JPH07301615A - 液体媒質中の認識対の構成員である被検体の決定のための電気生化学的方法および系ならびにその電極 - Google Patents
液体媒質中の認識対の構成員である被検体の決定のための電気生化学的方法および系ならびにその電極Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 液体媒質中の被検体の存在および場合によっ
ては濃度の決定のための電気生化学系であり、この系は
一認識対の構成員を固定化させた電極を含み、該対の他
の構成員は該被検体であり、媒質中の該被検体の存在に
より、該固定化構成員と該被検体との間の複合体である
対複合体の形成がもたらされ、この系は更に、電極から
の電子の受容もしくは電極への電子の供与によりそれら
のレッドクス状態を変化させることが可能なレドックス
分子を含み、電極上での対複合体の形成によりその系の
電気的応答の変化がもたらされ、このことにより媒質中
の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定する
ことが可能な系である。 【効果】 抗原−抗体、糖−レクチンのような対を形成
する一構成員を披検体とする高感度測定系が提供でき
る。
ては濃度の決定のための電気生化学系であり、この系は
一認識対の構成員を固定化させた電極を含み、該対の他
の構成員は該被検体であり、媒質中の該被検体の存在に
より、該固定化構成員と該被検体との間の複合体である
対複合体の形成がもたらされ、この系は更に、電極から
の電子の受容もしくは電極への電子の供与によりそれら
のレッドクス状態を変化させることが可能なレドックス
分子を含み、電極上での対複合体の形成によりその系の
電気的応答の変化がもたらされ、このことにより媒質中
の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定する
ことが可能な系である。 【効果】 抗原−抗体、糖−レクチンのような対を形成
する一構成員を披検体とする高感度測定系が提供でき
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は電気生化学的センサーの
分野におけるものであり、そして液体媒質中の被検体の
存在および場合によっては濃度を決定するための系に関
する。本発明に従うと、被検体を、その被検体の存在下
において生じる電気的応答の変化により決定する。
分野におけるものであり、そして液体媒質中の被検体の
存在および場合によっては濃度を決定するための系に関
する。本発明に従うと、被検体を、その被検体の存在下
において生じる電気的応答の変化により決定する。
【０００２】
【発明の背景および従来の技術】レドックス酵素に基づ
くバイオセンサーは酵素特異的被検体に対し、測定可能
な電流応答を提供するものであり、グルコース、乳酸、
もしくはコリンのような被検体の決定用に提案されてき
た（Ａ．Ｈｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、
２３、１２８（１９９０）、およびＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈ
ｅｍ．、９６、３５７９（１９９２））。媒質中の被検
体の存在および場合によっては濃度の決定のための有用
なレドックス酵素によりコーティングされている電極を
利用する他の種類のアッセイが、Ｉ．Ｗｉｌｌｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１
１４、１０９６５−１０９６６（１９９２））により記
載されている。この刊行物は、電極上の酵素固定化層の
作製法、ならびに拡散電子媒体もしくは蛋白質結合電子
媒体によるレドックス酵素と電極表面との間の電気通信
について記載している。
くバイオセンサーは酵素特異的被検体に対し、測定可能
な電流応答を提供するものであり、グルコース、乳酸、
もしくはコリンのような被検体の決定用に提案されてき
た（Ａ．Ｈｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、
２３、１２８（１９９０）、およびＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈ
ｅｍ．、９６、３５７９（１９９２））。媒質中の被検
体の存在および場合によっては濃度の決定のための有用
なレドックス酵素によりコーティングされている電極を
利用する他の種類のアッセイが、Ｉ．Ｗｉｌｌｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１
１４、１０９６５−１０９６６（１９９２））により記
載されている。この刊行物は、電極上の酵素固定化層の
作製法、ならびに拡散電子媒体もしくは蛋白質結合電子
媒体によるレドックス酵素と電極表面との間の電気通信
について記載している。
【０００３】シグナル増幅部材として電気活性性酵素複
合体を必要とする電気化学的免疫アッセイの利用が、
Ｇ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ、１−１５（１９８６）、および欧州
特許出願第８５３０３３６７．８号（公開第１６７２４
８号）に記載されている。酵素複合体の探索（プロービ
ング）を必要とするこの免疫アッセイは、時間が経つに
つれて、そしてこの酵素反応に必要な成分の添加の際に
活性が減少するという大きな欠点を有する。
合体を必要とする電気化学的免疫アッセイの利用が、
Ｇ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ、１−１５（１９８６）、および欧州
特許出願第８５３０３３６７．８号（公開第１６７２４
８号）に記載されている。酵素複合体の探索（プロービ
ング）を必要とするこの免疫アッセイは、時間が経つに
つれて、そしてこの酵素反応に必要な成分の添加の際に
活性が減少するという大きな欠点を有する。
【０００４】均質の電気化学的免疫アッセイの利用が米
国特許第５，１９８，３６７号に開示されている。この
アッセイは、各々の抗体の存在下における複合体と電極
との電気通信が溶液中の被検体により調節される抗原性
レドックス活性蛋白質複合体の製造を必要とする。三成
分性の抗原−レドックスリレー蛋白質複合体の製造は困
難である。そのうえ全ての電気化学的免疫アッセイは単
一周期感知装置であり、再使用することができず、一回
の測定後に探索用複合体の活動が終結する。
国特許第５，１９８，３６７号に開示されている。この
アッセイは、各々の抗体の存在下における複合体と電極
との電気通信が溶液中の被検体により調節される抗原性
レドックス活性蛋白質複合体の製造を必要とする。三成
分性の抗原−レドックスリレー蛋白質複合体の製造は困
難である。そのうえ全ての電気化学的免疫アッセイは単
一周期感知装置であり、再使用することができず、一回
の測定後に探索用複合体の活動が終結する。
【０００５】レドックス不活性生体分子、および特にサ
ブマイクロモルおよびナノモル濃度の範囲内で生じる生
体分子の検出のための電気生化学的センサーは、診断、
食品分析、および環境分析における重要で将来性のある
用途を有する。これらの例は、所望されない代謝産物お
よび除草剤を探索するための抗体および抗原の検出か
ら、毒素およびウイルスの存在の同定までの範囲に及ぶ
ことができる。
ブマイクロモルおよびナノモル濃度の範囲内で生じる生
体分子の検出のための電気生化学的センサーは、診断、
食品分析、および環境分析における重要で将来性のある
用途を有する。これらの例は、所望されない代謝産物お
よび除草剤を探索するための抗体および抗原の検出か
ら、毒素およびウイルスの存在の同定までの範囲に及ぶ
ことができる。
【０００６】液体媒質中の被検体（この被検体は認識対
の一構成員である）の存在および場合によっては濃度の
決定のための電気生化学系を提供することが、本発明の
一つの目的である。
の一構成員である）の存在および場合によっては濃度の
決定のための電気生化学系を提供することが、本発明の
一つの目的である。
【０００７】更に、実質的に可逆的でそして再使用可能
な上記のような電気生化学系を提供することも本発明の
一の態様に従う目的である。
な上記のような電気生化学系を提供することも本発明の
一の態様に従う目的である。
【０００８】更にまた、上記系で使用するための電極を
提供することも本発明の目的である。
提供することも本発明の目的である。
【０００９】また、これらの電極を製造するための方法
を提供することも本発明の別の目的である。
を提供することも本発明の別の目的である。
【００１０】
【発明の一般的な記述】以下の記述においては用語「電
気的応答」は、所定の電位下での電流もしくは電荷の流
れを例とする電極の電流−電圧挙動を表すのに用いられ
る。この電気的応答は、電流もしくは電荷の流れを測定
することにより決定することができる。本発明に従う
と、新規の電気生化学系およびその生化学系における利
用のための電極が提供される。本発明に従うこの系は、
電気生化学的電極の電気的応答の変化によって液体媒質
中の被検体の存在および場合によっては濃度を決定する
ことが可能である。この被検体は、抗原−抗体、リガン
ド−レセプター、糖−レクチン、ビオチン−アビジン、
酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌク
レオチド−蛋白質、およびオリゴヌクレオチド−細胞を
例とする認識対の一部分を形成する。
気的応答」は、所定の電位下での電流もしくは電荷の流
れを例とする電極の電流−電圧挙動を表すのに用いられ
る。この電気的応答は、電流もしくは電荷の流れを測定
することにより決定することができる。本発明に従う
と、新規の電気生化学系およびその生化学系における利
用のための電極が提供される。本発明に従うこの系は、
電気生化学的電極の電気的応答の変化によって液体媒質
中の被検体の存在および場合によっては濃度を決定する
ことが可能である。この被検体は、抗原−抗体、リガン
ド−レセプター、糖−レクチン、ビオチン−アビジン、
酵素−基質、オリゴヌクレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌク
レオチド−蛋白質、およびオリゴヌクレオチド−細胞を
例とする認識対の一部分を形成する。
【００１１】本発明の第一の態様に従うと、液体媒質中
の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のため
の電気生化学系が提供され、その系は、ある認識対の一
構成員を固定化してある電極を含み（該対の他の構成員
は該被検体である）、媒質中の該被検体の存在により該
固定化構成員と該被検体との間に複合体の形成がもたら
され（今後これを「対複合体」とする）、この系は更に
電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与す
ることによりそれらのレドックス状態を変化させること
が可能なレドックス分子を含み、その電極上での対複合
体の形成によりその系の電気的応答の変化がもたらさ
れ、そのことにより媒質中の該被検体の存在および場合
によっては濃度を決定することができる。
の被検体の存在および場合によっては濃度の決定のため
の電気生化学系が提供され、その系は、ある認識対の一
構成員を固定化してある電極を含み（該対の他の構成員
は該被検体である）、媒質中の該被検体の存在により該
固定化構成員と該被検体との間に複合体の形成がもたら
され（今後これを「対複合体」とする）、この系は更に
電極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与す
ることによりそれらのレドックス状態を変化させること
が可能なレドックス分子を含み、その電極上での対複合
体の形成によりその系の電気的応答の変化がもたらさ
れ、そのことにより媒質中の該被検体の存在および場合
によっては濃度を決定することができる。
【００１２】固定化構成員は、特定認識対のいずれかの
一構成員であることができる。このような認識対の例
は、抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプタ
ー、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオ
チド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、およびオ
リゴヌクレオチド−細胞である。抗原を例とするこのよ
うな対の内の一つを電極に固定化する場合には、これは
抗体を例とする、液体媒質中の認識対の他の構成員の決
定に適する。
一構成員であることができる。このような認識対の例
は、抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプタ
ー、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレオ
チド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、およびオ
リゴヌクレオチド−細胞である。抗原を例とするこのよ
うな対の内の一つを電極に固定化する場合には、これは
抗体を例とする、液体媒質中の認識対の他の構成員の決
定に適する。
【００１３】電極上への被検体の結合、および電極上に
固定化される認識対の２つの構成員からなる対複合体形
成の結果、媒質中の該被検体の存在の指標を提供する電
極の電気的応答の変化がもたらされる。電極の電気特性
の変化の度合いは固定化構成員に対する該被検体の結合
の程度に関連し、そしてその電極を取り巻く媒質中の該
被検体の濃度に依存する。したがって電気特性の変化の
程度を、本発明の好ましい態様により媒質中の該被検体
の濃度の指標として使用することができる。
固定化される認識対の２つの構成員からなる対複合体形
成の結果、媒質中の該被検体の存在の指標を提供する電
極の電気的応答の変化がもたらされる。電極の電気特性
の変化の度合いは固定化構成員に対する該被検体の結合
の程度に関連し、そしてその電極を取り巻く媒質中の該
被検体の濃度に依存する。したがって電気特性の変化の
程度を、本発明の好ましい態様により媒質中の該被検体
の濃度の指標として使用することができる。
【００１４】以下の記載においては、用語「決定」は包
括的に、液体媒質中の存在のみの決定、もしくは存在お
よび濃度の両方の決定の両者を表すのに用いられる。
括的に、液体媒質中の存在のみの決定、もしくは存在お
よび濃度の両方の決定の両者を表すのに用いられる。
【００１５】本発明は、生物学的試料、水性試料、もし
くは食品試料中のある作用物質の決定に有用である。こ
の決定は、「直接モード」および「間接モード」として
本文中に引用される２つのモードの内の一つにより実施
することができる。直接モードに従うと、生物学的試料
中の作用物質はこの系の被検体となる。間接モードに従
うと、作用物質と被検体とは異なり、該系において決定
される被検体は、該試料中の作用物質の決定のための尺
度として作用する。
くは食品試料中のある作用物質の決定に有用である。こ
の決定は、「直接モード」および「間接モード」として
本文中に引用される２つのモードの内の一つにより実施
することができる。直接モードに従うと、生物学的試料
中の作用物質はこの系の被検体となる。間接モードに従
うと、作用物質と被検体とは異なり、該系において決定
される被検体は、該試料中の作用物質の決定のための尺
度として作用する。
【００１６】直接モードに従う生物学的試料中の作用物
質の決定は、主に、該系中の電極を検査用生物学的試料
で、もしくは該作用物質を含むその適切な分画で刺激す
る単一段階法である。本発明の直接モードの例は、生物
学的試料中の抗体の決定（この場合、電極には抗原が固
定化されており、その抗原に対して該抗体が特異的に結
合する）、あるいは抗−抗原抗体が固定化されている電
極の利用による抗原の決定である。
質の決定は、主に、該系中の電極を検査用生物学的試料
で、もしくは該作用物質を含むその適切な分画で刺激す
る単一段階法である。本発明の直接モードの例は、生物
学的試料中の抗体の決定（この場合、電極には抗原が固
定化されており、その抗原に対して該抗体が特異的に結
合する）、あるいは抗−抗原抗体が固定化されている電
極の利用による抗原の決定である。
【００１７】間接モードに従うと、生物学的試料中の作
用物質は直接的には決定されず、本質的には２段階法に
よりむしろ間接的に決定される。このモードに従うと、
生物学的試料を、第一段階においてある試薬溶液と反応
させる。この反応により、該試料中の該作用物質の濃度
に依存する様式での該被検体の形成、あるいは演繹的
に、存在する該被検体の濃度の減少がもたらされる。し
たがって、この種の反応に依存して、被検体の濃度は該
試料中の該作用物質の濃度に直接相関もしくは逆相関す
る。第二段階においては、この電極を第一段階の反応産
物で刺激させ、そして後に決定される被検体は該試料中
の該作用物質の間接的尺度として役立つ。
用物質は直接的には決定されず、本質的には２段階法に
よりむしろ間接的に決定される。このモードに従うと、
生物学的試料を、第一段階においてある試薬溶液と反応
させる。この反応により、該試料中の該作用物質の濃度
に依存する様式での該被検体の形成、あるいは演繹的
に、存在する該被検体の濃度の減少がもたらされる。し
たがって、この種の反応に依存して、被検体の濃度は該
試料中の該作用物質の濃度に直接相関もしくは逆相関す
る。第二段階においては、この電極を第一段階の反応産
物で刺激させ、そして後に決定される被検体は該試料中
の該作用物質の間接的尺度として役立つ。
【００１８】間接モードのある態様によると、この被検
体は検査用作用物質に結合する分子である。この態様の
試薬溶液は被検体を含み、そしてその試薬溶液と生物学
的試料との間の反応後にその被検体は該作用物質に結合
する。結果として、その溶液中の遊離被検体の濃度は減
少し、すなわちその後に決定すべき被検体の濃度は該試
料中の該作用物質の濃度に逆相関する。
体は検査用作用物質に結合する分子である。この態様の
試薬溶液は被検体を含み、そしてその試薬溶液と生物学
的試料との間の反応後にその被検体は該作用物質に結合
する。結果として、その溶液中の遊離被検体の濃度は減
少し、すなわちその後に決定すべき被検体の濃度は該試
料中の該作用物質の濃度に逆相関する。
【００１９】具体例は、検査すべき生物学的試料中の相
同なもしくは関連する抗原を決定する目的での固定化抗
原の利用である。この具体例に従うと、血漿試料を例と
する生物学的試料をまず最初に決定すべき抗原に特異的
に結合する抗体を含む試薬溶液と反応させる。結合後、
遊離抗体の濃度は低くなる。インキュベーション期間の
後に、該抗原が固定化されている電極を反応用溶液で刺
激化し、そしてその後遊離抗体の決定値が検査用生物学
的試料中の該抗原の指標として役立つ。当業者は恐らく
理解するであろうが、該遊離抗体の濃度は検査用試料中
の抗原の濃度に逆相関する。
同なもしくは関連する抗原を決定する目的での固定化抗
原の利用である。この具体例に従うと、血漿試料を例と
する生物学的試料をまず最初に決定すべき抗原に特異的
に結合する抗体を含む試薬溶液と反応させる。結合後、
遊離抗体の濃度は低くなる。インキュベーション期間の
後に、該抗原が固定化されている電極を反応用溶液で刺
激化し、そしてその後遊離抗体の決定値が検査用生物学
的試料中の該抗原の指標として役立つ。当業者は恐らく
理解するであろうが、該遊離抗体の濃度は検査用試料中
の抗原の濃度に逆相関する。
【００２０】そのうえこれもまた理解されるであろう
が、抗原ではなくむしろ検査用生物学的試料中の抗体
を、必要な変更を加えて類似する様式において決定する
ことができる。
が、抗原ではなくむしろ検査用生物学的試料中の抗体
を、必要な変更を加えて類似する様式において決定する
ことができる。
【００２１】この間接モードの他の態様に従うと、検査
用抗原は酵素であり、そして被検体はこの酵素により破
壊された分子であるか、あるいは他の前駆体分子からこ
の酵素により代謝される分子であるかのいずれかであ
る。最初の事例においては、この試薬溶液は該被検体を
含み、そして検査用試料との反応後に被検体の濃度は試
料中の酵素濃度に相関して減少する。後述の事例におい
ては、試薬溶液は該前駆体分子を含み、そして検査用試
料との反応後に被検体が形成され、そしてその後にその
濃度は試料中の酵素濃度に直接相関する。
用抗原は酵素であり、そして被検体はこの酵素により破
壊された分子であるか、あるいは他の前駆体分子からこ
の酵素により代謝される分子であるかのいずれかであ
る。最初の事例においては、この試薬溶液は該被検体を
含み、そして検査用試料との反応後に被検体の濃度は試
料中の酵素濃度に相関して減少する。後述の事例におい
ては、試薬溶液は該前駆体分子を含み、そして検査用試
料との反応後に被検体が形成され、そしてその後にその
濃度は試料中の酵素濃度に直接相関する。
【００２２】間接モードの別の態様に従うと、この試薬
溶液は該試料中の作用物質を該被検体へ転化させる酵素
を含む。
溶液は該試料中の作用物質を該被検体へ転化させる酵素
を含む。
【００２３】先の２つの態様では、第一事例における検
査用試料の酵素もしくは第二事例における試薬溶液の酵
素をこれらの方法の第一段階の実施後に取り除くべきで
ある。
査用試料の酵素もしくは第二事例における試薬溶液の酵
素をこれらの方法の第一段階の実施後に取り除くべきで
ある。
【００２４】本発明の一つの態様によるとレドックス分
子は媒質中を自由に動き回っている。この態様に従う
と、該被検体が固定化対構成員へ結合することで、電極
表面は液体媒質中の該被検体の濃度に依存して、レドッ
クス分子に対して絶縁状態もしくは部分的絶縁状態とな
る。
子は媒質中を自由に動き回っている。この態様に従う
と、該被検体が固定化対構成員へ結合することで、電極
表面は液体媒質中の該被検体の濃度に依存して、レドッ
クス分子に対して絶縁状態もしくは部分的絶縁状態とな
る。
【００２５】本発明の他の態様に従うと、このレドック
