NL8204323A

NL8204323A - Fysiologisch actieve stof; werkwijze voor het bereiden daarvan.

Info

Publication number: NL8204323A
Application number: NL8204323A
Authority: NL
Original assignee: Kitasato Inst
Priority date: 1981-12-02
Filing date: 1982-11-08
Publication date: 1983-07-01
Also published as: GB2111070A; US4533548A; ATA436782A; HU188599B; IT8224447A0; JPS5896025A; CH654013A5; IT1205279B; BE894925A; FR2517204B1; GB2111070B; DE3241990A1; FR2517204A1; AT380488B; DE3241990C2

Description

• * ·# » _____________;..............

VO 3875

Titel: Fysiologisch actieve stof? werkwijze voor het bereiden daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op de nieuwe fysiologisch actieve stof CH-1 en qp een werkwijze voor het bereiden daarvan.

Tot nu toe zijn vele pdysacchariden bekend met een interferon oproepende werkzaamheid of werkzaamheid tegen tumoren, en in de praktijk 5 zijn anti-tumor middelen zoals PSK gebruikt. Materialen met zowel de eigenschap - van werkzaamheid tegen tumoren en de eigenschap van een duidelijke interferon oproepende werkzaamheid zijn.echter niet bekend.

Gevonden isnu~, dat een materiaal, geëxtraheerd en geïsoleerd uit ChloraHa -pyresnoldosa behorend tot het genus Chlorella allebei 10 de bovenstaand vermelde eigenschappen heeft.

Het nieuwe fysiologisch actieve materiaal CH-1 volgens de onderhavige uitvinding (verder aangeduid als CH-1) is een zuur polysaccharide en heeft een interferon oproepende werkzaamheid en anti-tumor werkzaamheid.

15 Het CH-1 heeft de volgende fysisch-chemische eigenschappen: 1) Het bestaat tenminste uit koolstof, waterstof, zuurstof en stikstof en vertoont de volgende elementaire analyse: C: 38,49%; H: 6,07%; N: 1,39% 2) Molecuul gewicht: impermeabel voor een cellofaan membraan, en 20 S * 6,15, gemeten met een ultracentrifuge bij een concentratie van 0,2%, in een 0,2 M fosfaat buffer met een pH 7,2. Rotor type: RA 60HC, 51.-200 omwentelingen per minuut.

3) Smeltpunt: verkleurt bij ongeveer 240°C, daarnatreedtbij hogere 25 temperaturen carbonisatie op.

29 4) Specifieke rotatie:[a]_ --9,52 (c=l, HO) D 2 5) UV-spectrum: eind absorptie in 0,125% waterige oplossing.

6) IR-spectrum: getoond in fig. 1, KBr tablet, absorptie banden bij 3420, 2930, 1640, 1380, 1125, 1065, 1040, 30 990, 015, 835 en 800 cm"1 7) Oplosbaarheid: oplosbaar: water; onoplosbaar: gewone organische oplosmiddelen zoals methanol.

8 20 4 3 21 -2- * ·* 8) Kleurreactie: positief: Anthron, Molisch en carbazool-H^SO^ negatief: Folin-Lowry en ninhydrine 9) Aard: zuur, electroforesè over acetaat membraan [electroforese tot 0,8 cm voor (+) bij de conditie van 0,1 M pyridine-azijnzuur, 5 pH 5,0, 200 V (4 mA), 20 minuten] 10) Kleur: wit poeder 11) Eiwit: niet gevonden (gemeten door een Folin-Lowry kleurreactie) 12) Monosaccharide analyse: thamnose, arabinose, glucose, galactose en glucuron zuur (gedetecteerd met papier-10 chromatografie en gas-chromatografie na hydrolyse in 7% H^SO^, gedurende twee uur onder terugvloeikoeling koken) 13) Suiker gehalte: 53% (berekend als glucose) 14) Ultrar-centrifuge patroon: fig. 3 15 De biologische eigenschappen van CH-1 zijn als volgt: I. Interferon oproepende werkzaamheid: 1) Analyse methode A (in vitro):

Konijnen (Japanse witte konijnen) wordt bloed afgenomen door arteriotomy.

20 De verwijderde milt wordt met trypsine behandeld om gesuspendeerde 7 cellen te bereiden (2 - 5 X 10 cellen). De mftcellen worden met CH-1 gedurende 24 uur bij 25°C geincubeerd, gecentrifugeerd en de bovendrijvende vloeistof wordt verzameld, en in het medium wordt de interferon titer bepaald.

