的核酸
配列に比べて、陽性調節ヌクレオチド配列がより大き
く、ＰＣＲ増幅にはあまり魅力的ではないことが明らか
に望ましい。好ましくは、ベクター中のプライマー間の
距離は１．５Ｋｂよりも小さい。特に、この距離は、ベ
クター中の最長のプライマーヌクレオチド配列の長さの
約３倍に等しいことが好ましい。
ＣＲ増幅法に用いられるプライマーと同一の、少なくと
も１つのヌクレオチド配列を含んでいればよい。２つ以
上のこのような配列がベクターに挿入された場合、配列
は互いに所定の距離をおいて好適に挿入される。ベクタ
ー内でのヌクレオチド配列間の正確な距離は、本発明に
とって重要な要素ではないが、この距離は、塩基対の数
において、ヌクレオチド配列の長さよりも長くするべき
である。この距離の決定においてさらに考慮すべきこと
は、より小さな増幅生成物すなわち標的配列がＰＣＲ増
幅法には好まれるという事実である。したがって、特定
の核酸配列を検出することが目的であるので、標的核酸
配列に比べて、陽性調節ヌクレオチド配列がより大き
く、ＰＣＲ増幅にはあまり魅力的ではないことが明らか
に望ましい。好ましくは、ベクター中のプライマー間の
距離は１．５Ｋｂよりも小さい。特に、この距離は、ベ
クター中の最長のプライマーヌクレオチド配列の長さの
約３倍に等しいことが好ましい。
【００３８】本発明のベクターがＰＣＲプライマーの配
列に実質的に等しいヌクレオチド配列を２つ以上含む場
合には、たとえば、ベクターが２つのこのような配列を
含み、各配列は同じまたは異なるプライマーに実質的に
等しい場合には、２つのヌクレオチド配列をベクターの
対向する鎖上においてベクターに挿入することが好まし
い。たとえば、プラスミドをベクターとして用いる場
合、上述したように、一方のヌクレオチド配列をセンス
鎖に挿入し、他方のヌクレオチド配列を、第１の鎖から
特定の距離をおいたアンチセンス鎖に挿入することが好
ましい。
列に実質的に等しいヌクレオチド配列を２つ以上含む場
合には、たとえば、ベクターが２つのこのような配列を
含み、各配列は同じまたは異なるプライマーに実質的に
等しい場合には、２つのヌクレオチド配列をベクターの
対向する鎖上においてベクターに挿入することが好まし
い。たとえば、プラスミドをベクターとして用いる場
合、上述したように、一方のヌクレオチド配列をセンス
鎖に挿入し、他方のヌクレオチド配列を、第１の鎖から
特定の距離をおいたアンチセンス鎖に挿入することが好
ましい。
【００３９】さらなる態様において、本発明は、核酸配
列のＰＣＲを介した検出における陽性調節として用いる
ベクターの調製方法を提供する。この方法は、適当なベ
クターに、核酸のＰＣＲ増幅において用いられるプライ
マーの配列と実質的に同一の、少なくとも１つのヌクレ
オチド配列を挿入することを含む。
列のＰＣＲを介した検出における陽性調節として用いる
ベクターの調製方法を提供する。この方法は、適当なベ
クターに、核酸のＰＣＲ増幅において用いられるプライ
マーの配列と実質的に同一の、少なくとも１つのヌクレ
オチド配列を挿入することを含む。
【００４０】選択された特定のヌクレオチド配列は、標
準的な遺伝子操作技術を用いて、基本ベクターに挿入さ
れる。選択される技術そのものは本発明にとって重要な
要素ではない。一般に、部位特異的突然変異誘発が、ベ
クター内に所望の配列を正確に挿入し、ついで、得られ
た修正ベクターの選別を行なうために好ましいことがわ
かった。
準的な遺伝子操作技術を用いて、基本ベクターに挿入さ
れる。選択される技術そのものは本発明にとって重要な
要素ではない。一般に、部位特異的突然変異誘発が、ベ
クター内に所望の配列を正確に挿入し、ついで、得られ
た修正ベクターの選別を行なうために好ましいことがわ
かった。
【００４１】ＰＣＲにおける陽性調節に好適なウィルス
ベクターは、従来技術において標準的な技術を用いて組
み立てることができる。一般に、酵母菌ウィルスを用い
るならば、酵母菌株は、陽性調節の配列とともにそのウ
ィルスの配列を含むＤＮＡプラスミドを用いて転換され
る。選択された形質転換体は、ウィルスの配列および陽
性調節配列を含むプラスミド転写物の複製と被包を可能
とする。
ベクターは、従来技術において標準的な技術を用いて組
み立てることができる。一般に、酵母菌ウィルスを用い
るならば、酵母菌株は、陽性調節の配列とともにそのウ
ィルスの配列を含むＤＮＡプラスミドを用いて転換され
る。選択された形質転換体は、ウィルスの配列および陽
性調節配列を含むプラスミド転写物の複製と被包を可能
とする。
【００４２】上述したように、好適なベクターは公知で
あり従来技術において充分説明されている。さらに、Ｐ
ＣＲプライマー配列が、多様な標的核酸配列に対して知
られている。あるいは、このようなＰＣＲプライマー配
列を、標準的なＤＮＡ合成技術により、検出すべき核酸
や微生物から得られる情報を用いて、組み立てることが
できる。一般に、このような技術は、検出すべき微生物
のＤＮＡ内の可変領域の決定を含んでいる。プライマー
は、この可変領域に含まれる情報に基づいて組み立てら
れる。このような技術のさらなる例については、後述す
る実施例２のステップＡにおいて説明する。
あり従来技術において充分説明されている。さらに、Ｐ
ＣＲプライマー配列が、多様な標的核酸配列に対して知
られている。あるいは、このようなＰＣＲプライマー配
列を、標準的なＤＮＡ合成技術により、検出すべき核酸
や微生物から得られる情報を用いて、組み立てることが
できる。一般に、このような技術は、検出すべき微生物
のＤＮＡ内の可変領域の決定を含んでいる。プライマー
は、この可変領域に含まれる情報に基づいて組み立てら
れる。このような技術のさらなる例については、後述す
る実施例２のステップＡにおいて説明する。
【００４３】さらなる態様において、本発明は、標本内
の特定の核酸の検出のための方法を提供する。この方法
は、陽性調節ベクターの存在のもとで、特定の核酸配列
を含む疑いのある標本に対しポリメラーゼ連鎖反応を実
施することを含む。
の特定の核酸の検出のための方法を提供する。この方法
は、陽性調節ベクターの存在のもとで、特定の核酸配列
を含む疑いのある標本に対しポリメラーゼ連鎖反応を実
施することを含む。
【００４４】本発明の本態様の方法に用いられる陽性調
節ベクターは、上述したベクターのいずれでもよい。
節ベクターは、上述したベクターのいずれでもよい。
【００４５】患者から標本を得るための方法およびこの
標本から核酸を収集する方法については公知であり従来
技術において充分説明されている。本発明においては、
標的核酸を収集する標本は、限定されない。本発明者ら
は、本発明によれば、どんな典型的な臨床標本から得ら
れた核酸に対しても直接的な試験が可能となることを見
い出した。このような標本には、尿、血液、痰、脊髄液
などが含まれる。核酸の収集の技術としては、たとえ
ば、遠心沈殿法、核酸を解放するための細胞溶解、細胞
壁を破壊するための煮沸などが挙げられる。
標本から核酸を収集する方法については公知であり従来
技術において充分説明されている。本発明においては、
標的核酸を収集する標本は、限定されない。本発明者ら
は、本発明によれば、どんな典型的な臨床標本から得ら
れた核酸に対しても直接的な試験が可能となることを見
い出した。このような標本には、尿、血液、痰、脊髄液
などが含まれる。核酸の収集の技術としては、たとえ
ば、遠心沈殿法、核酸を解放するための細胞溶解、細胞
壁を破壊するための煮沸などが挙げられる。
【００４６】ＰＣＲ増幅法の実施はやはり従来技術にお
いてよく知られており、たとえば米国特許明細書第４，
６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載
されている。一般に、ＰＣＲ増幅は、（１）熱変性、
（２）アニーリング、（３）伸長、の３つの異なる段階
を含む。本発明の本態様の方法において、これらの３段
階に次の範囲の温度を用いることが特に好ましい。
いてよく知られており、たとえば米国特許明細書第４，
６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載
されている。一般に、ＰＣＲ増幅は、（１）熱変性、
（２）アニーリング、（３）伸長、の３つの異なる段階
を含む。本発明の本態様の方法において、これらの３段
階に次の範囲の温度を用いることが特に好ましい。
【００４７】（１）熱変性：約９２〜９６℃、好ましく
は約９４℃、（２）アニーリング：約３７〜７２℃、好
ましくは約６８℃、（３）伸長：約７２〜７４℃、好ま
しくは約７２℃。
は約９４℃、（２）アニーリング：約３７〜７２℃、好
ましくは約６８℃、（３）伸長：約７２〜７４℃、好ま
しくは約７２℃。
【００４８】また、第１のアニーリング−拡張サイクル
を開始する前に時間を延長して標本の熱変性を行なうこ
と、および、最後のサイクルの終りに時間を延長して標
本の伸長を行なうこと、が好ましい。この延長した熱変
性ならびに伸長の正確な時間は、用いられる標本と条件
に依存するが、それぞれ２〜３０分、好ましくは約１０
分で充分であることが、本発明者らにより見い出され
た。
を開始する前に時間を延長して標本の熱変性を行なうこ
と、および、最後のサイクルの終りに時間を延長して標
本の伸長を行なうこと、が好ましい。この延長した熱変
性ならびに伸長の正確な時間は、用いられる標本と条件
に依存するが、それぞれ２〜３０分、好ましくは約１０
分で充分であることが、本発明者らにより見い出され
た。
【００４９】本発明の本態様の方法において、ＰＣＲ増
幅技術は、所望に応じて何サイクルでも実施できる。上
述のとおり、完全なサイクルは熱変性期間、アニーリン
グ期間、伸長期間を含む。サイクル数、あるいは増幅時
間全体の長さは、本発明にとって重要な要素ではない。
しかしながら、充分な増幅生成物を製造して標本内の所
望の核酸の有無を決定するには、通常２０〜４０サイク
ルで充分であることが、本発明者らにより見い出され
た。特に、３０サイクルの増幅が好ましい。
幅技術は、所望に応じて何サイクルでも実施できる。上
述のとおり、完全なサイクルは熱変性期間、アニーリン
グ期間、伸長期間を含む。サイクル数、あるいは増幅時
間全体の長さは、本発明にとって重要な要素ではない。
しかしながら、充分な増幅生成物を製造して標本内の所
望の核酸の有無を決定するには、通常２０〜４０サイク
ルで充分であることが、本発明者らにより見い出され
た。特に、３０サイクルの増幅が好ましい。
【００５０】ＰＣＲ増幅から生じる増幅生成物は、核酸
断片の視覚化のための標準的な手法を用いて視覚化する
ことができる。たとえば、断片をアガロースゲル上で走
行させ、断片を適宜染色する。このような視覚化の特に
好適な方法としては、増幅生成物をたとえば２％アガロ
ースゲル上で走行させ、断片を臭化エチジウムで染色す
る。このような技術は公知である。
断片の視覚化のための標準的な手法を用いて視覚化する
ことができる。たとえば、断片をアガロースゲル上で走
行させ、断片を適宜染色する。このような視覚化の特に
好適な方法としては、増幅生成物をたとえば２％アガロ
ースゲル上で走行させ、断片を臭化エチジウムで染色す
る。このような技術は公知である。
【００５１】上述したように、ＰＣＲ増幅混合物におけ
る陽性調節ベクターの存在により、誤った陰性結果の発
生が防止される。すなわち、標的核酸断片が存在してい
るのに、陰性の結果が出ることが防止される。ポリメラ
ーゼ連鎖反応を介した核酸配列の検出の増幅生成物を観
察するとき、つぎの３つの可能性が生じる。
る陽性調節ベクターの存在により、誤った陰性結果の発
生が防止される。すなわち、標的核酸断片が存在してい
るのに、陰性の結果が出ることが防止される。ポリメラ
ーゼ連鎖反応を介した核酸配列の検出の増幅生成物を観
察するとき、つぎの３つの可能性が生じる。
【００５２】１．陽性調節ベクターのみの増幅生成物に
対応する、唯一のバンドが存在する。
対応する、唯一のバンドが存在する。
【００５３】この場合には、試験標本中に標的核酸断片
が存在しないことが明らかである。
が存在しないことが明らかである。
【００５４】２．陽性調節ベクターの増幅生成物に対応
するものと、標的核酸配列の増幅生成物に対応するもの
との、２つのバンドが存在する。この場合には、標的核
酸配列は良好に検出され、ＰＣＲ増幅は阻止されなかっ
た。
するものと、標的核酸配列の増幅生成物に対応するもの
との、２つのバンドが存在する。この場合には、標的核
酸配列は良好に検出され、ＰＣＲ増幅は阻止されなかっ
た。
【００５５】３．陽性調節ベクターの増幅生成物、ある
いは、標的核酸配列の増幅生成物に対応するバンドはま
ったく存在しない。この場合には、ＰＣＲ増幅が何らか
の形で阻止されたのであり、標本中の標的核酸配列の有
無に関する結論を出すことはできない。
いは、標的核酸配列の増幅生成物に対応するバンドはま
ったく存在しない。この場合には、ＰＣＲ増幅が何らか
の形で阻止されたのであり、標本中の標的核酸配列の有
無に関する結論を出すことはできない。
【００５６】本発明は、また、核酸配列のＰＣＲを介し
た検出における陽性調節ベクターの使用を提供する。こ
のようなベクターの使用は、患者から得られた標本から
直接、微生物すなわち微生物の核酸要素を検出するにあ
たり、極めて有用であると期待される。
た検出における陽性調節ベクターの使用を提供する。こ
のようなベクターの使用は、患者から得られた標本から
直接、微生物すなわち微生物の核酸要素を検出するにあ
たり、極めて有用であると期待される。
【００５７】本発明はさらに、標本、特に臨床標本にお
ける核酸のＰＣＲを介した検出に用いられるキットであ
って、検出すべき核酸に特異な陽性調節ベクターと、Ｄ
ＮＡ抽出および増幅試薬からなるキットを提供する。
ける核酸のＰＣＲを介した検出に用いられるキットであ
って、検出すべき核酸に特異な陽性調節ベクターと、Ｄ
ＮＡ抽出および増幅試薬からなるキットを提供する。
【００５８】
【実施例】以下、実施例を参照して、本発明についてさ
らに説明する。
らに説明する。
【００５９】実施例１ ヒト結核菌またはウシ結核菌の検出 Ａ．陽性調節プラスミドｐＰＧ１０の調製 プラスミドｐＰＧ１０は、一般に入手できるプラスミド
であるｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋（登録商
標）［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる］を出発体
として製造できる。ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ
＋は、アンピシリン耐性のための遺伝子と、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製源と、１本鎖ＤＮＡのＦ１複製源
とを含む。
であるｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋（登録商
標）［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる］を出発体
として製造できる。ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ
＋は、アンピシリン耐性のための遺伝子と、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製源と、１本鎖ＤＮＡのＦ１複製源
とを含む。
【００６０】核酸中のチミジン残基のいくらかをウラシ
ルに置換したプラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ
ＩＩ＋の１本鎖ＤＮＡは、介助ファージＫＯ７［Ｂｉｏ
ｒａｄより入手可能］を用いて、大腸菌株ＣＪ２３６
［ＢＲＬより入手可能］を転換することにより得られ
た。１本鎖ＤＮＡは、エチレングリコールを用いて沈殿
され、ついで、「分子クローニング：実験マニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」においてＳａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌにより説明された技術を用いて、アガロー
スゲル電気泳動により精製された。
ルに置換したプラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ
ＩＩ＋の１本鎖ＤＮＡは、介助ファージＫＯ７［Ｂｉｏ
ｒａｄより入手可能］を用いて、大腸菌株ＣＪ２３６
［ＢＲＬより入手可能］を転換することにより得られ
た。１本鎖ＤＮＡは、エチレングリコールを用いて沈殿
され、ついで、「分子クローニング：実験マニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」においてＳａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌにより説明された技術を用いて、アガロー
スゲル電気泳動により精製された。
【００６１】２つのプライマーＩＳ４１およびＩＳ４３
［Ｐｌｉｋｙａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．
Ｐｒｏｂｅｓ ５（１９９１）２１５］の配列を含み、
下記にオリゴヌクレオチドＡおよびＢとして示された配
列をもつ突然変異鎖ＤＮＡが、Ｂｉｏｒａｄより入手で
きるＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製され、つづい
て、突然変異誘発生成物の大腸菌株ＤＨ５αへの転換が
行なわれた。プライマーＩＳ４１およびＩＳ４３は、Ｉ
Ｓ６１１０として知られるヒト結核菌およびウシ結核菌
のゲノムにおける反復要素を認識する。大腸菌株ＤＨ５
αによりウラシルを含むＤＮＡ鎖を除去することがで
き、これにより、自動的に突然変異鎖を選択する。形質
転換体からのＤＮＡはアルカリ溶解により得られ、突然
変異体は、制限酵素ＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＩを用い
て、ＤＮＡの消化により検出された。
［Ｐｌｉｋｙａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．
Ｐｒｏｂｅｓ ５（１９９１）２１５］の配列を含み、
下記にオリゴヌクレオチドＡおよびＢとして示された配
列をもつ突然変異鎖ＤＮＡが、Ｂｉｏｒａｄより入手で
きるＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて調製され、つづい
て、突然変異誘発生成物の大腸菌株ＤＨ５αへの転換が
行なわれた。プライマーＩＳ４１およびＩＳ４３は、Ｉ
Ｓ６１１０として知られるヒト結核菌およびウシ結核菌
のゲノムにおける反復要素を認識する。大腸菌株ＤＨ５
αによりウラシルを含むＤＮＡ鎖を除去することがで
き、これにより、自動的に突然変異鎖を選択する。形質
転換体からのＤＮＡはアルカリ溶解により得られ、突然
変異体は、制限酵素ＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＩを用い
て、ＤＮＡの消化により検出された。
【００６２】２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、
１２５０個の塩基対の間隔をおいてプラスミドに挿入さ
れる。
１２５０個の塩基対の間隔をおいてプラスミドに挿入さ
れる。
【００６３】突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＡは下
記の配列［配列ＩＤ番号１］を有する：
記の配列［配列ＩＤ番号１］を有する：
【数１】
【００６４】ヌクレアーゼＳｓｐＩのための制限部位は
太字で示され、オリゴヌクレオチドプライマーＩＳ４１
の配列には下線が付されている。
太字で示され、オリゴヌクレオチドプライマーＩＳ４１
の配列には下線が付されている。
【００６５】突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＢは下
記の配列［配列ＩＤ番号２］を有する：
記の配列［配列ＩＤ番号２］を有する：
【数２】
【００６６】オリゴヌクレオチドＢの配列において、ヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩのための制限部位は太字体で示さ
れ、下線を付した配列はオリゴヌクレオチドプライマー
ＩＳ４３の配列である。
クレアーゼＥｃｏＲＩのための制限部位は太字体で示さ
れ、下線を付した配列はオリゴヌクレオチドプライマー
ＩＳ４３の配列である。
【００６７】プラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ
＋内へ組み込んだオリゴヌクレオチドＡの部位特異的突
然変異誘発は、プラスミド配列の２８５０の位置の、プ
ラスミドのＳｓｐＩ部位に、プライマーＩＳ４１の配列
を導入する。制限部位はこのプロセス中に削除される。
同様にして、オリゴヌクレオチドＢの部位特異的突然変
異誘発は、プラスミドの配列の１０９５の位置の、プラ
スミドのＡｌｕＩ制限部位に、プライマーＩＳ４３の配
列を導入する。これによりその制限部位を削除し、新た
なＥｃｏＲＩ部位を作る。
＋内へ組み込んだオリゴヌクレオチドＡの部位特異的突
然変異誘発は、プラスミド配列の２８５０の位置の、プ
ラスミドのＳｓｐＩ部位に、プライマーＩＳ４１の配列
を導入する。制限部位はこのプロセス中に削除される。
同様にして、オリゴヌクレオチドＢの部位特異的突然変
異誘発は、プラスミドの配列の１０９５の位置の、プラ
スミドのＡｌｕＩ制限部位に、プライマーＩＳ４３の配
列を導入する。これによりその制限部位を削除し、新た
なＥｃｏＲＩ部位を作る。
【００６８】プラスミドｐＰＧ１０（図１）は、Ｓｓｐ
Ｉ部位の欠失、親プラスミドのＡｌｕＩ部位、および１
０９５の位置に新たに作られたＥｃｏＲＩ部位の存在に
より特徴づけられる。
Ｉ部位の欠失、親プラスミドのＡｌｕＩ部位、および１
０９５の位置に新たに作られたＥｃｏＲＩ部位の存在に
より特徴づけられる。
【００６９】プラスミドｐＰＧ１０は、つぎに、ＩＳ４
１およびＩＳ４３の配列をプライマーとして用いるポリ
メラーゼ連鎖反応を用いて分析され、予定された１２５
０個の塩基対増幅生成物が得られた。
１およびＩＳ４３の配列をプライマーとして用いるポリ
メラーゼ連鎖反応を用いて分析され、予定された１２５
０個の塩基対増幅生成物が得られた。
【００７０】 Ｂ．ヒト結核菌およびウシ結核菌のＰＣＲ検出 ミコバクテリア以外のすべての微生物を溶解するため
に、痰標本を水酸化ナトリウム３０ｍｌで処理した。つ
ぎに、標準的な手法を用いて、１３ｒｐｍの遠心分離を
行ない、標本を濃縮した。得られたペレットを食塩水で
洗浄し、再びペレット状にし、水中に再懸濁した。
に、痰標本を水酸化ナトリウム３０ｍｌで処理した。つ
ぎに、標準的な手法を用いて、１３ｒｐｍの遠心分離を
行ない、標本を濃縮した。得られたペレットを食塩水で
洗浄し、再びペレット状にし、水中に再懸濁した。
【００７１】痰懸濁液の標本５００μｌを、１．５ｍｌ
超小型遠心管にピペット注入し、１３ｒｐｍで標本の遠
心分離を行なった。つぎに、１ｍｌの１０ｍＭトリス
（ヒドロオキシメチル）アミノメタン塩酸（Ｔｒｉｓ−
ＨＣＬ）（ｐＨ８．０）、トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝
液中の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用
いて得られたペレットを洗浄し、再び遠心分離を行なっ
た。得られたペレットを、リゾチーム２０ｍｇ／ｍｌを
含むＴＥ緩衝液７５μｌ中に再懸濁した。その後、３７
℃で２時間にわたってインキュベートした。この時間の
最後に、２ＭのＮａＯＨ２５μｌおよび２０％のドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた処理と、溶液の５
分間の煮沸を行なって、ミコバクテリアを溶解した。つ
ぎに５０μｌの１Ｎ塩酸水溶液で標本を中和し、１３ｒ
ｐｍでふたたび遠心分離を行なった。
超小型遠心管にピペット注入し、１３ｒｐｍで標本の遠
心分離を行なった。つぎに、１ｍｌの１０ｍＭトリス
（ヒドロオキシメチル）アミノメタン塩酸（Ｔｒｉｓ−
ＨＣＬ）（ｐＨ８．０）、トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝
液中の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用
いて得られたペレットを洗浄し、再び遠心分離を行なっ
た。得られたペレットを、リゾチーム２０ｍｇ／ｍｌを
含むＴＥ緩衝液７５μｌ中に再懸濁した。その後、３７
℃で２時間にわたってインキュベートした。この時間の
最後に、２ＭのＮａＯＨ２５μｌおよび２０％のドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた処理と、溶液の５
分間の煮沸を行なって、ミコバクテリアを溶解した。つ
ぎに５０μｌの１Ｎ塩酸水溶液で標本を中和し、１３ｒ
ｐｍでふたたび遠心分離を行なった。
【００７２】そして、つぎのようにして、痰標本からＰ
ＣＲ阻害因子を取り除いた。Ｐｒｏｍｅｇａから入手し
た「マジック ミニプレップ（Ｍａｇｉｃ Ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐ）」（登録商標）キットを用いて、標準的な技術
により、ＤＮＡを上澄みから抽出した。ただし、ゲノミ
ックＤＮＡの沈殿を避けるため、２．５５ＭのＫＯＡｃ
（ｐＨ４．８）のかわりに１Ｍ塩酸水溶液を用いて中和
を行なった。つぎに、２００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）と、５ｍＭのＥＤＴＡと、０．２Ｍ塩化ナトリ
ウムと、５０％エタノールとの溶液２ｍｌで、カラムを
洗浄した。ＤＮＡは、水５０μｌ中でカラムから溶出し
た。
ＣＲ阻害因子を取り除いた。Ｐｒｏｍｅｇａから入手し
た「マジック ミニプレップ（Ｍａｇｉｃ Ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐ）」（登録商標）キットを用いて、標準的な技術
により、ＤＮＡを上澄みから抽出した。ただし、ゲノミ
ックＤＮＡの沈殿を避けるため、２．５５ＭのＫＯＡｃ
（ｐＨ４．８）のかわりに１Ｍ塩酸水溶液を用いて中和
を行なった。つぎに、２００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）と、５ｍＭのＥＤＴＡと、０．２Ｍ塩化ナトリ
ウムと、５０％エタノールとの溶液２ｍｌで、カラムを
洗浄した。ＤＮＡは、水５０μｌ中でカラムから溶出し
た。
【００７３】つぎに、５０μｌの最終容積をもつ溶液中
で、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この溶液は、２
００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ
と、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ、１０ｍＭのトリ
スＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、０．５μｌのプライマー、上記のステ
ップＡにおいて説明したように調製された１０ｐｇの制
御プラスミドｐＰＧ１０からなる。そして、痰標本から
精製された５μｌのＤＮＡをこの反応混合物に添加し
た。ＰＣＲ反応の開始前に、ＤＮＡの熱変性を１０分間
行なった。各ＰＣＲサイクルは、熱変性、アニーリン
グ、伸長からなり、各サイクルの温度と時間はつぎのと
おりであった。熱変性は９４℃で２分間、アニーリング
は６８℃で２分間、伸長は７２℃で２分間であり、これ
を３０サイクル行なった。各ステップの時間を、各サイ
クルの終了時に５秒ずつ増加した。最終サイクルの最後
に、１０分間にわたって生成物を充分伸長した。
で、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した。この溶液は、２
００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ
