JPH04211400A - 修飾核酸の製造方法 - Google Patents
修飾核酸の製造方法Info
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、修飾核酸の製造方法、
この製造方法を包含する核酸の検出方法、これらの方法
を行うための試薬、および該方法で製造される核酸に関
するものである。
この製造方法を包含する核酸の検出方法、これらの方法
を行うための試薬、および該方法で製造される核酸に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】核酸の検出方法は、ますます、臨床学的
診断において、例えばウイルス診断薬および細菌診断薬
のようなヒト診断薬の領域において、免疫学的試験より
も敏感であることが証明されている。しかしながら、核
酸検出方法は、食物診断薬および組織学にも適用されて
きた。これらの方法において、検出しようとする核酸を
含有する物質を、検出しようとする核酸に対して相補的
である核酸と接触させる。その後、様々な方法で核酸ハ
イブリッドの形成を可視化することができる。このよう
な方法は、例えば、ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−２８０１
５８２または米国特許ＵＳ−Ａ−４３５８５３５に開示
されている。
診断において、例えばウイルス診断薬および細菌診断薬
のようなヒト診断薬の領域において、免疫学的試験より
も敏感であることが証明されている。しかしながら、核
酸検出方法は、食物診断薬および組織学にも適用されて
きた。これらの方法において、検出しようとする核酸を
含有する物質を、検出しようとする核酸に対して相補的
である核酸と接触させる。その後、様々な方法で核酸ハ
イブリッドの形成を可視化することができる。このよう
な方法は、例えば、ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−２８０１
５８２または米国特許ＵＳ−Ａ−４３５８５３５に開示
されている。
【０００３】しかしながら、これらの方法は、非常に少
量の核酸の検出にあまりよく適していない。これらの方
法を改良するために、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００
３６２において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 系によってハイブ
リダイゼーション反応の前の段階で検出しようとする核
酸を増加させることが示唆されている。このために、検
出しようとする核酸一本鎖当たり少なくとも１つのいわ
ゆるプライマーを試料に添加する。プライマーから開始
して、モノヌクレオチドとの反応を介する酵素的延長反
応によって、核酸一本鎖の各々に関して、鋳型核酸に対
して相補的である核酸鎖を形成する。この反応は数回連
続して行うことができ、これによって、新しく形成され
た核酸鎖を増加させることもできる。この方法および上
記従来技術の方法の欠点は、標識核酸とのハイブリダイ
ゼーション反応が増加反応の後に行われることである。
量の核酸の検出にあまりよく適していない。これらの方
法を改良するために、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００
３６２において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 系によってハイブ
リダイゼーション反応の前の段階で検出しようとする核
酸を増加させることが示唆されている。このために、検
出しようとする核酸一本鎖当たり少なくとも１つのいわ
ゆるプライマーを試料に添加する。プライマーから開始
して、モノヌクレオチドとの反応を介する酵素的延長反
応によって、核酸一本鎖の各々に関して、鋳型核酸に対
して相補的である核酸鎖を形成する。この反応は数回連
続して行うことができ、これによって、新しく形成され
た核酸鎖を増加させることもできる。この方法および上
記従来技術の方法の欠点は、標識核酸とのハイブリダイ
ゼーション反応が増加反応の後に行われることである。
【０００４】欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４に
おいて、新しく形成された核酸と標識化モノヌクレオチ
ドとの一体化の結果、標識核酸プローブによるハイブリ
ダイゼーションを省略することができるブロッティング
法が示唆されている。しかしながら、この方法の欠点は
、ゲルクロマトグラフィーによって核酸を分離しなけれ
ばならないことである。これは、装置を複雑にし、時間
を消耗する。
おいて、新しく形成された核酸と標識化モノヌクレオチ
ドとの一体化の結果、標識核酸プローブによるハイブリ
ダイゼーションを省略することができるブロッティング
法が示唆されている。しかしながら、この方法の欠点は
、ゲルクロマトグラフィーによって核酸を分離しなけれ
ばならないことである。これは、装置を複雑にし、時間
を消耗する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
技術の欠点を回避することであり、特に、核酸の検出の
ためにより少ない工程しか必要としない簡単で非常に感
受性の高い方法を提供することである。
技術の欠点を回避することであり、特に、核酸の検出の
ためにより少ない工程しか必要としない簡単で非常に感
受性の高い方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも１
つのプライマーを鋳型核酸にハイブリダイズし、少なく
とも４つの異なるタイプのモノヌクレオチドと反応させ
ることによって、該プライマーを鋳型核酸に対して相補
的である核酸鎖に酵素的に延長させることによる核酸の
製造方法であって、該相補的核酸鎖が固定を可能にさせ
る２つまたはそれ以上の基および１つまたはそれ以上の
検出可能な基を担持していることを特徴とする製造方法
を提供するものである。本発明は、また、核酸検出方法
、核酸製造用試薬、核酸製造用試薬キットおよび上記方
法のうちの１つにおいて製造された核酸を提供するもの
でもある。
つのプライマーを鋳型核酸にハイブリダイズし、少なく
とも４つの異なるタイプのモノヌクレオチドと反応させ
ることによって、該プライマーを鋳型核酸に対して相補
的である核酸鎖に酵素的に延長させることによる核酸の
製造方法であって、該相補的核酸鎖が固定を可能にさせ
る２つまたはそれ以上の基および１つまたはそれ以上の
検出可能な基を担持していることを特徴とする製造方法
を提供するものである。本発明は、また、核酸検出方法
、核酸製造用試薬、核酸製造用試薬キットおよび上記方
法のうちの１つにおいて製造された核酸を提供するもの
でもある。
【０００７】本発明の範囲内で、鋳型核酸は、特に、原
核生物もしくは真核生物起源のＤＮＡおよびＲＮＡであ
る。これらは、ウイルス性および細菌性核酸ならびにビ
ロイド由来の核酸を含む。これらは、一本鎖または二本
鎖であり得る。これらは、プラスミドのようなエピソー
ム核酸またはゲノム、染色体核酸であり得る。核酸は、
特定の微生物または微生物の群によって特徴付けられる
。核酸は、例えば制限酵素によって開裂された核酸のよ
うに、既に前処理された核酸であってもよい。ＲＮＡの
場合、ｃＤＮＡを予め製造しておくべきである。核酸が
一本鎖形態で存在するかまたは反応を行う前に一本鎖形
態にされる場合に優れていることが証明された。
核生物もしくは真核生物起源のＤＮＡおよびＲＮＡであ
る。これらは、ウイルス性および細菌性核酸ならびにビ
ロイド由来の核酸を含む。これらは、一本鎖または二本
鎖であり得る。これらは、プラスミドのようなエピソー
ム核酸またはゲノム、染色体核酸であり得る。核酸は、
特定の微生物または微生物の群によって特徴付けられる
。核酸は、例えば制限酵素によって開裂された核酸のよ
うに、既に前処理された核酸であってもよい。ＲＮＡの
場合、ｃＤＮＡを予め製造しておくべきである。核酸が
一本鎖形態で存在するかまたは反応を行う前に一本鎖形
態にされる場合に優れていることが証明された。
【０００８】試料中に存在し、検出または製造反応に関
する基部を形成する特定の核酸を、以下、鋳型核酸と称
する。
する基部を形成する特定の核酸を、以下、鋳型核酸と称
する。
【０００９】鋳型核酸は、純粋な形態で、または検出し
ようとしていないかもしくは使用されない他の核酸との
混合物として存在し得る。
ようとしていないかもしくは使用されない他の核酸との
混合物として存在し得る。
【００１０】これらの核酸は、前処理されたかまたは前
処理されていない固体または液体試料中に含まれ得る。 鋳型核酸は、例えば細胞のような微生物の溶解によって
得られ、他の核酸でもある非常に多くの種類の化合物を
含む試料中に含まれるのが好ましい。
処理されていない固体または液体試料中に含まれ得る。 鋳型核酸は、例えば細胞のような微生物の溶解によって
得られ、他の核酸でもある非常に多くの種類の化合物を
含む試料中に含まれるのが好ましい。
【００１１】核酸の製造に関する本発明の方法を行うた
めに、鋳型核酸を含む試料に、適切な条件下、核酸一本
鎖当たり少なくとも１つの、好ましくは１つのプライマ
ーを添加する。このプライマーは、好ましくは１２〜６
０、特に、１５〜３０ｎｔ（ヌクレオチド）長さのオリ
ゴヌクレオチドである。該プライマーは、鋳型核酸の個
々の領域とハイブリダイズすることができる。これは、
プライマーが鋳型核酸の領域に対して本質的に相補的で
あるヌクレオチド配列を有する場合に可能である。
めに、鋳型核酸を含む試料に、適切な条件下、核酸一本
鎖当たり少なくとも１つの、好ましくは１つのプライマ
ーを添加する。このプライマーは、好ましくは１２〜６
０、特に、１５〜３０ｎｔ（ヌクレオチド）長さのオリ
ゴヌクレオチドである。該プライマーは、鋳型核酸の個
々の領域とハイブリダイズすることができる。これは、
プライマーが鋳型核酸の領域に対して本質的に相補的で
あるヌクレオチド配列を有する場合に可能である。
【００１２】プライマーは、好ましくは、デオキシリボ
ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構築されてお
り、これらのヌクレオチドは、修飾または非修飾であり
