JPH0687795B2 - マクロ分子ヒドロラ−ゼ用螢光偏光アツセイ、このアツセイに使用する試薬及びこれら試薬の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、流体中、特に全血、血清、プラズマ又は尿の
ような生物流体試料中のマクロ分子ヒドロラーゼの存在
及び（又は）量を決定する試薬を利用して螢光偏光アツ
セイを実施するための試薬、試薬の製法及びアツセイの
実施法に関する。

マクロ分子ヒドロラーゼ活性について分析することが望
ましい多くの場合がある。過去には、前記ヒドロラーゼ
のアツセイは、典型的には試薬として複数の酵素及び基
質の使用を含んでいた。種々の酵素及び基質が単一の溶
液中に配合され、その安定性が温度、pH、塩度等のよう
な条件に対する矛盾する要件に左右されている点で、前
記のアツセイは困難なものであつた。例えば、基質は、
比較的低いpHの溶液中の方が安定であり、酵素は、高い
pHの溶液中の方が安定であることがあるので、基質に対
して又酵素に対して互に使用可能な環境が利用できない
ことから重大な問題が生じる。前記のアツセイを実施す
る際の他の潜在的困難は、分析に必要である種々の酵素
の間の交さ反応性の可能性である。

マクロ分子ヒドロラーゼアッセイの１つの特に有利な応
用は、アルフアアミラーゼのような、多糖類ヒドロラー
ゼの定量的決定である。アルフアアミラーゼは、デンプ
ン関連多糖類中アルフア−グルコシド結合を加水分解す
る酵素である。すいぞう炎、消化器潰瘍、すい管の閉
塞、すいぞうがん、急性アルコール摂取又は中毒及びお
たふくかぜのようなだえき腺疾患を含む、いくつかの疾
病状態は、アミラーゼの上昇を示す。１つの先行技術の
操作によれば、アルフアアミラーゼの活性は、試料をホ
スホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−６
−りん酸デヒドロゲナーゼ及び限界デキストリンと反応
させて後、340nmの波長においてNADH（還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）の光吸収の程度を測定
することによつてアツセイされる。

マクロ分子ヒドロラーゼアツセイの他の１応用は、トリ
プシンのようなエンドプロテアーゼの定量的決定であ
る。トリプシンは、すいぞう中見出されるエンドプロテ
アーゼである。典型的には、トリプシンは、Ｎ−α−ベ
ンゾイルアルギニンエチルエステル（BAEE）のような色
素原基質を使用することによつてアツセイされる。BAEE
は、比較的小さい合成基質であるので、このようにして
実施されるアツセイは、極度に特異的ではない。

小さい合成基質は、つくるのが比較的簡単であるが、そ
れらは、それらの大きさのために特異性を欠く傾向があ
る。大きい合成基質の方がある酵素に対して特異的であ
るが、製造するのが極度に困難であることがある。酵素
の開裂の化学の詳細な知識を必要とし、この知識が得ら
れても、合成それ自体が複雑であることがある。

別法として、トリプシンは、ゼラチンフイルム上に試料
を置くことによつて分析されている。ゼラチンが液化す
る場合には、トリプシンの正の値が記録される。この後
者の方法は、それが単に定性型の分析になる傾向がある
という欠点を有する。いくつかのプロテアーゼに応用で
きる別の１アツセイ法は、普通使用されている放射性標
識法である。この方法の主な欠点は、放射性を測定する
ことによつて試験の結果を得る前に、反応した基質から
未反応の基質を分離しなければならないことである。

尚別の１応用は、リパーゼの定量的決定である。過去に
は、リパーゼは、典型的には合成色素原基質又は濁度透
明化法によつて分析されている。前記の技術は、欠点が
ないことはなく、これらの方法は、安定性、純度及び基
質の特性記述の問題、並びに特異性及び再現性の問題が
ある。

従つて、アミラーゼ、エンドプロテアーゼ及びリパーゼ
のようなマクロ分子ヒドロラーゼについて流体を定量的
に分析する、簡易かつ正確な手段の必要性が現在ある。

本発明は、（１）マクロ分子ヒドロラーゼの螢光偏光ア
ツセイ用試薬；（２）この試薬をつくる合成法；並びに
（３）多糖類ヒドロラーゼ、エンドプロテアーゼ及びリ
パーゼのようなマクロ分子ヒドロラーゼの存在を定量的
に決定する螢光偏光アツセイを実施する分析法に向けら
れる。

