JPH0698797A - 核酸検出法 - Google Patents
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 主に液相法におけるハイブリダイゼーション
反応において、核酸試料の再会合の問題を除去した改良
方法の提供。 【構成】 核酸試料中の標的配列の存在をプローブとの
核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
方法において、当該試料中の核酸を必要により二本鎖か
ら一本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する標的
配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な配
列を有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌクレ
オチド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在しない
条件下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行うこ
とを特徴とする核酸の検出方法。
反応において、核酸試料の再会合の問題を除去した改良
方法の提供。 【構成】 核酸試料中の標的配列の存在をプローブとの
核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
方法において、当該試料中の核酸を必要により二本鎖か
ら一本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する標的
配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な配
列を有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌクレ
オチド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在しない
条件下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行うこ
とを特徴とする核酸の検出方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定の配列を有する核
酸の検出法に関する。さらに詳細には、特定の塩基配列
を有する遺伝子の有無を核酸同士のハイブリダイゼーシ
ョン反応によって検出する方法において、所望のハイブ
リダイゼーション反応に競合するヌクレオチド鎖を当該
反応系から事前に除去して、検出感度を向上させる方法
に関する。
酸の検出法に関する。さらに詳細には、特定の塩基配列
を有する遺伝子の有無を核酸同士のハイブリダイゼーシ
ョン反応によって検出する方法において、所望のハイブ
リダイゼーション反応に競合するヌクレオチド鎖を当該
反応系から事前に除去して、検出感度を向上させる方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】特定の塩基配列を有する遺伝子の有無を
核酸同士のハイブリダイゼーション反応によって検出す
る方法は、近年遺伝子検出法として広く用いられている
方法である。すなわち、相補的な配列を有する核酸同士
のハイブリダイゼーション反応は、特異性・反応性が高
いことから、免疫反応と同様にリガンド−レセプター反
応として広く用いられている方法である。
核酸同士のハイブリダイゼーション反応によって検出す
る方法は、近年遺伝子検出法として広く用いられている
方法である。すなわち、相補的な配列を有する核酸同士
のハイブリダイゼーション反応は、特異性・反応性が高
いことから、免疫反応と同様にリガンド−レセプター反
応として広く用いられている方法である。
【０００３】ところで、従来は核酸試料を変性させたま
まニトロセルロース膜、ナイロン膜等に当該核酸試料を
直接固定して、必要によりプレハイブリダイゼーション
した後に標識核酸プローブにより標的配列を検出する固
相法が広く用いられてきた。しかしながら、この方法に
よる場合、担体である前記膜の核酸結合量には限界があ
る。そして、さらに目的とする核酸以外の核酸が多量に
存在する場合には、所望のヌクレオチド鎖とプローブと
のハイブリダイゼーションが妨げられる場合がある。
まニトロセルロース膜、ナイロン膜等に当該核酸試料を
直接固定して、必要によりプレハイブリダイゼーション
した後に標識核酸プローブにより標的配列を検出する固
相法が広く用いられてきた。しかしながら、この方法に
よる場合、担体である前記膜の核酸結合量には限界があ
る。そして、さらに目的とする核酸以外の核酸が多量に
存在する場合には、所望のヌクレオチド鎖とプローブと
のハイブリダイゼーションが妨げられる場合がある。
【０００４】かかる固相法の欠点を克服するための一手
段として、ハイブリダイゼーション反応を液相中で行う
所謂液相法が広く紹介されている( 特開昭61-195699 号
公報、同61-274699 号公報、同62-229068 号公報、特開
平1-104200号公報、同1-501339号公報等) 。この液相法
は、目的のヌクレオチド鎖も標識プローブも液相中に溶
解した状態で反応させる液／液反応であり反応速度が速
く、反応性にも優れている。また、さらに担体に捕捉プ
ローブを固定化して核酸試料中の目的とする核酸鎖のみ
を選択的に捕捉する方法も紹介されている( 特開昭60-1
88100 号公報、同60-188397 号公報、同61-264240 号公
報、同62-81564号公報) 。
段として、ハイブリダイゼーション反応を液相中で行う
所謂液相法が広く紹介されている( 特開昭61-195699 号
公報、同61-274699 号公報、同62-229068 号公報、特開
平1-104200号公報、同1-501339号公報等) 。この液相法
は、目的のヌクレオチド鎖も標識プローブも液相中に溶
解した状態で反応させる液／液反応であり反応速度が速
く、反応性にも優れている。また、さらに担体に捕捉プ
ローブを固定化して核酸試料中の目的とする核酸鎖のみ
を選択的に捕捉する方法も紹介されている( 特開昭60-1
88100 号公報、同60-188397 号公報、同61-264240 号公
報、同62-81564号公報) 。
【０００５】この液相法に伴う欠点として、核酸試料の
再会合に関する問題がある。すなわち、ハイブリダイゼ
ーション反応の試料となる核酸のうち、DNA は通常二本
鎖状態で安定であり、ハイブリダイゼーション反応に供
するために変性条件下で一本鎖にしても、ハイブリダイ
ゼーション条件下においては当該相補鎖同士が再びアニ
ールして二本鎖を形成し、これが所望するプローブとの
ハイブリダイゼーション反応に競合して検出の感度を低
下させる原因となる。さらに、ロタウイルス(Rotaviru
s) のRNA のように二本鎖で存在するRNA を検出する場
合も上記と同様の再会合の問題が生じる。
再会合に関する問題がある。すなわち、ハイブリダイゼ
ーション反応の試料となる核酸のうち、DNA は通常二本
鎖状態で安定であり、ハイブリダイゼーション反応に供
するために変性条件下で一本鎖にしても、ハイブリダイ
ゼーション条件下においては当該相補鎖同士が再びアニ
ールして二本鎖を形成し、これが所望するプローブとの
ハイブリダイゼーション反応に競合して検出の感度を低
下させる原因となる。さらに、ロタウイルス(Rotaviru
s) のRNA のように二本鎖で存在するRNA を検出する場
合も上記と同様の再会合の問題が生じる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、主に
液相法におけるハイブリダイゼーション反応において、
上記の核酸試料の再会合の問題を除去した改良核酸検出
法の提供にある。
液相法におけるハイブリダイゼーション反応において、
上記の核酸試料の再会合の問題を除去した改良核酸検出
法の提供にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題の
解決手段について鋭意検討した結果、所望のハイブリダ
イゼーション反応に競合するヌクレオチド鎖を当該反応
系から事前に除去して、検出感度を向上させることが可
能であることを見出し本発明を完成した。すなわち、本
願は以下の発明を要旨とするものである。 （１）核酸試料中の標的配列の存在をプローブとの核酸
ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する方法
において、当該試料中の核酸を必要により二本鎖から一
本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する標的配列
を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な配列を
有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌクレオチ
ド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在しない条件
下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行うことを
特徴とする核酸の検出方法。 （２）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存在をプロー
ブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去して、 核酸試料中の標的配列の存在を、プローブとの核酸ハ
イブリダイゼーション反応により検出する（１）記載の
方法。 （３）（１）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去することを特徴とする核酸の検出方法。 （４）（３）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解
するエキソヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解で
あることを特徴とする核酸の検出方法。 （５）（３）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一方のヌクレオ
チド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性を与え
る手段を施した後、当該二本鎖核酸を当該エキソヌクレ
アーゼで処理して、他方のヌクレオチド鎖を分解して除
去することを特徴とする核酸の検出方法。 （６）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖の増幅
量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対して低くする
ことを特徴とする、核酸試料中の標的配列の存在をプロ
ーブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により
検出する（１）記載の方法。 （７）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、さら
に一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマーを
基に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なヌク
レオチド鎖を増幅させた核酸試料中の標的配列の存在を
核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーション反応の
有無により検出する（１）記載の方法。 （８）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列を含むヌクレオチド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に
対して抵抗性を与える手段を施した後、当該増幅物を当
該エキソヌクレアーゼで処理することを特徴とする
（５）記載の核酸の検出方法。 （９）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列を含まないヌクレオチド鎖を分解して除去する手段
が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレアー
ゼによるヌクレオチド鎖の分解であることを特徴とす
る、（４）記載の核酸の検出方法。 （10）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去することを
特徴とする核酸の検出方法。 （11）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、標的配列と相補
的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量を、これに
対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比較して相対
的に低くして、当該標的配列と相補的な配列を含むヌク
レオチド鎖断片の連結反応による生成量を低くすること
を特徴とする核酸の検出方法。 （12）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、さらに増
幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖のみに相補
的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレオチド断
片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅して、この
当該一方のヌクレオチド鎖以外のヌクレオチド鎖の生成
量を相対的に低くして、試料核酸とプローブとのハイブ
リダイゼーション反応の有無により、核酸試料中に標的
配列が存在するか否かを検出することを特徴とする
（１）記載の核酸の検出方法。 （13）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、一方のヌクレオ
チド鎖の反応系における存在量を実質的に少なくする
か、又は当該ヌクレオチド鎖が存在しない条件にする手
段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレア
ーゼによる分解であることを特徴とする核酸の検出方
法。 （14）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、一方のヌクレオ
チド鎖を反応系から除去する手段がエキソヌクレアーゼ
による反応であり、かつ反応系からの除去を企図しない
ヌクレオチド鎖の基となるオリゴヌクレオチド断片群の
一部又は全部にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性
を与える手段を施したことを特徴とする核酸の検出方
法。
解決手段について鋭意検討した結果、所望のハイブリダ
イゼーション反応に競合するヌクレオチド鎖を当該反応
系から事前に除去して、検出感度を向上させることが可
能であることを見出し本発明を完成した。すなわち、本
願は以下の発明を要旨とするものである。 （１）核酸試料中の標的配列の存在をプローブとの核酸
ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する方法
において、当該試料中の核酸を必要により二本鎖から一
本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する標的配列
を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な配列を
有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌクレオチ
ド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在しない条件
下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行うことを
特徴とする核酸の検出方法。 （２）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存在をプロー
ブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去して、 核酸試料中の標的配列の存在を、プローブとの核酸ハ
イブリダイゼーション反応により検出する（１）記載の
方法。 （３）（１）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去することを特徴とする核酸の検出方法。 （４）（３）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解
するエキソヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解で
あることを特徴とする核酸の検出方法。 （５）（３）記載の核酸の検出方法において、核酸試料
として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖
に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖を
分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一方のヌクレオ
チド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性を与え
る手段を施した後、当該二本鎖核酸を当該エキソヌクレ
アーゼで処理して、他方のヌクレオチド鎖を分解して除
去することを特徴とする核酸の検出方法。 （６）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖の増幅
量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対して低くする
ことを特徴とする、核酸試料中の標的配列の存在をプロ
ーブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により
検出する（１）記載の方法。 （７）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、さら
に一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマーを
基に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なヌク
レオチド鎖を増幅させた核酸試料中の標的配列の存在を
核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーション反応の
有無により検出する（１）記載の方法。 （８）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列を含むヌクレオチド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に
対して抵抗性を与える手段を施した後、当該増幅物を当
該エキソヌクレアーゼで処理することを特徴とする
（５）記載の核酸の検出方法。 （９）ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相
補的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プ
ライマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅
方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、標的
配列を含まないヌクレオチド鎖を分解して除去する手段
が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレアー
ゼによるヌクレオチド鎖の分解であることを特徴とす
る、（４）記載の核酸の検出方法。 （10）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去することを
特徴とする核酸の検出方法。 （11）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、標的配列と相補
的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量を、これに
対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比較して相対
的に低くして、当該標的配列と相補的な配列を含むヌク
レオチド鎖断片の連結反応による生成量を低くすること
を特徴とする核酸の検出方法。 （12）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、さらに増
幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖のみに相補
的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレオチド断
片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅して、この
当該一方のヌクレオチド鎖以外のヌクレオチド鎖の生成
量を相対的に低くして、試料核酸とプローブとのハイブ
リダイゼーション反応の有無により、核酸試料中に標的
配列が存在するか否かを検出することを特徴とする
（１）記載の核酸の検出方法。 （13）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、一方のヌクレオ
チド鎖の反応系における存在量を実質的に少なくする
か、又は当該ヌクレオチド鎖が存在しない条件にする手
段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレア
ーゼによる分解であることを特徴とする核酸の検出方
法。 （14）ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相
補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニール
した状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片
群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた
後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させるこ
とを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブ
とのハイブリダイゼーション反応の有無により検出する
（１）記載の核酸の検出方法において、一方のヌクレオ
チド鎖を反応系から除去する手段がエキソヌクレアーゼ
による反応であり、かつ反応系からの除去を企図しない
ヌクレオチド鎖の基となるオリゴヌクレオチド断片群の
一部又は全部にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性
を与える手段を施したことを特徴とする核酸の検出方
法。
【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。 Ａ．本発明は核酸試料中の標的配列の存在をプローブと
の核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出す
る方法において適用される。上記において、「核酸試
料」とは主にDNA のことを意味するものである。しかし
ながら、例えば前記のロタウイルスのように通常的に二
本鎖で存在するRNA の検出を企図する場合は、当該二本
鎖RNA を本発明における「核酸試料」として扱うことを
妨げるものではない。また、ここにいうDNA の種類は特
に限定されるものではなく、Genomic DNA とcDNAとにか
かわらず適用することができる。さらに、核由来のDNA
に限定されるものではなく、例えばミトコンドリアに由
来するDNA 、原核生物のDNA 、ウイルスのDNA 等にも適
用することができる。
の核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出す
る方法において適用される。上記において、「核酸試
料」とは主にDNA のことを意味するものである。しかし
ながら、例えば前記のロタウイルスのように通常的に二
本鎖で存在するRNA の検出を企図する場合は、当該二本
鎖RNA を本発明における「核酸試料」として扱うことを
妨げるものではない。また、ここにいうDNA の種類は特
に限定されるものではなく、Genomic DNA とcDNAとにか
かわらず適用することができる。さらに、核由来のDNA
に限定されるものではなく、例えばミトコンドリアに由
来するDNA 、原核生物のDNA 、ウイルスのDNA 等にも適
用することができる。
【０００９】また、「プローブ」とは一本鎖核酸と相補
的な配列を有し、当該一本鎖核酸とハイブリダイズが可
能なDNA 若しくはRNA のヌクレオチド鎖のことをいい、
当該ハイブリダイズ反応が生じたか否かを識別するため
の標識が施されている。かかる標識は本発明においては
特に限定されるものではなく、通常公知の標識法によっ
て標識された上記ヌクレオチド鎖をハイブリダイズ反応
の有無の識別のために用いることができる。例えば、
3H、125I、32P 等の放射性同位元素による標識ヌクレオ
チド鎖や酵素、蛍光物質、発光物質、若しくはこれらを
含有する不溶性物質であるポリスチレンやアガロースゲ
ル等、各種の抗原やハプテン、ビオチン等による標識ヌ
クレオチド鎖をプローブとして用いることができる。な
お、ここに「相補的」とは、必ずしも当該ヌクレオチド
鎖の全ての塩基同士がアニール可能であることを必須と
することを意味するものではない。すなわち、ある反応
条件で非特異的なハイブリダイゼーション反応と標的核
酸とのハイブリダイゼーション反応を区別することがで
きる程度に相補的であることを意味する。
的な配列を有し、当該一本鎖核酸とハイブリダイズが可
能なDNA 若しくはRNA のヌクレオチド鎖のことをいい、
当該ハイブリダイズ反応が生じたか否かを識別するため
の標識が施されている。かかる標識は本発明においては
特に限定されるものではなく、通常公知の標識法によっ
て標識された上記ヌクレオチド鎖をハイブリダイズ反応
の有無の識別のために用いることができる。例えば、
3H、125I、32P 等の放射性同位元素による標識ヌクレオ
チド鎖や酵素、蛍光物質、発光物質、若しくはこれらを
含有する不溶性物質であるポリスチレンやアガロースゲ
ル等、各種の抗原やハプテン、ビオチン等による標識ヌ
クレオチド鎖をプローブとして用いることができる。な
お、ここに「相補的」とは、必ずしも当該ヌクレオチド
鎖の全ての塩基同士がアニール可能であることを必須と
することを意味するものではない。すなわち、ある反応
条件で非特異的なハイブリダイゼーション反応と標的核
酸とのハイブリダイゼーション反応を区別することがで
きる程度に相補的であることを意味する。
【００１０】ここにいう核酸ハイブリダイゼーション反
応は、主に液相法による核酸ハイブリダイゼーション反
応を意味する。なお、この液相法による核酸ハイブリダ
イゼーションには、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等
の担体に捕捉プローブを固定して、当該捕捉プローブに
よって標的配列を有する核酸鎖を捕捉する方法（特開昭
60-188100 号公報、同60-188397 号公報、同61-264240
号公報、同62-81564号公報) も含まれる。
応は、主に液相法による核酸ハイブリダイゼーション反
応を意味する。なお、この液相法による核酸ハイブリダ
イゼーションには、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等
の担体に捕捉プローブを固定して、当該捕捉プローブに
よって標的配列を有する核酸鎖を捕捉する方法（特開昭
60-188100 号公報、同60-188397 号公報、同61-264240
号公報、同62-81564号公報) も含まれる。
【００１１】また、この核酸ハイブリダイゼーション反
応を行う前に、標的配列を含むと考えられる遺伝子を予
め増幅させることができる。当該遺伝子増幅方法の代表
的態様の一つとして、ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対
してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基
にして、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とす
る遺伝子の増幅方法を挙げることができる。
応を行う前に、標的配列を含むと考えられる遺伝子を予
め増幅させることができる。当該遺伝子増幅方法の代表
的態様の一つとして、ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対
してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基
にして、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とす
る遺伝子の増幅方法を挙げることができる。
【００１２】かかる一の遺伝子増幅方法は、所謂PCR 法
として既に公知である( 特開昭62-281号公報) 。さら
に、他の上記遺伝子増幅方法の代表的態様の一つとし
て、ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補
的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニールし
た状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片群
を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた後、
当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させることを
特徴とする遺伝子の増幅方法を挙げることができる。
として既に公知である( 特開昭62-281号公報) 。さら
に、他の上記遺伝子増幅方法の代表的態様の一つとし
