JP3508871B2

JP3508871B2 - クレアチニンデイミナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにクレアチニンデイミナーゼの製造法

Info

Publication number: JP3508871B2
Application number: JP27548293A
Authority: JP
Inventors: 伊藤　　潔; 忠芳本; 大典鶴
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1993-09-30
Filing date: 1993-11-04
Publication date: 2004-03-22
Anticipated expiration: 2019-03-22
Also published as: JPH07143881A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クレアチニンデイミナ
ーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片を有する組換えベクター、該組換えベ
クターで形質転換された形質転換体及び該形質転換体を
使用するクレアチニンデイミナーゼを製造する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】クレアチニンデイミナーゼ（EC 3.5.4.2
1)は、クレアチニンをＮ−メチルヒダントインとアンモ
ニアへ加水分解する反応を触媒する酵素であり、体液中
のクレアチニンを測定する試薬として使用されている。
クレアチニンデイミナーゼの供給源としては、バチルス
属細菌（特開昭６１−２１９３８３号公報）、コリネバ
クテリウム属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）、
フラボバクテリウム属細菌（The Journal of Biologica
l Chemistry Vol.260 No.7 p3915-3922, 1985)などが知
られている。しかしながら、これらの細菌のクレアチニ
ンデイミナーゼ生産量は充分なものではなかった。また
これらの細菌でクレアチニンデイミナーゼを生産するた
めには、培地に誘導物質であるクレアチニンを添加する
ことが必要である。しかしながら、クレアチニンが高価
であることから、工業的にクレアチニンデイミナーゼを
生産する際、クレアチニンを必要としない安価な製造法
が求められていた。

【０００３】誘導物質を必要とする細胞からの酵素の遺
伝子を、他の細胞へ導入して遺伝子工学的に酵素を生産
することにより、誘導物質を必要とせず、安価に酵素を
生産することは、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラー
ゼなどの酵素では実施されている。しかしながら、クレ
アチニンデイミナーゼでは、そのアミノ酸配列および遺
伝子が未知であり、遺伝子工学的に生産することは今ま
で行われていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、クレ
アチニンデイミナーゼを有する蛋白質の遺伝情報を有す
るＤＮＡ断片を単離し、その分子構造を明らかにすると
ともに、クレアチニンデイミナーゼ活性を有する蛋白質
を遺伝子工学的手法によって、純粋な形で安価に大量供
給しうる手段を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、クレアチニンデイミナーゼ生産菌の菌
体から抽出した染色体ＤＮＡより、クレアチニンデイミ
ナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ断
片の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を決定した。更
に、本クレアチニンデイミナーゼを遺伝子工学的手法を
用いて形質転換体により誘導物質のない条件で高生産さ
せることに成功し、高純度なクレアチニンデイミナーゼ
を安価に大量供給することを可能にした。

【０００６】すなわち本発明はクレアチニンデイミナー
ゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ断片で
あり、その一例として配列表の配列番号２に記載される
アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、例えば配列番号１に
記載される塩基配列を含有するものが挙げられる。

【０００７】また本発明は上記ＤＮＡ断片を有する組換
えベクターである。

【０００８】さらに本発明は上記組換えベクターで形質
転換された形質転換体である。

【０００９】また本発明は上記形質転換体を培地で培養
し、クレアチニンデイミナーゼを生成させ、該クレアチ
ニンデイミナーゼを採取することを特徴とするクレアチ
ニンデイミナーゼの製造法である。

【００１０】本発明のクレアチニンデイミナーゼ生産菌
としては、クレアチニンデイミナーゼを生産する菌株で
あれば、特に限定されないが、本発明の実施例において
は、バチルス・エスピーＣＮＩ−１３６５（微工研菌寄
第８１３８号）を利用した。

【００１１】これらの菌を培養する培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて硝酸塩、リ
ン酸塩等を含有するものがある。炭素源としては、澱粉
あるいは澱粉加水分解物、糖密、ペプトン類等が用いら
れる。窒素源としては、ポリペプトン、トリプトン、肉
エキス、酵母エキス等が使用できる。培養は好気的条件
下で培地のpH及び温度を適宜調節することが望ましい。
培養時間は培養物のクレアチニンデイミナーゼ活性が最
高になるところまで行なう。

