JPH06303981A

JPH06303981A - ホルムアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにホルムアルデヒド脱水素酵素の製造法

Info

Publication number: JPH06303981A
Application number: JP9454793A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Ito; 伊藤　　潔; Tadashi Yoshimoto; 忠芳本; Onori Tsuru; 大典鶴; Mari Takahashi; 真理高橋
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1993-04-21
Filing date: 1993-04-21
Publication date: 1994-11-01

Abstract

(57)【要約】【目的】グルタチオン非依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素活性を天然の細菌において随伴する他の酵素を産
生せず、純粋な形で安価に大量供給しうる手段を提供す
る。【構成】配列表の配列番号１に記載された塩基配列を
含有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有する組換えベク
ター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体お
よび該形質転換体を培地で培養し、ホルムアルデヒド脱
水素酵素を生成させ、該ホルムアルデヒド脱水素酵素を
採取することを特徴とするホルムアルデヒド脱水素酵素
の製造法である。【効果】特に天然の細菌から生産した酵素には、クレ
アチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼ、ザルコシン脱水素酵素などが含有され、その
除外には多大の工程を必要としたが、本発明においては
これらの精製工程を簡略化することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、体液中のクレアチン測
定、クレアチニン測定、尿酸測定あるいはカタラーゼ測
定に用いられる、グルタチオン非依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤ
ＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有する組換えベクター、該ベ
クターで形質転換された形質転換体及び該形質転換体を
使用するホルムアルデヒド脱水素酵素を製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ホルムアルデヒド脱水素酵素（EC 1.2.
1.46 ）は、ホルムアルデヒドから蟻酸への酸化を触媒
する酵素で、グルタチオン依存性、非依存性の２つのタ
イプがある。グルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水
素酵素は、広く生物界に存在し、大腸菌から人に至るま
で多くの生物から精製されている。一方、グルタチオン
非依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素としては、現在ま
でのところシュードモナス属細菌が生産する酵素が唯一
のものである。活性発現にグルタチオンを必要としない
点で、シュードモナス属細菌が生産するホルムアルデヒ
ド脱水素酵素は、クレアチニン、クレアチン等の測定に
おける実用面において優れている。しかしながら、これ
らのシュードモナス属細菌は本来、ホルムアルデヒド脱
水素酵素の他に、クレアチニン、クレアチンの測定に必
要であるクレアチニン・アミドヒドロラーゼ、クレアチ
ンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシン脱水素酵素なども
ともに産生する。したがって該細菌からホルムアルデヒ
ド脱水素酵素を精製して純粋なものを得るには多大な工
程が必要である。またシュードモナス属細菌のホルムア
ルデヒド脱水素酵素生産性はあまり十分なものではな
く、工業的にホルムアルデヒド脱水素酵素を多量に生産
することも求められていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、グル
タチオン非依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素活性を有
する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ断片を単離し、そ
の分子構造を明らかにするとともに、ホルムアルデヒド
脱水素酵素活性を有する蛋白質を遺伝子工学的手法によ
って天然の細菌において随伴する他の酵素を産生せず、
純粋な形で安価に大量供給しうる手段を提供することに
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、グルタチオン非依存性ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素生産菌としてシュードモナス・プチダ(Pse
udomonas putida)を選び、該菌体より抽出した染色体Ｄ
ＮＡよりホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子の単離に成
功し、そのＤＮＡの全構造を決定した。更に本ホルムア
ルデヒド脱水素酵素を遺伝子工学的手法によって形質転
換体に高生産させることに成功し、高純度なホルムアル
デヒド脱水素酵素を安価に大量供給することを可能にし
た。

【０００５】すなわち本発明はグルタチオン非依存性ホ
ルムアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情
報を有するＤＮＡ断片であり、その一例をして配列表の
配列番号１に記載された塩基配列を含有するものが挙げ
られる。

