JP2871031B2

JP2871031B2 - 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤

Info

Publication number: JP2871031B2
Application number: JP2205000A
Authority: JP
Inventors: 正明吉川; 隆造佐々木; 英雄千葉; 真一福留; 育夫北村
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1990-08-03
Filing date: 1990-08-03
Publication date: 1999-03-17
Anticipated expiration: 2014-03-17
Also published as: JPH0491097A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規なペプチドおよび該ペプチドまたはその
塩を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に
関する。

［従来の技術］血圧上昇をもたらす代表的な生体内因子としてレニン
・アンジオテンシン系が、また血圧降下に働く代表的な
生体内因子としてカリクレイン・キニン系が知られてい
るが、アンジオテンシン変換酵素（以後「ACE」とい
う）はこのいずれの系にも大きく関与している。

その機構を簡単に説明する。まず、レニン・アンジオ
テンシン系では、血中に分泌された腎臓の酵素レニンが
血中のアンジオテンシノーゲンに作用してデカペプチド
であるアンジオテンシンＩを生成する。このアンジオテ
ンシンＩは血圧上昇作用を示さないが、これにACEが作
用するとオクタペプチドであるアンジオテンシンIIを生
成する。このアンジオテンシンIIは末梢血管を収縮させ
るとともに、副腎皮質に作用してアルドステロンの産出
を促し、アルドステロンは腎臓に作用してナトリウムの
再吸収・体液量増加を招いて心拍出量の増大をもたら
し、そのいずれもが血圧を大きく上昇させる。

一方、カリクレイン・キニン系では血中の前駆体タン
パク質であるキニノーゲンに血中酵素のカリクレインが
作用してキニンを遊離産出するが、このキニンは末梢血
管を拡張させるとともにホスホリパーゼA₂を活性化して
プロスタグランジンの合成を促進して血圧を降下させ
る。ところがこのカリクレイン・キニン系にACEが働く
と、ACEは末梢血管の拡張作用およびホスホリパーゼA₂
の活性化作用を有する上記キニンも分解・不活性化して
しまうために、血圧の降下が生じなくなる。

したがって、ACEの上記のような働きを阻害する物質
（ACE阻害剤）が存在すると、血圧上昇物質であるアン
ジオテンシンIIの生成が抑制され、且つ血圧降下物質と
して働くキニンの分解が防止されて、血圧の上昇抑制お
よび血圧降下が可能になる。

かかる点から近年ACE阻害剤の研究開発が色々行われ
ており、天然タンパク質由来の、または合成による特定
のペプチド類がACE阻害作用を有することが報告されて
いる。これまでに報告された天然タンパク質由来のACE
阻害ペプチドとしては、マムシ由来のブラジキニン・ポ
テンシエーターＢ（Pyr−Gly−Leu−Pro−Pro−Arg−Pr
o−Lys−Ile−Pro−Pro）およびブラジキニン・ポテン
シエーターＣ（Pyr−Gly−Leu−Pro−Pro−Gly−Pro−P
ro−Ile−Pro−Pro）［いずれもH.Kato and T.Suzuki,B
iochemistry,10,p.972（1971）に記載されている］、牛
乳カゼイン由来のペプチドであるPhe−Phe−Val−Ala−
Pro−Phe−Pro−Glu−Val−Phe−Gly−Lys（特公昭60−
23085号公報）、Phe−Phe−Val−Ala−Pro（特開昭59−
44323号公報）、Thr−Thr−Met−Pro−Leu−Trp（特開
平２−20263号公報）、Ala−Val−Pro−Tyr−Pro−Gln
−Arg、魚類タンパク質由来のペプチドであるTyr−Lys
−Ser−Phe−Ile−Lys−Gly−Tyr−Pro−Val−Met、ト
ウモロコシγ−ゼイン由来のペプチドであるLeu−Pro−
Pro、Val−His−Leu−Pro−Pro、Val−His−Leu−Pro−
Pro−Pro等を挙げることができるが、その大半はアミノ
酸が５個以上結合したペプチドである。

