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DE10315640A1 - Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung - Google Patents

Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung Download PDF

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DE10315640A1 DE10315640A DE10315640A DE10315640A1 DE 10315640 A1 DE10315640 A1 DE 10315640A1 DE 10315640 A DE10315640 A DE 10315640A DE 10315640 A DE10315640 A DE 10315640A DE 10315640 A1 DE10315640 A1 DE 10315640A1
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Abstract

Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung sowie ein dafür geeignetes Reaktionsgefäß.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle chemischer, molekularbiologischer oder biochemischer Prozesse, insbesondere enzymatischer Reaktionen, durch die kontrollierte Freisetzung von prozessrelevanten Komponenten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Spezifität der PCR.
  • In molekularbiologischen oder biochemischen Verfahren ist es häufig von erheblicher Bedeutung, den Start der Reaktion zu kontrollieren und die Reaktion ggf. ebenso wieder zu einem definierten Zeitpunkt zu beenden. Dazu kann beispielsweise die Aktivität eines Enzyms an- oder abgeschaltet werden. Ebenso ist es vorteilhaft, die Aktivität eines Enzyms zu kontrollieren.
  • Die Aktivität einer Vielzahl von Enzymen ist Mg++-abhängig. Dies gilt beispielsweise für die DNA- und RNA abhängige DNA-Polymerase, die Restriktionsendonukleasen, Kinasen oder Proteasen.
  • Die Frage nach der Kontrolle einer enzymatischen Reaktion stellt sich in der Praxis beispielsweise bei der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR). Bei der PCR handelt es sich um eine Methode zur spezifischen Amplifikation beliebiger Nukleinsäureabschnitte mittels der DNA-Polymerase.
  • Eine typische PCR besteht in der Regel aus dem zyklischen Ablauf dreier Verfahrensschritte, die bei unterschiedlichen Temperaturstufen ablaufen: In einem ersten Schritt erfolgt durch eine Aufhitzung des Reaktionsansatzes auf 94 bis 98°C eine Denaturierung der doppelsträngigen Ziel-DNA. In einem zweiten Schritt wird die Temperatur abgesenkt, um eine Hybridisierung der für die Amplifikation der Ziel-Oligonukleotide erforderlichen Primer an die einzelsträngig vorliegende DNA-Matrize zu ermöglichen (annealing).
  • Die Festlegung der Temperatur, auf die der Reaktionsansatz für das annealing abgesenkt werden muß, wird durch die verwendeten Primer bestimmt.
  • Nach dem annealing wird die Temperatur erneut erhöht, nämlich auf eine Temperatur von etwa 72°, um die Verlängerung (extension) der Primer durch die DNA-Polymerase zu gewährleisten.
  • Die Anlagerung der Primer an den Einzelstrang der Zielsequenz bestimmt entscheidend die Spezifität der PCR. So besteht bei einer niedrigen Temperatur des Reaktionsansatzes die Gefahr, daß sich die Primer unspezifisch an der Zielsequenz anlagern. Die ebenso im Reaktionsansatz befindliche DNA-Polymerase weist zwar ihre höchste Aktivität bei 55 bis 80 °C. Selbst bei Temperaturen zwischen 20 und 55 °C ist sie jedoch noch aktiv. So weist sie beispielsweise bei 40 bis 50 °C noch eine Aktivität von 27 bis 70 % auf.
  • Daraus folgt, daß bei einer Temperaturabsenkung zum annealing auch die unspezifisch paarenden Primer durch die DNA-Polymerase verlängert werden, da dafür bereits ein Primerkomplex aus nur wenigen Basenpaaren ausreicht. Dabei können z.B. sog. „Primer Dimere" entstehen, bei denen es sich um Verlängerungen von miteinander gepaarten Primern handelt.
  • Das Risiko von ungewollten Primer/Primer-Interaktionen nimmt mit der Anzahl der Primerpaare zu, so z.B. in einer Multiplex-PCR.
  • Die unspezifische Anlagerung der Primer an andere Primer oder an der Ziel-DNA hat zur Folge, daß – möglicherweise bereits im ersten Schritt der PCR – unspezifische Syntheseprodukte („wrong bands") entstehen, die während der PCR noch weiter amplifiziert werden. Die Spezifität der PCR ist in diesen Fällen erheblich reduziert.
  • Zur möglichen Verhinderung der unspezifischen Amplifikationen wurde das Prinzip der sogenannten "Hot-Start-PCR" entwickelt. Diese Form der PCR basiert im Prinzip darauf zu gewährleisten, daß die Aktivität der DNA-Polymerase erst bei einer hohen Temperatur einsetzt, bei der nur noch die spezifisch paarenden Primer hybridisiert vorliegen, so daß eine Polymerisation an anderenfalls unspezifisch hybrisierten Primern unterdrückt wird.
  • In ersten Ansätzen der Hot-Start-PCR wurde die DNA-Polymerase erst nach Erwärmung des Reaktionsansatzes hinzugefügt. Alternativ wird mindestens eines der für die Aktivität der DNA-Polymerase unerlässlichen Reagentien – z.B. Mg++, dNTPs oder die Primer – erst nach der Erwärmung auf die gewünschte Temperatur hinzugefügt (H.A. Ehrlich et al., Science 252, 643-1651 (1991) und R.T. D'Aquila et al., Nucleic Acid res. 19, 3749 (1991).
