JPH05339166A

JPH05339166A - アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造法

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Publication number: JPH05339166A
Application number: JP4168467A
Authority: JP
Inventors: Shigemitsu Kudo; 重光工藤; Kazuyoshi Okubo; 一良大久保
Original assignee: ABO SADAKICHI
Current assignee: ABO SADAKICHI
Priority date: 1992-06-03
Filing date: 1992-06-03
Publication date: 1993-12-21
Anticipated expiration: 2012-07-09
Also published as: JP2627849B2

Abstract

(57)【要約】【目的】アンジオテンシン変換酵素を有効に阻害する
ことにより、血圧上昇を抑制する安全な物質を、食品素
材の中からみいだし、その阻害物質の構造を明らかにす
るとともに、簡単な濃縮法を開発し、アンジオテンシン
変換酵素阻害物質を含む食品素材を提供する。【構成】大豆蛋質溶液を蛋白質加水分解酵素で分解
後、直ちに逆相分配系樹脂に吸着し、含水アルコールで
溶出してアンジオテンシン変換酵素阻害物質を製造す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシンI か
らアンジオテンシンIIへの変換を触媒するアンジオテン
シン変換酵素の阻害物質およびその製造法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】最近、アンジオテンシン変換酵素の阻害
剤が、本態性高血圧に効果的であることが多くの研究お
よび臨床の場で明らかにされている。即ち、アンジオテ
ンシン変換酵素は、昇圧に働く内分泌・体内性因子とし
て代表的なレニン・アンジオテンシン系で重要な役割を
担っているとともに降圧に働く内分泌系・体内性因子と
して代表的なカリクレイン・キニン系に大きく関与して
いる。さらに、レニン・アンジオテン神系では、腎臓の
酵素レニンが血中に分泌され、血中の糖蛋白質アンジオ
テンシンノーゲンに作用し、アンジオテンシンI を生成
する。この物質には昇圧作用はないがこれにアンジオテ
ンシン変換酵素が作用するとこの系の生物活性の中心で
あるアンジオテンシンIIは抹消血管を収縮させ抹消血管
抵抗を増大させるとともに副腎皮質に作用してアルドス
テロンの産生遊出を促進する。アルドステロンは腎臓に
作用し、ナトリウムの再吸収を促進し、体内に水ととも
に貯留するため体液量が増え、心拍量が増大する。これ
らの作用は血圧を大きく上昇させる。このように、アン
ジオテンシン変換酵素の生理的作用機序が明らかとな
り、アンジオテンシン変換酵素阻害物質による高血圧に
対する有効性が確かめられている。

【０００３】このような理論的裏付けから、天然物から
のアンジオテンシン変換酵素阻害物質の検索が行なわ
れ、多数見出されている。さらに、より効果的阻害剤の
合成が行なわれている。一方、日常摂取されている食品
からもアンジオテンシン変換酵素阻害物質が見いだされ
ており、合成阻害剤と比べ、これらは、長年にわたる食
経験からその安全性が充分確かめられていることから、
平常の食生活により血圧を正常に保つ効果が期待されて
いる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、天然物
および食品由来アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質
は、人体に対する安全性から需要性が高く、より一層の
開発が望まれていた。

【０００５】本発明は、この課題を解決するためになさ
れたものであって、アンジオテンシン変換酵素を有効に
阻害することにより、血圧上昇を抑制する安全な物質
を、食品素材の中からみいだし、その阻害物質の構造を
明らかにするとともに、簡単な濃縮法を開発し、アンジ
オテンシン変換酵素阻害物質を含む食品素材を提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上述の目的の
ために種々の研究を重ねて得られた知見に基づいて完成
したものである。

【０００７】即ち、広範囲の食品に使用されている大豆
を原料として、その水抽出液を調製し、蛋白質分解酵素
により分解し、それの不溶物を遠心および濾過により取
り除き、そのろ液を直ちに逆相系充填剤を詰めたカラム
に流し、アンジオテンシン変換酵素阻害物質を吸着後、
含水アルコールで溶出することにより、簡単に阻害物質
を濃縮することができ、また、この阻害物質混合物から
構造式Pro-Ala-Gly-Tyr、Pro-Arg-Val-Phe、Leu-Glu-Phe、
Asp-Thr-Lys-Phe、Tyr-Pro-Ser およびPhe-Tyrの６種の
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを単離すること
ができたことによるものである。

