JPH06502303A - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ 発明の背景 本発明は、ＤＮＡの配列決定に使用できる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する 。

インニス（Ｉｎｎｉｓ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、 　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８５：９４３６−９４４０．１９８８■■A サーマス・アクアティカス（Ｔｅｒｗｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＥＴ　ａ　ｑ 又はＴａｇ　ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる］はＤＮＡの配列決定に有用である と記載されている。

ロイヤー（Ｌａｗｙｅｒ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：６４２７．１ ９８９には、ＴａｑをコードしているＤＮＡの単離及びそのクローニングが記載 されている。この文献に記載されているＤＮＡ及びアミノ酸配列は、本明細書で 使用している用語であるＴａｑ遺伝子及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを規定する ものである。

フェルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らの米国特許第４．８８９．８１８号にはＴ ａｑの単離及び発現が記載され、以下のように説明されている：所望の酵素活性 を有する生物学的に活性な遺伝子産物を回収するには、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝 子の全コード化配列は必要でないことも見いだされた。コード化配列の約１／３ が存在していないアミノ末端の欠失により、ポリメラーゼ検定において確かに活 性である遺伝子産物が生産された。

従って、翻訳の際にその配列へ組み込まれるアミノ酸の欠失、付加又は改変によ って、そのタンパク質の活性を破壊することなく、−次構造自体を修飾すること ができる。

特にＴａｑポリメラーゼの場合、そのタンパク質のＮ−末端を組換え及び天然の 両条件下で相当部分欠失させることができ、またそのタンパク質の活性が依然保 持されていることを示す証拠が存在する。単離された天然タンパク質はタンパク 質分解的な分解の結果物であり得、断頭された遺伝子の翻訳の結果物でないこと は明らかである。しかし、プラスミドｐＦＣ８５［２，８ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［［ −Ａｓｐ７１８制限断片を含有する。そのＨｉｎｄｌｌｒ部位は２０６及び２０ ７コドンに位置する］の断頭遺伝子から調製された突然変異体はＤＮＡポリメラ ーゼの検定において十分に活性であり、これは完全長の配列をコードするＤＮＡ から調製したものと同様である。特定のＮ−末端短縮型が活性であることは明ら かであるので、そのポリメラーゼを発現させるために使用される遺伝子構築物に はコード化配列の対応する短縮型も包含され得る。

発明の概要 本発明は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと呼称されるサーマス・アクアティカス（ Ｔｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼのその野生型［Ｌａ ｖｙｅｒらの前掲］のＮ−末端２３５アミノ酸を欠いている以外は、そのＤＮＡ ポリメラーゼと同一の配列を有しているＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を 含有するベクターに関する。このＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼは本明細書では△Ｔａ ｑ（デルタＴａｑ）と呼称している。

本発明者は、ＴａｑポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性又はその熱安定性を 損なうことなく、ＴａｑポリメラーゼのＮ−末端２３５アミノ酸を除去できるこ とを見いだした。△Ｔａｑポリメラーゼは高温域の熱に対して依然安定であるが 、ＤＮＡ配列決定実験によって測定すると５′−エキソヌクレアーゼ活性は殆ど ないか、又は全く存在していない。Ｔａｑの付随的５゛−エキソヌクレアーゼが 欠如しているため、△ＴａｑポリメラーゼはＤＮＡの配列決定にとって野生型Ｔ ａｑポリメラーゼよりも有意に優れている。△Ｔａｑポリメラーゼを使用する際 には、ＤＮＡ配列決定の反応における伸長反応を行う際のその伸長時間又は緩衝 条件に配慮する必要が殆どない。

好ましい態様は、ベクターがＡＴＣＣ番号６８４３１として寄託されているプラ スミドｐＷＢ２５３として存在する核酸であるもの、又はそのようなベクターを 含有する宿主細胞である。