  • Diese Möglichkeiten des nachträglichen Hinzufügens der für die DNA-Polymerase-Aktivität erforderlichen Reagentien ist jedoch mit einem zusätzlichen Schritt im PCR-Verlauf verbunden und hat sich daher in der Praxis nicht durchgesetzt.
  • Andere Überlegungen basieren darauf, dem Reaktionsansatz von Beginn an einen gegen die DNA-Polymerase gerichteten Antikörper beizufügen, der bei höheren Temperaturen denaturiert. Damit wird die DNA-Polymerase freigegeben.
  • In einer neueren Entwicklung wird dem Reaktionsmix in Wachs eingebettetes Magnesiumchlorid hinzugefügt. Bei einer Erwärmung über 68° hinaus schmilzt das Wachs und gibt das Magnesiumsalz frei. Danach liegen die für die Aktivierung der DNA-Polymerase erforderlichen Magnesiumionen in der Lösung DNA vor. Die Verwendung von Wachsbetten ist u.a. bekannt aus der PCT Offenlegungsschrift WO 91/12342 oder dem US Patent 5, 643, 764.
  • Die Verwendung von in Wachs eingebetteten Reaktionskomponenten zum kontrollierten Beginn enzymatischer Reaktionen hat den Nachteil, daß stets das Erhitzen des Reaktionssystems zur Freisetzung der wesentlichen Reaktions-Komponente erforderlich ist. Das setzt wiederum – wie bei der Hot-Start-PCR – hitzresistente Enzyme voraus. Damit ist der Anwendungsbereich dieser Kontrollsysteme im Ergebnis erheblich eingeschränkt.
  • Des weiteren gewährleisten die bekannten PCR-Hot-Start Systeme mit in Wachs eingebettetem Mg++-Salz zwar, daß die DNA-Polymerase-Aktivität beim Anfahren der PCR – d.h. bei dem ersten Erwärmen der PCR auf die für die Denaturierung der Ziel-DNA erforderlichen Temperatur – unterdrückt wird. Nach dem erstmaligen Aufschmelzen der das Magnesiumchlorid freisetzenden Wachsschicht kann jedoch nicht mehr verhindert werden, daß die DNA-Polymerase bei dem für das annealing notwendigen Absenken der Temperatur aktiv bleibt. Bei diesen zyklisch wiederkehrenden annealing- Bedingungen bleibt somit das Risiko der unspezifischen Primer-Paarung – und somit das Risiko der unspezifischen Amplifikationsprodukte – erhalten.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein verbessertes Verfahren sowie ein entsprechendes Reaktionsgefäß für die Kontrolle des Ablaufs chemischer Reaktionen bereitzustellen. Als chemische Reaktion wird dabei auch jedes molekularbiologische oder biochemische Verfahren verstanden. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Hot-Start-PCR bereitzustellen.
  • Diese Aufgabe wird gelöst, indem mindestens eine für die Reaktion wesentliche Reaktionskomponente in ein wasserunlösliches aber wasserpermeables Polymer eingebettet wird. Die Komponente selber ist wasserlöslich. Im Falle der PCR-Kontrolle handelt es sich dabei vorzugsweise um ein Magnesiumsalz, bevorzugt um ein in Wasser schwer lösliches Magnesiumsalz.
  • Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, durch das wasserunlösliche aber wasserpermeable Polymer eine Diffusionsbarriere zu schaffen und somit die Konzentration des darin zunächst eingebetteten Salzes in dem Reaktionsansatz zu kontrollieren. Somit verhindert das Polymer nicht das Eintreten der wasserlöslichen Komponente in den Reaktionsansatz, sondern reduziert lediglich dessen Diffusionskoeffizienten und damit dessen Gehalt in der Lösung. Durch die Kontrolle der Konzentration der für den Beginn oder den Ablauf der Reaktion wesentlichen Komponente in dem Reaktionsansatz wird somit im Ergebnis eine Kontrolle der Reaktion, insbesondere des Beginnes der Reaktion, erreicht.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Bytyralharze, Polyvinylbutyrat, Polyvinylacetal oder Polyvinylacetat eingesetzt.
  • Das Polymer mit der darin eingebetteten Komponente, beispielsweise in Form von Salzkristallen, kann den Wänden eines Reaktionsgefäßes anliegen. Diese Reaktionsgefäße können für spezielle Anwendungen mit jeweils auf die Anwendung abgestimmten Polymeren und darin eingebetteten Komponenten vorgefertigt werden. Dazu kann die Komponente, beispielsweise ein Salz, gemeinsam mit dem Polymer in Lösemitteln, z.B. Chloroform suspendiert werden.
  • Im Falle der PCR-Kontrolle wird vorzugsweise ein Magnesiumsalz in das Polymer eingebettet, dessen Löslichkeit in dem für die DNA-Polymerase-Aktivität erforderlichen Temperaturbereich ebenso temperaturabhängig ist. So wird erreicht, daß in dem für die Verlängerung der Primer erforderlichen Temperaturbereich von beispielsweise 72° C eine ausreichende Konzentration freier Magnesiumionen vorliegt, während in dem Temperaturbereich von beispielsweise 50 bis 60° C die Magnesiumionen wieder als Salz ausfallen und daher für die DNA-Polymerase nicht zur Verfügung stehen. Demnach ist die DNA-Polymerase in diesem niedrigeren Temperaturbereich nicht oder wesentlich weniger aktiv.
