JPH06702B2 - 抗アレルギ−剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な抗アレルギー剤に関する。

〔従来の技術〕

人体におけるアレルギー症状は多様であり、一般にＩ〜
IV型に分類されている。その中でもアトピー型、アナフ
イラキシー型アレルギーは即時型（Ｉ型）アレルギーに
属し、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘
息、枯草熱等の病態を発現することが知られている。

これらの症状発現の機構については詳しく研究されてお
り、その結果、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等の多
数の医薬品が開発されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、これらの薬剤には、呼吸器系、消化器
系、肝機能、過敏症の誘発等多方面にわたる副作用があ
り、より安全な抗アレルギー剤の開発が望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、アレルギー疾患に対し有効に作用
し、かつ安全性の高い医薬を開発すべく研究してきたと
ころ、マンナンが優れた抗アレルギー作用、血小板活性
化因子拮抗作用、抗ヒスタミン作用等を有し、かつ安全
性も高いことを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はマンナンを有効成分とする抗アレル
ギー剤を提供するものである。

本発明で使用するマンナンとは、マンノースを主な構成
成分とする多糖類をいい、例えばその由来、構成等によ
り分類して示せば以下のものが挙げられる。

(1)微生物由来のマンナン サッカロミセス セルビシア（Saccharomyces cerevisi
ae）、サッカロミセス ダイレンシス（Saccharomyces
dairensis）、サッカロミセス エクスグス（Saccharom
yces exiguus）、サッカロミセス クルーベリ（Saccha
romyces kluyveri）、サッカロミセス セルバジイ（Sa
ccharomyces servazzii）、サッカロミセス テルリス
（Saccharomyces telluris）、サッカロミセス ユニス
ポラス（Saccharomyces unisporous）等のサッカロミセ
ス属に属する酵母；ロドトルラグルチニス（Rhodotorul
a glutinis）等の赤色酵母；バチルス ポリミキサ（Ba
cillus polymyxa）、スカルシナ フラバ（Scarcina fl
ava）等の細菌などの菌体あるいは培養液から得られる
マンナン。

(2)植物由来のマンナン ゾウゲヤシマンナンＡ、ゾウゲヤシマンナンＢ、紅藻マ
ンナン、緑藻マンナン、ラン科植物塊根中のサレップマ
ンナン、コーヒーマメマンナン、南アフリカ産植物huac
ra ponapalmマンナン、ツクネイモマンナン、ヤマイモ
マンナン等。

(3)グルコマンナン コンニャクイモ、ユリ、スイセン、ヒガンバナ等の地下
茎から得られるマンノースの他にグリコースを含有する
マンナン。

(4)ガラクトマンナン ローカストビーンガム、ダイズ種皮由来のソイビーンフ
ル、タムソンガム、皮膚糸状菌由来の糸状菌ガラクトマ
ンノグリカン、グアーガム等のマンノースの他のガラク
トースを含有するマンナン。

(5)その他 キサンタンガム等のマンノース以外に２種以上の糖を含
むマンナン。

これらのマンナン中、(1)微生物由来のマンナンおよび
(2)植物由来のマンナン、特に酵母由来のマンナン、す
なわち酵母マンナンが好ましい。

マンナンは従来多くの生理活性を示すことが報告されて
いる。すなわち、免疫促進作用（特開昭51-292215
号）、抗腫瘍作用（特開昭54-97692号、同58-121216
号）、抗感染作用（特開昭58-109423号）、インターフ
エロン誘導活性（E.Matiso et al,Acta.Virol.,14,1
(1970)）、マクロフアージ遊走阻止活性（M.Suzuki＆Y.
Hayashi,Japan J.Microbiol.,19,355(1975)などを有す
ることが報告されている。しかしこれらの報告には、マ
ンナンの抗アレルギー作用に関する記載は全く存しな
い。

本発明に用いるマンナンは、種々の微生物、植物等から
自体公知の方法で採取することができるが、また市販の
もの（例えばシグマ社、東京化成等から入手できる）で
もよい。例えば酵母マンナンは、酵母菌の細胞壁に存在
するので、酵母菌を各々の菌学的性状に合致した培養条
件で培養し、菌体を集め、得られた培養菌体から抽出す
ることができる。