得る。プライマーのほとんどのヌクレオチドが非修飾で
あるのが好ましい。
ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構築されてお
り、これらのヌクレオチドは、修飾または非修飾であり
得る。プライマーのほとんどのヌクレオチドが非修飾で
あるのが好ましい。
【００１３】非修飾ヌクレオチドは、天然に生じるヌク
レオチドであり、例えば、アデノシン、グアノシン、チ
ミジン、ウリジンおよびシチジンである。修飾ヌクレオ
チドは、７−デアザ−アデノシンもしくは７−デアザ−
グアノシンのようなヌクレオチド類似物または固定を可
能にさせる（固定可能な）基または検出可能な基を含む
該非修飾ヌクレオチドの誘導体である。
レオチドであり、例えば、アデノシン、グアノシン、チ
ミジン、ウリジンおよびシチジンである。修飾ヌクレオ
チドは、７−デアザ−アデノシンもしくは７−デアザ−
グアノシンのようなヌクレオチド類似物または固定を可
能にさせる（固定可能な）基または検出可能な基を含む
該非修飾ヌクレオチドの誘導体である。
【００１４】固定され得る基は、例えば化学反応または
光反応によって、固相に共有結合することができる化学
基、または認識され、基特異性相互関係を介して別の分
子または分子の一部によって結合され得る基もしくは分
子の部分である。したがって、このような基は、例えば
、ハプテン、抗原および抗体、糖蛋白、例えばレクチン
、またはビオチンもしくはイミノビオチンのような結合
蛋白の結合相手である。ハプテンおよびビタミンが好ま
しく、ビオチンまたはジゴキシゲニンのようなステロイ
ドが特に好ましい。
光反応によって、固相に共有結合することができる化学
基、または認識され、基特異性相互関係を介して別の分
子または分子の一部によって結合され得る基もしくは分
子の部分である。したがって、このような基は、例えば
、ハプテン、抗原および抗体、糖蛋白、例えばレクチン
、またはビオチンもしくはイミノビオチンのような結合
蛋白の結合相手である。ハプテンおよびビタミンが好ま
しく、ビオチンまたはジゴキシゲニンのようなステロイ
ドが特に好ましい。
【００１５】検出可能な基は、例えば、放射性同位体、
蛍光色素または色素産生物質のような直接検出可能な基
もしくは分子の部分、あるいは次の反応によって間接的
に検出可能である基を共有結合している。これらは、特
に、固定され得る基に関する上記生物特異性基（ｂｉｏ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｕｐｓ）を含む。ジゴキシゲ
ニンが特に好ましい。
蛍光色素または色素産生物質のような直接検出可能な基
もしくは分子の部分、あるいは次の反応によって間接的
に検出可能である基を共有結合している。これらは、特
に、固定され得る基に関する上記生物特異性基（ｂｉｏ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｕｐｓ）を含む。ジゴキシゲ
ニンが特に好ましい。
【００１６】プライマーは、固定を可能にさせる１つま
たは数個の基また検出可能な基を含有することができる
。固定を可能にさせる１つまたはそれ以上の基および１
つまたはそれ以上の検出可能な基を含有することもでき
る。プライマーは、これらの基を全く含まないのが好ま
しい。
たは数個の基また検出可能な基を含有することができる
。固定を可能にさせる１つまたはそれ以上の基および１
つまたはそれ以上の検出可能な基を含有することもでき
る。プライマーは、これらの基を全く含まないのが好ま
しい。
【００１７】このようなプライマーは、当業者に公知の
方法で、例えば、国際出願公開ＷＯ８４／０３２８５と
同様の化学合成によって、または欧州特許出願ＥＰ−Ａ
−００６３８７９と同様の酵素的一体化によって製造す
ることができる。プライマーは、任意の位置で修飾され
得るが、しかしながら好ましくは３’末端ではない。５
’末端での修飾は、例えばマニアティスら編集のＣＳＨ
のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２３９頁（１９８２）に従って、
または／および核塩基を介して、例えばε−アミノカプ
ロン酸リンカーを介しておよび／またはフェインバーグ
ら（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）（アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．）、１３２、６（１９８３））に従ってランダムプラ
イミング（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｉｎｇ）を介して可
能である。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２に開
示されている全てのプライマーは、大体において、適し
ている。
方法で、例えば、国際出願公開ＷＯ８４／０３２８５と
同様の化学合成によって、または欧州特許出願ＥＰ−Ａ
−００６３８７９と同様の酵素的一体化によって製造す
ることができる。プライマーは、任意の位置で修飾され
得るが、しかしながら好ましくは３’末端ではない。５
’末端での修飾は、例えばマニアティスら編集のＣＳＨ
のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第２３９頁（１９８２）に従って、
または／および核塩基を介して、例えばε−アミノカプ
ロン酸リンカーを介しておよび／またはフェインバーグ
ら（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）（アナリティ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．）、１３２、６（１９８３））に従ってランダムプラ
イミング（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｉｎｇ）を介して可
能である。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２に開
示されている全てのプライマーは、大体において、適し
ている。
【００１８】鋳型核酸の適合部分によるプライマーのハ
イブリダイゼーションが生じる条件は、例えば欧州特許
出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２によって、当業者に公知
である。これらは、プライマーの長さおよび相補性の程
度に依存している。
イブリダイゼーションが生じる条件は、例えば欧州特許
出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２によって、当業者に公知
である。これらは、プライマーの長さおよび相補性の程
度に依存している。
【００１９】プライマーは、特にその３’末端に、鋳型
核酸の対応するヌクレオチドに対して相補的である少な
くとも１つのヌクレオチドを有しているべきである。さ
らに、プライマーは、好ましくはその５’末端に、鋳型
核酸に対して相補的ではないヌクレオチド配列を含むこ
とができる。酵素、例えばポリメラーゼに対する認識部
位を含むこともでき、さらに蛋白も結合され得る。
核酸の対応するヌクレオチドに対して相補的である少な
くとも１つのヌクレオチドを有しているべきである。さ
らに、プライマーは、好ましくはその５’末端に、鋳型
核酸に対して相補的ではないヌクレオチド配列を含むこ
とができる。酵素、例えばポリメラーゼに対する認識部
位を含むこともでき、さらに蛋白も結合され得る。
【００２０】プライマーのヌクレオチド配列は、鋳型核
酸の一本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイゼーション
の後にプライマーの３’末端を越えて伸びるように選択
される。
酸の一本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイゼーション
の後にプライマーの３’末端を越えて伸びるように選択
される。
【００２１】核酸の製造に関する本発明の方法において
、鋳型核酸とプライマーによって形成されたハイブリッ
ド核酸は、上記鋳型核酸の一本鎖領域に対して相補的で
あるプライマーに結合した核酸の一片の形成によってプ
ライマーの３’末端で延長される。これは、欧州特許出
願ＥＰ−Ａ−０２００３６２と同様に行うことができる
。該欧州特許出願に開示されている延長は、４つのモノ
ヌクレオシド三リン酸による。
、鋳型核酸とプライマーによって形成されたハイブリッ
ド核酸は、上記鋳型核酸の一本鎖領域に対して相補的で
あるプライマーに結合した核酸の一片の形成によってプ
ライマーの３’末端で延長される。これは、欧州特許出
願ＥＰ−Ａ−０２００３６２と同様に行うことができる
。該欧州特許出願に開示されている延長は、４つのモノ
ヌクレオシド三リン酸による。
【００２２】本発明の方法において、モノヌクレオシド
三リン酸として、修飾および非修飾ヌクレオシド三リン
酸が用いられる。修飾ヌクレオシド三リン酸は、上記修
飾ヌクレオチドの三リン酸である。このような修飾モノ
ヌクレオシド三リン酸の例としては、ジゴキシゲニン−
ｄＵＴＰ（欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４）ま
たはビオチン−ｄＵＴＰである。延長反応において、固
定を可能にさせる基を担持しているこれらヌクレオシド
三リン酸および検出可能な基を担持しているこれらヌク
レオシド三リン酸は、修飾ヌクレオシド三リン酸と同時
に使用することができる。固定を可能にさせる基は、検
出可能な基とは異なる基である場合が好ましい。ある実
験条件に従うと、延長が約３０〜４０ヌクレオチド以上
である場合、固定を可能にさせる数個の基が新しく形成
されたヌクレオチド配列と確実に一体化され得る。ヌク
レオシド三リン酸は、全く修飾されていないのが好まし
い。１つのタイプの修飾形態のヌクレオシド三リン酸お
よび４つの天然タイプのヌクレオシド三リン酸を使用す
る場合が特に好ましい。
三リン酸として、修飾および非修飾ヌクレオシド三リン
酸が用いられる。修飾ヌクレオシド三リン酸は、上記修
飾ヌクレオチドの三リン酸である。このような修飾モノ