  • Es ist darüber hinaus vorteilhaft, die Menge des dem Reaktionsansatz hinzugefügten schwerlöslichen Magnesiumsalzes so zu bestimmen, daß in beiden relevanten Temperaturbereichen – d.h. beim annealing und bei der extension – eine an diesem Salz gesättigte Lösung vorliegt.
  • Die Art des Salzes kann so gewählt sein, daß eine für die DNA-Polymerase günstige Magnesiumionen-Konzentration im hohen Temperaturbereich und eine die Aktivität weitgehendst ausschließende Konzentration im niedrigeren Temperaturbereich vorliegt. So wird gemäß der erfindungsgemäßen Verwendung des Magnesiumsalzes gewährleistet, daß selbst bei den wiederkehrenden Schritten der Temperaturabsenkung beim PCR-Verlauf die unspezifische Paarung der Primer nicht zu einer ungewollten Verlängerung der Primer führt. Im Ergebnis wird somit das Risiko der Synthese unspezifischer PCR-Produkte reduziert.
  • Das erfindungsgemäß eingesetzte Mg++-Salz weist bevorzugt bei 18°C eine Löslichkeit in Wasser von 5,7–4 mol/l und bei 100°C eine Löslichkeit von 5,4 10–3 mol/l auf.
  • In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird Magnesiumoxalat als schwerlösliches Salz eingesetzt.
  • Die Verwendung des in einem wasserunlöslichen aber wasserpermeablen Polymer eingebetteten schwerlöslichen Mg++-Salzes hat den Vorteil, daß die vorteilhafte Konzentration der Mg++-Ionen in dem Reaktionsmix selbst bei einer schnellen Erhitzung des Systems erst bei einer Temperatur erreicht ist, die für die Extension der Primer durch die DNA-Polymerase geeignet ist. Somit führt die Verwendung des Polymerbettes zu einer nochmaligen Verzögerung der Freisetzung der Mg++-Ionen. Vorzugsweise werden die Magnesiumionen erst nach einer 5-minütigen Erhitzung des Reaktinsmixes bei 94°C freigesetzt.
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die in der Lösung vorhandene Magnesiomkonzentration durch ein weiteres – leichter lösliches – Oxalatsalz eingestellt werden. Dazu kann z.B. Ammoniumoxalat eingesetzt werden. Die damit geänderte Konzentration der in Lösung befindlichen Oxalationen hat über die chemischen Gleichgewichtsreaktionen wiederum einen Einfluß auf die Konzentration des Magnesiomoxalats. Vorteilhafterweise ist dazu eine Ammoniumoxalat-Konzentration von 10 bis 12 mM vorhanden.
  • Das Prinzip der Verwendung einer weiteren Komponente, deren Löslichkeit oder Verfügbarkeit die Löslichkeit oder die Verfügbarkeit der für die Reaktion erforderlichen Komponente beeinflußt, selber aber kein Reaktionspartner ist, gilt grundsätzlich. Bei dieser weiteren Komponente handelt es sich vorzugsweise um ein Salz.
  • In die verwendete Polymerschicht können auch andere Mg-++-abhängige Enzyme – so z.B. die Restriktionsendonukleasen, Kinasen, Proteasen oder Ligasen -eingebettet werden. Das erfindungsgemäße System kann zwar besonders vorteilhaft in der PCR eingesetzt werden. Es eignet sich aber auch für die Kontrolle beliebiger andere Mg++-abhängiger Reaktionen, die ebenso temperatursensibel sind.
  • Beispiel 1:
  • Beginn der PCR
  • 1. Bereitstellung des in Butyralharz eingebetteten Magnesiumoxalates:
  • 1 g. von Magnesiumoxalates wird in 1 ml Butyralharzlösung (0.5g/ml) in Chloroform suspendiert. 5 mkL der Suspension werden in ein Reaktionsgefäß (vorzugsweise in ein Eppendort-Röhrchen) gefüllt. Die Suspension wird für 10 min. bei 50°C belüftet.
  • 2. Reaktionsansatz und Durchführung der Reaktion:
  • Der PCR-Reaktionsansatz (100 μl) wird in das mit dem Butyralharz versehene Reaktionsgefäß gefüllt. Der Reaktionsansatz enhält: 10 mM Tris-HCl (pH 9.0 bei 25°C); 50 mM KCl; 0.1 % Triton X-100; 0.2 mM von Nukleotiden (dNTP); Primer P1 and P2 (je 20 pmol); 100 ng von E. coli DNA als Matrize und 10 U Klentaq DNA Polymerase.
  • Das DNA Fragment (690 bp) des E. coli Uracil DNA Glycosylasegens wird amplifiziert durch die Primer P1 (5'-ATGGCTAACGAATTAACCTGGCA) und P2 (5'-TTACTCACTCTCTGCCGGTAAT).
  • Das Gefäß mit dem Reaktionsansatz wird von 24°C auf 94°C bei einer Rate von 1°C/sec erhitzt. Nach der Inkubation des Ansatzes bei 94°C bei 0, 1, 2, 3 und 5 min werden die Proben (15 μl) in neue Reaktionsgefäße überführt. 25 Zyklen der Reaktion verlaufen in den neuen Gefäßen bei 94°C – 30 sek; 58°C – 30 sek; 72°C – 100 sek. Die PCR Produkte werden in der Elektrophorese analysiert (1).