て、ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補
的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニールし
た状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片群
を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた後、
当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させることを
特徴とする遺伝子の増幅方法を挙げることができる。
【００１３】かかる他の遺伝子増幅方法は、所謂LCR 法
として公知である( 特開平2-2934号公報、同2-23899 号
公報) 。なお、上記二種類の遺伝子増幅方法の態様をハ
イブリダイゼーション反応に応用することによって、
「核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌク
レオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌクレ
オチド鎖が、当該一方のヌクレオチド鎖に対比して実質
的に少ないか、又は存在しない条件下で上記核酸ハイブ
リダイゼーション反応を行う」という本発明の必須要件
を好適に満足させることが可能である。かかる点につい
ては後述する。 Ｂ．試料中の核酸を必要により二本鎖から一本鎖に変性
させた後に適用される方法である。
として公知である( 特開平2-2934号公報、同2-23899 号
公報) 。なお、上記二種類の遺伝子増幅方法の態様をハ
イブリダイゼーション反応に応用することによって、
「核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌク
レオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌクレ
オチド鎖が、当該一方のヌクレオチド鎖に対比して実質
的に少ないか、又は存在しない条件下で上記核酸ハイブ
リダイゼーション反応を行う」という本発明の必須要件
を好適に満足させることが可能である。かかる点につい
ては後述する。 Ｂ．試料中の核酸を必要により二本鎖から一本鎖に変性
させた後に適用される方法である。
【００１４】ここで、核酸試料を二本鎖から一本鎖にす
る変性の条件としては、例えば二本鎖DNA を熱変性させ
る場合には、80〜105 ℃で１〜20分間処理を行う。アル
カリ変性を行う場合には、0.2 〜１規定のNaOHの存在下
で１〜30分間処理して等量のHCl で中和する。酸変性を
行う場合には、例えば0.01〜１規定のHCl の存在下で１
〜30分間処理し、等量のNaOHで中和する。この他の方法
として、酵素的にヌクレオチド鎖の分解を行うこともで
きる。また、二本鎖RNA を変性させる場合には、熱若し
くは酸による変性手段を用いるのが好ましい。
る変性の条件としては、例えば二本鎖DNA を熱変性させ
る場合には、80〜105 ℃で１〜20分間処理を行う。アル
カリ変性を行う場合には、0.2 〜１規定のNaOHの存在下
で１〜30分間処理して等量のHCl で中和する。酸変性を
行う場合には、例えば0.01〜１規定のHCl の存在下で１
〜30分間処理し、等量のNaOHで中和する。この他の方法
として、酵素的にヌクレオチド鎖の分解を行うこともで
きる。また、二本鎖RNA を変性させる場合には、熱若し
くは酸による変性手段を用いるのが好ましい。
【００１５】なお、上記の酸若しくはアルカリによる変
性を行った後に、必ずしも変性系の中和を行う必要はな
い。「必要により」とは、核酸試料が常に二本鎖の状態
にあるとは限らないことを考慮するものである。すなわ
ち、核酸試料が当初より一本鎖の場合には、前記変性を
行う必要はない。 Ｃ．核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖が、当該一方のヌクレオチド鎖に対比して実
質的に少ないか、又は存在しない条件下で上記核酸ハイ
ブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする核酸の
検出方法である。
性を行った後に、必ずしも変性系の中和を行う必要はな
い。「必要により」とは、核酸試料が常に二本鎖の状態
にあるとは限らないことを考慮するものである。すなわ
ち、核酸試料が当初より一本鎖の場合には、前記変性を
行う必要はない。 Ｃ．核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖が、当該一方のヌクレオチド鎖に対比して実
質的に少ないか、又は存在しない条件下で上記核酸ハイ
ブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする核酸の
検出方法である。
【００１６】かかる核酸ハイブリダイゼーション反応系
において、ヌクレオチド鎖を実質的に少ないか、又は存
在しない条件にする手法としては、例えば以下の手法を
挙げることができる。ただし、これらの列挙した手法に
よって本発明の範囲が限定されるものではない。 (a) 核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する。
において、ヌクレオチド鎖を実質的に少ないか、又は存
在しない条件にする手法としては、例えば以下の手法を
挙げることができる。ただし、これらの列挙した手法に
よって本発明の範囲が限定されるものではない。 (a) 核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する。
【００１７】かかる分解・除去の手段としては、例えば
二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレアーゼに
よるヌクレオチド鎖の分解反応を挙げることができる。
このエキソヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解
は、ヌクレオチド鎖の5'末端からの分解であると、同3'
末端からの分解であるとを問わず試料となる二本鎖核酸
の両端から開始する。そして二本鎖の一方の鎖を分解
し、一本鎖となった時点で反応が停止するように条件を
設定するのが好ましい。なお、この場合用いるエキソヌ
クレアーゼ量は、所望のヌクレオチド鎖の分解反応が進
行する限りにおいて最小限度に止めるのが、経済的観点
からも、副反応の惹起を可能な限り防止するという観点
からも好ましい。またこの場合、標的とする核酸配列が
エキソヌクレアーゼにより分解されないように、標的と
する塩基配列からエキソヌクレアーゼにより分解される
側に十分な長さの核酸鎖長を持たせることで、「核酸試
料として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド
鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖
のみを分解して除去する」という所期の目的を達成する
ことができる。
二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌクレアーゼに
よるヌクレオチド鎖の分解反応を挙げることができる。
このエキソヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解
は、ヌクレオチド鎖の5'末端からの分解であると、同3'
末端からの分解であるとを問わず試料となる二本鎖核酸
の両端から開始する。そして二本鎖の一方の鎖を分解
し、一本鎖となった時点で反応が停止するように条件を
設定するのが好ましい。なお、この場合用いるエキソヌ
クレアーゼ量は、所望のヌクレオチド鎖の分解反応が進
行する限りにおいて最小限度に止めるのが、経済的観点
からも、副反応の惹起を可能な限り防止するという観点
からも好ましい。またこの場合、標的とする核酸配列が
エキソヌクレアーゼにより分解されないように、標的と
する塩基配列からエキソヌクレアーゼにより分解される
側に十分な長さの核酸鎖長を持たせることで、「核酸試
料として存在する標的配列を有する一方のヌクレオチド
鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌクレオチド鎖
のみを分解して除去する」という所期の目的を達成する
ことができる。
【００１８】このような目的を達成するためのエキソヌ
クレアーゼとしては、例えばエキソヌクレアーゼIII、B
a131 ヌクレアーゼ、λエキソヌクレアーゼ、T7ジーン
６エキソヌクレアーゼ等を挙げることができる。これら
のエキソヌクレアーゼのうち、T7ジーン６エキソヌクレ
アーゼは一本鎖を分解する副反応が起こらないという点
で好ましい。
クレアーゼとしては、例えばエキソヌクレアーゼIII、B
a131 ヌクレアーゼ、λエキソヌクレアーゼ、T7ジーン
６エキソヌクレアーゼ等を挙げることができる。これら
のエキソヌクレアーゼのうち、T7ジーン６エキソヌクレ
アーゼは一本鎖を分解する副反応が起こらないという点
で好ましい。
【００１９】ここで、「標的とする塩基配列からエキソ
ヌクレアーゼにより分解される側に十分な長さの核酸鎖
長」は、一般に特異的な配列を認識するためには15mer
の鎖長が必要であり、その長さの標的核酸を残存させる
には少なくとも検出を企図するヌクレオチド鎖と相補的
な関係を有するヌクレオチド鎖において、エキソヌクレ
アーゼが分解を開始する末端から標的配列に対して相補
的な関係を有する配列の前端までの核酸鎖長よりも15me
r 以上長いことが必要であり、100mer以上の鎖長を有す
ることが、エキソヌクレアーゼにより相補鎖が確実に分
解され、かつ標的配列が確実に残存するという点で好ま
しい。さらに、当該鎖長の上限は特に限定されないが、
分解に要するエキソヌクレアーゼ量を可能な限り少なく
するという点、及び反応時間の短縮を図るという点にお
いて、500mer程度以上は長くならないように設定するの
が好ましい。
ヌクレアーゼにより分解される側に十分な長さの核酸鎖
長」は、一般に特異的な配列を認識するためには15mer
の鎖長が必要であり、その長さの標的核酸を残存させる
には少なくとも検出を企図するヌクレオチド鎖と相補的
な関係を有するヌクレオチド鎖において、エキソヌクレ
アーゼが分解を開始する末端から標的配列に対して相補
的な関係を有する配列の前端までの核酸鎖長よりも15me
r 以上長いことが必要であり、100mer以上の鎖長を有す
ることが、エキソヌクレアーゼにより相補鎖が確実に分
解され、かつ標的配列が確実に残存するという点で好ま
しい。さらに、当該鎖長の上限は特に限定されないが、
分解に要するエキソヌクレアーゼ量を可能な限り少なく
するという点、及び反応時間の短縮を図るという点にお
いて、500mer程度以上は長くならないように設定するの
が好ましい。
【００２０】例えば上記の設定に従って、前記PCR 法に
おける遺伝子増幅用のプライマーを調製して、これによ
り所望の二本鎖DNA を増幅・調製することができる。さ
らに前記LCR 法においては、ヌクレオチド鎖とその相補
鎖のそれぞれの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌク
レオチド鎖とアニールした状態で隣接する二組以上のオ
リゴヌクレオチド断片群を上記の設定に準じて用いるこ
とで所望の二本鎖DNAを増幅・調製することができる。
なお、上記の分解・除去手段はPCR 法とLCR 法に対して
のみ用いられる手段ではなく、他の遺伝子増幅方法、例
えば、特開平2-5864号公報、同2-268683号公報、同2-50
0565号公報、同2-501532号公報、同4-131099号公報、同
4-500759号公報、又は同4-501057号公報記載の方法に対
しても適用することができる。
おける遺伝子増幅用のプライマーを調製して、これによ
り所望の二本鎖DNA を増幅・調製することができる。さ
らに前記LCR 法においては、ヌクレオチド鎖とその相補
鎖のそれぞれの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌク
レオチド鎖とアニールした状態で隣接する二組以上のオ
リゴヌクレオチド断片群を上記の設定に準じて用いるこ
とで所望の二本鎖DNAを増幅・調製することができる。
なお、上記の分解・除去手段はPCR 法とLCR 法に対して
のみ用いられる手段ではなく、他の遺伝子増幅方法、例
えば、特開平2-5864号公報、同2-268683号公報、同2-50
0565号公報、同2-501532号公報、同4-131099号公報、同
4-500759号公報、又は同4-501057号公報記載の方法に対
しても適用することができる。
【００２１】さらにエキソヌクレアーゼの分解の形式、
すなわち3'末端からの分解であると5'末端からの分解で
あるとによらずに、二本鎖核酸の一方のヌクレオチド鎖
にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性を与える手段
を施した後、当該二本鎖核酸を当該エキソヌクレアーゼ
で処理することで、前記の「核酸試料として存在する標
的配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な
配列を有する他方のヌクレオチド鎖のみを分解して除去
する」という所期の目的を達成することができる。
すなわち3'末端からの分解であると5'末端からの分解で
あるとによらずに、二本鎖核酸の一方のヌクレオチド鎖
にエキソヌクレアーゼ反応に対して抵抗性を与える手段
を施した後、当該二本鎖核酸を当該エキソヌクレアーゼ
で処理することで、前記の「核酸試料として存在する標
的配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的な
配列を有する他方のヌクレオチド鎖のみを分解して除去
する」という所期の目的を達成することができる。
【００２２】ここで、二本鎖核酸の両方の鎖を同一方向
に分解するエキソヌクレアーゼとしては、例えばエキソ
ヌクレアーゼIII、Ba131 ヌクレアーゼ、λエキソヌク
レアーゼ、T7ジーン６エキソヌクレアーゼ等を挙げるこ
とができる。また、「エキソヌクレアーゼ反応に対して
抵抗性を与える手段」としては、例えばヌクレオチド鎖
中の塩基、糖、又はリン酸部分の修飾を挙げることがで
きる。かかる修飾は核酸試料として存在する標的配列の
増幅が行われる際、又は核酸ハイブリダイゼーションに
よる検出を行う際に、これらの反応の進行に障害を与え
たり検出の感度を低下させずに、エキソヌクレアーゼに
よる分解反応に対する抵抗性を所望のヌクレオチド鎖に
付与することができる限りにおいて限定されるものでは
ない。例えば、炭素数が１〜４のアルキルホスフェート
基、ホスホロチオエート基、メチルチオホスフェート基
等のリン酸結合部位修飾体；デオキシリボースの3'又は
5'部分に対して内位添加剤であるメチルチオホスフェー
ト、カルボジイミド、N-ヒドロキシベンジルトリアゾー
ル等を反応させて結合させた糖修飾体; 又は3',2'-ジデ
オキシ化した糖修飾体を挙げることができる。また、核
酸塩基を直接修飾して上記抵抗性を与えることができ
る。さらに、試料核酸をα構造DNA にしたり、アクリジ
ニウム等のインターカレーターを核酸試料に結合させて
上記抵抗性を当該核酸試料に与えることもできる。これ
らの修飾法は、修飾体の性質、修飾を企図する対象とな
