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JPH0698004B2 - Ｔｎｆ発現用新規プラスミド - Google Patents

Ｔｎｆ発現用新規プラスミド

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Publication number
JPH0698004B2
JPH0698004B2 JP60217740A JP21774085A JPH0698004B2 JP H0698004 B2 JPH0698004 B2 JP H0698004B2 JP 60217740 A JP60217740 A JP 60217740A JP 21774085 A JP21774085 A JP 21774085A JP H0698004 B2 JPH0698004 B2 JP H0698004B2
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JP
Japan
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plasmid
tnf
gene
dna
derived
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Application number
JP60217740A
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English (en)
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JPS6277324A (ja
Inventor
武博 大島
正治 田中
成一 松倉
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Suntory Ltd
Original Assignee
Suntory Ltd
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Publication date
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Priority to AU62595/86A priority patent/AU597902B2/en
Priority to US06/907,816 priority patent/US4871663A/en
Priority to DE8686112941T priority patent/DE3682872D1/de
Priority to AT86112941T priority patent/ATE70305T1/de
Priority to EP86112941A priority patent/EP0220482B1/en
Priority to KR1019860007968A priority patent/KR870003201A/ko
Publication of JPS6277324A publication Critical patent/JPS6277324A/ja
Priority to US07/402,675 priority patent/US5059530A/en
Publication of JPH0698004B2 publication Critical patent/JPH0698004B2/ja
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規プラスミドおよびその利用に関する。更に
詳しくは、抗腫瘍活性を有する蛋白質である癌壊死因子
（Tumor Necrossis Factor、以下TNFと略す）を高発現
するプラスミドに関する。
従来の技術 1975年Carswellらは、免疫賦活剤で感作した動物の血清
中から殺腫瘍細胞活性あるいは癌壊死活性を有する物質
を見出し、癌壊死因子（Tumor Necrosis Factor、以下T
NFと略す）と名づけた（Proc、Natl.Acad.Scl.US72:366
6〜3670,1975）。その後、TNFは宿主に大きな影響を及
ぼすことなく、種々の腫瘍を壊死させること、又in vit
roでは種々の形質転換した細胞（腫瘍化された細胞）を
殺したり生長を止めるのに対し、正常な細胞には影響を
与えないことが知られ、抗腫瘍剤あるいは抗癌剤として
期待されている。TNFは、生体内の活性化されたマクロ
ファージから産生することが報告され（Ruff,H.R.＆ Gi
fford,G,E.,LymphoKines vol.2（ed.pick,E,）235〜27
2,Academic Press New York,1981）、近年は株化された
マクロファージ様細胞の培養液からTNF活性を有する物
質が分離されている。最近になって、２つのグループ
が、活性化されたヒトマクロファージ様細胞が産生する
ヒトTNF（蛋白質）のアミノ酸配列を組換えDNA技術を利
用して明らかにした（Pennica,D.ら,Nature312:724〜72
9,1984およびWang,A.M.ら、Sciece228:149〜154,198
5）。いずれのグループも、活性化したヒトマクロファ
ージ様細胞HL−60からヒトTNFのmRNAを分離しそのcDNA
