JPH04300898A - 新規糖タンパク複合体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、クロレラ属の単細胞
緑藻が藻体外に産生する糖タンパク複合体に関し、特に
は抗腫瘍作用を有する糖タンパク複合体に係る。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗腫瘍作用を示すタンパク質ある
いは多糖として、キノコや細菌由来のものが知られてい
る。これらはいずれも、生体の腫瘍に対する防御機能を
高めることにより抗腫瘍作用を示すことが見出されてい
る。

【０００３】一方、クロレラ属の単細胞緑藻（以下、ク
ロレラと記載することがある）などの緑藻については、
分子量が１２万であり、数種類の糖で構成されている抗
腫瘍糖タンパク質の抽出・分離が報告されている（特開
昭６１−６９７２８号公報）。この物質は、アミラーゼ
を用いた加水分解処理によって抗腫瘍作用が増強され、
直接的殺細胞作用を示す。しかしながら、この物質は細
胞内物質であるため多様な成分を含み、その上藻体外に
分泌されないので分画精製および大量採取が困難であっ
た。

【０００４】クロレラが藻体外に産生する物質としては
、粘質多糖（特公昭６１−９６９９２号公報）やＭｏｏ
ｒｅ，Ｂ．Ｇ．、Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｇ．の多糖類（
Ｓｃｉｅｎｃｅ　、１４５　：５８６−５８７　、１９
６４）などが知られているが、これらの物質に抗腫瘍作
用は認められていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、従来、
クロレラが多糖類を藻体外に産生することは知られてい
るが、これらの物質には抗腫瘍作用は認められていない
。また、クロレラが藻体外に産生する糖タンパク複合体
も知られていない。

【０００６】この発明は、クロレラ属の単細胞緑藻が藻
体外に産生し、かつ抗腫瘍作用を有する新規糖タンパク
複合体、およびその製造方法を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意研究の結果、クロレラが培養液中に産生す
る、抗腫瘍作用を有する新規の糖タンパク複合体を見出
した。

【０００８】この発明による糖タンパク複合体は、クロ
レラ属の単細胞緑藻が藻体外に産生する糖タンパク複合
体であって、構成糖として５０％以上のガラクトースを
含有する多糖類とタンパク質とを含み、該多糖類の含有
率が５０ないし７０％、該タンパク質の含有率が３０な
いし５０％、および平均分子量が２０万であることを特
徴とする。

【０００９】以下、この発明による糖タンパク複合体の
製造方法について説明する。

【００１０】クロレラの培養法としては、独立栄養性（
Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ　）、従属栄養性（Ｈｅｔｅｒ
ｏｔｒｏｐｈｉｃ　）もしくは混合栄養性（Ｍｉｘｏｔ
ｒｏｐｈｉｃ　）のいずれの方法を用いてもよいが、効
率を考慮すると従属栄養条件下もしくは混合栄養条件下
で培養することが好ましい。培養の際には、クロレラ以
外の微生物が混入しないように、各機器類、培養液等の
滅菌および取扱いには十分注意する必要がある。

【００１１】培養は、まず、寒天斜面培地で保存してい
た種株の小規模培養を坂口フラスコを用いて行なう。続
いて、一般的なクロレラの液体培養用培地を用いて、徐
々にスケールアップしながら数日ないし数週間培養する
。得られたクロレラ培養液は遠心分離機にかけて、目的
とする糖タンパク複合体を含有する上清（ＣＶＳと略す
）とクロレラ藻体とに分離する。

【００１２】得られたＣＶＳから限外ろ過、透析もしく
はゲルろ過クロマトグラフィーにより高分子成分（ＣＶ
ＳーＵと略す）を分離し、次いで疎水クロマトグラフィ
ー、陰イオンクロマトグラフィー、キレートクロマトグ
ラフィー等を用いて精製して目的とする糖タンパク複合
体を得る。

【００１３】得られた糖タンパク複合体は抗腫瘍作用を
有しており、抗腫瘍剤の主成分として使用することがで
きる。なお、培養液の上清であるＣＶＳおよび粗精製物
であるＣＶＳーＵもそのまま抗腫瘍剤として使用するこ
とが可能である。