これに関連して、本発明はＮ−末端２３５アミノ酸を欠く以外はＴａｑと実質的 に同一であるアミノ酸配列を有する精製ＤＮＡポリメラーゼ、すなわち△Ｔａｑ を提供する。「精製」なる用語は、通常それに伴われる多（の宿主細胞タンパク 質からポリメラーゼを分離することを意味し、好ましくはポリメラーゼは調製物 の少な（とも１０％（Ｗ／Ｗ）タンパク質であり、より好ましくは均質な調製物 として、例えば均質な溶液として提供される。

△Ｔａｑは野生型Ｔａｑよりも加工性が低い（ｌｅｓｓ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ）ようである。

△ＴａｑがＰＣＲ増幅反応を行うには、より多くのＤＮＡポリメラーゼ単位が必 要である。

好ましい態様の説明 添付の図面は配列決定用ゲルから得られるオートラジオグラフィーを再現したも のである。

以下に本発明を実施するために適切な方法及び材料の例を説明する。これは本発 明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。

Ｔａｑの発現遺伝子の構築 ヌクレオチド配列１に示すＮ−末端配列、及びヌクレオチド配列２に示すＣ−末 端配列を有している△Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を構築するため、以下 の操作を行った。

全す−マス・アクアティカスＤＮＡ０．２５μｇから得た突然変異遺伝子を、以 下の２つの合成りＮＡプライマーによってプライムするポリメラーゼ連鎖反応（ Ｐ　ＣＲ，５ａｉｋｉらの５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７．１９８１ｉ）を使 用し増幅した：（ａ）野生型塩基対７０５から開始する野生型ＤＮＡと相同的な ２７ｍｅｒ（ヌクレオチド配列３に示す）；　このプライマーは増幅ＤＮＡ産物 にＮｃｏ１部位を導入するためのものである：　（ｂ）Ｔａｑをコードする野生 型遺伝子の他方の鏡上の終止コドンをまたぎ、ＤＮＡ産物にＨ４ｎｄｍ部位を導 入するための３３ｍａｒ（ヌクレオチド配列４に示す）。

ＰＣＲ反応用の緩衝液はＩＱ＋ｃＭトリス−ＨＣｆｐＨ３，５５，２，５０１Ｍ 　ＭｇＣｌ２．１６ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ，，１５０ｇｇ／ｇｌＢｓＡ、及び ２００μＭの各ｄＮＴＰである。サイクルパラメーターは２分９５°、２分６５ °、５分７２°であった。

ＰＣＲによって導入される突然変異を最小限に抑えるため（Ｓａｉｋｉら、前掲 ）、フェノール抽出、エタノール沈殿及び制限酵素Ｎｃｏｌ及びＨｉｎｄＩ［［ による消化のまえには１０サイクルのＰＣＲＬか行わなかった。

ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＤｌ［断片の産物を、ＮｃｏＴ及びＨｉｎｄ　ｍで消化し 子牛腸アルカリホスファターゼで処理しておいたプラスミドｐＷＢ２５０にクロ ーンした。ｐＴＡＣ２と以前は呼ばれ、Ｊ、Ｍａｊｏｒｓから入手されたこのプ ラスミドの骨格はｐＢＲ３２２のｐｖｕＩｒ部位から時計の反対回りで以下の要 素を担持している（アポストロフィー「′」は、発現の方向が反時計回りでなく 、時計回りであることを意味している）二　部分的１ａｃ　Ｚ　’配列、ｌａｃ 　Ｉ　’、１ａｃＰＵＶ５（方向は不明）、ＰＬバイオケミカルズ・ファルマシ アーＬＫＢ（カタログ番号２７−４８８３）から入手されるｔａｃプロモーター の２つのコピー、Ｔ７遺伝子１０プロモーター及び開始コドンからなり、これら はＮｃｏＴ部位、ＨｉｎｄＤＩ部位、ｔｒｐＡターミネータ−（ＰＬ番号２７− ４８８４−０１）、Ｍ１３複製起点、及びｐＢＲ３２２のａｌｌｌｐＲ遺伝子を 構成するよう調節されている。クローンした遺伝子の発現は０．１１１１ＭＩＰ ＴＧによって誘発させる。

