DE4301693A1 - Verfahren zur Amplifikation und Verfahren zum Nachweis von Polynucleotidsequenzen an fester Phase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidsequenz und insbesondere ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure- bzw. Polynucleotid­ sequenz an fester Phase, bei dem das Verfahren zur Amplifika­ tion der Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidsequenz verwendet wird.

In der Vergangenheit sind zahlreiche Verfahren entwickelt wor­ den, um eine spezifische Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidse­ quenz künstlich bzw. in-vitro zu amplifizieren. Als erstes und inzwischen weitverbreitetes Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz in-vitro wurde die Polymerase-Kettenreak­ tion (engl. "polymerase chain reaction", im folgenden abge­ kürzt durch PCR), entwickelt, die beschrieben ist US-A 4 683 202 und US-A 4 683 195. Bei der PCR wird eine definierte DNA- Sequenz mittels zweier flankierender Polynucleotid-Primer, die jeweils so an einen terminalen Sequenzbereich der komplementä­ ren DNA-Stränge der definierten DNA-Sequenz binden, daß die 3′-Enden der Primer zueinandergerichtet sind, und auf diese Weise eine gegenläufige DNA-Polymerase-abhängige Synthese neue komplementärer DNA-Stränge ablaufen, um über einen häufig wie­ derholten Reaktionszyklus, der die Schritte DNA-Denaturierung, Primer-Bindung ("annealing") und Polymerisation umfaßt, die definierte DNA-Sequenz exponentiell zu amplifizieren. Auf diese Weise können Polynucleotidsequenzen bis zu einer Länge von etwa 6000 Basen (bei einzelsträngig vorliegenden Nuclein­ säuren) oder Basenpaaren (bei doppelsträngig vorliegenden Nucleinsäuren), amplifiziert werden, wobei auch von einer ein­ zigen oder wenigen Kopien der Nucleinsäure ausgegangen werden kann. Da ein RNA-Molekül durch die Reverse Transcriptase-Reak­ tion in ein DNA-Molekül umgewandelt werden kann, kann die Nucleinsäureprobe für die PCR ursprünglich auch als RNA vor­ liegen.

Neben der PCR haben sich noch andere Verfahren zur Amplifika­ tion von Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidsequenzen herausge­ bildet, wie das auf Transkription basierende Amplifikationssy­ stem (abgekürzt TAS, siehe D.Y. Kwo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, Seiten 1173 bis 1177 (1989)), das nach retroviralem Replikationsmuster ablaufende "Sequenz-Replikationssystem" (abgekürzt 3SR, siehe JP.C. Gua­ telli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, Seiten 1874 bis 1878 (1990)) und das Q-beta Replicase- System (siehe F.R. Kramer und P.M. Lizadi, Nature 339, Seiten 401 bis 402 (1989)).

Die Reaktionen dieser bekannten Amplifikationsverfahren finden üblicherweise in flüssigem Medium statt. Dies hat den Nach­ teil, daß für die Verfügbarkeit der amplifizierten Polynucleo­ tidsequenz für weitere Anwendungen das Amplifikationsprodukt durch aufwendige Verfahrensschritte, z. B. durch chromatogra­ phische Verfahren oder durch elektrophoretische Trennverfah­ ren, gewonnen und ggf. gereinigt werden muß.

Für viele Anwendungsbereiche, in denen eine Amplifikation einer definierten Polynucleotidsequenz gewünscht oder erfor­ derlich ist, insbesondere zum Nachweis einer spezifischen Po­ lynucleotidsequenz, besteht das Bedürfnis, ein Verfahren, wel­ ches die Amplifikation einer Polynucleotidsequenz umfaßt, we­ sentlich zu vereinfachen.

Es ist daher Aufgabe vorliegender Erfindung, ein Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz zur Verfügung zu stellen, bei dem die amplifizierte Polynucleotidsequenz ohne weitere Schritte aus dem Ansatz zur Amplifikation gewonnen werden kann und die so gewonnene, amplifizierte Polynucleotid­ sequenz leicht weiteren Anwendungen, insbesondere einer Nach­ weisbestimmung, zugänglich ist.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Polynucleotidsequenz in Gegenwart eines Kunststoff-Trägers amplifiziert wird, wobei mindestens ein Teil der mit der Polynucleotidsequenz in Kon­ takt tretenden Oberfläche des Kunststoff-Trägers aktiviert wurde durch Erhöhung des Oberflächeninhalts, so daß die ampli­ fizierten Polynucleotide an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers gebunden werden.

Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz an fe­ ster Phase, bei dem die Polynucleotidsequenz nach dem oben ge­ nannten Verfahren amplifiziert und an den Kunststoff-Träger als feste Phase gebunden wird, und die amplifizierte Poly­ nucleotidsequenz anschließend bestimmt wird.