ス分子は被検体分子に連結してる（今後これを「修飾被
検体」と称する）。この態様に従うと、修飾被検体と検
査用試料中にもともと存在する被検体とは、固定化構成
員への結合について競合する。比較的高濃度の該被検体
が存在する場合には電極固定化構成員への修飾被検体の
結合はほとんど生じない。それとは対照的に、試料中の
決定すべき被検体が低濃度である場合には電極上に固定
化された構成員に対する修飾被検体の広範囲にわたる結
合が生じる。固定化構成員への修飾被検体の結合によっ
て電極物質にレドックス分子が近接するようになり、こ
れら２つの間の電子交換が容易になる。したがって、固
定化構成員に修飾被検体が結合することにより電極の電
気的応答が上昇する。この増加は検査用試料中の被検体
の濃度に逆相関するため、大きく増加する場合は被検体
の濃度が低いことを示し、その逆もまた同様である。
ス分子は被検体分子に連結してる（今後これを「修飾被
検体」と称する）。この態様に従うと、修飾被検体と検
査用試料中にもともと存在する被検体とは、固定化構成
員への結合について競合する。比較的高濃度の該被検体
が存在する場合には電極固定化構成員への修飾被検体の
結合はほとんど生じない。それとは対照的に、試料中の
決定すべき被検体が低濃度である場合には電極上に固定
化された構成員に対する修飾被検体の広範囲にわたる結
合が生じる。固定化構成員への修飾被検体の結合によっ
て電極物質にレドックス分子が近接するようになり、こ
れら２つの間の電子交換が容易になる。したがって、固
定化構成員に修飾被検体が結合することにより電極の電
気的応答が上昇する。この増加は検査用試料中の被検体
の濃度に逆相関するため、大きく増加する場合は被検体
の濃度が低いことを示し、その逆もまた同様である。
【００２６】先の態様のある変法に従うと、電極を修飾
被検体と試料中の決定すべき被検体とで同時に刺激す
る。
被検体と試料中の決定すべき被検体とで同時に刺激す
る。
【００２７】この態様を実施する他の変法に従うと、電
極を、被検体の存在が決定すべきものとなっている試料
で最初に刺激し、そしてその次に修飾被検体を含む溶液
で刺激する。
極を、被検体の存在が決定すべきものとなっている試料
で最初に刺激し、そしてその次に修飾被検体を含む溶液
で刺激する。
【００２８】電極物質は、種々の導電物質、具体的には
イオウ含有性部分と化学的に会合付着するか、もしくは
化学吸着する可能性を有するようなものから選択するこ
とができる。電極物質は、金、プラチナ、銀、もしくは
銅のような金属類からできているか、あるいはこれらに
よりコーティングされていることが好ましい。他の態様
においては、電極は、電極表面に官能基付加済みアルコ
キシシランが会合しているインジウム−すずオキシド
（Ｉｎｄｉｕｍ ｔｉｎ ｏｘｉｄｅ）（ＩＴＯ）を例
とする導電ガラス電極からできていてもよい（ＩＴＯ電
極のシラン化は、アルゴン雰囲気下、無水トルエン中、
３−アミノプロピルトリエトキシシランでのその電極の
還元、およびその後のオーブン内での乾燥により吸着を
行うことができる）。
イオウ含有性部分と化学的に会合付着するか、もしくは
化学吸着する可能性を有するようなものから選択するこ
とができる。電極物質は、金、プラチナ、銀、もしくは
銅のような金属類からできているか、あるいはこれらに
よりコーティングされていることが好ましい。他の態様
においては、電極は、電極表面に官能基付加済みアルコ
キシシランが会合しているインジウム−すずオキシド
（Ｉｎｄｉｕｍ ｔｉｎ ｏｘｉｄｅ）（ＩＴＯ）を例
とする導電ガラス電極からできていてもよい（ＩＴＯ電
極のシラン化は、アルゴン雰囲気下、無水トルエン中、
３−アミノプロピルトリエトキシシランでのその電極の
還元、およびその後のオーブン内での乾燥により吸着を
行うことができる）。
【００２９】レドックス分子は、電子の受容もしくは供
与によりそのレドックス状態を変化させることが可能な
分子である。レドックス分子の例はＫ4Ｆｅ（ＣＮ）
6［ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄
（ＩＩ）酸塩］である。他の例は、Ｎ−メチル−Ｎ’−
カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムであ
る。
与によりそのレドックス状態を変化させることが可能な
分子である。レドックス分子の例はＫ4Ｆｅ（ＣＮ）
6［ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄
（ＩＩ）酸塩］である。他の例は、Ｎ−メチル−Ｎ’−
カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムであ
る。
【００３０】固定化構成員は、連結基により電極表面上
に固定化されることが好ましく、この連結基は典型的に
は、以下の一般式（Ｉ） Ｚ−Ｒ1−Ｑ （Ｉ） ［式中、Ｚは、電極物質が該金属の内の一つである場合
には、該金属と化学的に会合付着するか、もしくは化学
吸着することが可能なイオウ含有性部分を表し、そして
電極物質がガラスである場合には、該ガラスとの化学的
会合付着、もしくは化学吸着が可能なメトキシもしくは
アルコキシシラン残基を表し、Ｒ1は連結基を表し、Ｑ
は、認識対の一構成員である部分と共有結合を形成する
ことが可能な官能基である］を有することができる。
に固定化されることが好ましく、この連結基は典型的に
は、以下の一般式（Ｉ） Ｚ−Ｒ1−Ｑ （Ｉ） ［式中、Ｚは、電極物質が該金属の内の一つである場合
には、該金属と化学的に会合付着するか、もしくは化学
吸着することが可能なイオウ含有性部分を表し、そして
電極物質がガラスである場合には、該ガラスとの化学的
会合付着、もしくは化学吸着が可能なメトキシもしくは
アルコキシシラン残基を表し、Ｒ1は連結基を表し、Ｑ
は、認識対の一構成員である部分と共有結合を形成する
ことが可能な官能基である］を有することができる。
【００３１】Ｚは、電極物質がある金属である場合に
は、例えばチオール基、あるいはジスルフィド基、スル
ホン酸もしくは硫酸基から得られるイオウ原子であるこ
とができる。
は、例えばチオール基、あるいはジスルフィド基、スル
ホン酸もしくは硫酸基から得られるイオウ原子であるこ
とができる。
【００３２】Ｒ1は共有結合であることができるか、あ
るいはペプチドもしくはポリペプチドであることができ
るか、あるいはアルキレン、アルケニレン、アルキニレ
ンフェニル含有性鎖、および他の多くのもののような非
常に広範囲にわたる種々の適切な基から選択することが
できる。
るいはペプチドもしくはポリペプチドであることができ
るか、あるいはアルキレン、アルケニレン、アルキニレ
ンフェニル含有性鎖、および他の多くのもののような非
常に広範囲にわたる種々の適切な基から選択することが
できる。
【００３３】Ｒ1の具体例は、ある化学結合であるか、
あるいは以下に示す式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、もしく
は（ＩＩｃ）
あるいは以下に示す式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、もしく
は（ＩＩｃ）
【００３４】
【化１】
【００３５】［式中、Ｒ2もしくはＲ3は同一もしくは異
なることができ、そして１−１６の炭素原子を有する直
鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン、アルケニレン、ア
ルキニレンを表すか、あるいは共有結合を表し、Ａおよ
びＢは同一もしくは異なることができ、そしてＯもしく
はＳを表し、Ｐｈは、ＳＯ3-もしくはアルキル基からな
る群から選択される一つもしくは複数の構成成分を例と
するものにより場合によっては置換されるフェニル基で
ある］を有する基である。
なることができ、そして１−１６の炭素原子を有する直
鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン、アルケニレン、ア
ルキニレンを表すか、あるいは共有結合を表し、Ａおよ
びＢは同一もしくは異なることができ、そしてＯもしく
はＳを表し、Ｐｈは、ＳＯ3-もしくはアルキル基からな
る群から選択される一つもしくは複数の構成成分を例と
するものにより場合によっては置換されるフェニル基で
ある］を有する基である。
【００３６】Ｑは、認識対の一構成員のカルボキシル残
基に結合することができる官能基、例えばアミン基、認
識対の構成員のアミン残基に結合することが可能なカル
ボキシル基、認識対の一構成員のアミン残基に結合する
ことが可能なイソシアネートもしくはイソチオシアネー
ト基あるいはアシル基、あるいは蛋白質もしくはポリペ
プチドのヒドロキシ残基に結合することが可能なハライ
ド基のようなものである。具体例は、−ＮＨ2、−ＣＯ
ＯＨ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏのような基、もしく
は式−Ｒa−ＣＯ−Ｇ［式中、ＧはＣｌのようなハロゲ
ンである］、のアシル基もしくはＯＨ、ＯＲb、−ＯＣ
ＯＲb基、もしくは
基に結合することができる官能基、例えばアミン基、認
識対の構成員のアミン残基に結合することが可能なカル
ボキシル基、認識対の一構成員のアミン残基に結合する
ことが可能なイソシアネートもしくはイソチオシアネー
ト基あるいはアシル基、あるいは蛋白質もしくはポリペ
プチドのヒドロキシ残基に結合することが可能なハライ
ド基のようなものである。具体例は、−ＮＨ2、−ＣＯ
ＯＨ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏのような基、もしく
は式−Ｒa−ＣＯ−Ｇ［式中、ＧはＣｌのようなハロゲ
ンである］、のアシル基もしくはＯＨ、ＯＲb、−ＯＣ
ＯＲb基、もしくは
【００３７】
【化２】
【００３８】基であり、ここでＲaおよびＲbは独立にＣ
1−Ｃ12アルケニル、アルケニル、もしくは場合によっ
ては例えばハロゲンにより置換されるフェニル含有性鎖
である。
1−Ｃ12アルケニル、アルケニル、もしくは場合によっ
ては例えばハロゲンにより置換されるフェニル含有性鎖
である。
【００３９】このような連結基の具体例は、式
【００４０】
【化３】
【００４１】を有するシステアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉ
ｎｅ）（ＩＩＩ）、シスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）
（ＩＶ）、およびシステイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミオールエステルである。
ｎｅ）（ＩＩＩ）、シスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）
（ＩＶ）、およびシステイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミオールエステルである。
【００４２】結合カップルである２つの対構成員の互い
同士の結合は典型的には高親和性結合であり、すなわち
これら２つの対構成員は互いが容易には解離せず、そし
てこの電極をすすいだ後でさえも被検体は依然として固
定化構成員に実質的に結合したままになっている。別の
測定にこの電極を再利用する目的においては、固定化構
成員から被検体を解離させ、そしてこの系から被検体を
取り除く必要がある。本発明の好ましい態様に従うと、
この解離は、２つの異性化状態を有し、そして２つの異
なる波長の光エネルギーへの露出（または暴露）により
その２つの状態の間を可逆的に切り替わることが可能な
電極上に固定化されている構成員に結合しているある基
により達成する。このような基は典型的には第一および
第二異性化状態を有し、そして一つの状態から他へと可
逆的に切り替わることにより、該被検体に対する固定化
構成員の結合親和性に変化をもたらす固定化構成員の立
体配座の変化を引き起こす。このような立体配座の変化
は、例えば結合部位の閉塞もしくは結合部位内の立体配
座の変化を生じることがあり、このことにより被検体に
対する固定化構成員の結合親和性の減少を生じ、これが
今後、高親和性状態から低親和性状態への変化もしくは
切り替えとして定義される。
同士の結合は典型的には高親和性結合であり、すなわち
これら２つの対構成員は互いが容易には解離せず、そし
てこの電極をすすいだ後でさえも被検体は依然として固
定化構成員に実質的に結合したままになっている。別の
測定にこの電極を再利用する目的においては、固定化構
成員から被検体を解離させ、そしてこの系から被検体を
取り除く必要がある。本発明の好ましい態様に従うと、
この解離は、２つの異性化状態を有し、そして２つの異
なる波長の光エネルギーへの露出（または暴露）により
その２つの状態の間を可逆的に切り替わることが可能な
電極上に固定化されている構成員に結合しているある基
により達成する。このような基は典型的には第一および
第二異性化状態を有し、そして一つの状態から他へと可
逆的に切り替わることにより、該被検体に対する固定化
構成員の結合親和性に変化をもたらす固定化構成員の立
体配座の変化を引き起こす。このような立体配座の変化
は、例えば結合部位の閉塞もしくは結合部位内の立体配
座の変化を生じることがあり、このことにより被検体に
対する固定化構成員の結合親和性の減少を生じ、これが
今後、高親和性状態から低親和性状態への変化もしくは
切り替えとして定義される。
【００４３】最初の状態においては固定化構成員は該被
検体への結合に対する高い親和性を有し、そして測定実
施後には電極を該基が第二状態へと切り替わるように処
理し、そしてその後該被検体は固定化構成員から解離す
る。典型的にはすすぎ用溶液のすすぎおよび洗浄により
この系から該被検体を取り除いた後に、電極を該基が該
第一状態に切り替わって戻るように別の処理を施し、こ
のことにより電極の再利用のための準備が整う。
検体への結合に対する高い親和性を有し、そして測定実
施後には電極を該基が第二状態へと切り替わるように処
理し、そしてその後該被検体は固定化構成員から解離す
る。典型的にはすすぎ用溶液のすすぎおよび洗浄により
この系から該被検体を取り除いた後に、電極を該基が該
第一状態に切り替わって戻るように別の処理を施し、こ
のことにより電極の再利用のための準備が整う。
【００４４】この２つの状態の間の切り替えは、赤外、
可視、もしくは紫外の範囲内の適切な波長の光への露出
により達成する。反応基は、第一波長の光エネルギーへ
の露出により該第一状態から該第二状態へと、そして第
一波長とは異なる第二波長への露出により第二状態から
第一状態へと切り替わる。これらの切り替えの内の一つ
を緩和な熱処理により達成することも可能である。
可視、もしくは紫外の範囲内の適切な波長の光への露出
により達成する。反応基は、第一波長の光エネルギーへ
の露出により該第一状態から該第二状態へと、そして第
一波長とは異なる第二波長への露出により第二状態から
第一状態へと切り替わる。これらの切り替えの内の一つ
を緩和な熱処理により達成することも可能である。
【００４５】したがって、本発明の一つの態様に従っ
て、認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対
して反応性を示す基を有するかもしくはそれに連結され
ている系が提供され、該基が第一および第二状態を有
し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態か
ら第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出によ
り第二状態から第一状態へと転化することが可能であ
り、この露出により該被検体への結合についての固定化
構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一
状態にある場合には、該固定化構成員は該被検体に対し
て高い結合親和性を有するために、該被検体が本質的に
固定化構成員に結合したままになっており、そして第二
状態にある場合には、該固定化構成員は該被検体に対し
て低い結合親和性を有するために、結合被検体が容易に
解離する。
て、認識対の固定化構成員が光エネルギーへの露出に対
して反応性を示す基を有するかもしくはそれに連結され
ている系が提供され、該基が第一および第二状態を有
し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態か
ら第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出によ
り第二状態から第一状態へと転化することが可能であ
り、この露出により該被検体への結合についての固定化
構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一
状態にある場合には、該固定化構成員は該被検体に対し
て高い結合親和性を有するために、該被検体が本質的に
固定化構成員に結合したままになっており、そして第二
状態にある場合には、該固定化構成員は該被検体に対し
て低い結合親和性を有するために、結合被検体が容易に
解離する。
【００４６】本発明の他の態様に従うと、第一状態から
の第二状態への該切り替えが光エネルギーへの露出によ
るものであるが、第二状態からの第一状態への切り替え
が緩和な熱処理によるものである系も提供される。
の第二状態への該切り替えが光エネルギーへの露出によ
るものであるが、第二状態からの第一状態への切り替え
が緩和な熱処理によるものである系も提供される。
【００４７】本発明の系の感度は、大きな分子もしくは
一群の分子と結合しているかもしくは複合体形成してい
る被検体分子の利用により増加させることができる（今
後これを「複合化被検体」と称する）。固定化構成員へ
結合する際、複合化被検体は電極物質へのレドックス分
子の接近を立体的に妨げる。ある態様によると、これは
例えば被検体である抗体に対する抗−抗体、および蛋白
質被検体に対する抗体などのような大きな分子もしくは
分子の複合体に対して結合している被検体の利用により
達成する。
一群の分子と結合しているかもしくは複合体形成してい
る被検体分子の利用により増加させることができる（今
後これを「複合化被検体」と称する）。固定化構成員へ
結合する際、複合化被検体は電極物質へのレドックス分
子の接近を立体的に妨げる。ある態様によると、これは
例えば被検体である抗体に対する抗−抗体、および蛋白
質被検体に対する抗体などのような大きな分子もしくは
分子の複合体に対して結合している被検体の利用により
達成する。
【００４８】他の態様によると、被検体が固定化構成員
に結合可能になった後に、この電極を結合被検体に結合
可能な作用物質で刺激し、このことにより結合被検体と
複合体形成した作用物質が立体障害を引き起こす。立体
障害を増大させる目的で、最初の複合体の形成後、電極
を、例えば抗−抗体のような、固定化被検体と既に結合
しているかもしくは複合体形成している作用物質に対し
て結合もしくは複合体形成する抗−作用物質と反応さ
せ、そしてこのことにより複合体のサイズの増加を引き
起こし、そしてこれにより立体障害の増加をも引き起こ
す。
に結合可能になった後に、この電極を結合被検体に結合
可能な作用物質で刺激し、このことにより結合被検体と
複合体形成した作用物質が立体障害を引き起こす。立体
障害を増大させる目的で、最初の複合体の形成後、電極
を、例えば抗−抗体のような、固定化被検体と既に結合
しているかもしくは複合体形成している作用物質に対し
て結合もしくは複合体形成する抗−作用物質と反応さ
せ、そしてこのことにより複合体のサイズの増加を引き
起こし、そしてこれにより立体障害の増加をも引き起こ
す。
【００４９】先に記載の様式においてこの系の感度を増
加させることにより、電極の電気的応答の変化を、電極
に対するわずかな被検体分子の結合後に測定することが
できる。
加させることにより、電極の電気的応答の変化を、電極
に対するわずかな被検体分子の結合後に測定することが
できる。
【００５０】本発明の他の態様に従うと、液体媒質中の
被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための
先の電気生化学系における利用のための電極が提供さ
れ、この電極は認識対の一つの構成員の層が固定化され
ている電極物質を含み、該対の他の構成員は該被検体で
あり、この電極物質はレドックス分子との電気通信が可
能であり、この電気通信は固定化構成員への該被検体の
結合により修正され、このことにより電極を取り囲む媒
質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定
することができる。
被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための
先の電気生化学系における利用のための電極が提供さ
れ、この電極は認識対の一つの構成員の層が固定化され
ている電極物質を含み、該対の他の構成員は該被検体で
あり、この電極物質はレドックス分子との電気通信が可
能であり、この電気通信は固定化構成員への該被検体の
結合により修正され、このことにより電極を取り囲む媒
質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定
することができる。
【００５１】本発明のある態様により、液体媒質中の被
検体の存在および場合によっては濃度の決定のための先
の電気生化学系における利用のための実質的に再利用可
能な電極が提供され、この電極はレドックス分子との電
気通信を可能にする電極物質を含み、この電極物質上に
は認識対の一つの構成員の層が固定化されており（この
対の他の構成員は該被検体である）、レドックス分子と
電極物質との間の電気通信は該被検体への該構成員の結
合により修正され、固定化された構成員は光エネルギー
への露出に反応性を示す基を有するかあるいはそれに連
結されており、該基は第一および第二状態を有し、そし
て第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状