ヌクレオシド三リン酸の例としては、ジゴキシゲニン−
ｄＵＴＰ（欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４）ま
たはビオチン−ｄＵＴＰである。延長反応において、固
定を可能にさせる基を担持しているこれらヌクレオシド
三リン酸および検出可能な基を担持しているこれらヌク
レオシド三リン酸は、修飾ヌクレオシド三リン酸と同時
に使用することができる。固定を可能にさせる基は、検
出可能な基とは異なる基である場合が好ましい。ある実
験条件に従うと、延長が約３０〜４０ヌクレオチド以上
である場合、固定を可能にさせる数個の基が新しく形成
されたヌクレオチド配列と確実に一体化され得る。ヌク
レオシド三リン酸は、全く修飾されていないのが好まし
い。１つのタイプの修飾形態のヌクレオシド三リン酸お
よび４つの天然タイプのヌクレオシド三リン酸を使用す
る場合が特に好ましい。
【００２３】修飾形態でも使用される非修飾ヌクレオシ
ド三リン酸の量は、このタイプのヌクレオシド三リン酸
の合計量がほぼ同一のままであるように、使用される修
飾ヌクレオシド三リン酸の量によって減少されるのが好
ましい。異なるタイプのモノヌクレオシド三リン酸の量
は、各々の場合ほぼ同一であり、当業者には公知である
。例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２と同
様の延長において、好ましくは１００μＭ〜３００μＭ
、特に好ましくは約２００μＭである。
ド三リン酸の量は、このタイプのヌクレオシド三リン酸
の合計量がほぼ同一のままであるように、使用される修
飾ヌクレオシド三リン酸の量によって減少されるのが好
ましい。異なるタイプのモノヌクレオシド三リン酸の量
は、各々の場合ほぼ同一であり、当業者には公知である
。例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２と同
様の延長において、好ましくは１００μＭ〜３００μＭ
、特に好ましくは約２００μＭである。
【００２４】以下の本発明の方法の具体例によって、少
なくとも１つの検出可能な基および固定を可能にさせる
２つまたはそれ以上の基を含有し、鋳型核酸に対して少
なくとも部分的に相補的である核酸を製造することがで
きる。
なくとも１つの検出可能な基および固定を可能にさせる
２つまたはそれ以上の基を含有し、鋳型核酸に対して少
なくとも部分的に相補的である核酸を製造することがで
きる。
【００２５】少なくとも１つの検出可能な基を含有する
プライマーおよび固定可能な基を含有する１つのタイプ
のヌクレオシド三リン酸の使用。この場合、プライマー
は、さらに１つまたは数個の固定可能な基を含有するこ
とができ、さらに検出可能な基を含有する１つのタイプ
のヌクレオシド三リン酸を使用することができる。しか
しながら、プライマーがさらなる検出可能な基を有して
いない具体例が好ましい。
プライマーおよび固定可能な基を含有する１つのタイプ
のヌクレオシド三リン酸の使用。この場合、プライマー
は、さらに１つまたは数個の固定可能な基を含有するこ
とができ、さらに検出可能な基を含有する１つのタイプ
のヌクレオシド三リン酸を使用することができる。しか
しながら、プライマーがさらなる検出可能な基を有して
いない具体例が好ましい。
【００２６】少なくとも１つの固定可能な基を含有する
プライマーおよび検出可能な基を含有するヌクレオシド
三リン酸、ならびに固定可能な基を含有するヌクレオシ
ド三リン酸の使用。この場合も、プライマーは、さらに
検出可能な基を含有することができる。
プライマーおよび検出可能な基を含有するヌクレオシド
三リン酸、ならびに固定可能な基を含有するヌクレオシ
ド三リン酸の使用。この場合も、プライマーは、さらに
検出可能な基を含有することができる。
【００２７】１以上の固定可能な基を含有するプライマ
ーおよび検出可能な基を含有するヌクレオシド三リン酸
の使用。さらに、固定可能な基を含有するヌクレオシド
三リン酸を使用することもできる。
ーおよび検出可能な基を含有するヌクレオシド三リン酸
の使用。さらに、固定可能な基を含有するヌクレオシド
三リン酸を使用することもできる。
【００２８】固定可能な基または検出可能な基を含有し
ないプライマーおよび検出可能な基を含有するモノヌク
レオシド三リン酸ならびに固定可能な基を含有するモノ
ヌクレオシド三リン酸の使用。この条件は、この場合に
プライマーの修飾に関する反応が省略されるので好まし
い。さらに、検出可能なモノヌクレオチドおよび固定可
能なモノヌクレオチドの一体化によって、形成された核
酸は、確実に、多数の固定可能な基および少なくとも１
つの検出可能な基を含有する。この変形の別の長所は、
未反応プライマーと形成された核酸との分離が非常に容
易であることである。
ないプライマーおよび検出可能な基を含有するモノヌク
レオシド三リン酸ならびに固定可能な基を含有するモノ
ヌクレオシド三リン酸の使用。この条件は、この場合に
プライマーの修飾に関する反応が省略されるので好まし
い。さらに、検出可能なモノヌクレオチドおよび固定可
能なモノヌクレオチドの一体化によって、形成された核
酸は、確実に、多数の固定可能な基および少なくとも１
つの検出可能な基を含有する。この変形の別の長所は、
未反応プライマーと形成された核酸との分離が非常に容
易であることである。
【００２９】酵素は、ＤＮＡ−またはＲＮＡ−依存性Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ活性を呈するプライマー
の延長のための酵素として考慮される。熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼが好ましい。これらは、例えば、ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼまたはイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグ
メントを含む。
ＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ活性を呈するプライマー
の延長のための酵素として考慮される。熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼが好ましい。これらは、例えば、ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼまたはイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグ
メントを含む。
【００３０】延長反応は、鋳型核酸の５’末端で終わる
のが好ましい。しかしながら、所望により、停止剤、例
えば停止ヌクレオチドの使用によって早期に中断するこ
とができる。必要な場合、例えばリガーゼ反応を介して
、新しく形成された核酸の片を最終的にプライマーにラ
イゲートする。
のが好ましい。しかしながら、所望により、停止剤、例
えば停止ヌクレオチドの使用によって早期に中断するこ
とができる。必要な場合、例えばリガーゼ反応を介して
、新しく形成された核酸の片を最終的にプライマーにラ
イゲートする。
【００３１】酵素触媒反応によって、修飾および非修飾
モノヌクレオシド三リン酸を使用して、プライマーは、
鋳型核酸の対応する部分に対して相補的である核酸の一
片によって延長される。新しく形成された核酸は、固定
を可能にさせる２つまたはそれ以上の基および１つまた
はそれ以上の検出可能な基を含有している。固定を可能
にさせる２つまたはそれ以上の基が新しく形成された核
酸の鎖に含まれている場合が非常に優れていることが分
かった。特にこのような核酸は、このような基を１つだ
けしか有していない核酸よりも効果的に固定され得る。 これは、新しく形成された核酸のより正確な定量によっ
て鋳型核酸の初期量の定量を容易にする。
モノヌクレオシド三リン酸を使用して、プライマーは、
鋳型核酸の対応する部分に対して相補的である核酸の一
片によって延長される。新しく形成された核酸は、固定
を可能にさせる２つまたはそれ以上の基および１つまた
はそれ以上の検出可能な基を含有している。固定を可能
にさせる２つまたはそれ以上の基が新しく形成された核
酸の鎖に含まれている場合が非常に優れていることが分
かった。特にこのような核酸は、このような基を１つだ
けしか有していない核酸よりも効果的に固定され得る。 これは、新しく形成された核酸のより正確な定量によっ
て鋳型核酸の初期量の定量を容易にする。
【００３２】それぞれ新しく形成された鎖における検出
可能な基の数は、好ましくは１よりも多く、約１５番目
から３０番目のヌクレオチド毎に検出可能な基を有する
場合が特に好ましい。
可能な基の数は、好ましくは１よりも多く、約１５番目
から３０番目のヌクレオチド毎に検出可能な基を有する
場合が特に好ましい。
【００３３】本発明の方法によって、核酸は、例えば、
１００〜８０００ｂｐの長さを有するように製造するこ
とができる。しかしながら、実質的に、延長を行う酵素
系によってのみ限定される。
１００〜８０００ｂｐの長さを有するように製造するこ
とができる。しかしながら、実質的に、延長を行う酵素
系によってのみ限定される。
【００３４】増幅生成物のさらなる適用によって、ポリ
メラーゼを、例えば、フェノール化（ｐｈｅｎｏｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）によって精製し得る。唯一の分析がサザー
ンブロット、ドットブロットによるかまたはＭＴＰにお
ける場合、これは必要ではない。
メラーゼを、例えば、フェノール化（ｐｈｅｎｏｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）によって精製し得る。唯一の分析がサザー
ンブロット、ドットブロットによるかまたはＭＴＰにお
ける場合、これは必要ではない。
【００３５】新しく形成された核酸は、好ましくは、親
和性物質上でのゲルクロマトグラフィーによって、ある
いは沈澱によって、未反応モノヌクレオシド三リン酸お
よびプライマーから二本鎖または一本鎖に分離される。 これに関して、固定可能な基によって修飾されていない
プライマーを使用する本発明方法は、非修飾プライマー
から新しく形成された核酸の分離が、固定可能な基を結