本発明の第１の面によれば、螢光偏光アツセイにおいて
使用する新規な試薬が発見された。この試薬は、平面偏
光に対して螢光偏光反応を生じることができる螢光団に
カツプリングされている、決定されるヒドロラーゼによ
つて開裂可能な基質よりなる。

本発明の第２の面によれば、この新規な試薬をつくる方
法が提供される。これらの合成法は、マクロ分子ヒドロ
ラーゼによつて開裂可能である基質を、螢光偏光反応を
生じることができる螢光団とカツプリングさせることよ
りなる。このような基質に対する一般式は、Ｐ−（ｘ−
Ｆ）_nにより示すことができる。式中Ｐはマクロ分子基
質を表わし、それは多糖類、ポリペプチドリポペプチド
類及びポリヌクレオチド類よりなる群から選択すること
ができる;xは安定な結合基を表わし、それはアルキル
類、アリール類、アミド類、アミン類、チオアミン類、
カーボネート類、チオカーボネート類、カルボニル類、
スルホネート類、イミド類、エステル類、チオエステル
類、エーテル類、チオエーテル類よりなる群から選択す
ることができる;Fは螢光団を表わす;nは基質上螢光団及
び結合基の数を表わす。

本発明の第３の面によれば、マクロ分子ヒドロラーゼの
螢光偏光アツセイを実施する方法が提供される。これら
の分析法は、被分析体及び分析されるマクロ分子ヒドロ
ラーゼによつて開裂可能である基質を含有する試料を含
む試験溶液を調製し、これを、螢光偏光反応を生じるこ
とができる螢光団部分にカツプリングさせることよりな
る。次に試験溶液をある期間温置させる。温置の後、得
られた溶液に平面偏光を通し、試料中マクロ分子ヒドロ
ラーゼの指標として螢光偏光反応を検出する。

特に、本発明は、（ａ）被分析物（analyte）を含有す
ると疑われるテストサンプルを含む均一系テスト溶液
（homogenous test solution）を生成し、 （ｂ）該テスト溶液をある期間温置し、 （ｃ）該テスト溶液を通して平面偏光を通過させ、そし
て （ｄ）該テスト溶液から検出される螢光消偏光（fluore
scence depolarization）の速度を該テスト溶液中に存
在する被分析物の量に相関させる各工程からなるテスト
サンプル中の被分析物の存在または濃度を決定するため
の螢光偏光アッセイにおいて、 均一系テスト溶液が （ｉ）アミラーゼを含有すると疑われる血清又は血漿テ
ストサンプル、 （ii）フルオレセイン又はフルオレセインの誘導体とカ
ップリングするアミロースからなり、平面偏光に対して
螢光偏光反応を生じる得るアミラーゼ基質、及び （iii）脂肪酸結合剤を含み、 該アミラーゼ基質がテストサンプル中に存在するアミラ
ーゼの量に相関され得る速度で開裂される改良方法を提
供する。

本発明の他の目的及びそれに伴なう利点は、次の詳細な
説明及び実施例を参照して最もよく理解される。

本発明は、試料中、多糖類ヒドロラーゼ、プロテアーゼ
及びリパーゼのような、マクロ分子ヒドロラーゼの存在
を決定する螢光偏光アツセイに向けられる。本発明は、
このアツセイ中使用される試薬、並びに試薬をつくる方
法、並びにこのアツセイを実施する方法を提供する。本
発明のアツセイは、マクロ分子ヒドロラーゼの定性的又
は定量的決定に使用することができ、従つて、本開示の
目的には、用語「決定」（determining）は、定性及び
定量分析に共に適用されると理解される。

本発明の螢光偏光アツセイは、従来知られるか又は提案
されているマクロ分子ヒドロラーゼアツセイに比し多く
の利点を提供する。これらの利点のうちいくつかは、本
発明のアツセイ系においては単一の基質のみを必要とす
ることから生じ、一方その外の利点は、合成基質ではな
く、天然基質の使用が好適であることから生じる。

本発明のアツセイ系においては１つの基質のみを必要と
するので、アツセイ系の安定化に伴なう問題が最小であ
る。上に論じられたように、他のアツセイ系において使
用されるいくつかの基質及び酵素は、安定性について互
に両立し得ない要件を有することが多い。同時の利点
は、このアツセイ系において使用するのに単一の基質の
みをつくることを要することである。