態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状
態から第一状態と転化することが可能であり、この露出
により該被検体への結合についての固定化構成員の親和
性の変化が誘導され、このことにより第一状態である場
合には固定化構成員は該被検体に対して高い結合親和性
を有するために、結合被検体は容易には解離せず、そし
て第二状態である場合には固定化構成員は該被検体に対
して低い結合親和性を有するため、結合作用物質は容易
に解離し、そしてこの系から取り出すことができ、そし
てその後にこの電極を第二波長の光に露出させて該第一
状態への変化を誘導することができ、このことによりこ
の電極の再利用の準備が整い、このことによりこの電極
を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によって
は濃度を再度決定することができる。
検体の存在および場合によっては濃度の決定のための先
の電気生化学系における利用のための実質的に再利用可
能な電極が提供され、この電極はレドックス分子との電
気通信を可能にする電極物質を含み、この電極物質上に
は認識対の一つの構成員の層が固定化されており（この
対の他の構成員は該被検体である）、レドックス分子と
電極物質との間の電気通信は該被検体への該構成員の結
合により修正され、固定化された構成員は光エネルギー
への露出に反応性を示す基を有するかあるいはそれに連
結されており、該基は第一および第二状態を有し、そし
て第一波長の光照射への露出により第一状態から第二状
態へと、そして第二波長の光照射への露出により第二状
態から第一状態と転化することが可能であり、この露出
により該被検体への結合についての固定化構成員の親和
性の変化が誘導され、このことにより第一状態である場
合には固定化構成員は該被検体に対して高い結合親和性
を有するために、結合被検体は容易には解離せず、そし
て第二状態である場合には固定化構成員は該被検体に対
して低い結合親和性を有するため、結合作用物質は容易
に解離し、そしてこの系から取り出すことができ、そし
てその後にこの電極を第二波長の光に露出させて該第一
状態への変化を誘導することができ、このことによりこ
の電極の再利用の準備が整い、このことによりこの電極
を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によって
は濃度を再度決定することができる。
【００５２】本発明の好ましい態様に従うと、光エネル
ギーへの露出に反応性を示す基は、これを第一状態から
第二状態へと変化させるような第一波長の光の照射に反
応性を示す一つを上回る安定な構造もしくは異性体状態
を有する化合物である。この状態変化は可逆的であり、
それはこの基がこれを第二状態から第一状態へと変化さ
せる第二波長（もしくは熱処理により）での光照射にも
反応性を示すためである。典型的には、第一および第二
波長は、赤外、可視、もしくは紫外領域内にある。
ギーへの露出に反応性を示す基は、これを第一状態から
第二状態へと変化させるような第一波長の光の照射に反
応性を示す一つを上回る安定な構造もしくは異性体状態
を有する化合物である。この状態変化は可逆的であり、
それはこの基がこれを第二状態から第一状態へと変化さ
せる第二波長（もしくは熱処理により）での光照射にも
反応性を示すためである。典型的には、第一および第二
波長は、赤外、可視、もしくは紫外領域内にある。
【００５３】この基を製造するのに使用することができ
る５つの系統の化合物の例を図１９において読み取るこ
とができ、構造（１）から（５）まではすなわち、アゾ
ベンゼン類（１）、スピロピラン類（２）、フルギド類
（３）、チオフェネフルギド類（４）、もしくはマラカ
イトグリーン（５）を含む。これら５つの系統の化合物
の内の３つのものにおける構造変化の例を図１９の構造
（６）から（８）までにより説明するが、これらの変化
は適切な波長の光エネルギー照射にそれらを露出させる
際に生じるものである。具体的には、項目（６）はアゾ
ベンゼン類を、構造（７）はスピロピラン類を、そして
構造（８）はマラカイトグリーンを示す。これらの化合
物全ては、電極表面上に固定化すべき認識対の構成員に
連結することができる基を製造するための構造修飾を必
要とする。したがって好ましい態様においては、これら
の化合物を化学的に修飾して活性エステル、アミン、カ
ルボン酸、もしくはハロゲン化物誘導体を形成させる。
これらの部分の存在により、認識対の構成員へのこの基
の連結が容易になる。構造（１３）および（１４）は両
者とも、スピロピランを第一状態（ａ）からスピロピラ
ンがメロシアニン形態をとっている第二状態（ｂ）へと
変化させるのに必要な光エネルギーの適切な波長、なら
びにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分を有す
るおよび有さない第一および第二異性体状態の構造をも
示している。
る５つの系統の化合物の例を図１９において読み取るこ
とができ、構造（１）から（５）まではすなわち、アゾ
ベンゼン類（１）、スピロピラン類（２）、フルギド類
（３）、チオフェネフルギド類（４）、もしくはマラカ
イトグリーン（５）を含む。これら５つの系統の化合物
の内の３つのものにおける構造変化の例を図１９の構造
（６）から（８）までにより説明するが、これらの変化
は適切な波長の光エネルギー照射にそれらを露出させる
際に生じるものである。具体的には、項目（６）はアゾ
ベンゼン類を、構造（７）はスピロピラン類を、そして
構造（８）はマラカイトグリーンを示す。これらの化合
物全ては、電極表面上に固定化すべき認識対の構成員に
連結することができる基を製造するための構造修飾を必
要とする。したがって好ましい態様においては、これら
の化合物を化学的に修飾して活性エステル、アミン、カ
ルボン酸、もしくはハロゲン化物誘導体を形成させる。
これらの部分の存在により、認識対の構成員へのこの基
の連結が容易になる。構造（１３）および（１４）は両
者とも、スピロピランを第一状態（ａ）からスピロピラ
ンがメロシアニン形態をとっている第二状態（ｂ）へと
変化させるのに必要な光エネルギーの適切な波長、なら
びにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分を有す
るおよび有さない第一および第二異性体状態の構造をも
示している。
【００５４】図１９において示される光異性化可能な活
性エステルの例は、Ｎ−プロピオン酸スピロピランのＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１５）、４−カ
ルボキシアゾベンゼンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（１６）、およびチオフェネフルギドのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（１７）である。
性エステルの例は、Ｎ−プロピオン酸スピロピランのＮ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１５）、４−カ
ルボキシアゾベンゼンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（１６）、およびチオフェネフルギドのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（１７）である。
【００５５】本発明はまた、（ａ）金属もしくはガラス
電極に対するイオウ含有性部分もしくは官能基付加済み
アルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学
吸着により電極物質上へ該連結基を固定化すること、
（ｂ）連結基の該官能基に対して固定化すべき認識対の
構成員を結合させること、を含む、先の電極を製造する
ための方法も提供する。
電極に対するイオウ含有性部分もしくは官能基付加済み
アルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学
吸着により電極物質上へ該連結基を固定化すること、
（ｂ）連結基の該官能基に対して固定化すべき認識対の
構成員を結合させること、を含む、先の電極を製造する
ための方法も提供する。
【００５６】段階（ａ）および（ｂ）は、固定化を結合
前に実施するよう逆転させることができる。
前に実施するよう逆転させることができる。
【００５７】本発明は更に、（ａ）金属もしくはガラス
電極に対するイオウ含有性部分もしくは官能基付加済み
アルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学
吸着により電極物質上へ該連結基を固定化すること、
（ｂ）該認識対の一つの構成員を光異性化可能な基電極
で化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エ
ネルギーへの露出による認識対の他の構成員に対する結
合親和性を変化させること、（ｃ）電極上に固定化され
た連結基の該官能基に、認識対の修飾構成員を結合させ
ること、を含む、光エネルギに対して反応性を示す基を
取り込む先の電極を製造するための方法を提供する。
電極に対するイオウ含有性部分もしくは官能基付加済み
アルコキシシラン各々の化学的会合付着、もしくは化学
吸着により電極物質上へ該連結基を固定化すること、
（ｂ）該認識対の一つの構成員を光異性化可能な基電極
で化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エ
ネルギーへの露出による認識対の他の構成員に対する結
合親和性を変化させること、（ｃ）電極上に固定化され
た連結基の該官能基に、認識対の修飾構成員を結合させ
ること、を含む、光エネルギに対して反応性を示す基を
取り込む先の電極を製造するための方法を提供する。
【００５８】段階（ａ）および（ｃ）は、異性化可能基
を、これを電極上に固定化させた後に認識対の構成員に
結合させるよう逆転させることができ、そして段階
（ａ）および（ｂ）についてもやはり同様である。
を、これを電極上に固定化させた後に認識対の構成員に
結合させるよう逆転させることができ、そして段階
（ａ）および（ｂ）についてもやはり同様である。
【００５９】本発明はここで、以下に示す幾つかの具体
的態様の記述においてより詳細に説明されるであろう
し、時としては添付される図面を参考にすることがある
が、このことにより前述の記述の一般性を損なうことは
ない。
的態様の記述においてより詳細に説明されるであろう
し、時としては添付される図面を参考にすることがある
が、このことにより前述の記述の一般性を損なうことは
ない。
【００６０】本発明の詳細な記述 本発明はここで、幾つかの具体的態様により詳細に説明
されるであろうが、本発明はそれらにより制限されるこ
とがないものとして理解される。当業者は、開示される
本発明の態様および他の態様の様々な修飾によっても本
発明を実施できることを恐らく認めることであろうし、
そして当業者がこの明細書中の開示物により基づくその
ような他の態様を実施することは難しいことではないで
あろう。
されるであろうが、本発明はそれらにより制限されるこ
とがないものとして理解される。当業者は、開示される
本発明の態様および他の態様の様々な修飾によっても本
発明を実施できることを恐らく認めることであろうし、
そして当業者がこの明細書中の開示物により基づくその
ような他の態様を実施することは難しいことではないで
あろう。
【００６１】最初に、本発明の直接モードの態様の概略
図である図１を参照する。電極１の表面は、認識対３の
一構成員に共有結合している連結基２を含む複合体の固
定化層により覆われている。この電極は典型的には金で
できているか、あるいは金によりコーティングされてい
るが、銀もしくはプラチナのような他の金属からできて
いるかもしくはコーティングされていることもある。こ
の電極はまた、ＩＴＯ電極を一例とする非金属製電極で
あることもできる。この電極を緩衝液およびレッドクス
カップルＲ+／Ｒ４を含む液体媒質中に浸す。他の２本
の電極（図示されていない）を使用するが、対極は典型
的にはプラチナワイヤーもしくはグラファイトでできて
おり、そして参照電極は典型的にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極
である。この系は、認識対の被検体構成員５の感度の良
い電気生化学的検出を可能にする。電極固定化層を、電
気的応答を生じるため電極の表面上に固定化されている
相手側構成員に結合する認識対５の被検体構成員で刺激
する。被検体構成員の結合により電極はレドックス分子
に対して絶縁状態となり、これによりサイクリックボル
タングラム（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａ
ｍ）を例とする電気的応答が減少する。被検体構成員の
結合量は溶液中の被検体の濃度に依存する。特定される
期間、種々の濃度の被検体による刺激に対する電極固定
化層の電気的応答を測定することによって検量線が得ら
れ、この検量線により既知の試料中の抗体を正確に決定
することが可能になる。ナノモル範囲を下回る濃度を容
易に検出することができる。認識対が抗原−抗体を含む
場合の固定化構成員による電極表面の典型的な適用範囲
は１０-12モルｃｍ-2の桁である。表面の１０％もしく
はそれを上回る結合が検出可能である。
図である図１を参照する。電極１の表面は、認識対３の
一構成員に共有結合している連結基２を含む複合体の固
定化層により覆われている。この電極は典型的には金で
できているか、あるいは金によりコーティングされてい
るが、銀もしくはプラチナのような他の金属からできて
いるかもしくはコーティングされていることもある。こ
の電極はまた、ＩＴＯ電極を一例とする非金属製電極で
あることもできる。この電極を緩衝液およびレッドクス
カップルＲ+／Ｒ４を含む液体媒質中に浸す。他の２本
の電極（図示されていない）を使用するが、対極は典型
的にはプラチナワイヤーもしくはグラファイトでできて
おり、そして参照電極は典型的にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極
である。この系は、認識対の被検体構成員５の感度の良
い電気生化学的検出を可能にする。電極固定化層を、電
気的応答を生じるため電極の表面上に固定化されている
相手側構成員に結合する認識対５の被検体構成員で刺激
する。被検体構成員の結合により電極はレドックス分子
に対して絶縁状態となり、これによりサイクリックボル
タングラム（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａ
ｍ）を例とする電気的応答が減少する。被検体構成員の
結合量は溶液中の被検体の濃度に依存する。特定される
期間、種々の濃度の被検体による刺激に対する電極固定
化層の電気的応答を測定することによって検量線が得ら
れ、この検量線により既知の試料中の抗体を正確に決定
することが可能になる。ナノモル範囲を下回る濃度を容
易に検出することができる。認識対が抗原−抗体を含む
場合の固定化構成員による電極表面の典型的な適用範囲
は１０-12モルｃｍ-2の桁である。表面の１０％もしく
はそれを上回る結合が検出可能である。
【００６２】この方法はまた、糖−レクチン、リガンド
−レセプター、ビオチン−アビジン、オリゴヌクレオチ
ド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌク
レオチド−細胞、および基質−酵素のような他の認識対
の分析に適用することも可能である。
−レセプター、ビオチン−アビジン、オリゴヌクレオチ
ド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴヌク
レオチド−細胞、および基質−酵素のような他の認識対
の分析に適用することも可能である。
【００６３】レドックス分子の性質は、認識対の性質、
ならびにそのレドックス分子がその対の一構成員に結合
するか否かに依存して変化する。図１におけるもののよ
うな最も単純な系においてはレドックス分子は溶液中を
自由に動きまわり、そして電極から電子を受容するもし
くはそこへ電子を供与することによりそれらのレドック
ス状態を変化させることが可能である。一例はヘキサシ
アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩、
もしくは図１９（１１）において示される式を有する化
合物である。
ならびにそのレドックス分子がその対の一構成員に結合
するか否かに依存して変化する。図１におけるもののよ
うな最も単純な系においてはレドックス分子は溶液中を
自由に動きまわり、そして電極から電子を受容するもし
くはそこへ電子を供与することによりそれらのレドック
ス状態を変化させることが可能である。一例はヘキサシ
アノ鉄（ＩＩＩ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩、
もしくは図１９（１１）において示される式を有する化
合物である。
【００６４】連結基は、電極表面との会合付着、もしく
はその表面上への化学吸着を容易にさせる部分（これは
典型的には、金属電極上への固定化のためのイオウ含有
性部分、あるいはＩＴＯ電極上への固定化のためのアル
コキシシラン残基である）、ならびに結合基を含み、そ
して認識対の固定化構成員のある部分と共有結合を形成
することが可能な官能基を含む化合物である。連結基の
例はシスタミンである。認識対の一構成員を直接固定化
することができる場合には、この連結基を場合によって
選択できる。
はその表面上への化学吸着を容易にさせる部分（これは
典型的には、金属電極上への固定化のためのイオウ含有
性部分、あるいはＩＴＯ電極上への固定化のためのアル
コキシシラン残基である）、ならびに結合基を含み、そ
して認識対の固定化構成員のある部分と共有結合を形成
することが可能な官能基を含む化合物である。連結基の
例はシスタミンである。認識対の一構成員を直接固定化
することができる場合には、この連結基を場合によって
選択できる。
【００６５】図２は本発明の直接モードの他の態様であ
り、この場合にはレドックス分子は被検体に結合してい
る。層が固定化させてある電極は、認識対の被検体構成
員を含む試料により（段階（１））、そしてその後にレ
ドックス分子Ｒを連結させることによる修飾を施した被
検体を含む溶液により刺激した（段階２）。
り、この場合にはレドックス分子は被検体に結合してい
る。層が固定化させてある電極は、認識対の被検体構成
員を含む試料により（段階（１））、そしてその後にレ
ドックス分子Ｒを連結させることによる修飾を施した被
検体を含む溶液により刺激した（段階２）。
【００６６】検査のためには、この電極を固定時間の
間、未知の濃度の被検体を含む生物学的もしくは他の被
検体試料で刺激し、そしてその後に修飾被検体の溶液で
刺激した。電極の固定化層に結合した修飾被検体の量は
未修飾被検体結合の量に依存する。より多くの固定化層
部位が未修飾被検体に占領されるに従って、修飾被検体
が利用できる部位は少なくなって行く。したがって電気
的応答は、検査用試料中の被検体の濃度に逆相関する。
間、未知の濃度の被検体を含む生物学的もしくは他の被
検体試料で刺激し、そしてその後に修飾被検体の溶液で
刺激した。電極の固定化層に結合した修飾被検体の量は
未修飾被検体結合の量に依存する。より多くの固定化層
部位が未修飾被検体に占領されるに従って、修飾被検体
が利用できる部位は少なくなって行く。したがって電気
的応答は、検査用試料中の被検体の濃度に逆相関する。
【００６７】この系は、既知の異なる濃度の被検体で、
そして次に固定濃度の修飾被検体で電極を刺激し、そし
てその後に電気的応答を測定することにより検量するこ
とができる。
そして次に固定濃度の修飾被検体で電極を刺激し、そし
てその後に電気的応答を測定することにより検量するこ
とができる。
【００６８】ここでは図３を参照する。この図中に略記
される態様は図２中に示されるものに非常に類似してい
るが、相違点は、この態様においては電極を既知の被検
体濃度を含む試料と修飾被検体とで同時に刺激すること
である。得られる電気的応答の質は類似している。
される態様は図２中に示されるものに非常に類似してい
るが、相違点は、この態様においては電極を既知の被検
体濃度を含む試料と修飾被検体とで同時に刺激すること
である。得られる電気的応答の質は類似している。
【００６９】恐らく理解されるであろうが、先に示す態
様は、ある態様における被検体が他の態様における固定
化構成員であることができ、その逆も同様であるという
点で交換可能である。例えば、ある試料中の所定の抗原
の存在の検出の目的においては、固定化構成員はこの抗
原に対して特異的な抗体であることができる一方で、抗
体の存在を検出する目的においては、固定化構成員は抗
原であることができる。このことは図４および５におい
て示されており、そして被検体と固定化構成員との役割
が逆転しているものの、これらは本質的には図２および
３と相同である。
様は、ある態様における被検体が他の態様における固定
化構成員であることができ、その逆も同様であるという
点で交換可能である。例えば、ある試料中の所定の抗原
の存在の検出の目的においては、固定化構成員はこの抗
原に対して特異的な抗体であることができる一方で、抗
体の存在を検出する目的においては、固定化構成員は抗
原であることができる。このことは図４および５におい
て示されており、そして被検体と固定化構成員との役割
が逆転しているものの、これらは本質的には図２および
３と相同である。
【００７０】ここでは図６を参照するが、これは本発明
の直接モードにより従う他の態様の概略図である。この
態様により測定の実施後の電極の再生が可能となって、
次の測定における再使用が可能となる。この功績は、こ
の態様に従い、図６のｃにおいて示されるように２つの
異性化状態、すなわちＡおよびＢを有し、そしてエネル
ギーｈν1（波長λ1を有する）およびエネルギーｈν2