合する固相上で特に簡単であるので、とりわけ優れてい
る。
和性物質上でのゲルクロマトグラフィーによって、ある
いは沈澱によって、未反応モノヌクレオシド三リン酸お
よびプライマーから二本鎖または一本鎖に分離される。 これに関して、固定可能な基によって修飾されていない
プライマーを使用する本発明方法は、非修飾プライマー
から新しく形成された核酸の分離が、固定可能な基を結
合する固相上で特に簡単であるので、とりわけ優れてい
る。
【００３６】形成された核酸は、所望により、例えば二
本鎖を変性させることによって、または置換反応によっ
て鋳型核酸と分離することができる。新しく形成された
核酸は、さらなる反応、例えば欧州特許出願ＥＰ−Ａ−
０３００７９６におけるような制限酵素による切断にお
いて加えることができる。該核酸は、それ自体を、上記
本発明方法における核酸の形成のための鋳型核酸として
使用することもできる；これら核酸はそれらに対して少
なくとも部分的に相補的であり、元の鋳型核酸と相同的
である。新しく形成された核酸によってハイブリダイズ
することができるプライマーを、鋳型核酸に対して相補
的なヌクレオチド配列の代わりにプライマーとして使用
しなければならない。他の点においては、上記条件を満
足しなければならない。元の鋳型核酸も新しい核酸の形
成のための鋳型として再度利用可能であるので、これに
よって、各々の核酸が本発明方法で使用される場合、両
方の新しく形成された核酸鎖が少なくともほぼ指数的に
増加される。これは、個々の温度または／および試薬サ
イクル中に生じ得るかまたは均質に等しくすることがで
きる。該反応は、原則的には、停止剤（例えばＥＤＴＡ
）の添加によって任意の時間で停止され得る。さらに、
欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２０１１８４と同様に数時間
後にいわゆる“集合した（ｎｅｓｔｅｄ）”プライマー
を使用するように、本発明方法を変形することができる
。このときから、生成された核酸配列の一部分だけで増
幅される。
本鎖を変性させることによって、または置換反応によっ
て鋳型核酸と分離することができる。新しく形成された
核酸は、さらなる反応、例えば欧州特許出願ＥＰ−Ａ−
０３００７９６におけるような制限酵素による切断にお
いて加えることができる。該核酸は、それ自体を、上記
本発明方法における核酸の形成のための鋳型核酸として
使用することもできる；これら核酸はそれらに対して少
なくとも部分的に相補的であり、元の鋳型核酸と相同的
である。新しく形成された核酸によってハイブリダイズ
することができるプライマーを、鋳型核酸に対して相補
的なヌクレオチド配列の代わりにプライマーとして使用
しなければならない。他の点においては、上記条件を満
足しなければならない。元の鋳型核酸も新しい核酸の形
成のための鋳型として再度利用可能であるので、これに
よって、各々の核酸が本発明方法で使用される場合、両
方の新しく形成された核酸鎖が少なくともほぼ指数的に
増加される。これは、個々の温度または／および試薬サ
イクル中に生じ得るかまたは均質に等しくすることがで
きる。該反応は、原則的には、停止剤（例えばＥＤＴＡ
）の添加によって任意の時間で停止され得る。さらに、
欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２０１１８４と同様に数時間
後にいわゆる“集合した（ｎｅｓｔｅｄ）”プライマー
を使用するように、本発明方法を変形することができる
。このときから、生成された核酸配列の一部分だけで増
幅される。
【００３７】本発明方法は、一体化に利用可能である固
定を可能にさせるヌクレオシド三リン酸の量が最終反応
サイクルにおいて制限するように行うこともできる。こ
れは、該反応において非一体化ビオヌクレオチドを多量
に消費し、したがって、ＳＡ結合部位を生体標識増幅生
成物とそれ以上競合しないという長所を有している。し
たがって、非一体化ヌクレオチドの予備分離（カラムま
たは沈澱）がもはや必要ではない。
定を可能にさせるヌクレオシド三リン酸の量が最終反応
サイクルにおいて制限するように行うこともできる。こ
れは、該反応において非一体化ビオヌクレオチドを多量
に消費し、したがって、ＳＡ結合部位を生体標識増幅生
成物とそれ以上競合しないという長所を有している。し
たがって、非一体化ヌクレオチドの予備分離（カラムま
たは沈澱）がもはや必要ではない。
【００３８】核酸またはそのフラグメントは、例えば欧
州特許出願ＥＰ−Ａ−０３１０２２９、欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−０３００７９６、国際出願公開ＷＯ８８／１０
３１５、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２０１１８４、欧州
特許出願ＥＰ−Ａ−０３２９８２２、欧州特許出願ＥＰ
−Ａ−０２７２０９８または欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０
３０３１５５のような核酸増幅反応の結果として形成す
るもののような本発明方法に関する鋳型核酸としても使
用することができる。これらの場合、本発明方法に従っ
て延長反応を一度行うだけで、本発明に従って修飾され
た核酸を多量に生成することができる。
州特許出願ＥＰ−Ａ−０３１０２２９、欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−０３００７９６、国際出願公開ＷＯ８８／１０
３１５、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２０１１８４、欧州
特許出願ＥＰ−Ａ−０３２９８２２、欧州特許出願ＥＰ
−Ａ−０２７２０９８または欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０
３０３１５５のような核酸増幅反応の結果として形成す
るもののような本発明方法に関する鋳型核酸としても使
用することができる。これらの場合、本発明方法に従っ
て延長反応を一度行うだけで、本発明に従って修飾され
た核酸を多量に生成することができる。
【００３９】ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（固定可能、リ
アリーら（Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．）、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ） ８０、４０４５−４９（１９８３）
）およびジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（検出可能）
のような別々に標識された２つのモノヌクレオシド三リ
ン酸を用いて欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２０１１８４に
従って行われる方法は、本発明方法の特に好ましい具体
例である。
アリーら（Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．）、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ） ８０、４０４５−４９（１９８３）
）およびジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（検出可能）
のような別々に標識された２つのモノヌクレオシド三リ
ン酸を用いて欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２０１１８４に
従って行われる方法は、本発明方法の特に好ましい具体
例である。
【００４０】以下の実験条件が、特に好都合であること
が証明された。反応の量：５０〜１００μｌ；標識プラ
イマーの濃度：２００ｎＭ〜１μＭ；ｄＮＴＰタイプの
合計濃度：１００〜３００μＭ；ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ：１〜３Ｕまたは他の熱安定性ポリメラーゼ；緩
衝液：３０〜１００ｍＭ ＫＣｌ；５〜２０ｎＭトリス
（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ８．２〜８．７ ａｔ ｒｔ；０．
５〜２ｍＭ ＭｇＣｌ２；所望によりゼラチンまたはヌ
クレアーゼ−遊離ＢＳＡのような安定化剤；ＰＣＲサイ
クル：２０〜６０、好ましくは２０〜３０；変性：開始
２〜１０分前、９２〜９５℃（所望により；非常に複雑
なＤＮＡの場合）、ＰＣＲ １〜５分間、９２〜９５℃
；プライマーハイブリダイゼーション１〜５分、３５〜
５５℃、延長：１〜１０分、６５〜７５℃、好ましくは
３分、ＰＣＲの末端で形成された核酸から非一体化ｄＮ
ＴＰ’ｓおよびプライマー分子の分離：セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ ７５またはＧ １００（フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））またはストレプタ
ビジン固相（例えばドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３８１７
７１６に従って）。第１サイクルから修飾ｄＮＴＰ’ｓ
をすでに添加することもでき、最後の３〜５サイクルで
最初に添加してもよい。後者の方法は、ｂｉｏ−ｄＵＴ
Ｐを制限量で添加する場合に推奨される。各一本鎖に関
して互いに対する特定のプライマーの量の比は、約１：
１であるのが好ましい。ｄｉｇ−ｄＵＴＰ：ｂｉｏ−ｄ
ＵＴＰ：ｄＴＴＰの比は、３：３：１〜１：１：３であ
り、好ましくは１：１：２〜１：１：１である。ｄｉｇ
−ｄＵＴＰ（またはｂｉｏ−ｄＵＴＰ）：ｄＴＴＰ（修
飾プライマーを使用する場合）の比は、３：１〜１：３
、好ましくは１：２である。
が証明された。反応の量：５０〜１００μｌ；標識プラ
イマーの濃度：２００ｎＭ〜１μＭ；ｄＮＴＰタイプの
合計濃度：１００〜３００μＭ；ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ：１〜３Ｕまたは他の熱安定性ポリメラーゼ；緩