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die PCR nach einer Inkubation bei 94°C für 3 min beginnt.
  • Beispiel 2 (Kontrolle zu 1):
  • Das Verfahren wird wie oben durchgeführt mit der Ausnahme, daß 1 g. Magnesiumoxalat in 1 ml Chloroform ohne das Butyralharz verwendet wird.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die PCR bereits vor der Inkubation bei 94°C beginnt.
  • Beispiel 3:
  • Beginn der DNA Verdauung.
  • Das Verfahren wird wie oben durchgeführt mit folgenden Änderungen:
    • a) Der Reaktionsansatz (100 μl) enthält: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl (pH 8.4 bei 25°C); 10 mM 2-Mercaptoethanol; 2 μg. DNA pBR322; 2 U Taq 1 Restriktionsendonuklease.
    • b) Das Gefäß mit dem eingebetteten Magnesiumoxalat und dem Reaktionsansatz wird bei einer Rate von 0.5°C/sek von 24°C auf 64°C erhitzt. Nach der Inkubation des Ansatzes bei 64°C für 0, 1 , 2 , 3 und 5 min werden die Proben (15 μL) in neue Reaktionsgefäße überführt. Die Reaktion wird in den neuen Gefäßen für eine Stunde bei 64°C fortgesetzt.
  • Die Daten (2) zeigen, daß die Reaktion nach einer Inkubation für 2 min bei 64°C beginnt.
  • Beispiel 4 (als Kontrolle zu 3):
  • Das Verfahren gemäß Beispiel 3, wobei 1 g. des Magnesiumoxalates in 1 ml Chloroform ohne Butyralharz suspendiert wird.
  • Die Ergebnisse machen deutlich (2), daß die Reaktion nach der Inkubation bei 30°C für 10 min beginnt.
  • Die 1 zeigt die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte aus dem Beispiel 1 (Spuren 1 bis 5) und dem Beispiel 2 (Spuren 6 bis 10). Die Reaktionsansätze waren bei 94°C für 0 (Spuren 1 und 6), 1 min (Spuren 2 und 7) 2 min (Spuren 3 und 8), 3 min (4 und 9) und 5 min (5 und 10) inkubiert.
  • Die Daten zeigen, daß im Beispiel 1 die PCR nach 3 Inkubation bei 94^C min beginnt (Spuren 4 und 5) und daß im Beispiel 2 die PCR noch vor der Inkubation bei 94° (Spur 6) beginnt.
  • Die 2 zeigt die elektrophoretische Analyse der DNA-Ligation aus dem Beispiel 4. Der Reaktionsansatz war bei 30°C für 1 (Spur 1), für 2 min (Spur 2), für 3 min (Spur 3), für 5 min (Spur 4) und 10 min (Spur 5) inkubiert. Die Ligation beginnt ausweislich der Ergebnisse nach der Inkubation für 10 min (Spur 5).
  • Beispiel 5: Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße
  • Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß kann für PCR-Reaktionen mit beliebigen DNA-Polymerasen versendest werden. Beispielsweise geeignete Polymerasen sind nachfolgend aufgeführt.
  • Tabelle 1: Optimierung des Reaktionsansatzes für die verwendete Polymerase durch 10x "AdjustingBuffer". (Adaptationspuffer) (Endvolumen für den PCR-Ansatz – 100 μl)
    Figure 00110001
  • Versuchsprotokoll:
  • Bei den erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen handelt es sich um gewöhnliche PCR-Gefäße, deren innere Wände von einem Polymer beschichtet sind. Dieses Polymer enthält beispielsweise ein schwer lösliches Magnesiumsalz. Die optimale Wirkung entfalten die erfindungsgemäßen Gefäße bei einer Erhitzung des PCR-Reaktionsansatzes auf Temperaturen auf 90 bis 95 °C während des PCR-Zyklus:
    • 1. Vorbereiten des Reaktionsansatzes
    • 2. Einfüllen von 20 bis 80 μl des Reaktionsansatzes in das Gefäß
    • 3. Inkubation bei 90 bis 95 °C für 5 Minuten
    • 4. Beginn der PCR-Reaktion: 90 – 95 °C für 30 Sekunden 50 – 60 °C für 30 bis 45 Sekunden 70 – 75 °C ≥ 30 Sekunden
  • Vorsicht das der Reaktionsansatz sollte keinen zusätzlichen Magnesiumionen enthalten.
  • Fig. 3: Erhöhung der PCR-Spezifität durch Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße nach Beispiel 5.
  • Ein 180 by DNA Fragment aus 50 ng einen humanen genomischnen DNA wurde über 30 Zyklen amplifiziert. "Hot-Start" wird manuell durchgeführt d. h. das Enzym wurde in den 94 °C heizen Reaktionsansatz gegeben ( Spuren 1 und 2). Die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße wurden werden (Spuren 3 und 4).
  • Die PCR wurde durchgeführt in einem Volumen von 25 μl enthaltend 0,5 U (Spuren 1 und 3) oder 2,0 U (Spuren 2 und 4) der Tagpolymerase (Spur 5: Marker für das Molekulargewicht).