培養菌体から酵母マンナンを抽出するには、例えば菌体
をオートクレーブ加熱処理して上清（オートクレーブ抽
出液）を得、マンナンが多糖であることからフエーリ
ング試薬を用いて、マンナン−銅複合体を形成せしめる
ことにより抽出する方法又は、塩酸を利用した除蛋白
方法により実施することができる。また、市販の酵母エ
キス（例えば、デイフコ社、タケダ薬品工業、大五栄養
等により販売されている。）には、酵母マンナンが含有
されているので、オートクレーブ抽出液の代わりにこれ
を用いることもできる。

オートクレーブ抽出液は、Haworthらの方法（J.Chem.So
c.,1937,784）、Peatらの方法（J.Chem.Soc.,1961,386
1）に従い、製造される。すなわち、培養菌体をクエン
酸緩衝液（0.02Ｍ，pH7.0）に懸濁し、１２１℃、９０
分間オートクレーブ中で加熱する。冷却後遠心分離を行
い、上清部を集める。再度沈澱部にクエン酸緩衝液を加
え、同様の操作を行い、得られた上清部を合わせること
により得られる。

フエーリング試薬を用いる抽出・精製法は、次の如くし
て実施される。すなわち、オートクレーブ抽出液又は、
酵母エキスに攪拌しながら同量のフエーリング試薬を加
える。ここでマンナン−銅複合体の沈澱が生じてくる。
沈澱部を希塩酸に溶解し、これをメタノール−酢酸混液
（８：１v/v）中にゆっくりと滴下する。数時間放置し
てマンナンの沈澱を集め、銅の色がなくなるまでこの操
作を繰り返す。沈澱をガラスフイルターで集め、メタノ
ール、エーテル等で洗浄し、粗マンナンを得る。グルカ
ンを除くために粗マンナンを水に溶解した後フエーリン
グ試薬を加え、さらに上記操作を繰り返すことにより精
製マンナンが得られる。またマンナン−銅複合体の沈澱
を得た後、強酸型イオン交換樹脂、例えばアンバーライ
トIR120、同IR121、同IR118等を用いて脱銅することも
できる。

塩酸を利用した除蛋白による抽出・精製法は、次の如く
して実施される。すなわち、オートクレーブ抽出液又は
酵母エキスに３Ｎ塩酸を添加し、pHを3.5とした後生ず
る沈澱を除去し、上清部に３倍容の冷却メタノールを加
える。沈澱を集め、水に懸濁し、１Ｎ苛性ソーダにてpH
7.0に調整し、不溶物を除去する。この操作を繰り返
し、pH2.5で沈澱が生じないことを確かめ、終濃度0.5Ｎ
となるように水酸化カリウムを加え、３７℃１〜２時間
放置する。pHを3.5とし、冷メタノールを３倍容加え沈
澱を水に懸濁しpH7.0に調整する。この液をイオン交換
水に対し、一昼夜透析を行う。蛋白、核酸の除去が不完
全な場合には、プロナーゼ（長瀬産業）、リボヌクレア
ーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ（シグマ社）を添加
し、分解後、セバッグ抽出法により酵素蛋白を除去し、
イオン交換水に対し透析を行う。

上記方法により抽出されたマンナンは、さらにゲル過
法（バイオゲルＰ−３００、バイオゲルＡ−0.5ｍ、セ
フアデックスＧ−２００等）や陰イオン交換クロマトグ
ラフィ−（DEAE−セフアデックスＡ−５０、DEAE−セル
ロース、DEAE−バイオゲル等）等によって分画精製する
ことができる。この精製は例えば、大久保らの方法（J.
Bacterio1.136,63(1978)）に従って行なわれる。

上記抽出法のうち、銅を用いることが廃液処理等に問題
があるため、塩酸を利用する方法が好ましい。

以下にサッカロミセス セルビシア由来の酵母エキス
（ディフコ社）より塩酸を利用する方法にて得られた酵
母マンナン（以下酵母マンナンＡと略す）及び市販の酵
母マンナン（シグマ社，以下酵母マンナンＢと略す）の
薬理作用ならびに安全性について検討した結果を示す。