【００１２】培養物より、クレアチニンデイミナーゼを
精製するには、次の様な方法が用いられる。培養物を遠
心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによっ
てクレアチニンデイミナーゼ含有溶菌物を調製する。溶
菌方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ
などの細胞壁溶解酵素による処理や超音波破砕、ダイノ
ミル破砕処理等の物理的破砕法が好適である。この様に
して得られた溶菌物を硫安沈澱分画し、脱塩した後、陽
イオン交換カラム、陰イオン交換カラムやヒドロキシル
アパタイトカラム等の担体にかけてカラムクロマトグラ
フィーによる分画を行なう。

【００１３】本発明のクレアチニンデイミナーゼ活性を
有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ（以下、クレア
チニンデイミナーゼ遺伝子ともいう）は、クレアチニン
デイミナーゼ生産細菌から抽出してもよく、また合成す
ることもできる。上記塩基配列としては、例えば配列表
の配列番号２に記載されたアミノ酸配列をコードする塩
基配列、または配列表の配列番号１に記載された塩基配
列を挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡ断片
は、遺伝子組換え技術により、基本となるＤＮＡの特定
部位に、該ＤＮＡがコードするクレアチニンデイミナー
ゼの基本的な特性を変化させることなく、或いはその特
性を改善するように人為的に変異、例えば置換、削除、
挿入などを起こさせたものも含むものである。

【００１４】本発明のＤＮＡ断片は、例えばバチルス属
細菌のＤＮＡを分離・精製した後、超音波、制限酵素な
どを用いて、ＤＮＡを切断化したものとリニヤーな発現
ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接着末端部におい
て、ＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させて組換えベ
クターとする。こうして得られた組換えベクターは複製
可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと
クレアチニンデイミナーゼ活性、あるいはクレアチニン
デイミナーゼ遺伝子に特異的なプローブとのハイブリダ
イゼーションを指標としてスクリーニングして該組換え
ベクターを保持する微生物を得る。該微生物を培養し、
該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、次い
で該組換えベクターからクレアチニンデイミナーゼ遺伝
子を採取すればよい。

【００１５】次にＤＮＡの採取方法をより詳細に説明す
る。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは次
の如くにして採取する。すなわち、供与微生物である上
述した細菌を例えば液体培地で約１〜３日間通気撹拌培
養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いでこ
れを溶菌させることによってクレアチニンデイミナーゼ
遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法
としてはたとえばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの
細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要により、プロ
テアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなど
の界面活性剤が併用され、更に細胞壁の物理的破砕法で
ある凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との
組み合せで行ってもよい。

【００１６】この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを
分離・精製するには常法に従って例えばフェノール抽出
による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアー
ゼ処理、アルコール沈澱遠心分離などの方法を適宜組み
合わせることにより行なうことができる。微生物から分
離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波
処理、制限酵素処理などを行なうことができるが、得ら
れる微生物ＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならし
める為、制限酵素とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用
する、例えばEcoRＩ,Hind III ,BamH ＩなどのII型制限
酵素が適している。

【００１７】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものが適している。ファージとして
は、例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を
宿主微生物とする場合には、λgt・10，λgt・11などが
使用できる。また、プラスミドとしては、例えばエシェ
リヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、pBluescr
ipt, pUC18などが使用できる。

【００１８】この様なベクターを、先に述べたクレアチ
ニンデイミナーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切
断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベク
ター断片を得ることが望ましい。微生物ＤＮＡ断片をベ
クター断片と結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼ
を用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の
接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの
後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断
片とベクター断片との組換えベクターを作成する。必要
ならば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して、生
体内のＤＮＡリガーゼを利用し、組換えベクターを作成
することもできる。

【００１９】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質
が発現できるものであればよく、例えば宿主微生物がエ
シェリヒア・コリー W3110, エシェリヒア・コリーC60
0, エシェリヒア・コリーJM109, エシェリヒア・コリ
ーHB101, エシェリヒア・コリーDH5 αなどが利用でき
る。

【００２０】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換
えDNA の移入を行なう方法などを採用することができ、
更にエレクトロポレーション法を用いても良い。こうし
て得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養
されることにより、多量のクレアチニンデイミナーゼを
安定して生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクタ
ー移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保
持するベクターの薬剤耐性マーカーとクレアチニンデイ
ミナーゼとを同時に発現し得る微生物を検索すればよ
く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育
し、且つクレアチニンデイミナーゼを生産する微生物を
選択すればよい。