本発明のアツセイは、好適には、合成ではなく、天然の
基質を使用する。決定されるマクロ分子ヒドロラーゼに
対して特異的である合成基質の構造を化学的に決定する
ことが必要ではなく、このような基質を得ることに向け
られる複雑な合成操作を画き出し、行なうことも必要で
ないので、天然基質の製造は比較的簡単な仕事である。
単一の基質は、それ自体容易に製造され、それを使用す
ることの重要な結果は、比較的低い試薬のコストであ
る。尚更に、本発明に従つて実施されるアツセイは、き
わめて鋭敏であり、極度に再現性がある。天然基質は、
合成基質に比して良好なアツセイの特異性が得られる傾
向さえあるので、それらは特に有利でもある。

本発明のアツセイは、螢光偏光の原理に従つて操作され
る。これらの原理によれば、螢光団が平面偏光のビーム
によつて励起される場合には、それは代つて偏光を発す
る。発する光の偏光の程度は、螢光団を有する分子が励
起と発光の時の間に回転した程度に逆相関している。あ
る分子が約68.5度の角度回転するのに要する時間は、分
子の回転緩和時間と定義される。回転緩和時間は、小さ
い分子（例えば、フルオレセインのような）の場合には
比較的小さく（約１ノナ秒の程度）、大きい分子（例え
ば、イムノグロブリンのような）の場合には大きい（約
100ノナ秒の程度）。分子の回転緩和時間は、主にその
容積によつてきまるので、溶液状態のその螢光の観察さ
れた偏光は、その大きさの直接の指標を与える。

本発明のアツセイの更に別の１利点は、均質アツセイで
あること、即ち、螢光偏光の読みを取る前に未反応の基
質から開裂生成物を分離する必要がないことである。

本発明によれば、決定されるマクロ分子ヒドロラーゼに
よつて開裂可能である基質（ただし、この基質は螢光団
で標識されている）を提供することによつて、マクロ分
子ヒドロラーゼを分析することができる。反応混合物
を、垂直、次に水平偏光によつて逐次励起し、発光の垂
直成分のみを分析することによつて、反応混合物中の螢
光の偏光をきわめて正確に決定することができる。基質
が無傷である時には、螢光団はきわめて大きい分子の一
部であり、それで、螢光偏光反応は高い値を生じる。基
質がヒドロラーゼ酵素によつて開裂されている時には、
螢光団は比較的小さい分子の一部であり、その螢光団部
分に帰せられる螢光偏光反応は実質的に低下する。大量
の酵素が存在する場合には、螢光偏光の速度は実質的で
あり、一方酵素があまり又は全く存在しない場合には、
マクロ分子基質は比較的ゆつくり開裂するか又は全く開
裂せず、螢光偏光の速度は対応しておそい。

本発明の原理は、マクロ分子ヒドロラーゼとして知られ
る広いカテゴリイの化合物に応用可能であり、それら
は、次のものを含むが限定されてはいない：アルフア及
びベータアミラーゼ；リパーゼ；エステラーゼ；ペクチ
ナーゼ；ヌクレオチダーゼ；ラミナリナーゼ；テキスト
ラーゼ；ポリガラクテユロナーゼ；チテイナーゼ；リゾ
チーム；ノイアミニダーゼ；ヒアルロニダーゼ；ヌクレ
オシダーゼ；アミノペプチダーゼ；カルボキシペプチダ
ーゼ；グルタミルカルボキシペプチダーゼ；プロインシ
ユリナーゼ；インシユリナーゼ；レニン；ペプシン；ト
リプシン；キモトリプシン；パンクレアトペプチダー
ゼ；カテプシン；パパイン；キモパパイン；フイシン；
スロンビン；プラスミン；スブチロペプチダーゼ；アス
ペルギロペプチダーゼ；ストレプトコツカスペプチダー
ゼ；ストレプトキナーゼ；クロストリジオペプチダー
ゼ；ブロメライン；ケラチナーゼ；ウロキナーゼ；エン
テロペプチダーゼ；カリクレイン；アポピリドキサル酵
素ヒドロラーゼ；並びにペクテートリアーゼ。本発明の
目的のために特に興味がある広いクラスのマクロ分子ヒ
ドロラーゼは、多糖類ヒドロラーゼ、リパーゼ及びプロ
テアーゼを含む。ここで詳細に説明される本発明の好ま
しい態様では、アミラーゼ、トリプシン及びリポタン白
リパーゼが決定される。特に、本発明ではアミラーゼが
好適に決定される。