と、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ、１０ｍＭのトリ
スＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ２、０．５μｌのプライマー、上記のステ
ップＡにおいて説明したように調製された１０ｐｇの制
御プラスミドｐＰＧ１０からなる。そして、痰標本から
精製された５μｌのＤＮＡをこの反応混合物に添加し
た。ＰＣＲ反応の開始前に、ＤＮＡの熱変性を１０分間
行なった。各ＰＣＲサイクルは、熱変性、アニーリン
グ、伸長からなり、各サイクルの温度と時間はつぎのと
おりであった。熱変性は９４℃で２分間、アニーリング
は６８℃で２分間、伸長は７２℃で２分間であり、これ
を３０サイクル行なった。各ステップの時間を、各サイ
クルの終了時に５秒ずつ増加した。最終サイクルの最後
に、１０分間にわたって生成物を充分伸長した。
【００７４】このＰＣＲ生成物の分析は、標本を２％の
アガロースゲル上で走行させ、臭化エチジウムで染色す
ることにより行なわれた。
アガロースゲル上で走行させ、臭化エチジウムで染色す
ることにより行なわれた。
【００７５】ステップＡで説明したように、陽性調節プ
ラスミドのみが、約１２５０個の塩基対を有するバンド
の生成をもたらす。ＩＳ６１１０標的配列の良好な増幅
は、約３１７個の塩基対を有するバンドの生成をもたら
す。したがって、３１７個の塩基対を有するバンドと、
１２５０個の塩基対を有するバンドの、２つのバンドが
存在する場合、このことは、ＩＳ６１１０標的配列が良
好に増幅され、当該標本がヒト結核菌かウシ結核菌のい
ずれかを含むことを示す。一方、染色によって、１２５
０個の塩基対に相当するバンド１つだけが現れたなら
ば、これは、標本中に標的ＩＳ６１１０配列が存在しな
いこと、したがってミコバクテリア感染がないことを示
す。まったくバンドがあらわれない場合、もしくは、少
なくとも３１７個または１２５０個の塩基対のいずれか
に相当するバンドが存在しない場合には、これは、ＰＣ
Ｒが阻害されたことを示している。
ラスミドのみが、約１２５０個の塩基対を有するバンド
の生成をもたらす。ＩＳ６１１０標的配列の良好な増幅
は、約３１７個の塩基対を有するバンドの生成をもたら
す。したがって、３１７個の塩基対を有するバンドと、
１２５０個の塩基対を有するバンドの、２つのバンドが
存在する場合、このことは、ＩＳ６１１０標的配列が良
好に増幅され、当該標本がヒト結核菌かウシ結核菌のい
ずれかを含むことを示す。一方、染色によって、１２５
０個の塩基対に相当するバンド１つだけが現れたなら
ば、これは、標本中に標的ＩＳ６１１０配列が存在しな
いこと、したがってミコバクテリア感染がないことを示
す。まったくバンドがあらわれない場合、もしくは、少
なくとも３１７個または１２５０個の塩基対のいずれか
に相当するバンドが存在しない場合には、これは、ＰＣ
Ｒが阻害されたことを示している。
【００７６】分析結果を図２に示す。この図は、１３個
の臨床標本の分析を示す。微生物学的データおよび臨床
データの間の良好な相関が得られた。１２５０個の塩基
対のバンドは、４欄および９欄を除くすべての標本中に
存在する。すなわち、４欄と９欄の標本においてはＰＣ
Ｒが働かなかったことになる。２欄および６欄の標本の
みが、３１７個の塩基対のバンドの存在を示している。
すなわち、これらの標本のみがミコバクテリアを含んで
いたことを示している。Ｍ欄は分子量マーカーである。
の臨床標本の分析を示す。微生物学的データおよび臨床
データの間の良好な相関が得られた。１２５０個の塩基
対のバンドは、４欄および９欄を除くすべての標本中に
存在する。すなわち、４欄と９欄の標本においてはＰＣ
Ｒが働かなかったことになる。２欄および６欄の標本の
みが、３１７個の塩基対のバンドの存在を示している。
すなわち、これらの標本のみがミコバクテリアを含んで
いたことを示している。Ｍ欄は分子量マーカーである。
【００７７】実施例２ 歯周疾患を起こす微生物の検出 Ａ．プライマーの調製 歯周疾患に関与するとして知られる３つの微生物、すな
わち、Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉ
ｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓのためのプライマーを生成した。３つ
の微生物のＤＮＡ配列揃えは、遺伝子バンクに収容され
た情報を用いて行なわれた。増幅のために選択された座
位は、１６８リボソームＤＮＡにおける高度に可変の領
域であり、下記に述べるように、共通のプライマーＵ３
を設計するために用いられる保存配列を含む。３つの微
生物Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓのそれぞれに特異なオリゴヌクレオチド
は、この座位の内部の可変領域から設計され、異なる大
きさの断片を増幅した［Ｂｉ：１６８塩基対、Ａａ：２
５５塩基対、Ｂｇ：３４２塩基対］。各プライマーがそ
の微生物に特異であるという事実は、配列揃えを利用し
て、ＤＮＡ分析プログラム（Ｍａｃａｗ（登録商標））
を用いて証明された。この特異性は、ＰＣＲ増幅におい
て他のバクテリアからのＤＮＡを用いることにより、経
験的に示された。この場合には、増幅生成物は得られな
かった。
わち、Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉ
ｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓのためのプライマーを生成した。３つ
の微生物のＤＮＡ配列揃えは、遺伝子バンクに収容され
た情報を用いて行なわれた。増幅のために選択された座
位は、１６８リボソームＤＮＡにおける高度に可変の領
域であり、下記に述べるように、共通のプライマーＵ３
を設計するために用いられる保存配列を含む。３つの微
生物Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓのそれぞれに特異なオリゴヌクレオチド
は、この座位の内部の可変領域から設計され、異なる大
きさの断片を増幅した［Ｂｉ：１６８塩基対、Ａａ：２
５５塩基対、Ｂｇ：３４２塩基対］。各プライマーがそ
の微生物に特異であるという事実は、配列揃えを利用し
て、ＤＮＡ分析プログラム（Ｍａｃａｗ（登録商標））
を用いて証明された。この特異性は、ＰＣＲ増幅におい
て他のバクテリアからのＤＮＡを用いることにより、経
験的に示された。この場合には、増幅生成物は得られな
かった。
【００７８】Ｂ．プラスミドｐＰＧＵ３の調製 上記実施例１のステップＡにおいて述べたと同様な手順
にしたがって、ただし、下記に示す配列［配列ＩＤ番号
３］を有する突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＭＵＴ
Ｕ３を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーＵ３の配
列を親プラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋
に挿入し、突然変異プラスミドｐＰＧＵ３を得た。
にしたがって、ただし、下記に示す配列［配列ＩＤ番号
３］を有する突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＭＵＴ
Ｕ３を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーＵ３の配
列を親プラスミドｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋
に挿入し、突然変異プラスミドｐＰＧＵ３を得た。
【００７９】突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＭＵＴ
Ｕ３：
Ｕ３：
【数３】
【００８０】ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋の１
０９５の位置のＡｌｕＩ部位内へ組み込んだＵ３の配列
の部位特異的突然変異誘発は、その部位の削除と新たな
ＸｈｏＩ部位（太字で示す）の創出をもたらす。プライ
マーＵ３の配列には下線が付されている。プラスミド
は、新たなＸｈｏＩ部位の存在およびＡｌｕＩ部位の欠
失によって特徴づけられる。
０９５の位置のＡｌｕＩ部位内へ組み込んだＵ３の配列
の部位特異的突然変異誘発は、その部位の削除と新たな
ＸｈｏＩ部位（太字で示す）の創出をもたらす。プライ
マーＵ３の配列には下線が付されている。プラスミド
は、新たなＸｈｏＩ部位の存在およびＡｌｕＩ部位の欠
失によって特徴づけられる。
【００８１】部位特異的突然変異誘発により作られたプ
ラスミドは、ｐＰＧＭＵＴＵ３と呼ばれた。このプラス
ミドのＸｈｏＩ断片を、標準的な技術を用いて二次クロ
ーン化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片ＤＮＡポリメラーゼを用い
て平滑末端化を行ない、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて切
断した。この切断断片は、制限酵素ＳｍａＩおよびＥｃ
ｏＲＩで切断されたｐＰＧＭＵＴＵ３に挿入された。
ラスミドは、ｐＰＧＭＵＴＵ３と呼ばれた。このプラス
ミドのＸｈｏＩ断片を、標準的な技術を用いて二次クロ
ーン化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片ＤＮＡポリメラーゼを用い
て平滑末端化を行ない、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて切
断した。この切断断片は、制限酵素ＳｍａＩおよびＥｃ
ｏＲＩで切断されたｐＰＧＭＵＴＵ３に挿入された。
【００８２】得られたプラスミドｐＰＧＵＳの構造を図
３に示す。このプラスミドにＰＣＲ増幅を実施し、その
結果、約８５０塩基対の長さの増幅生成物が得られた。
３に示す。このプラスミドにＰＣＲ増幅を実施し、その
結果、約８５０塩基対の長さの増幅生成物が得られた。
【００８３】 Ｃ．標本中の歯周疾患を起こすバクテリアの検出 歯周ポケットすなわち歯周溝の歯根域に無菌吸収性尖紙
（ｐａｐｅｒ ｐｏｉｎｔ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ、第２７１６号）を穏やかに挿入すること
により、標本を収集した。１０秒後、尖紙を取り出し、
５００μｌの食塩水を入れた１．５ｍｌエッペンドルフ
管に移した。このエッペンドルフ管を、３０秒間、ボル
テックス振とうすることにより溶菌斑標本中の微生物を
尖紙から溶出させた。尖紙を取り出した後、２０μｌの
標本を７００μｌ管に入れ、細胞を分断するために５分
間にわたり煮沸した。
（ｐａｐｅｒ ｐｏｉｎｔ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ、第２７１６号）を穏やかに挿入すること
により、標本を収集した。１０秒後、尖紙を取り出し、
５００μｌの食塩水を入れた１．５ｍｌエッペンドルフ
管に移した。このエッペンドルフ管を、３０秒間、ボル
テックス振とうすることにより溶菌斑標本中の微生物を
尖紙から溶出させた。尖紙を取り出した後、２０μｌの
標本を７００μｌ管に入れ、細胞を分断するために５分
間にわたり煮沸した。
【００８４】上記の配列ＩＤ番号３において下線で示さ
れた配列［配列ＩＤ番号４］をもつプライマーＵ３は、
３つの微生物Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに共通である。これら３つの微
生物を識別するために、ＰＣＲ反応に用いられるプライ
マーは、それぞれ、微生物の１つずつに特異なものとし
た。すなわち、プライマーＡＡ２［配列ＩＤ番号５］
は： ＣＧＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＡＴ ＡＣＧ なる配列をもち、Ａ．ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏ
ｍｉｔａｎｓに特異であり、２５５塩基対をもつＰＣＲ
増幅生成物を生じる。
れた配列［配列ＩＤ番号４］をもつプライマーＵ３は、
３つの微生物Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎｏｍ
ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに共通である。これら３つの微
生物を識別するために、ＰＣＲ反応に用いられるプライ
マーは、それぞれ、微生物の１つずつに特異なものとし
た。すなわち、プライマーＡＡ２［配列ＩＤ番号５］
は： ＣＧＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＡＴ ＡＣＧ なる配列をもち、Ａ．ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏ
ｍｉｔａｎｓに特異であり、２５５塩基対をもつＰＣＲ
増幅生成物を生じる。
【００８５】プライマーＢ１７［配列ＩＤ番号６］は： ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＡＣ ＴＣＧ ＧＧ なる配列をもち、微生物Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓに
特異であり、１６８塩基対をもつＰＣＲ増幅生成物を生
じる。
特異であり、１６８塩基対をもつＰＣＲ増幅生成物を生
じる。
【００８６】プライマーＢＧ８［配列ＩＤ番号７］は： ＴＴＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＣＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＣＧ ＡＧ なる配列をもち、微生物Ｂ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに特