る核酸の種類と形態及び／又は修飾を企図する時期に応
じた方法を選択することができる。なお、当該修飾の時
期は遺伝子増幅法に用いられるプライマー等のヌクレオ
チド鎖の合成の際であってもよいし、その合成後であっ
てもよい。さらに、増幅反応の後にヌクレオチド鎖を分
解・除去する手段を施す場合には、当該増幅反応の後で
あってもよい。
に分解するエキソヌクレアーゼとしては、例えばエキソ
ヌクレアーゼIII、Ba131 ヌクレアーゼ、λエキソヌク
レアーゼ、T7ジーン６エキソヌクレアーゼ等を挙げるこ
とができる。また、「エキソヌクレアーゼ反応に対して
抵抗性を与える手段」としては、例えばヌクレオチド鎖
中の塩基、糖、又はリン酸部分の修飾を挙げることがで
きる。かかる修飾は核酸試料として存在する標的配列の
増幅が行われる際、又は核酸ハイブリダイゼーションに
よる検出を行う際に、これらの反応の進行に障害を与え
たり検出の感度を低下させずに、エキソヌクレアーゼに
よる分解反応に対する抵抗性を所望のヌクレオチド鎖に
付与することができる限りにおいて限定されるものでは
ない。例えば、炭素数が１〜４のアルキルホスフェート
基、ホスホロチオエート基、メチルチオホスフェート基
等のリン酸結合部位修飾体；デオキシリボースの3'又は
5'部分に対して内位添加剤であるメチルチオホスフェー
ト、カルボジイミド、N-ヒドロキシベンジルトリアゾー
ル等を反応させて結合させた糖修飾体; 又は3',2'-ジデ
オキシ化した糖修飾体を挙げることができる。また、核
酸塩基を直接修飾して上記抵抗性を与えることができ
る。さらに、試料核酸をα構造DNA にしたり、アクリジ
ニウム等のインターカレーターを核酸試料に結合させて
上記抵抗性を当該核酸試料に与えることもできる。これ
らの修飾法は、修飾体の性質、修飾を企図する対象とな
る核酸の種類と形態及び／又は修飾を企図する時期に応
じた方法を選択することができる。なお、当該修飾の時
期は遺伝子増幅法に用いられるプライマー等のヌクレオ
チド鎖の合成の際であってもよいし、その合成後であっ
てもよい。さらに、増幅反応の後にヌクレオチド鎖を分
解・除去する手段を施す場合には、当該増幅反応の後で
あってもよい。
【００２３】なお、核酸ハイブリダイゼーション反応の
前提として増幅反応を行わない場合には、例えば核酸試
料の特定の塩基配列に着目して当該箇所をII型の制限酵
素で切断した後、そこに直接修飾体を導入する方法；若
しくは修飾体を既に導入した合成リンカーを当該切断箇
所に導入する方法等を採ることができる。 (b) 核酸ハイブリダイズ反応の前提として、遺伝子の増
幅反応を行う場合においては、以下の手段を挙げること
ができる。
前提として増幅反応を行わない場合には、例えば核酸試
料の特定の塩基配列に着目して当該箇所をII型の制限酵
素で切断した後、そこに直接修飾体を導入する方法；若
しくは修飾体を既に導入した合成リンカーを当該切断箇
所に導入する方法等を採ることができる。 (b) 核酸ハイブリダイズ反応の前提として、遺伝子の増
幅反応を行う場合においては、以下の手段を挙げること
ができる。
【００２４】(i) ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対して
それぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存
在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有
無により検出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去する方
法。
それぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存
在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有
無により検出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去する方
法。
【００２５】ここにいう遺伝子の増幅方法として代表的
なものに、前記PCR 法を挙げることができる。一方のプ
ライマーを標識する標識リガンドとしては、プライマー
としての機能を喪失しない程度に低分子で、かつ増幅反
応の進行に悪影響を与えない物質を選択する必要があ
る。かかるリガンドの標識は、当該リガンドの種類、標
識対象に応じた通常公知の方法で実行することができ
る。例えば、核酸を標識する場合には、特公平3-59914
号公報、同3-74239 号公報記載の方法に従い、プライマ
ー核酸にアミノ基を導入した後、NHS ビオチンと反応さ
せることで達成できる。なお、このプライマー核酸のア
ミノ基には、上記ビオチンの他、蛍光物質、発光物質、
ハプテン等を結合させることも容易にできる。かかる場
合、必要によりカルボジイミド等の架橋剤を用いること
ができる( 蛋白質・核酸・酵素・別冊31,p37(1987)) 。
なものに、前記PCR 法を挙げることができる。一方のプ
ライマーを標識する標識リガンドとしては、プライマー
としての機能を喪失しない程度に低分子で、かつ増幅反
応の進行に悪影響を与えない物質を選択する必要があ
る。かかるリガンドの標識は、当該リガンドの種類、標
識対象に応じた通常公知の方法で実行することができ
る。例えば、核酸を標識する場合には、特公平3-59914
号公報、同3-74239 号公報記載の方法に従い、プライマ
ー核酸にアミノ基を導入した後、NHS ビオチンと反応さ
せることで達成できる。なお、このプライマー核酸のア
ミノ基には、上記ビオチンの他、蛍光物質、発光物質、
ハプテン等を結合させることも容易にできる。かかる場
合、必要によりカルボジイミド等の架橋剤を用いること
ができる( 蛋白質・核酸・酵素・別冊31,p37(1987)) 。
【００２６】増幅反応は、選択する遺伝子増幅法の種類
に対応した反応を行う。例えば、PCR 法の場合には、耐
熱性DNA ポリメラーゼの存在下で複数回の熱サイクルを
繰り返して遺伝子の増幅を行う( 特開昭62-281号公報)
。核酸を二本鎖から一本鎖に変性させる手段として
は、前記の熱変性、アルカリ変性、酸変性等の変性手段
を用いることができる。
に対応した反応を行う。例えば、PCR 法の場合には、耐
熱性DNA ポリメラーゼの存在下で複数回の熱サイクルを
繰り返して遺伝子の増幅を行う( 特開昭62-281号公報)
。核酸を二本鎖から一本鎖に変性させる手段として
は、前記の熱変性、アルカリ変性、酸変性等の変性手段
を用いることができる。
【００２７】リガンドに特異的なレセプターは、リガン
ドの種類によって異なる。例えばリガンドとしてホルモ
ン、例えばテストステロン、コルチゾール等のステロイ
ドホルモンやアセチルコリン等を用いる場合には、当該
ホルモンのレセプターや当該ホルモンに対する抗体を；
リガンドとしてジゴキシゲニンやジニトロフェノール等
のハプテンに対しては、それに対応する特異抗体を；リ
ガンドとして糖を用いる場合にはその特異的レクチン
を、例えばグルコースとコンナカバリンＡ、ガラクトー
スとアグルチニン等をレセプターとして用いることがで
きる。また、化学反応性物質としてソラレン、アクリジ
ン染料類、フェナントリジン類、フェナジン類、フロク
マリン類、フェノチアジン類、キノリン類等の光反応性
物質をリガンドとしておき、担体のカルボキシ基、アミ
ノ基、水酸基等と光照射によって反応・結合させること
もできる。さらにビオチンをリガンドとして、アビジン
若しくはストレプトアビジンをレセプターとして用いる
こともできる。なお、このビオチン−アビジン系は、ア
ルカリによる変性条件下でもリガンド−レセプター反応
を生じ得るという点で好ましい態様として挙げることが
できる。
ドの種類によって異なる。例えばリガンドとしてホルモ
ン、例えばテストステロン、コルチゾール等のステロイ
ドホルモンやアセチルコリン等を用いる場合には、当該
ホルモンのレセプターや当該ホルモンに対する抗体を；
リガンドとしてジゴキシゲニンやジニトロフェノール等
のハプテンに対しては、それに対応する特異抗体を；リ
ガンドとして糖を用いる場合にはその特異的レクチン
を、例えばグルコースとコンナカバリンＡ、ガラクトー
スとアグルチニン等をレセプターとして用いることがで
きる。また、化学反応性物質としてソラレン、アクリジ
ン染料類、フェナントリジン類、フェナジン類、フロク
マリン類、フェノチアジン類、キノリン類等の光反応性
物質をリガンドとしておき、担体のカルボキシ基、アミ
ノ基、水酸基等と光照射によって反応・結合させること
もできる。さらにビオチンをリガンドとして、アビジン
若しくはストレプトアビジンをレセプターとして用いる
こともできる。なお、このビオチン−アビジン系は、ア
ルカリによる変性条件下でもリガンド−レセプター反応
を生じ得るという点で好ましい態様として挙げることが
できる。
【００２８】なお、前記レセプターは通常担体に結合さ
せて用いるものである。かかる結合担体としては、例え
ばナイロン膜、ニトロセルロース膜等の膜；ポリスチレ
ンラテックス、アガロース粒子、ポリアクリルアミド粒
子等の微粒子；マイクロプレート、試験管等を用いるこ
とができる。なおレセプターと担体をレセプターの性質
に応じた公知の物理的方法で結合させて、当該結合担体
を調製することができる。なお、イムノダイン（日本ボ
ール社製）、イモビロンP(ミリポア社製) 等、市販の吸
着担体膜をそのまま本発明に対して用いることができ
る。また、上記微粒子を用いる場合には、反応液中に当
該微粒子を添加し処理を行うことも、当該微粒子をカラ
ムに充填してこのカラムに反応液を通すことによって処
理することも可能である。このような微粒子を用いた結
合担体としては、例えばストレプトアビジンを結合した
ポリスチレンラテックス磁性ビーズ（ダイナール社製）
を挙げることができる。マイクロプレート又は試験管を
用いる場合は、これらの素材の物理的若しくは化学的性
質並びにレセプターの当該性質に応じた方法で結合担体
を用いることができる。なお、上記のいずれの結合担体
においても、核酸試料の捕捉の際の立体障害を防ぐため
に、必要に応じてスペーサーを介在させることができ
る。さらに、担体のカルボキシル基、アミノ基、水酸基
その他の官能基を適切な条件下でレセプターに共有結合
させることも可能である。例えば、アミノ基同士をグル
タルアルデヒドで架橋する方法や、カルボジイミドによ
るカルボキシル基とアミノ基の結合を行う方法を挙げる
こともできる( 蛋白質・核酸・酵素・別冊31,p46(198
7)) 。
せて用いるものである。かかる結合担体としては、例え
ばナイロン膜、ニトロセルロース膜等の膜；ポリスチレ
ンラテックス、アガロース粒子、ポリアクリルアミド粒
子等の微粒子；マイクロプレート、試験管等を用いるこ
とができる。なおレセプターと担体をレセプターの性質
に応じた公知の物理的方法で結合させて、当該結合担体
を調製することができる。なお、イムノダイン（日本ボ
ール社製）、イモビロンP(ミリポア社製) 等、市販の吸
着担体膜をそのまま本発明に対して用いることができ
る。また、上記微粒子を用いる場合には、反応液中に当
該微粒子を添加し処理を行うことも、当該微粒子をカラ
ムに充填してこのカラムに反応液を通すことによって処
理することも可能である。このような微粒子を用いた結
合担体としては、例えばストレプトアビジンを結合した
ポリスチレンラテックス磁性ビーズ（ダイナール社製）
を挙げることができる。マイクロプレート又は試験管を
用いる場合は、これらの素材の物理的若しくは化学的性
質並びにレセプターの当該性質に応じた方法で結合担体
を用いることができる。なお、上記のいずれの結合担体
においても、核酸試料の捕捉の際の立体障害を防ぐため
に、必要に応じてスペーサーを介在させることができ
る。さらに、担体のカルボキシル基、アミノ基、水酸基
その他の官能基を適切な条件下でレセプターに共有結合
させることも可能である。例えば、アミノ基同士をグル
タルアルデヒドで架橋する方法や、カルボジイミドによ
るカルボキシル基とアミノ基の結合を行う方法を挙げる
こともできる( 蛋白質・核酸・酵素・別冊31,p46(198
7)) 。
【００２９】上記の結合担体にリガンドで標識された遺
伝子増幅物を特異的に結合させ、次いで当該結合担体を
反応系から除去することによって所望する核酸ハイブリ
ダイゼーション条件を設定することができる。 (ii)ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補
的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニールし
た状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片群
を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた後、
当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させることを
特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中に
標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブとの
ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する核酸
の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去する方法。
伝子増幅物を特異的に結合させ、次いで当該結合担体を
反応系から除去することによって所望する核酸ハイブリ
ダイゼーション条件を設定することができる。 (ii)ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補
的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖とアニールし
た状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオチド断片群
を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせた後、
当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結させることを
特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中に
標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプローブとの
ハイブリダイゼーション反応の有無により検出する核酸
の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去する方法。
【００３０】ここにいう遺伝子の増幅方法として代表的
なものに、前記LCR 法を挙げることができる。標的配列
と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片群のうち、
少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を上記増幅反応に
影響を及ぼさないリガンドで標識する手段及び当該リガ
ンドの種類；増幅反応は、選択する遺伝子増幅法の種類
に対応した反応を行うこと；核酸を二本鎖から一本鎖に
変性させる手段；リガンドに特異的なレセプター；及び
リガンドに特異的なレセプターを結合させた吸着担体に