【００２１】上述の方法により得られたクレアチニンデ
イミナーゼ遺伝子の塩基配列は、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 74, 5463〜5467(1977)に記載されているジデオ
キシ法で解読し、またクレアチニンデイミナーゼのアミ
ノ酸配列は塩基配列より推定した。この様にして、一度
選択されたクレアチニンデイミナーゼ遺伝子を保有する
組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他
の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。ま
た、クレアチニンデイミナーゼ遺伝子を保持する組換え
ベクターから制限酵素などにより切断してクレアチニン
デイミナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを切り出し、これ
を同様な方法により切断して得られるベクター断片とを
結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実施で
きる。

【００２２】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
よく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され
得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよ
く、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、
マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼ
イン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。

【００２３】培養温度は菌が発育し、クレアチニンデイ
ミナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリ
ヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。
培養時間は条件によって多少異なるが、クレアチニンデ
イミナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時
期に培養を終了すればよく、通常は６〜48時間程度であ
る。培地pHは菌が発育しクレアチニンデイミナーゼを生
産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはpH6.0
〜9.0 程度である。

【００２４】培養物中のクレアチニンデイミナーゼを生
産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用すること
もできるが、一般には常法に従ってクレアチニンデイミ
ナーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離など
により、クレアチニンデイミナーゼ含有溶液と微生物菌
体とを分離した後に利用される。クレアチニンデイミナ
ーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾
過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次い
でこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的
方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及
びまたは界面活性剤を添加してクレアチニンデイミナー
ゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。

【００２５】この様にして得られたクレアチニンデイミ
ナーゼ含有溶液を例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸ア
ンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親
水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセト
ンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。ま
た、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸
着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーにより、精製されたクレア
チニンデイミナーゼを得る事ができる。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、クレアチニンデイミナーゼの活性測定は
以下のように行なった。すなわち、49mMリン酸緩衝液(p
H7.5) 、38mMクレアチニン、0.29mMＮＡＤＰＨ、0.95mM
α−ケトグルタル酸、16U/mlグルタミン酸脱水素酵素中
で酵素を37℃，3〜4 分反応させる。クレアチニンが加
水分解されて生じるアンモニア１分子とα−ケトグルタ
ル酸がグルタミン酸脱水素酵素の働きで結合しグルタミ
ン酸となる際、ＮＡＤＰＨ１分子が消費される。このＮ
ＡＤＰＨの減少を、１分間当りの340nm の吸光度の減少
で測定する。酵素活性の１単位は、この条件下で１分間
当たり１マイクロモルのアンモニアを生成する酵素量と
した。

【００２７】実施例１クレアチニンデイミナーゼのア
ミノ酸配列の決定クレアチニンデイミナーゼ粉末（東洋紡製）を、Superd
ex200 カラムでのゲル濾過クロマトグラフィー及びMono
-Qカラムを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー
により精製した。最終精製標品をSDS-PAGEでチェックし
たところ、ほぼ均一なバンドが得られ、サブユニットの
分子量は約４３０００ダルトンと計算された。この標品
を脱塩を兼ねてVydac C4カラムを用いた逆相ＨＰＬＣで
さらに精製し、マニュアルエドマン分解法によってＮ末
端からのアミノ酸配列を決定した（配列表の配列番号
３）。また、同標品をアスパラギン酸残基に特異的なプ
ロテアーゼであるAsp-N によって分解して得たペプチド
混合物を逆相ＨＰＬＣで分離，精製し、マニュアルエド
マン分解法によりペプチド断片のアミノ酸配列を決定し
た（配列表の配列番号４）。