  • 4: Erfolgreiches Auffinden und Amplifikation der Promotor Region (1,2 kb) des Xenopus laevis Gens XAC-2 durch des erfindungsgemäße Verfahren.
  • Die Promoto-Region (1,2 kb) wurde amplifiziert aus 20 ng der genomischen Bibliothek des südafrikanischen Frosches Xenopus laevis. Die PCR (30 Zyklen) wurde in einer herkömmlichen PCR-Gefäß (Spur 1) und in den erfindungsgemäßen Gefäß (Spur 2).

Claims (18)

  1. Verfahren zur kontrollierten Freisetzung einer Komponente in einen Reaktionsansatz zur Kontrolle einer chemischen Reaktion umfassend die Verwendung eines wasserunlöslichen, wasserpermeablen Polymers enthaltend eine für die chemische Reaktion wesentliche Reaktionskomponente.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer aus der Gruppe folgender Polymere ausgewählt ist: Bytyralharz, Polyvinylbutyrat, Polyvinylacetal oder Polyvinylacetat.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer in dem Reaktionsansatz vorliegt.
  4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche gekennzeichnet durch eine Erwärmung des Polymers oder des Reaktionsansatzes.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine enzymatische Reaktion ist.
  6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion die Aktivität eines der folgenden Enzyme umfaßt: DNA- oder RNA-Polymerasen, Ligasen, Endonukleasen, Kinasen oder Proteasen.
  7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche gekennzeichnet durch eine PCR
  8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskomponente ein schwerlösliches Magnesiumsalzes ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß das Mg++-Salz bei 18 °C in Wasser eine Löslichkeit von 5,7–4 mol/l und bei 100°C eine Löslichkeit von 5,4 10– 3 mol/l aufweist.
  10. Verwendung nach Anspruch 9 gekennzeichnet durch Mg++-Oxalat.
  11. Verwendung eines Magnesiumsalzes, das in einem wasserunlöslichen, aber Wasser permeablen Polymer eingebettet, zur Steuerung der PCR.
  12. Reaktions-Kit enthaltend ein Magnesiumsalz, das in einem wasserunlöslichen, aber Wasser permeablen Polymer eingebettet.
  13. Reaktionskit nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, daß das Magnesiumsalz in Wasser schwer löslich ist.
  14. Reaktions-Kit nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, daß das Mg++-Salz bei 18 °C in Wasser eine Löslichkeit von 50 nmol/l aufweist.
  15. Reaktions-Kit nach Anspruch 14 gekennzeichnet durch Mg++-Oxalat.
  16. Reaktions-Kit nach einem vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer aus der Gruppe folgender Polymere ausgewählt ist: Bytyralharz, Polyvinylbutyrat, Polyvinylacetal oder Polyvinylacetat.
  17. Gefäß enthaltend einen Reaktionskit nach einem der Ansprüche 12 bis 16.
  18. Gefäß nach Anspruch 17 für die Verwendung in der PCR.
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DE10315640A DE10315640A1 (de) 2003-04-04 2003-04-04 Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung
PCT/US2004/010168 WO2004090169A2 (en) 2003-04-04 2004-04-01 Compositions for controlled release of enzymatic reaction components
AU2004227368A AU2004227368B2 (en) 2003-04-04 2004-04-01 Compositions for controlled release of enzymatic reaction components
JP2006509623A JP2006521827A (ja) 2003-04-04 2004-04-01 酵素反応成分の放出を制御する方法
DE602004015958T DE602004015958D1 (de) 2003-04-04 2004-04-01 Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten
CA002521476A CA2521476A1 (en) 2003-04-04 2004-04-01 Compositions for controlled release of enzymatic reaction components
US10/817,680 US7306929B2 (en) 2003-04-04 2004-04-01 Method for controlled release of enzymatic reaction components
ES04758773T ES2310745T3 (es) 2003-04-04 2004-04-01 Procedimiento de liberacion controlada de componentes de una reaccion enzimatica.