をクローン化して塩基配列を決定する一方、上記細胞の
培養液よりTNFを精製しそのアミノ末端側のアミノ酸を
決定することにより、成熟ヒトTNFは、第１図に示すよ
うなVal-Arg-Ser…にはじまりカルボキシル末端はLeuで
終る157個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、そ
の前駆体はさらに76個アミノ酸からなるポリペプチドが
上記ポリペプチドのアミノ末端に付加された蛋白質であ
るとしている。又、彼等は上記ヒトTNFポリペプチドを
形質転換された大腸菌で産生することにも成功してい
る。Pennica,D.らは（既述文献）、大腸菌トリプトファ
ン遺伝子のプロモーター、オペレーターおよびリボゾー
ム結合（Shine-Dalga-rno:SD）配列下流に上記成熟TNF
遺伝子をつないだプラスミドを用い、大腸菌（W3110）
でＬ−929細胞に対する抗殺細胞活性で約３×105ユニッ
ト/A550＝１あるいは約３×105分子／細胞（但し108単
位/mg蛋白質の比活性があるとして）を示すTNFを産生さ
せ、Wang,A.M,らは（既述文献）、バクテリオファージ
λPLプロモーターとλ遺伝子Ｎリボゾーム結合配列の下
流に成熟TNF遺伝子を連結した温度感受性Cop-型（Wons,
E.M,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:3570,1982）のColE
1由来のプラスミドを用い、約2.3×105ユニット/mlの効
率であるいは全細胞蛋白質の約８％に相当するTNFを大
腸菌DG95株で産生させている（TNF活性測定には上記と
同じＬ−929細胞を使用）。
発明が解決しようとする問題点 上述の如く、157個のアミノ酸からなる成熟ヒトTNFは、
その遺伝子（cDNA）および大腸またはバクテリオファー
ジの発現制御に関する遺伝子が組み込まれたプラスミド
を用いて生産されているが、その生産性は必ずしも充分
であるとは言えず、更効率良く生産することのできる発
現系、例えば新規発現ベクターを開発することは産業界
の大きな要請である。
そこで、本発明の目的もTNFを高発現することの出来る
ベクターたるプラスミド、該プラスミドを用いた形質転
換体によってTNFを効率良く製造する方法、更には該方
法によって生産されるTNFを含む組成物を提供すること
にある。
問題点を解決するための手段 本発明者等は、上記問題点を解決すべく、ヒト成熟TNF
の大腸菌における高発現ベクターについて鋭意研究した
結果、TNFの構造遺伝子の上流に、ラムダファージ若し
くはT4ファージ遺伝子（T4gene32）由来のリボゾーム結
合配列（別名シャインダルカルノ配列）を伴う、T4ファ
ージ遺伝子DNA断片由来のプロモーター領域が単独また
は複数存在する領域を有し、且つ該構造遺伝子の翻訳終
止を暗号化する塩基配列の直後に、大腸菌遺伝子由来の
転写終止を暗号化する塩基配列（ターミネーター）を付
したDNA断片を、必要に応じてプラスミドDNAの複製を制
御する遺伝子領域（repressor of primer:以下ropと略
す）が一部欠如したpBR322由来のプラスミドに挿入して
得られる新規なプラスミドを用いることにより、ヒト成
熟TNFを大腸菌中で従来法よりもはるかに効率良く生産
できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明の新規プラスミドは、TNFの構造遺伝子の
上流にファージ遺伝子由来のプロモーター領域を有し、
且つ該構造遺伝子の翻訳終止を暗号化する塩基配列の直
後に、大腸菌遺伝子由来の転写終止を暗号化する塩基配
列（ターミネーター）を含むDNA断片が連結されたDNA断
片が挿入されていることを特徴とする。
本発明のTNFが発現ベクタープラスミドは、第１図に示
したアミノ酸配列をコードする遺伝子が発現される様に
組み込まれたプラスミド、pBR322−PL−T4−hTNF（本プ
ラスミドが導入された大腸菌C600株は西独ゲッチンゲン
のthe Culture Collection of the Deutsche samm-lung
von Mikroorganismenに寄託番号DSM3175を得て寄託さ
れている。尚、本プラスミドはスイスのBiogen S.A.社
の好意により分譲を受けた。）から以下に述べるような
種々の改良を加えることによって得ることができる。上
記プラスミドpBR322−PL−T4−hTNFには、TNF遺伝子が
ラムダファージのPLプロモーターと、T4gene32で表わさ
れるT4フアージ断片由来のT4プロモーターの支配下に発
現されるよう造成されたDNA断片が挿入されており、リ
ボゾーム結合配列（SD配列）はT4ファージ由来のものが
使用されている。添付した第３図〔Ｉ〕は、該プラスミ
ドpBR322−PL−T4−hTNFの制限酵素地図を表わす。
まず、pBR322−PL−T4−hTNF上にあるTNFプラスミドの
アミノ末端の１部をコードするDNAと翻訳開始点の５′
側上流のDNAの１部とを含むClaI−AvaIDNA小断片を、以
下の塩基配列で示される化学的に合成したClaI−AvaIリ
ンカー： とおきかえることによりプラスミドpPLT4TNF（第３図中
〔II〕の制限酵素地図で示される）を得る。これは、pB
R322−PL−T4−hTNF上にあるTNFプラスミドのアミノ末
端のアミノ酸をコードしている塩基配列を、Pennica,D.