【００２８】実施例２染色体ＤＮＡの分離バチルス・エスピーＣＮＩ−１３６５の染色体ＤＮＡを
次の方法で分離した。同菌株を100ml のＬＢ培地(1.0%
ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム(p
H7.2) で37℃一晩振盪培養後、遠心(8000rpm,10 分) に
より集菌した。15mMクエン酸ナトリウム、0.15M塩化ナ
トリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、20% シュー
クロース、1mM EDTA、50mMトリス塩酸(pH7.6) を含んだ
溶液 5mlに懸濁させ、 0.5mlのリゾチーム溶液(100mg/m
l)を加えて37℃、30分間保温した。次いで11mlの 1% ラ
ウロイルサルコシン酸、0.1M EDTA(pH9.6)を含む溶液を
加えた。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を 0.5% 塩化
セシウムを約１００％加え、撹拌混合し、55.000rpm,２
０時間の超遠心でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡ
は、10mMトリス塩酸(pH8.0) 、1mM EDTAを含んだ溶液(T
E)で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。エシェリヒア・コ
リーDH5 αのコンピテントセルはHanahan の方法により
作成し、ライブラリー作成の宿主として用いた。

【００２９】実施例３クレアチニンデイミナーゼ遺伝
子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組換
えベクターの調製実施例１で決定したアミノ酸配列をもとに２種類のプロ
ーブ（配列表の配列番号５、６）を作成し、実施例２で
得た染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によるクレア
チニンデイミナーゼ遺伝子断片の増幅を行ない、約1kbp
の増幅断片を得た。次に、得られた断片をプローブとし
て実施例２で得た染色体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼ
ーションを行なった結果、6kbpKpnIの特異的バンドが検
出された。そこで、この部分のＤＮＡを抽出し、制限酵
素KpnI（東洋紡製）で切断したpBluescript と T4-ＤＮ
Ａリガーゼ（東洋紡製）で反応させ、ＤＮＡを連結し
た。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーDH5 αのコ
ンピテントセルを用いて形質転換した。得られたコロニ
ーをＰＣＲ法で増幅した断片をプローブとしたコロニー
ハイブリダイゼーションでスクリーニングして、クレア
チニンデイミナーゼ遺伝子を含有する6kbp KpnI ＤＮＡ
断片を持つ組換えベクターを得、ｐＣＤ１と命名した。

【００３０】次いでｐＣＤ１の挿入ＤＮＡ断片を、種々
の制限酵素による消化処理後、pBluescript にサブクロ
ーニングし、種々の挿入ＤＮＡ断片を有する派生プラス
ミドを得、エシェリヒア・コリーDH5 αを形質転換し
た。ｐＣＤ１及びその派生プラスミドの挿入ＤＮＡ制限
酵素地図を図１に示した。

【００３１】実施例４塩基配列の決定ｐＣＤ１の派生プラスミドであるｐＣＤ２の挿入ＤＮＡ
断片について、種々の制限酵素で切断してサブクローン
を調製した。種々のサブクローンは常法に従い、SEQUEN
ASE VERSION2.0 7-deaza-dGTP kit （東洋紡製）を用い
て塩基配列の決定を行った。決定した塩基配列及びアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号１および配列番号２に示し
た。

【００３２】実施例５形質転換体の培養とクレアチニ
ンデイミナーゼの生成（１）クレアチニンデイミナーゼ生産培地（0.5%酵母エキス、
1.0%ポリペプトン、0.5%ＮａＣｌ（pH7.5)) 50mlを500m
l フラスコに分注し、 121℃、15分間オートクレーブを
行ない放冷後、別途無菌濾過した抗生物質（50mg/ml ア
ンピシリン（ナカライテスク製))を添加した。この培地
に上記と同一組成の培地で予め30℃で18時間振盪培養し
たｐＣＤ２組換え体の培養液 5mlを接種し、30℃で通気
撹拌培養した。培養開始より20時間後で、ｐＣＤ２組換
え体は、誘導物質であるクレアチニンを培地に添加する
ことなしに、約0.15U/mlのクレアチニンデイミナーゼ活
性を示した。同条件下で、バチルス・エスピーＣＮＩ−
１３６５のクレアチニンデイミナーゼ活性は検出限界以
下であった。すなわち、本発明のクレアチニンデイミナ
ーゼ遺伝子がエシェリヒア・コリー内において、誘導物
質なしに効率的に発現することが明らかとなった。