【０００６】また本発明は上記ＤＮＡ断片を有する組換
えベクターである。

【０００７】さらに本発明は上記組換えベクターで形質
転換された形質転換体である。

【０００８】また本発明は上記形質転換体を培地で培養
し、ホルムアルデヒド脱水素酵素を生成させ、該ホルム
アルデヒド脱水素酵素を採取することを特徴とするホル
ムアルデヒド脱水素酵素の製造法である。

【０００９】本発明のグルタチオン非依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素生産菌としては、シュドモナス属細菌
であれば、いかなるものでのよいが、例えばシュードモ
ナス・プチダ、シュードモナス・アエルギノーサ、シュ
ードモナス・セバシアやシュードモナス・フルオレッセ
ンス等が挙げられる。本願発明の実施例においては、シ
ュードモナス・プチダPSー7を利用した。

【００１０】これらの菌を培養する培地とは、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じて硝酸塩、リン酸
塩等を含有するものである。炭素源としては、澱粉ある
いは澱粉加水分解物、糖密、ペプトン類等が用いられ
る。窒素源としては、ポリペプトン、トリプトン、肉エ
キス、酵母エキス等が使用できる。培養は好気的条件下
で培地のｐＨ及び温度を適宜調節することが望ましい
が、形質転換された菌によっては必ずしもその必要はな
い。培養時間は培養物のホルムアルデヒド脱水素酵素活
性が最高になるところまで行なう。

【００１１】培養物より、ホルムアルデヒド脱水素酵素
を精製するには、従来、次の様な方法が用いられてい
る。培養物を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌さ
せることによってホルムアルデヒド脱水素酵素含有溶菌
物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームや
β−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理や超
音波破砕、ダイノミル破砕処理等の物理的破砕法が好適
である。この様にして得られた溶菌物を硫安沈澱分画
し、脱塩した後、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カ
ラムやヒドロキシルアパタイトカラム等の担体にかけて
カラムクロマトグラフィーによる分画を行う。シュード
モナス属細菌は、ホルムアルデヒド脱水素酵素の他に、
クレアチニン、クレアチンの測定に用いられるクレアチ
ニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼ、ザルコシン脱水素酵素などもともに産生する。た
とえばシュードモナス・プチダPS-7は約 1単位/ml のク
レアチニンアミドヒドロラーゼ、約 1単位/ml のクレア
チンアミジノヒドロラーゼ、約 0.5単位/ml のザルコシ
ン脱水素酵素を生産する。これらの酵素がホルムアルデ
ヒド脱水素酵素の精製標品に混入していると、本来の設
定値より過剰な量の酵素が測定物の存在することとな
り、測定誤差が生じる原因となる。したがって該細菌か
らホルムアルデヒド脱水素酵素を精製して純粋なものを
得るには多大な工程が必要である。すなわち2種類以上
のカラムクロマトグラフィーの組み合わせ、および他の
精製法との併用を検討することが必要となる。

【００１２】本発明のグルタチオン非依存性ホルムアル
デヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有す
るＤＮＡ（以下、ホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子と
もいう）は、シュードモナス属細菌、例えばシュードモ
ナス・プチダから抽出してもよく、また合成することも
できる。このような塩基配列としては、例えば配列表の
配列番号１に記載された塩基配列または配列表の配列番
号２に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を
挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡは遺伝子組
換え技術により基本となるＤＮＡの特定部位に、該ＤＮ
Ａがコードするホルムアルデヒド脱水素酵素の基本的な
特性を変化させる事なく、或いはその特性を改善するよ
うに人為的に変異、例えば置換，削除，挿入などを起こ
させたものも含むものである。