（波長λ2を有する）の光への露出によりこれら２つの
状態の間を可逆的に切り替わることが可能な基１２によ
り固定化構成員１１を修飾することにより達成される。
これら２つの異性化状態ＡおよびＢの間の切り替わりに
より、修飾を施した固定化構成員の立体配座変化が生
じ、これにより被検体１３に対する結合親和性に変化が
生じ、状態Ａの場合には、修飾を施した固定化構成員は
高親和性での被検体１３への結合が可能であり、状態Ｂ
の場合には、被検体に対する結合の親和性は非常に低く
なる。
の直接モードにより従う他の態様の概略図である。この
態様により測定の実施後の電極の再生が可能となって、
次の測定における再使用が可能となる。この功績は、こ
の態様に従い、図６のｃにおいて示されるように２つの
異性化状態、すなわちＡおよびＢを有し、そしてエネル
ギーｈν1（波長λ1を有する）およびエネルギーｈν2
（波長λ2を有する）の光への露出によりこれら２つの
状態の間を可逆的に切り替わることが可能な基１２によ
り固定化構成員１１を修飾することにより達成される。
これら２つの異性化状態ＡおよびＢの間の切り替わりに
より、修飾を施した固定化構成員の立体配座変化が生
じ、これにより被検体１３に対する結合親和性に変化が
生じ、状態Ａの場合には、修飾を施した固定化構成員は
高親和性での被検体１３への結合が可能であり、状態Ｂ
の場合には、被検体に対する結合の親和性は非常に低く
なる。
【００７１】図式６のａとｂとは非常に類似しており、
相違点は、図６のｂの被検体１３と固定化構成員１１が
各々固定化構成員１１’と被検体１３’になっていると
いう点で、図６のａの固定化構成員１１とリガンド１３
の役割が逆転しているということである。これらの態様
が相同であるということの他に、以下に示される記述が
図式６のａについてのみ関連するものであったとして
も、これをまた図６のｂにおいて示される態様にも同様
に適用することができるということが理解され、したが
って利用周期ａ1、ａ2、ａ3、ａ4、およびａ5での各段
階はそれぞれ図６（ｂ）における各段階ｂ1、ｂ2、
ｂ3、ｂ4、およびｂ5に相当する。
相違点は、図６のｂの被検体１３と固定化構成員１１が
各々固定化構成員１１’と被検体１３’になっていると
いう点で、図６のａの固定化構成員１１とリガンド１３
の役割が逆転しているということである。これらの態様
が相同であるということの他に、以下に示される記述が
図式６のａについてのみ関連するものであったとして
も、これをまた図６のｂにおいて示される態様にも同様
に適用することができるということが理解され、したが
って利用周期ａ1、ａ2、ａ3、ａ4、およびａ5での各段
階はそれぞれ図６（ｂ）における各段階ｂ1、ｂ2、
ｂ3、ｂ4、およびｂ5に相当する。
【００７２】最初の段階ａ1においては、基１２は異性
化段階Ａにあり、この場合この基は被検体１３に対する
高親和性結合を有する。被検体１３の存在下では、この
被検体は固定化構成員に結合しており（段階ａ1）、こ
の結合により電気化学反応の変化がもたらされる
（ａ3）。測定の実施後、電極を波長λ1の光で照射し、
そしてその後に基１２はその異性化状態Ｂとなり、そし
てその後に固定化構成員１１の立体配座変化がもたらさ
れ、これにより被検体１３への低結合親和性が生じる。
その結果、段階ａ4においては、被検体１３は固定化構
成員１１から解離する。その後、この系をすすいで未結
合被検体を除去し、そして除去後（段階ａ5）、電極を
波長λ2の光で照射し、そしてその後に基１２を異性化
によって状態Ａへと戻し、そして修飾を施した固定化構
成員はそのもともとの立体配座になる（ａ1）。この段
階（ａ1）においては電極を再利用する準備が整ってい
る。
化段階Ａにあり、この場合この基は被検体１３に対する
高親和性結合を有する。被検体１３の存在下では、この
被検体は固定化構成員に結合しており（段階ａ1）、こ
の結合により電気化学反応の変化がもたらされる
（ａ3）。測定の実施後、電極を波長λ1の光で照射し、
そしてその後に基１２はその異性化状態Ｂとなり、そし
てその後に固定化構成員１１の立体配座変化がもたらさ
れ、これにより被検体１３への低結合親和性が生じる。
その結果、段階ａ4においては、被検体１３は固定化構
成員１１から解離する。その後、この系をすすいで未結
合被検体を除去し、そして除去後（段階ａ5）、電極を
波長λ2の光で照射し、そしてその後に基１２を異性化
によって状態Ａへと戻し、そして修飾を施した固定化構
成員はそのもともとの立体配座になる（ａ1）。この段
階（ａ1）においては電極を再利用する準備が整ってい
る。
【００７３】図５の態様ならびに図６の態様に類似し
て、図２および３において示される修飾被検体も利用す
ることができるということが理解されよう。
て、図２および３において示される修飾被検体も利用す
ることができるということが理解されよう。
【００７４】ここでは図７を参照するが、これは本発明
の間接モードに従う態様を示している。この態様におい
ては、固定化構成員２２の層を有する電極２１を含む系
を生物学的試料２４中の作用物質２３の決定のために利
用するが、この作用物質は固定化構成員と相同（固定化
されていないとはいえ）である。この態様に従うと、既
知の濃度の被検体２６を含む溶液２５を試料２４と反応
させる。この反応後に被検体分子２６と作用物質分子２
３との間に結合が生じるが、この結合の度合いは作用物
質の濃度に依存する。その後に電極を反応用溶液２７で
刺激し、そしてこの後に遊離被検体分子が固定化構成員
に結合するが、この結合濃度の度合いは溶液２７中の遊
離被検体分子の量に依存する。電気的応答の変化により
溶液２７中の遊離被検体２６の濃度の決定が可能にな
り、この変化が次には試料２４中の作用物質２３の決定
に役立つ。
の間接モードに従う態様を示している。この態様におい
ては、固定化構成員２２の層を有する電極２１を含む系
を生物学的試料２４中の作用物質２３の決定のために利
用するが、この作用物質は固定化構成員と相同（固定化
されていないとはいえ）である。この態様に従うと、既
知の濃度の被検体２６を含む溶液２５を試料２４と反応
させる。この反応後に被検体分子２６と作用物質分子２
３との間に結合が生じるが、この結合の度合いは作用物
質の濃度に依存する。その後に電極を反応用溶液２７で
刺激し、そしてこの後に遊離被検体分子が固定化構成員
に結合するが、この結合濃度の度合いは溶液２７中の遊
離被検体分子の量に依存する。電気的応答の変化により
溶液２７中の遊離被検体２６の濃度の決定が可能にな
り、この変化が次には試料２４中の作用物質２３の決定
に役立つ。
【００７５】ここでは図８を参照するが、これは本発明
の間接モードに従う他の態様を表す。図８の態様は図７
のものに本質的には類似しており、相違点は、固定化構
成員２２’は試料２４’中における決定すべき作用物質
２３’に相同ではなく、むしろ被検体２６’に対する類
似する結合特性のみを有するということである。
の間接モードに従う他の態様を表す。図８の態様は図７
のものに本質的には類似しており、相違点は、固定化構
成員２２’は試料２４’中における決定すべき作用物質
２３’に相同ではなく、むしろ被検体２６’に対する類
似する結合特性のみを有するということである。
【００７６】ここでは図９を参照するが、これは本発明
の間接モードに従うさらに別の態様を示す。この態様に
より、被検体３２が産物３３および３４に分解する反応
に、図９のａにより示されるような触媒作用を及ぼす酵
素３１の決定が可能になる。
の間接モードに従うさらに別の態様を示す。この態様に
より、被検体３２が産物３３および３４に分解する反応
に、図９のａにより示されるような触媒作用を及ぼす酵
素３１の決定が可能になる。
【００７７】図９のｂにおいて示されるように、既知の
濃度の被検体３２を含む溶液３５を、未知の濃度の酵素
３１を含む生物学的試料３６と反応させるが、この酵素
が、この生物学的試料中の決定すべき作用物質である。
この反応後に、被検体３２の内の幾つかはこの酵素によ
り分解されて反応産物３３となるが、この分解の度合い
は試料３６中の酵素３１の濃度に依存する。その後に固
定化構成員３８の層を保持する電極３７を反応用溶液３
９と反応させるが、この際に遊離被検体３２はこの電極
上の固定化構成員３８に結合する。電気的応答の変化に
より、溶液３９中の被検体の決定が可能になり、このこ
とにより次には試料３６中の酵素３１の決定が可能にな
る。
濃度の被検体３２を含む溶液３５を、未知の濃度の酵素
３１を含む生物学的試料３６と反応させるが、この酵素
が、この生物学的試料中の決定すべき作用物質である。
この反応後に、被検体３２の内の幾つかはこの酵素によ
り分解されて反応産物３３となるが、この分解の度合い
は試料３６中の酵素３１の濃度に依存する。その後に固
定化構成員３８の層を保持する電極３７を反応用溶液３
９と反応させるが、この際に遊離被検体３２はこの電極
上の固定化構成員３８に結合する。電気的応答の変化に
より、溶液３９中の被検体の決定が可能になり、このこ
とにより次には試料３６中の酵素３１の決定が可能にな
る。
【００７８】ここでは図１０を参照するが、これは図９
の実施例に類似しており、そしてそのため類似する構成
員にはプライム符号を付けた類似番号が与えられてい
る。この態様においては、酵素３１’が反応を開始させ
るが、この反応においては前駆体被検体分子３３’およ
び３４’の異化作用が生じて被検体分子３２’を生じ
る。図１０のｂにおいて示されるように、この態様にお
いては既知の濃度の前駆体被検体３３’を含む溶液３
５’を未知の量の酵素３１’を含む試料３６’と反応さ
せる。その後、構成員３８’の層を固定化させてある電
極３７’を反応用溶液３９’で刺激するが、この際に被
検体分子３２’は固定化構成員３８’に結合し、結合の
度合いは溶液３９’中の被検体分子のレベルに依存す
る。電気的応答の変化を決定することにより、溶液３
９’中の被検体３２の濃度が決定され、このことにより
次には試料３６’中の酵素３１’の決定が可能となる。
の実施例に類似しており、そしてそのため類似する構成
員にはプライム符号を付けた類似番号が与えられてい
る。この態様においては、酵素３１’が反応を開始させ
るが、この反応においては前駆体被検体分子３３’およ
び３４’の異化作用が生じて被検体分子３２’を生じ
る。図１０のｂにおいて示されるように、この態様にお
いては既知の濃度の前駆体被検体３３’を含む溶液３
５’を未知の量の酵素３１’を含む試料３６’と反応さ
せる。その後、構成員３８’の層を固定化させてある電
極３７’を反応用溶液３９’で刺激するが、この際に被
検体分子３２’は固定化構成員３８’に結合し、結合の
度合いは溶液３９’中の被検体分子のレベルに依存す
る。電気的応答の変化を決定することにより、溶液３
９’中の被検体３２の濃度が決定され、このことにより
次には試料３６’中の酵素３１’の決定が可能となる。
【００７９】今度は図１１を参照するが、これは本発明
の間接モードのさらに別の態様を説明する。この態様に
おいては、図１０の態様における酵素３１’のものに類
似する反応の異化作用を生じる未知の量の酵素４１を、
決定すべき生物学的作用物質４３の未知の量を含む試料
４２に添加する。この作用物質は、実際には酵素４１に
より被検体４４へと転化する前駆体被検体である。この
反応後、固定化構成員４６の層が固定化されている電極
４５を溶液５５と反応させ、この後に固定化構成員４６
への被検体分子４４の結合が生じ、結合の度合いは溶液
５５中の被検体４４の濃度に依存する。決定される電気
的応答の変化は、その後に溶液５５中の被検体４４の濃
度の決定のための測定物として役立ち、これが次に生物
学的試料４２中の作用物質４３の濃度を決定するのに役
立つ。
の間接モードのさらに別の態様を説明する。この態様に
おいては、図１０の態様における酵素３１’のものに類
似する反応の異化作用を生じる未知の量の酵素４１を、
決定すべき生物学的作用物質４３の未知の量を含む試料
４２に添加する。この作用物質は、実際には酵素４１に
より被検体４４へと転化する前駆体被検体である。この
反応後、固定化構成員４６の層が固定化されている電極
４５を溶液５５と反応させ、この後に固定化構成員４６
への被検体分子４４の結合が生じ、結合の度合いは溶液
５５中の被検体４４の濃度に依存する。決定される電気
的応答の変化は、その後に溶液５５中の被検体４４の濃
度の決定のための測定物として役立ち、これが次に生物
学的試料４２中の作用物質４３の濃度を決定するのに役
立つ。
【００８０】ここでは図１２を参照するが、これは結合
構成員への被検体の結合によりもたらされる電極の電気
的応答の変化を、結合被検体に結合する作用物質の利用
により増幅させる本発明のある態様を示す。図１２
（ａ）においては電極５１が固定化構成員５２を保持し
ていることが示されているが、この場合においてはこの
固定化構成員は抗体５３に特異的に結合する抗原であ
る。この電極のサイクリックボルタングラムにより対照
反応５４が得られる。この電極を抗体５３を含む溶液で
刺激した際には、図１２（ｂ）において示されるよう
に、電極に対する抗体の結合が生じる。サイクリックボ
ルタングラム５４’は電気的応答の減少を示す。しかし
ながら検査用試料中に少量の抗体５３のみが存在する場
合には、対照５４と比較するとこの反応の変化は少な
い。
構成員への被検体の結合によりもたらされる電極の電気
的応答の変化を、結合被検体に結合する作用物質の利用
により増幅させる本発明のある態様を示す。図１２
（ａ）においては電極５１が固定化構成員５２を保持し
ていることが示されているが、この場合においてはこの
固定化構成員は抗体５３に特異的に結合する抗原であ
る。この電極のサイクリックボルタングラムにより対照
反応５４が得られる。この電極を抗体５３を含む溶液で
刺激した際には、図１２（ｂ）において示されるよう
に、電極に対する抗体の結合が生じる。サイクリックボ
ルタングラム５４’は電気的応答の減少を示す。しかし
ながら検査用試料中に少量の抗体５３のみが存在する場
合には、対照５４と比較するとこの反応の変化は少な
い。
【００８１】電気的応答の変化を増幅させる目的で、そ
の後電極を抗体５３に特異的に結合する抗−抗体５５を
含む溶液で刺激する。その結果、結合抗体上における分
子複合体５６の形成が生じ、この抗体は更に電極の電極
物質の表面へのレドックスカップルＲ＋／Ｒの接近を妨
げ、そしてその結果、サイクリックボルタングラム５
４”は対照５４と比較すると際立った減少を示す。
の後電極を抗体５３に特異的に結合する抗−抗体５５を
含む溶液で刺激する。その結果、結合抗体上における分
子複合体５６の形成が生じ、この抗体は更に電極の電極
物質の表面へのレドックスカップルＲ＋／Ｒの接近を妨
げ、そしてその結果、サイクリックボルタングラム５
４”は対照５４と比較すると際立った減少を示す。
【００８２】本発明はここで、以下の実施例により更に
詳細に説明されるであろう。
詳細に説明されるであろう。
【００８３】
実施例１：抗原−抗体認識対（直接モード） ＤＮＰを含む層を固定化させた電極による抗−ＤＮＰ−
抗体の決定。
抗体の決定。
【００８４】この実施例において用いられる電極の製造
の方法を図１３に示す。みがき金電極（領域 ３×１０
-2ｃｍ2）を脱水ＤＭＦ中の３，３’−ジチオジプロピ
オン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
０．１Ｍの溶液中に２時間浸した。この電極を脱水Ｄ
ＭＦで洗浄し、そしてその後ＤＭＳＯ：ＴＨＦ（１：
１）と１５μＬ（５ｃｃ当たり）のジエチルプロピルア
ミン中のＮε−２，４−ＤＮＰ−リシンの０．０２５Ｍ
溶液中に、室温において一晩浸した。
の方法を図１３に示す。みがき金電極（領域 ３×１０
-2ｃｍ2）を脱水ＤＭＦ中の３，３’−ジチオジプロピ
オン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
０．１Ｍの溶液中に２時間浸した。この電極を脱水Ｄ
ＭＦで洗浄し、そしてその後ＤＭＳＯ：ＴＨＦ（１：
１）と１５μＬ（５ｃｃ当たり）のジエチルプロピルア
ミン中のＮε−２，４−ＤＮＰ−リシンの０．０２５Ｍ
溶液中に、室温において一晩浸した。
【００８５】この電気化学的実施例は、作動電極として
Ｎε−２，４−ＤＮＰ−リシン抗原単一層電極を、対極
としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／
ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解
質は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中
の、１．１ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス分子で
ある）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温
度は３７±２℃であり、そして走査速度は２００ｍＶ／
秒であった。この電極を１５分間、抗体である抗−ＤＮ
Ｐの溶液中に浸した。抗体である抗−ＤＭＰ抗体の様々
な濃度におけるＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス探索子）
の電流応答を記録した。
Ｎε−２，４−ＤＮＰ−リシン抗原単一層電極を、対極
としてＰｔ−ワイヤーを、そして参照電極としてＡｇ／
ＡｇＣｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解
質は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中
の、１．１ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス分子で
ある）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温
度は３７±２℃であり、そして走査速度は２００ｍＶ／
秒であった。この電極を１５分間、抗体である抗−ＤＮ
Ｐの溶液中に浸した。抗体である抗−ＤＭＰ抗体の様々
な濃度におけるＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス探索子）
の電流応答を記録した。
【００８６】抗−ＤＮＰ抗体なしの場合（対照−ａと表
示される曲線）、および抗−ＤＮＰ抗体の濃度を上昇さ
せた場合のサイクリックボルタングラム（ｂ−ｅと表示
される曲線）を図１４に示す。図示されるように、電気
的応答は抗体濃度の関数として減少している。図１５
は、抗体濃度の関数としての、対照に対するピーク時の
電流反応の変化（ΔＩpc）を示している。図示されるよ
うに、電流応答の変化は、抗体濃度の直線関数である。
更に図示されるように、０．５μＭのような低い抗体濃
度も検出することができる。
示される曲線）、および抗−ＤＮＰ抗体の濃度を上昇さ
せた場合のサイクリックボルタングラム（ｂ−ｅと表示
される曲線）を図１４に示す。図示されるように、電気
的応答は抗体濃度の関数として減少している。図１５
は、抗体濃度の関数としての、対照に対するピーク時の
電流反応の変化（ΔＩpc）を示している。図示されるよ
うに、電流応答の変化は、抗体濃度の直線関数である。
更に図示されるように、０．５μＭのような低い抗体濃
度も検出することができる。
【００８７】実施例２：抗原−抗体認識対（直接モー
ド） フルオレセイン層を固定化させた電極による抗−フルオ
レセイン−抗体の決定 本実施例において用いられる電極の製造の方法を図１６
に示す。みがき金電極（領域 ３・１０-2ｃｍ2）を、
ＤＭＳＯ中の３，３’−ジチオジプロピオン酸ビス（Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル） ０．０２Ｍの
溶液中に浸した。電極をＤＭＳＯで、次にＴＨＦで洗浄
し、そしてその後室温において２．５ｍｌのＴＨＦ中の
１，１２−ジアミノドデカン、２５ｍｇを含む溶液中に
２４時間浸した。
ド） フルオレセイン層を固定化させた電極による抗−フルオ
レセイン−抗体の決定 本実施例において用いられる電極の製造の方法を図１６
に示す。みがき金電極（領域 ３・１０-2ｃｍ2）を、
ＤＭＳＯ中の３，３’−ジチオジプロピオン酸ビス（Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル） ０．０２Ｍの
溶液中に浸した。電極をＤＭＳＯで、次にＴＨＦで洗浄
し、そしてその後室温において２．５ｍｌのＴＨＦ中の
１，１２−ジアミノドデカン、２５ｍｇを含む溶液中に
２４時間浸した。
【００８８】修飾電極を室温において更に２４時間、３
００μｌの無水ＤＭＦ中に溶解させた２０ｍｇのイソチ
オシアン酸フルオレセインの溶液に浸した。
００μｌの無水ＤＭＦ中に溶解させた２０ｍｇのイソチ
オシアン酸フルオレセインの溶液に浸した。
【００８９】この電気化学的実施例は、作動電極として
フルオレセイン抗原単一層電極を、対極としてＰｔ−ワ
イヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用
する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩
衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ
4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス分子である）および０．１
５ＭのＮａＣｌからできていた。温度は３７±１℃であ
り、そして走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
フルオレセイン抗原単一層電極を、対極としてＰｔ−ワ
イヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用
する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩
衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ
4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス分子である）および０．１
５ＭのＮａＣｌからできていた。温度は３７±１℃であ
り、そして走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
【００９０】図１７は、抗−フルオレセイン抗体濃度の
関数としてのフルオレセイン電極の電流応答を示してい
る。この電流応答は、抗体溶液中で電極を１分間インキ
ュベートした後に測定した。図示されるように、抗体濃
度と電流応答の変化との間には直線依存性が存在する。
関数としてのフルオレセイン電極の電流応答を示してい
る。この電流応答は、抗体溶液中で電極を１分間インキ
ュベートした後に測定した。図示されるように、抗体濃
度と電流応答の変化との間には直線依存性が存在する。
【００９１】実施例３：抗原−抗体認識対（直接モー
ド） ペプチド層を固定化させた電極の利用による抗−ペプチ
ド抗体の決定 図１８のａにおいて示される抗原としてのペプチドは、
Ｆ−ＭＯＣ脱離（Ｇ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓ．、３３、１９８９、２９８−３０３）のために
用いられる、酸不安定性であるが塩基性（ピペリジン）
条件下においては安定である保護処理済みＣｙｓ、Ａｓ
ｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ側鎖を用いるＦ−ＭＯＣ固体相ペプ
チド合成により合成した。粗生成ペプチドはＨＰＬＣ
（ＲＰ−１８）により精製した。
ド） ペプチド層を固定化させた電極の利用による抗−ペプチ
ド抗体の決定 図１８のａにおいて示される抗原としてのペプチドは、
Ｆ−ＭＯＣ脱離（Ｇ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓ．、３３、１９８９、２９８−３０３）のために
用いられる、酸不安定性であるが塩基性（ピペリジン）
条件下においては安定である保護処理済みＣｙｓ、Ａｓ
ｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ側鎖を用いるＦ−ＭＯＣ固体相ペプ
チド合成により合成した。粗生成ペプチドはＨＰＬＣ
（ＲＰ−１８）により精製した。
【００９２】図１８のｂに概略が示されている固定化層
抗原電極は、３時間の期間、（２：１）Ｈ2Ｏ：ＣＨ3Ｃ
Ｎ、０．1％ＴＦＡ、ｐＨ＝１、の３００μｌの０．１
Ｍペプチド溶液中にみがき金電極（領域 ３×１０-2ｃ
ｍ2）を浸すことにより製造した。
抗原電極は、３時間の期間、（２：１）Ｈ2Ｏ：ＣＨ3Ｃ
Ｎ、０．1％ＴＦＡ、ｐＨ＝１、の３００μｌの０．１
Ｍペプチド溶液中にみがき金電極（領域 ３×１０-2ｃ
ｍ2）を浸すことにより製造した。
【００９３】電気化学的測定は、作動電極として固定化
電極（図１８のｂ）を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、
そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの
電極セル中で実施した。電解質の組成物は、リン酸緩衝
液、０．０１Ｍ（ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ4
Ｆｅ（ＣＮ）6、０．１５ＭのＣａＣｌであった。温度
は２０±１℃であり、そして操作速度は２００ｍＶ／秒
であった。レドックス分子であるヘキサシアノ鉄（ＩＩ
Ｉ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩は電極から電子
を受容するかあるいは電極へと電子を供与し、そしてレ
ドックス分子が電極から絶縁される率が高まると、この
増加を示す値は抗原固定化層電極への抗体の結合を決定
するための測定値として機能する。図１９は、レドック
ス分子の存在下における抗原固定化層電極の電気的応答
のサイクリックボルタングラムを示す。０．２３μｇ／
ｍｌの濃度の抗体の添加の際には電気化学的応答が徐々
に減少することが示される（曲線ｂからｄまで）。３５
分後（曲線ｄ）における陰極の減少率は抗体の非存在下
におけるもともとの値の５５％に相当する。
電極（図１８のｂ）を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、
そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの
電極セル中で実施した。電解質の組成物は、リン酸緩衝
液、０．０１Ｍ（ｐＨ＝７．４）中の１．１ｍＭのＫ4
Ｆｅ（ＣＮ）6、０．１５ＭのＣａＣｌであった。温度
は２０±１℃であり、そして操作速度は２００ｍＶ／秒
であった。レドックス分子であるヘキサシアノ鉄（ＩＩ
Ｉ）酸塩／ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸塩は電極から電子
を受容するかあるいは電極へと電子を供与し、そしてレ
ドックス分子が電極から絶縁される率が高まると、この
増加を示す値は抗原固定化層電極への抗体の結合を決定
するための測定値として機能する。図１９は、レドック
ス分子の存在下における抗原固定化層電極の電気的応答
のサイクリックボルタングラムを示す。０．２３μｇ／
ｍｌの濃度の抗体の添加の際には電気化学的応答が徐々
に減少することが示される（曲線ｂからｄまで）。３５
分後（曲線ｄ）における陰極の減少率は抗体の非存在下
におけるもともとの値の５５％に相当する。
【００９４】実施例４：糖−レクチン認識対（直接モー
ド） 糖の層を固定化させた電極の利用によるコンカナバリン
Ａ（ＣｏｎＡ）の決定 蛋白質であるＣｏｎＡは、単糖であるα−Ｄ−マンノピ
ラノースに特異的に結合するレクチンである。ＣｏｎＡ
を図２０の式（１１）を有するレドックス分子、Ｎ−メ
チル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジ
ニウムに対して連結させることにより修飾した。
ド） 糖の層を固定化させた電極の利用によるコンカナバリン
Ａ（ＣｏｎＡ）の決定 蛋白質であるＣｏｎＡは、単糖であるα−Ｄ−マンノピ
ラノースに特異的に結合するレクチンである。ＣｏｎＡ
を図２０の式（１１）を有するレドックス分子、Ｎ−メ
チル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，４’−ビピリジ
ニウムに対して連結させることにより修飾した。
【００９５】ＣｏｎＡに対するＮ−メチル−Ｎ’−カル
ボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムの化学的結
合は、蛋白質分子のリシン残基のアミノ基へのカルボキ
シ基のカルボジイミドカップリングにより実施した。２
３ｍｇのＮ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，
４’−ビピリジニウム、８０ｍｇのＨＥＰＥＳ、および
１８４ｍｇの尿素を１．６ｍｌの蒸留水中に溶解し、こ
の溶液のｐＨを７．２に調節し、そしてその後４℃に冷
却した。１ｍｌの水溶液（４℃）中の５０ｍｇのＣｏｎ
Ａをこの溶液に添加し、そしてその後カップリング用再
利用性被検体（ｒｅａｎａｌｙｔｅ）としての５．５ｍ
ｇのＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドナトリウム
塩（スルホ−ＮＨＳ）および１２ｍｇの１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＣ）を添加した。得られる混合物を一晩反応させた
（４℃）。得られる溶液をリン酸緩衝液、ｐＨ＝７
（０．０８７５Ｍ、ＭｎＣｌ2 ０．１ｍＭ、ＣａＣｌ2
０．１ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ）に対して透析
し、そしてその後水に対して透析した。透析済み溶液を
遠心し（３０分、４℃、１５０００ｒｐｍ）、そしてこ
の上清を凍結乾燥して化学的に修飾されたＣｏｎＡ（３
０ｍｇ）の粉末を取得した。Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボ
キシメチレン−４，４’−ビピリジニウムに関するコン
カナバリンＡの堆積量は、蛋白質分子当たり３つのピリ
ジニウム基に相当する。
ボキシメチレン−４，４’−ビピリジニウムの化学的結
合は、蛋白質分子のリシン残基のアミノ基へのカルボキ
シ基のカルボジイミドカップリングにより実施した。２
３ｍｇのＮ−メチル−Ｎ’−カルボキシメチレン−４，
４’−ビピリジニウム、８０ｍｇのＨＥＰＥＳ、および
１８４ｍｇの尿素を１．６ｍｌの蒸留水中に溶解し、こ
の溶液のｐＨを７．２に調節し、そしてその後４℃に冷
却した。１ｍｌの水溶液（４℃）中の５０ｍｇのＣｏｎ
Ａをこの溶液に添加し、そしてその後カップリング用再
利用性被検体（ｒｅａｎａｌｙｔｅ）としての５．５ｍ
ｇのＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドナトリウム
塩（スルホ−ＮＨＳ）および１２ｍｇの１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＣ）を添加した。得られる混合物を一晩反応させた
（４℃）。得られる溶液をリン酸緩衝液、ｐＨ＝７
（０．０８７５Ｍ、ＭｎＣｌ2 ０．１ｍＭ、ＣａＣｌ2
０．１ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ）に対して透析
し、そしてその後水に対して透析した。透析済み溶液を
遠心し（３０分、４℃、１５０００ｒｐｍ）、そしてこ
の上清を凍結乾燥して化学的に修飾されたＣｏｎＡ（３
０ｍｇ）の粉末を取得した。Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボ
キシメチレン−４，４’−ビピリジニウムに関するコン
カナバリンＡの堆積量は、蛋白質分子当たり３つのピリ
ジニウム基に相当する。
【００９６】Ａｕ電極と会合させてある単糖固定化層
は、図２２において示される一連の変換により製造し
た。みがき金電極（領域−３×１０-2ｃｍ2）を２時
間、シスタミンの０．０２Ｍ水溶液で処理した。得られ
るシスタミン修飾電極をその後、この電極固定化層を３
００μＬのリン酸緩衝液 ０．１Ｍ、ｐＨ＝７．３、中
の１ｍｇのｐ−イソチオシアナトフェニルα−Ｄ−マン
ノピラノシドの溶液中に浸すことにより、官能基付加済
み単糖であるｐ−イソチオシアナトフェニルα−Ｄ−マ
ンノピラノシド（図２３の式（１２））と反応させて、
チオ尿素に連結している単糖固定化層電極を得た。
は、図２２において示される一連の変換により製造し
た。みがき金電極（領域−３×１０-2ｃｍ2）を２時
間、シスタミンの０．０２Ｍ水溶液で処理した。得られ
るシスタミン修飾電極をその後、この電極固定化層を３
００μＬのリン酸緩衝液 ０．１Ｍ、ｐＨ＝７．３、中
の１ｍｇのｐ−イソチオシアナトフェニルα−Ｄ−マン
ノピラノシドの溶液中に浸すことにより、官能基付加済
み単糖であるｐ−イソチオシアナトフェニルα−Ｄ−マ
ンノピラノシド（図２３の式（１２））と反応させて、
チオ尿素に連結している単糖固定化層電極を得た。
【００９７】この電気化学的実施例は、作動電極として
単糖固定化層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そ
して参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電
極セル中で実施した。電解質はリン酸緩衝液、０．１Ｍ
（ｐＨ＝８）中の１ｍＭのＫＣｌであり、温度は２０±
１℃であり、そして走査速度は１０００ｍｖ／秒であっ
た。
単糖固定化層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、そ
して参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの電
極セル中で実施した。電解質はリン酸緩衝液、０．１Ｍ
（ｐＨ＝８）中の１ｍＭのＫＣｌであり、温度は２０±
１℃であり、そして走査速度は１０００ｍｖ／秒であっ
た。
【００９８】ＣｏｎＡの様々な濃度、およびレドックス
分子に連結させることにより修飾を施したＣｏｎＡ（修
飾ＣｏｎＡ）の一定濃度をこのセル内に導入した。この
系を２時間平衡化させ、そしてサイクルボルタモグラム
を記録した。
分子に連結させることにより修飾を施したＣｏｎＡ（修
飾ＣｏｎＡ）の一定濃度をこのセル内に導入した。この
系を２時間平衡化させ、そしてサイクルボルタモグラム
を記録した。
【００９９】図２３は、様々なＣｏｎＡ濃度および修飾
ＣｏｎＡの一定濃度（２５μ）における電気化学的応答
を示す。曲線（ａ）はＣｏｎＡの濃度が０Ｍでありそし
て陰極電流が高い場合の電気化学的応答であり、Ｃｏｎ
Ａの濃度は、（ｂ）２．５μＭ、（ｃ）５μＭ、（ｄ）
１０μＭ、（ｅ）２０μＭとなっている。コンカナバリ
ンＡの濃度が上昇するに連れて陰極電流は減少する。
ＣｏｎＡの一定濃度（２５μ）における電気化学的応答
を示す。曲線（ａ）はＣｏｎＡの濃度が０Ｍでありそし
て陰極電流が高い場合の電気化学的応答であり、Ｃｏｎ
Ａの濃度は、（ｂ）２．５μＭ、（ｃ）５μＭ、（ｄ）
１０μＭ、（ｅ）２０μＭとなっている。コンカナバリ
ンＡの濃度が上昇するに連れて陰極電流は減少する。
【０１００】図２４は、未修飾ＣｏｎＡの濃度に対する
修飾ＣｏｎＡの減少に関する電荷の検量曲線を示す。こ
の電荷は、図２５において示されるボルタングラムの還
元もしくは酸化曲線の積分領域を表す。この検量曲線を
使用することによりＣｏｎＡの未知の濃度を１×１０-6
Ｍという低いレベルまで決定することができる。
修飾ＣｏｎＡの減少に関する電荷の検量曲線を示す。こ
の電荷は、図２５において示されるボルタングラムの還
元もしくは酸化曲線の積分領域を表す。この検量曲線を
使用することによりＣｏｎＡの未知の濃度を１×１０-6
Ｍという低いレベルまで決定することができる。
【０１０１】図２５は、未修飾コンカナバリンＡの関数
としての、修飾ＣｏｎＡの還元時に必要とされる陰極電
流を示す。
としての、修飾ＣｏｎＡの還元時に必要とされる陰極電
流を示す。
【０１０２】実施例５：糖−レクチン認識対（間接モー
ド） 糖の層を固定化させた電極の利用によるＣｏｎＡの決定 みがき金電極（領域 ３×１０-2ｃｍ2）を２時間０．
０２Ｍシスタミンの水溶液中に浸した。この電極をＨ2
Ｏで洗浄し、その後室温において、０．１２５ｍｌのＤ
ＭＳＯおよび０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ＝７、中に溶解させてある１．５ｍｇのα−
Ｄ−マンノピラノシルフェニルイソチオシアン酸エステ
ルの溶液中に浸した。
ド） 糖の層を固定化させた電極の利用によるＣｏｎＡの決定 みがき金電極（領域 ３×１０-2ｃｍ2）を２時間０．
０２Ｍシスタミンの水溶液中に浸した。この電極をＨ2
Ｏで洗浄し、その後室温において、０．１２５ｍｌのＤ
ＭＳＯおよび０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩
衝液、ｐＨ＝７、中に溶解させてある１．５ｍｇのα−
Ｄ−マンノピラノシルフェニルイソチオシアン酸エステ
ルの溶液中に浸した。
【０１０３】リン酸一カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．８、
１ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＭｎＣｌ2、０．１ｍＭ
のＣａＣｌ2、１×１０-7ＭのＣｏｎＡからなる溶液
を、１×１０-4Ｍ、１×１０-5Ｍ、１×１０-6Ｍ、１×
１０-7Ｍ、および１×１０-8Ｍのα−Ｄ−マンノピラノ
シドからなる溶液と混合した。この混合物を室温におい
て３０分間インキュベートし、そしてその後修飾電極を
６分間この混合物中に浸した。その後この電極を先と同
一の緩衝液で洗浄し、そして電気化学的測定に用いた。
１ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＭｎＣｌ2、０．１ｍＭ
のＣａＣｌ2、１×１０-7ＭのＣｏｎＡからなる溶液
を、１×１０-4Ｍ、１×１０-5Ｍ、１×１０-6Ｍ、１×
１０-7Ｍ、および１×１０-8Ｍのα−Ｄ−マンノピラノ
シドからなる溶液と混合した。この混合物を室温におい
て３０分間インキュベートし、そしてその後修飾電極を
６分間この混合物中に浸した。その後この電極を先と同
一の緩衝液で洗浄し、そして電気化学的測定に用いた。
【０１０４】この電気化学的実施例は、作動電極として
のマンノピラノシド単一層電極を、対極としてＰｔ−ワ
イヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用
する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．８）中の１ｍＭのＫ4Ｆｅ
（ＣＮ）6（レドックス探索用分子である）および１ｍ
ＭのＫＣｌからできていた。走査速度は２００ｍＶ／ｓ
であった。
のマンノピラノシド単一層電極を、対極としてＰｔ−ワ
イヤーを、そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用
する３つの電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．８）中の１ｍＭのＫ4Ｆｅ
（ＣＮ）6（レドックス探索用分子である）および１ｍ
ＭのＫＣｌからできていた。走査速度は２００ｍＶ／ｓ
であった。
【０１０５】図２６は、様々な濃度のα−Ｄ−マンノピ
ラノジドを含む先のＣｏｎＡ溶液と相互作用させた際
の、マンノース層を固定化させてある電極の電流応答を
示す。この曲線は、このような電極による未知の試料中
のマンノースの分析のための検量曲線として役に立つこ
とができる。
ラノジドを含む先のＣｏｎＡ溶液と相互作用させた際
の、マンノース層を固定化させてある電極の電流応答を
示す。この曲線は、このような電極による未知の試料中
のマンノースの分析のための検量曲線として役に立つこ
とができる。
【０１０６】実施例６：抗原−抗体認識対（直接モー
ド）の可逆的結合 ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）を固定化させた電極
による抗−ＤＮＰ抗体の決定 抗ＤＮＰの親和性は、ジニトロスピロピラン（図２０中
の式１３（ａ））に対しては高いが、その異性体である
ジニトロメロシアニン（図２０中の式１３（ｂ））に対
しては低い。
ド）の可逆的結合 ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）を固定化させた電極
による抗−ＤＮＰ抗体の決定 抗ＤＮＰの親和性は、ジニトロスピロピラン（図２０中
の式１３（ａ））に対しては高いが、その異性体である
ジニトロメロシアニン（図２０中の式１３（ｂ））に対
しては低い。
【０１０７】ジニトロスピロピラン化合物およびその誘
導体は可逆的光異性化特性を示す。３００ｎｍと４００
ｎｍとの間の波長でのジニトロスピロピラン（式１３
（ａ））の照明によりこの化合物はジニトロメロシアニ
ン（式１３（ｂ））に異性化するが、一方で４８０ｎｍ
を上回る領域の可視スペクトルでのジニトロメロシアニ
ンの照射によってはジニトロスピロピランを生じる異性
化がもたらされる。
導体は可逆的光異性化特性を示す。３００ｎｍと４００
ｎｍとの間の波長でのジニトロスピロピラン（式１３
（ａ））の照明によりこの化合物はジニトロメロシアニ
ン（式１３（ｂ））に異性化するが、一方で４８０ｎｍ
を上回る領域の可視スペクトルでのジニトロメロシアニ
ンの照射によってはジニトロスピロピランを生じる異性
化がもたらされる。
【０１０８】ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）の層を
固定化してある電極は、図２６に示されるスキームに従
って製造した。みがき金電極（領域 ３×１０-2ｃ
ｍ2）を２時間，０．２Ｍのシスタミン二塩酸塩水溶液
中に浸した。このシスタミン修飾電極を脱水ＤＭＦで洗
浄し、そしてその後、脱水ＤＭＦ溶液中の、図２０およ
び２７の式１４（ａ）を有する０．２Ｍのスピロピラン
官能基付加済み活性エステル内に浸した。
固定化してある電極は、図２６に示されるスキームに従
って製造した。みがき金電極（領域 ３×１０-2ｃ
ｍ2）を２時間，０．２Ｍのシスタミン二塩酸塩水溶液
中に浸した。このシスタミン修飾電極を脱水ＤＭＦで洗
浄し、そしてその後、脱水ＤＭＦ溶液中の、図２０およ
び２７の式１４（ａ）を有する０．２Ｍのスピロピラン
官能基付加済み活性エステル内に浸した。
【０１０９】ＤＮＳＰ抗原固定化層電極を、抗−ＤＮＰ
−抗体のための電気的免疫センサーとして、そして抗体
の可逆的解離について、その両方を調査した。第一段階
（図２７のａ）におけるＤＮＳＰ電極を、抗原−抗体対
複合体が形成されるように抗−ＤＮＰ−抗体により刺激
し、そしてその後、その第二状態（図２７のｂ）への抗
原の転化および抗体の放出のための４００ｎｍと３００
ｎｍとの間の連続照射、ならびに第一活性状態への固定
化抗原層の回復のための４８０ｎｍを上回る後続照射
（もしくは熱処理）による再利用のための処理を施し
た。
−抗体のための電気的免疫センサーとして、そして抗体
の可逆的解離について、その両方を調査した。第一段階
（図２７のａ）におけるＤＮＳＰ電極を、抗原−抗体対
複合体が形成されるように抗−ＤＮＰ−抗体により刺激
し、そしてその後、その第二状態（図２７のｂ）への抗
原の転化および抗体の放出のための４００ｎｍと３００
ｎｍとの間の連続照射、ならびに第一活性状態への固定
化抗原層の回復のための４８０ｎｍを上回る後続照射
（もしくは熱処理）による再利用のための処理を施し
た。
【０１１０】電気化学的測定は、作動電極としてＤＮＳ
Ｐ抗体固定化層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、
そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの
電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．
０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１ｍＭのＫ4Ｆｅ（Ｃ
Ｎ）6、０．１５ＭのＮａＣｌ、ならびに８μＭの抗−
ＤＮＰからできており、温度は３７±１℃であり、そし
て走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
Ｐ抗体固定化層電極を、対極としてＰｔ−ワイヤーを、
そして参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを使用する３つの
電極セル中で実施した。電解質は、リン酸緩衝液（０．
０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の１ｍＭのＫ4Ｆｅ（Ｃ
Ｎ）6、０．１５ＭのＮａＣｌ、ならびに８μＭの抗−
ＤＮＰからできており、温度は３７±１℃であり、そし
て走査速度は２００ｍＶ／秒であった。
【０１１１】ここでは図２８を参照するが、これは抗−
ＤＮＰ抗体での電極の１６分間のインキュベーション
（ｔ＝０では曲線（ｃ）、ｔ＝１６分の時間では曲線
ｚ）の後のＤＮＳＰ電極のサイクリックボルタングラム
を示している。図２８のａは、抗原がそのもともとの状
態（図２７の状態ａ）にある電極での結果を示している
一方で、図２７のｂは、抗原が二価イオン性メロシアニ
ン立体配座（図２７の状態ｂ）に光異性化している電極
での結果ある。これらの結果は、ＤＮＳＰに結合する抗
体は電極を絶縁状態にさせ、そして電気的応答が減少す
ることを明確に示している。それと比較して、最初の電
極反応（曲線ｃ）と比較するとボルタングラムがほとん
ど変化を示さないままでいるという事実により証拠が示
されるように、この抗体は実際に不活性なメロシアニン
異性体には結合しない。
ＤＮＰ抗体での電極の１６分間のインキュベーション
（ｔ＝０では曲線（ｃ）、ｔ＝１６分の時間では曲線
ｚ）の後のＤＮＳＰ電極のサイクリックボルタングラム
を示している。図２８のａは、抗原がそのもともとの状
態（図２７の状態ａ）にある電極での結果を示している
一方で、図２７のｂは、抗原が二価イオン性メロシアニ
ン立体配座（図２７の状態ｂ）に光異性化している電極
での結果ある。これらの結果は、ＤＮＳＰに結合する抗
体は電極を絶縁状態にさせ、そして電気的応答が減少す
ることを明確に示している。それと比較して、最初の電
極反応（曲線ｃ）と比較するとボルタングラムがほとん
ど変化を示さないままでいるという事実により証拠が示
されるように、この抗体は実際に不活性なメロシアニン
異性体には結合しない。
【０１１２】ここでは図２９を参照するが、これは様々
な電気状態における、対照に対する電流測定応答の変化
を示している。各状態においては電極を１６分間、抗−
ＤＮＰ抗体とインキュベートした。この実施例において
は電極は当初、固定化抗原が二価イオンであるメロシア
ニン立体配座をとっている状態にあった（図２７の立体
配座ｂ）。抗−ＤＮＰ抗体とのインキュベーションの後
に高い電流測定反応（黒塗り丸、表示ａ）を示し、この
ことにより、この抗体は固定化抗体層とは活発には相互
作用を行わないことが示される。４８０ｎｍを上回る波
長でのこの電極の照射により、スピロピラン立体配座
（図２７の立体配座ａ）への抗原の異性化がもたらされ
た。この電極を抗−ＤＮＰ抗体と１６分間インキュベー
トしたところ電極の電流応答の減少がもたらされ（白抜
き四角、表示ｂ）、このことにより電極に対する抗体の
結合ならびにその後の絶縁状態が証明された。３００−
４００ｎｍの間の波長において更に照射を続けると抗原
層がメロシアニン立体配座へと戻る転移がもたらされ、
そしてこの状態においては電極は再び抗−ＤＮＰ抗体
（黒塗り丸、表示ｃ）に対して再び不活性となってお
り、得られる電極の電流応答が高くなることにより電極
表面からの抗体の放出が生じていることが示される。４
８０ｎｍを上回る波長でこの電極を更に照射すると抗原
はスピロピラン立体配座に戻る転移を行い、そしてこの
電極はこの状態において再び抗−ＤＮＰ抗体に結合する
ことができる（白抜き四角、表示ｄ）。したがって、こ
のような電極を反復測定に使用することができる。
な電気状態における、対照に対する電流測定応答の変化
を示している。各状態においては電極を１６分間、抗−
ＤＮＰ抗体とインキュベートした。この実施例において
は電極は当初、固定化抗原が二価イオンであるメロシア
ニン立体配座をとっている状態にあった（図２７の立体
配座ｂ）。抗−ＤＮＰ抗体とのインキュベーションの後
に高い電流測定反応（黒塗り丸、表示ａ）を示し、この
ことにより、この抗体は固定化抗体層とは活発には相互
作用を行わないことが示される。４８０ｎｍを上回る波
長でのこの電極の照射により、スピロピラン立体配座
（図２７の立体配座ａ）への抗原の異性化がもたらされ
た。この電極を抗−ＤＮＰ抗体と１６分間インキュベー
トしたところ電極の電流応答の減少がもたらされ（白抜
き四角、表示ｂ）、このことにより電極に対する抗体の
結合ならびにその後の絶縁状態が証明された。３００−
４００ｎｍの間の波長において更に照射を続けると抗原
層がメロシアニン立体配座へと戻る転移がもたらされ、
そしてこの状態においては電極は再び抗−ＤＮＰ抗体
（黒塗り丸、表示ｃ）に対して再び不活性となってお
り、得られる電極の電流応答が高くなることにより電極
表面からの抗体の放出が生じていることが示される。４
８０ｎｍを上回る波長でこの電極を更に照射すると抗原
はスピロピラン立体配座に戻る転移を行い、そしてこの
電極はこの状態において再び抗−ＤＮＰ抗体に結合する
ことができる（白抜き四角、表示ｄ）。したがって、こ
のような電極を反復測定に使用することができる。
【０１１３】実施例７：抗原−抗体認識対（間接モー
ド） 抗−ＤＮＰ抗体との反応によるそしてＤＮＰ層を固定化
させた電極の利用によるＮε−２，４−ＤＮＰ−リシン
の決定 この電極の製造法は実施例６に記載され、そして図２７
において説明されるように実施した。
ド） 抗−ＤＮＰ抗体との反応によるそしてＤＮＰ層を固定化
させた電極の利用によるＮε−２，４−ＤＮＰ−リシン
の決定 この電極の製造法は実施例６に記載され、そして図２７
において説明されるように実施した。
【０１１４】作用物質溶液は、リン酸緩衝液（０．０１
Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の０．１５ＭＮａＣｌ、および様
々な濃度の抗原Ｎε−２，４−ＤＮＰ−リシン（図２０
の式１９を有する）からできていた。被検体である抗−
ＤＮＰ−抗体（５０μＭ）をこの作用物質溶液に添加
し、そして３７±２℃において５分間混合した。
Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の０．１５ＭＮａＣｌ、および様
々な濃度の抗原Ｎε−２，４−ＤＮＰ−リシン（図２０
の式１９を有する）からできていた。被検体である抗−
ＤＮＰ−抗体（５０μＭ）をこの作用物質溶液に添加
し、そして３７±２℃において５分間混合した。
【０１１５】この電極をλ＞４５０ｎｍの光で照射し
て、固定化抗原単一層が確実に図２６の立体配座ａをと
るようにさせた。その後電極を１８分間抗原溶液中でイ
ンキュベートし、そして蒸留水で洗浄し、そして電気化
学的測定に用いた。
て、固定化抗原単一層が確実に図２６の立体配座ａをと
るようにさせた。その後電極を１８分間抗原溶液中でイ
ンキュベートし、そして蒸留水で洗浄し、そして電気化
学的測定に用いた。
【０１１６】電気化学的測定は、作動電極として、被検
体溶液中での処理後のＤＮＰ−単一層電極を、対極とし
てＰｔ−ワイヤーを、そして対照電極としてＡｇ／Ａｇ
Ｃｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質
は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の
１．１ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス分子であ
る）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温度
は３７±２℃であり、走査速度は２００ｍＶ／秒であっ
た。
体溶液中での処理後のＤＮＰ−単一層電極を、対極とし
てＰｔ−ワイヤーを、そして対照電極としてＡｇ／Ａｇ
Ｃｌを使用する３つの電極セル中で実施した。電解質
は、リン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中の
１．１ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6（レドックス分子であ
る）および０．１５ＭのＮａＣｌからできていた。温度
は３７±２℃であり、走査速度は２００ｍＶ／秒であっ
た。
【０１１７】図２９は、作用物質溶液中の様々な作用物
質濃度における電気的応答の検量曲線を示す。ΔＩ
peは、レドックス探索子のみの存在下における抗原電極
の電流応答と、先に記載の処理後の電極の反応との間
の、様々な抗原濃度に関する差異である。
質濃度における電気的応答の検量曲線を示す。ΔＩ
peは、レドックス探索子のみの存在下における抗原電極
の電流応答と、先に記載の処理後の電極の反応との間
の、様々な抗原濃度に関する差異である。
【０１１８】実施例８： 光エネルギーに対する反応性を示す基による蛋白質修飾
のための方法 光エルギーへの露出に対する反応性を示す基よる蛋白質
の修飾は、一例としては、各々の光異性化可能な活性エ
ステル基の、蛋白質分子の一部分であるリシン残基のア
ミノ基とのカルボジイミドカップリングにより実施し
た。この方法による修飾を施した蛋白質はコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）、パパイン、およびキモトリプシンで
あった。各々の光異性化可能な活性エステルは、Ｎ−プ
ロピオン酸スピロピランのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（式１４（ａ）および１５）、４−カルボキ
シアゾベンゼンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（１６）、およびチオフェネフルギドのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（１７）（これらの式は図２
０に説明してある）である。
のための方法 光エルギーへの露出に対する反応性を示す基よる蛋白質
の修飾は、一例としては、各々の光異性化可能な活性エ
ステル基の、蛋白質分子の一部分であるリシン残基のア
ミノ基とのカルボジイミドカップリングにより実施し
た。この方法による修飾を施した蛋白質はコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）、パパイン、およびキモトリプシンで
あった。各々の光異性化可能な活性エステルは、Ｎ−プ
ロピオン酸スピロピランのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（式１４（ａ）および１５）、４−カルボキ
シアゾベンゼンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（１６）、およびチオフェネフルギドのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（１７）（これらの式は図２
０に説明してある）である。
【０１１９】この修飾法は、０℃において２４−４８時
間、２５０ｍｇのＮａＨＣＯ3を含む６ｍｌの水溶液中
の５０ｍｇの蛋白質を、２００μＬのＴＨＦ中に溶かし
た５−１５ｍｇ（必要とされる積載量に従う）の活性エ
ステルと反応させることにより実施した。
間、２５０ｍｇのＮａＨＣＯ3を含む６ｍｌの水溶液中
の５０ｍｇの蛋白質を、２００μＬのＴＨＦ中に溶かし
た５−１５ｍｇ（必要とされる積載量に従う）の活性エ
ステルと反応させることにより実施した。
【０１２０】図３０は、ＣｏｎＡを光異性化可能な化合
物に連結させることによるＣｏｎＡの修飾の実施例を示
す。活性エステルである、チオフェネフルギド（式１
７）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＣｏｎ
Ａと反応させ、そして得られる溶液を遠心した（１５０
００ｒｐｍ、３０分、４℃）。その後この上清を凍結乾
燥させて修飾蛋白質の粉末を取得した。堆積の度合い
は、修飾蛋白質に会合した発色団の吸光度測定（ε ２
２００ｃｍ-1、λ＝５３２ｎｍ）、およびローリー方
（Ｌｏｗｒｙ、Ｏ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． １０３、２６５（１９５１））による各試
料中の総蛋白質含有量の決定を初めとする常法により決
定した。
物に連結させることによるＣｏｎＡの修飾の実施例を示
す。活性エステルである、チオフェネフルギド（式１
７）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＣｏｎ
Ａと反応させ、そして得られる溶液を遠心した（１５０
００ｒｐｍ、３０分、４℃）。その後この上清を凍結乾
燥させて修飾蛋白質の粉末を取得した。堆積の度合い
は、修飾蛋白質に会合した発色団の吸光度測定（ε ２
２００ｃｍ-1、λ＝５３２ｎｍ）、およびローリー方
（Ｌｏｗｒｙ、Ｏ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． １０３、２６５（１９５１））による各試
料中の総蛋白質含有量の決定を初めとする常法により決
定した。
【０１２１】全ての修飾蛋白質は、実質的に可逆的な様
式で第一状態から第二状態へと、そして第二状態から第
一状態へと転化させることができ、そしてこれらの状態
を分光法により追跡した。
式で第一状態から第二状態へと、そして第二状態から第
一状態へと転化させることができ、そしてこれらの状態
を分光法により追跡した。
【０１２２】実施例９：感度の増大 抗−ＩｇＥ抗体を用いる抗−ＤＮＰ−抗体分析の感度の
増加 ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）の層を固定化させた
電極は、実施例６に記載されそして図２７に説明される
方法により製造した。ＤＮＳＰ電極は様々な期間にわた
って１００μＭの抗−ＤＮＰ−抗体を含む溶液で刺激し
たが、この際に、抗原−抗体対複合体が電極表面上に形
成した（インキュベーションの期間が長いほど複合体形
成の量が多くなる）。その後様々な電極について、実施
例６において記載される電気化学的セル中での電気化学
的分析を実施した。これらの電極の電流応答を記録し
た。
増加 ジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）の層を固定化させた
電極は、実施例６に記載されそして図２７に説明される
方法により製造した。ＤＮＳＰ電極は様々な期間にわた
って１００μＭの抗−ＤＮＰ−抗体を含む溶液で刺激し
たが、この際に、抗原−抗体対複合体が電極表面上に形
成した（インキュベーションの期間が長いほど複合体形
成の量が多くなる）。その後様々な電極について、実施
例６において記載される電気化学的セル中での電気化学
的分析を実施した。これらの電極の電流応答を記録し
た。
【０１２３】その後電極を３７℃において１０分間、
２．５ｍｇ／ｍｌの抗−マウスＩｇＥ抗体を含むＰＢＳ
緩衝溶液中でインキュベートした。（この抗−ＤＮＰ−
抗体はマウスＩｇＥであり、そしてそのため抗−マウス
ＩｇＥは電極表面に結合した抗−ＤＮＰ−抗体上に複合
体を形成する）。その後これらの電極を実施例６に記載
される電気化学的セルに移し、そして電極の電流応答を
記録した。
２．５ｍｇ／ｍｌの抗−マウスＩｇＥ抗体を含むＰＢＳ
緩衝溶液中でインキュベートした。（この抗−ＤＮＰ−
抗体はマウスＩｇＥであり、そしてそのため抗−マウス
ＩｇＥは電極表面に結合した抗−ＤＮＰ−抗体上に複合
体を形成する）。その後これらの電極を実施例６に記載
される電気化学的セルに移し、そして電極の電流応答を
記録した。
【０１２４】ここでは図１を参照するが、この図におい
てはΔｉ(1) pcは、電極を抗−ＤＮＰ−抗体で刺激した
後の電極の電流応答の変化を表し（この刺激の前の反応
と比較するもの）、そしてΔｉ(2) pcは、抗マウスＩｇ
Ｅ抗体での第二刺激後の電流応答の変化を表す。この図
に示されるように、Δｉ(1) pc（Ｘ−軸）の値と、Δｉ
(2) pc（Ｙ−軸）の値とは直線関係を示す。このプロッ
トの傾きは抗−ＩｇＥ抗体での刺激後の電極の感度の増
幅因子を表す。この事例においては、感度は約２．３の
因子により増幅された。
てはΔｉ(1) pcは、電極を抗−ＤＮＰ−抗体で刺激した
後の電極の電流応答の変化を表し（この刺激の前の反応
と比較するもの）、そしてΔｉ(2) pcは、抗マウスＩｇ
Ｅ抗体での第二刺激後の電流応答の変化を表す。この図
に示されるように、Δｉ(1) pc（Ｘ−軸）の値と、Δｉ
(2) pc（Ｙ−軸）の値とは直線関係を示す。このプロッ
トの傾きは抗−ＩｇＥ抗体での刺激後の電極の感度の増
幅因子を表す。この事例においては、感度は約２．３の
因子により増幅された。
【０１２５】実施例１０：金以外の電極の利用 インジウム−すずオキシド（ＩＴＯ）ガラスでできてい
る電極を、その電極を、アセトン、トルエン、もしくは
ベンゼンのような有機溶媒に関して１％（ｖ／ｖ）の３
−アミノプロピルトリエトキシシランと共にインキュベ
ートすることによって修飾する。インキュベーションの
後には、この連結基が電極上に固定化される。その後、
様々な抗原および蛋白質を、この連結基のアミノ残基を
介して固定化することができる。
る電極を、その電極を、アセトン、トルエン、もしくは
ベンゼンのような有機溶媒に関して１％（ｖ／ｖ）の３
−アミノプロピルトリエトキシシランと共にインキュベ
ートすることによって修飾する。インキュベーションの
後には、この連結基が電極上に固定化される。その後、
様々な抗原および蛋白質を、この連結基のアミノ残基を
介して固定化することができる。
【０１２６】本発明の主な特徴または態様は以下のとお
りである。
りである。
【０１２７】１． 認識対の一構成員が固定化されてい
る電極を含み、該対の他の構成員が該被検体であり、媒
質中の該被検体の存在により該固定化構成員と該被検体
との間の複合体である対複合体の形成がもたらされ、そ
して更に電極から電子を受容するかもしくは電極に電子
を供与することによりレドックス状態を変化させること
が可能なレドックス分子を含み、電極上の対複合体の形
成がその系の電気的応答に変化を及ぼし、このことによ
り媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を
決定することができる、液体媒質中の被検体の存在およ
び場合によっては濃度の決定のための電気生化学系。
る電極を含み、該対の他の構成員が該被検体であり、媒
質中の該被検体の存在により該固定化構成員と該被検体
との間の複合体である対複合体の形成がもたらされ、そ
して更に電極から電子を受容するかもしくは電極に電子
を供与することによりレドックス状態を変化させること
が可能なレドックス分子を含み、電極上の対複合体の形
成がその系の電気的応答に変化を及ぼし、このことによ
り媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃度を
決定することができる、液体媒質中の被検体の存在およ
び場合によっては濃度の決定のための電気生化学系。
【０１２８】２． 被検体が認識対の内の一つであり、
その対が抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプ
ター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレ
オチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴ
ヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる群から
選択され、電極上の固定化構成員が該対の内の他方のも
のである、上記被検体の決定に利用する、上記１に記載
の系。
その対が抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レセプ
ター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌクレ
オチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オリゴ
ヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる群から
選択され、電極上の固定化構成員が該対の内の他方のも
のである、上記被検体の決定に利用する、上記１に記載
の系。
【０１２９】３． 作用物質が該被検体である、試料中
の作用物質の決定のための、上記１もしくは２に記載の
系。
の作用物質の決定のための、上記１もしくは２に記載の
系。
【０１３０】４． 該作用物質が該被検体とは異なり、
該対複合体の形成の結果としての電気的応答の該変化が
試料中の該作用物質の間接的決定に役立つ、生物学的試
料中の作用物質の決定のための、上記１もしくは２に記
載の系。
該対複合体の形成の結果としての電気的応答の該変化が
試料中の該作用物質の間接的決定に役立つ、生物学的試
料中の作用物質の決定のための、上記１もしくは２に記
載の系。
【０１３１】５． 該レドックス分子が溶液中を自由に
動き回る、上記１−４の内のいずれか一つに記載の系。