衝液：３０〜１００ｍＭ ＫＣｌ；５〜２０ｎＭトリス
（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ８．２〜８．７ ａｔ ｒｔ；０．
５〜２ｍＭ ＭｇＣｌ２；所望によりゼラチンまたはヌ
クレアーゼ−遊離ＢＳＡのような安定化剤；ＰＣＲサイ
クル：２０〜６０、好ましくは２０〜３０；変性：開始
２〜１０分前、９２〜９５℃（所望により；非常に複雑
なＤＮＡの場合）、ＰＣＲ １〜５分間、９２〜９５℃
；プライマーハイブリダイゼーション１〜５分、３５〜
５５℃、延長：１〜１０分、６５〜７５℃、好ましくは
３分、ＰＣＲの末端で形成された核酸から非一体化ｄＮ
ＴＰ’ｓおよびプライマー分子の分離：セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ ７５またはＧ １００（フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））またはストレプタ
ビジン固相（例えばドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−３８１７
７１６に従って）。第１サイクルから修飾ｄＮＴＰ’ｓ
をすでに添加することもでき、最後の３〜５サイクルで
最初に添加してもよい。後者の方法は、ｂｉｏ−ｄＵＴ
Ｐを制限量で添加する場合に推奨される。各一本鎖に関
して互いに対する特定のプライマーの量の比は、約１：
１であるのが好ましい。ｄｉｇ−ｄＵＴＰ：ｂｉｏ−ｄ
ＵＴＰ：ｄＴＴＰの比は、３：３：１〜１：１：３であ
り、好ましくは１：１：２〜１：１：１である。ｄｉｇ
−ｄＵＴＰ（またはｂｉｏ−ｄＵＴＰ）：ｄＴＴＰ（修
飾プライマーを使用する場合）の比は、３：１〜１：３
、好ましくは１：２である。
【００４１】上記の値は、おおよその値である。これら
から逸脱する条件が個々の場合に可能である場合も当業
者はすぐに認識することができる。
から逸脱する条件が個々の場合に可能である場合も当業
者はすぐに認識することができる。
【００４２】本発明によって、期待されたよりも良く固
定され得る核酸を製造することができ、簡単な方法で定
量的に検出することができるという長所を有することは
驚くことである。
定され得る核酸を製造することができ、簡単な方法で定
量的に検出することができるという長所を有することは
驚くことである。
【００４３】これらの長所は、核酸の検出方法にとりわ
け良く適用され得る。したがって、本発明は、検出しよ
うとする核酸の鎖の少なくとも一部分に対して相補的で
ある鎖を形成し、形成された核酸を固相に結合させ、形
成された核酸を検出することによる核酸の検出方法であ
って、該相補的鎖が、鋳型核酸として検出しようとする
核酸を使用して、少なくとも１つのプライマーを鋳型核
酸にハイブリダイズし、異なるタイプの、好ましくは少
なくとも４つのタイプのモノヌクレオチドと反応させる
ことによって、プライマーを鋳型核酸に対して本質的に
相補的である核酸鎖に酵素的に延長させることによって
形成され、該相補的核酸鎖が固定を可能にさせる２つま
たはそれ以上の基および１つまたはそれ以上の検出可能
な基を担持していることを特徴とする検出方法を提供す
るものでもある。
け良く適用され得る。したがって、本発明は、検出しよ
うとする核酸の鎖の少なくとも一部分に対して相補的で
ある鎖を形成し、形成された核酸を固相に結合させ、形
成された核酸を検出することによる核酸の検出方法であ
って、該相補的鎖が、鋳型核酸として検出しようとする
核酸を使用して、少なくとも１つのプライマーを鋳型核
酸にハイブリダイズし、異なるタイプの、好ましくは少
なくとも４つのタイプのモノヌクレオチドと反応させる
ことによって、プライマーを鋳型核酸に対して本質的に
相補的である核酸鎖に酵素的に延長させることによって
形成され、該相補的核酸鎖が固定を可能にさせる２つま
たはそれ以上の基および１つまたはそれ以上の検出可能
な基を担持していることを特徴とする検出方法を提供す
るものでもある。
【００４４】この製造方法において、所望により前処理
されているかまたは例えば上記のように増幅されている
検出しようとする核酸またはその一部分は、本発明の製
造方法の鋳型核酸としての役目をする。
されているかまたは例えば上記のように増幅されている
検出しようとする核酸またはその一部分は、本発明の製
造方法の鋳型核酸としての役目をする。
【００４５】該製造方法の結果として形成される核酸鎖
は、その後、非常に簡単な手段で検出され得る。これに
関して、二本鎖は、所望により一本鎖に開裂され得る。 形成される２倍の修飾核酸は、例えばゲルクロマトグラ
フィーによって検出することができる。しかしながら、
適切な固相と接触させ、そこに固定させるのが好ましい
。
は、その後、非常に簡単な手段で検出され得る。これに
関して、二本鎖は、所望により一本鎖に開裂され得る。 形成される２倍の修飾核酸は、例えばゲルクロマトグラ
フィーによって検出することができる。しかしながら、
適切な固相と接触させ、そこに固定させるのが好ましい
。
【００４６】固相のタイプは、固定を可能にさせる基に
依存する。固定可能な基が例えばハプテンである場合、
表面上にこのハプテンに対する抗体を有する固相を用い
ることができる。固定可能な基が例えばビオチンのよう
なビタミンである場合、固相は、アビジンまたはストレ
プタビジンのような固定結合蛋白を含むことができる。 修飾核酸上の基を介する固定は、例えばハイブリダイゼ
ーション反応よりも緩やかな条件下で行うことができる
ので、特に優れている。
依存する。固定可能な基が例えばハプテンである場合、
表面上にこのハプテンに対する抗体を有する固相を用い
ることができる。固定可能な基が例えばビオチンのよう
なビタミンである場合、固相は、アビジンまたはストレ
プタビジンのような固定結合蛋白を含むことができる。 修飾核酸上の基を介する固定は、例えばハイブリダイゼ
ーション反応よりも緩やかな条件下で行うことができる
ので、特に優れている。
【００４７】形成される核酸を固定するために、核酸の
製造工程の完了後、容器に反応混合物を充填し、該容器
の表面上で固定可能な基と反応することができるのが好
ましい。該容器は例えばキュベットまたは微量滴定プレ
ートであり得る。しかしながら、反応混合物を負荷する
膜、ティッシュまたはパッドのような多孔性物質の形態
の固相を使用することも可能である。いわゆるビーズの
使用も可能である。
製造工程の完了後、容器に反応混合物を充填し、該容器
の表面上で固定可能な基と反応することができるのが好
ましい。該容器は例えばキュベットまたは微量滴定プレ
ートであり得る。しかしながら、反応混合物を負荷する
膜、ティッシュまたはパッドのような多孔性物質の形態
の固相を使用することも可能である。いわゆるビーズの
使用も可能である。
【００４８】固定反応を生じるインキュベーション期間
の後、容器、多孔性物質またはペレット化ビーズから液
相を除去する。その後、固相への本発明核酸の結合が非
常にしっかりとしているので、固相を適切な緩衝液で洗
浄することができる。
の後、容器、多孔性物質またはペレット化ビーズから液
相を除去する。その後、固相への本発明核酸の結合が非
常にしっかりとしているので、固相を適切な緩衝液で洗
浄することができる。
【００４９】固相に結合した修飾核酸の量は、原則的に
は、公知の方法で測定することができ、これによって行
われなければならない工程は検出可能な基のタイプに依
存する。例えば蛍光標識のような直接検出可能な基の場
合、標識の量は、蛍光分析によって測定される。検出可
能な基がハプテンである場合、修飾核酸を、欧州特許出
願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４において同様に記載されて
いるようにハプテンに対する標識抗体と反応させるのが
好ましい。標識は、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵
素標識であり得る。酵素標識の場合、核酸の量は、通常
、色素物質、化学発光物質または蛍光物質と酵素との反
応を測光的、化学発光的および蛍光分析的にモニターす
ることによって測定される。
は、公知の方法で測定することができ、これによって行
われなければならない工程は検出可能な基のタイプに依
存する。例えば蛍光標識のような直接検出可能な基の場
合、標識の量は、蛍光分析によって測定される。検出可
能な基がハプテンである場合、修飾核酸を、欧州特許出
願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４において同様に記載されて
いるようにハプテンに対する標識抗体と反応させるのが
好ましい。標識は、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵
素標識であり得る。酵素標識の場合、核酸の量は、通常
、色素物質、化学発光物質または蛍光物質と酵素との反
応を測光的、化学発光的および蛍光分析的にモニターす
ることによって測定される。
【００５０】直接検出可能な基の場合、洗浄工程前に、
すでに、反応混合物に必要とされる試薬（例えば、ハプ
テンに対して指向する標識抗体）を添加しておくことも
できる。
すでに、反応混合物に必要とされる試薬（例えば、ハプ
テンに対して指向する標識抗体）を添加しておくことも
できる。
【００５１】核酸の検出は、定性的および定量的に行う
ことができる。定量的な評価の場合、既知の核酸含有量
の試料による少なくとも１つの比較試験を行うのが好都
合であることが分かった。検量線の確立も可能であり、
推奨される。
ことができる。定量的な評価の場合、既知の核酸含有量
の試料による少なくとも１つの比較試験を行うのが好都
合であることが分かった。検量線の確立も可能であり、
推奨される。
【００５２】本発明の検出方法は、欧州特許出願ＥＰ−
Ａ−０２００３６２に開示されている全領域に適用され
得る。該方法は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２２９７０
１およびＥＰ−Ａ−０１３１０５２に従ってウイルスお
よび細菌拮抗剤にも適用され得る。
Ａ−０２００３６２に開示されている全領域に適用され
得る。該方法は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２２９７０