［発明の内容］上記のような状況下に本発明者らもACE阻害作用を有
する物質について研究を進めてきた。

その結果、上記既知のACE阻害ペプチドとは異なった
アミノ酸配列を有する、ロイシン−グルタミン−プロリ
ン−アルギニンが配列した新規なテトラペプチドLeu−G
ln−Pro−Argを小麦グルテンの加水分解物から単離する
ことができ、そしてこのテトラペプチドがACE阻害作用
を有することを見出した。

したがって、本発明は、下記の式 Leu−Gln−Pro−Arg で表されるペプチドおよびその塩である。

更に、本発明は上記式で表されるペプチドまたはその
塩を有効成分とするACE阻害剤を包含する。

本発明の上記ACE阻害活性を有するペプチドは、最初
はグルテンのプロテアーゼによる加水分解処理生成物と
して発見されたものであり、その場合には上記４種のア
ミノ酸Leu、Gln、ProおよびArgはいずれもＬ−アミノ酸
である。しかしながら、それに限定されず上記のアミノ
酸配列を有するテトラペプチドであればいずれの光学異
性体であってもよく、該４種のアミノ酸の全部がＤ−ア
ミノ酸からなるテトラペプチドおよび４種のアミノ酸の
うちのいずれか１個、２個または３個がＬ−アミノ酸で
あって残りがＤ−アミノ酸からなるテトラペプチドも包
含され、それらは化学合成により製造することができ
る。

本発明のテトラペプチドの調製法の例を挙げると以下
のとおりである。

小麦グルテンの加水分解による方法小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して
水溶性のグルテン由来ペプチド混合物を調製する。この
場合に、該ペプチド混合物は、まず小麦グルテンを希塩
酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状態で、酸性で作用
するプロテアーゼで加水分解し、中和後、中性で作用す
るプロテアーゼで更に加水分解する方法により調製する
のがよい。

酸性で作用するプロテアーゼとしては、特に酵素の活
性中心にアスパラギン酸残基とアスパラギン酸のカルボ
ン酸イオンが関与するアスパルティックプロティナーゼ
を使用するのがよい。そのようなプロテアーゼの例とし
ては、ペプシン、ヒイロタケ起源のアスパルティックプ
ロティナーゼ、アスペルギルス起源のアスパルティック
プロティナーゼ、ペニシリウム起源のアスパルティック
プロティナーゼを挙げることができる。中性で作用する
プロテアーゼとしてはトリプシン、キモトリプシン、プ
ラスミン、トロンビン等のセリンプロテアーゼを挙げる
ことができる。特に酸性で作用するプロテアーゼとして
ペプシンを使用し、且つ中性で作用するプロテアーゼと
してトリプシンおよび／またはキモトリプシンを使用す
ると目的物を高収率で得ることができ好ましい。酸性で
作用するプロテアーゼおよび中性で作用するプロテアー
ゼは、それぞれ１種類のみを使用しても、またはプロテ
アーゼ同士がお互いに悪影響を及ぼさないかぎりは複数
種を併用してもよい。複数のプロテアーゼを使用する場
合は、複数のプロテアーゼを同時に存在させて加水分解
を行っても、または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を
行ってもよい。また、プロテアーゼはフリーの状態で使
用しても、固定化して使用してもよい。プロテアーゼの
使用量はいずれの場合も乾燥したグルテン100g当たりプ
ロテアーゼ約5,000〜100,000unitsを用いるのがよい。

ここで本明細書中のプロテアーゼ活性（unit）はすべ
て下記の方法により測定したものである。

プロテアーゼ活性の測定法基質として米国メルク社製のハマーステインカゼイン
１％溶液を用い、アンソン−萩原変法［赤堀四郎編“酵
素研究法”第２巻第237頁（昭和36年１月10日、朝倉書
店発行）］により測定した。反応は30℃で30分間行い、
１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する
酵素量を1unitとした。