ついては前記(i) の場合と同様である。
なものに、前記LCR 法を挙げることができる。標的配列
と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片群のうち、
少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を上記増幅反応に
影響を及ぼさないリガンドで標識する手段及び当該リガ
ンドの種類；増幅反応は、選択する遺伝子増幅法の種類
に対応した反応を行うこと；核酸を二本鎖から一本鎖に
変性させる手段；リガンドに特異的なレセプター；及び
リガンドに特異的なレセプターを結合させた吸着担体に
ついては前記(i) の場合と同様である。
【００３１】上記の結合担体にリガンドで標識された遺
伝子増幅物を特異的に結合させ、次いで当該結合担体を
反応系から除去することによって所望する核酸ハイブリ
ダイゼーション条件を設定することができる。 (iii) 前記(i) に示した「ヌクレオチド鎖とその相補鎖
に対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマー
を基にして、当該プライマーを伸長せしめることを特徴
とする遺伝子の増幅方法」で増幅された二種類のヌクレ
オチド鎖のうち、標的配列と相補的な塩基配列を有する
ヌクレオチド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチ
ド鎖に対して低くする方法。
伝子増幅物を特異的に結合させ、次いで当該結合担体を
反応系から除去することによって所望する核酸ハイブリ
ダイゼーション条件を設定することができる。 (iii) 前記(i) に示した「ヌクレオチド鎖とその相補鎖
に対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマー
を基にして、当該プライマーを伸長せしめることを特徴
とする遺伝子の増幅方法」で増幅された二種類のヌクレ
オチド鎖のうち、標的配列と相補的な塩基配列を有する
ヌクレオチド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチ
ド鎖に対して低くする方法。
【００３２】かかる方法においては、増幅反応により標
的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖を生
成するために増幅反応系に添加するプライマー量を、標
的配列を含むヌクレオチド鎖を生成するために添加する
プライマー量に比較して、相対的に少なくすることで、
標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖の
増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対して低く
する目的を達成することができる。
的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖を生
成するために増幅反応系に添加するプライマー量を、標
的配列を含むヌクレオチド鎖を生成するために添加する
プライマー量に比較して、相対的に少なくすることで、
標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖の
増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対して低く
する目的を達成することができる。
【００３３】具体的には、前者のプライマー量を後者の
プライマー量と比較して、１／10以下、好ましくは１／
1000以下とすることで前記目的を達成することができ
る。なお、かかる手法は核酸配列のシーケンシング法と
して用いられている(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85,7652
-7656(1988))が、核酸ハイブリダイゼーションに用いら
れた例はない。 (iv)前記(ii)に示した「ヌクレオチド鎖とその相補鎖の
それぞれの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオ
チド鎖とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴ
ヌクレオチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブ
リダイズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士
を連結させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅
された核酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料
核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応の有無
により検出する核酸の検出方法」において、標的配列と
相補的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量を、こ
れに対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比較して
相対的に低くする方法。
プライマー量と比較して、１／10以下、好ましくは１／
1000以下とすることで前記目的を達成することができ
る。なお、かかる手法は核酸配列のシーケンシング法と
して用いられている(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85,7652
-7656(1988))が、核酸ハイブリダイゼーションに用いら
れた例はない。 (iv)前記(ii)に示した「ヌクレオチド鎖とその相補鎖の
それぞれの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオ
チド鎖とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴ
ヌクレオチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブ
リダイズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士
を連結させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅
された核酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料
核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応の有無
により検出する核酸の検出方法」において、標的配列と
相補的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量を、こ
れに対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比較して
相対的に低くする方法。
【００３４】かかる方法においては、前記(iii) の場合
と同様に増幅反応により標的配列と相補的な塩基配列を
有するヌクレオチド鎖を生成するために増幅反応系に添
加するオリゴヌクレオチド鎖断片群の量を、標的配列を
含むヌクレオチド鎖を生成するために添加するオリゴヌ
クレオチド鎖断片群の量に比較して、相対的に少なくす
ることで、標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレ
オチド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に
対して低くする目的を達成することができる。
と同様に増幅反応により標的配列と相補的な塩基配列を
有するヌクレオチド鎖を生成するために増幅反応系に添
加するオリゴヌクレオチド鎖断片群の量を、標的配列を
含むヌクレオチド鎖を生成するために添加するオリゴヌ
クレオチド鎖断片群の量に比較して、相対的に少なくす
ることで、標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレ
オチド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に
対して低くする目的を達成することができる。
【００３５】具体的には、前者のオリゴヌクレオチド鎖
断片群の量を後者のオリゴヌクレオチド鎖断片群の量と
比較して、１／10以下、好ましくは１／1000以下とする
ことで前記目的を達成することができる。 (v) ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相補
的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プラ
イマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅方
法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、さらに
一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマーを基
に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なヌクレ
オチド鎖を増幅させる方法。
断片群の量を後者のオリゴヌクレオチド鎖断片群の量と
比較して、１／10以下、好ましくは１／1000以下とする
ことで前記目的を達成することができる。 (v) ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相補
的な塩基配列を有するプライマーを基にして、当該プラ
イマーを伸長せしめることを特徴とする遺伝子の増幅方
法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、さらに
一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマーを基
に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なヌクレ
オチド鎖を増幅させる方法。
【００３６】すなわち、前記(i) に示した「ヌクレオチ
ド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相補的な塩基配列を
有するプライマーを基にして、当該プライマーを伸長せ
しめることを特徴とする遺伝子の増幅方法」で増幅され
た二種類のヌクレオチド鎖のうち、一方のヌクレオチド
鎖にのみ相補的な配列を有する第三のプライマーを用
い、当該第三のプライマーによる遺伝子の増幅反応を行
うことにより、容易に一本鎖の標的配列を含むヌクレオ
チド鎖を選択的に得ることができる。
ド鎖とその相補鎖に対してそれぞれ相補的な塩基配列を
有するプライマーを基にして、当該プライマーを伸長せ
しめることを特徴とする遺伝子の増幅方法」で増幅され
た二種類のヌクレオチド鎖のうち、一方のヌクレオチド
鎖にのみ相補的な配列を有する第三のプライマーを用
い、当該第三のプライマーによる遺伝子の増幅反応を行
うことにより、容易に一本鎖の標的配列を含むヌクレオ
チド鎖を選択的に得ることができる。
【００３７】この場合、第一段階で使用したプライマー
が充分量存在すると他方のヌクレオチド鎖も同時に増幅
され二本鎖となることから、第三のプライマーの添加前
において、第一段階のプライマーが実質的に少ないか存
在しない状態にしておくことが必要である。かかる状態
にする方法としては、限外ろ過フィルター、例えばウル
トラフリー( ミリポア社製) を用いてプライマーを除去
する方法や、電気泳動やカラムによる分画精製によって
プライマーを除去する方法を挙げることができる。
が充分量存在すると他方のヌクレオチド鎖も同時に増幅
され二本鎖となることから、第三のプライマーの添加前
において、第一段階のプライマーが実質的に少ないか存
在しない状態にしておくことが必要である。かかる状態
にする方法としては、限外ろ過フィルター、例えばウル
トラフリー( ミリポア社製) を用いてプライマーを除去
する方法や、電気泳動やカラムによる分画精製によって
プライマーを除去する方法を挙げることができる。
【００３８】(vi)ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞ
れの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖
とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイ
ズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結
させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、
さらに増幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖の
みに相補的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅す
る方法。
れの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖
とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイ
ズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結
させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、
さらに増幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖の
みに相補的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅す
る方法。
【００３９】すなわち、前記(ii)に示した「ヌクレオチ
ド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補的であり、かつ
それぞれのヌクレオチド鎖とアニールした状態で隣接す
る二組以上のオリゴヌクレオチド断片群を対応するヌク
レオチド鎖にハイブリダイズさせた後、当該オリゴヌク
レオチド鎖断片同士を連結させることを特徴とする遺伝
子の増幅方法で増幅された核酸試料中に標的配列が存在
するか否かを、試料核酸とプローブとのハイブリダイゼ
ーション反応の有無により検出する核酸の検出方法」に
おいて、増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、一
方のヌクレオチド鎖にのみ相補的な配列を有するオリゴ
ヌクレオチド断片群を用い、当該オリゴヌクレオチド群
による遺伝子の増幅反応を行うことにより、容易に一本
鎖の標的配列を含むヌクレオチド鎖を選択的に得ること
ができる。
ド鎖とその相補鎖のそれぞれの鎖に相補的であり、かつ
それぞれのヌクレオチド鎖とアニールした状態で隣接す
る二組以上のオリゴヌクレオチド断片群を対応するヌク
レオチド鎖にハイブリダイズさせた後、当該オリゴヌク
レオチド鎖断片同士を連結させることを特徴とする遺伝
子の増幅方法で増幅された核酸試料中に標的配列が存在
するか否かを、試料核酸とプローブとのハイブリダイゼ