らおよびWang,A.N.ら（既述文献）に記載されているTNF
のcDNAの塩基配列にするためである（pBR322−PL−T4−
hTNF上の該当する領域は上記cDNAの塩基配列と若干異な
っている）。
次いで、TNF構造遺伝子の翻訳終止コドンの直後に大腸
菌由来のターミネーターが容易に連結されるように、Mo
rinaga,Y.らによるin vitro mutation法（Morinaga,Y.e
t al.,Biotechnology,２:636〜639,1984）に従い、該TN
F構造遺伝子の翻訳終止コドンの直後にSaII切断部位を
有するプラスミドpPLT4TNF-SalIを造成する（第３図参
照）。尚、このSalI切断部位の挿入は、M13ファージを
用いる別のin Vitro mutation法（例えば、Zoller,M.J.
＆ smith,M.,Nucl.Acid.Res,.10:6487,1982および特願
昭58−241457に記載の方法）によっても行うことができ
る。
続いて、第４図中〔Ｖ〕で示される制限酵素地図を有す
る上記プラスミドpPLT4TNF-SalIをAhaIIIとSaiIで切断
して得られる、PLT4プロモーターおよびTNF遺伝子を有
する断片、各々の末端にSalI粘着部位およびEcoRI粘
着部位を有し、以下の塩基配列を有する化学合成DNA切
片（ターミネーターtrpａ:trpａ）： およびプラスミドpBR322をAhaIIIおよびEccRIで切断し
て得られる3.2kb.のEcoRI−AhaIIIDNA断片（テトラサイ
クリン耐性遺伝子Tcｒを含む大きな断片）の３つの断
片をT4DNAリガーゼを用いて連結することによって、TNF
構造遺伝子の直後に大腸菌遺伝子由来のターミネーター
が挿入され、且つテトラサイクリン耐性遺伝子（Tcｒ）
を有するプラスミドpPLT4TNFST8（第４図中、制限酵素
地図〔VII〕で示される）を造成する。該プラスミドの
造成は、形質転換株のテトラサイクリング耐性、アンピ
シリン感受性を指標にして容易に確認することができ
る。
上記プラスミドpPLT4TNFST8は、ラムダファージの温度
感受性レプレッサー遺伝子（例えばcI857）を発現する
ことができ、しかも、pBR322のようなプラスミドと共存
できるようなプラスミド（例えばpCI857）を有する大腸
菌に形質転換される。カナマイシン耐性遺伝子およびラ
ムダファージの温度感受性レプレッサー遺伝子cI857を
有し、pBR322由来のプラスミドと共存可能なプラスミド
pCI857（以下単にcIと略す）についてはGene22,103〜11
3,1983（Remant,E.,Tsao,H.＆ Fiers,W）に記載されて
いる。ラムダファージのPLプロモーター支配下に外来遺
伝子が発現されるように造成されたプラスミドによって
形質転換される宿主大腸菌は、上記のpCI857（CI）プラ
スミドを有するかまたは上記温度感受性レプレッサー遺
伝子を染色体上に有するラムダファージ溶原菌であるこ
とが好ましい。特にCIプラスミドを有する大腸菌WA802/
CIまたはW3110/CIが好ましい。
pPLT4TNFST8によって形質転換された大腸菌は、ヒトTNF
を従来法に比較して著しく高生産（最高1.9×107ユニッ
ト/ml）するが、さらに取り扱い易く且つ高性産性プラ
スミドを得るべく、第５図に示すように、プロモーター
領域の変変換（PLとT4の２つのプロモーターが連らなっ
たプロモーターからT4プロモーターのみからなるプロモ
ーターへの変換:pPLT4TNFST8→pT4TNFST8）、および第
６図に示すように、pBR322由来のプラスミドDNAの複製
を制御するrop（represso of primer）遺伝子の機能を
欠如させたプラスミドpT4TNFST8rop-の造成を行う。
PLT4プロモーターからT4プロモーターへの変換は、プラ
スミドの宿主領域を広くするためであり（T4プロモータ
ー支配下に外来遺伝子を発現させる場合の宿主は、PLT4
の場合のように、cl857のようなラムダファージの温度
感受性レプレッサー遺伝子を含む大腸菌に限る必要はな
い）、rop遺伝子の機能を欠如させるのは、プラスミド
の宿主細胞内での複製をより効率よく行わしめるためで
ある。
以上の如く造成された本発明のプラスミドによって形質
転換された大腸菌形質転換株は、適当な培地で振盪又は
通気攪拌培養され、SDSポリアクリルアミゲル電気泳動
（以下SDS PAGEと略す）およびTNF活性を測定すること
により、TNFの生産量を算出することができる。TNE活性
は後述の実施例で具体的に示す如く、Lymphokines vol.