動き回る、上記１−４の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３２】６． 該レドックス分子が被検体分子に連
結されている、上記１−４の内のいずれか一つに記載の
系。
結されている、上記１−４の内のいずれか一つに記載の
系。
【０１３３】７． 電極物質が金、プラチナ、もしくは
銀である、上記１−６の内のいずれか一つに記載の系。
銀である、上記１−６の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３４】８． 電極物質が導電ガラスである、上記
１−６の内のいずれか一つに記載の系。
１−６の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３５】９． 認識対の固定化構成員が光エネルギ
ーへの露出に対して反応性を示す基を有しているもしく
はそれに連結されており、該基は第一および第二状態を
有し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態
から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出に
より第二状態から第一状態へと転化することが可能であ
り、この露出により該被検体への結合についての固定化
構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一
状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い
結合親和性を有するために、この被検体が本質的に固定
化構成員に結合したままになっており、そして該第二状
態である場合には該固定化構成員は該被検体ヘの低い結
合親和性を有するために、結合した被検体が容易に解離
する、上記１−８の内のいずれか一つに記載の系。
ーへの露出に対して反応性を示す基を有しているもしく
はそれに連結されており、該基は第一および第二状態を
有し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態
から第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出に
より第二状態から第一状態へと転化することが可能であ
り、この露出により該被検体への結合についての固定化
構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一
状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い
結合親和性を有するために、この被検体が本質的に固定
化構成員に結合したままになっており、そして該第二状
態である場合には該固定化構成員は該被検体ヘの低い結
合親和性を有するために、結合した被検体が容易に解離
する、上記１−８の内のいずれか一つに記載の系。
【０１３６】１０．以下に示す、（ａ）認識対の一構成
員を固定化させた電極（該対の他の構成員は該被検体で
ある）を、決定すべき被検体を含む媒質ならびにその電
極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与する
ことによりレドックス状態を変化させることが可能なレ
ドックス分子と接触させること、（ｂ）該溶液との接触
の結果として電気的応答の変化を測定すること（このこ
とにより該被検体の存在および場合によっては濃度を決
定することが可能である）、を含む、液体媒質中の被検
体の存在および場合によっては濃度の決定のための方
法。
員を固定化させた電極（該対の他の構成員は該被検体で
ある）を、決定すべき被検体を含む媒質ならびにその電
極から電子を受容するかもしくは電極に電子を供与する
ことによりレドックス状態を変化させることが可能なレ
ドックス分子と接触させること、（ｂ）該溶液との接触
の結果として電気的応答の変化を測定すること（このこ
とにより該被検体の存在および場合によっては濃度を決
定することが可能である）、を含む、液体媒質中の被検
体の存在および場合によっては濃度の決定のための方
法。
【０１３７】１１．該固定化構成員が該対の内の他方の
ものである、抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レ
セプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌ
クレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オ
リゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる対
の群の内の一つの認識対である被検体の決定のための、
上記１０に記載の方法。
ものである、抗原−抗体、糖−レクチン、リガンド−レ
セプター、ビオチン−アビジン、酵素−基質、オリゴヌ
クレオチド−ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド−蛋白質、オ
リゴヌクレオチド−細胞、および基質−酵素よりなる対
の群の内の一つの認識対である被検体の決定のための、
上記１０に記載の方法。
【０１３８】１２．該作用物質が該被検体であり、そし
て電極を、該作用物質を含む該試料もしくはその分画と
接触させることを含む、ある試料中の作用物質の決定の
ための、上記１０もしくは１１に記載の方法。
て電極を、該作用物質を含む該試料もしくはその分画と
接触させることを含む、ある試料中の作用物質の決定の
ための、上記１０もしくは１１に記載の方法。
【０１３９】１３．作用物質が該被検体以外の分子であ
り、該作用物質を含む溶液の試薬溶液との接触により、
試薬溶液中の該被検体の形成、もしくは該試薬溶液中の
遊離被検体濃度の減少のいずれかがもたらされ、そして
以下に示す、（ａ）該作用物質を含む該試料もしくはそ
の分画を該試薬溶液と接触させること、（ｂ）電極を反
応（ａ）の産物と接触させること、（ｃ）電極の該反応
産物との接触によりもたらされる電気的応答の変化を測
定し、このことにより該試料中の該作用物質の存在およ
び場合によっては濃度を決定すること、を含む、ある試
料中の作用物質の決定のための、上記１０もしくは１２
に記載の方法。
り、該作用物質を含む溶液の試薬溶液との接触により、
試薬溶液中の該被検体の形成、もしくは該試薬溶液中の
遊離被検体濃度の減少のいずれかがもたらされ、そして
以下に示す、（ａ）該作用物質を含む該試料もしくはそ
の分画を該試薬溶液と接触させること、（ｂ）電極を反
応（ａ）の産物と接触させること、（ｃ）電極の該反応
産物との接触によりもたらされる電気的応答の変化を測
定し、このことにより該試料中の該作用物質の存在およ
び場合によっては濃度を決定すること、を含む、ある試
料中の作用物質の決定のための、上記１０もしくは１２
に記載の方法。
【０１４０】１４．該被検体が、該作用物質に結合する
分子である、上記１３に記載の方法。
分子である、上記１３に記載の方法。
【０１４１】１５．該作用物質が固定化構成員と同一の
該被検体への結合特性を有する、上記１４に記載の方
法。
該被検体への結合特性を有する、上記１４に記載の方
法。
【０１４２】１６．該作用物質が、（ｉ）酵素によりそ
れらの内の一つが該作用物質である複数の産物へと分解
されるか、あるいは（ｉｉ）酵素により該作用物質へと
転化する前駆体分子であるか、のいずれかである分子で
あり、該試薬溶液が該酵素を含む、上記１３に記載の方
法。
れらの内の一つが該作用物質である複数の産物へと分解
されるか、あるいは（ｉｉ）酵素により該作用物質へと
転化する前駆体分子であるか、のいずれかである分子で
あり、該試薬溶液が該酵素を含む、上記１３に記載の方
法。
【０１４３】１７．レドックス分子が溶液中を自由に動
き回る、上記１０−１６の内のいずれか一つに記載の方
法。
き回る、上記１０−１６の内のいずれか一つに記載の方
法。
【０１４４】１８．レドックス分子が、レドックス分子
に連結している被検体分子を含む修飾被検体の一部分を
形成する、上記１０−１６の内のいずれか一つに記載の
方法。
に連結している被検体分子を含む修飾被検体の一部分を
形成する、上記１０−１６の内のいずれか一つに記載の
方法。
【０１４５】１９．電極を、決定すべきものである被検
体を含む媒質と該修飾被検体とに同時に接触させる、上
記１８に記載の方法。
体を含む媒質と該修飾被検体とに同時に接触させる、上
記１８に記載の方法。
【０１４６】２０．電極を最初に、決定すべきのもであ
る被検体を含む媒質に、次に該修飾被検体に接触させ
る、上記１８に記載の方法。
る被検体を含む媒質に、次に該修飾被検体に接触させ
る、上記１８に記載の方法。
【０１４７】２１．認識対の固定化構成員が光エネルギ
ーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそ
れに連結されており、該基は第一および第二状態を有
し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態か
ら第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出によ
り第二状態から第一状態へと転化することが可能であ
り、この露出により該被検体への結合についての固定化
構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一
状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い
結合親和性を有するために、この被検体は本質的に固定
化構成員に結合したままになっており、そして該第二状
態である場合には固定化構成員は該被検体ヘの低い結合
親和性を有するために、結合した被検体は容易に解離
し、かつ（ａ）該電極を該媒質に接触させ、そして該電
気的応答を測定すること、（ｂ）該電極を該第一波長を
有する光で照射すること、（ｃ）電極を取り囲む媒質か
ら被検体分子を取り除くように電極をすすぐこと、そし
て（ｄ）該電極を該第二波長を有する光で照射し、この
ことにより電極の再利用のための準備が整うこと、を含
む、上記１０−２０の内のいずれか一つに記載の方法。
ーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそ
れに連結されており、該基は第一および第二状態を有
し、そして第一波長の光照射への露出により第一状態か
ら第二状態へと、そして第二波長の光照射への露出によ
り第二状態から第一状態へと転化することが可能であ
り、この露出により該被検体への結合についての固定化
構成員の親和性の変化が誘導され、このことにより第一
状態にある場合には該固定化構成員が該被検体への高い
結合親和性を有するために、この被検体は本質的に固定
化構成員に結合したままになっており、そして該第二状
態である場合には固定化構成員は該被検体ヘの低い結合
親和性を有するために、結合した被検体は容易に解離
し、かつ（ａ）該電極を該媒質に接触させ、そして該電
気的応答を測定すること、（ｂ）該電極を該第一波長を
有する光で照射すること、（ｃ）電極を取り囲む媒質か
ら被検体分子を取り除くように電極をすすぐこと、そし
て（ｄ）該電極を該第二波長を有する光で照射し、この
ことにより電極の再利用のための準備が整うこと、を含
む、上記１０−２０の内のいずれか一つに記載の方法。
【０１４８】２２．認識対の固定化構成員が光エネルギ
ーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそ
れに連結されており、該基は第一および第二状態を有
し、そして緩和な熱処理により第一状態から第二状態へ
転化することが可能であり、この露出により該被検体へ
の結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導さ
れ、このことにより第一状態にある場合には該固定化構
成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、こ
の被検体は本質的に固定化構成員に結合したままになっ
ており、そして該第二状態である場合には固定化構成員
は該被検体ヘの低い結合親和性を有するために、結合し
た被検体は容易に解離し、かつ（ａ）該電極を該媒質に
接触させ、そして該電気的応答を測定すること、（ｂ）
該電極を該第一波長を有する光で照射すること、（ｃ）
電極を取り囲む媒質から被検体分子を取り除くように電
極をすすぐこと、そして（ｄ）電極を緩和な熱処理に供
し、このことにより電極の再利用のための準備が整うこ
と、を含む、上記１０−２０の内のいずれか一つに記載
の方法。
ーへの露出に対して反応性を示す基を有するもしくはそ
れに連結されており、該基は第一および第二状態を有
し、そして緩和な熱処理により第一状態から第二状態へ
転化することが可能であり、この露出により該被検体へ
の結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導さ
れ、このことにより第一状態にある場合には該固定化構
成員が該被検体への高い結合親和性を有するために、こ
の被検体は本質的に固定化構成員に結合したままになっ
ており、そして該第二状態である場合には固定化構成員
は該被検体ヘの低い結合親和性を有するために、結合し
た被検体は容易に解離し、かつ（ａ）該電極を該媒質に
接触させ、そして該電気的応答を測定すること、（ｂ）
該電極を該第一波長を有する光で照射すること、（ｃ）
電極を取り囲む媒質から被検体分子を取り除くように電
極をすすぐこと、そして（ｄ）電極を緩和な熱処理に供
し、このことにより電極の再利用のための準備が整うこ
と、を含む、上記１０−２０の内のいずれか一つに記載
の方法。
【０１４９】２３．被検体分子が大きな分子もしくは群
をなす分子と結合しているもしくは複合体形成してお
り、このことにより感度が上昇する、上記１０−２２の
内のいずれか一つに記載の方法。
をなす分子と結合しているもしくは複合体形成してお
り、このことにより感度が上昇する、上記１０−２２の
内のいずれか一つに記載の方法。
【０１５０】２４．電極が認識対の一構成員の層を固定
化させた電極物質を含み、該対の他の構成員が該被検体
であり、電極物質がレドックス分子との電気通信が可能
であり、その電気通信が該被検体の固定化構成員への結
合により修正され、このことにより電極を取り囲む媒質
中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定す
ることができる、液体媒質中の被検体の存在および場合
によっては濃度の決定において利用するための電極。
化させた電極物質を含み、該対の他の構成員が該被検体
であり、電極物質がレドックス分子との電気通信が可能
であり、その電気通信が該被検体の固定化構成員への結
合により修正され、このことにより電極を取り囲む媒質
中の該被検体の存在および場合によっては濃度を決定す
ることができる、液体媒質中の被検体の存在および場合
によっては濃度の決定において利用するための電極。
【０１５１】２５．電極がレドックス分子との電気通信
が可能な電極物質を含み、その電極物質上に認識対の一
構成員の層が固定化されており、この対の他の構成員が
被検体であり、レドックス分子と電極物質との間の電気
通信が該被検体への該構成員の結合により修正され、固
定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示
す基を有するもしくはそれに連結されており、該基は第
一および第二状態を有し、そして第一波長の光の照射へ
の露出によ第一状態から第二状態へと、そして第二波長
の光の照射への露出により第二状態から第一状態へと転
化することが可能であり、この露出により該被検体への
結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導さ
れ、このことにより第一状態にある場合には該固定化構
成員は該作用物質に対して高い結合親和性を有するため
に、結合被検体は容易に解離せず、そして該第二状態に
ある場合には該固定化構成員は該被検体に対する低い結
合親和性を有するため、結合作用物質は容易に解離し、
そしてこれをこの系から取り除くことができ、そしてそ
の後に電極を該第一状態に変化を誘導する第二波長の光
に露出することができ、このことによりこの電極の再使
用の用意を整えることができ、このことにより電極を取
り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃
度を再度決定することが可能である、液体媒質中の被検
体の存在および場合によっては濃度の決定のための先の
電気生化学系における利用のための実質的に再使用可能
な電極。
が可能な電極物質を含み、その電極物質上に認識対の一
構成員の層が固定化されており、この対の他の構成員が
被検体であり、レドックス分子と電極物質との間の電気
通信が該被検体への該構成員の結合により修正され、固
定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示
す基を有するもしくはそれに連結されており、該基は第
一および第二状態を有し、そして第一波長の光の照射へ
の露出によ第一状態から第二状態へと、そして第二波長
の光の照射への露出により第二状態から第一状態へと転
化することが可能であり、この露出により該被検体への
結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導さ
れ、このことにより第一状態にある場合には該固定化構
成員は該作用物質に対して高い結合親和性を有するため
に、結合被検体は容易に解離せず、そして該第二状態に
ある場合には該固定化構成員は該被検体に対する低い結
合親和性を有するため、結合作用物質は容易に解離し、
そしてこれをこの系から取り除くことができ、そしてそ
の後に電極を該第一状態に変化を誘導する第二波長の光
に露出することができ、このことによりこの電極の再使
用の用意を整えることができ、このことにより電極を取
り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によっては濃
度を再度決定することが可能である、液体媒質中の被検
体の存在および場合によっては濃度の決定のための先の
電気生化学系における利用のための実質的に再使用可能
な電極。
【０１５２】２６．光エネルギーへの露出に対して反応
性を示す該基を、アゾベンゼン類、スピロピラン類、フ
ルギド類、チオフェネフルギド類、およびマラカイトグ
リーンよりなる群から選択する、上記２５に記載の電
極。
性を示す該基を、アゾベンゼン類、スピロピラン類、フ
ルギド類、チオフェネフルギド類、およびマラカイトグ
リーンよりなる群から選択する、上記２５に記載の電
極。
【０１５３】２７．以下に示す、（ａ）該連結基を、金
属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしく
は官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付
着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させる
こと、（ｂ）固定化すべき認識対の一構成員を連結基の
該官能基に結合させること、を含む、上記２５に記載の
電極の製造のための方法。
属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしく
は官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付
着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させる
こと、（ｂ）固定化すべき認識対の一構成員を連結基の
該官能基に結合させること、を含む、上記２５に記載の
電極の製造のための方法。
【０１５４】２８．固定化すべき認識対の一構成員を連
結基の該官能基に結合させ、そして該連結基を、金属も
しくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官
能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付着、も
しくは化学吸着により電極物質上に固定化させることを
含む、上記２５に記載の電極の製造のための方法。
結基の該官能基に結合させ、そして該連結基を、金属も
しくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしくは官
能基付加済みアルコキシシラン各々の化学会合付着、も
しくは化学吸着により電極物質上に固定化させることを
含む、上記２５に記載の電極の製造のための方法。
【０１５５】２９．以下に示す、（ａ）該連結基を、金
属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしく
は官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学的会合付
着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させる
こと、（ｂ）該認識対の一構成員を光異性化可能物質で
化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エネ
ルギーへの露出により認識対の他の構成員に対する結合
を変化させること、および（ｃ）認識対の修飾構成員を
電極上に固定化させた連結基の該官能基に結合させるこ
と、を含む、上記２６に記載の電極の製造のための方
法。
属もしくはガラス電極物質へのイオウ含有性部分もしく
は官能基付加済みアルコキシシラン各々の化学的会合付
着、もしくは化学吸着により電極物質上に固定化させる
こと、（ｂ）該認識対の一構成員を光異性化可能物質で
化学的に修飾し、このことにより修飾構成員が、光エネ
ルギーへの露出により認識対の他の構成員に対する結合
を変化させること、および（ｃ）認識対の修飾構成員を
電極上に固定化させた連結基の該官能基に結合させるこ
と、を含む、上記２６に記載の電極の製造のための方
法。