ーション反応の有無により検出する核酸の検出方法」に
おいて、増幅された二種類のヌクレオチド鎖のうち、一
方のヌクレオチド鎖にのみ相補的な配列を有するオリゴ
ヌクレオチド断片群を用い、当該オリゴヌクレオチド群
による遺伝子の増幅反応を行うことにより、容易に一本
鎖の標的配列を含むヌクレオチド鎖を選択的に得ること
ができる。
【００４０】この場合、第一段階で使用したオリゴヌク
レオチド断片が充分量存在すると他方のヌクレオチド鎖
も同時に増幅され二本鎖となることから、第三のオリゴ
ヌクレオチド断片の添加前において、第一段階のオリゴ
ヌクレオチド断片が実質的に少ないか存在しない状態に
しておくことが必要である。かかる状態にする方法とし
ては、限外ろ過フィルター、例えばウルトラフリー( ミ
リポア社製) を用いてオリゴヌクレオチド断片を除去す
る方法や、電気泳動やカラムによる分画精製によってオ
リゴヌクレオチド断片を除去する方法を挙げることがで
きる。Ｄ．上記により、所望の核酸ハイブリダイゼーシ
ョンの条件を設定して、企図する核酸ハイブリダイゼー
ション反応を行う方法である。
レオチド断片が充分量存在すると他方のヌクレオチド鎖
も同時に増幅され二本鎖となることから、第三のオリゴ
ヌクレオチド断片の添加前において、第一段階のオリゴ
ヌクレオチド断片が実質的に少ないか存在しない状態に
しておくことが必要である。かかる状態にする方法とし
ては、限外ろ過フィルター、例えばウルトラフリー( ミ
リポア社製) を用いてオリゴヌクレオチド断片を除去す
る方法や、電気泳動やカラムによる分画精製によってオ
リゴヌクレオチド断片を除去する方法を挙げることがで
きる。Ｄ．上記により、所望の核酸ハイブリダイゼーシ
ョンの条件を設定して、企図する核酸ハイブリダイゼー
ション反応を行う方法である。
【００４１】かかる核酸ハイブリダイゼーション法とし
ては、液相で標識プローブを反応させた後、直接標識を
検出する方法（特開平2-503147号公報、同2-503268号公
報)；液相で標識プローブと捕捉可能な標識を施した捕
捉プローブを反応させた後、担体に結合した捕捉剤で当
該捕捉プローブを捕捉する液相サンドイッチ法( 特開昭
61-195699 号公報、同61-274699 号公報、同62-229068
号公報、特開平1-104200号公報、同1-501399号公報等)
；担体に直接結合した捕捉プローブと標識プローブを
用いる固相サンドイッチ法（特開昭60-188100 号公報、
同60-188397 号公報、同61-264240 号公報、同62-81564
号公報等) ；核酸試料を直接標識して、担体に結合した
捕捉剤で当該核酸試料を捕捉し、核酸試料に結合した標
識を測定する方法（特開昭62-265999 号公報) 等が用い
られる。
ては、液相で標識プローブを反応させた後、直接標識を
検出する方法（特開平2-503147号公報、同2-503268号公
報)；液相で標識プローブと捕捉可能な標識を施した捕
捉プローブを反応させた後、担体に結合した捕捉剤で当
該捕捉プローブを捕捉する液相サンドイッチ法( 特開昭
61-195699 号公報、同61-274699 号公報、同62-229068
号公報、特開平1-104200号公報、同1-501399号公報等)
；担体に直接結合した捕捉プローブと標識プローブを
用いる固相サンドイッチ法（特開昭60-188100 号公報、
同60-188397 号公報、同61-264240 号公報、同62-81564
号公報等) ；核酸試料を直接標識して、担体に結合した
捕捉剤で当該核酸試料を捕捉し、核酸試料に結合した標
識を測定する方法（特開昭62-265999 号公報) 等が用い
られる。
【００４２】
【実施例】次に実施例によって本発明を具体的に説明す
るが、本発明の範囲がこれにより限定されるものではな
い。 （参考例１）各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。
るが、本発明の範囲がこれにより限定されるものではな
い。 （参考例１）各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。
【００４３】合成の方法はABI 社マニュアルに従い、0.
2 μM スケールで実施した。各種のオリゴヌクレオチド
の脱保護は55℃のアンモニア水中で一夜行った。オリゴ
ヌクレオチドの精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラ
ムにて実行した。 (1) 第１オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の271番目から292 番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する（配列番号１）。また5'
末端の５塩基は必要によりホスホチオエート基で結合し
た。 (2) 第２オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の622番目から642 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する（配列番号２）。
2 μM スケールで実施した。各種のオリゴヌクレオチド
の脱保護は55℃のアンモニア水中で一夜行った。オリゴ
ヌクレオチドの精製はファルマシア社製FPLCで逆相カラ
ムにて実行した。 (1) 第１オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の271番目から292 番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する（配列番号１）。また5'
末端の５塩基は必要によりホスホチオエート基で結合し
た。 (2) 第２オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の622番目から642 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する（配列番号２）。
【００４４】必要により第２オリゴヌクレオチドの5'末
端にビオチンを導入した。すなわち、当該オリゴヌクレ
オチドの合成時N-MMT −ヘキサノールアミンリンカー
（ミリジェン社製）を用いて5'末端にアミノ基を導入
し、室温下、アンモニア水中で24時間放置して脱保護し
たのちN −ヒドロキシサクシニミジルビオチンを結合す
る方法（C.F.バーバラ（C.F.Barbara ）等：DNA ，第４
巻，327 頁(1985)) に従った。 (3) 第３オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の478番目から507 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する（配列番号３）。5 ’末
端に32P-ATP 及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
32P 標識した。 (4) 第４オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の453番目から477 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列、その3'側に30塩基のオリゴdAを
有する（配列番号４）。 (5) 第５オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の430番目から452 番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する（配列番号５）。 (6) 第６及び6'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の451 番目から471 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第６オリゴヌクレ
オチド（配列番号６）及びその相補的な配列を有する第
6'オリゴヌクレオチド（配列番号７）を示す。 (7) 第７及び7'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の472 番目から492 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第７オリゴヌクレ
オチド（配列番号８）及びその相補的な配列を有する第
7'オリゴヌクレオチド（配列番号９）を示す。 (8) 第８及び8'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の493 番目から518 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第８オリゴヌクレ
オチド（配列番号10) 及びその相補的な配列を有する第
8'オリゴヌクレオチド（配列番号11) を示す。 （実施例１） 〔一本鎖核酸の調製〕プライマーとして参考例１に示し
た第１オリゴヌクレオチド及びリガンド標識プライマー
として同ビオチン標識第２オリゴヌクレオチドを各々40
pmole 、及び標的配列を含む核酸試料としてコレラの培
養菌から分離・部分精製したゲノム核酸１ngを、50μl
の下記の反応液に加えた。次に当該反応液を94℃に５分
間保った後、TthDNAポリメラーゼ（東洋紡績社製）を４
単位加え、さらにこれを94℃に１分間保った後、下記の
熱サイクルにて、PCR 法による遺伝子の増幅を行った。
端にビオチンを導入した。すなわち、当該オリゴヌクレ
オチドの合成時N-MMT −ヘキサノールアミンリンカー
（ミリジェン社製）を用いて5'末端にアミノ基を導入
し、室温下、アンモニア水中で24時間放置して脱保護し
たのちN −ヒドロキシサクシニミジルビオチンを結合す
る方法（C.F.バーバラ（C.F.Barbara ）等：DNA ，第４
巻，327 頁(1985)) に従った。 (3) 第３オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の478番目から507 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列を有する（配列番号３）。5 ’末
端に32P-ATP 及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
32P 標識した。 (4) 第４オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の453番目から477 番目のヌクレオチ
ド配列と相補的な配列、その3'側に30塩基のオリゴdAを
有する（配列番号４）。 (5) 第５オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオチドは
コレラ毒素遺伝子の430番目から452 番目のヌクレオチ
ド配列と相同的な配列を有する（配列番号５）。 (6) 第６及び6'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の451 番目から471 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第６オリゴヌクレ
オチド（配列番号６）及びその相補的な配列を有する第
6'オリゴヌクレオチド（配列番号７）を示す。 (7) 第７及び7'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の472 番目から492 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第７オリゴヌクレ
オチド（配列番号８）及びその相補的な配列を有する第
7'オリゴヌクレオチド（配列番号９）を示す。 (8) 第８及び8'オリゴヌクレオチド：本オリゴヌクレオ
チドはコレラ毒素遺伝子の493 番目から518 番目のヌク
レオチド配列と相同的な配列を有する第８オリゴヌクレ
オチド（配列番号10) 及びその相補的な配列を有する第
8'オリゴヌクレオチド（配列番号11) を示す。 （実施例１） 〔一本鎖核酸の調製〕プライマーとして参考例１に示し
た第１オリゴヌクレオチド及びリガンド標識プライマー
として同ビオチン標識第２オリゴヌクレオチドを各々40
pmole 、及び標的配列を含む核酸試料としてコレラの培
養菌から分離・部分精製したゲノム核酸１ngを、50μl
の下記の反応液に加えた。次に当該反応液を94℃に５分
間保った後、TthDNAポリメラーゼ（東洋紡績社製）を４
単位加え、さらにこれを94℃に１分間保った後、下記の
熱サイクルにて、PCR 法による遺伝子の増幅を行った。
【００４５】(反応液) 10mM Tris-HCl（pH8.9 ） 1.5mM MgCl2 80mM KCl 500μg ／ml BSA 0.1 ％ コール酸ナトリウム 0.1 ％ トリトンX100 0.2mM dATP，dGTP，dCTP，dTTP 変性 94℃ 60秒 アニール 58℃ 120秒 伸長反応 75℃ 90秒 (サイクル数) 30回 得られたPCR 増幅産物をそのまま段階希釈して、一方の
検出対象とした。
検出対象とした。
【００４６】そして、前記のPCR 増幅産物20μl にスト
レプトアビジン磁性ビーズ（ダイナル社製）を40μl 添
加し、これを室温で10分間攪拌した。次に磁石で磁性ビ
ーズを収集し、TE緩衝液で当該磁性ビーズを2 回洗浄し
た。さらに、0.3 規定のNaOHを100 μl を加えて10分間
放置した後、磁石で磁性ビーズを除き、この磁性ビーズ
処理試料を一本鎖化処理検出試料とした。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕前記
の検出対象であるPCR 増幅産物４μl に0.33規定のNaOH
16μl を加え、10分間放置し一方の検出試料とした。ま
た、PCR 反応後、上記磁性ビーズ処理した一本鎖化処理
検出試料20μｌを用いた。
レプトアビジン磁性ビーズ（ダイナル社製）を40μl 添
加し、これを室温で10分間攪拌した。次に磁石で磁性ビ
ーズを収集し、TE緩衝液で当該磁性ビーズを2 回洗浄し
た。さらに、0.3 規定のNaOHを100 μl を加えて10分間
放置した後、磁石で磁性ビーズを除き、この磁性ビーズ
処理試料を一本鎖化処理検出試料とした。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕前記
の検出対象であるPCR 増幅産物４μl に0.33規定のNaOH
16μl を加え、10分間放置し一方の検出試料とした。ま
た、PCR 反応後、上記磁性ビーズ処理した一本鎖化処理
検出試料20μｌを用いた。
【００４７】各試料20μl 及び検出プローブとして32P
標識した第３オリゴヌクレオチド及び第４オリゴヌクレ
オチド各1nmoleをハイブリダイゼーション液（５×SSC
，0.5 ％BSA ，0.5 ％PVP ，１％SDS ）80μl に添加
し、これを50℃で２時間加温した。加温後、固定化捕捉
プローブとしてポリT 結合磁性ビーズ（ダイナビーズオ
リゴ（dT）25：ダイナル社製）を20μl を加え、さらに
１時間反応後、磁石で当該磁性ビーズを集め、50℃下で
その磁石を１×SSC で３回洗浄した。その後、磁性ビー
ズの放射活性をベックマンレディーソルブ液を用い液体
シンチレーション計数により測定した。 〔結果〕結果を表１に示す。
標識した第３オリゴヌクレオチド及び第４オリゴヌクレ
