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JPH069517B2 - セフアロスポリンｃの製法 - Google Patents

セフアロスポリンｃの製法

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Publication number
JPH069517B2
JPH069517B2 JP59042203A JP4220384A JPH069517B2 JP H069517 B2 JPH069517 B2 JP H069517B2 JP 59042203 A JP59042203 A JP 59042203A JP 4220384 A JP4220384 A JP 4220384A JP H069517 B2 JPH069517 B2 JP H069517B2
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JP
Japan
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alkyl
phosphite
hydrogen
phenyl
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Application number
JP59042203A
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JPS59173097A (ja
Inventor
デビツド・アンソニ−・ロウ
ガ−ネ・ロマニツク
レオナ−ド・エム・カツプレツテイ
リチヤ−ド・ポ−ル・エランダ−
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of JPS59173097A publication Critical patent/JPS59173097A/ja
Publication of JPH069517B2 publication Critical patent/JPH069517B2/ja
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセフアロスポリンＣの改良製法に関する。特に
本発明は不要のデスアセチルセフアロスポリンＣも生成
するセフアロスポリンＣ生成性微生物発酵中培養媒質へ
のある有機および無機りん化合物添加に関する。
上記りん化合物添加は不純物デスアセチルセフアロスポ
リンＣの発酵を非常に抑制するので、発酵肉汁からセフ
アロスポリンＣを回収できまた後に７−アミノセフアロ
スポラン酸（７−ＡＣＡ）に転化できる。
セフアロスポリンＣ〔３−アセトキシメチル−７β−
（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）セ
フ−３−エム−４−カルボン酸）はそれ自体ある程度抗
生物質活性をもつが、主に準合成セフアロスポリン抗生
物質製造の出発物質として重要ものである。故にセフア
ロスポリンＣは知られた方法で３−アセトキシメチル−
７β−アミノセフ−３−エム、カルボン酸（７−ＡＣ
Ａ）に転化でき、これは広範な市販セフアロスポリン抗
生物質製造用重要中間体として使用できる。
セフアロスポリンＣは特にエメリセロプシス−セフアロ
スポリウム（Emericellopsis-Cephalosporium）属の菌
を含む種々の微生物の発酵によつてえられることが知ら
れている。セフアロスポリン−Ｃ生成性微生物の例は、
セフアロスポリウム（Cephalosporum）の原ブロック
株、即ちセフアロスポリウム種、I.M.I. ４９１３７
（ＡＴＣＣ １１５５０）および英国特許第1,109,362
号に記載の突然変異株８６５０（ＡＴＣＣ１４５５３）
の様なその突然変異体、英国特許第1,503,851号に記載
のセフアロスポリウム種I.B.M.１１３１および英国特許
第1,400,433号に記載のセフアロスポリウム種株、Ｆ．
１２（ＡＴＣＣ ２０３３９）がある。文献に報告され
ているセフアロスポリンＣ生成性有機体の他の例には英
国特許第1,488,822号に記載のセフアロスポリウム ポ
リアリューラム（polyaleurum）Ｙ−５０５（−ＰＦＥ
ＲＭNo.１１６０）、英国特許第１，４８８，８２１号
に記載のセフアロスポリウム アクレモニウム（acremo
nium）Ｋ−１２１（ＡＴＣＣ ２０４２７）およびセフ
アロスポリウム アクレモニウム Ｎ−７５（ＡＴＣＣ
２０４２８）およびセフアロスポリウム ポリアリュ
ーラム １９９（ＡＴＣＣ ２０３５９）および英国特
許第1,389,714号に記載のＹ５０５（ＡＴＣＣ ２０３
６０）というその突然変異体がある。セフアロスポリン
Ｃは一般にセフアロスポリウム アクレモニウム（アク
レモニウム クリソジエナム （Chrysogenum）とも知
られている）の高生産性突然変異株を用いて工業的に生