EP04758773A EP1611257B1 (de) 2003-04-04 2004-04-01 Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten
AT04758773T ATE405677T1 (de) 2003-04-04 2004-04-01 Verfahren zur kontrollierten freisetzung enzymatischer reaktionskomponenten
US11/924,342 US20080138879A1 (en) 2003-04-04 2007-10-25 Method for controlled release of enzymatic reaction components

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1992706B1 (de) 2002-02-21 2014-11-19 Alere San Diego, Inc. Rekombinase-Polymerase-Verstärkung
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
WO2006119419A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Geunsook Jeon Materials and kits for use in hot-start pcr, and methods of amplifying nucleic acids in a polymerase chain reaction
EP2829615B1 (de) 2005-07-25 2018-05-09 Alere San Diego, Inc. Kit zur Multiplexierung einer Rekombinase-Polymerase-Verstärkung
WO2008035205A2 (en) 2006-05-04 2008-03-27 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
WO2011120024A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Quantalife, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
US12162008B2 (en) 2008-09-23 2024-12-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Partition-based method of analysis
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
GB2502409B8 (en) 2008-09-23 2014-10-15 Bio Rad Laboratories Droplet-based assay system
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US12090480B2 (en) 2008-09-23 2024-09-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Partition-based method of analysis
US8633015B2 (en) 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
WO2010135310A1 (en) 2009-05-20 2010-11-25 Biosite Incorporated Dna glycosylase/lyase and ap endonuclease substrates
EP2438196B1 (de) * 2009-06-05 2016-12-21 Alere San Diego, Inc. Kits und reagenzien für rekombinase-polymerase-amplifikationen
EP2940153B1 (de) 2009-09-02 2020-05-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. System zum Mischen von Flüssigkeiten durch Koaleszenz mehrerer Emulsionen
EP2556170A4 (de) 2010-03-25 2014-01-01 Quantalife Inc Tröpfchentransport- und erkennungssystem
JP2013524169A (ja) 2010-03-25 2013-06-17 クァンタライフ・インコーポレーテッド 液滴によるアッセイ用の検出システム
EP4016086A1 (de) 2010-11-01 2022-06-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System zur formung von emulsionen
US12097495B2 (en) 2011-02-18 2024-09-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
CN103534360A (zh) 2011-03-18 2014-01-22 伯乐生命医学产品有限公司 借助对信号的组合使用进行的多重数字分析
WO2012149042A2 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
EP2737089B1 (de) 2011-07-29 2017-09-06 Bio-rad Laboratories, Inc. Bibliothekscharakterisierung durch digitalen test
WO2013155531A2 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
EP2940149A4 (de) * 2012-12-28 2016-07-27 Wako Pure Chem Ind Ltd Verfahren zur erkennung von hydroxymethyliertem cytosin in dna und reagenzienkit für solch eine erkennung

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US419909A (en) * 1890-01-21 Post-hole auger
DE2029419C3 (de) * 1969-09-26 1974-02-07 American Optical Corp., Southbridge, Mass. (V.St.A.) Durch Laserstrahlen löschbare Druckfarbe
US3761437A (en) * 1969-09-26 1973-09-25 American Optical Corp Laser energy absorbing composition containing a copper salt
US4098728A (en) 1976-01-02 1978-07-04 Solomon Rosenblatt Medical surgical sponge and method of making same
US4247498A (en) 1976-08-30 1981-01-27 Akzona Incorporated Methods for making microporous products
US4519909A (en) 1977-07-11 1985-05-28 Akzona Incorporated Microporous products
US4186189A (en) 1977-09-28 1980-01-29 Ethicon, Inc. Absorbable pharmaceutical compositions based on poly(alkylene oxalates)
US4384975A (en) 1980-06-13 1983-05-24 Sandoz, Inc. Process for preparation of microspheres
US4507414A (en) * 1982-05-14 1985-03-26 The B. F. Goodrich Company Smoke retardant vinyl halide polymer compositions
DK151608C (da) 1982-08-13 1988-06-20 Benzon As Alfred Fremgangsmaade til fremstilling af et farmaceutisk peroralt polydepotpraeparat med kontrolleret afgivelse
HU187215B (en) 1983-01-26 1985-11-28 Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar Method for producing pharmaceutical product of high actor content and prolonged effect
US4469743A (en) 1983-03-14 1984-09-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polyvinyl butyral laminates
US5135477A (en) 1984-10-29 1992-08-04 Medtronic, Inc. Iontophoretic drug delivery
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4789630A (en) 1985-10-04 1988-12-06 Cetus Corporation Ionic compounds containing the cationic meriquinone of a benzidine
US5466591A (en) 1986-08-22 1995-11-14 Hoffmann-La Roche Inc. 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
US5079352A (en) 1986-08-22 1992-01-07 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5455170A (en) 1986-08-22 1995-10-03 Hoffmann-La Roche Inc. Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05
US5283189A (en) 1987-02-09 1994-02-01 Research Development Corporation Of Japan β-galactosidase from Thermus sp
US4830855A (en) 1987-11-13 1989-05-16 Landec Labs, Inc. Temperature-controlled active agent dispenser
JP2531246B2 (ja) 1988-08-26 1996-09-04 東洋紡績株式会社 耐熱性ｄｎａポリメラ―ゼおよびその製法
US5215907A (en) 1989-02-24 1993-06-01 Oklahoma Medical Research Foundation Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius
GB8905269D0 (en) 1989-03-08 1989-04-19 Univ Bristol Novel modified nad-dependent dehydrogenases
HU203041B (en) 1989-03-14 1991-05-28 Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar Process for producing pharmaceutical compositions of controlled releasing factor containing nifedipin
US5071648A (en) 1989-04-06 1991-12-10 Merocel Corporation Polymeric broad-spectrum antimicrobial materials
ES2141088T3 (es) * 1990-02-16 2000-03-16 Hoffmann La Roche Mejoras en la especificidad y conveniencia de la reaccion en cadena de la polimerasa.