本発明の方法において多種多様の螢光団を使用すること
ができる。前に示したとおり、螢光団の選定は、決定さ
れるべき特定のマクロ分子ヒドロラーゼ及び用いられる
酵素系に依存する。有用な螢光団のクラスの代表的なも
のは、フルオレセイン類、ローダミン類、フラビン類、
クマリン類、ナフタレン類、アクリジン類、アンスラセ
ン類、多核融合型炭化水素類、スチルベン類、アンスラ
ニル酸類、アミノスチリルピリジン類、キノリン類、サ
リチル酸類、シアニン類、オキソノール類、フエナンチ
ジン類、フルオレスカミン類、並びにそれらの誘導体及
び塩類である。使用することができる特定の螢光団の例
示は、例えば、エオシン、ローダミン、アミノナフタレ
ンスルホネート、アクリフラビン、フルオレセイン、ジ
ヒドロ安息香酸、ジヒドロキノリン、NADH、リボフラビ
ン、ブリリアントスルフアフラビン、キノリン、ナフト
ールスルホン酸、チオフラビン、クマリン、アクリジン
オレンジ、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、
オキサジン、ウンベリフエロン、アクリジン、レゾルフ
イン、並びにそれらの誘導体及び塩類を包含する。特
に、本発明ではフルオレセイン又はフルオレセイン誘導
体が使用される特定すれば、4,6−ジクロロトリアジン
−２−（イル）アミノフルオレセイン（DTAF）及びフル
オレセインイソチオシアネート（FITC）は、特に有用か
つ有利であることが見出されている。

当該技術熟練者によく理解されるように、螢光団の選択
は次のような因子に依存する：（１）螢光団及び用いら
れる機器の励起及び発光波長；（２）螢光団と基質との
間の結合官能性；（３）フリーラベルの回転緩和時間；
（４）量子収量；並びに（５）吸光率。

その外、螢光団の励起及び発光の波長の適当な選択は、
ヘモグロビン及びビリルビンのような、分析下にある試
料中の種々の成分からの干渉の低下のために重要であ
る。従つて、螢光団は、その励起及び発光の波長がヘモ
グロビン及びビリルビンのような物質の吸収スペクトル
と重ならないように選ばれるべきである。

結合官能性は、ある種の基質がある種の螢光団と反応す
ることが知られている官能基を有している点で、螢光団
の選定に影響する。例えば、DTAFは、リジン基上アミン
部分と強く反応する；従つて、基質上リジン基が容易に
利用される時には、DTAFは選定の螢光団である。他の例
は、当該技術熟練者にとつて容易に確かめることができ
る。時には、脂肪族連鎖のような連結基を使用して、螢
光団及び基質のそれぞれの結合官能性を結合することが
できる。例示される結合基の型のリストは前に述べられ
ている。

回転緩和時間は、ペリンの式によつて計算され、これは
当該技術熟練者に周知である。アツセイの精度がある時
間にわたる螢光偏光反応の差異を検出することに依存す
るので、これは重要な因子である。開裂した螢光団基質
が、無傷の螢光団−基質によつて得られるものから認め
得る程異なつていない場合には、有意な脱分極反応を検
出することは困難である。螢光団の量子収量及び吸光率
は、基質上への螢光団の置換の最小度に影響するので、
基質の作業濃度のために十分な螢光強度を観察すること
ができるように、それらは重要である。量子収量及び吸
光率が不良である場合には、ある溶液の螢光偏光の精密
な測定のために不十分な螢光強度が観察されることがあ
る。不良の量子収量は、基質上高度の置換を必要とす
る。