産される。この突然変異体およびその製法の例は文献に
広く記載されている。
多年のあらゆる研究にも拘らずセフアロスポリンＣの工
業的発酵法は未だ十分満足なものでない。殆んどのセフ
アロスポリンＣを生成する微生物、特に工業的製造に使
われる高生成株はその化学的物理的性質が同じため望む
セフアロスポリンＣ生成物から分離が極めてむつかしい
不純物、デスアセチルセフアロスポリンＣの相当量を同
時に生成する。発酵中生成される全セフアロスポリンＣ
核の約１５％量のデスアセチルセフアロスポリンＣの存
在はセフアロスポリンＣ（又はより普通にその溶媒抽出
可能な誘導体）の回収の際デスアセチルセフアロスポリ
ンＣ（又はその誘導体）が混在する。更にセフアロスポ
リンＣ（又はその誘導体）は工業的にあとの７−ＡＣＡ
への転化前に普通精製されないので、７−ＡＣＡの製品
品質も初めの発酵肉汁中のデスアセチルセフアロスポリ
ンＣの同時生成によつて悪影響をうける。
従来のセフアロスポリンＣ製法は主としてより高いセフ
アロスポリンＣ生産性をもつ新微生物のセフアロスポリ
ンＣ生産を増す発酵添加物に関している。故に例えば実
質的にセフアロスポリンＣを高収率生成するセフアロス
ポリウム アクレモニウムの突然変異株が開発されてい
る。セフアロスポリンＣを生成有機体の発酵中セフアロ
スポリンＣの収率を上げる様栄養媒質に種々の添加物を
加えることが示唆されている。故に亜硫酸ナトリウム、
メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ヒドロ
亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、および硫酸ナ
トリウムの様ないおう化合物の使用は英国特許第820,42
2号に発表されており、メチオニン、塩化カルシウム、
塩化マグネシウム、硫酸アンモニウム、およびある炭水
化物、油と脂肪酸の使用は英国特許第983,755号に発表
されており、ノルヴアリンとノルロイシンの使用は英国
特許第975,393号に発表されており、フエニル酢酸の使
用は英国特許第975,394号に発表されており、またε−
カプロラクタム、２−ブタノン、第２ブチルアルコール
と1,3−ブタンジオールの使用は英国特許第1,503,851号
に発表されている。セフアロスポリンC発酵中のデスアセチルセフアロスポリンC
の同時生成問題はセフアロスポリンCとしてより高率のセフアロスポリンC
核生成微生物生成法又は抽出-分離法(例えば米国特許第
4,059,573号）の形でのみ提出されている。
デスアセチルセフアロスポリンＣは初めセフアロスポリ
ウム アクレモニウムの培養物液で検出された。アブ
ラハムらはこの物質の生成はセフアロスポリンＣの酵素
的脱アセチル化によると考えた。（Biochem.J.81、５９
１−５９６、１９６１）。次いでセフアロスポリンＣを
脱アセチル化できるテステラーゼ酵素が種々の源泉、例
えば柑橘類、細菌、放線菌類、小麦胚芽、哺乳動物肝臓
と腎臓およびロードトルラ（Rhodotorula）から単離さ
れている。Develop.Ind.Microbiol8、417−423（１９６
７）にピサノらはセフアロスポリウム属中にエステラー
ゼ活性は広がつていると報告している。大部分のこのア
セチルエステラーゼ酵素は広い基質耐性をもつと思われ
る。即ちβ−ナフチル アセテイトとトリアセチンは活
性物質であり、セフアロスポリンＣに対するその活性は
特異とは思われない。マツクドナルド，Ｋ，Ｄ．，ニュ
ーヨーク、アカデミツクプレス変輯Second Internation
al Symp.on Genetics of Industrial Microorgnisms,Pr
oc.,４５１−４７２ページ（１９７５）のNueschらおよ
びAgr.Biol.Chem.39(6)、１３０３−1309（１９７５）
のフザサワらは各別個にセフアロスポリウム アクレモ
ニウムの細胞外肉汁澄液からセフアロスポリンＣエスト
ラーゼ活性を部分精製しこの酵素活性の存在がＣ．アク
レモニウム発酵におけるデスアセチルセフアロスポリン
Ｃの発生の原因にある程度なつていると結論した。同様
にエストラーザ活性はセフアロスポリンＣ生成性ストレ
プマイセス ストレプトマイセテス クラバリゲルス
（Streptmyces Clavuligerus）（Antimicrob.Agents Ch
emother1、237-241(1972））中で検出されている。しか
しフーバーはAppl.Microbiol.16(7)、1011−1014（１９
６８）中で発酵法におけるデスアセチルセフアロスポリ
ンＣの生成はセフアロスポリンＣの非酵素的加水分解に
よるものであると証明している。セフアロスポリンＣ生
成が酵素的と非酵素的両方の加水分解によるものであ
り、酵素的アセチルエストラーゼ活性が特別な役割をす
るというのが本発明の考えである。
リールシュらのマツクドナルド。Ｋ．Ｄ．ニューヨー
ク、アカデミツクプレス編Second International Symp.