異であり、３４２塩基対をもつＰＣＲ増幅生成物を生じ
る。
異であり、３４２塩基対をもつＰＣＲ増幅生成物を生じ
る。
【００８７】ＰＣＲに用いられる溶液は、５０μｌの最
終容積をもち、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰと、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ
と、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）と、５０ｍＭ
のＫＣｌと、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．５μｌの
３つのプライマーＢＧ８、Ｂ１７、ＡＡ２の混合物と、
１．５μＭのＵ３プライマーと、１ｐｇの陽性調節プラ
スミドｐＰＧＵ３と、５μｌの煮沸溶菌斑標本とを含ん
でいた。この混合物に対して、１０分間の熱変性を行な
ったのち、３０サイクルのＰＣＲを実施した。これらの
サイクルは、９４℃で２分間の熱変性と、６８℃で２分
間のアニーリングと、７２℃で２分間の伸長とを含み、
各サイクルの終了時に各ステップの時間を５秒ずつ増加
させた。最終サイクルの終りに、１０分間にわたり、生
成物を充分伸長した。
終容積をもち、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰと、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ
と、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）と、５０ｍＭ
のＫＣｌと、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．５μｌの
３つのプライマーＢＧ８、Ｂ１７、ＡＡ２の混合物と、
１．５μＭのＵ３プライマーと、１ｐｇの陽性調節プラ
スミドｐＰＧＵ３と、５μｌの煮沸溶菌斑標本とを含ん
でいた。この混合物に対して、１０分間の熱変性を行な
ったのち、３０サイクルのＰＣＲを実施した。これらの
サイクルは、９４℃で２分間の熱変性と、６８℃で２分
間のアニーリングと、７２℃で２分間の伸長とを含み、
各サイクルの終了時に各ステップの時間を５秒ずつ増加
させた。最終サイクルの終りに、１０分間にわたり、生
成物を充分伸長した。
【００８８】標本を３％アガロースゲル上で走行させ、
臭化エチジウムで染色することにより、ＰＣＲ生成物を
視覚化した。その結果は図４および下記を参照して説明
される。
臭化エチジウムで染色することにより、ＰＣＲ生成物を
視覚化した。その結果は図４および下記を参照して説明
される。
【００８９】３つの微生物すべてを含む臨床標本では、
ＰＣＲ増幅生成物は、１６８、２５５、３４２、８５０
塩基対のバンドを示す。標本中にバクテリアのどれかが
存在する場合には、そのバクテリアに特異な増幅断片に
対応するバンドが染色後に現れる。３つの微生物のいず
れも標本中に存在しない場合には、８５０塩基対のバン
ドのみが現れる。ＰＣＲ反応が阻害された場合には、１
６８、２５５、３４２、８５０塩基対のいずれのバンド
も現れない。
ＰＣＲ増幅生成物は、１６８、２５５、３４２、８５０
塩基対のバンドを示す。標本中にバクテリアのどれかが
存在する場合には、そのバクテリアに特異な増幅断片に
対応するバンドが染色後に現れる。３つの微生物のいず
れも標本中に存在しない場合には、８５０塩基対のバン
ドのみが現れる。ＰＣＲ反応が阻害された場合には、１
６８、２５５、３４２、８５０塩基対のいずれのバンド
も現れない。
【００９０】図４には、１１の臨床標本から抽出された
ＤＮＡ抽出物の増幅結果が示されている。Ｍ欄は分子量
マーカー（φＸ１７４ＨａｅＩＩＩマーカー）、１〜１
１欄は１つ、２つ、３つの微生物を含む標本、ダッシュ
（−）を付した欄は負の対照である。
ＤＮＡ抽出物の増幅結果が示されている。Ｍ欄は分子量
マーカー（φＸ１７４ＨａｅＩＩＩマーカー）、１〜１
１欄は１つ、２つ、３つの微生物を含む標本、ダッシュ
（−）を付した欄は負の対照である。
【００９１】実施例３ 血液標本中のＣ型肝炎の検出 Ａ．ＰＣＲ陽性調節ウィルスの作成 次の配列［配列ＩＤ番号８および９］をもつプライマー
ＭＨＣＶ１およびＭＨＣＶ２を用いて、Ｃ型肝炎含有標
本の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により、Ｃ型肝炎
ウィルス５’非翻訳領域が得られた。
ＭＨＣＶ１およびＭＨＣＶ２を用いて、Ｃ型肝炎含有標
本の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により、Ｃ型肝炎
ウィルス５’非翻訳領域が得られた。
【００９２】
【数４】
【００９３】
【数５】
【００９４】これらの配列において、ＳｍａＩ制限部位
は太字で示され、５’非翻訳領域の配列には下線が付さ
れている。
は太字で示され、５’非翻訳領域の配列には下線が付さ
れている。
【００９５】逆転写酵素ＰＣＲ増幅生成物は、ＳｍａＩ
で消化され、平滑末端を生じ、ｐＲＥ８９のＸｍｎＩ部
位にクローンされた。ｐＲＥ８９は、酵母菌ＰＣＫ１プ
ロモーターにより発現が推進される欠損酵母菌２本鎖Ｒ
ＮＡウィルスであるＸウィルスの、ｃＤＮＡクローンで
ある。結紮（リゲーション）生成物は大腸菌株ＤＨ５α
に転換された。ＰＣＲにより、ＰＣＲのプライマーとし
て５’非翻訳領域（「外部プライマー」）の配列を用い
て、組換え体を選別した。
で消化され、平滑末端を生じ、ｐＲＥ８９のＸｍｎＩ部
位にクローンされた。ｐＲＥ８９は、酵母菌ＰＣＫ１プ
ロモーターにより発現が推進される欠損酵母菌２本鎖Ｒ
ＮＡウィルスであるＸウィルスの、ｃＤＮＡクローンで
ある。結紮（リゲーション）生成物は大腸菌株ＤＨ５α
に転換された。ＰＣＲにより、ＰＣＲのプライマーとし
て５’非翻訳領域（「外部プライマー」）の配列を用い
て、組換え体を選別した。
【００９６】Ｃ型肝炎ウィルスの５’非翻訳領域を含む
プラスミドはｐＰＧ１５と呼ばれ、その構成は制限分析
と配列決定により確認された。
プラスミドはｐＰＧ１５と呼ばれ、その構成は制限分析
と配列決定により確認された。
【００９７】つぎに、Ｃ型肝炎ウィルス保存領域の５’
非翻訳領域のヌクレオチド−１２７から−１７０に広が
る内部削除が行われる。これにより、削除される断片と
相補型の配列をもつリポータープローブを用いる場合
に、Ｃ型肝炎ウィルスの増幅生成物と陽性調節の増幅生
成物との識別を可能とする。このステップにより、Ｂａ
ｍＨＩ制限部位のＤＮＡへの導入も可能となり、クロー
ニングが容易になった。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉ
ｏｒａｄ）および下記の配列［配列ＩＤ番号１０］を有
する突然変異誘発性プライマーＭＨＣＶ３を用いたオリ
ゴヌクレオチド突然変異誘発により、内部削除が作り出
された。
非翻訳領域のヌクレオチド−１２７から−１７０に広が
る内部削除が行われる。これにより、削除される断片と
相補型の配列をもつリポータープローブを用いる場合
に、Ｃ型肝炎ウィルスの増幅生成物と陽性調節の増幅生
成物との識別を可能とする。このステップにより、Ｂａ
ｍＨＩ制限部位のＤＮＡへの導入も可能となり、クロー
ニングが容易になった。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉ
ｏｒａｄ）および下記の配列［配列ＩＤ番号１０］を有
する突然変異誘発性プライマーＭＨＣＶ３を用いたオリ
ゴヌクレオチド突然変異誘発により、内部削除が作り出
された。
【００９８】
【数６】
【００９９】上記の配列において、新たに導入されたＢ
ａｍＨＩ部位の配列は太字で示され、５’−非翻訳領域
には下線が付されている。
ａｍＨＩ部位の配列は太字で示され、５’−非翻訳領域
には下線が付されている。
【０１００】突然変異体は、反応プライマーとして外部
プライマーを用いたＰＣＲを用いて判別された。この、
ｐＰＧ１６と呼ばれるプラスミドが正確な構成は、配列
決定により確認された。
プライマーを用いたＰＣＲを用いて判別された。この、
ｐＰＧ１６と呼ばれるプラスミドが正確な構成は、配列
決定により確認された。
【０１０１】つぎに、プラスミドｐＰＧ１６は、オリゴ
ヌクレオチド陽性調節プローブの配列を含む１５０塩基
対の断片に対する宿主として用いられた。この配列は、
標準的な技術を用いて、ｐＰＧ１６のＢａｍＨＩ部位に
挿入された。下記のヌクレオチドプライマー［配列ＩＤ
番号１１および１２］を用いて、プラスミドｐＢＬＵＥ
ＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋から、ＰＣＲにより、ＤＮＡ
断片が得られた。
ヌクレオチド陽性調節プローブの配列を含む１５０塩基
対の断片に対する宿主として用いられた。この配列は、
標準的な技術を用いて、ｐＰＧ１６のＢａｍＨＩ部位に
挿入された。下記のヌクレオチドプライマー［配列ＩＤ
番号１１および１２］を用いて、プラスミドｐＢＬＵＥ
ＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋から、ＰＣＲにより、ＤＮＡ
断片が得られた。
【０１０２】
【数７】
【０１０３】
【数８】
【０１０４】ＢａｍＨＩ部位は太字体で示されている。
【０１０５】ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫＩＩ＋プラ
スミドに対してＰＣＲを実施することにより得られた増
幅生成物は、つぎに、酵素ＢａｍＨＩで制限された。得
られた線形ＤＮＡは、プラスミドｐＰＧ１６に挿入され
た。このプラスミドは前もってＢａｍＨＩで切断された
ものである。得られたプラスミドは、大腸菌株ＤＨ５α
の転換に用いられた。結紮混合物と形質転換体は、ＰＣ
Ｒにより、反応においてＣ型肝炎ウィルス外部プライマ
ーを用いて判別された。最後に、その構成を配列分析に
より確認した。
スミドに対してＰＣＲを実施することにより得られた増
幅生成物は、つぎに、酵素ＢａｍＨＩで制限された。得
られた線形ＤＮＡは、プラスミドｐＰＧ１６に挿入され
た。このプラスミドは前もってＢａｍＨＩで切断された
ものである。得られたプラスミドは、大腸菌株ＤＨ５α
の転換に用いられた。結紮混合物と形質転換体は、ＰＣ
Ｒにより、反応においてＣ型肝炎ウィルス外部プライマ
ーを用いて判別された。最後に、その構成を配列分析に
より確認した。
【０１０６】ｐＰＧ１７と称され、図５および以下にそ
の構造を示す新たな組換えプラスミドは、Ｃ型肝炎ウィ
ルス５’非翻訳領域に挿入された陽性調節プローブ配列
を含んでいた。これは、また、ＸウィルスｃＤＨＡクロ
ーンにも挿入された。その転写は酵母菌ＰＧＫ１プロモ
ーターの制御下において行なわれた。
の構造を示す新たな組換えプラスミドは、Ｃ型肝炎ウィ
ルス５’非翻訳領域に挿入された陽性調節プローブ配列
を含んでいた。これは、また、ＸウィルスｃＤＨＡクロ
ーンにも挿入された。その転写は酵母菌ＰＧＫ１プロモ
ーターの制御下において行なわれた。
【０１０７】つぎに、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ突然変
異ウィルスゲノムは、以下のようにして得られた。酵母
菌株Ｙ５９［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＣＣより入手可能］
（アルファ、ｔｒｐ１、ｓｋｉ２、Ｌ−Ａ−ＨＮ、Ｍ
ｏ）は、上述したように調製されたプラスミドｐＰＧ１
７で転換された。このプラスミドｐＰＧ１７は、陽性調
節配列を含む組換えＸウィルスをコード化するものであ
る。形質転換体は、Ｈ−Ｔｒｐ板上にプレーティングす
ることにより選別された。酵母菌株Ｙ５９は、ＲＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼと、Ｘ主被覆プロテインを供給す
るとして知られているＬ−Ａ介助ウィルスを含んでい
る。この酵母菌は、ウィルス配列を含むｐＰＧ１７転写
体の複製と被包を可能とする。ｐＰＧ１７の転写は、酵
母菌ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＧＫ１プロモータ
ーにより推進される。
異ウィルスゲノムは、以下のようにして得られた。酵母
菌株Ｙ５９［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＣＣより入手可能］
（アルファ、ｔｒｐ１、ｓｋｉ２、Ｌ−Ａ−ＨＮ、Ｍ
ｏ）は、上述したように調製されたプラスミドｐＰＧ１
７で転換された。このプラスミドｐＰＧ１７は、陽性調
節配列を含む組換えＸウィルスをコード化するものであ
る。形質転換体は、Ｈ−Ｔｒｐ板上にプレーティングす
ることにより選別された。酵母菌株Ｙ５９は、ＲＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼと、Ｘ主被覆プロテインを供給す
るとして知られているＬ−Ａ介助ウィルスを含んでい
る。この酵母菌は、ウィルス配列を含むｐＰＧ１７転写
体の複製と被包を可能とする。ｐＰＧ１７の転写は、酵
母菌ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＧＫ１プロモータ
ーにより推進される。
【０１０８】つぎに、選別された形質転換体を、２日間
にわたり、３０℃で、トリプトファンなしに、ＢＲＬか
ら購入した合成培地において成長させた。Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）４５４ページにおい
てＦｕｊｉｍｕｒａｒａ ＆Ｗｉｃｋｎｅｒにより説明
された手法にしたがって、塩化カルシウム遠心分離によ
り、ウィルス粒子が得られた。突然変異ウィルスの複製
型は、標準的な技術を用いて、電気泳動により、分離さ
れた。ＰＣＲを用いたｐＰＧ１７の増幅により、３４２
塩基対の断片に相当するバンドが生成された。
にわたり、３０℃で、トリプトファンなしに、ＢＲＬか