【００１４】

【実施例】実施例１　　クロレラの培養および糖タンパ
ク複合体の調製 寒天斜面培地（グルコース培地）で保存していた種株（
クロレラ工業社内番号ＣＫ−２２　）１白金耳を坂口フ
ラスコに接種し、４日間振とう培養した。その後、培養
液を１０リットルのジャーファメンターに移し、３日間
培養した。この培養液をさらに１トンタンクに移し、４
日間培養した後培養液を収穫した。ここで使用した培地
の組成および培養条件は以下の通りである。

【００１５】培地組成（培地１リットル当り）グルコー
ス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　
ｇ尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　７．５　ｇリン酸ーカリウム　　　　　　
　　　　　　　　　　２．５　ｇ硫酸マグネシウム・７
水和物　　　　　　２．５　ｇ培養条件 ｐＨ　　７．０　　　（ＮａＯＨ　にて調整）３７℃ 得られたクロレラ培養液を６０００ｒｐｍ　で１５分間
遠心分離し、目的とする糖タンパク複合体を含有する上
清（ＣＶＳ）とクロレラ藻体とに分離した。このＣＶＳ
をＰＴＨＫ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ製、２００　倍）を用いて限外ろ過した後、凍
結乾燥して高分子成分（ＣＶＳーＵ）を得た。ＣＶＳー
Ｕの収量は、培養液１リットル当り２ないし３ｇであっ
た。 実施例２　　糖タンパク複合体の精製 実施例１で得たＣＶＳーＵ　　１０ｇを、次に示す方法
で活性画分を確認しながら順次分画した。

【００１６】まず、ＣＶＳーＵをフェニルーセファロー
ス　　ＣＬ−４Ｂ　（疎水クロマトグラフィー）にかけ
、１／１０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　　６．８１）を用い
て溶出して親水性の強い最初の画分（Ｐ１と略す）を分
取した。次いで、この画分を陰イオン交換クロマトグラ
フィーにかけて２番目の画分（Ｐ１Ｑ２と略す）を分取
した。このＰ１Ｑ２を、さらにキレートクロマトグラフ
ィーにかけて分画し、２番目に溶出した抗腫瘍活性の高
い画分（Ｑ２Ｃ２と略す）２．２　ｇを得た。

【００１７】得られた抗腫瘍活性成分（Ｑ２Ｃ２）の化
学的性状を調べるために以下の測定を行なった。

【００１８】（ａ）一般分析 糖、タンパク質、脂質、核酸、リン酸基および硫酸基に
ついて、それぞれの含有率を求めた。この際、全糖につ
いてはフェノール・硫酸法によりガラクトース換算で、
タンパク質についてはＬｏｗｒｙ　法によりウシ血清ア
ルブミン換算で、脂質についてはクロロホルム・メタノ
ール抽出による重量法およびガスクロマトグラフィーに
よる脂肪酸の検出によって、リン酸基についてはＢａｒ
ｔｌｅｔｔ法によって、および硫酸基についてはＤｏｄ
ｇｓｏｎ−Ｐｒｉｃｅ　の比濁法によって求めた。結果
を以下に示す。

【００１９】糖　　　　　　　　　　　　　　５１．８
％タンパク質　　　　　　３６．３％ 脂質　　　　　　　　　　　　検出せず核酸　　　　　
　　　　　　　検出せずリン酸基　　　　　　　　検出
せず 硫酸基　　　　　　　　　　検出せず なお３０サンプルについて同様の測定を行なったところ
、糖およびタンパク質の含有率はそれぞれ５０〜７０％
、および３０〜５０％の範囲内にあった。

【００２０】（ｂ）糖組成 糖組成は、　２．５Ｍトリフルオロ酢酸を用いて　１０
０℃で　７時間加水分解した後、トリフルオロ酢酸誘導
体としてガスクロマトグラフィーにより測定した。結果
を以下に示す。なお、含有率は（ｗ／ｗ）％で示した。