基質は、いかによく分析されるマクロ分子ヒドロラーゼ
によつて開裂されるかの見地で置換されるべきである。
基質の大きさが比較的短時間にヒドロラーゼによつてか
なり減小するように開裂がおこることが重要である。例
えば、本発明に従つてアルフアアミラーゼを分析するた
めに本発明中好適な基質は、ポテトアミロースであり、
これは、上述した螢光団部分DTAF及びFITCにカツプリン
グされる時、良好な結果を生じる。このアツセイにおい
て良好な結果を生じている他の基質は、アミロペクチ
ン、ポテトデンプン、リトナーの可溶性デンプン、並び
にマルトリン（Maltrin ）040、050、100、250、500及
び550（アイオワ州マスカチン在グレイン・プロセシン
グ・コーポーレーシヨンから得られる）である。他の有
用な基質は、小麦デンプン、米デンプン、コーンデンプ
ン及びデキストリンである。

適当な酵素目盛づけの操作は、種々の量の酵素を含有す
る一連の溶液を調製し、次に対照法によつてこれらの溶
液のアツセイから酵素活性値を得ることを含む。次に目
盛づけられた酵素溶液を、上述した螢光偏光操作によつ
て分析する。偏光値を酵素活性値に対してプロツトして
標準カーブをつくる。

この操作の変数をバランスさせることによつてこのアツ
セイのパラメーターは最適にされる。このアツセイの試
料サイズ温置パラメーターは、アツセイスパン（最低及
び最高カリブレーターの間のミリ偏光として表わされ
る）、試料マトリツクス干渉、アツセイ処理量、温置時
間及び精度をバランスさせることによつて最適にされ
る。本発明中好適な試料サイズは、反応容量２ミリリツ
トルあたり25マイクロリツトルである。最適処理量は、
温置時間を５分又はそれ以下に保つことによつて得られ
る。５％より小さい変動係数をもつ精度のためには、50
ミリ偏光単位より大きいアツセイスパンが好適である。
試薬混合物中基質濃度は、アツセイスパン、フオトメー
ター強度及び試料マトリツクス干渉をバランスさせるこ
とによつて最適にされる。

ここに述べる好適な操作に従つて実施されるアミラーゼ
のアツセイは、高度に精密であることが立証されてい
る。変動する水準のアミラーゼをもつ36の患者試料を使
用し、好適な操作から得られる結果と、市販のアミラー
ゼ試験（イリノイ州シカゴ在アボツト・ラボラトリーズ
からのエージエント（Agent ））を比較して相関研究
を行なつた。この相関研究は良好な結果を生じ、本発明
に従つて実施されるアミラーゼアツセイの精度を明らか
に示した。

勿論、本発明中好適な操作及びアツセイパラメーター
は、例示のため、又限定のためではなく述べられ、当該
技術熟練者に明らかなように、特定の応用に合うように
大きく変えることができる。従つて、本発明中最も好適
なアツセイ条件は、35℃又はその付近のアツセイ温度、
５分又はその付近の温置時間、7.5又はその付近のpH及
びミリリツトルあたり50マイクログラム又はその付近の
基質濃度を含むが、これらの条件は広く変えることがで
きる。かくして、例えば、アツセイ温度は、約15℃〜約
45℃の範囲に保つことができる；温置時間は、アツセイ
の所望の感度によつて、約１秒〜約１時間の間で選択す
ることができる（約１分〜約１時間の間で選択される温
置時間が好適であるが）;pHは、特定のpHにおける酵素
活性により、約３〜約11の範囲に保つことができる；そ
して基質の濃度は、螢光団の溶解度及び量子収量によつ
て、最終試験溶液中約0.01ノナグラム/ml〜約300mg/ml
の範囲であることができる。

その外、本発明の好適な螢光偏光アツセイは、例えば、
必らずしも温置時間直後に開始して間隔を置いてではな
く螢光偏光反応を試験することによつて、変えることが
できる。例えば、温置後ある時間に１回の読みを取り、
基質を含有するが酵素を含有しないコントロールからの
読みと比較することができる。試料と試薬とを配合し、
ある時間予温置して後初期の読みを取る更に他のテクニ
クを作り上げてよい。次にこの溶液をあるセツトされた
間隔の時間更に温置して後第２の読みを取ることができ
る。次にこの２つの時点の間の螢光偏光反応を使用す
る。

従つて、前記の詳細な説明及び次の実施例は、限定では
なく例示であると見なされること、又本発明の範囲は、
特許請求の範囲（その均等物をすべて含む）によつての
み定められることが意図されている。