プロテアーゼ処理は、各々の状況（例えばプロテアー
ゼの種類、プロテアーゼの使用形態等）に応じて最適の
pH、温度、プロテアーゼ量、処理速度、処理時間等の条
件を選択して行うのがよく、例えば上で挙げたプロテア
ーゼを使用する場合、まず酸性で作用するプロテアーゼ
をpH約1.5〜5.0、温度約30〜50℃で作用させ、その後pH
を約6.0〜8.0とした後、中性で作用するプロテアーゼを
温度約30〜50℃で作用させて0.75Mトリクロロ酢酸への
溶解率が約40〜80％になるまで加水分解を行うとよい。

目的とする加水分解状態が達成された時点で加熱およ
び／またはpH調整してプロテアーゼを失活させ、失活し
た酵素、未分解グルテン等の不溶性固形物を遠心分離等
の適当な手段で分離除去し、残留液中に含まれているペ
プチド混合物を乾燥等により回収する。

次いで、このペプチド混合物を水等に溶解させた状態
で高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィー等）等により処理して
上記テトラペプチドを純粋な形態で単離する。

上記したペプチド混合物を含有する水溶液の分離精製
およびテトラペプチドの単離は、例えば次の（ａ）〜
（ｄ）の工程からなる方法で行うことができる。

（ａ）ペプチド混合物をODSカラムによる逆相高速液体
クロマトグラフィーに通過させ、吸着成分を0.1％トリ
フルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と0.1％トリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）にてＢ液の濃度
が０％から50％まで直線的に増加する直線濃度勾配溶離
液を用いて溶離すると、アセトニトリルの濃度が約15〜
16％の範囲の溶離液区分に高吸収ピークが現れ、この画
分のACE阻害活性を測定確認して回収する、（ｂ）必要に応じて上記（ａ）の工程を繰返す。

（ｃ）（ｂ）工程で得られた画分から溶媒を乾燥等によ
り除去して白色の固体を回収し、そして（ｄ）上記白色固体として得られた生成物のアミノ酸配
列を例えばアプライドバイオシステムズ社製のプロテイ
ンシーケンサー（477−Ａ型）等を使用して調べ、Leu−
Gln−Pro−Argからなるテトラペプチドであることを確
認する。

また、本発明のテトラペプチドを化学合成により製造
する場合は、例えば次の方法を採用することができる。

本発明のテトラペプチドの化学合成法米国バイロサーチ社のSAM TWO型自動ペプチド合成装
置を使用して同装置の標準プロトコルにしたがって合成
を行う。すなわち、Boc（ブトキシカルボニル）−Arg
（Tos）−樹脂を45％トリフルオロ酢酸を含むデブロッ
ク液で処理した後、Boc−Proをジイソプロピルカルボジ
イミドの存在下でカップルさせる。以下、上記と同様に
デブロッキングした後、Boc−GlnおよびBoc−Leuを順次
カップルさせてBoc−Leu−Gln−Pro−Arg（Tos）−樹脂
を得る。このペプチド樹脂を10％アニソールを含むフッ
化水素中に入れて０℃で１時間撹拌する。フッ化水素を
留去した後、エーテルで残渣を洗浄し10％酢酸でペプチ
ドを抽出する。得られた粗ペプチドをODSカラムによる
逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して精製して、
Leu−Gln−Pro−Argを得る。

本発明のACE阻害剤は人間および種々の動物に投与す
ることができ、少量の投与によって顕著な血圧降下およ
び上昇抑制を達成することができる。

本発明のACE阻害剤の好適な投与量は、投与される人
間や動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種
々の条件によって異なる。

そして、本発明のACE阻害剤は経口投与および非経口
投与のいずれによっても投与可能であり、更に単独で投
与しても、また製薬工業において通常使用されている固
体担体や液状担体と一緒に投与してもよく、或は他の薬
剤と混合または組合わせて使用することができる。また
投与形態は、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水
溶液、注射剤等の任意の形態が可能である。

更に、本発明のACE阻害剤は、食品や飼料中に添加し
て、またはそれらと一緒に投与することもでき、その場
合には天然タンパク質に由来するＬ−Leu−Ｌ−Gln−Ｌ
−Pro−Ｌ−Argが望ましい。