【０００８】そして、このことから、本発明において
は、上述の目的を達成するための手段として、構造式Pr
o-Ala-Gly-Tyr、Pro-Arg-Val-Phe、Leu-Glu-Phe、Asp-Thr-
Lys-Phe、Tyr-Pro-Ser およびPhe-Tyr に示されるペプチ
ドおよびその塩を少なくとも一種を含有することを特徴
とするアンジオテンシン変換酵素阻害物質を提起し、ま
た、大豆蛋質溶液を蛋白質加水分解酵素で分解後、直ち
に逆相分配系樹脂に吸着し、含水アルコールで溶出する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害物質の
製造法を提起するものである。

【０００９】

【実施例】次に本発明の実施例を具体的に説明する。（実施例１）豆乳２リットルに１ｇの蛋白質分解酵素を
添加し、緩やかに撹拌しながら４５℃で２時間加水分解
を行なった。次に、反応容器をそのまま沸騰水中につけ
加熱を続けることにより、熱凝固性蛋白質を凝集し、遠
心分離により、上清を得た。さらにセライト濾過により
透明液を得ることができた。この液を凍結乾燥すること
により、凍結乾燥物80.84gを得ることができた。また、
アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、IC₅₀ 125μg/ml
であった。なお、ここで濾過液を凍結乾燥したのは、IC
₅₀を測定するためであり、凍結乾燥を行なわずに次の工
程にいくことができる。

【００１０】凍結乾燥物80g を400ml の水に溶解後、逆
相分配系樹脂を充填し、予め水で平衡化したカラム(5×
28cm) に供給し、１リットルの水で溶出した後、順次１
０％づつメタノール濃度を上げ、５０％メタノールまで
ステップワイズで溶出を行なった。ここで用いた逆相分
配系樹脂は、オクタデシルシラン（株式会社ワイエムシ
ー）を用いたが、いずれの逆相分配樹脂でも使用でき
る。また、溶出メタノールを用いたがこれにかぎるもの
ではない。最後に、１００％メタノールで溶出後、各溶
出画分を濃縮・凍結乾燥し、収量とアンジオテンシン変
換酵素阻害活性を測定した。その結果（表１）１００％
水溶出画分、即ち、非吸着成分に阻害活性は、検出され
なかった。また、１０〜１００％メタノール溶出画分全
てに同程度の活性が検出されることから、アンジオテン
シン変換酵素阻害ペプチドは、逆相分配系充填カラムに
吸着する性質を有し、しかも、多数存在するものと推定
された。また、この結果から明らかなように一回の操作
によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性の高い物質を
高収量で得ることができる。

【００１１】逆相分配系充填カラムに吸着したアンジオ
テンシン変換酵素阻害物質の有効性を確かめるために、
高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）を用い調べた。即ち、
窒素源としてカゼイン、分離大豆蛋白および豆乳を上記
のように処理し、逆相分配系樹脂を充填したカラムにか
け非吸着成分の溶出後、１００％メタノールで溶出し、
この１００％メタノール溶出画分を凍結乾燥し粉末状に
したものを用い、合成実験飼料を作成し、ＳＨＲに投与
した。なお、その時の飼料組成は、表２の通りであっ
た。この飼料を飲水とともに自由に摂取させた。血圧
は、無麻酔下、非絶食下で尾静脈圧を測定した。その結
果、図１に示すように１００％メタノール溶出画分に血
圧上昇抑制効果が認められた。

【００１２】（実施例２）実施例１に示したように、ア
ンジオテンシン変換酵素阻害物質混合物が実際にＳＨＲ
の血圧上昇抑制作用を示すことから、その活性本体の単
離精製を行なった。即ち、実施例１における２０％メタ
ノール溶出画分2.77g を１５％メタノールに溶解し、予
め同じ溶媒で平衡化したオクタデシルシリルカラム(2.5
×22cm) に供給し、同じ溶媒で溶出した。各画分の220n
m における吸光度を測定した結果（図２）、No.93 にピ
ークを示した。また、各フラクション 100μｌを使用
し、阻害活性を測定した結果、No.93 ピーク成分の比活
性が低いと考えられることから、No.35 から80およびN
o.110から 160を濃縮・凍結乾燥し、それぞれ20I およ
び20II画分とした。また、各画分のIC₅₀は、20I が50μ
g/ml、20IIが40μg/mlであった。

【００１３】続いて、20II画分をバイオゲルＰ−２（バ
イオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）によるゲル濾
過を行なった。即ち、20II画分0.33g を蒸留水に溶解
し、蒸留水で平衡化してあるバイオゲルＰ−２カラム
（２×９１ｃｍ）でゲル濾過を行なった。活性ピークN
o.45-53.54-63および64-85 （図３）をそれぞれ濃縮・
凍結乾燥し20II-1、20II-2、20II-3とした。各画分のIC
₅₀は、それぞれ93,5および 3μg/mlであった。