on Gentics of Industrial Microorganisms,Proc.,１７
９−１９５ページ（１９７６）およびフエリツクスらの
FEMS Microbiol.ctt.８、５５−５８（１９８０）はデ
スアセチルセフアロスポリンＣもデスアセトキシセフア
ロスポリンＣからセフアロスポリンＣ生合成における細
胞内中間体であることを示している。
セフアロスポリウム アクレモニウムから部分精製した
アセチルエストラーゼの酵素活性はエステラーゼの抑制
剤と認められたジイソプロピルフルオロホスフエイト
（Agr.Bicl.Chem.３９(6)、１３０３−１３０９、１９
７５）によつて抑制されると報告された。しかしこのり
んアセチルエストラーゼ抑制剤を激しい毒性と高価のた
めセフアロスポリンＣの工業的製造には使用できない。
セフアロスポリンＣの大気中での性質のためこれは発酵
肉汁から溶媒抽出法でより容易に回収できる様その誘導
体に通常変えられる。この誘導体の例は英国特許出願第
2,021,640Ａに記載されている。特に好ましい１方法は
米国特許第3,573,296号に発表されている。この好まし
い方法によつてえられるセフアロスポリンＣ誘導体は米
国特許第3,830,809号に発表されている様に結晶性ビス
ージクロロヘキシルアミン塩として回収できる。次いで
発酵肉汁から回収されたセフアロスポリンＣ又はその誘
導体は普通の方法、例えば米国特許3,932,392号の方法
によつて裂開されて７−ＡＣＡとなる。
上に記載のとおり発酵中全セフアロスポリン核（セフア
ロスポリンＣとデスアセチルセフアロスポリンＣ）の約
１５％の量でえられたデスアセチルセフアロスポリンＣ
不純物は望むセフアロスポリンＣ製品と全く同じ化学的
性質をもつている。故にセフアロスポリンＣを溶媒抽出
可能な誘導体に変えるとデスアセチルセフアロスポリン
Ｃも同じ誘導体に変り分離されたセフアロスポリンＣ誘
導体にはデスアセチルセフアロスポリンＣ誘導体が混在
している。したがつてデスアセチルセフアロスポリンＣ
としてえられるセフアロスポリン核の割合を減少すれば
純セフアロスポリンＣ誘導体生成物となることはわかる
であろう。更にこの誘導体は７−ＡＣＡに転化前に通常
精製されないので発酵肉汁のデスアセチルセフアロスポ
リン量の減少はより良い７−ＡＣＡ製品品質となる。
本発明はセフアロスポリンＣ発酵中デスアセチルセフア
ロスポリンＣ生成抑制剤として働らくあるりん化合物を
提供するものである。えられる発酵肉汁はデスアセチル
セフアロスポリンＣに対しセフアロスポリンＣを著しく
高い割合で含むので回収したセフアロスポリンＣ製品品
質、引いてはこのセフアロスポリンＣ製品からつくつた
最終７−ＡＣＡ中間体の品質を改良する。
本発明はセフアロスポリンＣ生成性微生物の浸漬好気性
培養によるセフアロスポリンＣの改良製法に関する。特
に本発明は培養媒質中にある有機および無機りん化合物
添加によるセフアロスポリンＣ生成性でありデスアセチ
ルセフアロスポリンＣも生成する微生物の発酵中のデス
アセチルセフアロスポリンＣ生成抑制法に関する。
本発明によるりん化合物抑制剤は一般式： をもつ。上記式中式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は各無関係に
任意に置換されたアルキル、アリール又はアラルキルを
表わし；Ｒ4は任意に置換されたアルキル又は−ＯＲ10
（Ｒ10は水素又は任意に置換されたアルキル、アリール
又はアラルキルを表わす）を表わし；Ｒ5は水素又は任
意に置換されたアルキル、アリール又はアラルキルを表
わし；Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アルケニル、アルカノ
イル又は任意に置換されたアルキル基を表わし；かつＲ
8とＲ9はいづれも水素又はいづれもクロロである。これ
らの化合物はセフアロスポリンＣの発酵製造中デスアセ
チルセフアロスポリンＣの生成を効果的に減少する。更
にこれら化合物はジイソピロピルフルオロホスフエイト
よりも実質的に毒性小さく一般に比較的安価であるので
大規模セフアロスポリンＣ製造に実用できる。
本発明の方法が発酵肉汁中においてセフアロスポリンＣ
生成性でありデスアセチルセフアロスポリンＣも生成す
る微生物を用いる以外は本発明法は普通のセフアロスポ
リンＣ製造用発酵法に使用できる。この微生物の例は文
献・英国特許出願2,060,60Ａ等に記載されている。他の
セフアロスポリンＣ生成性微生物はデスアセチルセフア
ロスポリンＣ生成についてこの分野でよく知られた普通
の試験法により容易に試験できる。