ら購入した合成培地において成長させた。Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）４５４ページにおい
てＦｕｊｉｍｕｒａｒａ ＆Ｗｉｃｋｎｅｒにより説明
された手法にしたがって、塩化カルシウム遠心分離によ
り、ウィルス粒子が得られた。突然変異ウィルスの複製
型は、標準的な技術を用いて、電気泳動により、分離さ
れた。ＰＣＲを用いたｐＰＧ１７の増幅により、３４２
塩基対の断片に相当するバンドが生成された。
【０１０９】Ｂ．血液標本中のＣ型肝炎ウィルスの検出 Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４（１９９１）５１ページに
おいてＣｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌにより説明され
た条件と技術にしたがって、ＲＮＡが、血液標本から分
離された。上記ステップＡに説明されたようにして調製
された陽性調節ＲＮＡの量を変化させて、すなわち、１
０から１００００分子量の範囲で、逆転写酵素ＰＣＲ
（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行した。ＲＴ−ＰＣＲの手順は上
記Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌにおいて説明されて
いるとおりである。
おいてＣｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌにより説明され
た条件と技術にしたがって、ＲＮＡが、血液標本から分
離された。上記ステップＡに説明されたようにして調製
された陽性調節ＲＮＡの量を変化させて、すなわち、１
０から１００００分子量の範囲で、逆転写酵素ＰＣＲ
（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行した。ＲＴ−ＰＣＲの手順は上
記Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌにおいて説明されて
いるとおりである。
【０１１０】増幅生成物は、臭化エチジウムで染色した
２％アガロースゲルにおいて分析された。もしＣ型肝炎
ウィルスが標本中に存在すれば、２５９塩基対を有する
断片に相当するバンドが生成される。一方、陽性調節ウ
ィルスの増幅生成物は、上述したように、３４２塩基対
に等しい。標本中にＣ型肝炎ウィルスが存在する場合に
得られた２つのバンドは、陽性調節ウィルスとＣ型肝炎
ウィルスの５’非翻訳領域をオリゴヌクレオチドプロー
ブとして用いて、ハイブリダイゼーション技術により、
さらに特徴づけられる。
２％アガロースゲルにおいて分析された。もしＣ型肝炎
ウィルスが標本中に存在すれば、２５９塩基対を有する
断片に相当するバンドが生成される。一方、陽性調節ウ
ィルスの増幅生成物は、上述したように、３４２塩基対
に等しい。標本中にＣ型肝炎ウィルスが存在する場合に
得られた２つのバンドは、陽性調節ウィルスとＣ型肝炎
ウィルスの５’非翻訳領域をオリゴヌクレオチドプロー
ブとして用いて、ハイブリダイゼーション技術により、
さらに特徴づけられる。
【０１１１】実施例４ ヒト細胞におけるインターロイキン−２ｍＲＮＡレベル
の検出と測定 Ａ．ＰＣＲ陽性調節組換えウィルスの組み立て 上記実施例３のステップＡにおいて説明したものと同様
な手順にしたがう。ただし、ＸｃＤＮＡクローンに導入
される配列は、約５００塩基対により分離される２つの
プライマー配列からなるものであった。
の検出と測定 Ａ．ＰＣＲ陽性調節組換えウィルスの組み立て 上記実施例３のステップＡにおいて説明したものと同様
な手順にしたがう。ただし、ＸｃＤＮＡクローンに導入
される配列は、約５００塩基対により分離される２つの
プライマー配列からなるものであった。
【０１１２】下記の配列［配列ＩＤ番号１３］を有する
突然変異オリゴヌクレオチドＭＩＬ２を用いて、インタ
ーロイキン−２（ＩＬ−２）センスおよびＩＬ−２アン
チセンス相補配列を、ＸｃＤＮＡクローンＰＲＥＳに挿
入した。ここで、ＢａｍＨＩ部位は太字体で示され、Ｉ
Ｌ２プライマーの配列には下線が付されている。
突然変異オリゴヌクレオチドＭＩＬ２を用いて、インタ
ーロイキン−２（ＩＬ−２）センスおよびＩＬ−２アン
チセンス相補配列を、ＸｃＤＮＡクローンＰＲＥＳに挿
入した。ここで、ＢａｍＨＩ部位は太字体で示され、Ｉ
Ｌ２プライマーの配列には下線が付されている。
【０１１３】
【数９】
【０１１４】このプライマーは、オリゴヌクレオチドＩ
Ｌ２ＳおよびＩＬ２ＡＳをプライマーとして用いたＰＣ
Ｒにより、２本鎖型に変換された。このプライマーは、
酵素ＸｍｎＩで切断されたｐＲＥ８９に結紮され平滑末
端を形成した。得られた結紮混合物を用いて、大腸菌株
ＤＨ５αを転換した。形質転換体は制限分析を用いて判
別された。構成は、配列分析によりさらに特徴づけられ
た。得られたプラスミドはｐＰＧ２１と呼ばれた。
Ｌ２ＳおよびＩＬ２ＡＳをプライマーとして用いたＰＣ
Ｒにより、２本鎖型に変換された。このプライマーは、
酵素ＸｍｎＩで切断されたｐＲＥ８９に結紮され平滑末
端を形成した。得られた結紮混合物を用いて、大腸菌株
ＤＨ５αを転換した。形質転換体は制限分析を用いて判
別された。構成は、配列分析によりさらに特徴づけられ
た。得られたプラスミドはｐＰＧ２１と呼ばれた。
【０１１５】上記実施例３のステップＡに概説された手
順にしたがって、ただし、ＰＢＳ１２のかわりに突然変
異誘発性プライマーＰＢＳ１５［配列ＩＤ番号１４］を
用いて、陽性調節配列を含む５００塩基対のＤＮＡ断片
が、上記のようにして調製されたｐＰＧ２１のＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入された。
順にしたがって、ただし、ＰＢＳ１２のかわりに突然変
異誘発性プライマーＰＢＳ１５［配列ＩＤ番号１４］を
用いて、陽性調節配列を含む５００塩基対のＤＮＡ断片
が、上記のようにして調製されたｐＰＧ２１のＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入された。
【０１１６】
【数１０】
【０１１７】ＢａｍＨＩ部位は太字体で示されている。
【０１１８】このようにして得られた、５００塩基対に
より分離されたＩＬ−２プライマー配列を含む突然変異
ＸｃＤＮＡクローンは、ｐＰＧ２２と呼ばれた。ＰＣＲ
およびＩＬ−２プライマーを用いてこのプラスミドの増
幅を行なったところ、この陽性調節は約５５４塩基対の
バンドをもたらした。
より分離されたＩＬ−２プライマー配列を含む突然変異
ＸｃＤＮＡクローンは、ｐＰＧ２２と呼ばれた。ＰＣＲ
およびＩＬ−２プライマーを用いてこのプラスミドの増
幅を行なったところ、この陽性調節は約５５４塩基対の
バンドをもたらした。
【０１１９】図６に示した構造をもち、上記のようにし
て調製されたプラスミドｐＰＧ２２を用い、上記の実施
例３のステップＡに記載されたものと同様な手順にした
がって、酵母菌細胞を転換し、ＩＬ−２陽性調節のＲＮ
Ａ配列を含む突然変異ウィルスゲノムを得た。
て調製されたプラスミドｐＰＧ２２を用い、上記の実施
例３のステップＡに記載されたものと同様な手順にした
がって、酵母菌細胞を転換し、ＩＬ−２陽性調節のＲＮ
Ａ配列を含む突然変異ウィルスゲノムを得た。
【０１２０】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（１９
９１）１１８７ページにおいてＭｃＫｎｉｇｈｔにより
概説された手順にしたがって、ＲＮＡが、ヒト細胞から
分離された。用いられたＲＴ−ＰＣＲの条件もこの論文
に記載されている。ＰＣＲを実行するため、１０から１
００００分子の制御ＲＮＡを、ＲＮＡ標本に添加した。
臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルを用い
て、得られたバンドすなわち４１０塩基対のバンドおよ
び５５４塩基対のバンドとを視覚化したのち、反応にお
いて陽性調節ウィルスを存在させたことにより、正確な
結果が保証されることが明らかとなった。
９１）１１８７ページにおいてＭｃＫｎｉｇｈｔにより
概説された手順にしたがって、ＲＮＡが、ヒト細胞から
分離された。用いられたＲＴ−ＰＣＲの条件もこの論文
に記載されている。ＰＣＲを実行するため、１０から１
００００分子の制御ＲＮＡを、ＲＮＡ標本に添加した。
臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルを用い
て、得られたバンドすなわち４１０塩基対のバンドおよ
び５５４塩基対のバンドとを視覚化したのち、反応にお
いて陽性調節ウィルスを存在させたことにより、正確な
結果が保証されることが明らかとなった。
【０１２１】実施例５ ヒト結核菌６５ＫＤａ抗原ｍＲＮＡの検出 Ａ．陽性制御組換えウィルスの作成 Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（１９８９）８４３ペ
ージにおいてＨａｎｃｅにより説明された下記の２つの
プライマーが、陽性調節ウィルスの作成に用いられた。
ージにおいてＨａｎｃｅにより説明された下記の２つの
プライマーが、陽性調節ウィルスの作成に用いられた。
【０１２２】ＴＢ−１［配列ＩＤ番号１５］： ５’
−ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’
−ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’
【０１２３】ＴＢ−２［配列ＩＤ番号１６］： ５’
−ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴ−３’
−ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴ−３’
【０１２４】ＴＢ−１は、６５ＫＤａ抗原をコード化す
る核酸の塩基３９７から４１６に由来するセンスプライ
マーである。一方、ＴＢ−２は塩基５５４から５３５に
由来するアンチセンスプライマーである。
る核酸の塩基３９７から４１６に由来するセンスプライ
マーである。一方、ＴＢ−２は塩基５５４から５３５に
由来するアンチセンスプライマーである。
【０１２５】陽性調節ウィルスは、上記実施例４のステ
ップＡにおける説明と同様にして作成された。ＢａｍＨ
Ｉ制限部位から分離されたＴＢ−１およびＴＢ−２配列
は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＭＴＢ６５ＫＤ
［配列ＩＤ番号１７］を用いて、ＸｃＤＮＡクローンｐ
ＲＥ８９に挿入された。
ップＡにおける説明と同様にして作成された。ＢａｍＨ
Ｉ制限部位から分離されたＴＢ−１およびＴＢ−２配列
は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＭＴＢ６５ＫＤ
［配列ＩＤ番号１７］を用いて、ＸｃＤＮＡクローンｐ
ＲＥ８９に挿入された。
【０１２６】
【数１１】
【０１２７】ここで、ＢａｍＨＩ部位は太字体で示され
ている。
ている。
【０１２８】このプライマーは、ＰＣＲにより、オリゴ
ヌクレオチドＴＢ−１およびＴＢ−２をプライマーとし
て用いて、２本鎖型に変換された。得られた生成物は、
ｐＲＥ８９のＸｍｎＩ部位への平滑末端結紮を用いて結
紮された。
ヌクレオチドＴＢ−１およびＴＢ−２をプライマーとし
て用いて、２本鎖型に変換された。得られた生成物は、
ｐＲＥ８９のＸｍｎＩ部位への平滑末端結紮を用いて結
紮された。
【０１２９】得られたプラスミドを用いて、大腸菌株Ｄ
Ｈ５αを転換した。形質転換体は、制限分析を用いて判
別された。構成は、配列分析を用いてさらに特徴づけら
れた。得られたプラスミドはｐＰＧ２５と呼ばれた。
Ｈ５αを転換した。形質転換体は、制限分析を用いて判
別された。構成は、配列分析を用いてさらに特徴づけら
れた。得られたプラスミドはｐＰＧ２５と呼ばれた。
【０１３０】上記実施例４のステップＡに概説された手
順にしたがって、５００塩基対の陽性調節配列が得ら
れ。プラスミドｐＰＧ２５に挿入された。得られたプラ
スミドｐＰＧ２６は、図７に示された構造を持ち、Ｘｃ
ＤＮＡ配列に挿入された陽性調節プローブを含む５００
塩基対配列により分離されたプライマーＴＢ−１および
ＴＢ−２の配列を含んでいた。ＴＢ−１およびＴＢ−２
配列をプライマーとしてこのプラスミドのＰＣＲ増幅を
行なうと、５４８塩基対のバンドが現れる。
順にしたがって、５００塩基対の陽性調節配列が得ら
れ。プラスミドｐＰＧ２５に挿入された。得られたプラ
スミドｐＰＧ２６は、図７に示された構造を持ち、Ｘｃ
ＤＮＡ配列に挿入された陽性調節プローブを含む５００
塩基対配列により分離されたプライマーＴＢ−１および
ＴＢ−２の配列を含んでいた。ＴＢ−１およびＴＢ−２
配列をプライマーとしてこのプラスミドのＰＣＲ増幅を
行なうと、５４８塩基対のバンドが現れる。
【０１３１】上記実施例３のステップＡに概説された手
順にしたがって、プラスミドｐＰＧ２６を用いた酵母菌
細胞の転換により、ヒト結核菌６５ＫＤａ抗原陽性調節
のＲＮＡ配列を含む突然変異ウィルスゲノムが得られ
た。
順にしたがって、プラスミドｐＰＧ２６を用いた酵母菌
細胞の転換により、ヒト結核菌６５ＫＤａ抗原陽性調節
のＲＮＡ配列を含む突然変異ウィルスゲノムが得られ
た。
【０１３２】 Ｂ．標本中のヒト結核菌の６５ＫＤａ抗原のＰＣＲ検出 ガラスビーズとフェノル−クロロフォルムの存在のもと
で、音波破砕により、ミコバクテリア細胞を、ＰＣＲ用
に調製した。フェノルークロロフォルム溶液を用いた３
回の抽出ののち、ＲＮＡが沈殿し、ＲＮａｓｅを含まな
い水中に再溶解された。可変量の、すなわち，１０〜１
００００分子の陽性調節ＲＮＡをＰＣＲ混合体に添加
し、標準的な技術を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
で、音波破砕により、ミコバクテリア細胞を、ＰＣＲ用
に調製した。フェノルークロロフォルム溶液を用いた３
回の抽出ののち、ＲＮＡが沈殿し、ＲＮａｓｅを含まな
い水中に再溶解された。可変量の、すなわち，１０〜１
００００分子の陽性調節ＲＮＡをＰＣＲ混合体に添加