【００１３】本発明のＤＮＡは、例えばシュードモナス
・プチダのＤＮＡを分離・精製した後、超音波，制限酵
素などを用いて、ＤＮＡを切断したものとリニヤーな発
現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部におい
てＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させて組換えベク
ターとする。こうして得られた組換えベクターは複製可
能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとホ
ルムアルデヒド脱水素酵素活性、あるいはホルムアルデ
ヒド脱水素酵素遺伝子に特異的なプローブとのハイブリ
ダイゼーションを指標としてスクリーニングして該組換
えベクターを保持する微生物を得る。該微生物を培養
し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、
次いで該組換えベクターからホルムアルデヒド脱水素酵
素遺伝子を採取すればよい。

【００１４】次にＤＮＡの採取方法をより詳細に説明す
る。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは次
の如くにして採取される。すなわち、供与微生物である
上述した細菌を例えば液体培地で約１〜３日間通気撹拌
培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いで
これを溶菌させることによってホルムアルデヒド脱水素
酵素遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌
方法としてはたとえばリゾチームやβ−グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要により、
プロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム
などの界面活性剤が併用され、更に細胞壁の物理的破砕
法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法
との組み合せで行ってもよい。この様にして得られた溶
菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って例え
ばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処
理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱遠心分離な
どの方法を適宜組み合わせることにより行なうことがで
きる。

【００１５】微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断
する方法は、例えば超音波処理，制限酵素処理などを行
なうことができるが、得られる微生物ＤＮＡ断片とベク
ターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素とりわけ
特定ヌクレオチド配列に作用する、例えばEcoRＩ, Hind
II，BamHＩなどのII型制限酵素が適している。ベクター
としては、宿主微生物で自律的に増殖しうるファージま
たはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたも
のが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒ
ア・コリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合
には、λgt・10,λgt・11 などが使用できる。また、プラ
スミドとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主微
生物とする場合にはpBR322,pUC18などが使用できる。こ
の様なベクターを、先に述べたホルムアルデヒド脱水素
酵素遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した
制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得
ることが望ましい。微生物ＤＮＡ断片をベクター断片と
結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法
であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベ
クター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤ
ＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター
断片との組換えベクターを作成する。必要ならば、アニ
ーリングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡ
リガーゼを利用し、組換えベクターを作成することもで
きる。

【００１６】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質
が発現できるものであればよく、例えば宿主微生物がエ
シェリヒア・コリー W3110, エシェリヒア・コリーC60
0, エシェリヒア・コリーJM109 ，エシェリヒア・コリ
ーDH5 αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクタ
ーを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェ
リヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオン
の存在下で組換えDNA の移入を行なう方法などを採用す
ることができ、更にエレクトロポレーション法を用いて
も良い。こうして得られた形質転換体である微生物は、
栄養培地で培養されることにより、多量のホルムアルデ
ヒド脱水素酵素を安定して生産し得ることを見出した。
宿主微生物への目的組換えベクター移入の有無について
の選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤
耐性マーカーとホルムアルデヒド脱水素酵素とを同時に
発現し得る微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マ
ーカーに基づく選択培地で生育し、且つホルムアルデヒ
ド脱水素酵素を生産する微生物を選択すればよい。

【００１７】上述の方法により得られたホルムアルデヒ
ド脱水素酵素遺伝子の塩基配列はサイエンス（Scienc
e),214,1205 〜1210(1981)に記載されているジデオキシ
法で解読し、またホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ
酸配列は塩基配列より推定した。この様にして、一度
選択されたホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子を保有す
る組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、
他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。ま
た、ホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子を保持する組換
えベクターから制限酵素などにより切断してホルムアル
デヒド脱水素酵素遺伝子を含有するＤＮＡを切り出し、
これを同様な方法により切断して得られるベクター断片
とを結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実
施できる。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿
主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよ
く、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通
気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源として
は微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得
る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよ
く、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、
マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼ
イン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。