本発明に用いる最も好ましいセフアロスポリンＣ生成性
微生物はセフアロスポリンＣとデスアセチルセフアロス
ポリンＣの両方を生成するセフアロスポリウム アクレ
モニウム（アクレモニウム クリソジエナムとも知られ
ている）株である。代表的セフアロスポリウム アクレ
モニウム製造株はデスアセチルセフアロスポリンＣとし
て全セフアロスポリンＣ核（セフアロスポリンＣとデサ
セチルセフアロスポリンＣ）の約１５％を生成する。
本発明の方法は普通のセフアロスポリンＣ発酵法によつ
てセフアロスポリンＣ栄養媒質中で好気性条件、好まし
くは浸漬培養液中でセフアロスポリンＣ生成性微生物
（セフアロスポリンＣとデスアセチルセフアロスポリン
Ｃを生成しうる）を培養して行なうとよい。本発明はあ
るりん化合物を栄養媒質中に加えることにより発酵時デ
スアセチルセフアロスポリンＣの生成を実質的に減少し
て不要のデスアセチルセフアロスポリンＣに比べ望むセ
フアロスポリンＣを実質的に含む最終肉汁がえられると
いう発見に基づく。
使用する栄養媒質は炭素と窒素の同化性源を含む必要が
ありまた必要ならば成長促進物質および無機塩を加え
る。適当する炭素源には例えばグルコース、蔗糖、澱
粉、可溶性澱粉、植物油、動物油、デキストリンおよび
麦芽糖がある。
適当する窒素源には例えば天然窒素含有物質又はそれか
らつくつた物質、例えば肉抽出液、ペプトン、カゼイ
ン、コーン浸漬液、酵母抽出液、大豆粉、トリプトン、
綿実粉、麦ふすまがある。窒素を含む有機又は無機化合
物、例えば尿素、硝酸塩およびアンモニウム塩、例えば
酢酸アンモニウム、塩化又は硫酸アンモニウムも使用で
きる。
発酵アンモニウム媒質に使われる無機塩は硫酸塩、硝酸
塩、塩化物、炭酸塩等で、これらはセフアロスポリンＣ
製造に使われている。
使用できる成長促進剤には例えばシステイン、シスチ
ン、チオサルフエイト、メチルオレフエイト、特にメチ
オニンがあり、また鉄、亜鉛、銅およびマンガンの様な
微量元素もある。
温度、pHおよび発酵時間の様な培養条件は使用微生物が
望むセフアロスポリンＣの最大量を堆積する様選ばれ
る。温度は通常約１５−４５℃、好ましくは約２５℃に
保たれ、また発酵は約１−２０日間、好ましくは４−１
０日間、最も好ましくは約６日間である。
今やある有機および無機りん化合物をセフアロスポリン
Ｃ生成性微生物の培養中培養媒質に加えると発酵肉汁中
のデスアセチルセフアロスポリンＣの生成を実質的に減
少することが発見されたのである。このデスアセチルセ
フアロスポリンの生成減少はセフアロスポリンＣ生成性
微生物の培養中一般に生成されるアセチルエステラーゼ
酵素の抑制結果と信じられている。
本発明の方法に使用できるりん化合物は式： で表わされる。式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は各無関係に任
意に置換されたアルキル、アリール又はアラルキルを表
わし；Ｒ4は任意に置換されたアルキル又は−ＯＲ
10（但しＲ10は水素又は任意に置換されたアルキル、ア
リール又はアラルキルを表わす）を表わし；Ｒ5は水素
又は任意に置換されたアルキル、アリール又はアラルキ
ルを表わし；Ｒ6は水素、ヒドロキシアルケニル、アル
カノイル又は任意に置換されたアルキル基を表わし；か
つＲ8とＲ9はいづれも水素又はいづれもクロロである。
好ましいりん化合物は式Ｉ、II、IIIおよびIVにおいて
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が各無関係に直鎖又は分岐鎖Ｃ1−Ｃ
10アルキル、フエニル又はフエニル（Ｃ1−Ｃ4）アルキ
ルを表わし（上記アルキル基又はフエニルアルキルのア
ルキル部分はクロロ、ブロモ、フルオロ、アイオド又は
カルボキシの様な置換基１又は２以上、好ましくは１乃
至３で任意に置換されており、また、上記フエニル又は
フエニルアルキル部分はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6ア
ルコキシおよびハロから無関係に選ばれた置換基１又は
２以上、好ましくは１乃至３で任意に置換されてい
る）、を表わし；Ｒ4はハロ基１又は２以上、好ましく
は１−３で任意に置換されたＣ1−Ｃ6アルキル又は−Ｏ
Ｒ10（但しＲ10は水素、Ｃ1−Ｃ10アルキル、フエニ
ル、又はフエニル（Ｃ1−Ｃ4であり、アルキル（上記ア
ルキル、フエニルおよびフエニルアルキル基は上記Ｒ1
について定義したとおり任意に置換されていてもよい）
を表わし；Ｒ5は水素、Ｃ1−Ｃ10アルキル、フエニル、
又はフエニル（Ｃ1−Ｃ4）アルキル（上記アルキル、フ