ツースビック検定（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ　ａｓｓａのによるサイズ［Ｂａｒｎｅ ｓの５ｃｉｅｎｃｅ　１９５：３９３゜１９７７］、コロニーＰＣＲによる１８ ００ｂｐ標的断片を生じさせる能力、及び培養物０．５ｍｌ由来の８０℃に加熱 した洗浄細胞から入手される抽出物における■ＰＴＧ誘発性のＤＮＡポリメラー ゼ活性の高いレベルに基づき、上記のクローニングにより得られた１２個のアン ビンリン耐性コロニーのうち３個が所望の断片を含有していることが証明された （精製方法の初期の工程として下記に示す画分Ｉ）。これらのプラスミドの最初 のものをｐＷＢ　２５３と命名し、△Ｔａｑの調製用生産に使用した。

後期の対数増殖期にあるＥ、ｃｏｌｉ宿主株Ｘ７０２９（ｌａｃオペロンを網羅 する欠失Ｘ７４を有する野生型Ｅ、ｃｏｌｉ）中のｐＷＢ　２５３培養物１リツ トルを、領　１ｍＭＩＰＴＧを含有する新鮮な豊富な培養培地４リツトルの１つ に分配し、３７℃で１２時間、振盪下のインキュベートを続けた。総量５リツト ルを遠心により採取し、細胞溶解緩衝液（２０諷ＭトリスーＨ（ｌｐＨ８，５５ ，１０５Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、１６ｒｓＭ　（ＮＨ，）２５０４．０．１％ＮＰ４０ ，０．１％Ｔｖｅｅｎ２０、及び１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。細胞懸濁液 ３００＠１にリゾチーム６０盲ｇを加え、細胞を時折旋回させなから５−１０℃ で１５分間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を沸騰水浴中で旋回させ、 素早く８０℃に加熱し、細胞を５ｏ−ｓｉ℃に１７分間維持させた。殆どの酵素 が不活化されたと期待されるこの処理の後、細胞を水浴中で３７℃に冷却し、プ ロテアーゼインヒビター２ｚｌ（イソプロパツール中、１００ｍＭ　ＰＭＳＦ） を加えた。細胞を遠心ボトルに分配し、５ｏｒｖａｌＳＳ−３４０−ターで１５ 分間１５．０００にて遠心した（２℃）。得られた上清を画分Ｉと呼ぶ。

洗浄剤ＮＰ４０及びＴｗｅｅｎ２０は、酵素を暴露させるすべてのボトル及び溶 液にて常に０．０１％から０，５％（通常は０．１％）で存在させた。特に明記 しない限り、すべての緩衝液は、以下の保存緩衝液について記載しているように トリス−ＨＣｌ及びＤＴＴも含有している。

画分ＩをＮａＣ１中、０．２５Ｍにした後、１０％ポリミンーＰ　［Ｐｏｌｙｍ ｉｎ−Ｐコ（ポリエチレン−イミン）を沈殿した核酸に滴加した。加えた適切な ボリミンーＰを決定し、それを必要量少量以上には添加しないよう、ボリミンー Ｐの滴を加えることにより遠心抽出物０．５ｔｌを定期的に試験し、過剰の沈殿 物が形成された場合にのみ、より多くのポリミンーＰをバルク抽出物に加えるよ うにした。次いで、抽出物を遠心し、核酸を殆ど取り出した。

Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０によるクロマトグラフィー　［Ｊｏｙｃｅ及びＧｒｉｎｄ ｌｅｙのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　５ｃｉ８．　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　 ８０　：１８３０．１９８３にて使用されている］は成功しなかった。ポリメラ ーゼ活性は、酵素を塩濃度領　ＩＭに希釈した場合でも全（結合しなかった。

このＢｉｏ−Ｒｅｘ　７０への結合性の欠如の理由は、この時点ではさらに調査 しなかった。そうでなく、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０からの流出物を別のクロマトグ ラフィー媒質に適用した。