例1. 本発明によつて螢光団部分にカツプリンブされた基質を
つくる１方法を例示するため、好適な操作を述べる。ポ
テトアミロース1gをジメチルスルホキシド（DMSO）10ml
に溶解する。ピリジン２滴、ジラウリン酸ジブチルスズ
700マイクロリツトル及びフルオレセインイソチオシア
ネート（FITC）10mgを添加する。この溶液を約100℃に
３時間加熱し、次に放冷する。冷却後、エタノール（Et
OH）100mlを添加してデンプンを析出させることによつ
て標識基質を精製する。この混合物は、更に冷却して析
出を容易にしてよい。析出したデンプンを過し、DMSO
10mlに再溶解し、次にエタノール100mlで再析出させ
る。最後に、析出したデンプンを過、乾燥し、生成物
を貯蔵する。

このアツセイを実施するために本発明中好適な操作によ
れば、３種の試薬を調製し、これを便宜上、Ａ、Ｂ及び
Ｃという:A＝300mg/mlの脂肪酸を含まないウシ血清アル
ブミン;B＝10mg/mlの、85％DMSO中0.1MNaClをもつフル
オレセイン標識アミロース;C＝3.6MのNaCl。緩衝液（以
下“TDX バツフアー”という）は、pH7.5において、0.
01ウシガンマグロブリン及び0.10％のアジ化ナトリウム
と共に、0.1Mのリン酸ナトリウムバツフアーよりなる。
この好適な実施態様において、アツセイは、アボツトTD
X螢光偏光分析器上有利に実施することができる。Ｃ試
薬20.5マイクロリツトルを、Ａ試薬25マイクロリツトル
と混合し、TDXバツフアー962.5ml中に入れる。この混合
物に平面偏光型を通し、水平及び垂直強度を読む。次に
この溶液にＣ試薬12.5マイクロリツトルを添加し、Ｂ試
薬25マイクロリツトル、試料20マイクロリツトル及びTD
Xバツフアー追加の942.5マイクロリツトルと共に試験溶
液を得る。この試験溶液を35℃において５分間温置させ
る。この溶液に平面偏光を通し、螢光偏光を測定する。
最終偏光反応を計算し、目盛づけ曲線と比較する。

例2. スイートポテトからのアミロース3gを、TDXバツフアー
約100ml中DTAF約2mgの溶液に添加した。アミロースは完
全には溶解しなかつた。５及び30分後20マイクロリツト
ルを取り出し、1mlにうすめた。次にうすめた混合物20
マイクロリツトルを更にバツフアー1ml中うすめた。こ
の溶液をキユーベツトに添加し、アボツトTDX螢光偏光
分析器上ゲイン５において螢光強度及び正味ミリ偏光を
読んだ。このカツプリング反応を開始して５分後、螢光
偏光が上昇することが観察され、DTAFのアミロースへの
カツプリングを示した。次にミリリツトルあたり10mgの
細菌アミラーゼ溶液10マイクロリツトルを、DTAFカツプ
リング型アミロースを含有するキユーベツトに添加し
た。その時アミロースの小断片への加水分解のために偏
光はただちに低下し、かくして本テクニクの原理を明ら
かに示した。

例3. EtOH約100ml及びアセトン100mlを添加してフルオレセイ
ン標識アミロースを析出させることによつて、例２から
の基質を更に調製した。次にこのものをビユヒナー斗
中EtOH約50mlを使用して過して遊離のDTAFを洗い出し
た。このアミロースを乾燥し、水に再懸濁させた。次に
この溶液を過して不溶のアミロースを除去した。

例4. TDXバツフアー1mlに、飽和NaCl溶液90マイクロリツト
ル、例３からの基質25マイクロリツトル及び試料25マイ
クログラムを添加した。この溶液を混合し、35℃におい
て温置した。種々の温置時間において、TDX分析器上螢
光偏光を読んだ。使用された試料は、シグマの正常及び
上昇型酵素であつた。これらの試料は、それぞれアミラ
ーゼリツトルあたり約1700及び4500シグマ単位を含有し
ていた。次のデータが得られた： このデータは、ブタのアミロース（シグマのコントロー
ル中）が基質を開裂したことを明らかに示す。