エニルおよびフエニルアルキル基は上記Ｒ1について定
義したとおり任意に置換されていてもよい）を表わし；
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ
6アルカノイル、又はＣ1−Ｃ6アルキル（上記アルキル
基はシアノ、Ｃ2−Ｃ6アルカノイル又はカルボ（Ｃ1−
Ｃ6）アルコキシの様な置換基１又は２以上、好ましく
は１−３で任意に置換されていてもよい）を表わし；か
つＲ8とＲ9はいづれも水素又はいづれもクロロである様
な式Ｉ、II、IIIおよびIVをもつ化合物である。
式Ｉをもつホスフアイト化合物の例はトリメチルホスフ
アイトトリエチル ホスフアイト、トリイソプロピル
ホスフアイト、トリブチル ホスフアイト、トリフエニ
ル ホスフアイトおよびトリス（２−クロロエチル）ホ
スフアイトである。ベンジル ジエチル ホスフアイト
およびジフエニル イソデシル ホスフアイトの様な混
合官能ホスフアイトも使用できる。
式IIをもつりん化合物の例には亜りん酸、ジベンジル、
ホスフアイト、ジブチル ホスフアイト、ジエチル、ホ
スフアイト、ジイソプロピル、ホスフアイト、ジメチル
ホスフアイト、ジフエニル ホスフアイト、トリエチ
ル ホスフアイノ アセテイト、２−クロロエチル、ホ
スホン酸、ジエチル シアノメチル、ホスフオネイト、
ジメチル メチル ホスフオネイト、ジメチル ホスフ
エイト、トリメチル ホスフオノアセテイト、ジエチル
エチル ホスフオネイト、ジエチル カルボメトキシ
メチル ホスフオネイト、ジエチル ジエチル アセ
チル ホスフオネイト、ジメチルアセチルメチル ホス
フオネイト、ジメチル シアノメチル ホスフオネイ
ト、ジエチル アリル ホスフオネイトおるび２−カル
ボキシエチル ホスフオン酸がある。
式IIIをもつ化合物には次亜りん酸、モノメチルホスフ
オネイト、モノエチルホスフオネイトおよび2,2,2-トリ
クロロエチル ホスホロジクロリダイトがある。
式IVをもつピロホスフアイト化合物にはテトラメチルピ
ロホスフアイトとテトラエチルピロホスフアイトがあ
る。
好ましいりん化合物は抑制剤には亜りん酸、次亜りん
酸、ジイソプロピル ホスフアイト、トリイソプロピル
ホスフアイト、ジベンジル ホスフアイト、ジメチル
ホスフアイト、トリブチル ホスフアイト、トリエチ
ル ホスフオノアセテイト、２−クロロエチル ホスフ
オン酸、テトラエチルピロホスフアイト、ジエチル シ
アノメチル ホスフオネイト、ジメチル メチル ホス
フオネイト、2,2,2-トリクロロエチル ホスフオロジク
ロリダイト、ジメチル ホスフエイト、ジフエニル ホ
スフアイト、トリフエニル ホスフアイト、トリメチル
ホスフアイト、ジブチル ホスフアイト、トリス（２
−クロロエチル）ホスフアイト、トリメチル ホスフオ
ノ アセテイト、ジエチルエチル ホスフオネイト、ジ
エチル カルボメトキシメチル ホスホネイト、ジエチ
ル アセチル ホスホネイト、ジメチル アセチルメチ
ル ホスホネイト、ジメチル シアノメチル ホスホネ
イトおよびジエチル アリル ホスホネイトがある。
特に好ましい化合物には亜りん酸、次亜りん酸、ジイソ
プロピル、ホスフアネイト、トリイソプロピル ホスフ
アイト、ジベンジル ホスフアイト、ジメチル ホスフ
アイトおよび トリブチル ホスフアイトがある。
最も好ましいりん化合物抑制剤は亜りん酸である。
りん化合物は約１００乃至３０００ｐｐｍ（重量基
準）、好ましくは約２００乃至１０００ｐｐｍの最終肉
汁濃度となる様使用するとよい。抑制化合物は発酵中一
時に又は一定間隔で添加できる。
有機りん化合物は約７０乃至１４０時間の発酵進行中に
１回又は数回に添加するのが最も便利である。無機りん
化合物は接種直後から約１４０時間迄の発酵進行中に添
加できる。また化合物は殺菌前の発酵媒質中にバツチで
きる。
本発明の方法による上記りん化合物使用は発酵肉汁中の
デスアセチルセフアロスポリンＣの割合（セフアロスポ
リンＣとデスアセチルセフアロスポリンＣの全セフアロ
スポリン核を基準として）を実質的に低下することが発
見されている。代表的セフアロスポリンＣ発酵に化合物
使用の場合、デスアセチルセフアロスポリンＣの濃度は
非処理発酵時の約１５％（全セフアロスポリン核に対
し）に比べて約４％に減少されたのである。
処理した振とうフラスコ発酵において生成されたセフア
ロスポリン核の全量は変らず残ると思われ、かくしてセ
フアロスポリンＣ力価は一般に適当量だけ増加される。
大規模発酵においてはりん抑制化合物使用がセフアロス
ポリンＣ量増加となるに至つていない。しかしセフアロ
スポリンＣ濃度が一定に止つていてさえ処理した発酵中