25 2) Analyse methode B (in vivo):

Op geregelde tijden na intraveneuze injectie van 100 mg/kg CH-1 in ddy muizen van vier weken oud, werd bloed van de muizen afgetapt en werd de interferon titer in het serum bepaald.

3) Analyse methode van de interferon (IF) titer: 30 De IF titer wordt bepaald met de plaque 50% afname methode onder toepassing vanRK13 cultuur van een konijnennier cel.—lijn en van Vescular stomatitis virus als aanvallend virus.

4) Resulaten: (1) in vitro methode: 35 Monster concentratie (ug/ml): 10 1 0,1 0,01 8204323

IJ SUIS! J!" ........................ " ,l:||||:! : -l·!1! '::!' ':"'Vi'V

ί 1 ..I—.

-3- IF titer (u) 49 34 20 (2) in vivo methode: tijdstip van bloedafname: 2 uur later 5 uur later IF titer (u) 240 15 5 Zoals boven aangetoond, heeft de verbinding volgens de onder- havige uitvinding een interferon oproepende werkzaamheid: II. Inhibltolra werkzaamheid op virus infectie: 1) Analyse methode: CS-1 wordt intraveneus in de staartader aan ddï muizen toegediend 10 en na 2 - 12 uur Worden de muizen intraeneus in de staartader behandeld met vaccinia virus. Het aantal pokken, dat op de staarthuid verschijnt, wordt op de achtste dag na dese behandeling geteld.

2) Resultaat.

Het resultaat wordt in de volgende tabel getoond.

15 Inhibitoire werkzaamheden op virus infectie: dosis (mg/kg) Behandelings- Gemiddeld aantal pokken schema (vijf muizen) controle - 58,7 100 -2 uur 1 20 25 -2 uur 1,6 100 -6 uur 4 25 -6 uur 26 III. Anti-tumor werkzaamheid: 1) Werkzaamheid tegen muizen leukemie P-388: 25 CDF. muizen worden intraperitoneaal ingeënt met P-388 cellen, 2 lx 1Ö ,en wordeidagelijks van dag 1 tot dag 15 met CH-1 behandeld.

820 4 321Ï ·· V JxÉc. . a ·. £ ϊζ- ν'. £ Λ'. .: : . ΐ-.

I ; —— - * - ~ -4- * -

Het resultaat: dosis (mg/kg/dag) Gemiddeld aantal overle- Toename levensduur vingsdagen (%) controle 15 0 5 50 16,8 8 250 19,5 26

Toename van de levensduur (%) = 100 x (gemiddeld aantal overlevings-dagen 'bij behandeling/gemiddeld aantal overlevingsdagen van de controle) - 100.

10 (2) Werkzaamheid tegen de vaste tumor S-180: 7 ICR-muizen worden subcutaan ingeënt met Sarcoma-180 (1 x 10 ) cellen op dag 0, en CH-1 wordt achtereenvolgens 1 maal per dag op de dagen 1-9 intraperitoneaal toegediend.

dosis (mg/kg/dag) Gemiddelde levensduur Toename levensduur 15 (dagen, 5 muizen) (%) 42 0 50 50 19 250 61 45

Een tot op heden bekend materiaal met werkzaamheid tegen tumoren, 20 dat verkregen wordt uit het genus Chlorella is een anti-tumor middel, geïsoleerd uit Chlorella regularis (JP-A-52-79016). Dit material bevat 3,6% eiwitten, terwijl in CH-1 geen eiwit wordt aangetroffen. Verder is het bovenstaand vermelde voorbekende materiaal een polysaccharide dat bestaat uit 95 ± 2% glucose en sporen hoeveelheden van rhamnose en 25 galactose, d.w.z. een polysaccharide dat uit glucose als hoofdcomponent bestaat. Het CH-1 volgens de onderhavige uitvinding is echter een polysaccharide, dat bestaat uit kleine hoeveelheden galactose, arabinose, glucose en glucuron-zuur, en als hoofdcomponent rhamnose. Beide materialen .verschillen van elkaar in hun suiker componenten. Daardoor 30 kan CH-1 worden aangeduid als een nieuw materiaal.