以下に、本発明を例を挙げて具体的に説明するが本発
明はそれらによって限定されない。

実施例１［小麦グルテンの加水分解によるテトラペプチドの調
製］小麦グルテン5gを0.03N塩酸100mlに分散溶解させた
後、蒸留水を加えて全量200mlにした。1N塩酸を加えてp
Hを2.0に調整した後、ペプシン（米国シグマ社製）5000
unitsを加えて、37℃で15時間反応させた。次に、5N水
酸化ナトリウム水溶液でpHを7.0に調整した後、トリプ
シンとキモトリプシン（米国シグマ社製）を各々1000un
itsずつ加えて37℃で５時間反応させた。次いで、90℃
で20分間加熱して酵素を失活させるとともに未溶解物を
沈澱させた。室温に冷却した後、10000Gで20分間遠心分
離して固形物を分離除去した。上澄液を回収し凍結乾燥
してペプチド混合物4.0gを得た。

上記のペプチド混合物20mgをナカライテスク株式会社
製のODSカラムであるCosmosil 5C₁₈（20×250mm）を用
いた逆相高速液体クロマトグラフィー10ml/分の流速で
通過させた後、吸着成分を0.1％トリフルオロ酢酸水溶
液（Ａ液）と0.1％トリフルオロ酢酸を含有するアセト
ニトリル溶液（Ｂ液）にてＢ液の濃度が０％から50％ま
で直線的に増加する直線濃度勾配溶離液を10ml/分の流
速で通して溶離すると同時にその溶離してきた液の波長
215nmにおける吸光度を測定すると第１図に示す多数の
ピークのあるフローチャートを得た。ここで第１図の左
側縦軸は溶離してきた液の波長215nmにおける吸光度（O
D₂₁₅）を、右側縦軸は溶離液中のアセトニトリル濃度
（％）を示す。

各ピークを分取してそのACE阻害活性を調べたとこ
ろ、アセトニトリルの濃度が15〜16％の溶離液区分にあ
る高吸収ピークが高いACE阻害活性を有していた。そこ
でこの画分を回収して、上記高速液体クロマトグラフィ
ー処理を再度繰返した。

得られた画分から溶媒を乾燥除去して白色の固体20μ
ｇを回収した。この白色固体をアプライトバイオシステ
ム社のプロテインシーケンサー477−Ａ型を使用してそ
のアミノ酸配列を調べたところ、Ｎ末端から順次Ｌ−Le
u、Ｌ−Gln、Ｌ−ProおよびＬ−Argが遊離してきた。こ
のことから式Ｈ・Ｌ−Leu−Ｌ−Gln−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg
・OHで表されるテトラペプチドであることが確認され
た。

シリカゲルプレートによる薄層クロマトグラフィーで
Rf値を求めたところ、ブタノール：酢酸：ピリジン：水
＝15:3:10:12の展開溶媒を使用した場合のRf値は0.34で
あった。

［ペプチドのACE阻害活性の測定］実施例１で得たテトラペプチドのACE阻害活性の測定
をBiochmical Pharamacology 20,p.1937（1971）に記載
のCheung ＆ Cushmanの方法に準じて以下の方法によっ
て行った。

酵素基質:Bz（ベンジル）−Gly−His−Leu 86mgを水8ml
とリン酸緩衝液8mlに溶解した溶液。

酵素：うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）1g
を50mmolのリン酸緩衝液10ml中で粉砕した後、遠心分離
した上澄液。

上記の酵素基質100μｌ、酵素溶液12μｌおよび実施
例１で製造したテトラペプチドの所定量を混合し、水を
加えて全体の液量を250μｌとした後、37℃で30分間反
応させた。次いで、1N塩酸250μｌを加えて反応を停止
させた後、酢酸エチル1.5mlを加えてVortexミキサーで1
5秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から1.0mlを分取して酢酸エチルを留去
し、残渣に蒸留水1mlを加えて溶解させた。溶解液の228
nmにおける紫外吸収値（OD₂₂₈）を測定した。

阻害率は、阻害剤なしで上記と同様に反応させたとき
のOD₂₂₈を100％とし且つ反応開始前（反応時間０分の
時）のOD₂₂₈を０％とした時に、阻害率が50％になる時
の阻害剤（実施例１のテトラペプチド）の濃度IC₅₀とし
て求めた。