2,235,1981Academio Pressに記載の方法に準じて測定さ
れる。
第５図および第６図において造成されるプラスミド、な
かんずく第６図のpT4TNFST8rop-によって形質転換され
た大腸菌W3110/pT4TNFST8rop-は、ジャーファーメンタ
ーによる培養において2.8×107〜1.9×108ユニット/ml
という驚くべきTNF生産性を示し、SDS-PAGEによるTNFの
生産量は形質転換大腸菌の全蛋白質の実に40％以上にも
達する。また、上記プラスミドを別の宿主大腸菌WA802
に導入した形質転換株WA802/pT4TNFST8rop-のTNF生産性
も3.0×107〜6.7×107ユニット/mlと高いものである。
このようにTNF高生産能を有するプラスミドは従来知ら
れていない。例えば、既述のWang,A.M.ら（Science328,
149〜154,1985）の報告にみられるプラスミドでは、同
様なTNFの測定法において約３×105ユニット/mlであ
り、又本発明において出発プラスミドとして用いたpBR3
22−PL−T4×hTNFで５〜６×105ユニット/ml程度であ
る。即ち、本発明のプラスミド（特にpPLT4TNST8および
pT4TNFT8rop-）にはTNFの生産において従来にない著し
い効果があることは明らかである。
尚、第５図において造成されるプラスミドpT4TNFST8に
よって形質転換された大腸菌W3110/pT4TNFST8およびWA8
02/pT4TNFST8は、 pPLT4TNFST8によって形質転換された大腸菌よりも若干T
NF生産性は劣るが（各々約５×106ユニット/mlの生
産）、該プラスミド上にあるrop遺伝子の機能を欠如さ
せることにより上述の如く“予期されなかった効果”を
生じる。
本発明のプラスミドによって形質転換された大腸菌が生
産するTNFは、適当な方法で抽出され、DEAE−セファロ
ースカラムクロマトグラフィーや色素吸着アフィニティ
カラムクロマトグラフィーさらにゲル過等によって医
薬品組成物として使用しうる純度にまで精製することが
できる。
以下に実施例をもって本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されたもの
ではない。
TNF遺伝子としては例えば活性化されたヒトマクロファ
ージ様細胞が産生するmRNAからcDNAの断片が用いられて
いるが、第１図に示すアミノ酸配列をコードするもので
あれば化学的に合成されるDNAを用いてもよい。また、
プロモーターおよびSD配列として大腸菌ファージの遺伝
子由来のプロモーターおよびSD配列が用いられている
が、使用される宿主細胞に応じて他の遺伝子例えば大腸
菌のtrp遺伝子やlpp遺伝子由来のもの或いはそれらの改
良されたものを用いてもよい。さらに、宿主大腸菌株と
してWA802やW3110を用いているが、使用されるプラスミ
ドによっては他の大腸菌株を用いてもよい。
［実施例］ プラスミドDNAの制限酵素による切断、DNA断片の結合
（ligation）、大腸菌の形質転換、形質転換株のスクリ
ーニング、プラスミドDNA又は断片の分離等遺伝子組換
えの基本的操作については、米国Cold Spring Habor La
boratory出版のManiatis,T.らによる、Molecular Cloni
ng-ALaboratory Manual（1982）およびAddison-Wesley
Publishing Company出版のRadriquez,R.L.とTait,R.c著
によるRecombinant DNA Techniques.An Introduction
（1983）に記載の方法に準じて行った。
実施例 １ プラスミドpPLT4TNFおび pPLT4TNF-SalIの造成 プラスミドpBR332−PL−T4−hTNF（本プラスミドによっ
て形質転換された大腸菌C600/CI株は西独のthe Culture
collection of the Deutsche Sammlung von MiKroorga
nismenにDSM3175の寄託番号で寄託されており、本プラ
スミドは、第３図中（Ｉ）の制限酵素地図で示される）