１およびＥＰ−Ａ−０１３１０５２に従ってウイルスお
よび細菌拮抗剤にも適用され得る。
【００５３】本発明の検出方法の特に好ましい具体例は
、新しく形成された核酸の製造方法およびその後の検出
の特に好ましい具体例を包含する。以下の一般的な条件
が検出に特に優れていることが証明された：３７℃で１
〜４時間、ストレプタビジン表面（ドイツ特許出願ＤＥ
−Ａ−３８１７７１６）上で形成された核酸の分離；緩
衝液による洗浄；アルカリホスファターゼによって標識
されたジゴキシゲニンに対する抗体の溶液と一緒にイン
キュベート；緩衝液による洗浄；４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート、０．０５〜０．２Ｍと一緒にイン
キュベート；蛍光分析器で測定；検量線と比較。
、新しく形成された核酸の製造方法およびその後の検出
の特に好ましい具体例を包含する。以下の一般的な条件
が検出に特に優れていることが証明された：３７℃で１
〜４時間、ストレプタビジン表面（ドイツ特許出願ＤＥ
−Ａ−３８１７７１６）上で形成された核酸の分離；緩
衝液による洗浄；アルカリホスファターゼによって標識
されたジゴキシゲニンに対する抗体の溶液と一緒にイン
キュベート；緩衝液による洗浄；４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート、０．０５〜０．２Ｍと一緒にイン
キュベート；蛍光分析器で測定；検量線と比較。
【００５４】本発明は、核酸鎖中に、１またはそれ以上
の検出可能な基および固定を可能にする２またはそれ以
上の基を有することを特徴とする一本鎖または二本鎖核
酸を提供するものでもある。これらの修飾核酸は、例え
ば、これらが適切な固相上に非常にしっかりと固定され
ることが可能であるという長所を有している。これらは
、本発明の手段で鋳型核酸を用いて製造することができ
る。しかしながら、これらは、他の方法で、例えば、対
応するモノヌクレオシド三リン酸（固定可能な基および
検出可能な基）を使用する場合にドイツ特許出願ＤＥ−
Ａ−３７２６９３４と同様に転写によって、製造するこ
ともできる。これに関しては、しばしば、プライマーを
必要としない。
の検出可能な基および固定を可能にする２またはそれ以
上の基を有することを特徴とする一本鎖または二本鎖核
酸を提供するものでもある。これらの修飾核酸は、例え
ば、これらが適切な固相上に非常にしっかりと固定され
ることが可能であるという長所を有している。これらは
、本発明の手段で鋳型核酸を用いて製造することができ
る。しかしながら、これらは、他の方法で、例えば、対
応するモノヌクレオシド三リン酸（固定可能な基および
検出可能な基）を使用する場合にドイツ特許出願ＤＥ−
Ａ−３７２６９３４と同様に転写によって、製造するこ
ともできる。これに関しては、しばしば、プライマーを
必要としない。
【００５５】本発明は、核酸の検出のための本発明方法
を行うための試薬キットを提供するものでもある。これ
らの試薬キットのうち１つは、分離容器中に、検出可能
な基を担持している第１モノヌクレオシド三リン酸、固
定を可能にさせる基を担持している第２モノヌクレオシ
ド三リン酸および鋳型核酸および４つのモノヌクレオチ
ドの使用によって鋳型核酸に対して相補的である核酸を
形成することができる酵素を含有する。
を行うための試薬キットを提供するものでもある。これ
らの試薬キットのうち１つは、分離容器中に、検出可能
な基を担持している第１モノヌクレオシド三リン酸、固
定を可能にさせる基を担持している第２モノヌクレオシ
ド三リン酸および鋳型核酸および４つのモノヌクレオチ
ドの使用によって鋳型核酸に対して相補的である核酸を
形成することができる酵素を含有する。
【００５６】さらに、核酸鎖に対して相補的である核酸
に対するプライマーの延長に必要である他の全ての試薬
を含むことが好ましい。これは、特に、核酸に対して特
異的である１つのプライマーまたは検出しようとする核
酸種ならびに他の全てのモノヌクレオシド三リン酸を含
む。さらに、補助物質として、適切なｐＨ緩衝物質、変
性溶液および洗浄溶液を含むことができる。
に対するプライマーの延長に必要である他の全ての試薬
を含むことが好ましい。これは、特に、核酸に対して特
異的である１つのプライマーまたは検出しようとする核
酸種ならびに他の全てのモノヌクレオシド三リン酸を含
む。さらに、補助物質として、適切なｐＨ緩衝物質、変
性溶液および洗浄溶液を含むことができる。
【００５７】制御としてプライマーとハイブリダイズす
ることができる特異的なヌクレオチド配列を含むことも
好ましい。
ることができる特異的なヌクレオチド配列を含むことも
好ましい。
【００５８】所望によって、試薬キットは、検出可能な
基の測定に必要である試薬も含有する。ハプテンを使用
する場合、標識抗体は、例えば、分離容器中に含まれる
。
基の測定に必要である試薬も含有する。ハプテンを使用
する場合、標識抗体は、例えば、分離容器中に含まれる
。
【００５９】他の試薬キットは、分離容器中に、検出し
ようとする核酸に対して本質的に相補的であり、固定を
可能にさせる２つまたはそれ以上の基を担持している少
なくとも１つのプライマー、検出可能な基を担持してい
る少なくとも１つのモノヌクレオシド三リン酸およびプ
ライマーの鋳型核酸および４つのモノヌクレオシドの使
用によって鋳型核酸に対して相補的である核酸を形成す
ることができる酵素を含有する。
ようとする核酸に対して本質的に相補的であり、固定を
可能にさせる２つまたはそれ以上の基を担持している少
なくとも１つのプライマー、検出可能な基を担持してい
る少なくとも１つのモノヌクレオシド三リン酸およびプ
ライマーの鋳型核酸および４つのモノヌクレオシドの使
用によって鋳型核酸に対して相補的である核酸を形成す
ることができる酵素を含有する。
【００６０】プライマーを核酸に延長させるのに必要で
ある他の全ての試薬を含むのも好ましい。この場合、こ
れらは、特に、他のモノヌクレオシド三リン酸を含む。 これらに、該補助剤、制御核酸および基の検出用試薬が
含有されているのも好ましい。
ある他の全ての試薬を含むのも好ましい。この場合、こ
れらは、特に、他のモノヌクレオシド三リン酸を含む。 これらに、該補助剤、制御核酸および基の検出用試薬が
含有されているのも好ましい。
【００６１】図１は、本発明の方法に従って核酸を測定
した結果を示すグラフである。これらの結果は検量線と
して使用することもできる。
した結果を示すグラフである。これらの結果は検量線と
して使用することもできる。
【００６２】以下の実施例によって、本発明をさらに説
明する。
明する。
【００６３】
実施例１
２つの異なる修飾モノヌクレオシド三リン酸とのポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） 欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２に従ってＰ
Ｃ反応を行うためにプラスミドｐＳＰＴ１８ｎｅｏ（鋳
型核酸、ジーン（Ｇｅｎｅ） １９：３２７〜３３６（
１９８２）におけるベックら（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．
）に従って製造した）１０ｎｇ〜１００ａｇの希釈液を
用いた。ｐＳＰＴ１８ｎｅｏは、ｐＳＰＴ １８のＳｍ
ａＩ−ＢａｍＨＩ部位における９４０ｂｐ ＳｍａＩ−
Ｂｇ１Ｉにネオマイシン（ｎｅｏ）の配列を含んでいた
。したがって、特に増幅されたフラグメントは、プラス
ミド希釈液中２．３ｎｇ〜２３ａｇに対応する。このプ
ラスミド中のｎｅｏ配列付近にあるＴ７およびＳＰ６プ
ロモーターに対して特異的なプライマー（ベーリンガー
・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ−ｈｅ
ｉｍ）、オーダー・ナンバー１１７５１２２および９０
２１５２）によって反応を開始した。ＫＣｌ（５０ｍＭ
）；トリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ（ｐＨ８．５、１０ｍＭ
）；ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）；ゼラチン（１００μｇ
／ｍｌ）；ｄＡＴＰ（２００μＭ）；ｄＣＴＰ（２００
μＭ）；ｄＧＴＰ（２００μＭ）；ｄＴＴＰ（１００μ
Ｍ）；ジゴキシゲニン−１１−２’−デオキシウリジン
−５’−ｄＵＴＰ（ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ、欧州特許
出願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４）（５０μｍ）；ビオチ
ン−１６−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフ
ェート（ｂｉｏ−１６−ｄＵＴＰ、ベーリンガー・マン
ハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・
ハフツング、オーダー・ナンバー１０９３０７０）（５
０μＭ）の容量５０μｌで、Ｔ７プロモーターに対して
特異的なプライマー（３００ｎＭ）およびＳＰ６プロモ
ーターに対して特異的なプライマー（３００ｎＭ）と一
緒に、該ｐＳＰＴ１８ｎｅｏ希釈液および２．５Ｕ サ
ーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）−ＤＮＡポリメラーゼを使用して
、３０ ＰＣＲサイクルを行った。
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） 欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２００３６２に従ってＰ
Ｃ反応を行うためにプラスミドｐＳＰＴ１８ｎｅｏ（鋳
型核酸、ジーン（Ｇｅｎｅ） １９：３２７〜３３６（
１９８２）におけるベックら（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．
）に従って製造した）１０ｎｇ〜１００ａｇの希釈液を
用いた。ｐＳＰＴ１８ｎｅｏは、ｐＳＰＴ １８のＳｍ
ａＩ−ＢａｍＨＩ部位における９４０ｂｐ ＳｍａＩ−