Vorteilhafte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation und das Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz vorzugsweise ausgeführt wird.

Fig. 1A stellt eine schematische Draufsicht, und Fig. 1B stellt einen schematischen Querschnitt entlang der Linie 2-2 aus Fig. 1A der Vorrichtung dar.

Zur Amplifikation einer Nucleinsäure- bzw. Polynucleotidse­ quenz kann irgendeine Technik verwendet werden, bei der die Polynucleotidsequenz vervielfältigt bzw. reproduziert wird. Geeignet sind beispielsweise die Amplifikationssysteme TAS, 3SR und das Q-beta Replikase-System, insbesondere jedoch die PCR, wie sie oben genannt sind und mit Quellennachweis angege­ ben wurden.

In den Amplifikationsreaktionen, welche Schritte unter Bedingungen erhöhter Temperatur durchlaufen, werden vorzugs­ weise thermostabile Reaktionskomponenten verwendet, wie zum Beispiel thermostabile DNA-Polymerasen für die PCR, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Geeignet sind bei­ spielsweise die thermostabilen DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, Thermus flavis oder Thermococcus litoralis. Die für die Amplifikationsreaktionen erforderlichen Enzyme müssen nicht von Enzymisolierungen stammen, sondern können auch klo­ nierten Ursprungs sein.

Einen Überblick über neuere Entwicklungen und die Reaktionsbe­ dingungen für die PCR werden z. B. gegeben in: H.A. Erlich, R. Gibbs und H.H. Kazazian: "Polymerase Chain Reaction", in "Current Communications in Molecular Biology", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), sowie in: T. Maniatis et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988).

Es können jegliche Arten von Nucleinsäure- bzw. Polynucleotid­ sequenzen gemäß Erfindung amplifiziert werden, wie doppel­ strängige und einzelsträngige DNA und RNA. Die zu amplifizie­ rende Polynucleotidsequenz kann selbst Teil einer längeren Po­ lynucleotidsequenz sein, beispielsweise Teil eines Gens, einer regulatorischen Sequenz, einer viralen oder bakteriellen DNA- oder RNA-Sequenz, einer Boten-RNA (m-RNA) oder eines Plasmids.

Der Reaktionsansatz zur Amplifikation einer gewünschten Poly­ nucleotidsequenz wird in einem wäßrigen Medium, welches die für die entsprechende Amplifikationsreaktion erforderlichen Zusätze enthält, mit einem Kunststoff-Träger in Kontakt ge­ bracht, wobei mindestens ein Teil der mit dem Amplifikations­ ansatz in Kontakt tretenden Oberfläche des Kunststoff-Trägers in aktiviertem Zustand vorliegt.

Aktivierung bedeutet, daß der Oberflächeninhalt im aktivierten Oberflächenbereich des Kunststoff-Trägers erhöht worden ist, oder mit anderen Worten, daß die tatsächliche Oberfläche bzw. Ist-Oberfläche gegenüber der die Mantelfläche (die Einhüllende des Oberflächenprofils) des Kunststoff-Trägers vergrößert wurde. Die Aktivierung kann durch mechanische oder chemische Mittel bewirkt werden. Ausführliche Erläuterungen zu der Art des zu verwendenden Kunststoff-Trägers sowie zu dessen Akti­ vierung werden in den anhängigen PCT-Anmeldungen PCT/EP 92/02256 (Anmeldetag: 8. Oktober 1992) und PCT/EP 92/02432 (Anmeldetag: 23. Oktober 1992) gegeben, deren Beschreibungen als Teil der Offenbarung vorliegender Anmeldung gelten.

Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren für den Kunststoff-Träger ein Material verwendet, das eine Matrix aus Copolymer oder Polymerblend aufweist. Dieses Material kann nämlich leicht durch chemische Mittel aktiviert werden, wie nachstehend erläutert wird. Das Material kann ggf. noch wei­ tere übliche Zusätze enthalten, wie Farbstoffe, Pro­ zessierhilfsmittel, Stabilisatoren, Vernetzungsmittel, Weich­ macher, Füllstoffe und dergleichen. Als Copolymere oder Poly­ merblends können solche verwendet werden, die in den oben ge­ nannten PCT-Anmeldungen Nr. 92/02256 und Nr. 92/02432 genannt sind, insbesondere Copolymere von Styrol und Butadien oder Styrol und Chloropren oder Polymerblends von Polystyrol und Polybutadien oder Polystyrol und Polychloropren. Bei Aktivie­ rung durch chemische Mittel wurde der Kunststoff-Träger, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll, und zwar mindestens ein Teil des Oberflächenbereiches des Kunst­ stoff-Trägers, der mit dem Amplifikationsansatz in Kontakt kommen soll, in einen aktivierten Zustand versetzt, indem mindestens dieser Teil des Oberflächenbereiches des Kunst­ stoff-Trägers mit einem Lösungsmittel behandelt wurde, welches eine Polymerkomponente des Copolymers bzw. des Polymerblends leichter löst als die andere bzw. die anderen Polymehrkompo­ nente(n) des Copolymers bzw. Polymerblends. Zu diesem Zweck eignen sich beispielsweise Lösungsmittel wie Ether, z. B. Diethylether, Ester, Alkohole, Ketone, Aldehyde, Säuren, Ba­ sen, ungesättigte oder aliphatische (lineare, verzweigte oder zyklische) Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe und ähnliche Materialien, wel­ che das polymere Material teilweise lösen, so daß die Polymer­ matrix geöffnet wird. Im Resultat ist die mit dem Lösungsmit­ tel behandelte Oberfläche des Kunststoff-Trägers in ihrer tatsächlichen Oberflächen bzw. Ist-Oberfläche erhöht.