【００１４】ＹＭＣ−ＯＤＳＡＭ３２３カラム（株式
会社ワイエムシー）を用い、20II-2および20II-3画分か
ら活性成分の単離を高速液体クロマトグラフィーで行な
った。その結果（図４および図５）、20II-2画分から20
II-21 、22、23および24の４成分を分離することがで
き、また、20II-3画分から20II-31 および20II-32 の２
成分を分離することができた。また、単離した各成分の
IC₅₀および構造解析の結果を表３に示した。

【００１５】なお、この実施例におけるアンジオテンシ
ン変換酵素阻害率の測定は、公知のアンジオテンシン変
換酵素阻害活性測定法（Cushman-Cheung法）によって測
定した。即ち、１単位のアンジオテンシン変換酵素（シ
グマ社、ラビット肺由来）を２０ｍｌの０．１Ｍホウ酸
緩衝液（pH8.3 、0.3M NaCl を含む）に溶解し、アンジ
オテンシン変換酵素溶液を調製した。この酵素液0.15ml
に阻害剤溶液0.1ml を加え、さらに、100mg のヒプリル
ーヒスチジルーロイシン（Hippuryl-His-Leu、シグマ
社）を50mlのホウ酸緩衝液（pH8.3 、0.3M NaCl を含
む）に溶解して調製した基質溶液0.25mlを加え混合し
た。次に、この混合溶液を、37℃で30分間反応した後、
１規定の塩酸を0.25ml添加し反応を停止した。その後1.
5ml の酢酸エチルを加えて充分撹拌し、3,000rpmで２分
間遠心分離後、酢酸エチル層を１ml採取した。この酢酸
エチルを蒸発乾固後、１mlの蒸留水に溶解し、抽出した
ヒプリル酸の吸収（228nm ）を測定し、アンジオテンシ
ン変換酵素阻害率を下記の式により求めた。｛１−（ＯＤ_a −ＯＤ_ab）／（ＯＤ_c −ＯＤ_cb）｝×１００（但し、ＯＤ_a は上記のようにしてサンプルを加えて測
定した時の吸光度、ＯＤ _abは混合液を反応する前に１規
定の塩酸を0.25ml添加し測定した時の吸光度、ＯＤ_c は
混合液にサンプルを加えずに測定した時の吸光度、ＯＤ
_cbは混合液にサンプルを加えずに１規定の塩酸を0.5ml
添加して測定した時の吸光度）またアンジオテンシン変
換酵素阻害率が50％になるのに必要な阻害物質の濃度を
ＩＣ₅₀と定義し阻害活性の強さの指標とした。

【００１６】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
高血圧の予防に効果的であることが臨床の場で明らかに
されているアンジオテンシン変換酵素阻害物質を、副作
用などの面で心配のある合成阻害剤としてではなく、長
い食体験からその安全性が立証されている食品である大
豆を用い、その蛋白質分解酵素により生成するアンジオ
テンシン変換酵素阻害ペプチドを逆相分配系カラムに吸
着後、含水アルコールで溶出することにより、濃縮した
形態として得られるようにしているのだから、平常の食
生活により血圧を正常に保つ効果のある安全な食品素材
を、簡単な操作で濃縮して得られるようになる。また、
単離したアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、阻
害率が高く食品素材としてばかりではなく医薬品として
活用できるようになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】カゼイン、分離大豆蛋白および逆相分配系樹脂
に吸着した成分の自然発症高血圧にラットに対する血圧
抑制を示す図である。

【図２】オクタデシルシリルカラム（株式会社ワイエム
シー）による逆相分配クロマトグラフイーで分画した各
フラクションの220nm における吸光度およびアンジオテ
ンシン変換酵素阻害率を示した図である。

【図３】ゲル濾過（バイオゲルP-2)によって分画された
各フラクションの220nm における吸光度およびアンジオ
テンシン変換酵素阻害率を示した図である。

【図４】高速液体クロマトグラフイーを用いて分画を行
なった時の吸光度を表す図である。

【図５】高速液体クロマトグラフイーを用いて分画を行
なった時の吸光度を表す図である。

【表１】

【表２】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/06 ＺＮＡ 8214−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】構造式Pro-Ala-Gly-Tyr、Pro-Arg-Val-Ph
e、Leu-Glu-Phe、Asp-Thr-Lys-Phe、Tyr-Pro-Ser およびPh
e-Tyr に示されるペプチドおよびその塩を少なくとも一
種を含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵
素阻害物質。
【請求項２】大豆蛋質溶液を蛋白質加水分解酵素で分
解後、直ちに逆相分配系樹脂に吸着し、含水アルコール
で溶出することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素
阻害物質の製造法。