次に、ヘパリンアガロースを用いたクロマトグラフィーを成功裏に行った。ここ で１リツトルにまで希釈することにより、抽出物をヘパリンアガロース５０厘ｌ と共に撹拌し、次いでそのアガロースをカラム中に軽く充填した。このカラムを Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１で洗浄し、ＩＭＮａＣＩによって酵素を溶出させた。次いで 、ポリメラーゼ活性のピーク（１２ｍｌ）を５０％グリセリン保存緩衝液（５０ ％グリセリン（ｖ／ｖ）、１００ｍＭ　ＫＣＩ、２（ｈＭ　トリス−ＨＣｆｐＨ ３，５５，０゜１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５％Ｔｖｅｅｎ及び２ ０、領　５％Ｎ　Ｐ　４０　）に対して透析した。酵素の最終的収量は１ｉ当た り３００．０００単位の濃度で６ｉであった（下記参照）。酵素の部分量を保存 緩衝液中に１０倍で希釈し、この作動強度酵素をＫＴ５と命名した。

酵素１単位は、７４℃、３０分間で酸不溶性物質に１０ｎｍｏｌのデオキシ三リ ン酸を導入する酵素の量と定義される。実際の検定時間は５分又は１０分であっ た（従って、３０分に適切に外挿する）。力価測定した完全長のＴａｑＤＮＡポ リメラーゼ（ＡｍｐｌｊＴａｑ　：　５商業単位／μｌで市販されている：　ｌ 商業単位は本明細書で定義した単位１と同等と考えられる）を標品として使用し た。検定緩衝液は２０ｍＭ　トリス−ＨＣｆｐＨ７，８，８μＩＭ　ＭｇＣ／２ ．０．１＋＋ｇ／翼ｎＢｓＡ、５ｍＭ　ＤＴＴ、４％グリセリン、各１００／ｚ Ｍ　ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ、　２５　ｕＭ　［３Ｈ］　ｄ　ＴＴ　 Ｐ（４００ｃｍｐ／ｐｍｏｌｅ）、及び１６０ｚｇｋｌ活性化子牛胸腺ＤＮＡ（ 市販品：ファルマシア）である。

配列決定法 上記のΔＴａｑによるノブオキシ配列決定を以下にまとめる。これは、基本的に Ｉ　ｎｎ１ｓらＥＰｒｏｃ、　Ｎ５ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５ ：　９４３６　（１９８ｇ）］が開示した方法に従う。反応は微量滴定ウェル中 で行なった。

標識延長反応において、Ｌｇ混合物［１４μｍの水、３μｌの１０ｘΔＴａｑ緩 衝液［２０ｍＭ１−リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，５，２５℃）、１０　ｍＭ　Ｍｇ　 Ｃ１２，２ｍＭ　ＭｎＣ１，，１０＋ａＭイソクエン酸および１６＋ｓＭ硫酸ア ンモニウム（この硫酸アンモニウムは５０ｍＭＫＣｌまたは水で置き換えてもよ い）］、３μｍの１０ｍＭ　ｄＴＴＰ、１μｌの１０ｍＭ　ｄＧＴＰ、および３ μｍの１０ｍＭ　ｄＣＴＰ］（２４μｍ）を、鋳型（３μｍ；０．５〜１．０ピ コモル）およびプライマー（２μｍ：２ピコモル）に加えた。

これらの溶液を渦巻撹拌し、回転下降させ、そして７０℃に加熱および４５℃に 冷却することによってアニールさせた。”Ｐ　ｄＡＴＰ［４００ｍｃｉ／μモル ：１ｆｆｉＣｉ／ｍｌは２．５μＭに等しい］を乾燥させ、上記ＤＮＡ溶液中に 再懸濁し、ΔＴａｑ（１μＩ；５単位）を加えた。この溶液を４５秒間３７℃ま で暖め、氷上で冷却した。この反応混合物から４つの反応液を取り、４ｘ　ｄＸ ＴＰ（２μｍ）および４種の４ｘｄｄストツク溶液のうちの１種（２μｌ）を含 む溶液（４μｍ）を入れた微量滴定ウェルに加えた。４ｘｄＸＴＰは、４種すべ てのｄＮＴＰ（１２０μｍ）、０．２％ツイーン（Ｔｖｅｅｎ）　２０、および ０．２％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ−４０からなる。４ｘｄｄストツク 溶液のそれぞれは、７２０ｇＭ　ｄｄＡ、３６０ＭＭｄｄＣ。