【００３３】実施例６形質転換体の培養とクレアチニ
ンデイミナーゼの生成（２）ｐＣＤ２組換え体を実施例５と同様の条件にて、培養温
度のみ３７℃に変更して培養を行った。培養開始より２
０時間後で、ｐＣＤ２組換え体は誘導物質であるクレア
チニンを培地に添加することなしに、約1.7U/ml のクレ
アチニンデイミナーゼ活性を示した。すなわち培養温度
の至適化により、生産性の大幅な向上が見込めることが
明らかとなった。

【００３４】

【発明の効果】本発明によってクレアチニンデイミナー
ゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が明らかになり、
遺伝子工学的手法によりクレアチニンデイミナーゼを容
易に高純度で大量生産することが出来る。また、クレア
チニンデイミナーゼ生産の際に必要であった誘導物質で
あるクレアチニンが、本発明の製造法を用いることによ
り不要となった。さらに、本発明のクレアチニンデイミ
ナーゼ遺伝子と種々の蛋白質工学的手法とを用いること
により、より高活性な、或いはより安定性の高い新規ク
レアチニンデイミナーゼを作ることも可能になる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１５９１配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：ＣＮＩ−１３６５配列 CTGCAGCTGT CCTCGGACCA GTTACCTCGA CCACCTCAAC CCCCGATGAA AACTATCGAG 60 GTTCTCGGAC AAGGCTAAGC GGAGGTCCCC GATGCAGAGG CAATGCTGAG AAACTATCTA 120 CGACAGCTCA CCATTTTTAT TTAACTCCAC ACTAATACCT GTCAAGCAAT AGAATAGATA 180 GCATCTGGAT CCTCCAGAGT TTGAAAATAT GCCTTGACAT GTAGAAATGG AGTTCTT 237 GTG CGC ATT ACA AAC GCC CAG GTT AAG AAC TAC GCA GAG TTA GTT GAT 285 Met Arg Ile Thr Asn Ala Gln Val Lys Asn Tyr Ala Glu Leu Val Asp 1 5 10 15 ATC ACC ATA GAG GGT GAA AGA ATC TCA ACT ATT ACC CCC TCC GCG CTT 333 Ile Thr Ile Glu Gly Glu Arg Ile Ser Thr Ile Thr Pro Ser Ala Leu 20 25 30 CGA CCA GAA GAA GAT CGC CGC GCG GAC GAT TAC GAT GCC GCA GGA AGA 381 Arg Pro Glu Glu Asp Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asp Ala Ala Gly Arg 35 40 45 CTG GTC TCA CCC CAG TTC GCC GAA GCA CAC ATC CAC CTT GAC TAC GCA 429 Leu Val Ser Pro Gln Phe Ala Glu Ala His Ile His Leu Asp Tyr Ala 50 55 60 AAC ACC GCG GGA GTA CCT CGC GAA AAT TCT TCT GGC ACA CTT TTT GAA 477 Asn Thr Ala Gly Val Pro Arg Glu Asn Ser Ser Gly Thr Leu Phe Glu 65 70 75 80 GCC ATC GAA ATC TGG GCC GAC CGC AAA ACC CAA GGC TTC CAC ATC AAA 525 Ala Ile Glu Ile Trp Ala Asp Arg Lys Thr Gln Gly Phe His Ile Lys 85 90 95 GAG GAT ATT AAA GCG AAA GCT CTC CAG GCA GCC CGT CGG GCA GCA GAA 573 Glu Asp Ile Lys Ala Lys Ala Leu Gln Ala Ala Arg Arg Ala Ala Glu 100 105 110 CAC GGC GTT GGC TTC ATC CGC ACC CAT GTA GAC GTT ACA GAT CCC ACC 621 His Gly Val Gly Phe Ile Arg Thr His Val Asp Val Thr Asp Pro Thr 115 120 125 TTC GCC GGG TTT GAA GCA ATT GCG GAG CTG CGC GAT GAA GTC CGC GAG 669 Phe Ala Gly Phe Glu Ala Ile Ala Glu Leu Arg Asp Glu Val Arg Glu 130 135 140 TGG TGC GAT ATC CAG ATT GTC GCC TTC CCG CAA AAT GGC ATT TAC GCC 717 Trp Cys Asp Ile Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Asn Gly Ile Tyr Ala 145 150 155 