JP3078859B2 (ja) 1990-02-23 2000-08-21 武田薬品工業株式会社 安定な放出制御性製剤用コーティング剤
US5192675A (en) 1990-03-20 1993-03-09 Life Technologies, Inc. Cloned KpnI restriction-modification system
US5500363A (en) 1990-04-26 1996-03-19 New England Biolabs, Inc. Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria
US5091187A (en) 1990-04-26 1992-02-25 Haynes Duncan H Phospholipid-coated microcrystals: injectable formulations of water-insoluble drugs
US5246707A (en) 1990-04-26 1993-09-21 Haynes Duncan H Sustained release delivery of water-soluble bio-molecules and drugs using phospholipid-coated microcrystals, microdroplets and high-concentration liposomes
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US6787338B2 (en) 1990-06-04 2004-09-07 The University Of Utah Method for rapid thermal cycling of biological samples
DK146090D0 (da) 1990-06-15 1990-06-15 Novo Nordisk As Thermostabil protease
US5643777A (en) 1990-06-15 1997-07-01 Novo Nordisk A/S Thermostable protease from thermococcus
DK145990D0 (da) 1990-06-15 1990-06-15 Novo Nordisk As Thermostabil protease
US5283179A (en) 1990-09-10 1994-02-01 Promega Corporation Luciferase assay method
EP0553264A4 (en) 1990-10-05 1994-07-13 Wayne M Barnes Thermostable dna polymerase
US5545552A (en) 1990-12-03 1996-08-13 Stratagene Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5120349A (en) 1990-12-07 1992-06-09 Landec Labs, Inc. Microcapsule having temperature-dependent permeability profile
US5580573A (en) 1991-02-01 1996-12-03 E. R. Squibb And Sons, Inc. Temperature activated controlled release
CH680325B5 (de) * 1991-02-25 1993-02-15 Ebauchesfabrik Eta Ag
US5229285A (en) 1991-06-27 1993-07-20 Kikkoman Corporation Thermostable luciferase of firefly, thermostable luciferase gene of firefly, novel recombinant dna, and process for the preparation of thermostable luciferase of firefly
US5459055A (en) 1991-12-27 1995-10-17 Epicentre Technologies Corporation Thermostable ribonuclease H isolated from Thermus flavus
US5413924A (en) 1992-02-13 1995-05-09 Kosak; Kenneth M. Preparation of wax beads containing a reagent for release by heating
EP0572057A1 (de) 1992-05-11 1993-12-01 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. PCR-Reagenzien- und Testsatz und Verfahren für die Amplifikation und Detektion mit verringerter, nicht-spezifischer Amplifikation von Nukleinsäuren
US5700672A (en) 1992-07-23 1997-12-23 Stratagene Purified thermostable pyrococcus furiousus DNA ligase
US5744345A (en) 1992-10-05 1998-04-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Hyperthermostable β-galactosidase gene, enzyme encoded thereby, and process for production
US5565339A (en) * 1992-10-08 1996-10-15 Hoffmann-La Roche Inc. Compositions and methods for inhibiting dimerization of primers during storage of polymerase chain reaction reagents
US5332774A (en) 1992-10-16 1994-07-26 Arco Chemical Technology, L.P. Polyvinyl acetal resins based on hydroxyaldehydes and use of the resins in laminar structures
US5614402A (en) 1992-12-07 1997-03-25 Third Wave Technologies, Inc. 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase
JP3459421B2 (ja) 1992-12-23 2003-10-20 サイテック ソチエタ レスポンサビリタ リミテ 調節された開放医薬形の調製法及びそのようにして得られた医薬形
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
US5616402A (en) * 1993-03-19 1997-04-01 Ncr Corporation Printing ribbon for printing red scannable bar codes
US5427928A (en) 1993-03-24 1995-06-27 Slesarev; Alexei I. Thermostable DNA Topoisomerase V
DE69414921T3 (de) * 1993-06-29 2004-04-15 Hewlett-Packard Co. (N.D.Ges.D.Staates Delaware), Palo Alto Vernetztes Polyvinylbutyral Bindemittel für organische Photoleiter
JP3808501B2 (ja) 1994-04-01 2006-08-16 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 高度に精製された組み換え逆転写酵素
US5939257A (en) 1994-04-18 1999-08-17 Amersham Life Science, Inc. Thermostable alkaline phosphatases
WO1995030756A1 (en) 1994-04-18 1995-11-16 United States Biochemical Corporation Thermostable alkaline phosphatase of thermus thermophilus
FR2719417B1 (fr) 1994-04-28 1996-07-19 Person Henri Le Composant à hétérostructure semi-conductrice, commande par la lumière pour la génération d'oscillations hyperfréquences.