７２μＭｄｄＧ、または３６０ＭＭｄｄＴ（または、対照として水）のいずれか を含有している。この４ｘｄＸＴＰと４ｘｄｄ溶液を１＝１の比で予め混合して 、得られた溶液（４μｍ）を４つのＤＮＡ反応液のそれぞれに添加できるように した。

これら溶液を混合し、微量滴定ウェルをテープで遮蔽し、１０分間７０〜７５° Ｃに暖めた（所望により、２０または３０分間インキュベートを続けてもよい） 。次いで、この微量滴定ウェルを真空下に乾燥しくテープの除去後）、ブルー・ ホルムアミド緩衝液（１２μｍ）を加えた。次いで、このウェルを３０秒間９０ ℃に加熱し、その１１５をゲルに付した。

図面はこのような配列決定反応の結果の１例である。この図面において、Ａｍｐ ｌｉＴａＱ（野生型Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた結果が、ΔＴ ａｑおよびシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ’）Ｔ　７　ＤＮＡポリメラー ゼによる結果と比較されている。ΔＴａｑはＡ叩１ｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラー ゼと比較したときに配列決定ゲルにおいて三重のバンドを全く生じないかまたは わずかじか生じないので、非有意レベルの５゛−エキソヌクレアーゼ活性を有し ている。

上記の配列決定法は、酵素の相違、添加した酵素の単位、および図面に記したイ ンキュベート時間を除いて、すべての実験に対して同じように行なった。レーン Ａ−Ｄに示した実験結果のインキュベート時間は３分であり、レーンＥおよびＦ では１０分であり、レーンＧでは２０分であった。Ｓ　ｅｑｕｅｎａｓｅＲＤ　 Ｎ　Ａポリメラーゼは、ＴａｂｏｒおよびＲ４ｃｈａｒｄｓｏｎ［Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：　４７６７　（１９８７）］が記載 している条件下および比較的低温で用いた。鋳型は、サソリ毒素ＡａｌＴの人工 遺伝子をコードしている１本鎖ＤＮＡであった。プライマーは、「リバース（反 転）Ｊｌａｃプライマーであったにれは、ベクターｐＢｓ−上のｌａｃ　Ｚの開 始コドンをまたぐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ”マイナス゛、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ から）］。

図面から、短時間の延長反応（３分）における５市販車位（上記定義のように、 約３０単位）のＡｉｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは非常に劣った配列決定 データを与えるが、一方、ΔＴａｑの３０単位は、または１５０単位であっても 、長時間（１０または２０分）の延長反応後でさえ優れたデータを与え、５ｅｑ ｕｅｎａｓｅ’　ＤＮＡポリメラーゼと同等であることが明らかである。

寄託 菌株ｐＷＢ２５３／Ｘ７０２９は、１９９０年１０月４日にアメリカン・タイプ −カルチャー壷コレクンヨン［＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ］に寄託されており、番号ＡＴＣＣ ６８４３１を受けている。出願人は、本培養物が、本願に対して発行された特許 の期間満了前に、培養物に対する最後の要求後の５年間に、または３０年間のよ り長い期間に死滅したときには、この培養物を置換する責任があること、および 該特許の発行（このときに本寄託物をだれでも入手することができるようになる ）を寄託機関に通知する責任があることを承認している。このときまでは、本寄 託物は、３７　Ｃ，Ｆ、Ｒ，セクション１−１４および３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，セクシ ョン１１２の条項のもとて特許庁長官に対して入手可能である。