【００１８】培養温度は菌が発育し、ホルムアルデヒド
脱水素酵素を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシュ
リヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度であ
る。培養時間は条件によって多少異なるが、ホルムアル
デヒド脱水素酵素が最高収量に達する時期を見計らって
適当時期に培養を終了すればよく、通常は6〜48時間程
度である。培地pHは菌が発育しホルムアルデヒド脱水素
酵素を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましく
はpH6.0 〜9.0 程度である。培養物中のホルムアルデヒ
ド脱水素酵素を生産する菌体を含む培養液をそのまま採
取し利用することもできるが、一般には常法に従ってホ
ルムアルデヒド脱水素酵素が培養液中に存在する場合は
濾過，遠心分離などにより、ホルムアルデヒド脱水素酵
素含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。
ホルムアルデヒド脱水素酵素が菌体内に存在する場合に
は、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段に
より菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法または
リゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じ
てEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して
ホルムアルデヒド脱水素酵素を可溶化し、水溶液として
分離採取する。

【００１９】この様にして得られたホルムアルデヒド脱
水素酵素含有溶液を例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸
アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは
親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセ
トンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。
また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。
吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過，吸着クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィーにより、精製されたホル
ムアルデヒド脱水素酵素を得ることができる。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、ホルムアルデヒド脱水素酵素の活性測定
は以下のように行なった。すなわち、21mMリン酸緩衝液
(pH7.5) 、4.2mM ホルムアルデヒド、0.46mM ＮＡＤ、
27μM ＰＭＳ、0.1mM ＮＴＢ、0.21% トリトンＸ−１０
０中で酵素を３７℃、１５分反応させ、生成したＮＡＤ
ＨによりＰＭＳを介してＮＴＢを還元し、生成したジホ
ルマザンの570nm における吸光度を測定する。酵素活性
の１単位は、この条件下で１分間当たり１／２マイクロ
モルのジホルマザンを生成する酵素量とした。

【００２１】実施例１グルタチオン非依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素のア
ミノ酸配列の決定グルタチオン非依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素粉末
（東洋紡製）をSuperdex200 カラムでのゲル濾過クロマ
トグラフィー及びヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィーにより精製した。最終精製標品をSDS ー PAGE
でチェックしたところ、ほぼ均一なバンドが得られ、サ
ブユニットの分子量は約４２０００ダルトンと計算され
た。この標品をアンモニア−蟻酸緩衝液に対し透析後、
凍結乾燥し、マニュアルエドマン分解法によって精製し
た酵素のＮ末端からのアミノ酸配列を決定した（配列表
の配列番号３）。また、同標品を臭化シアンによって分
解して得たペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣで分離、精製
し、マニュアルエドマン分解法によりペプチド断片のア
ミノ酸配列を決定した（配列表の配列番号４）。

【００２２】実施例２染色体ＤＮＡの分離シュードモナス・プチダPSー7の染色体ＤＮＡを次の方法
で分離した。同菌株を100ml のＬＢ培地（1.0%ポリペプ
トン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム（pH7.2)で
37℃一晩振盪培養後、遠心(8000rpm,10 分) により集菌
した。15mMクエン酸ナトリウム,0.15M塩化ナトリウムを
含んだ溶液で菌体を洗浄した後、20% シュークロース,1
mMＥＤＴＡ, 50mMトリス塩酸(pH7.6) を含んだ溶液 5ml
に懸濁させ、0.5ml のリゾチーム溶液(100mg/ml)を加え
て37℃，30分間保温した。次いで11mlの 1% ラウロイル
サルコシン、0.1MＥＤＴＡ（pH9.6)を含む溶液を加え
た。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を0.5%塩化セシウ
ムを約100%加え、撹拌混合し、55.000rpm ，20時間の超
遠心でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは、10mMトリ
ス塩酸(pH8.0) ，1mM ＥＤＴＡを含んだ溶液(TE)で透析
し、精製ＤＮＡ標品とした。エシェリヒア・コリー DH5
αのコンピテントセルは Hanahanの方法により作成し、
ライブラリー作成の宿主として用いた。