US5643754A (en) 1994-05-25 1997-07-01 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding a leptospira outer membrane protein
JP3557289B2 (ja) 1994-07-21 2004-08-25 株式会社林原生物化学研究所 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
AUPN245295A0 (en) 1995-04-13 1995-05-11 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Assay for genetic abnormalities
US5776720A (en) 1995-05-18 1998-07-07 Coulter Corporation Assay reagent
US6033859A (en) 1996-05-24 2000-03-07 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Thermostable DNA polymerase from a hyperthermophilic archaeon strain KOD1
JP3112148B2 (ja) 1995-05-31 2000-11-27 東洋紡績株式会社 核酸の増幅方法およびその試薬
US5773258A (en) 1995-08-25 1998-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme
US5665551A (en) 1995-09-13 1997-09-09 Roche Molecular Systems, Inc. Purified nucleic acid encoding a thermostable pyrophosphatase
EP0866868B1 (de) 1995-12-15 2001-07-11 Amersham Life Science Inc Thermostabile dna polymerase aus thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus und davon abgeleitete mutierte enzyme mit entfernter exonukleaseaktivität
US6036486A (en) * 1996-01-25 2000-03-14 Frazier-Simplex, Inc. Heat regeneration for oxy-fuel fired furnaces
US20020164751A1 (en) 1996-06-19 2002-11-07 Short Jay M. Enzymes having thermostable phosphatase activity and methods of use thereof
US6312892B1 (en) 1996-07-19 2001-11-06 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction
EP0822256B1 (de) 1996-07-29 2003-09-24 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modifizierte thermostabile DNA Polymerase und eine DNA Polymerasezusammensetzung zur Amplifikation von Nukleinsäuren
US5736373A (en) 1996-09-23 1998-04-07 Becton, Dickinson And Company Thermostable DNA polymerase from Bacillus pallidus
DE19641064A1 (de) 1996-10-04 1998-04-09 Wacker Chemie Gmbh Modifizierte Polyvinylbutyrale mit niederer Lösungsviskosität
US5705379A (en) 1996-10-23 1998-01-06 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleotide sequences encoding a thermostable alkaline protease
FR2756560A1 (fr) * 1996-12-04 1998-06-05 Adir Nouveaux derives de l'imidazoline, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US6143517A (en) 1996-12-23 2000-11-07 University Of Florida Thermostable proteolytic enzymes and uses thereof in peptide and protein synthesis
US5744150A (en) 1997-01-29 1998-04-28 Xomed Surgical Products, Inc. Softened antimicrobial sponge material with color change indication of antimicrobial activity
DE69833652T2 (de) 1997-06-10 2006-09-21 Takara Bio Inc., Otsu System zum exprimieren einer hyperthermostabilen protease
US6113947A (en) 1997-06-13 2000-09-05 Genentech, Inc. Controlled release microencapsulated NGF formulation
US6004752A (en) * 1997-07-29 1999-12-21 Sarnoff Corporation Solid support with attached molecules
JP3018163B2 (ja) 1997-09-04 2000-03-13 工業技術院長 パイロコッカス属に属する超好熱性細菌由来の耐熱性Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ
US6346379B1 (en) 1997-09-11 2002-02-12 F. Hoffman-La Roche Ag Thermostable DNA polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes
EP2860252A1 (de) 1997-09-19 2015-04-15 Promega Corporation Thermostabile Luciferasen und Verfahren zur Herstellung
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US6183998B1 (en) 1998-05-29 2001-02-06 Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 Method for reversible modification of thermostable enzymes
US6130045A (en) 1998-06-11 2000-10-10 Clontech Laboratories, Inc. Thermostable polymerase
US6294367B1 (en) 1998-06-15 2001-09-25 California Institute Of Technology Thermostable peptidase
JP3482140B2 (ja) * 1998-10-06 2003-12-22 株式会社東芝 核酸鎖合成方法、核酸固定化チップおよび核酸鎖検出方法
CA2347104A1 (en) 1998-10-26 2000-04-05 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Sustained-release particles
IL143733A0 (en) 1998-12-23 2002-04-21 Orphan Medical Inc Microbiologically sound and stable solutions of gamma-hydroxybutyrate salt for the treatment of narcolepsy
US6380380B1 (en) 1999-01-04 2002-04-30 Specialty Assays, Inc. Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates
JP4175746B2 (ja) 1999-08-30 2008-11-05 独立行政法人科学技術振興機構 新規な耐熱性コラーゲン分解酵素、前記酵素を産生する新規な微生物および前記酵素の製造方法
US6541216B1 (en) 1999-12-22 2003-04-01 Roche Diagnostics Corporation Amperometric biosensor test strip
US7078208B2 (en) 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US6214557B1 (en) 2000-06-06 2001-04-10 Washington University Cold sensitive mutant DNA polymerases
KR100392501B1 (ko) 2000-06-28 2003-07-22 동국제약 주식회사 다중 에멀젼법에 의한 서방출성 미립구의 제조방법
US6576109B1 (en) * 2000-09-27 2003-06-10 Wealtec Enterprise Co., Ltd. Gel tray structure of an electrophoresis trough
AU2002233188A1 (en) 2000-12-21 2002-07-01 Unilever Plc Cleaning compositions
JP4146095B2 (ja) 2001-01-15 2008-09-03 ユニチカ株式会社 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法
CN100404692C (zh) * 2001-05-11 2008-07-23 松下电器产业株式会社 生物分子基底,使用它的检验和诊断方法及装置
EP1275735A1 (de) 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Zusammensetzung und Methode zur 'Hot start' Nukleinsäureamplifizierung
AU2002327421A1 (en) 2001-08-02 2003-02-17 Wayne M. Barnes Magnesium precipitate hot start method for molecular manipulation of nucleic acids
US20030027196A1 (en) 2001-08-02 2003-02-06 Barnes Wayne M. Magnesium precipitate methods for magnesium dependent enzymes
US6403341B1 (en) 2001-08-02 2002-06-11 Wayne M. Barnes Magnesium precipitate hot start method for PCR
US6921641B2 (en) 2001-08-10 2005-07-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Thermostable UvrA and UvrB polypeptides and methods of use
US6902921B2 (en) 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
RU2215037C1 (ru) 2002-04-15 2003-10-27 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Способ ферментативного синтеза днк

Also Published As

Publication number Publication date
CA2521476A1 (en) 2004-10-21
EP1611257A2 (de) 2006-01-04
AU2004227368A1 (en) 2004-10-21
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ATE405677T1 (de) 2008-09-15
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