し、標準的な技術を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１３３】増幅生成物は、２％アガロースゲル中を走
行させ臭化エチジウムで染色することにより、視覚化さ
れた。約３８３および５４８塩基対（それぞれ６５ＫＤ
ａ抗原および陽性調節配列に対応する）のバンドの存在
により、ＰＣＲが完全であり、誤った陰性結果が回避さ
れたことが示される。これらのバンドは、陽性調節およ
びＴＢ−１およびＴＢ−２配列をプローブとして用いた
ハイブリダイゼーションによりさらに特徴づけられる。
行させ臭化エチジウムで染色することにより、視覚化さ
れた。約３８３および５４８塩基対（それぞれ６５ＫＤ
ａ抗原および陽性調節配列に対応する）のバンドの存在
により、ＰＣＲが完全であり、誤った陰性結果が回避さ
れたことが示される。これらのバンドは、陽性調節およ
びＴＢ−１およびＴＢ−２配列をプローブとして用いた
ハイブリダイゼーションによりさらに特徴づけられる。
【０１３４】配列の一覧表 (1) 一般情報 (i) 出願人 (A) 名称：ＰＨＡＲＭＡ ＧＥＮ Ｓ．Ａ． (B) 住所：ＣＡＬＬＥ ＤＥ ＣＡＬＥＲＡ，３ (C) 都市：マドリッド (E) 国：スペイン (F) 郵便番号（ＺＩＰ）：２８７６０ (G) 電話番号：（９１） ８０３ ２０ ００ (H) ファックス番号：（９１）８０３ １１ ４３ (ii)発明の名称：微生物のＰＣＲを介した検出のコント
ロール (iii) 配列数：１７ (iv)コンピューター読取り形態 (A) 媒体の種類：フロッピーディスク (B) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換 (C) オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−
ＤＯＳ (D) ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ リリース＃１．
０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ） (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９２１７３６８．１ (B) 出願日：１９９２年８月１４日 (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９３０３４９８．１ (B) 出願日：１９９３年２月２２日 (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９３０９１９８．１ (B) 出願日：１９９３年５月５日 (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９３０９１９５．７ (B) 出願日：１９９３年５月５日
ロール (iii) 配列数：１７ (iv)コンピューター読取り形態 (A) 媒体の種類：フロッピーディスク (B) コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換 (C) オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−
ＤＯＳ (D) ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ リリース＃１．
０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ） (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９２１７３６８．１ (B) 出願日：１９９２年８月１４日 (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９３０３４９８．１ (B) 出願日：１９９３年２月２２日 (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９３０９１９８．１ (B) 出願日：１９９３年５月５日 (vi)先の出願： (A) 出願番号：ＧＢ ９３０９１９５．７ (B) 出願日：１９９３年５月５日
【０１３５】(2) 配列ＩＤ番号１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５１塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ヒト結核菌 (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１： ＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴ ＴＴＣＡＡＴＣＣＴＧ ＣＧＡ
ＧＣＧＴＡＧＧ ＣＧＴＣＧＧＡＴＴＧ ＡＡＧＣＡＴ
ＴＴＡＴ Ｃ
ＧＣＧＴＡＧＧ ＣＧＴＣＧＧＡＴＴＧ ＡＡＧＣＡＴ
ＴＴＡＴ Ｃ
【０１３６】(2) 配列ＩＤ番号２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５３塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ウシ結核菌 (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：２： ＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣ ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴ ＧＧＣ
ＧＴＧＧＡＣＧ ＣＧＧＣＴＧＡＧＧＣ ＧＧＴＡＡＴ
ＡＣＧＧ ＴＴＡ
ＧＴＧＧＡＣＧ ＣＧＧＣＴＧＡＧＧＣ ＧＧＴＡＡＴ
ＡＣＧＧ ＴＴＡ
【０１３７】(2) 配列ＩＤ番号３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６０塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：Ａ．ＡＣＴＹＮＯＭＹＣＥＴＥＭＣＯＭＩ
ＴＡＮＳ、Ｂ．ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＵＳ、Ｂ．ＧＩＮＧ
ＩＶＡＬＩＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：３： ＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴ ＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡ ＧＣＧ
ＴＧＣＣＡＧＣ ＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ ＡＴＡＣＧＣ
ＴＣＡＣ ＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧ
ＴＡＮＳ、Ｂ．ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＵＳ、Ｂ．ＧＩＮＧ
ＩＶＡＬＩＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：３： ＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴ ＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡ ＧＣＧ
ＴＧＣＣＡＧＣ ＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ ＡＴＡＣＧＣ
ＴＣＡＣ ＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧ
【０１３８】(2) 配列ＩＤ番号４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２４塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：Ａ．ＡＣＴＹＮＯＭＹＣＥＴＥＭＣＯＭＩ
ＴＡＮＳ、Ｂ．ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＵＳ、Ｂ．ＧＩＮＧ
ＩＶＡＬＩＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：４： ＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡ ＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ ＴＡＣ
Ｇ
ＴＡＮＳ、Ｂ．ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＵＳ、Ｂ．ＧＩＮＧ
ＩＶＡＬＩＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：４： ＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡ ＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ ＴＡＣ
Ｇ
【０１３９】(2) 配列ＩＤ番号５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２４塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＡＣＴＹＮＯＭＹＣＥＳ ＡＣＴＹＮＯＭ
ＹＣＥＴＥＭＣＯＭＩＴＡＮＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：５： ＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡ ＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ ＴＡＣ
Ｇ
ＹＣＥＴＥＭＣＯＭＩＴＡＮＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：５： ＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡ ＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ ＴＡＣ
Ｇ
【０１４０】(2) 配列ＩＤ番号６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３２塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＢＡＣＴＥＲＯＩＤＥＳ ＩＮＴＥＲＭＥ
ＤＩＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：６： ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣ ＧＣＣＴＧＣＧＣＴＧ ＣＧＴ
ＧＴＡＣＴＣＧ ＧＧ
ＤＩＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：６： ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣ ＧＣＣＴＧＣＧＣＴＧ ＣＧＴ
ＧＴＡＣＴＣＧ ＧＧ
【０１４１】(2) 配列ＩＤ番号７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３２塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＢＡＣＴＥＲＯＩＤＥＳ ＧＩＮＧＩＶＡ
ＬＩＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：７： ＴＴＧＧＣＣＧＣＴＴ ＡＣＴＧＴＡＴＡＴＣ ＧＣＡ
ＡＡＣＡＧＣＧ ＡＧ
ＬＩＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：７： ＴＴＧＧＣＣＧＣＴＴ ＡＣＴＧＴＡＴＡＴＣ ＧＣＡ
ＡＡＣＡＧＣＧ ＡＧ
【０１４２】(2) 配列ＩＤ番号８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２４塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：８： ＣＣＣＧＧＧＣＧＡＣ ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴ ＡＧＡ
Ｔ
Ｔ
【０１４３】(2) 配列ＩＤ番号９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２５塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＹＥＳ (vi)起源： (A) 微生物：ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：９： ＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧ ＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴ ＡＣＧ
ＡＧ
ＡＧ
【０１４４】(2) 配列ＩＤ番号１０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３３塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１０： ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ ＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡ ＴＴＧ
ＣＣＡＧＧＡＣ ＧＡＣ
ＣＣＡＧＧＡＣ ＧＡＣ