５μｇを制限酵素ClaIで完全に、AvaI（0.5ユニット）
で部分分解し、以下の塩基配列を有する化学合成したCl
aI−AvaIリンカーDNA断片： （0.5μｇ）をライゲーション溶液中に混合し、T4DNAリ
ガーゼ２ユニットを用いてライゲーション（ligation）
を行った。続いてこの溶液を用いて大腸菌W3110/CIを形
質転換し、アンピシリン耐性を示し且つTNF生産能を示
す形質転換株から常法により目的とするプラスミドpPLT
4TNF（第３図中、〔II〕で表わされる）を分離した。
次に、Morinaga,Y.ら（Biotechnology２:636〜639,198
4）の方法に準じて、上記プラスミドpPLT4TNF上のTNF構
造遺伝子の直後にSalI切断部位を挿入した。即ち、まず
pPLT4TNFを２つに分け、１つをEcoRIとPstIを用いて完
全に切断し、PLプロモーターを含むDNA断片部分が欠如
した二本鎖のDNA断片（第３図中〔III〕で示される）を
得、もう一方をHindIIIとBstEIIを用いて切断し、TNF遺
伝子の３′側の一部を含む断片が欠如した二本鎖のDNA
（第３図中〔IV〕示される）を得た。この両DNA断片〔I
II〕および〔IV〕と、SalI切断部位を有し、且つ以下の
塩基配列を有する化学合成一本鎖DNAであるAB180: ５′‐ATCATTGCCCTGTGAGTCGACCGAACATCCAACCTT-3′とを
混合し、100℃で二重鎖DNAを変性させて一本鎖DNAとし
た後ゆっくり冷却し、アニーリング（対合）させること
により二重鎖形成を行わしめた。この反応液に、dNTPと
DNAポリメラーゼ（Klenow fragment）およびT4DNAリガ
ーゼおよびATPを加えて反応させることにより完全な環
状二重鎖DNAとした。この反応液を用いて大腸菌M3110/C
Iを形質転換し、アンピシリン耐性を示す形質転換株を
得た。次に、該アンピシリン耐性を示す形質転換株に含
まれるプラスミドを分離し制限酵素による解析を行った
結果、第３図中、〔Ｖ〕で表わされる、目的とするプラ
スミドpPLT4TNF-Sal、即ちTNF構造遺伝子のすぐ下流にS
alI切断部位を有するプラスミド、であることを確認し
た。
実施例２ プラスミドpPLT4TNFST8の造成 実施例１で造成したプラスミドpPLT4TNF-SalI上のTNF構
造遺伝子の翻訳終止コドンの直後にターミネーターtrpa
を挿入し、薬剤耐性マーカーをアンピシリンからテトラ
サイクリンに変えたプラスミドpPLT4TNFST8の造成を以
下のように行った（第４図参照）。
実施例１で得たプラスミドpPLT4TNF-SalIをAhaIIIとSal
Iで切断して得られる、PL・T4プロモーターおよびTNF遺
伝子を有する断片、各々の末端にSalI粘着部位および
EcoRI粘着部位を有し、以下の塩基配列を有する化学合
成DNA切片（ターミネーターtrpａ:trpａ）： および第４図中〔VI〕の制限酵素地図で表わされるプラ
スミドpBR322をAhaIIIおよびEcoRIで切断して得られる
3.2kb.のEcoRI−AhaIIIDNA断片（テトラサイクリン遺伝
子Tcｒを含む大きな断片）の３つの断片をT4DNAリガ
ーゼを用いて連結し、これを大腸菌W3110/cI株およびWA
802/CI株に形質転換した。形質転換株はテトラサイクリ
ン耐性を示し、アンピシリン感受性を指標にスクリーニ
ングした。さらに、形質転換株から常法に従いプラスミ
ドを分離し、制限酵素による解析を行い、目的とするプ
ラスミドpPLT4TNFST8（第４図中〔VII〕の制限酵素地図
で表わされる）が造成されていることを確認した。
尚、本プラスミドで形質転換された大腸菌WA802/CI/pPL
T4TNFST8は、SBM281と命名され、微生物工業技術研究所
にFERM BP−906の寄託番号を得て寄託されている。
実施例 ３ プラスミドpT4TNFST8の造成 実施例２で得たプラスミドpPLT4TNFST8（５μｇ）をEco
RI（0.5ユニット）を用いて部分分解し、次に、dNTP（d
ATP,dGTP,dTTPおよびdCTP）存下DNAポリメラーゼを用い
て、EccRI粘着末端を平滑末端にした（フィル・イ