【００２３】実施例３ホルムアルデヒド脱水素酵素遺
伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組
換えベクターの調製実施例１で決定したアミノ酸配列をもとに２種類のプロ
ーブ（配列表の配列番号５，６）を作成し、実施例２で
得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるホルムア
ルデヒド脱水素酵素遺伝子断片の増幅を行ない、約0.5k
bpの増幅断片を得た。次に得られた断片をプローブとし
て実施例２で得た染色体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼ
ーションを行なった結果、9kbpEcoRI の特異的バンドが
検出された。そこで、この部分のＤＮＡを抽出し、EcoR
I(東洋紡製）で切断したpBR322とT4-ＤＮＡリガーゼ
（東洋紡製）で反応させ、ＤＮＡを連結した。連結した
ＤＮＡはエシェリヒア・コリー DH5αのコンピテントセ
ルを用いて形質転換した。得られたコロニーをＰＣＲ法
で増幅した断片をプローブとしたコロニーハイブリダイ
ゼーションでスクリーニングして、ホルムアルデヒド脱
水素酵素遺伝子を含有する9kbpEcoRI ＤＮＡ断片を持つ
組換えベクターを得た（Ｅ１と命名）。

【００２４】次いで組換えベクターＥ１より挿入ＤＮＡ
断片を種々の制限酵素による切断、あるいはエキソヌク
レアーゼIII（東洋紡製）による消化処理を行なって、
ブルースクリプト(pBluescript) にサブクローニング
し、約2.1kbpの挿入ＤＮＡ断片を有する組換えベクター
Ｋ３ＤＮ７１を得、エシェリヒア・コリー DH5αを形質
転換した。組換えベクターＥ１及びＫ３ＤＮ７１を含む
その派生プラスミドの挿入ＤＮＡ制限酵素地図を図１に
示した。

【００２５】実施例４塩基配列の決定組換えベクターＫ３ＤＮ７１の挿入ＤＮＡ断片について
種々の制限酵素で切断してサブクローンを調製した。種
々のサブクローンは常法に従い、塩基配列決定用キット
(SEQUENASE VERSION 2.0 7-deaza-dGTP kit)(東洋紡
製）を用いて塩基配列の決定を行った。決定した塩基配
列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１および配列番
号２に示した。

【００２６】実施例５形質転換体の培養とホルムアル
デヒド脱水素酵素の生成ホルムアルデヒド脱水素酵素生産培地（1.0%肉エキス,
1.0% ポリペプトン，0.5%ＮａＣｌ(pH7.5))50mlを 500m
lフラスコに分注し、 121℃，15分間オートクレーブを
行い放冷後、別途無菌濾過した抗生物質（50mg/ml アン
ピシリン（ナカライテスク製))を添加した。この培地に
上記と同一組成の培地で予め30℃で18時間振盪培養した
Ｋ３ＤＮ７１組換え体の培養液 5mlを接種し、30℃で通
気撹拌培養した。培養開始より20時間後で、Ｋ３ＤＮ７
１組換え体は約 6.5U/mlのホルムアルデヒド脱水素酵素
活性を示した。この値は、同条件下でのシュードモナス
・プチダPSー7のホルムアルデヒド脱水素酵素活性の約４
０倍に相当し、本ホルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子が
エシェリヒア・コリー内において、効率的に発現するこ
とが明らかとなった。

【００２７】

【発明の効果】本発明によってグルタチオン非依存性ホ
ルムアルデヒド脱水素酵素遺伝子の塩基配列及びアミノ
酸配列が明らかになり、また遺伝子工学的手法によりホ
ルムアルデヒド脱水素酵素を容易に高純度で大量生産す
ることが出来る。特に天然の細菌から生産した酵素に
は、他の酵素、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシン脱水素酵素が
含有され、その除外には多大の工程を必要としたが、本
発明においてはこれらの精製工程を簡略化することが可
能となった。また本発明のグルタチオン非依存性ホルム
アルデヒド脱水素酵素遺伝子と種々の蛋白質工学的手法
とを用いることにより、より高活性な、或いはより安定
性の高い新規ホルムアルデヒド脱水素酵素を作ることも
可能になる。