【０１４５】(2) 配列ＩＤ番号１１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２６塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１１： ＣＣＴＡＧＧＴＴＣＴ ＡＴＧＧＡＴＡＡＣＣ ＧＴＡ
ＴＴＡ
ＴＴＡ
【０１４６】(2) 配列ＩＤ番号１２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２６塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＹＥＳ (vi)起源： (A) 微生物：ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１２： ＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴ ＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧ ＧＣＣ
ＡＡＣ
ＡＡＣ
【０１４７】(2) 配列ＩＤ番号１３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５６塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＩＮＴＥＲＬＥＵＫＩＮ−２ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１３： ＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣ ＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧ ＣＡＴ
ＣＣＧＧＡＴＴ ＣＣＡＴＧＡＴＧＡＧ ＣＣＡＧＣＡ
ＡＣＴＧ ＴＧＧＴＧＧ
ＣＣＧＧＡＴＴ ＣＣＡＴＧＡＴＧＡＧ ＣＣＡＧＣＡ
ＡＣＴＧ ＴＧＧＴＧＧ
【０１４８】(2) 配列ＩＤ番号１４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２６塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＩＮＴＥＲＬＥＵＫＩＮ−２ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１４： ＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ＧＧＣ
ＧＡＡ
ＧＡＡ
【０１４９】(2) 配列ＩＤ番号１５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２０塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＭＹＣＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ ＴＵＢＥＲ
ＣＵＬＯＳＩＳ ６５ＫＤＡ ＡＮＴＩＧＥＮ (x) 刊行の情報： (A) 著者：ＨＡＮＣＥ (B) 雑誌：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． (D) 巻：３ (F) ページ：８４３〜 (G) 日付：１９８９ (K) 配列ＩＤ番号１５における関連残基：１〜２０ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１５： ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ
ＣＵＬＯＳＩＳ ６５ＫＤＡ ＡＮＴＩＧＥＮ (x) 刊行の情報： (A) 著者：ＨＡＮＣＥ (B) 雑誌：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． (D) 巻：３ (F) ページ：８４３〜 (G) 日付：１９８９ (K) 配列ＩＤ番号１５における関連残基：１〜２０ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１５： ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ
【０１５０】(2) 配列ＩＤ番号１６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２０塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＹＥＳ (vi)起源： (A) 微生物：ＭＹＣＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ ＴＵＢＥＲ
ＣＵＬＯＳＩＳ ６５ＫＤＡ ＡＮＴＩＧＥＮ (x) 刊行の情報： (A) 著者：ＨＡＮＣＥ (B) 雑誌：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． (D) 巻：３ (F) ページ：８４３〜 (G) 日付：１９８９ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１６： ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣ ＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴ
ＣＵＬＯＳＩＳ ６５ＫＤＡ ＡＮＴＩＧＥＮ (x) 刊行の情報： (A) 著者：ＨＡＮＣＥ (B) 雑誌：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． (D) 巻：３ (F) ページ：８４３〜 (G) 日付：１９８９ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１６： ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣ ＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴ
【０１５１】(2) 配列ＩＤ番号１７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：４７塩基対 (B) 種類：核酸 (C) 鎖：１本 (D) トポロジー：線形 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii) 仮説的：ＮＯ (iii) アンチセンス：ＮＯ (vi)起源： (A) 微生物：ＭＹＣＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ ＴＵＢＥＲ
ＣＵＬＯＳＩＳ ６５ＫＤＡ ＡＮＴＩＧＥＮ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１７： ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ ＧＧＡ
ＴＴＣＣＡＡＣ ＡＣＣＴＴＴＧＧＧＣ ＴＧＣＡＧＣ
Ｔ
ＣＵＬＯＳＩＳ ６５ＫＤＡ ＡＮＴＩＧＥＮ (xi)配列記述：配列ＩＤ番号：１７： ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣ ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ ＧＧＡ
ＴＴＣＣＡＡＣ ＡＣＣＴＴＴＧＧＧＣ ＴＧＣＡＧＣ
Ｔ
【０１５２】
【発明の効果】上述したように、本発明によれば、標本
のＰＣＲ増幅に際して陽性調節ベクターを用いることに
より、誤った陰性結果の発生が防止される。すなわち、
標的となる核酸が存在しているのに、陰性の結果が出る
ことが防止される。
のＰＣＲ増幅に際して陽性調節ベクターを用いることに
より、誤った陰性結果の発生が防止される。すなわち、
標的となる核酸が存在しているのに、陰性の結果が出る
ことが防止される。
【図１】プラスミドｐＰＧ１０の構造を示す概略図であ
る。
る。
【図２】陽性調節プラスミドｐＰＧ１０の存在のもと
で、ヒト結核菌および／またはウシ結核菌の検出中に形
成される増幅生成物の臭化エチジウム染色アガロースゲ
ルの写真である。Ｍは分子量マーカーであり、１〜１３
欄は分析される臨床標本である。
で、ヒト結核菌および／またはウシ結核菌の検出中に形
成される増幅生成物の臭化エチジウム染色アガロースゲ
ルの写真である。Ｍは分子量マーカーであり、１〜１３
欄は分析される臨床標本である。
【図３】プラスミドｐＰＧＵ３の構造を示す概略図であ
る。
る。
【図４】陽性調節プラスミドｐＰＧＵ３の存在におい
て、歯周疾患を起こすバクテリアの検出中に形成される
増幅生成物の臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真
である。Ｍは分子量マーカーであり、１〜１１欄は分析
される臨床標本であり、−を付した欄は陰性対照であ
る。
て、歯周疾患を起こすバクテリアの検出中に形成される
増幅生成物の臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真
である。Ｍは分子量マーカーであり、１〜１１欄は分析
される臨床標本であり、−を付した欄は陰性対照であ
る。
【図５】プラスミドｐＰＧ１７の構造を示す概略図であ
る。
る。
【図６】プラスミドｐＰＧ２２の構造を示す概略図であ
る。
る。
【図７】プラスミドｐＰＧ２６の構造を示す概略図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９３０９１９５．７ (32)優先日 1993年５月５日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 フアン カルロス テルセロ スペイン，マドリッド，トレス カント ス，ポリゴノ インダストリアル デ ト レス カントス，カレ デ カレラ，３, ケア オブ ファーマ ジェン ソシエダ ッド アノニマ (72)発明者 ルシア ガルシア スペイン，マドリッド，ユニヴァーシダッ ド コンプルテンセ デ マドリッド，フ ァクルタッド デ メディシナ，デパルタ メント デ ビオキミカ （番地なし) (72)発明者 ホセ アントニオ ラモス スペイン，マドリッド，ユニヴァーシダッ ド コンプルテンセ デ マドリッド，フ ァクルタッド デ メディシナ，デパルタ メント デ ビオキミカ （番地なし) (72)発明者 ジョージ アレマニー スペイン，マドリッド，トレス カント ス，ポリゴノ インダストリアル デ ト レス カントス，カレ デ カレラ，３, ケア オブ ファーマ ジェン，ソシエダ ッド アノニマ
Claims (53)
- 【請求項１】 ポリメラーゼ連鎖反応増幅方法による標
本中の特定の核酸配列の検出における陽性調節として用
いられるベクターにおいて、上記ポリメラーゼ連鎖反応
増幅方法において用いられるプライマーの配列と実質的
に同一の配列を有する少なくとも１個のヌクレオチド配
列を含むことを特徴とするベクター。 - 【請求項２】 上記特定の核酸配列は、微生物、がん細
胞の総核酸、１本鎖または２本鎖ウィルスのゲノム、も
しくは２本鎖ＲＮＡウィルス転写体に由来することを特
徴とする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】 上記特定の核酸配列は、微生物に由来す
ることを特徴とする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項４】 上記ポリメラーゼ連鎖反応増幅方法にお
いて用いられるプライマーの配列と実質的に同一の２〜
１０個のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求
項１に記載のベクター。 - 【請求項５】 上記ポリメラーゼ連鎖反応増幅方法にお
いて用いられるプライマーの配列と実質的に同一の２個
のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に
記載のベクター。 - 【請求項６】 上記少なくとも１個のヌクレオチド配列
は、上記プライマーの配列と同一であることを特徴とす
る請求項１に記載のベクター。 - 【請求項７】 上記少なくとも１個のヌクレオチド配列
は、上記ベクターのセンスおよびアンチセンス鎖の両方
に挿入されることを特徴とする請求項１に記載のベクタ
ー。 - 【請求項８】 上記ベクターのセンス鎖中の上記少なく
とも１個のヌクレオチド配列と、上記ベクターのアンチ
センス鎖中の上記少なくとも１個のヌクレオチド配列と
の間の距離は、１．５Ｋｂより短いことを特徴とする請
求項１に記載のベクター。 - 【請求項９】 プラスミドであることを特徴とする請求
項１に記載のベクター。 - 【請求項１０】 ウィルスであることを特徴とする請求
項１に記載のベクター。 - 【請求項１１】 上記少なくとも１個のヌクレオチド配
列は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の
ベクター。 - 【請求項１２】 上記少なくとも１個のヌクレオチド配
列は、ＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の
ベクター。 - 【請求項１３】 ２つ以上の起源に存在する特定の核酸
配列の検出を可能とすることを特徴とする請求項１に記
載のベクター。 - 【請求項１４】 ｐＰＧ１０、ｐＰＧＵ３、ｐＰＧ１
７、ｐＰＧ２２、ｐＰＧ２６から選択されることを特徴
とする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項１５】 標本中の特定の核酸を検出する方法に
おいて、陽性調節ベクターの存在のもとで、上記特定の
核酸配列を含む疑いのある標本に対してポリメラーゼ連
鎖反応を実行することを含む方法。 - 【請求項１６】 上記標本は、尿、血液、痰、脊髄液で
あることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 (i) ９２〜９６℃での熱変性、 (ii)３７〜７２℃でのアニーリング、 (iii) ７２〜７４℃での伸長なる条件のもとで増幅が実
行されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１８】 上記標本に対し、第１のアニーリング
−伸長サイクルを開始する前に期間を延長して熱変性を
行ない、最終サイクルの最後において期間を延長して伸
長を行なうことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１９】 全体の増幅期間は、２０〜４０サイク
ルの範囲内であることを特徴とする請求項１５に記載の
方法。 - 【請求項２０】 上記陽性調節ベクターは、上記ポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅方法において用いられるプライマー
の配列と実質的に同一の配列を有する少なくとも１個の
ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１５に
記載の方法。 - 【請求項２１】 上記特定の核酸配列は、微生物、がん
細胞の総核酸、１本鎖または２本鎖ウィルスのゲノム、
もしくは２本鎖ＲＮＡウィルス転写体に由来することを
特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２２】 上記特定の核酸配列は、微生物に由来
することを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２３】 上記ベクターは、上記ポリメラーゼ連
鎖反応増幅方法において用いられるプライマーの配列と
実質的に同一の２〜１０個のヌクレオチド配列を有する
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２４】 上記ベクターは、上記ポリメラーゼ連
鎖反応増幅方法において用いられるプライマーの配列と
実質的に同一の２個のヌクレオチド配列を含むことを特
徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２５】 上記少なくとも１個のヌクレオチド配
列は、上記プライマーの配列と同一であることを特徴と
する請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２６】 上記ベクターは、上記ベクターのセン
スおよびアンチセンス鎖の両方に挿入される少なくとも
１個のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項
１５に記載の方法。 - 【請求項２７】 上記ベクターは、上記ベクターのセン
ス鎖中の上記少なくとも１個のヌクレオチド配列と、上
記ベクターのアンチセンス鎖中の上記少なくとも１個の
ヌクレオチド配列との間の距離が、１．５Ｋｂより短く
なるように構成されることを特徴とする請求項１５に記
載の方法。 - 【請求項２８】 上記ベクターはプラスミドであること
を特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２９】 上記ベクターはウィルスであることを
特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項３０】 上記ベクター中の上記少なくとも１個
のヌクレオチド配列は、ＤＮＡであることを特徴とする
請求項１５に記載の方法。 - 【請求項３１】 上記ベクター中の上記少なくとも１個
のヌクレオチド配列は、ＲＮＡであることを特徴とする
請求項１５に記載の方法。 - 【請求項３２】 上記ベクターは、２つ以上の起源に存
在する特定の核酸配列の検出を可能とすることを特徴と
する請求項１５に記載の方法。 - 【請求項３３】 上記ベクターは、ｐＰＧ１０、ｐＰＧ
Ｕ３、ｐＰＧ１７、ｐＰＧ２２、ｐＰＧ２６から選択さ
れることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項３４】 標本中の核酸のポリメラーゼ連鎖反応
を介した検出に用いられるキットにおいて、検出すべき
上記核酸に特異な陽性調節ベクターと、ＤＮＡ抽出およ
び増幅試薬からなることを特徴とするキット。 - 【請求項３５】 上記ベクターは、上記ポリメラーゼ連
鎖反応増幅方法において用いられるプライマーの配列と
実質的に同一の配列を有する少なくとも１個のヌクレオ
チド配列を含むことを特徴とする請求項３４に記載のキ
ット。 - 【請求項３６】 上記特定の核酸配列は、微生物、がん
細胞の総核酸、１本鎖または２本鎖ウィルスのゲノム、
もしくは２本鎖ＲＮＡウィルス転写体に由来することを
特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項３７】 上記特定の核酸配列は、微生物に由来
することを特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項３８】 上記ベクターは、上記ポリメラーゼ連
鎖反応増幅方法において用いられるプライマーの配列と
実質的に同一の２〜１０個のヌクレオチド配列を含むこ
とを特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項３９】 上記ベクターは、上記ポリメラーゼ連
鎖反応増幅方法において用いられるプライマーの配列と
実質的に同一の２個のヌクレオチド配列を含むことを特
徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４０】 上記ベクターは、上記プライマーの配
列と同一である上記少なくとも１個のヌクレオチド配列
を含むことを特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４１】 上記ベクターは、上記ベクターのセン
スおよびアンチセンス鎖の両方に挿入される少なくとも
１個のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項
３４に記載のキット。 - 【請求項４２】 上記ベクターは、１．５Ｋｂより短い
距離をおいて上記ベクターのセンス鎖およびアンチセン
ス鎖の両方に挿入される少なくとも１個のヌクレオチド
配列を含むことを特徴とする請求項３４に記載のキッ
ト。 - 【請求項４３】 上記ベクターはプラスミドであること
を特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４４】 上記ベクターはウィルスであることを
特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４５】 上記ベクター中の上記少なくとも１個
のヌクレオチド配列は、ＤＮＡであることを特徴とする
請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４６】 上記ベクター中の上記少なくとも１個
のヌクレオチド配列は、ＲＮＡであることを特徴とする
請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４７】 ２つ以上の起源に存在する特定の核酸
配列の検出が可能であることを特徴とする請求項３４に
記載のキット。 - 【請求項４８】 上記ベクターは、ｐＰＧ１０、ｐＰＧ
Ｕ３、ｐＰＧ１７、ｐＰＧ２２、ｐＰＧ２６から選択さ
れることを特徴とする請求項３４に記載のキット。 - 【請求項４９】 歯周病を起こす病原体のポリメラーゼ
連鎖反応を介した検出に用いられるプライマー。 - 【請求項５０】 Ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｙｎ
ｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓから選択された微生物の検
出を可能とする請求項４９に記載のプライマー。 - 【請求項５１】 ＣＧＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＧＣ Ｃ
ＧＣ ＧＧＴ ＡＡＴ ＡＣＧ［配列ＩＤ番号５］なる
配列を有し、Ａ． ａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍ
ｉｔａｎｓに特異である請求項４９に記載のプライマ
ー。 - 【請求項５２】 ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ Ｃ
ＴＧ ＣＧＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＡＣ ＴＣＧ ＧＧ
［配列ＩＤ番号６］なる配列を有し、Ｂ．ｉｎｔｅｒｍ
ｅｄｉｕｓに特異である請求項４９に記載のプライマ
ー。 - 【請求項５３】 ＴＴＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＣ Ｔ
ＧＴ ＡＴＡ ＴＣＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＣＧ ＡＧ
［配列ＩＤ番号７］なる配列を有し、Ｂ．ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓに特異である請求項４９に記載のプライマー。
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929217368A GB9217368D0 (en) | 1992-08-14 | 1992-08-14 | Identification of mycobacterium tuberculosis and mycobacterium bovis |
| GB939303498A GB9303498D0 (en) | 1993-02-22 | 1993-02-22 | A plasmid for use in the pcr identification of a microorganism |
| GB9309198.1 | 1993-05-05 | ||
| GB9303498.1 | 1993-05-05 | ||
| GB9309195.7 | 1993-05-05 | ||
| GB9217368.1 | 1993-05-05 | ||
| GB939309198A GB9309198D0 (en) | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Dna for diagnosing periodontitis pathogens |
| GB939309195A GB9309195D0 (en) | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Design and obention of a recombinant rna virus and its use |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787978A true JPH0787978A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=27450921
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP5222858A Pending JPH0787978A (ja) | 1992-08-14 | 1993-08-16 | ポリメラーゼ連鎖反応を介する微生物検出の制御に用いるベクター |
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| JP (1) | JPH0787978A (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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| ES2129365B1 (es) * | 1997-07-18 | 2000-04-01 | Pharmagen S A | Metodo para la deteccion de secuencias especificas de acidos nucleicos en presencia de un vector util como control positivo interno. |
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| FR3098827A1 (fr) | 2019-07-17 | 2021-01-22 | Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives | Dispositif micro-fluidique incluant de réaction d'amplification |
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| PT528306E (pt) * | 1991-08-15 | 2000-05-31 | Hoffmann La Roche | Iniciadores e sondas de micobacterias |
-
1993
- 1993-08-10 EP EP9393306300A patent/EP0586112A3/en not_active Withdrawn
- 1993-08-16 JP JP5222858A patent/JPH0787978A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008247913A (ja) * | 1995-05-08 | 2008-10-16 | Immuno Ag | １以上の血漿誘導体を含む、品質保証された薬物 |
Also Published As
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| EP0586112A2 (en) | 1994-03-09 |
| EP0586112A3 (en) | 1994-09-14 |
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