160 TAC GAA GGT GGC CAG AAG CTA ATC TCA GAT GCA ATG TCT GCA GGT GCA 765 Tyr Glu Gly Gly Gln Lys Leu Ile Ser Asp Ala Met Ser Ala Gly Ala 165 170 175 GAT GTC GTT GGT GGC ATC CCA CAC CTT GAA CCC ACC CGA GAT GAT GGT 813 Asp Val Val Gly Gly Ile Pro His Leu Glu Pro Thr Arg Asp Asp Gly 180 185 190 GTC GAG TCG GTG AAA TGG CTT TTC GAC CTT GCA GAG AAG CAC TCA GCC 861 Val Glu Ser Val Lys Trp Leu Phe Asp Leu Ala Glu Lys His Ser Ala 195 200 205 CCC ATC GAT ATC CAC ACC GAT GAA ATT GAC GAT CCA CAT TCC CGA TTT 909 Pro Ile Asp Ile His Thr Asp Glu Ile Asp Asp Pro His Ser Arg Phe 210 215 220 GTC GAA GTC CTC GCC GCA GAA GCC GCA AAA CGT GAC ATG GGC GCA CAA 957 Val Glu Val Leu Ala Ala Glu Ala Ala Lys Arg Asp Met Gly Ala Gln 225 230 235 240 ACC GTG GTG TCC CAT TCT GTT GCG ATG GCA TAT TAT TCA CCT GGC TAC 1005 Thr Val Val Ser His Ser Val Ala Met Ala Tyr Tyr Ser Pro Gly Tyr 245 250 255 ATG GCG CGA CTT TTA CCC AAG CTC GCA GCA TCA AAG GTT CGT TTT GCA 1053 Met Ala Arg Leu Leu Pro Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Arg Phe Ala 260 265 270 GTA TGC CCC AAT GAA AAC CTC CAT CTG CAA GGA CTT GGT TTC CAA GGA 1101 Val Cys Pro Asn Glu Asn Leu His Leu Gln Gly Leu Gly Phe Gln Gly 275 280 285 CCC GTC CCC CGA GGT GTT GCA CCG GTA AAG CAA CTT ACC GAA TGG GGA 1149 Pro Val Pro Arg Gly Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Thr Glu Trp Gly 290 295 300 ATT CCA GTA AGT TTT TGC CAG GAC TCA CTC AAT GAC CCC TTC TAC CCC 1197 Ile Pro Val Ser Phe Cys Gln Asp Ser Leu Asn Asp Pro Phe Tyr Pro 305 310 315 320 ATG GGC GAT GGA GAT CTA CTC CGC ATT CTC GAT TCT GGA TTA CAC GTG 1245 Met Gly Asp Gly Asp Leu Leu Arg Ile Leu Asp Ser Gly Leu His Val 325 330 335 TCC CAC ATG CTC ACA GCC AGC CAC TTG AAG AAT GCA CTA TCG TTC ATC 1293 Ser His Met Leu Thr Ala Ser His Leu Lys Asn Ala Leu Ser Phe Ile 340 345 350 ACC ACC AAT CCA GCC GGA AAC CTA GGC CTG GAC AAT TAC GAC ATT GCA 1341 Thr Thr Asn Pro Ala Gly Asn Leu Gly Leu Asp Asn Tyr Asp Ile Ala 355 360 365 GAA AAC TCC CCG GCG AAC CTG CTG GTT CTT GAT GCG AGC AGC GAG AAG 1389 Glu Asn Ser Pro Ala Asn Leu Leu Val Leu Asp Ala Ser Ser Glu Lys 370 375 380 GAA GCT GTA CAA AGA AAA GCT TCC GTA CTT TGAGCATCCA CCGCGGCAAA 1439 Glu Ala Val Gln Arg Lys Ala Ser Val Leu 385 390 AAGGTGCTCT CCAGGGAGCC CGAACAGGTG GACTGGAACA TCTAACAGCC CAGTTGGGCC 1499 TCCTTAAATT TTGTGGCACT CCCCACATTT CTATCAATCT ATAGAAAGTA TGACTTAAGT 1559 CGATTTTGCA AGTTTCTATA GATTGATAGA AA 1591