のデスアセチルセフアロスポリンＣの減量はより高純度
のセフアロスポリンＣ製品回収を非常に可能にするであ
ろう。
本発明のりん化合物は酵素濃度でその抑制活性をもつと
示された。故にセフアロスポリンＣエステラーゼ活性は
ＤＥＡＥセフアデツクスＡ５０管クロマトグラフ法によ
りセフアロスポリウム アクレモニウム肉汁上澄液から
部分的に精製され、このプレパレイシヨンの加水分解活
性（セフアロスポリンＣのデスアセチルセフアロスポリ
ンＣへの転化をフオローしＨＰＬＣによつて測定した場
合）が式Ｉ、II、IIIおよびIVをもつりん化合物によつ
て抑制されることが発見された。
発酵完了後セフアロスポリンＣ製品は米国特許第3,573,
296号に記載の様な知られた方法によつて溶媒抽出法に
よつて容易に回収できる様な誘導体に転化される。発酵
によつてえたセフアロスポリンＣ又はその誘導体は次い
で既知法によつて多くの準合成セフアロスポリンＣ製造
の重要中間体７−ＡＣＡに変えられる。本発明によるり
ん抑制化合物使用によつてセフアロスポリンＣ又はその
誘導体および最終７−ＡＣＡ中間体はより効果的にまた
非処理肉汁法と比較した場合非常に高純度でえられる。
次の実施例は本発明を例証するためのもので、如何なる
意味でも本発明の範囲を特記した実施態様に限定するも
のではない。実施例に使用したｐｐｍは重量対重量基準
である。以下におけるCephCはセフアロスポリンＣを、
またDephＣはデスアセチル セフアロスポリンＣを表わ
す。
実施例１ セフアロスポリウム アクレモニウム（デスアセチルCe
phCも生成する高cephC生成性突然変異株）の標準振とう
フラスコ発酵液を次の方法でよつてつくつた。冷凍保存
培養液からのコーン浸漬液−グルコース主体の種媒質接
種から種培養を開始した。種フラスコを２６０ｒｐｍで
振とうしながら２８℃で３日培養し、１０％接種量を生
産段階発酵開始に使用した。生成媒質はコーン浸漬液、
PHARMMEDIA（テキサス州フオース ウオース、トシイダ
ース オイル ミル社販売の綿実粉）、デキストリン、
大豆油、メチオニンおよび硫酸アンモニウムの平衡組成
物に基づいた。フラスコを２６０ｒｐｍ、２５℃で全６
日間振とうし、次いで肉汁試料を稀釈、過してＨＰＬ
Ｃ法によつてcephCとDes cephCを分析した。抑制剤は下
記量を４日目（９６時間）に加えた。結果は次のとお
り： 実施例２ 実施例１に記載の標準振とうフラスコ発酵条件と同じ生
成用培養液を用いて無機と有機りん化合物を接種後０．
４８および９６時間の進行中の発酵液に加えて最終抑制
剤肉汁液濃度１００乃至８００ｐｐｍとした。結果は次
表のとおり： 実施例３ 実施例１の標準振とうフラスコ発酵条件および同じ生成
用培養液を用いて無機りん抑制化合物を媒質に加えた後
１２１℃のオートクレイプ中で２０分間殺菌した。結果
を次表に示す。
実施例４ 標準培養液生成と発酵法により３０撹拌槽発酵機中で
セフアロスポリウム アクレモニウムを発酵させた。コ
ーン浸漬液−フア−マメイデイア−グルコース媒質上プ
ロパージ（proparge）した種培養液を使つて容器の媒質
容量の１０％に接種した。発酵媒質はコーン浸漬液、大
豆粉、および有機炭素と窒素として大豆油より成るもの
であつた。発酵中グルコース シロップと大豆油を供給
した。９６時間において試験発酵機にトリブチルホスフ
アイトを最終的汁濃度３００ｐｐｍまで加えた。添加効
果を下記セフアロスポリンＣとデスアセチルセフアロス
ポリンＣの濃度変化について記録している。
トリブチル ホスフアイト添加はデスアセチルセフアロ
スポリンＣ生成量を対照試験におけるceph核の１５．０
％から９．１％まで低下したのである。
実施例５ 普通のセフアロスポリンＣ媒質と普通の方法を用いて３
０００撹拌槽発酵機中でセフアロスポリウム アクレ
モニウムを発酵した。１００時間においてジメチル水素
ホスフアイトを最終汁濃度６００ｐｐｍまで加えた。添
加抑制剤の結果は次のとおりである。
実施例６ 次の添加りん化合物も振とうフラスコ発酵法で試験した
処デスアセチルセフアロスポリンＣ生成に対して抑制活
性を示した： トリエチル ホスホノアセテイト、 ２−クロロエチル ホスホン酸、 テトラエチルピロホスフアイト、 ジエチル シアノメチル ホスホネイト、 2,2,2-トリクロロエチル ホスホロジクロリダイト、 ジメチル ホスフエイト、 トリメチル ホスフアイト、 トリエチル ホスフアイト、 ジブチル ホスフアイト、 トリ（２−クロロエチル）ホスフアイト、 トリメチル ホスホノアセテイト、 ジエチル エチル ホスホネイト、 トリブチル ホスフアイト、 トリフエニル ホスフアイト、 ジエチル カルボメオキシメチル ホスホネイト、 ジメチル アセチルメチル ホスホネイト、 ジメチル シアノメチル ホスホネイト、 ジエチル アリル ホスホネイト、 実施例７ 次の添加りん化合物も発酵機内で試験した処デスアセチ