ン）。続いてAhaIII（５ユニット）を加えてpPLT4TNST8
上のAhaIIIサイトを切断し、T4DNAリガーゼを用いてラ
イゲーションを行なった後、大腸菌WA802およびW3110株
を形質転換した。テトラサイクリン耐性を示す形質転換
株（各々WA802/pT4TNFST8およびW3110/pT4TNST8と名づ
けた）からプラスミドDNAを分離し制限酵素解析を行う
ことにより、該形質転換株が目的とするプラスミドpT4T
NFST8（第５図中〔VIII〕の制限酵素地図で表わされ
る）を有していることを確認した。
実施例 ４ プラスミドpT4TNFST8rop-の造成 実施例２で得たpPLT4TNFST8から、プラスミドDNAの複製
を制御するpBR322由来のrop（repressor of primer）遺
伝子の機能が除去されたプラスミドpT4TNFST8rop-は以
下のようにして行った。
まず、第６図中〔VI〕で表わされるプラスミドpBR322を
PvuIIとBalIで切断し（どちらの制限酵素も平滑末端を
与える）、T4DNAリガーゼを用いてライゲーション後、
大腸菌WA802株を形質転換した。続いてアンピシリン耐
性およびテトラサイクリン耐性を示す形質転換株より、
pBR322からPvuII−BalI小DNA断片が除去されたプラスミ
ドpBR322△BalI（第６図中〔IX〕で表わされる）を分離
した。
次に、上記で得たプラスミドpBR322△BalIをHindIIIとA
haIIIで切断して得られるDNA断片と、実施例２で得たpP
LT4TNFST8（第６図中〔VII〕で表わされる）をEcoRIで
部分分解し、EcoRI粘着末端をフィル・イン（実施例３
参照）した後、さらにHindIIIで切断して得られるDNA断
片とを混合した。続いてT4DNAリガーゼを用いてこれら
のDNA断片をライゲーションした後、大腸菌WA802および
W3110株を形質転換し、サトラサイイクリン耐性を示す
クローンを得た。次に、これらのクローンからプラスミ
ドDNAを分離し、制限酵素による解析を行い、目的とす
るプラスミドpT4TNFST8rop-（第６図中〔Ｘ〕で表わさ
れる）が造成されていることを確認した。該プラスミド
pT4TNFST8rop-を有する大腸菌WA802およびW3株は、各々
WA802/ pT4TNFST8rop-およびW3110/pT4TNFST8rop-と名づけ、そ
のTNF生産性を測定した。
実施例 ５ 形質転換株のTNF活性の測定 形質転換株の培養は、10μg/mlテトラサイクリンを含む
（CIプラスミドを有する形質転換体の場合には、更にカ
ナマイシン40μg/mlを含む）LB培地（00.5％酵母エキ
ス、１％バクト・トリプトン、0.5％NaCl、pH7.0）で37
℃、15時間行った。培養液0.5mlを遠心分離して集菌
し、得られた菌体を250μg/mlのリゾーム（Sigma社製、
Gradel:卵白リゾチーム）を含むPBS溶液（日水製薬社
製）0.5mlに懸濁し、０℃、30分間反応させた後、エタ
ノール・ドライアイス中で凍結後37℃で融解する操作を
３回繰り返すことで溶菌させた。この溶菌液を、12,000
rpm、５分間遠心分離し、その上清をTNF活性測定用試料
とし、Ruff,M.R and Gifford,E.G.,Lymphokines,（Ed.P
ick,E.）vol.2,235〜272,AcademicPress,New York（198
1）に記載の方法を若干改良し、以下の様に行った。
即ち、10％牛胎児血清、0.1％NaHCO3、0.03％グルタミ
ンを含むイーグルMEM培地で段階的に希釈した試料0.1ml
に対し、対数増殖期にあるマウスＬ細胞の亜株であるＬ
−929細胞（ATCC寄託番号:CCL−１）６×105個/mlの浮
遊液（上記と同じ培地を使用）0.1mlを96穴の平底型組
織培養マイクロプレート（Nunc社製）の各穴に加えた。
各穴には予じめ最終１μg/mlとなる様にアクチノマイシ
ンＤ（Makor Chemicals社製）を加えておいた。次に上
記マイクロプレートを、５％CO2を含む空気中、37℃で
約18時間培養した。培養後、上清を捨てて、20％メタノ