【００２８】

【配列表】

配列番号： 1 配列の長さ：1296 配列の型：核酸(DNA) 鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 起源生物名：シュードモナスプチダ(Pseudomonas PUTIDA) 株名：PS-7 配列 CCTTTGTATT CACAACAACA ACGGAGAATT ACGC ATG TCT GGT AAT CGT GGT 52 Met Ser Gly Asn Arg Gly 1 5 GTC GTT TAT CTC GGT TCG GGC AAG GTC GAA GTC CAG AAG ATC GAC TAC 100 Val Val Tyr Leu Gly Ser Gly Lys Val Glu Val Gln Lys Ile Asp Tyr 10 15 20 CCC AAA ATG CAG GAC CCT CGC GGC AAG AAG ATC GAG CAC GGG GTC ATC 148 Pro Lys Met Gln Asp Pro Arg Gly Lys Lys Ile Glu His Gly Val Ile 25 30 35 CTG AAA GTC GTC TCC ACC AAC ATC TGC GGC TCG GAC CAG CAC ATG GTG 196 Leu Lys Val Val Ser Thr Asn Ile Cys Gly Ser Asp Gln His Met Val 40 45 50 CGC GGT CGT ACC ACC GCC CAG GTA GGC CTC GTG CTT GGC CAC GAG ATC 244 Arg Gly Arg Thr Thr Ala Gln Val Gly Leu Val Leu Gly His Glu Ile 55 60 65 70 ACC GGT GAG GTG ATC GAG AAG GGC CGT GAC GTA GAG AAC CTG CAG ATC 292 Thr Gly Glu Val Ile Glu Lys Gly Arg Asp Val Glu Asn Leu Gln Ile 75 80 85 GGC GAC CTG GTT TCC GTA CCC TTC AAC GTG GCC TGC GGC CGC TGC CGT 340 Gly Asp Leu Val Ser Val Pro Phe Asn Val Ala Cys Gly Arg Cys Arg 90 95 100 TCC TGC AAG GAA ATG CAC ACC GGC GTT TGC CTG ACC GTC AAT CCG GCC 388 Ser Cys Lys Glu Met His Thr Gly Val Cys Leu Thr Val Asn Pro Ala 105 110 115 CGC GCT GGC GGC GCC TAC GGC TAT GTC GAC ATG GGC GAC TGG ACC GGT 436 Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Tyr Val Asp Met Gly Asp Trp Thr Gly 120 125 130 GGC CAG GCC GAG TAC TTG CTG GTG CCC TAC GCC GAC TTC AAC CTG CTC 484 Gly Gln Ala Glu Tyr Leu Leu Val Pro Tyr Ala Asp Phe Asn Leu Leu 135 140 145 150 AAG CTG CCG GAT CGC GAC AAG GCC ATG GAG AAG ATC CGT GAC CTG ACC 532 Lys Leu Pro Asp Arg Asp Lys Ala Met Glu Lys Ile Arg Asp Leu Thr 155 160 165 TGC CTT TCC GAC ATC CTG CCC ACC GGC TAC CAC GGC GCC GTA ACT GCC 580 Cys Leu Ser Asp Ile Leu Pro Thr Gly Tyr His Gly Ala Val Thr Ala 170 175 180 GGC GTT GGC CCG GGC AGC ACC GTG TAC GTG GCC GGT GCC GGC CCG GTC 628 Gly Val Gly Pro Gly Ser Thr Val