ルセフアロスポリンＣ生成に対して抑制活性を示した： トリエチル ホスホノアセテイト、 ２−クロロエチル ホスホン酸、 テトラエチルピロホスフアイト、 ジエチル シアノメチル ホスホネイト、 ジメチル メチル ホスホネイト、 2,2,2-トリクロロエチル ホスホロジクロリダイト、 ジメチル ホスフエイト、 トリエチル ホスフアイト、 ジフエニル ホスフアイト、 トリフエニル ホスフアイト、 ジイソプロピル ホスフアイト、 トリイソプロピル ホスフアイト。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチヤ−ド・ポ−ル・エランダ− アメリカ合衆国ニユ−ヨ−ク州13104マン リウス・ベイサ−・ドライブ8376

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】セフアロスポリンＣを生成すると共にデス
    アセチルセフアロスポリンＣも生成する微生物を栄養媒
    質中で培養することによるセフアロスポリンＣの製法に
    おいて、上記媒質中に式： （式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は各無関係に直鎖又は分岐
    鎖Ｃ1−Ｃ10アルキル、フエニル又はフエニル（Ｃ1−Ｃ
    4）アルキルを表わし上記アルキル基又はフエニルアル
    キルのアルキル部分は任意に１又は２以上のハロ又はカ
    ルボキシ置換基で置換されておりまた上記フエニル基又
    はフェニルアルキルのフエニル部分は任意に１又は２以
    上のＣ1−Ｃ6アルキルＣ1−Ｃ6アルコキシ又はハロ置換
    基で置換されており；Ｒ4は任意に１又は２以上のハロ
    基で置換されたＣ1−Ｃ6アルキル又は−ＯＲ10を表わ
    し、但しＲ１０は水素又は上記Ｒ1について定義したと
    おりの基を表わし；Ｒ5は水素又は上記Ｒ1について定義
    したとおりの基を表わし；Ｒ6は水素、ヒドロキシ、Ｃ2
    −Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルカノイル又はＣ1−Ｃ6
    アルキルを表わし、上記アルキル基は任意に１又は２以
    上のシアノ、Ｃ2−Ｃ6アルカノイル又はカルボ（Ｃ1−
    Ｃ6）アルコキシ基によつて置換されており；かつＲ8と
    Ｒ9はいづれも水素又はいづれもクロロを表わす）で示
    されるりん化合物を約１００乃至３０００ppmの濃度に
    加えることを特徴とする改良製法。
  2. 【請求項２】微生物がセフアロスポリウム属のセフアロ
    スポリンＣ生成性株である特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  3. 【請求項３】微生物がセフアロスポリウム アクレモニ
    ウムのセフアロスポリンＣの生成性株である特許請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】りん化合物が式： （但し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は各無関係にＣ1−Ｃ10アル
    キル、ハロ−置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、フエニル又は
    ベンジルを表わす）で示される特許請求の範囲第１項、
    ２項又は３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】Ｒ1、Ｒ2およびＲ3が各無関係にメチル、
    エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、フエニル、ベンジ
    ル、イソデシル又は２−クロロエチルである特許請求の
    範囲第４項に記載の方法。
  6. 【請求項６】りん化合物が式： （式中Ｒ4がＣ1−Ｃ6アルキル、ハロ−置換Ｃ1−Ｃ6ア
    ルキル又は−ＯＲ10であり、かつＲ10が水素、Ｃ1−Ｃ6
    アルキル、ハロ−置換Ｃ1−Ｃ10アルキル、フエニル又
    はベンジルであり；Ｒ5が水素、Ｃ1−Ｃ10アルキル、ハ
    ロ−置換Ｃ1−Ｃ10アルキル、フエニル又はベンジルで