Im Rahmen der Erfindung wurde nun überraschenderweise festge­ stellt, daß die zu amplifizierende Polynucleotidsequenz ebenso wie die Polynucleotide, die im Laufe des Amplifika­ tionsprozesses synthetisiert werden, an die aktivierte Ober­ fläche des Kunststoff-Trägers gebunden werden. Dies geschieht automatisch während der ablaufenden Amplifikationsreaktion, ohne daß ein zusätzlicher Schritt zur Bindung der gebildeten Polynucleotide an den Kunststoff-Träger erforderlich ist. Bin­ dungskapazität, -affinität und -stabilität der aktivierten Oberfläche des Kunststoff-Trägers gegenüber den Polynucleoti­ den sind so hoch, daß die während der Amplifikationsreaktion fortlaufend gebildeten Polynucleotide fest an dem aktivierten Kunststoff-Träger anhaften und nicht mehr von dessen Oberflä­ che abdiffundieren. Es wird angenommen, daß sich ein Gleichge­ wicht zwischen in der flüssigen Phase des wäßrigen Milieus be­ findlichen, niedermolekularen Komponenten des Amplifikations­ ansatzes und an der festen Phase des Kunststoff-Trägers gebun­ denen höhermolekularen Komponenten des Amplifikationsansatzes einstellt. D.h., die niedermolekularen Komponenten des Ampli­ fikationsansatzes, wie z. B. bei dem PCR-Ansatz verwendete Pri­ mer und Nucleotide, befinden sich im wesentlichen in der flüs­ sigen Phase, während die hochmolekularen Polynucleotide, die bei der Amplifikation gebildet werden, weitgehend an der fe­ sten Phase der aktivierten Trägeroberfläche gebunden vorlie­ gen.

Damit eine effiziente Bindung der während der Amplifikation gebildeten Polynucleotide an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers stattfindet, sollte die Länge der zu ampli­ fizierenden Polynucleotidsequenz nicht zu kurz sein. Geeigneterweise weist sie eine Sequenzlänge von mindestens 100, bevorzugt mindestens 200 und weiter bevorzugt mindestens 500 Nucleotide bzw. Basenpaare auf.

Selbstverständlich können in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur eine, sondern auch mehrere verschiedene, spezifische Polynucleotidsequenzen in einem Ansatz amplifiziert und an den Kunststoff-Träger gebunden werden. Ferner ist es auch im Rah­ men der Erfindung möglich, daß in dem Verfahren zur Amplifika­ tion einer Polynucleotidsequenz mehrere Amplifikationsstufen durchgeführt werden, wobei nur die letzte Amplifikationsstufe in Gegenwart eines oberflächenaktivierten Kunststoff-Trägers durchgeführt wird, während die übrigen, vorangehenden Amplifi­ kationsstufen auf herkömmliche Weise in rein wäßrigem Medium erfolgen. Mehrstufige Amplifikationsverfahren sind dem Fach­ mann beispielsweise für die PCR bekannt.

Weiter ist es möglich, bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz mittels der PCR- Reaktion, zuerst einen Primerüberschuß auf dem Träger zu immo­ bilisieren und die zu amplifizierende Polynucleotidsequenz an den Primer zu hybridisieren, und dann die PCR-Reaktion anzu­ schließen. In der nachfolgenden PCR-Reaktion bleibt das Reak­ tion- (Amplifikations-)Produkt am Träger verankert.

Je nach Wunsch kann der Kunststoff-Träger auf seiner gesamten Oberfläche oder nur in Oberflächenbereichen, die für den Kon­ takt mit dem Amplifikationsansatz vorgesehen sind, aktiviert worden sein. Es kann sogar erwünscht sein, daß lediglich ein kleinerer Teilbereich des Kunststoff-Trägers, der mit dem Amplifikationsansatz in Kontakt kommt, aktiviert wurde.