Tyr Val Ala Gly Ala Gly Pro Val 185 190 195 GGC CTG GCC GCT GCC GCC TCC GCT CGC CTG CTG GGC GCC GCC GTG GTT 676 Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Val 200 205 210 ATC GTC GGC GAC CTC AAC CCC GCC CGA CTG GCC CAC GCC AAG GCG CAG 724 Ile Val Gly Asp Leu Asn Pro Ala Arg Leu Ala His Ala Lys Ala Gln 215 220 225 230 GGC TTC GAG ATC GCC GAC CTG TCG CTG GAC ACC CCG CTG CAC GAG CAG 772 Gly Phe Glu Ile Ala Asp Leu Ser Leu Asp Thr Pro Leu His Glu Gln 235 240 245 ATC GCT GCG CTG CTG GGA GAG CCG GAA GTG GAT TGC GCG GTG GAT GCG 820 Ile Ala Ala Leu Leu Gly Glu Pro Glu Val Asp Cys Ala Val Asp Ala 250 255 260 GTG GGC TTC GAA GCT CGC GGC CAC GGC CAC GAA GGT GCC AAG CAC GAA 868 Val Gly Phe Glu Ala Arg Gly His Gly His Glu Gly Ala Lys His Glu 265 270 275 GCC CCG GCC ACT GTG CTG AAC TCG CTC ATG CAA GTC ACC CGC GTG GCC 916 Ala Pro Ala Thr Val Leu Asn Ser Leu Met Gln Val Thr Arg Val Ala 280 285 290 GGC AAG ATC GGT ATC CCC GGC CTT TAC GTC ACC GAA GAT CCG GGT GCC 964 Gly Lys Ile Gly Ile Pro Gly Leu Tyr Val Thr Glu Asp Pro Gly Ala 295 300 305 310 GTG GAG CCC GCG GCG AAG ATC GGC AGC CTG AGT ATT CGC TTC GGC CTC 1012 Val Glu Pro Ala Ala Lys Ile Gly Ser Leu Ser Ile Arg Phe Gly Leu 315 320 325 GGC TGG GCG AAA TCC CAC AGC TTC CAC ACT GGC CAG ACC CCG GTG ATG 1060 Gly Trp Ala Lys Ser His Ser Phe His Thr Gly Gln Thr Pro Val Met 330 335 340 AAG TAC AAC CGC GCA CTC ATG CAA GCG ATC ATG TGG GAC CGC ATC AAT 1108 Lys Tyr Asn Arg Ala Leu Met Gln Ala Ile Met Trp Asp Arg Ile Asn 345 350 355 ATC GCC GAA GTG GTG GGC GTG CAG GTC ATC AGC CTG GAC GAC GCA CCG 1156 Ile Ala Glu Val Val Gly Val Gln Val Ile Ser Leu Asp Asp Ala Pro 360 365 370 CGT GGC TAT GGC GAG TTC GAT GCC GGC GTG CCG AAG AAG TTC GTC ATC 1204 Arg Gly Tyr Gly Glu Phe Asp Ala Gly Val Pro Lys Lys Phe Val Ile 375 380 385 390 GAC CCG CAC AAG ACC TTC AGC GCG GCC TGATCGACTG CAATACCCCC 1251 Asp Pro His Lys Thr Phe Ser Ala Ala 395 GACGCCGTGA TGTGACAGCC GCGGCGTCTG TCCCTCAAGG GGCCC 1296