    あり；かつＲ6が水素、ヒドロキシ、Ｃ2−Ｃ6アルケニ
    ル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルカノイル又はＣ２
    −Ｃ６アルカノイル、、カルボ（Ｃ1−Ｃ6）アルコキシ
    又はシアノにより置換されたＣ1−Ｃ6アルキルである）
    で示される特許請求の範囲第１項、２項又は３項に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】Ｒ4が２−クロロエチル又は−ＯＲ10（但
    しＲ10は水素、ベンジル、ｎ−ブチル、エチル、イソプ
    ロピル、メチル、フエニル又は2,2,2−トリクロロエチ
    ルとする）であり；Ｒ5が水素、エチル、メチル、２−
    クロロエチル、ｎ−ブチル、フエニル、イソプロピル又
    はベンジルであり；かつＲ6が水素、ヒドロキシ、アリ
    ル、シアノメチル、カルボエトキシメチル、メチル、カ
    ルボメトキシメチル、エチル、アセチル又はアセチルメ
    チルである特許請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】りん化合物が式： （式中Ｒ5が水素、Ｃ1−Ｃ10アルキル、ハロ−置換Ｃ1
    −Ｃ10アルキル、フエニル又はベンジルであり；かつＲ
    8とＲ9がいづれも水素又はいづれもクロロである）をも
    つものである特許請求の範囲第１項、２項又は３項に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】Ｒ5が水素メチル、エチル又は2,2,2−トリ
    クロロエチルルである特許請求の範囲第８項に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】りん化合物がテトラメチルピロホスフア
    イト又はテトラエチルピロホスフアイトである特許請求
    の範囲第１項、２項又は３項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】りん化合物が亜りん酸、次亜りん酸、ジ
    イソプロピルホスフアイト、トリイソプロピル ホスフ
    アイト、ベンジルホスフアイト、ジメチル ホスフアイ
    ト、トリブチルホスフアイト、トリエチル ホスホノア
    セテイト、２−クロロエチルホスホン酸、テトラエチル
    ピロホスフアイト、ジエチルアノメチルホスホネイト、
    ジメチル メチルホスホネイト、2,2,2-トリクロロエチ
    ル ホスホロジクロリダイト、ジメチル ホスフエイ
    ト、ジフエニルホスフアイト、トリフエニルホスフアイ
    ト、トリメチルホスフアイト、ジブチルホスフアイト、
    トリス（２−クロロエチル）ホスフアイト、トリメチル
    ホスホノアセテイト、ジエチル エチル ホスホネイ
    ト、ジエチル カルボ メトキシ メチル ホスホネイ
    ト、ジエチル アセチル ホスホネイト、ジメチル ア
    セチルメチル ホスホネイト、ジメチル シアノメチル
    ホスホネイトおよびジエチル アリル ホスホネイト
    より成る群から選ばれたものである特許請求の範囲第１
    項、２項又は３項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】りん化合物が亜りん酸、次亜りん酸、ジ
    イソプロピルホスフアイト、トリイソプロピル ホスフ
    アイト、ジベンジル ホスフアイト、ジメチル ホスフ
    アイトおよびトリブチル ホスフアイトより成る群から
    選ばれたものである特許請求の紐囲第１項、２項又は３
    項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】りん化合物が亜りん酸である特許請求の
    範囲第１項、２項又は３項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】接種後約７０乃至１４０時間の発酵中に
    有機りん化合物を加える特許請求の範囲第１項、２項又
    は３項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】殺菌前又は接種０乃至１４０時間後に無
    機りん化合物を培養媒質中に加える特許請求の範囲第１
    項、２項又は３項に記載の方法。
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