オチド各1nmoleをハイブリダイゼーション液（５×SSC
，0.5 ％BSA ，0.5 ％PVP ，１％SDS ）80μl に添加
し、これを50℃で２時間加温した。加温後、固定化捕捉
プローブとしてポリT 結合磁性ビーズ（ダイナビーズオ
リゴ（dT）25：ダイナル社製）を20μl を加え、さらに
１時間反応後、磁石で当該磁性ビーズを集め、50℃下で
その磁石を１×SSC で３回洗浄した。その後、磁性ビー
ズの放射活性をベックマンレディーソルブ液を用い液体
シンチレーション計数により測定した。 〔結果〕結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】PCR 反応後、一本鎖化処理した試料では検
出感度の上昇が認められた。 （実施例２）実施例１のPCR 産物５μl 、及び「増幅さ
れた二種類のヌクレオチド鎖のうち、さらに一方のヌク
レオチド鎖に対して相補的なヌクレオチド鎖」として、
第５オリゴヌクレオチド40nmole のみを用い、第１、第
２オリゴヌクレオチドを添加することなく、実施例１と
同様の熱サイクルを５回実施した。但しアニール温度は
63℃であった。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕PCR
増幅産物を94℃加熱した後、又は室温に一夜放置した
後、実施例１の液相サンドイッチハイブリダイゼーショ
ン検出と同様の操作を行った。
出感度の上昇が認められた。 （実施例２）実施例１のPCR 産物５μl 、及び「増幅さ
れた二種類のヌクレオチド鎖のうち、さらに一方のヌク
レオチド鎖に対して相補的なヌクレオチド鎖」として、
第５オリゴヌクレオチド40nmole のみを用い、第１、第
２オリゴヌクレオチドを添加することなく、実施例１と
同様の熱サイクルを５回実施した。但しアニール温度は
63℃であった。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕PCR
増幅産物を94℃加熱した後、又は室温に一夜放置した
後、実施例１の液相サンドイッチハイブリダイゼーショ
ン検出と同様の操作を行った。
【００５０】その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】この結果、上記検出系においては増幅産物
を一夜放置した後でも測定は可能であった。 （実施例３） 〔試料核酸の調製〕参考例１の第５オリゴヌクレオチド
及び第２オリゴヌクレオチドをプライマーとして各々40
pmole を用いて実施例１と同様に遺伝子の増幅操作を行
った。
を一夜放置した後でも測定は可能であった。 （実施例３） 〔試料核酸の調製〕参考例１の第５オリゴヌクレオチド
及び第２オリゴヌクレオチドをプライマーとして各々40
pmole を用いて実施例１と同様に遺伝子の増幅操作を行
った。
【００５３】 変性 94℃ 60秒 アニール 58℃ 120秒 伸長反応 75℃ 90秒 (サイクル数) 30回 増幅反応後、94℃で５分間の加熱を行った後、エキソヌ
クレアーゼIII（東洋紡績社製 )380 単位を添加して、3
7℃で30分間反応させた。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
のエキソヌクレアーゼIII処理PCR 増幅産物10μl に0.6
規定のNaOHを10μl を加え、10分間放置し一本鎖核酸
試料とした。各試料20μl を用い、実施例１と同様の検
出を行った。また対照として、エキソヌクレアーゼIII
未処理のものも検出した。 〔結果〕結果を表３に示す。
クレアーゼIII（東洋紡績社製 )380 単位を添加して、3
7℃で30分間反応させた。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
のエキソヌクレアーゼIII処理PCR 増幅産物10μl に0.6
規定のNaOHを10μl を加え、10分間放置し一本鎖核酸
試料とした。各試料20μl を用い、実施例１と同様の検
出を行った。また対照として、エキソヌクレアーゼIII
未処理のものも検出した。 〔結果〕結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】増幅後、エキソヌクレアーゼIII処理した
試料において、検出感度の向上が認められた。 （実施例４）第６〜８オリゴヌクレオチド及び第6'〜8'
を用い、耐熱製DNA リガーゼを用いてコレラ核酸の増幅
を行った。オリゴヌクレオチド第６、７、7'、8'はその
5'末端をATP とホスホヌクレオチドキナーゼでリン酸化
した。またオリゴヌクレオチド第8'は3'末端の３塩基は
ホスホチオエート基で結合した。
試料において、検出感度の向上が認められた。 （実施例４）第６〜８オリゴヌクレオチド及び第6'〜8'
を用い、耐熱製DNA リガーゼを用いてコレラ核酸の増幅
を行った。オリゴヌクレオチド第６、７、7'、8'はその
5'末端をATP とホスホヌクレオチドキナーゼでリン酸化
した。またオリゴヌクレオチド第8'は3'末端の３塩基は
ホスホチオエート基で結合した。
【００５６】コレラ核酸は実施例１と同じ精製核酸を１
ng用いた。増幅条件を以下に記載する。 (反応液) 20mM Tris-HCl（pH7.6 ） 5mM MgCl2 25mM KCl 100 μM NAD 10mM DTT 100pmole 各々のオリゴヌクレオチド ───────────────────────────────── 100μl (総液量) 当該反応液を94℃で５分間保った後、TthDNAリガーゼ(
東洋紡績社製) を40単位加え、さらに94℃で１分間保っ
た後、下記の熱サイクルにより遺伝子の増幅を行った。
ng用いた。増幅条件を以下に記載する。 (反応液) 20mM Tris-HCl（pH7.6 ） 5mM MgCl2 25mM KCl 100 μM NAD 10mM DTT 100pmole 各々のオリゴヌクレオチド ───────────────────────────────── 100μl (総液量) 当該反応液を94℃で５分間保った後、TthDNAリガーゼ(
東洋紡績社製) を40単位加え、さらに94℃で１分間保っ
た後、下記の熱サイクルにより遺伝子の増幅を行った。
【００５７】 変性 94℃ 30秒 アニール 58℃ 60秒 伸長反応 50℃ 180秒 (サイクル数) 30回 増幅反応後、94℃で５分間の加熱を行った後、エキソヌ
クレアーゼIIIを380単位を添加して37℃で30分間反応さ
せて、増幅された二本鎖核酸を一本鎖にした。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
増幅産物10μl にO.6 規定のNaOH10μl を加え、10分間
放置し試料とした。また比較にエキソヌクレアーゼIII
未処理のものについても検討を行った。各試料20μl を
用い、実施例１と同様の検出を行った。 〔結果〕結果を表４に示す。
クレアーゼIIIを380単位を添加して37℃で30分間反応さ
せて、増幅された二本鎖核酸を一本鎖にした。 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
増幅産物10μl にO.6 規定のNaOH10μl を加え、10分間
放置し試料とした。また比較にエキソヌクレアーゼIII
未処理のものについても検討を行った。各試料20μl を
用い、実施例１と同様の検出を行った。 〔結果〕結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】増幅後エキソヌクレアーゼIII処理した試
料では、検出感度の向上が認められた。 （実施例５） 〔試料核酸の調製〕参考例１の第１オリゴヌクレオチド
及び第２オリゴヌクレオチドをプライマーとして各々40
pmole を用いて実施例１と同様に増幅を行った。但し第
１オリゴヌクレオチドの5'末端はホスホヌクレオチドキ
ナーゼとATP で予めリン酸化した。
料では、検出感度の向上が認められた。 （実施例５） 〔試料核酸の調製〕参考例１の第１オリゴヌクレオチド
及び第２オリゴヌクレオチドをプライマーとして各々40
pmole を用いて実施例１と同様に増幅を行った。但し第
１オリゴヌクレオチドの5'末端はホスホヌクレオチドキ
ナーゼとATP で予めリン酸化した。
【００６０】 変性 94℃ 60秒 アニール 58℃ 120秒 伸長反応 75℃ 90秒 (サイクル数) 30回 増幅反応後、反応液10μl を以下の反応液90μl に加
え、94℃で５分間の加熱を行った後、λエキソヌクレア
ーゼ(BRL社製 )120 単位を添加して37℃で30分間反応さ
せ、増幅された二本鎖核酸を一本鎖にした。
え、94℃で５分間の加熱を行った後、λエキソヌクレア
ーゼ(BRL社製 )120 単位を添加して37℃で30分間反応さ
せ、増幅された二本鎖核酸を一本鎖にした。
【００６１】(反応液) 67mM グリシン-KOH(pH9.4) 2.5mM MgCl2 50μg ／ml BSA 〔液相サンドイッチハイブリダイゼーション検出〕上記
の増幅産物10μl に0.6 規定のNaOH10μl を加え、10分
間放置し試料とした。また対象としてλエキソヌクレア
ーゼ未処理のものも実施した。各試料20μl を用い、実
施例１と同様の検出を行った。 〔結果〕結果を表５に示す。
の増幅産物10μl に0.6 規定のNaOH10μl を加え、10分
間放置し試料とした。また対象としてλエキソヌクレア
ーゼ未処理のものも実施した。各試料20μl を用い、実
施例１と同様の検出を行った。 〔結果〕結果を表５に示す。
【００６２】
【表５】
【００６３】増幅後、λエキソヌクレアーゼ処理した試
料では、検出感度の向上が認められた。
料では、検出感度の向上が認められた。
【００６４】
【発明の効果】本発明により、主に液相法におけるハイ
ブリダイゼーション反応において、核酸試料の再会合の
問題を除去した改良方法が提供される。
ブリダイゼーション反応において、核酸試料の再会合の
問題を除去した改良方法が提供される。
【００６５】
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２２ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の２７１番目から２９２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の６２２番目から６４２番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．３０ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７８番目から５０７番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTGTAATAT CTATCTCTGT AGCCCCTATT 30 配列番号：４ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２４ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５３番目から４７７番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 CGATGTAATT GTTCATCAAG CACCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 54 配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２３ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４３０番目から４５２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGATGGTATC GAGTTCATTT TGG 23 配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５１番目から４７１番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGGGTGCTTG ATGAACAATT A 21 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５１番目から４７１番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 TAATTGTTCA TCAAGCACCC C 21 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７２番目から４９２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 CATCGTAATA GGGGCTACAG A 21 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７２番目から４９２番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 TCTGTAGCCC CTATTACGAT G 21 配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２６ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４９３番目から５１８番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GATAGATATT ACAGTAACTT AGATAT 26 配列番号：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２６ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４９３番目から５１８番
目のヌクレオチドの配列と相補的配列を有する。 配列 ATATCTAAGT TACTGTAATA TCTATC 26
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の６２２番目から６４２番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．３０ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７８番目から５０７番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTGTAATAT CTATCTCTGT AGCCCCTATT 30 配列番号：４ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２４ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５３番目から４７７番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 CGATGTAATT GTTCATCAAG CACCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 54 配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２３ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４３０番目から４５２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGATGGTATC GAGTTCATTT TGG 23 配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５１番目から４７１番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GGGGTGCTTG ATGAACAATT A 21 配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４５１番目から４７１番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 TAATTGTTCA TCAAGCACCC C 21 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７２番目から４９２番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 CATCGTAATA GGGGCTACAG A 21 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４７２番目から４９２番
目のヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。 配列 TCTGTAGCCC CTATTACGAT G 21 配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２６ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４９３番目から５１８番
目のヌクレオチドの配列と相同的な配列を有する。 配列 GATAGATATT ACAGTAACTT AGATAT 26 配列番号：１１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２６ 配列を決定した方法：Ｓ 他の特徴：コレラ毒素遺伝子の４９３番目から５１８番
目のヌクレオチドの配列と相補的配列を有する。 配列 ATATCTAAGT TACTGTAATA TCTATC 26
Claims (14)
- 【請求項１】 核酸試料中の標的配列の存在をプローブ
との核酸ハイブリダイゼーション反応の有無により検出
する方法において、当該試料中の核酸を必要により二本
鎖から一本鎖に変性させた後、核酸試料として存在する
標的配列を有する一方のヌクレオチド鎖に対して相補的
な配列を有する他方のヌクレオチド鎖が、当該一方のヌ
クレオチド鎖に対比して実質的に少ないか、又は存在し
ない条件下で上記核酸ハイブリダイゼーション反応を行
うことを特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項２】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそ
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された核酸試料中の標的配列の存
在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の有
無により検出する方法において、 一方のプライマーをリガンドで標識して、 増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターに増幅
物中のリガンドを吸着させ、 リガンド標識されたプライマー伸長物を除去して、 核酸試料中の標的配列の存在を、プローブとの核酸ハ
イブリダイゼーション反応により検出する請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 請求項１記載の核酸の検出方法におい
て、核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去することを特徴とする核酸の
検出方法。 - 【請求項４】 請求項３記載の核酸の検出方法におい
て、核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一
方のみを分解するエキソヌクレアーゼによるヌクレオチ
ド鎖の分解であることを特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項５】 請求項３記載の核酸の検出方法におい
て、核酸試料として存在する標的配列を有する一方のヌ
クレオチド鎖に対して相補的な配列を有する他方のヌク
レオチド鎖を分解して除去する手段が、二本鎖核酸の一
方のヌクレオチド鎖にエキソヌクレアーゼ反応に対して
抵抗性を与える手段を施した後、当該二本鎖核酸を当該
エキソヌクレアーゼで処理して、他方のヌクレオチド鎖
を分解して除去することを特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項６】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそ
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、標的配列と相補的な塩基配列を有するヌクレオチ
ド鎖の増幅量を、標的配列を含むヌクレオチド鎖に対し
て低くすることを特徴とする、核酸試料中の標的配列の
存在をプローブとの核酸ハイブリダイゼーション反応の
有無により検出する請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそ
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、さらに一方のヌクレオチド鎖に対して相補的なプ
ライマーを基に、当該一方のヌクレオチド鎖に対して相
補的なヌクレオチド鎖を増幅させた核酸試料中の標的配
列の存在を核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーシ
ョン反応の有無により検出する請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそ
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、標的配列を含むヌクレオチド鎖にエキソヌクレア
ーゼ反応に対して抵抗性を与える手段を施した後、当該
増幅物を当該エキソヌクレアーゼで処理することを特徴
とする請求項５記載の核酸の検出方法。 - 【請求項９】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖に対してそ
れぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを基にし
て、当該プライマーを伸長せしめることを特徴とする遺
伝子の増幅方法で増幅された二種類のヌクレオチド鎖の
うち、標的配列を含まないヌクレオチド鎖を分解して除
去する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソ
ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖の分解であることを
特徴とする、請求項４記載の核酸の検出方法。 - 【請求項１０】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞ
れの鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖
とアニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレ
オチド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイ
ズさせた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結
させることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された
核酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸と
プローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により
検出する請求項１記載の核酸の検出方法において、 標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖断片
群のうち、少なくとも一つのヌクレオチド鎖断片を、上
記増幅反応に影響を及ぼさないリガンドで標識して、 当該増幅反応を行い、 二本鎖から一本鎖に変性させる前、若しくは変性させ
た後に、標識したリガンドに特異的なレセプターによっ
てリガンド標識された標的核酸配列と相補的配列を含む
オリゴヌクレオチド連結物を反応系から除去することを
特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項11】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれ
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核
酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する請求項１記載の核酸の検出方法において、標的配
列と相補的な配列を含むヌクレオチド鎖断片の添加量
を、これに対応するヌクレオチド鎖断片群の添加量と比
較して相対的に低くして、当該標的配列と相補的な配列
を含むヌクレオチド鎖断片の連結反応による生成量を低
くすることを特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項12】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれ
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅させ、さ
らに増幅された二本鎖断片の一方のヌクレオチド鎖のみ
に相補的な塩基配列を有する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を基に当該一方のヌクレオチド鎖を増幅し
て、この当該一方のヌクレオチド鎖以外のヌクレオチド
鎖の生成量を相対的に低くして、試料核酸とプローブと
のハイブリダイゼーション反応の有無により、核酸試料
中に標的配列が存在するか否かを検出することを特徴と
する請求項１記載の核酸の検出方法。 - 【請求項13】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれ
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核
酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する請求項１記載の核酸の検出方法において、一方の
ヌクレオチド鎖の反応系における存在量を実質的に少な
くするか、又は当該ヌクレオチド鎖が存在しない条件に
する手段が、二本鎖核酸の一方のみを分解するエキソヌ
クレアーゼによる分解であることを特徴とする核酸の検
出方法。 - 【請求項14】 ヌクレオチド鎖とその相補鎖のそれぞれ
の鎖に相補的であり、かつそれぞれのヌクレオチド鎖と
アニールした状態で隣接する二組以上のオリゴヌクレオ
チド断片群を対応するヌクレオチド鎖にハイブリダイズ
させた後、当該オリゴヌクレオチド鎖断片同士を連結さ
せることを特徴とする遺伝子の増幅方法で増幅された核
酸試料中に標的配列が存在するか否かを、試料核酸とプ
ローブとのハイブリダイゼーション反応の有無により検
出する請求項１記載の核酸の検出方法において、一方の
ヌクレオチド鎖を反応系から除去する手段がエキソヌク
レアーゼによる反応であり、かつ反応系からの除去を企
図しないヌクレオチド鎖の基となるオリゴヌクレオチド
断片群の一部又は全部にエキソヌクレアーゼ反応に対し
て抵抗性を与える手段を施したことを特徴とする核酸の
検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4253037A JPH0698797A (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | 核酸検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4253037A JPH0698797A (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | 核酸検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698797A true JPH0698797A (ja) | 1994-04-12 |
Family
ID=17245604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4253037A Pending JPH0698797A (ja) | 1992-09-22 | 1992-09-22 | 核酸検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0698797A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004011643A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | 核酸プローブ固定化基体およびそれを用いた標的核酸の存在を検出する方法 |
| US7618066B2 (en) | 2000-03-28 | 2009-11-17 | Giesecke & Devrient Gmbh | Photoengraved printed data carrier |
| JP2010166914A (ja) * | 1996-10-08 | 2010-08-05 | Kreatech Biotechnology Bv | ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体 |
-
1992
- 1992-09-22 JP JP4253037A patent/JPH0698797A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010166914A (ja) * | 1996-10-08 | 2010-08-05 | Kreatech Biotechnology Bv | ヌクレオチドを標識付けする方法、標識ヌクレオチド及び有用な中間体 |
| US7618066B2 (en) | 2000-03-28 | 2009-11-17 | Giesecke & Devrient Gmbh | Photoengraved printed data carrier |
| WO2004011643A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | 核酸プローブ固定化基体およびそれを用いた標的核酸の存在を検出する方法 |
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