Ｉ薬理作用 (1)抗アレルギー作用 抗アレルギー作用は、ラットにおける受身皮膚アナフイ
ラキシー（ＰＣＡ）反応を用いて試験を行った。

＜試験方法＞ SD系ラットを用い、水酸化アルミニウム、百日咳ワクチ
ンをアジュバンドとして卵白アルブミンで感作し、１４
日後に採血して抗血清を得た。この希釈液（６４０倍）
をあらかじめバリカンを用いて背部の毛を刈っておいた
同系ラット（９週齢，雄）に４ケ所0.1mlずつ皮内注射
した。５時間放置した後、酵母マンナンＡ又はＢを尾静
脈内へ注入した（５，１０mg/kg）。静注直後蛋白アル
ブミンと色素エバンスブルーの混合液を尾静脈へ注入
し、３０分後に生じた青色のスポットの面積を求め、コ
ントロールの面積に対する抑制率を求めた。尚、ポジテ
ィブコントロールとしてクロモグリク酸ナトリウムを用
いた。

＜結果＞ 結果を表１に示す。酵母マンナンＡ又はＢはクロモグリ
ク酸ナトリウムの1/3程度の抗アレルギー作用を示し
た。

(2)血小板活性化因子拮抗作用 血小板活性化因子拮抗作用は、血小板活性化因子（PA
F）投与時に血管外遊出される蛋白によって生ずる膨疹
に対する抑制率をもって判定した。

＜試験方法＞ SD系ラット（９週齢，雄）に、酵母マンナンＡ又はＢを
尾静脈より注入し（５，１０mg/kg、２０分後に2.5％牛
血清アルブミン溶液に２５ngのPAFを溶解したもの0.025
mlをあらかじめ毛を刈っておいた背部４ケ所に皮内注射
した。生じた膨疹の面積を求め、コントロールの面積に
対する抑制率を求めた。尚、ポジティブコントロールと
して塩酸プロメタジンを用いた。

＜結果＞ 結果を表２に示す。酵母マンナンＡ又はＢは塩酸プロメ
タジンと同等のPAF拮抗作用を示した。

(3)抗ヒスタミン作用 抗ヒスタミン作用は、ヒスタミン投与時に起こる膨疹に
対する抑制率をもって判定した。

＜試験方法＞ SD系ラット（９週齢，雄）に酵母マンナンＡ又はＢを尾
静脈より注入し（５，１０mg/kg）、１０分後にヒスタ
ミン溶液0.05ml（３０mg）をあらかじめ毛を刈っておい
た背部４ケ所に皮内注射した。生じた膨疹の面積を求
め、コントロールに対する抑制率を求めた。尚、ポジテ
ィブコントロールとして塩酸ジフエンヒドラミンを用い
た。

＜結果＞ 結果を表３に示す。酵母マンナンＡ又はＢは塩酸ジフエ
ンヒドラミンよりも優れた抗ヒスタミン作用を示した。

II安全性試験 ddYマウス（雄，４週齢）を用い、酵母マンナンＡおよ
びＢの急性毒性試験を行った。酵母マンナンＡ又はＢを
静脈内又は経口的に投与し、２４時間後の急性毒性を観
察した。その結果、酵母マンナンＡ、ＢのLD₅₀値は、と
もに静注で５００mg/kg以上、経口で６g/kg以上であっ
た。

本発明の抗アレルギー剤は静脈内投与用製剤、錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤、細粒剤等の経口投与用製剤とするこ
とができる。これらの製剤化にあたっては、医薬として
通常使用される賦形剤、滑沢剤、結合剤等の他、吸収を
向上させるための添加剤等を添加することができる。投
与量は、投与方法、症状、体重等によって異なるが通常
成人に対し、１０〜５００mg／日が好ましく、投与にあ
たってこれを１〜数回に分けて投与することが好まし
い。