ールを含む0.5％クリスタルバイオット水溶液を0.1mlず
つ各穴に加え、付着しているＬ−929細胞を15分間、室
温で染色した。続いて、染色したマイクロプレートを水
で充分洗浄後33％酢酸水溶液0.1mlを加えることで染色
された細胞から色素を抽出し、その抽出後の577nmにお
ける吸光度をTitertek Multiskan Spectrophotometerで
測定した。試料を加えていない対照の吸光度の50％の値
に相当する試料の希釈倍率の逆数を試料のTNF活性と
し、ユニット/mlで表示した。１つの試料について最底
４回の測定を行い、その平均値をTNF活性の値とした。
本発明によって造成された各種プラスミドによって形質
転換された形質転換体のTNNNF活性を上記方法で測定
し、改良前のTNF産生プラスミドpBR322−PL−T4−hTNF
によって形質転換されたものと比較した。
改良前のTNF産生プラスミドpBR322−PL−T4−hNFによっ
て形質転換されたWA802/CI株およびW3110/CI株のTNF活
性はいずれも約５〜６×105ユニット/mlであった。
これに対し、実施例２で得られた形質転換株WA820/CI/p
PLT4TNFST8およびW3110/CI/ pPLT4TNFST8は、各々最高1.9×107ユニット/mlのTNF生
産を示した。即ち改良前に比べ30倍強の生産性を有して
いた。プロモーター領域をPLT4からT4に変換した場合
（実施例３におけるWA802/pT4TNFST8およびW3110/pT4TN
FST8）のTNF生産性は上記に比べ5.4×106ユニット/mlと
やや低くなったが、該プラスミドからrop遺伝子の機能
を欠如させたプラスミドpT4TNFST8rop-による形質転換
株WA802/pT4TNFST8rop-およびW3110/pT4TNFST8rop-（実
施例４）、とりわけW3110/pT4TNFST8rop-のTNF生産量
は、ジャーファーメンターによる培養において2.8×107
〜1.9×108ユニット/mlにも達し、SDS PAGEによる解析
ではその生産量は該形質転換株の全蛋白質の40％以上で
あった。この生産性、改良前のプラスミドの生産性（５
〜６×105ユニット/ml）に比べ少なくとも40倍以上、多
くは実に300倍にも達するものであった。一方、WA802/p
PT4TNFST8rop-のTNF産生量も3.0×107〜6.7×107ユニッ
ト/mlと高いものであった。
実施例 ６ TNFの精製 形質転換株W3110/pT4TNFST8rop-を、テトラサイクリン1
0μg/mlを含むGC培地（２％グリセリン、３％カザミノ
酸、0.5％KH2PO4、0.2酵母エキス、0.1％MgSO4・7H2O、
pH6.5）で37℃、15時間、３容量（実容量２）のジ
ャーファーメンターを用いて培養した。次に10mMトリス
塩酸緩衝液（pH8）（以下単にトリスバッファーと略
す）に遠心集菌した菌体を懸濁し、冷却下高圧ホモゲナ
イザー（Manton-Gaulin Laboratory Homogenizer15M-8T
A）を用い8000psiで破砕後、遠心し上清を得た。これに
硫酸アンモニウムを80％飽和になるよう添加して生じる
蛋白質沈殿をトリスバッファーに溶解し、同バッファー
に対し充分透析を行った後、DEAEトヨパール650C（東洋
曹達社製）カラムクロマトグラフィーにかけた。TNF活
性画分は、0mMから300mMの直線的濃度勾配をもつ塩化ナ
トリウム溶液を流すことにより溶出された。続いて、TN
F活性画分をトリスバッファー（pH7）で希釈後、DEAEセ
ファロースCL−6B（ファルマシア社製）カラムにかけ、
OmMから200mMの直線的濃度勾配をもつ塩化ナトリウム溶
液を流し、TNF活性画分を得た。この精製工程でも、SDS
PAGEによる解析ではほヾ単一にTNF活性を有する蛋白質
のバンドが得られたが、さにこの画分をマトレックスブ
ルーＡ（アミコン社製）およびフェニルセファロースCL
−4B（ファルマシア社製）カラムにかけることにより精
製した。又、上記再クロマトグラフィーによって得られ
たTNF標品をゲル過担体であるセファクリルS200を用
いてさらに純度をあげることができた。