Ｂｇ１Ｉにネオマイシン（ｎｅｏ）の配列を含んでいた
。したがって、特に増幅されたフラグメントは、プラス
ミド希釈液中２．３ｎｇ〜２３ａｇに対応する。このプ
ラスミド中のｎｅｏ配列付近にあるＴ７およびＳＰ６プ
ロモーターに対して特異的なプライマー（ベーリンガー
・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ−ｈｅ
ｉｍ）、オーダー・ナンバー１１７５１２２および９０
２１５２）によって反応を開始した。ＫＣｌ（５０ｍＭ
）；トリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ（ｐＨ８．５、１０ｍＭ
）；ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）；ゼラチン（１００μｇ
／ｍｌ）；ｄＡＴＰ（２００μＭ）；ｄＣＴＰ（２００
μＭ）；ｄＧＴＰ（２００μＭ）；ｄＴＴＰ（１００μ
Ｍ）；ジゴキシゲニン−１１−２’−デオキシウリジン
−５’−ｄＵＴＰ（ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ、欧州特許
出願ＥＰ−Ａ−０３２４４７４）（５０μｍ）；ビオチ
ン−１６−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフ
ェート（ｂｉｏ−１６−ｄＵＴＰ、ベーリンガー・マン
ハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・
ハフツング、オーダー・ナンバー１０９３０７０）（５
０μＭ）の容量５０μｌで、Ｔ７プロモーターに対して
特異的なプライマー（３００ｎＭ）およびＳＰ６プロモ
ーターに対して特異的なプライマー（３００ｎＭ）と一
緒に、該ｐＳＰＴ１８ｎｅｏ希釈液および２．５Ｕ サ
ーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）−ＤＮＡポリメラーゼを使用して
、３０ ＰＣＲサイクルを行った。
【００６４】
サイクル：変性：９２℃で２分
プライマーハイブリダイゼーション：４２℃で２分延長
：７５℃で２分
：７５℃で２分
【００６５】熱循環器（ＤＮＡ・サーマル・サイクラー
・パーキン・エルマー・セタス（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ））中でＰＣＲを行った。蒸発から保護するために
反応物をパラフィン３０μｌで覆った。
・パーキン・エルマー・セタス（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ））中でＰＣＲを行った。蒸発から保護するために
反応物をパラフィン３０μｌで覆った。
【００６６】ＰＣ反応後、４Ｍ ＬｉＣｌ ５μｌをＰ
ＣＲ生成物に添加し、−７０℃で３０分間、エタノール
２５０μｌ中で沈澱させ、１５０００ｇで５分間ペレッ
ト化し、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、ト
リス（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）５０μｌに取り、ストレ
プタビジンで被覆した微量滴定プレート中にピペットで
取った。 ビオチン／ジゴキシゲニン−標識分子のストレプタビジ
ン固相への結合を、３７℃で２時間行った。壁結合反応
後、３７℃で２ｘ ＳＳＣで１０分間３回、および３７
℃でコンジュゲート緩衝液（トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５
、１００ｍＭ；ＮａＣｌ０．９％；ＢＳＡ、１％；プル
ロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ） Ｔ６８、０．５％）で
１０分間１回洗浄した。その後、３７℃で３０分間、４
０Ｕ ＜ジゴキシゲニン＞−アルカリホスファターゼコ
ンジュゲート体と一緒にインキュベートし、その後、ト
リス−ＨＣｌ、１００ｍＭ；およびＮａＣｌ、１５０ｍ
Ｍの２００μｌで各々５回洗浄した。最後に、３７℃で
３０分間、４−メチルウンベリフェリルリン酸（０．１
ｍＭ）でインキュベートし、ダイナテック・マイク
ロフルアー・リーダー（ＤｙｎａｔｅｃｈＭｉｃｒｏｆ
ｌｕｏｒ Ｒｅａｄｅｒ）で測定した。
ＣＲ生成物に添加し、−７０℃で３０分間、エタノール
２５０μｌ中で沈澱させ、１５０００ｇで５分間ペレッ
ト化し、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥させ、ト
リス（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）５０μｌに取り、ストレ
プタビジンで被覆した微量滴定プレート中にピペットで
取った。 ビオチン／ジゴキシゲニン−標識分子のストレプタビジ
ン固相への結合を、３７℃で２時間行った。壁結合反応
後、３７℃で２ｘ ＳＳＣで１０分間３回、および３７
℃でコンジュゲート緩衝液（トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５
、１００ｍＭ；ＮａＣｌ０．９％；ＢＳＡ、１％；プル
ロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ） Ｔ６８、０．５％）で
１０分間１回洗浄した。その後、３７℃で３０分間、４
０Ｕ ＜ジゴキシゲニン＞−アルカリホスファターゼコ
ンジュゲート体と一緒にインキュベートし、その後、ト
リス−ＨＣｌ、１００ｍＭ；およびＮａＣｌ、１５０ｍ
Ｍの２００μｌで各々５回洗浄した。最後に、３７℃で
３０分間、４−メチルウンベリフェリルリン酸（０．１
ｍＭ）でインキュベートし、ダイナテック・マイク
ロフルアー・リーダー（ＤｙｎａｔｅｃｈＭｉｃｒｏｆ
ｌｕｏｒ Ｒｅａｄｅｒ）で測定した。
【００６７】図１は、ストレプタビジン管において、各
々の場合に増幅調製物の１／５の検出を示す。蛍光信号
を鋳型核酸の濃度に対してプロットした。１００〜５０
０ｆｇの信号が容易に測定することができた。
々の場合に増幅調製物の１／５の検出を示す。蛍光信号
を鋳型核酸の濃度に対してプロットした。１００〜５０
０ｆｇの信号が容易に測定することができた。
【００６８】
実施例２
数回修飾したプライマーによるＰＣＲ 同一標的
を用いて同一濃度で実施例１に従ってＰＣＲを行った。 ＰＣ反応において、ＫＣｌ、５０ｍＭ；トリス−ＨＣｌ
、ｐＨ８．５、１０ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ；ゼ
ラチン １００μｇ／ｍｌ；ｄＡＴＰ、２００μＭ、ｄ
ＣＴＰ、２００μＭ；ｄＧＴＰ、２００μＭ；ｄＴＴＰ
、１３３μＭ；Ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ、６６μＭ中、
欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２６１２８３に従ってＮ−（
３−（Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルアミノメトキシホス
フィニルオキシ）ヘキシル）−２，２，２−トリフルオ
ロアセトアミド（アメリカ合衆国のバイオシステムズ（
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のアミノリンク（Ａｍｉｎｏｌ
ｉｎｋ）２）で標識されたＴ７プロモーター、５’−（
アミドカプロイル）−ビオチンに対して特異的であるプ
ライマー、３００ｎＭ；およびアミノリンク２によって
標識されたＳＰ６プロモーター、５’−（アミドカプロ
イル）−ビオチンに対して特異的なプライマー、３００
ｎＭと一緒に、実施例１に記載のｐＳＰＴ１８ｎｅｏの
希釈液および２．５Ｕ ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを
用いて、同一のサイクルプロフィルで３０サイクル行っ
た。ＰＣＲの後、反応物を１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
で３００μｌにし、２０００ｒｐｍで５分間、セファデ
ックスＧ７５カラム中で遠心分離し、−７０℃で３０分
間、エタノール７５０μｌ中、溶出液を４Ｍ ＬｉＣｌ
３０μｌで沈澱させ、遠心分離し、実施例１と同様に
再懸濁させた。＜ジゴキシゲニン＞−アルカリホスファ
ターゼコンジュゲート体との検出反応反応は、実施例１
と同様に行った。
を用いて同一濃度で実施例１に従ってＰＣＲを行った。 ＰＣ反応において、ＫＣｌ、５０ｍＭ；トリス−ＨＣｌ
、ｐＨ８．５、１０ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ；ゼ
ラチン １００μｇ／ｍｌ；ｄＡＴＰ、２００μＭ、ｄ
ＣＴＰ、２００μＭ；ｄＧＴＰ、２００μＭ；ｄＴＴＰ
、１３３μＭ；Ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ、６６μＭ中、
欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２６１２８３に従ってＮ−（
３−（Ｎ’，Ｎ’−ジイソプロピルアミノメトキシホス
フィニルオキシ）ヘキシル）−２，２，２−トリフルオ
ロアセトアミド（アメリカ合衆国のバイオシステムズ（
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のアミノリンク（Ａｍｉｎｏｌ
ｉｎｋ）２）で標識されたＴ７プロモーター、５’−（
アミドカプロイル）−ビオチンに対して特異的であるプ
ライマー、３００ｎＭ；およびアミノリンク２によって
標識されたＳＰ６プロモーター、５’−（アミドカプロ
イル）−ビオチンに対して特異的なプライマー、３００
ｎＭと一緒に、実施例１に記載のｐＳＰＴ１８ｎｅｏの
希釈液および２．５Ｕ ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを
用いて、同一のサイクルプロフィルで３０サイクル行っ
た。ＰＣＲの後、反応物を１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５