〔発明の効果〕

本発明の抗アレルギー剤は、優れた抗アレルギー作用、
血小板活性化因子拮抗作用、抗ヒスタミン作用を有する
とともに安全性が極めて高いので、種々のアレルギー症
状例えばアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、気管支
喘息、枯草熱などの治療に用いることができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ 酵母エキス（ディフコ社）１００ｇを７００mlのイオン
交換水に溶解し、３Ｎ塩酸を用いてpH3.5に調整した。
この時に生じた不溶物を遠心分離（３０００r.p.m，１
０分）にて除去し、得られた上清に３倍量の冷却メタノ
ールを添加し、約１５分間静置した。生じた沈澱を遠心
分離（３０００r.p.m，１０分）にて集め、約５０mlの
イオン交換水に懸濁した。この液を１Ｎ−苛性ソーダで
pH7.0に調整し、不溶物を遠心分離（18,000r.p.m，１０
分）で除去した。上清部を３Ｎ−塩酸にてpH3.5に調整
し、同様の操作を５回繰り返した。

最終的に得られた水溶液３０mlに対し、リボ核酸分解酵
素（RNase T₁：約２５０units）を加え２５℃で一昼夜
反応させた。この液にクロロホルム／メタノール（25/
1）混液３０mlを加え、よく振盪させメタノール−水層
を分取した。これに水酸化カリウム0.85ｇを加え、溶解
後３７℃で１時間振盪した。３Ｎ塩酸でpHを3.5とし３
倍量の冷却メタノールを添加し、沈澱物を遠心分離（3,
000r.p.m，１０分）し集めた。これを水に懸濁し、１Ｎ
−苛性ソーダでpH7.0とした後イオン交換水に対し１昼
夜透析を行った。透析内液を凍結乾燥し、さらに少量の
イオン交換水に溶解後バイオゲルＡ−0.5ｍゲルロ過カ
ラムへかけた。溶出液は0.1Ｎ塩酸カリウム溶液を用
い、マンナンの溶出をフエノール硫酸法にて定量した。
その他２６０，２８０nmによる吸収も測定した。フエノ
ール硫酸により発色するフラクションを集め、イオン交
換水に対し一昼夜透析後、凍結乾燥を行った。以上一連
の操作により約２ｇの酵母マンナンＡを得た。

このようにして得られた酵母マンナンＡと市販の酵母マ
ンナン（シグマ社，酵母マンナンＢと略す）の分析値を
以下に示す。

表４中、糖はフエノール硫酸法、蛋白はローリー法、リ
ンはAMESらの方法により定量した。

：３４５０(S)，２９６０(M)，１６６０(M)，１１５０
(M)，１０６０(S)，８３０(M) （第１図）^１ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭHz，Ｄ₂Ｏ中） δppm：5.6〜5.9（アノメリック水素） 4.1〜4.9（マンノース由来の水素） （第２図）¹³ C-NMR（２７０ＭHz，Ｄ₂Ｏ中） δppm：98.8〜１０３（マンノシル結合炭素） ６２〜７９（マンノース由来の炭素） （第３図） また酵母マンナンＡを２Ｎ三フッ化酢酸中、１００℃、
１２時間加水分解を行い、ホウ素化水素ナトリウムで還
元した後、ピリジン−無水酢酸中でアセチル化した。該
アセチル体をガスクロマトグラフィー（３％ECNSS-Mカ
ラム，カラム温度１９０℃，検出器FID）にて分析した
ところ、保持時間29.46分にマンンニトールのアセチル
体に相当する単一ピークとして出現した（第４図）。

これらの結果より、酵母マンナンＡは、マンノースを主
成分とする酵母マンナンであることを確認した。

実施例２ 酵母マンナンＡ又はＢ３ｇを生理食塩水１００mlに溶解
し、滅菌後、１mlずつアンプルに分注し、注射剤を製造
した。

実施例３ 次の成分を均一に混合し、滅菌後、１mlずつアンプルに
分注し、注射剤を製造した。

酵母マンナンＡ又はＢ ３ｇ 注射用蒸留水 ２０ml ポリソルベート 0.5ｇ 落花生油 ８０ml

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた酵母マンナンＡの赤外線吸
収スペクトル、第２図はその_１Ｈ核磁気共鳴スペクト
ル、第３図はその^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルをそれぞ
れ示す図面である。第４図は酵母マンナンＡを加水分解
・還元・アセチル化して得られた生成物のガスクロマト
グラフを示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡本 暉公彦 埼玉県越谷市七左町１−229−８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マンナンを有効成分とする抗アレルギー
   剤。