他の態様は後記の請求の範囲内にある。

ＤＮＡおよびアミノ酸配列のコンピューター提出（１）一般的情報： （＋）　特許出願人：　ハーネス、ウエーン・エム（ｉｉ）　発明の名称：　熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ｆｉ）　配列の数：　４ （捏）連絡先： （Ａ）　名宛人ニライオン・アンド・ライオン（Ｂ）　通りニスイード３４００ 、ウェスト・シックスス・ストリート６１１番 （Ｃ）　市：ロスアンゼルス （Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９００１７ （Ｖ）　コンピューター解読書式： （Ａ）　媒体型：３．５インチディスケット、１．４４Ｍｂ収容（Ｂ）　コンピ ューター：　ＩＢＭ　ＰＳ／２モデル５０Ｚまたは５５ミＸ（Ｃ）　オペレーテ ィング・システム：　ＩＢＭ　Ｐ、Ｃ，ＤＯ５（バージョン３．３０） （Ｄ）　ソフトウェア：　ｆｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ　（バージョン５．０）（虜 ）本出願のデータ： （Ａ）　出願番号：未　定 （Ｂ）　出願日：本　日 （Ｃ）　分類：未　定 （ｖｉ）　優先権主張出願のデータ： 以下に記載する出願を含む優先権主張出願の全体：なしくＡ）　出願番号： （Ｂ）　出願日： （ｖｉ）　弁理士／代理人情報： （Ａ）　氏名　ワーバーグ、リチャード・ジエイ（Ｂ）　登録番号・３２．３２ ７ （Ｃ）　参照／整理番号：１９３／２４０（ｉＸ）　電話連絡先情報： （Ａ）　電話番号：（２１３）４８９−１６００（Ｂ）　ファックス番号：（２ １３）９５５−０４４０（Ｃ）　テレックス番号：６７−３５１０リストに挙げ る配列の合計数：４ （２）　配列番号１の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ６８０ （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−末鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （Ｅ）　名称、配列番号１ （ｊｉ）　配列：配列番号１： （２）　配列番号２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝１６０ （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　＃Ｊｌの数ニー末鎖 （Ｄ）　トポロジー；直鎖状 （Ｅ）　名称：配列番号２ （１１）　配列・配列番号２： ＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡ　ＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡ　１２０Ｔ７ＡＧＣＣＣＧＣＣＴ ＡＡＴＧＡＧＣＧＧ　ＧＣＴＴｎＴＴＴＴ　ＡＡ丁ＴＣＴＴＧＡＡ　１６０（２ ）　配列番号３の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：２７ （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー末鎖 ＣＤ）　トポロジー：直鎖状 （Ｅ）　名称：配列番号３ （１１）　配列；配列番号３： ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧ　ＡＣＧＡＴＣ丁ＧＡＡ　ＧＣ丁Ｃ丁ＣＣ２７（２）　配 列番号４の情報 （Ｄ　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３３ （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数、−末鎖 （Ｄ）　トポロジー二直鎖状 （Ｅ）　名称、配列番号４ （ｉｉ）　配列：配列番号４： ＧＣＧ＾ＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＡＧ　ＴＣＣ３３ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９／１２ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的にＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端の２３５アミノ酸を欠くサー マス・アクアチカスのＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列からなるアミノ 酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコードしている核酸を含有するベクター。
2. ２．該核酸が、ＡＴＣＣＮｏ．６８４３１として寄託されている宿主細胞中に存 在するプラスミドｐＷＢ２５３中に存在している核酸と同一である請求項１に記 載のベクター。
3. ３．実質的にＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端の２３５アミノ酸を欠くサー マス・アクアチカスのＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列からなるアミノ 酸配列を有１するＤＮＡポリメラーゼをコードしている核酸を含有するベクター を含有している宿主細胞。
4. ４．ＡＴＣＣＮｏ．６８４３１として寄託されている請求項３に記載の宿主細胞 。
5. ５．実質的にＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＮ−末端の２３５アミノ酸を欠くサー マス・アクアチカスのＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列からなるアミノ 酸配列を有する精製されたＤＮＡポリメラーゼ。
6. ６．該ポリメラーゼが均質調製物として得られる請求項５に記載の精製されたＤ ＮＡポリメラーゼ。