で３００μｌにし、２０００ｒｐｍで５分間、セファデ
ックスＧ７５カラム中で遠心分離し、−７０℃で３０分
間、エタノール７５０μｌ中、溶出液を４Ｍ ＬｉＣｌ
３０μｌで沈澱させ、遠心分離し、実施例１と同様に
再懸濁させた。＜ジゴキシゲニン＞−アルカリホスファ
ターゼコンジュゲート体との検出反応反応は、実施例１
と同様に行った。
【００６９】
実施例３
ビオチンで数回標識された核酸のストレプタビジン
への結合 鋳型として組換えＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮ
Ａ（０、１、５、１０、２０、４０および８０ｎｇ）を
、検出プローブとしてＨＢＶ−特異性ジゴキシゲニン−
標識オリゴヌクレオチド（４０ヌクレオチド、ジゴキシ
ゲニンは合成の間にジゴキシゲニン分子で標識する）を
、および捕捉プローブとしてビオチンで１回標識された
ＨＢＶ−特異性オリゴヌクレオチド（４０ヌクレオチド
）またはビオチンで数回標識された同一配列のオリゴヌ
クレオチド（８ビオチン分子／オリゴヌクレオチド）を
用いてサンドイッチハイブリダイゼーション実験を行っ
た。ハイブリダイゼーション前に、鋳型ＤＮＡを１００
℃で１０分間変性させ、次いで、すぐ後に氷上に移した
。３７℃で６０分間、ストレプタビジン−被覆管中、合
計容量２００μｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、５
０ｍＭ；２ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ、３００ｍＭ；クエン酸
ナトリウム、３０ｍＭ）；５ｘ デンハート（Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ）溶液（０．１％ポリビニルピロリドン；０．
１％ウシ血清アルブミン；０．１％フィコール （Ｆ
ｉｃｏｌｌ）４００）中、捕捉または検出オリゴヌクレ
オチド各２００ｎｇを該量の組換えＨＢＶ ＤＮＡと一
緒にハイブリダイズした。
への結合 鋳型として組換えＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮ
Ａ（０、１、５、１０、２０、４０および８０ｎｇ）を
、検出プローブとしてＨＢＶ−特異性ジゴキシゲニン−
標識オリゴヌクレオチド（４０ヌクレオチド、ジゴキシ
ゲニンは合成の間にジゴキシゲニン分子で標識する）を
、および捕捉プローブとしてビオチンで１回標識された
ＨＢＶ−特異性オリゴヌクレオチド（４０ヌクレオチド
）またはビオチンで数回標識された同一配列のオリゴヌ
クレオチド（８ビオチン分子／オリゴヌクレオチド）を
用いてサンドイッチハイブリダイゼーション実験を行っ
た。ハイブリダイゼーション前に、鋳型ＤＮＡを１００
℃で１０分間変性させ、次いで、すぐ後に氷上に移した
。３７℃で６０分間、ストレプタビジン−被覆管中、合
計容量２００μｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、５
０ｍＭ；２ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ、３００ｍＭ；クエン酸
ナトリウム、３０ｍＭ）；５ｘ デンハート（Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ）溶液（０．１％ポリビニルピロリドン；０．
１％ウシ血清アルブミン；０．１％フィコール （Ｆ
ｉｃｏｌｌ）４００）中、捕捉または検出オリゴヌクレ
オチド各２００ｎｇを該量の組換えＨＢＶ ＤＮＡと一
緒にハイブリダイズした。
【００７０】その後、３７℃で、ＳＳＣ、２ｘ／ＳＤＳ
、０．２％ ２００μｌで２×１０分間、および３７℃
で、０．９％ＮａＯＨで１×１０分間洗浄した。次に、
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ；ＮａＣｌ
０．９％；ＢＳＡ、１％；プルロニックＴ６８ ０．５
％中、３７℃で、＜ジゴキシゲニン＞−西洋ワサビペオ
キシダーゼコンジュゲート体（１５０ Ｕ／ｍｌ）２０
０μｌと一緒にインキュベートし、０．９％ＮａＣｌで
５回洗浄した。次に、ＡＢＴＳ緩衝液（ＢＭナンバー１
１１２５９７）２００μｌ中、０．１％２，２−アジノ
−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリジンスルホネート（
６）］（ＡＢＴＳ、ＢＭナンバー７５６４０７）と一緒
にインキュベートし、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
、０．２％ ２００μｌで２×１０分間、および３７℃
で、０．９％ＮａＯＨで１×１０分間洗浄した。次に、
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ；ＮａＣｌ
０．９％；ＢＳＡ、１％；プルロニックＴ６８ ０．５
％中、３７℃で、＜ジゴキシゲニン＞−西洋ワサビペオ
キシダーゼコンジュゲート体（１５０ Ｕ／ｍｌ）２０
０μｌと一緒にインキュベートし、０．９％ＮａＣｌで
５回洗浄した。次に、ＡＢＴＳ緩衝液（ＢＭナンバー１
１１２５９７）２００μｌ中、０．１％２，２−アジノ
−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリジンスルホネート（
６）］（ＡＢＴＳ、ＢＭナンバー７５６４０７）と一緒
にインキュベートし、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【００７１】測定可能な吸光度（すなわち、存在するス
トレプタビジン−結合サンドイッチ分子の数）は、増殖
−標識した捕捉プローブを使用すると（他の条件は完全
に同一である）高いことが第１表において分かる。これ
は、ビオチンで数回標識した分子の効果的な結合に関す
る指標である。
第１表 ＨＢＶ鋳型 オリゴ−捕
捉プローブ オリゴ−捕捉プローブ
（ｎｇ） １ビオチン分子の吸
光度 ８ビオチン分子の吸光度
０ １２１
１１３
１ １２６
１３５
５ １３５
１４８
１０ １４６
１８０
２０ １７９
２３２
４０ ２３１
３３２
８０ ３１９
６７２
トレプタビジン−結合サンドイッチ分子の数）は、増殖
−標識した捕捉プローブを使用すると（他の条件は完全
に同一である）高いことが第１表において分かる。これ
は、ビオチンで数回標識した分子の効果的な結合に関す
る指標である。
第１表 ＨＢＶ鋳型 オリゴ−捕
捉プローブ オリゴ−捕捉プローブ
（ｎｇ） １ビオチン分子の吸
光度 ８ビオチン分子の吸光度
０ １２１
１１３
１ １２６
１３５
５ １３５
１４８
１０ １４６
１８０
２０ １７９
２３２
４０ ２３１
３３２
８０ ３１９
６７２
【図１】 本発明の方法に従って核酸を測定した結果
を示すグラフ。
を示すグラフ。
Claims (11)
- 【請求項１】 少なくとも１つのプライマーを鋳型核
酸にハイブリダイズし、異なるタイプのモノヌクレオチ
ドと反応させることによって、該プライマーを鋳型核酸
に対して相補的である核酸鎖に酵素的に延長させること
による核酸の製造方法であって、該相補的核酸鎖が固定
を可能にさせる２つまたはそれ以上の基および１つまた
はそれ以上の検出可能な基を担持していることを特徴と
する製造方法。 - 【請求項２】 少なくとも１つのタイプのモノヌクレ
オチドが検出可能な基を担持しており、同一または少な
くとも１つの異なるタイプのモノヌクレオチドが固定を
可能にさせる基を担持している請求項１記載の製造方法
。 - 【請求項３】 プライマーが固定を可能にさせる１つ
または数個の基を担持していることを特徴とする請求項
１または２記載の製造方法。 - 【請求項４】 プライマーが少なくとも２つの固定可
能な基を担持しており、１つのタイプのモノヌクレオチ
ドが検出可能な基を担持している請求項１記載の製造方
法。 - 【請求項５】 製造された核酸および元の鋳型核酸を
別の核酸の形成のための鋳型核酸として使用される請求
項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。 - 【請求項６】 検出しようとする核酸の鎖の少なくと
も一部分に対して相補的である鎖を形成し、形成された
核酸を固相に結合させ、形成された核酸を検出すること
による核酸の検出方法であって、該相補的鎖が、鋳型核
酸として検出しようとする核酸を使用して、少なくとも
１つのプライマーを鋳型核酸にハイブリダイズし、異な
るタイプのモノヌクレオチドと反応させることによって
、プライマーを鋳型核酸に対して本質的に相補的である
核酸鎖に酵素的に延長させることによって形成され、該
相補的核酸鎖が固定を可能にさせる２つまたはそれ以上
の基および１つまたはそれ以上の検出可能な基を担持し
ていることを特徴とする検出方法。 - 【請求項７】 検出可能な基を担持しているモノヌク
レオシド三リン酸および固定を可能にする基を担持して
いるモノヌクレオシド三リン酸を含んでいる核酸製造用
試薬。 - 【請求項８】 分離容器中に、検出可能な基を担持し
ている第１モノヌクレオシド三リン酸、固定を可能にさ
せる基を担持している第２モノヌクレオシド三リン酸、
および鋳型核酸および４つのモノヌクレオチドの使用に
よって鋳型核酸に対して相補的である核酸を形成するこ
とができる酵素を含有していることを特徴とする核酸検
出用試薬キット。 - 【請求項９】 分離容器中に、検出しようとする核酸
に対して本質的に相補的であり、固定を可能にさせる２
つまたはそれ以上の基を担持している少なくとも１つの
プライマー、検出可能な基を担持している少なくとも１
つのモノヌクレオシド三リン酸、およびプライマーの鋳
型核酸および４つのモノヌクレオチドの使用によって鋳
型核酸に対して相補的である核酸を形成することができ
る酵素を含有していることを特徴とする核酸検出用試薬
キット。 - 【請求項１０】 さらに制御核酸を含有してなる請求
項８または９記載の試薬キット。 - 【請求項１１】 １つの核酸鎖において１つまたは数
個の検出可能な基および１つの核酸鎖において固定を可
能にさせる２つまたはそれ以上の基を有することを特徴
とする一本鎖または二本鎖核酸。
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