8204323 -5-

De onderhavige uitvinding verschaft tevens een werkwijze voor het bereiden van het CH-1 materiaal, die gekenmerkt wordt doordat tot het genus Chlorella behorende chlorella worden gekweekt en CH-1 uit de aldus gekweekte cellen wordt geïsoleerd.

5 Het in de onderhavigs uitvinding toegepaste chlorella is in de natuur wijd verspreid en is een eencellige alge. Een voorkeursuitvoeringsvorm van de cellen, die in de onderhavige uitvinding worden gebruikt, wordt gevormd door Chlorella pyrenoidosa, en kunstmatige mutantstammen daarvan, verkregen door ultraviolet, röntgen, bestraling 10 of chemische mutagenen en natuurlijke mutanten vein de chlorella cellen die CH-1 produceren, kunnen in de onderhavige uitvinding worden toegepast*

Volgens de onderhavige uitvinding wordt chlorella, dat behoort tot het genus Chlorella ineen geschikt medium gekweekt. Men kan een voedings-15 medium gebruiken, dat azijnzuur, koolstofdioxide, calciumzout, magne-siumzout en kaliumzout, en desgewenst andere koolstofbronnen zoals glucose, stikstofbronnen zoals ureum en vitaminen omvat. Het kweken wordt gewoonlijk onder aseptiache omstandigheden uitgevoerd in een afgedichte tank onder aerobe omstandigheden. Er wordt gebruik gemaakt 20 van zichbaar licht, bijvoorbeeld zonlicht of fluorescentielicht.

CH-1 kan met heet water werden geëxtraheerd uit gekweekte cellen of gesproeidroogde cellen. De extractie wordt gedurende 1 uur bij 80 - 90°C uitgevoerd. Het extract of zijn .concentraat wordt met een met water mengbaar organisch oplosmiddel behandeld om het materiaal 25 te doen neerslaan. Voorbeelden van bij voorkeur toegepaste met water mengbare organische oplosmiddelen zijn lagere alcoholen zoals methanol en ethanol. De concentratie ligt bij voorkeur in een gebied tussen 40-80%.

Het aifins verkregen neerslag wordt door centrifugatie verzameld, 30 opgelost in water en aan een dialyse met een semi-permeabel membraan zoals een cellofaan-buis onderworpen om onzuiverheden met laag molecuul gewicht te verwijderen.

Het dialysaat wordt door absorptie-chromatografie en gel-filtratie behandeld om het Cff-Γ te zuiveren. Het dialysaat wérd bijvoorbeeld 35 geabsorbeerd in een kolom van DEAE-cellulose en geëlueerd met een 8204323 : : -6- verdunde basische oplossing. Het eluaat wordt geneutraliseerd, geleid door een kolom van CM-cellulose en de actieve fractie wordt gelyofiliseerd. Het lyofilisaat wordt opgelost in water en wordt geabsorbeerd in een kolom van DEAE-sepharcel, en aan gradient-5 chromatografie onderwerpen met water en 1M NaCl/0,01 N-HCl. Actieve fracties worden verzameld, aan gel-filtratie onder toepassing van Sephadex G-75 onderworpen en gelyofiliseerd om CH-1 te verkrijgen.

De uitvinding wordt aan de hand van het volgende voorbeeld nader toegelicht. Dit voorbeeld is niet beperkend bedoeld.

10 Voorbeeld.

Gesproeid droogpoeder (Ikg) van Chlorella pyrenoidosa werd geëxtraheerd met 5 liter heet water gedurende één uur bij 80-90°C.

Het extract werd gedurende 20 minuten met 7000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd. Methanol werd aan de bovenstaande oplossing 15 toegevoegd tot een concentratie van 40% en men liet het geheel gedurende een nacht bij 5°C staan,en centrifugeerde daarna gedurende 20 minuten met 9000 omwentelingen per minuut. Het neerslag werd opgelost in water en de waterige oplossing werd in een cellofaan buis gedurende een nacht aan dialyse onderworpen tegen stromend gedeioniseerd water.