【０１５６】３０．段階（ｃ）が段階（ｂ）の前にく
る、項目２９に記載の方法。
る、項目２９に記載の方法。
【０１５７】３１．段階（ｂ）が段階（ａ）の前にくる
項目３０に記載の方法。
項目３０に記載の方法。
【図１】図１は、本発明の直接モードに従う態様に従う
電極表面の概略図であり、この場合、認識対の一構成員
が電極（ａ）の表面上に固定化されており、この電極を
レッドクス分子Ｒ+／Ｒを含む液体媒質中に浸し、そし
てこの後に認識対の被検体構成員の既知の濃度を含む溶
液で刺激し、この被検体構成員はその後該表面（ｂ）上
に固定化された認識対の相手側構成員と結合する。この
結合により電気的応答の減少がもたらされる。
電極表面の概略図であり、この場合、認識対の一構成員
が電極（ａ）の表面上に固定化されており、この電極を
レッドクス分子Ｒ+／Ｒを含む液体媒質中に浸し、そし
てこの後に認識対の被検体構成員の既知の濃度を含む溶
液で刺激し、この被検体構成員はその後該表面（ｂ）上
に固定化された認識対の相手側構成員と結合する。この
結合により電気的応答の減少がもたらされる。
【図２】図２は、本発明の直接モードの他の態様の概略
図であり、この場合、認識対の一構成員を電極（ａ）の
表面上に固定化し、そしてこれを次に認識対の被検体構
成員の未知の濃度を含む溶液により刺激する（段階
（１））。被検体による幾つかの固定化部位の結合が生
じ（ｂ）、そしてその後この電極を、レドックス分子Ｒ
に連結させることにより修飾を施した被検体により刺激
する（段階（２））。該修飾被検体による結合（ｃ）に
より電気的応答（ｄ）が生じ、この電気的応答の程度は
段階１後に残存する空の部位の数に依存し、これは次に
は被検体の濃度に依存している。
図であり、この場合、認識対の一構成員を電極（ａ）の
表面上に固定化し、そしてこれを次に認識対の被検体構
成員の未知の濃度を含む溶液により刺激する（段階
（１））。被検体による幾つかの固定化部位の結合が生
じ（ｂ）、そしてその後この電極を、レドックス分子Ｒ
に連結させることにより修飾を施した被検体により刺激
する（段階（２））。該修飾被検体による結合（ｃ）に
より電気的応答（ｄ）が生じ、この電気的応答の程度は
段階１後に残存する空の部位の数に依存し、これは次に
は被検体の濃度に依存している。
【図３】図３は、図２の態様の変法の該略図であり、こ
の場合、認識対の一構成員は電極表面上に固定化されて
おり、これをその後、（ｉ）認識対の被検体構成員の未
知の濃度を含む溶液と、（ｉｉ）レドックス分子（ａ）
を連結させることにより修飾を施した被検体構成員との
両方で同時に刺激する。被検体および修飾被検体の各濃
度に依存する競合的結合が生じて電気的応答（ｂ）が産
生され、これが結局は（ｉ）の濃度に依存する電気的応
答（ｃ）を誘導する。
の場合、認識対の一構成員は電極表面上に固定化されて
おり、これをその後、（ｉ）認識対の被検体構成員の未
知の濃度を含む溶液と、（ｉｉ）レドックス分子（ａ）
を連結させることにより修飾を施した被検体構成員との
両方で同時に刺激する。被検体および修飾被検体の各濃
度に依存する競合的結合が生じて電気的応答（ｂ）が産
生され、これが結局は（ｉ）の濃度に依存する電気的応
答（ｃ）を誘導する。
【図４】図４は、各々図２および図３に類似する態様の
概略図であり、この場合、図２および図３の被検体は固
定化構成員である一方、図２および図３の固定化構成員
がここでは被検体となっている。
概略図であり、この場合、図２および図３の被検体は固
定化構成員である一方、図２および図３の固定化構成員
がここでは被検体となっている。
【図５】図４と同様な概略図である。
【図６】図６は、本発明の直接モードの更に別の態様の
概略図であり、この場合、固定化構成員を光エネルギー
への露出に反応性を示す基に連結することにより修飾す
る。この基は２つの異性化状態を有するが、これらは図
中ではＡおよびＶとして示されており、そして図６のｃ
において説明されるようにこれは光エネルギーｈν1へ
の露出によりＡからＢへと切り替わり、そして光エネル
ギーｈν2ヘの露出により切り替わってＢからＡへと戻
る。適切な波長の光への露出により、修飾を施した固定
化構成員は立体配座変化を受け、これは被検体に対する
結合親和性を変化させ、そしてそのために、被検体の結
合後この修飾を施した固定化構成員が放出され、そして
すすぎの後にこれは再使用のためにもともとの状態に転
化することが可能となる。図６のａおよびｂは操作周期
を説明しているが、これら２つの図の間の違いは、図６
のａとｂとにおける被検体と固定化構成員の役割が逆転
していることであり、これはつまり、図６のａの被検体
が図６のｂの固定化構成員であり、そしてその逆もまた
同じであるということである。
概略図であり、この場合、固定化構成員を光エネルギー
への露出に反応性を示す基に連結することにより修飾す
る。この基は２つの異性化状態を有するが、これらは図
中ではＡおよびＶとして示されており、そして図６のｃ
において説明されるようにこれは光エネルギーｈν1へ
の露出によりＡからＢへと切り替わり、そして光エネル
ギーｈν2ヘの露出により切り替わってＢからＡへと戻
る。適切な波長の光への露出により、修飾を施した固定
化構成員は立体配座変化を受け、これは被検体に対する
結合親和性を変化させ、そしてそのために、被検体の結
合後この修飾を施した固定化構成員が放出され、そして
すすぎの後にこれは再使用のためにもともとの状態に転
化することが可能となる。図６のａおよびｂは操作周期
を説明しているが、これら２つの図の間の違いは、図６
のａとｂとにおける被検体と固定化構成員の役割が逆転
していることであり、これはつまり、図６のａの被検体
が図６のｂの固定化構成員であり、そしてその逆もまた
同じであるということである。
【図７】図７は、生物学的試料中の作用物質の決定のた
めの本発明の間接モードに従う態様を示し、この作用物
質は固定化構成員と相同である。この態様においては、
未知の試料をまず第一に被検体と反応させ、そしてその
後この被検体の決定値が、生物学的試料中の作用物質の
ための間接的測定値として役立つ。
めの本発明の間接モードに従う態様を示し、この作用物
質は固定化構成員と相同である。この態様においては、
未知の試料をまず第一に被検体と反応させ、そしてその
後この被検体の決定値が、生物学的試料中の作用物質の
ための間接的測定値として役立つ。
【図８】図８は、本発明の間接モードに従う態様の概略
図であり、これは図７のものに類似するが、違いは、こ
の場合においては検査用作用物質が固定化構成員と相同
ではないが、固定化構成員と類似する被検体への結合親
和性を有しているということである。
図であり、これは図７のものに類似するが、違いは、こ
の場合においては検査用作用物質が固定化構成員と相同
ではないが、固定化構成員と類似する被検体への結合親
和性を有しているということである。
【図９】図９は、固定化構成員に結合しない産物へと被
検体を破壊することが可能な酵素の決定のための本発明
の間接モードに従う態様の概略図である。被検体を未知
の試料と反応させた後に、被検体の一部分が生物学的試
料中の酵素の量に依存して分解し、そしてその後被検体
の決定により試料中の酵素の間接的決定が可能になる。
検体を破壊することが可能な酵素の決定のための本発明
の間接モードに従う態様の概略図である。被検体を未知
の試料と反応させた後に、被検体の一部分が生物学的試
料中の酵素の量に依存して分解し、そしてその後被検体
の決定により試料中の酵素の間接的決定が可能になる。
【図１０】図１０は、図９の態様に類似する本発明の間
接モードに従う態様を説明しており、違いは、前駆体被
検体を後にある系内において決定される被検体へと転化
させる反応の異化作用を酵素が行うということである。
ここでもまた、被検体の決定により生物学的試料中の酵
素の間接的決定が可能となる。
接モードに従う態様を説明しており、違いは、前駆体被
検体を後にある系内において決定される被検体へと転化
させる反応の異化作用を酵素が行うということである。
ここでもまた、被検体の決定により生物学的試料中の酵
素の間接的決定が可能となる。
【図１１】図１１は、本発明の間接モードの更に別の態
様を説明しており、この場合、被検体はある酵素反応の
産物であり、この酵素反応においては生物学的試料中に
存在する前駆体被検体が、その後ある系において決定さ
れる被検体へとある酵素により転化され、この被検体の
決定により生物学的試料中の検査作用物質である前駆体
被検体の間接測定物が提供される。
様を説明しており、この場合、被検体はある酵素反応の
産物であり、この酵素反応においては生物学的試料中に
存在する前駆体被検体が、その後ある系において決定さ
れる被検体へとある酵素により転化され、この被検体の
決定により生物学的試料中の検査作用物質である前駆体
被検体の間接測定物が提供される。
【図１２】図１２は、本発明の一つの態様を説明してお
り、この場合、感度が結合被検体上での分子複合物の形
成により増大する。
り、この場合、感度が結合被検体上での分子複合物の形
成により増大する。
【図１３】図１３は、実施例１において記載される金電
極の修飾の方法を説明する。
極の修飾の方法を説明する。
【図１４】図１４は、抗−ＤＮＰ抗体の非存在下（曲線
ａ）および抗−ＤＮＰ抗体の様々な濃度（曲線ｂ−ｅ）
での、実施例１のＤＮＰ電極のサイクリックボルタング
ラム反応を示す。
ａ）および抗−ＤＮＰ抗体の様々な濃度（曲線ｂ−ｅ）
での、実施例１のＤＮＰ電極のサイクリックボルタング
ラム反応を示す。
【図１５】図１５は、対照（抗体なし）に対する様々な
抗体濃度におけるピークの電流反応の変化（ΔＩpc）を
示す。
抗体濃度におけるピークの電流反応の変化（ΔＩpc）を
示す。
【図１６】図１６は、実施例２に記載される金電極上の
フルオレセイン単一層の固定化の方法を説明する。
フルオレセイン単一層の固定化の方法を説明する。
【図１７】図１７は、実施例２において記載される様々
な抗−フルオレセイン抗体濃度における最大電流の変化
（ΔＩpc）を示す。
な抗−フルオレセイン抗体濃度における最大電流の変化
（ΔＩpc）を示す。
【図１８】図１８は、実施例３において記載される様式
における金電極（図１８のｂ）上に固定化された抗原性
ペプチド（図１８のａ）を示す。
における金電極（図１８のｂ）上に固定化された抗原性
ペプチド（図１８のａ）を示す。
【図１９】図１９は、抗−ペプチド抗体の添加後の、時
間０（曲線Ａ）、３分後（曲線Ｂ）、５分後（曲線
Ｃ）、および３５分後（曲線Ｄ）における図１８の抗原
性ペプチドでの修飾を施した金電極のサイクルボルタモ
グラムを示す。
間０（曲線Ａ）、３分後（曲線Ｂ）、５分後（曲線
Ｃ）、および３５分後（曲線Ｄ）における図１８の抗原
性ペプチドでの修飾を施した金電極のサイクルボルタモ
グラムを示す。
【図２０】図２０は、本文中に引用される化合物１−１
０の式を示す。
０の式を示す。
【図２１】図２１は、本文中に引用される化合物１１−
１７の式を示す。
１７の式を示す。
【図２２】図２２は、実施例４に記載される金電極の表
面上の単糖α−Ｄ−マンノピラノース層の固定化の方法
を説明する。
面上の単糖α−Ｄ−マンノピラノース層の固定化の方法
を説明する。
【図２３】図２３は、Ｎ−メチル−Ｎ’−カルボキシメ
チレン−４，４’−ビピリジニウムであるレドックス分
子を連結させることによる修飾を施したコンカナバリン
Ａの２５μＭという一定濃度の存在下における、様々な
濃度のコンカナバリンＡでの電極の刺激後の、図２０お
よび２１に説明される、α−Ｄ−マンノピラノシド単糖
層での修飾を施した金電極のサイクルボルタモグラムを
示す。未修飾のコンカナバリンＡの濃度は、０（曲線
ａ）、２．５μＭ（曲線ｂ）、５μＭ（曲線ｃ）、１０
μＭ（曲線ｄ）、および２０μＭ（曲線ｅ）であった。
チレン−４，４’−ビピリジニウムであるレドックス分
子を連結させることによる修飾を施したコンカナバリン
Ａの２５μＭという一定濃度の存在下における、様々な
濃度のコンカナバリンＡでの電極の刺激後の、図２０お
よび２１に説明される、α−Ｄ−マンノピラノシド単糖
層での修飾を施した金電極のサイクルボルタモグラムを
示す。未修飾のコンカナバリンＡの濃度は、０（曲線
ａ）、２．５μＭ（曲線ｂ）、５μＭ（曲線ｃ）、１０
μＭ（曲線ｄ）、および２０μＭ（曲線ｅ）であった。
【図２４】図２４は、図２２の系における未修飾コンカ
ナバリンＡ濃度の関数としての電荷移動の減少の検量曲
線を示す。
ナバリンＡ濃度の関数としての電荷移動の減少の検量曲
線を示す。
【図２５】図２５は、未修飾コンカナバリンＡの増加濃
度の存在下における、レドックス分子を連結させること
による修飾を施したコンカナバリンＡの一定濃度の存在
下における、図２２に説明されるα−Ｄ−マンノピラノ
シド単一層電極の陰極電流を示す。
度の存在下における、レドックス分子を連結させること
による修飾を施したコンカナバリンＡの一定濃度の存在
下における、図２２に説明されるα−Ｄ−マンノピラノ
シド単一層電極の陰極電流を示す。
【図２６】図２６は、様々な濃度のα−Ｄ−マンノピラ
ノジドを含むコンカナバリンＡ溶液に露出させた際の、
マンノース層を固定化させてある電極の電流測定反応を
示す。
ノジドを含むコンカナバリンＡ溶液に露出させた際の、
マンノース層を固定化させてある電極の電流測定反応を
示す。
【図２７】図２７は、実施例６において記載される金電
極上のジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）単一層の固定
化を説明する。
極上のジニトロスピロピラン（ＤＮＳＰ）単一層の固定
化を説明する。
【図２８】図２８のａは、抗−ＤＮＰ抗体との１６分間
のインキュベーションの後の、ＤＮＳＰの層を固定化さ
せてある電極のサイクリックボルタングラムを示すが、
図２８のａはもともとの状態におけるＤＮＰでのある電
極の結果である一方、図２８のｂは二価イオン性メロシ
アニン立体配座へのＤＮＳＰの光異性化後の同一電極の
結果である。
のインキュベーションの後の、ＤＮＳＰの層を固定化さ
せてある電極のサイクリックボルタングラムを示すが、
図２８のａはもともとの状態におけるＤＮＰでのある電
極の結果である一方、図２８のｂは二価イオン性メロシ
アニン立体配座へのＤＮＳＰの光異性化後の同一電極の
結果である。
【図２９】図２９は、抗−ＤＮＰ抗体とのインキュベー
ション後の、固定化抗原の２つの異なる異性化状態にお
ける図２７の電極中に生じるピーク電流を示し、（ｂ）
および（ｄ）はスピロＤＮＳＰ立体配座のものを、
（ａ）および（ｃ）は二価イオン性メロシアニン立体配
座への光異性化後のものを示す。スピロ状態からメロシ
アニン状態への異性化およびその逆は光により誘導し
た。
ション後の、固定化抗原の２つの異なる異性化状態にお
ける図２７の電極中に生じるピーク電流を示し、（ｂ）
および（ｄ）はスピロＤＮＳＰ立体配座のものを、
（ａ）および（ｃ）は二価イオン性メロシアニン立体配
座への光異性化後のものを示す。スピロ状態からメロシ
アニン状態への異性化およびその逆は光により誘導し
た。
【図３０】図３０は、光異性化可能な基を連結させるこ
とによる蛋白質コンカナバリンＡの修飾の方法を説明す
る。
とによる蛋白質コンカナバリンＡの修飾の方法を説明す
る。
【図３１】図３１は、抗−ＤＮＰ−抗体でのＤＮＰ固定
化電極の刺激後の応答の変化を（Δｉ(1) pc）、抗−Ｄ
ＮＰ−抗体に対する抗−抗体での電極の更に別の刺激の
後の電気的応答の変化と比較して示す。
化電極の刺激後の応答の変化を（Δｉ(1) pc）、抗−Ｄ
ＮＰ−抗体に対する抗−抗体での電極の更に別の刺激の
後の電気的応答の変化と比較して示す。
【図３２】図３０は、３−アミノプロピルトリエトキシ
シランである連結基を固定化することによる、透過性ガ
ラス電極であるインジウム−すずオキシド（ＩＴＯ）の
修飾の方法を説明する。
シランである連結基を固定化することによる、透過性ガ
ラス電極であるインジウム−すずオキシド（ＩＴＯ）の
修飾の方法を説明する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イタマル・ウイルナー イスラエル・メバセレトジオン90805・ハ シヤロムストリート12 (72)発明者 アリー・ダガン イスラエル・エルサレム92341・ハーラプ ストリート13 (72)発明者 シヤイ・ルビン イスラエル・メバセレトジオン90805・ハ イアスミンストリート74 (72)発明者 ロン・ブロンダー イスラエル・エルサレム93507・クニサ ５・ハラケベトストリート49 (72)発明者 アザリア・リクリン イスラエル・エルサレム93903・ギロ・ハ ボツセムストリート440／35 (72)発明者 ヤエル・コーエン イスラエル・エルサレム96674ハイムハビ ブストリート７／28
Claims (4)
- 【請求項１】 液体媒質中の被検体の存在および場合に
よっては濃度の決定のための電気生化学系であって、認
識対の一構成員を固定化させた電極を含み、該対の他の
構成員が該被検体であり、媒質中の該被検体の存在によ
り該固定化構成員と該被検体との間の複合体である対複
合体の形成がもたらされ、そして更に電極から電子を受
容するかもしくは電極に電子を供与することによりレド
ックス状態を変化させることが可能なレドックス分子を
含み、電極上の対複合体の形成がその系の電気的応答に
変化を及ぼし、このことにより媒質中の該被検体の存在
および場合によっては濃度を決定することができる電気
生化学系。 - 【請求項２】 （ａ）認識対の一構成員を固定化させた
電極（該対の他の構成員は該被検体である）を、決定す
べき被検体を含む媒質ならびにその電極から電子を受容
するかもしくは電極に電子を供与することによりレドッ
クス状態を変化させることが可能なレドックス分子と接
触させること、および（ｂ）該溶液との接触の結果とし
て電気的応答の変化を測定することにより、該被検体の
存在および場合によっては濃度を決定することを可能に
することを含む、液体媒質中の被検体の存在および場合
によっては濃度の決定方法。 - 【請求項３】 電極がレドックス分子との電気通信が可
能な電極物質を含み、その電極物質上に認識対の一構成
員の層が固定化されており（この対の他の構成員は被検
体である）、レドックス分子と電極物質との間の電気通
信が該被検体への該一構成員の結合により修正され、固
定化構成員が光エネルギーへの露出に対して反応性を示
す基を有するもしくはそれに結合されており、該基は第
一および第二状態を有し、そして第一波長の光の照射へ
の露出により第一状態から第二状態へと、そして第二波
長の光の照射への露出により第二状態から第一状態へと
転化することが可能であり、この露出により該被検体へ
の結合についての固定化構成員の親和性の変化が誘導さ
れ、このことにより第一状態にある場合には該固定化構
成員は該作用物質に対して高い結合親和性を有するため
に、結合被検体は容易に解離せず、そして該第二状態に
ある場合には該固定化構成員は該被検体に対する低い結
合親和性を有するために、結合作用物質は容易に解離
し、そしてこれをこの系から取り除くことができ、そし
てその後に電極を該第一状態に変化を誘導する第二波長
の光に露出することができ、このことによりこの電極の
再使用の用意を整えることができ、このことにより電極
を取り囲む媒質中の該被検体の存在および場合によって
は濃度を再度決定することが可能である、液体媒質中の
被検体の存在および場合によっては濃度の決定のための
先の電気生化学系における利用のための実質的に再使用
可能な電極。 - 【請求項４】 （ａ）該連結基を金属もしくはガラス電
極物質へのイオウ含有性部分もしくは官能基付加済みア
ルコキシシラン各々の化学会合付着、もしくは化学吸着
により電極物質上に固定化させること、および（ｂ）固
定化すべき認識対の一構成員を連結基の該官能基に結合
させること、を含む、請求項３に記載の電極の製造方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL108726 | 1994-02-22 | ||
| IL10872694A IL108726A (en) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | Electrobiochemical method and system for the determination of an analyte which is a member of a recognition pair in a liquid medium and electrodes therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07301615A true JPH07301615A (ja) | 1995-11-14 |
| JP3583496B2 JP3583496B2 (ja) | 2004-11-04 |
Family
ID=11065843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05815895A Expired - Fee Related JP3583496B2 (ja) | 1994-02-22 | 1995-02-22 | 液体媒質中の認識対の構成員である被検体の決定のための電気生化学的方法および系ならびにその電極 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5942388A (ja) |
| EP (1) | EP0668502B1 (ja) |
| JP (1) | JP3583496B2 (ja) |
| AT (1) | ATE217966T1 (ja) |
| DE (1) | DE69526747T2 (ja) |
| DK (1) | DK0668502T3 (ja) |
| ES (1) | ES2177586T3 (ja) |
| IL (1) | IL108726A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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