最終的に得られたTNF標品は、マイクロボンダパックC18
カラム（ウォーターズ社製）を用いた逆相高速液体クロ
マトグラフィー（島津製作所社製）により精製後、自動
アミノ酸分析器（日立製作所社製835-50型）を用い常法
に従いアミノ酸分析を行った。その結果、第１図のアミ
ノ酸配列から期待されるアミノ酸組成とよく一致した。
尚、本精製蛋白質のアミノ末端にはメチオニン残基が約
７％の割合で付加されているものと判断された。
また、上記精製蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列を、
Edman法に準じ、気相プロテインシークエンサーModel47
0A（Applied Biosystem社製）を用いて解析した結果、
第１図に示すアミノ酸配列と完全に一致していることが
認められた。
尚、ここでは形質転換株としてW3110/ pT4TNFST8rop-を用いた例を示したが、本発明で得られ
た他のTNF生産形質転換株についても同様な方法でほヾ
純粋なTNF蛋白質を精製することができた。
かくして得られるTNFは医薬として使用するに十分な程
純粋であり、TNFを含有する医薬組成物の有効成分とし
て使用することが可能である。
発明の効果 以上詳しく説明したように、本発明による新規プラスミ
ドによって形質転換された形質転換体は、極めて高い効
率でTNFを産生する。即ち、その生産性は従来技術に比
較して約40〜300倍という高いものであり、形質転換体
が産生するTNF量は該形質転換体の全蛋白質量の40％以
上にも達した。従って、本発明によれば医薬品として供
給しうる高純度のTNFを大量に製造することができ、工
業上の利用価値は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
第１図は、TNFのアミノ酸配列を示す図であり、第２図
は、TNFをコードする塩基配列を示す図であり、第３図
は、プラスミドpPLT4TNF-SalIの造成を示す図であり、
第４図は、プラスミドpPLT4TNFST8の造成を示す図であ
り、第５図は、プラスミドpT4TNFST8の造成を示す図で
あり、第６図は、プラスミドpT4TNFST8rop-の践成を示
す図である。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】癌壊死因子（TNF）の構造遺伝子の上流に
    ファージ遺伝子由来のラムダファージのPLで表される遺
    伝子のプロモーターまたはT4ファージDNA断片由来のプ
    ロモーターのいずれか１つ或いは両者のプロモーター領
    域を有し、且つ該構造遺伝子の翻訳終止を暗号化する塩
    基配列の直後に大腸菌のtrp a遺伝子由来の転写終止を
    暗号化する塩基配列（ターミネーター）を含むDNA断片
    が連結されたDNA断片が挿入されているプラスミド。
  2. 【請求項２】プラスミドDNAの複製を制御するPBR322由
    来のrop機能が欠如している特許請求の範囲第１項記載
    のプラスミド。
  3. 【請求項３】前記ターミネーターを含むDNA断片が TCGACAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTCTCGG GTCGGGCGGATTACTCCGCCGAAAAAAAAGAGCCTTAA である特許請求の範囲第１項または第２項記載のプラス
    ミド。
  4. 【請求項４】癌壊死因子（TNF）が下記のアミノ酸配列
    （Ｉ）で示される蛋白質である特許請求の範囲第１項ま
    たは第２項記載のプラスミド。
  5. 【請求項５】癌壊死因子（TNF）の構造遺伝子が下記のD
    NA配列（II）で示される特許請求の範囲第１項または第
    ２項記載のプラスミド。
  6. 【請求項６】pPLT4TNFST8またはpT4TNFST8で表される特
    許請求の範囲第１項記載のプラスミド。
  7. 【請求項７】pT4TNFST8rop-で表される特許請求の範囲
    第２項記載のプラスミド。
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