20 Het dialyzaat werd geabsobeerd in een kolom (6,4 x 39 cm) van DEAE-cellu- lose, geëquilibreerd met 0,005 M fosfaat buffer (pH 6,0) en geëlueerd met 0,05 N-NaOH. Elke fractie van 10 ml werd onderzocht op IF oproepende werkzaamheid en de verzamelde actieve fracties werden geneutraliseerd met 1N-HC1. De oplossing werd geleid door 25 een kolom (4 x 15 cm) van CM-cellulose, het eluaat werd geconcentreerd en gelyofiliseerd. Het in een geringe hoeveelheid water opgeloste ruwe poeder werd geabsorbeerd in een kolom (2,5 x 50 cm) van DEAE-sepharcel en werd door gradient elutie met water (500 ml) en 1M NaCl/0,01 N-HCK5Q0 ml) geëlueerd. Elke fractie van 10 ml werd onderzocht met 30 anthroon-H.SO en de fracties die een hoge concentratie saccharide ώ 4 bevatten werden verzameld, geneutraliseerd met 0,02 M-NaOH, daarna gedurende een nacht aan dialyse onderworpen met een cellofaan buis tegen kraanwater. Het dialysaat werd door een kolom (5 x 70 cm) van Sephadex G-75 geleid. Het eluaat werd gelyofiliseerd, waarbij een wit poeder 35 van CH-1 werd verkregen (200 mg).

In de tekening toont: 8204323 ' ........................'w'···...........Γ ......"I™ ......................ρ" 1 : ......,·Λ·,- € -7-

Pig. 1 het IR-spectrum vaa CH-1;

Fig. 2 het electroforese patroon van CH-1 over een acetaat membraan; en

Fig. 3 het ultracentrifuge patroon van CH-1.

8204323

Claims

1. Het bestaat tenminste uit koolstof,waterstof, zuurstof en stikstof, en heeft ongeveer de volgende elementaire analyse:

1. Fysiologisch actief materiaal CH-1 met de volgende fysisch-chemische eigenschappen:

2. Werkwijze voor het bereiden van fysiologisch actief materiaal CH-1, met het kenmerk, dat chlorella cellen behoren tot het genus

30 Chlorella worden geëxtraheerd met heet water, een fractionele precipi-tatie wordt uitgevoerd door een met water mengbaar organisch oplosmiddel aan het extract toe te voegen, de waterige oplossing van het precipitaat aan een dialyse wordt onderworpen, en het aldus verkregen dialysaat 8204323 v -¾ : : . Λ.: -9- ί ] : ; wordt onderworpen aan adsorptie-chromatografie en gel filtratie om het fysiologische actieve materiaal CH-1 te isoleren.

2. Molecuul gewicht: impermeabel voor cellofaan membraan, en S = 6,15 S (gemeten met een ultracentrifuge)

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het voor de fractionele precipitatie toegepaste oplosmiddel een lagere alcohol is.

3. Smeltpunt: kleurt bij ongeveer 240°C, daarnatreedt bij hogere temperaturen carbonisatie op. 29 10 4) Specifieke rotatie: Γο]^ = -9,52 (c = 1, ^0)

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de voor de fractionele precipitatie toegepaste lagere alcohol methanol is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat voor de ? ...... 1 fractionele precipitatie met Jtethanol een methanol concentratie van 40-80% wordt gebruikt.

5. Ultraviolet absorptie spectrum: eind absorptie in 0,125% waterige oplossing.

5 C: 38,49%, H: 6,07%, N: 1,39%

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het adsorbent voor de adsorptie-chromatografie DEAE-cellulose en CM-cellulose is.

6. Infrarood absorptie spectrum volgens fig. 1

7. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het' gel-filtratie medium voor gel-filtratie Sephadex G-75 of Sephadex G-100 is.

7. Oplosbaarheid: oplosbaar: water; 15 onoplosbaar: organische oplosmiddelen zoals methanol

8. Kleurreactie:· positief: Anthron, Molisch en carbazol-H^SO^; negatief: Folin-Lowry en ninhydrine

9. Aard: zuur, electroforese over acetaat-membraan getoond 20 in fig. 2

10. Kleur: wit poeder

11. Eiwit: niet gevonden (gemeten met de Folin-Lowry kleurreactie)

12. Monosaccharide analyse: rhamnose, galactose, arabinose, glucose en glucuron”zuur (gedetecteerd met paper-chromato- 25 grafie en gas-chromatografie na hydrolyse in 7% H2S°4' gedurende 2 uur koken onder terugvloeikoeling)

13. Suiker gehalte: 53% (berekend als glucose)

8. Werkwijze volgens conclusie 2, net het kenmerk, dat de chlorella Chlorella pyrenoidola is. 8204323