【００２１】ラムノース　　　　　　　　１４．４アラ
ビノース　　　　　　　１．０ キシロース　　　　　　　　　０．８ マンノース　　　　　　　　　４．８ グルコース　　　　　　　　痕跡 ガラクトース　　　　　　７６．９ グルコサミン　　　　　　　２．１ （ｃ）アミノ酸組成 アミノ酸組成は、０．０５％β−　メルカプトエタノー
ル含有　６Ｎ塩酸を用いて　１１０℃で２４時間加水分
解した後、フェニルチオヒダントイン誘導体として高速
液体クロマトグラフィーにより測定した。結果を以下に
示す。なお、含有率は（ｗ／ｗ）で示した。

【００２２】アスパラギン酸　　　　　　　　１１．１
グルタミン酸　　　　　　　　　　１３．７セリン　　
　　　　　　　　　　　　　　　６．２スレオニン　　
　　　　　　　　　　　６．９ヒスチジン　　　　　　
　　　　　　　６．２グリシン　　　　　　　　　　　
　　　　５．６アラニン　　　　　　　　　　　　　　
　９．５チロシン　　　　　　　　　　　　　　　５．
２アルギニン　　　　　　　　　　　　　２．８メチオ
ニン　　　　　　　　　　　　　０．９バリン　　　　
　　　　　　　　　　　　　７．０プロリン　　　　　
　　　　　　　　　　５．４フェニルアラニン　　　　
　　　３．６リジン　　　　　　　　　　　　　　　　
　３．５イソロイシン　　　　　　　　　　　３．０ロ
イシン　　　　　　　　　　　　　　　９．５（ｄ）赤
外線吸収スペクトル Ｑ２Ｃ２の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。

【００２３】（ｅ）元素分析 元素分析の結果は以下の通りである。

【００２４】Ｃ　　　　　　　　４１．１％Ｈ　　　　
　　　　　５．９％ Ｎ　　　　　　　　　４．４％ （ｆ）分子量 Ｑ２Ｃ２を、　０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　６．８１
　）を溶出液として、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００
　ＨＲ（１０×４６０　ｍｍ）を用いたゲルろ過クロマ
トグラフィーにかけた。その結果を図２に示す。図２に
おいて、破線は糖を、実線はタンパク質（２８０　ｎｍ
におけるＵＶ吸収）をそれぞれ表わす。また、種々のタ
ンパク質（分子量マーカー）と溶出時間との関係を図２
の場合と同様にして測定し、結果を図３に示した。図２
および図３より、Ｑ２Ｃ２の平均分子量は２０万である
ことが明らかになった。

【００２５】（ｇ）溶解性 Ｑ２Ｃ２は水に易溶である。 実施例３　　各成分の抗腫瘍効果 まず、ＣＤＦ１マウスに、Ｍｅｔｈ−Ａ繊維肉種をマウ
ス一匹当り約　３×１０６　個細胞づつ皮下移植した。 移植の　２日、　４日および　６日後に、一回にマウス
一匹当り　５ｍｇ／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）　
０．２ｍｌのＣＶＳーＵを、静脈内、皮下、腹腔内、も
しくは腫瘍内注射により投与した。

【００２６】飼育期間中にこれらのマウスの腫瘍サイズ
を測定してその体積を算出し、対照群との比較により抗
腫瘍作用を判定した。なお、各試料（ＣＶＳ−Ｕ）の滅
菌は沸騰水中で３０分間行なった。また、対照群として
は、ＰＢＳのみを投与したマウスを用いた。その結果を
表１に示す。

【００２７】

【表１】 表１に示すように、ＣＶＳ−Ｕは腫瘍内注射のみならず
、静脈内注射でも顕著な腫瘍抑制効果を示した。さらに
、腹腔内および皮下注射によっても明らかな抗腫瘍効果
が認められた。

【００２８】そこで、投与も行ない易く、最も安定して
強い効果の得られる腫瘍内注射の系について、さらに詳
細な検討を行なった。

【００２９】まず、ＣＤＦ１マウスに、Ｍｅｔｈ−Ａ腫
瘍を、マウス一匹当り約　３×１０６　個細胞づつ皮下
移植した。次いで、移植の２日、　４日および　６日後
に、一回に一匹当り　１もしくは　５ｍｇ／ＰＢＳ　０
．２ｍｌのＣＶＳ−ＵもしくはＱ２Ｃ２、またはＰＢＳ
（対照）を腫瘍内に投与した。