【００３６】配列番号：２配列の長さ：３９４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：ＣＮＩ−１３６５配列 Val Arg Ile Thr Asn Ala Gln Val Lys Asn Tyr Ala Glu Leu Val Asp 1 5 10 15 Ile Thr Ile Glu Gly Glu Arg Ile Ser Thr Ile Thr Pro Ser Ala Leu 20 25 30 Arg Pro Glu Glu Asp Arg Arg Ala Asp Asp Tyr Asp Ala Ala Gly Arg 35 40 45 Leu Val Ser Pro Gln Phe Ala Glu Ala His Ile His Leu Asp Tyr Ala 50 55 60 Asn Thr Ala Gly Val Pro Arg Glu Asn Ser Ser Gly Thr Leu Phe Glu 65 70 75 80 Ala Ile Glu Ile Trp Ala Asp Arg Lys Thr Gln Gly Phe His Ile Lys 85 90 95 Glu Asp Ile Lys Ala Lys Ala Leu Gln Ala Ala Arg Arg Ala Ala Glu 100 105 110 His Gly Val Gly Phe Ile Arg Thr His Val Asp Val Thr Asp Pro Thr 115 120 125 Phe Ala Gly Phe Glu Ala Ile Ala Glu Leu Arg Asp Glu Val Arg Glu 130 135 140 Trp Cys Asp Ile Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Asn Gly Ile Tyr Ala 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Gly Gln Lys Leu Ile Ser Asp Ala Met Ser Ala Gly Ala 165 170 175 Asp Val Val Gly Gly Ile Pro His Leu Glu Pro Thr Arg Asp Asp Gly 180 185 190 Val Glu Ser Val Lys Trp Leu Phe Asp Leu Ala Glu Lys His Ser Ala 195 200 205 Pro Ile Asp Ile His Thr Asp Glu Ile Asp Asp Pro His Ser Arg Phe 210 215 220 Val Glu Val Leu Ala Ala Glu Ala Ala Lys Arg Asp Met Gly Ala Gln 225 230 235 240 Thr Val Val Ser His Ser Val Ala Met Ala Tyr Tyr Ser Pro Gly Tyr 245 250 255 Met Ala Arg Leu Leu Pro Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Arg Phe Ala 260 265 270 Val Cys Pro Asn Glu Asn Leu His Leu Gln Gly Leu Gly Phe Gln Gly 275 280 285 Pro Val Pro Arg Gly Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Thr Glu Trp Gly 290 295 300 Ile Pro Val Ser Phe Cys Gln Asp Ser Leu Asn Asp Pro Phe Tyr Pro 305 310 315 320 Met Gly Asp Gly Asp Leu Leu Arg Ile Leu Asp Ser Gly Leu His Val 325 330 335 Ser His Met Leu Thr Ala Ser His Leu Lys Asn Ala Leu Ser Phe Ile 340 345 350 Thr Thr Asn Pro Ala Gly Asn Leu Gly Leu Asp Asn Tyr Asp Ile Ala 355 360 365 Glu Asn Ser Pro Ala Asn Leu Leu Val Leu Asp Ala Ser Ser Glu Lys 370 375 380 Glu Ala Val Gln Arg Lys Ala Ser Val Leu 385 390

【００３７】配列番号：３配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：ＣＮＩ−１３６５

【００３８】配列番号：４配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：バチルス・エスピー(Bacillus sp.) 株名：ＣＮＩ−１３６５配列配列の特徴他の情報 Xaa はLeu 又はMet である。

【００３９】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖ホモロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ATGCGIATIA CIAATGCICA 20

【００４０】配列番号：６配列の長さ：１７配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTRGGIAAGA TGGGIGA 17

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＣＤ１及びその派生プラスミドの挿入ＤＮＡ
の制限酵素地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 1/21 C12N 9/78 C12N 1/21 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に記載された塩基配
列、または、配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有し、クレアチニンデイミ
ナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡ断
片を有する組換えベクターで、エシェリヒア属に属する
微生物を形質転換した、培養時にクレアチニン添加を必
要としない、クレアチニンデイミナーゼを生産する形質
転換体。
【請求項２】請求項１に記載された形質転換体を培地
で培養し、クレアチニンデイミナーゼを生成させ、該ク
レアチニンデイミナーゼを採取することを特徴とするク
レアチニンデイミナーゼの製造法。
【請求項３】約３７℃付近の温度にて培養することを
特徴とする請求項２に記載されるクレアチニンデイミナ
ーゼの製造法。