例5. スイートポテトアミロース1gをジメチルスルホキシド
（DMSO）10mlに溶解した。ピリジン２滴、ラウリル酸ジ
ブチルスズ700マイクロリツトル及びFITC10mgをこの溶
液に添加した。溶解した時、溶液を蒸気浴上100℃にお
いて30分間加熱した。冷却後、エタノール100mlを添加
してアミロースを析出させた。溶融ガラス斗を使用し
て析出したアミロースを過した。エタノール液中の
未反応のFITCを棄てた。次に標識アミロースをDMSOに再
溶解し、更に２回再析出させた。

参考例１ ゼラチン約50mgを水約3mlに溶解した。次にDTAF約1mgを
この溶液に添加した。この混合物を室温において約３時
間温置した。次に遊離未反応フルオレセインを、エタノ
ール5mlを添加することによつて標識フルオレセインか
ら分離した。析出したタンパクを遠心分離し、非標識フ
ルオレセインを廃物として傾しやした。フルオレセイン
標識ゼラチンを少量の水に溶解し、TDXバツフアーで1/1
000にうすめて螢光偏光反応を測定した。約120ミリ偏光
単位において偏光反応が十分高かつたので、本発明によ
るこの操作は、トリプシンのアツセイに作業できると結
論された。

参考例２ すいぞうトリプシン（12,000BAEE単位）1mgを水1mlに溶
解した。この酵素ストツクを更に水でうすめ、このスト
ツクトリプシン溶液100マイクロリツトルを、例１から
のストツク基質溶液の1/1000うすめ液1mlと混合した。
この溶液を35℃において温置し、混合５分後にその螢光
偏光反応を測定した。次の結果は、キユーベツト中100
ノナグラムの少量のトリプシンを、標識ゼラチンを用い
る偏光テクニクによつて測定することができることを示
した。トリプシン濃度 ミリ偏光（mp） 酵素なし 123 100ノナグラム（ng） 109 １マイクログラム（μｇ） 94 10 μｇ 78 100μｇ 68 参考例３ リポタンパク溶液（マイルズ・ラボラトリーズ・インコ
ーポレーテツド、コード82-018）2mlをDMSO2mlと混合し
た。次にDMSO中FITCの100mg/ml溶液40マイクロリツトル
を添加した。ピリジン２滴を、ジラウリル酸ジブチルス
ズと共に添加した。この溶液を蒸気浴上に２時間置い
た。

２時間後、溶液10マイクロリツトルをDMSO1ml中でうす
めた。これをTDXバツフアー中更に1/100にうすめた。こ
の溶液のミリ偏光は183であることが見出された。

参考例４ 例８からのフルオレセイン標識リポタンパク基質をTDX
バツフアー1ml中にうすめ、種々の濃度のリポタンパク
リパーゼを添加した。次にこの溶液を35℃において５分
間温置して後螢光偏光を決定した。酵素濃度に比例する
濃度の減少が観察された。結果のデータ次のとおり。添加リパーゼ MP なし 180 65単位 122 163単位 93 特許請求の範囲においてのみ定められる、本発明の精神
及び範囲から離れることなく、ここに記載された本発明
の特定の実施態様において、種々の修飾及び改変を行な
うことができることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｌｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍ，18（１）, Ｐ．40−47，1985 Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，92（４），Ｐ. 1297−1306，1982 Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，88（４），Ｐ. 1185−1191，1980

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）被分析物を含有すると疑われるテス
   トサンプルを含む均一系テスト溶液を生成し、 （ｂ）該テスト溶液をある期間温置し、 （ｃ）該テスト溶液を通して平面偏光を通過させ、そし
   て （ｄ）該テスト溶液から検出される螢光消偏光の速度を
   該テスト溶液に存在する被分析物の量に相関させる各工
   程からなるテストサンプル中の被分析物の存在または濃
   度を決定するための螢光偏光アッセイにおいて、 均一系テスト溶液が （ｉ）アミラーゼを含有すると疑われる血清又は血漿テ
   ストサンプル、 （ii）フルオレセイン又はフルオレセインの誘導体とカ
   ップリングするアミロースからなり、平面偏光に対して
   螢光偏光反応を生じる得るアミラーゼ基質、及び （iii）脂肪酸結合剤を含み、 該アミラーゼ基質がテストサンプル中に存在するアミラ
   ーゼの量に相関され得る速度で開裂される改良方法。
2. 【請求項２】脂肪酸結合剤がアルブミンである特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】テストサンプルが血清テストサンプルであ
   る特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
4. 【請求項４】テストサンプルが血漿テストサンプルであ
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。