その結果を下記の表に示す。

また、参考のため既知の阻害剤であるブラジキニン・
ポテンシエーターＣについても上記と同様にして阻害率
を求めた。その結果を下記の表に併記する。

［ペプチドのACE阻害活性（IC₅₀）］ペプチド IC₅₀（μＭ）Ｈ・Ｌ−Leu−Ｌ−Gln−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg・OH（本発
明） 17 ブラジキニン・ポテンシエーターＣ 20 上記表の結果から、本発明のACE阻害剤は既知のACE阻
害剤ブラジキニン・ポテンシエーターＣに比べて低濃度
でIC₅₀を達成できることがわかる。

実施例２［合成によるテトラペプチドの製造］市販のBoc−Arg（Tos）−Resin（置換率0.3meq/g）1.
0gを、45％トリフルオロ酢酸および2.5％アニソールを
含む塩化メチレン20mlを予め入れてあるバイオサーチ社
のペプチド合成装置SAM TWO 2の反応槽に入れ、室温で2
5分間反応させてBoc基を除去した。

次に、Boc基の除去されたArg（Tos）−Resinを塩化メ
チレンで洗浄し、次いで10％のイソプロピルエチレンア
ミンを含む塩化メチレンにより中和した後、更に塩化メ
チレンで洗浄した。

この樹脂に0.4M Boc−Pro−ジメチルホルムアミド溶
液5ml、0.4Mジイソプロピルカルボジイミド−塩化メチ
レン溶液5mlを混合して反応槽に入れて室温で２時間撹
拌下に反応させた。

上記で得られた樹脂を、順にジメチルホルムアミド、
塩化メチレン、ジイソプロピルエチルアミンを10％含有
する塩化メチレン、塩化メチレンおよび塩化メチレン／
ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して、Boc−Pro−Ar
g（Tos）を得た。

引き続き上記と同様にしてBoc基の除去、Bocアミノ酸
のカップリングを繰り返してLeu−Gln−Pro−Arg（To
s）−樹脂からなる生成物を得た。

この樹脂を10％のアニソールを含有するフッ化水素20
ml中で０℃で１時間撹拌してペプチドを樹脂から遊離さ
せた。その後、フッ化水素を減圧留去し、残渣を30％酢
酸で抽出し、それを凍結乾燥して粗ペプチド150mgを得
た。これをナカライテスク株式会社製のODSカラムCosmo
sil 5C₁₈（20×250mm）を用いた逆相高速液体クロマト
グラフィーにより精製して最終生成物75mgを得た。その
アミノ酸組成（モル比）は、Leu:Glu:Pro:Arg＝1:1:1:1
であった。更に、実施例１で使用したのと同じプロテイ
ンシーケンサーにより分析した結果、Ｈ−Leu−Gln−Pr
o−Arg−OHであることが判明した。

また、該生成物の薄層クロマトグラフィーのRf値は実
施例１の生成物と同様に0.34であった。

［発明の効果］本発明のACE阻害剤は、極めて少量の投与でACEの活性
を阻害して血圧降下および血圧上昇抑制を達成すること
ができる。

また、本発明のACE阻害剤は、白色の水溶性粉末であ
るために、そのままでまたは水等に溶解させて経口投与
および非経口投与のいずれの方法によっても極めて簡単
に投与することができる。

その上、本発明の新規なテトラペプチドLeu−Gln−Pr
o−Argは、４個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単
な構造を有する低分子量化合物であるため、化学合成に
よっても簡単に製造することができ、しかも投与した場
合に体内での吸収性がよく高い血圧降下作用を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１において小麦グルテンを加水分解し
て得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラフィ
ーに通し、その吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の
溶離液により溶離した時に溶離してくる成分の吸光度
（OD₂₁₅）を測定したフローチャートである。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 5/103 A61K 38/07 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式 Leu−Gln−Pro−Arg で表わされるペプチドおよびその塩。
【請求項２】下記の式 Leu−Gln−Pro−Arg で表わされるペプチドまたはその塩を有効成分とするア
ンジオテンシン変換酵素阻害剤。