【００３０】飼育期間中にこれらのマウスの腫瘍サイズ
を測定してその体積を算出し、対照群との比較により抗
腫瘍効果を判定した。なお、各試料の滅菌は沸騰水中で
３０分間行なった。その結果を表２に示す。

【００３１】

【表２】 表２に示すように、Ｑ２Ｃ２は原料であるＣＶＳ−Ｕと
比較して明らかに強い抗腫瘍効果を示し、腫瘍の増殖を
約９０％抑制した。すなわち、抗腫瘍活性はＱ２Ｃ２に
局在し、Ｑ２Ｃ２は抗腫瘍糖タンパク複合体であると考
えることができる。 実施例４　　生体内での腫瘍に対する防御機能の増強Ｃ
ＶＳ−Ｕによる抗腫瘍効果が生体防御を介しているかど
うかを調べるために以下の実験を行なった。

【００３２】ＢＡＬＢ／Ｃマウスに　Ｍｅｔｈ−Ａ　腫
瘍を移植する系において、他の条件は実施例１と同様に
して実験を行なった。ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、正常のｎ
ｕ／＋　マウス（胸腺を有するマウス）およびｎｕ／ｎ
ｕマウス（胸腺が欠損しているためにＴリンパ球が無く
、正常な免疫反応が行なわれないマウス）を用いた。結
果を表３に示す。 なお、表中の数値は、腫瘍移植の１４日後のものである
。

【００３３】

【表３】 表３に示すように、ＣＶＳーＵは正常なｎｕ／＋　マウ
スでは約７０％の腫瘍増殖抑制率を示したが、Ｔリンパ
球がなく生体防御機能が低下しているｎｕ／ｎｕマウス
では効果が認められなかった。これより、ＣＶＳ−Ｕの
抗腫瘍効果には、生体防御反応、特にＴリンパ球が関与
していることが判明した。

【００３４】

【発明の効果】以上のように、この発明による新規の糖
タンパク複合体は、クロレラ属の単細胞緑藻により藻体
外に産生されるものであって、従来公知の、クロレラが
産生する多糖類もしくは糖タンパク質とは著しく異なる
化学的組成、すなわちガラクトースに富む多糖類とタン
パク質とを含むものである。この糖タンパク複合体は、
藻体外、すなわち培養液中に産生されるので、分離精製
が容易であり、かつ生産性も非常に高く、安価に製造す
ることができる。加えて、クロレラの培養液は、従来廃
棄していたものであるので、産業廃棄物の有効利用にも
なる。

【００３５】さらに、この糖タンパク複合体は、生体の
防御機能を高めることによる、抗腫瘍作用を有している
。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の糖タンパク複合体の赤外線吸収スペ
クトルを示す特性図。

【図２】この発明の糖タンパク複合体のゲルろ過クロマ
トグラフィーのパターンを示す特性図。

【図３】ゲルろ過クロマトグラフィーにおける種々の分
子量のタンパク質と溶出時間との関係を示す相関図。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　クロレラ属の単細胞緑藻が藻体外に産
   生する糖タンパク複合体であって、構成糖として５０％
   以上のガラクトースを含有する多糖類とタンパク質とを
   含み、該多糖類の含有率が５０ないし７０％、該タンパ
   ク質の含有率が３０ないし５０％、および平均分子量が
   ２０万である糖タンパク複合体。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の糖タンパク複合体を含
   有する抗腫瘍剤。
3. 【請求項３】　　クロレラ属の単細胞緑藻を培養し、そ
   の培養液を遠心して上清を分離し、この上清を精製して
   平均分子量２０万の画分を得ることを特徴とする請求項
   １記載の糖タンパク複合体の製造方法。
4. 【請求項４】　　前記精製を、まず限外ろ過、透析もし
   くはゲルろ過クロマトグラフィーにより行ない、次いで
   疎水クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー
   もしくはキレートクロマトグラフィーにより行なうこと
   を特徴とする請求項３記載の製造方法。