【００２９】配列番号： 2 配列の長さ：399 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：シュードモナスプチダ(Pseudomonas PUTIDA) 株名：PS-7 配列 Met Ser Gly Asn Arg Gly Val Val Tyr Leu Gly Ser Gly Lys Val Glu 1 5 10 15 Val Gln Lys Ile Asp Tyr Pro Lys Met Gln Asp Pro Arg Gly Lys Lys 20 25 30 Ile Glu His Gly Val Ile Leu Lys Val Val Ser Thr Asn Ile Cys Gly 35 40 45 Ser Asp Gln His Met Val Arg Gly Arg Thr Thr Ala Gln Val Gly Leu 50 55 60 Val Leu Gly His Glu Ile Thr Gly Glu Val Ile Glu Lys Gly Arg Asp 65 70 75 80 Val Glu Asn Leu Gln Ile Gly Asp Leu Val Ser Val Pro Phe Asn Val 85 90 95 Ala Cys Gly Arg Cys Arg Ser Cys Lys Glu Met His Thr Gly Val Cys 100 105 110 Leu Thr Val Asn Pro Ala Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Tyr Val Asp 115 120 125 Met Gly Asp Trp Thr Gly Gly Gln Ala Glu Tyr Leu Leu Val Pro Tyr 130 135 140 Ala Asp Phe Asn Leu Leu Lys Leu Pro Asp Arg Asp Lys Ala Met Glu 145 150 155 160 Lys Ile Arg Asp Leu Thr Cys Leu Ser Asp Ile Leu Pro Thr Gly Tyr 165 170 175 His Gly Ala Val Thr Ala Gly Val Gly Pro Gly Ser Thr Val Tyr Val 180 185 190 Ala Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Arg Leu 195 200 205 Leu Gly Ala Ala Val Val Ile Val Gly Asp Leu Asn Pro Ala Arg Leu 210 215 220 Ala His Ala Lys Ala Gln Gly Phe Glu Ile Ala Asp Leu Ser Leu Asp 225 230 235 240 Thr Pro Leu His Glu Gln Ile Ala Ala Leu Leu Gly Glu Pro Glu Val 245 250 255 Asp Cys Ala Val Asp Ala Val Gly Phe Glu Ala Arg Gly His Gly His 260 265 270 Glu Gly Ala Lys His Glu Ala Pro Ala Thr Val Leu Asn Ser Leu Met 275 280 285 Gln Val Thr Arg Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Pro Gly Leu Tyr Val 290 295 300 Thr Glu Asp Pro Gly Ala Val Glu Pro Ala Ala Lys Ile Gly Ser Leu 305 310 315 320 Ser Ile Arg Phe Gly Leu Gly Trp Ala Lys Ser His Ser Phe His Thr 325 330 335 Gly Gln Thr Pro Val Met Lys Tyr Asn Arg Ala Leu Met Gln Ala Ile 340 345 350 Met Trp Asp Arg Ile Asn Ile Ala Glu Val Val Gly Val Gln Val Ile 355 360 365 Ser Leu Asp Asp Ala Pro Arg Gly Tyr Gly Glu Phe Asp Ala Gly Val 370 375 380 Pro Lys Lys Phe Val Ile Asp Pro His Lys Thr Phe Ser Ala Ala 385 390 395

【００３０】配列番号： 3 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：シュードモナスプチダ(Pseudomonas PUTIDA) 株名：PS-7

【００３１】配列番号： 4 配列の長さ： 6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：シュードモナスプチダ(Pseudomonas PUTIDA) 株名：PS-7

【００３２】配列番号： 5 配列の長さ：20 配列の型：核酸(DNA) 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列 MAWCGTGGTG TNGTNTAYYT 20

【００３３】配列番号： 6 配列の長さ：20 配列の型：核酸(DNA) 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列 ARRTCiCKiA TYTTYTCCAT 20

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｅ１及びその派生プラスミドの挿入ＤＮＡの制
限酵素地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルタチオン非依存性ホルムアルデヒド
脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮ
Ａ断片。
【請求項２】配列表の配列番号１に記載された塩基配
列を含有する請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】請求項２に記載されたＤＮＡ断片を有す
る組換えベクター。
【請求項４】請求項３に記載された組換えベクターで
形質転換された形質転換体。
【請求項５】請求項４に記載された形質転換体を培地
で培養し、ホルムアルデヒド脱水素酵素を生成させ、該
ホルムアルデヒド脱水素酵素を採取することを特徴とす
るホルムアルデヒド脱水素酵素の製造法。