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Kunst­ stoff-Träger wird geeigneterweise selbst das Gefäß sein, in dem die Amplifikationsreaktion abläuft. Ein solches Gefäß kann beispielsweise die Form eines Röhrchens, eines Mikrozentrifu­ genröhrchens oder einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte ha­ ben. Eine Mikrotiterplatte hat den Vorteil, daß sie zahlreiche Vertiefungen aufweist (in der Regel 96) und somit viele Ampli­ fikationsansätze zur gleichzeitigen Durchführung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens aufnehmen kann.

Die Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens besonders gut ge­ eignet ist. Die Mikro(-titer-)vorrichtung umfaßt als Bestand­ teile eine Mikro(-titer-)maske 101, eine Deckplatte 103 sowie eine Platte 104 des Kunststoff-Trägers, der als aktivierter Kunststoff-Träger zur Bindung der amplifizierten Polynucleotidsequenz eingesetzt wird. Die Mikro(-titer-)maske 101 weist eine Vielzahl zylindrischer Hohlräume 102 auf, wobei die Hohlräume 102 jeweils einzelne Amplifikationsansätze aufnehmen sollen. Damit die einzelnen Hohlräume besser gegeneinander abgedichtet sind, wird vorzugsweise zwischen der Kunststoff-Trägerplatte 104 und der Mikro(-titer-)maske 101 eine Dichtungsschicht 105 aus elastischem Kunststoffmaterial eingebracht, welche korrespondierend zu den einzelnen Hohlräumen 102 entsprechende Ausnehmungen (nicht dargestellt) aufweist, damit die Amplifikationsansätze mit der Kunststoff- Trägerplatte 104 in Kontakt treten. Die Kunststoff- Trägerplatte ist also mindestens in den Bereichen, die mit den zylindrischen Hohlräumen 102 in Verbindung stehen, aktiviert, kann jedoch auch auf der ganzen, der Mikro(-titer-)maske 101 zugewandten Oberflächenseite aktiviert sein. Die Deckplatte 103, die aus beliebigen Materialien bestehen kann, schließt die einzelnen Hohlräume 102 gegeneinander und nach außen hin ab. Die Abdichtung sollte insbesondere im Hinblick auf erhöhte Dampfdruckphasen in den einzelnen Gefäßen (Wells) 102 ausgestaltet werden, die auftreten, wenn Am­ plifikationsverfahren Hochtemperaturzyklen durchlaufen, wie z. B. bei der PCR. Zu diesem Zweck kann auch noch eine weitere Elastomer-Dichtungsschicht zwischen Mikro(-titer-)maske 101 und Deckplatte 103 eingebracht werden.

Zum Zusammenbau der einzelnen Bestandteile der Vorrichtung, wie sie in Fig. 1B zu sehen ist, können beliebige Befestigungseinrichtungen verwendet werden. Vorzugsweise dienen Nutverschlüsse 106, 107 zum Zusammenbau der Vorrichtung. Geeignet sind jedoch auch andere Befestigungs- oder Verschlußeinrichtungen, die dem Fachmann geläufig sind, z. B. Klammern, Spangen, Schraubverschlüsse oder dergleichen. Vorzugsweise wird durch die Befestigungs- oder Verschlußeinrichtung ein Druck zwischen der Deckplatte 103 und der Mikro(-titer-)maske 101 und/oder zwischen der Kunststoff- Trägerplatte 104 und der Mikro(-titer-)maske 101 angelegt, um die Abdichtung der einzelnen Hohlraum-Gefäßkammern 102 zu verbessern.

Wie oben bereits erwähnt, kann dabei die Oberfläche des als Kunststoff-Träger verwendeten Reaktionsgefäßes vollständig oder teilweise aktiviert vorliegen, vorausgesetzt, daß minde­ stens ein Teil der mit der Polynucleotidsequenz im Amplifika­ tionsansatz in Kontakt tretenden Oberfläche der einzelnen Re­ aktionsgefäße aktiviert vorliegt. Es kann beispielsweise vor­ teilhaft sein, daß nur der Bodenbereich der den Amplifikati­ onsansatz auf nehmenden Vertiefung des jeweiligen Reaktionsge­ fäßes aktiviert wurde, während der übrige Bereich der mit dem Amplifikationsansatz in Kontakt tretenden Oberfläche sowie die restliche Oberfläche des Reaktionsgefäßes in nichtaktiviertem Zustand vorliegt, um so eine Konzentration der Bindung der während der Amplifikation gebildeten Polynucleotide auf einer kleineren Fläche zu erreichen.

Der Kunststoff-Träger kann jedoch auch in anderen Formen als in Form des Reaktionsgefäßes selbst vorliegen. Insbesondere kann der Kunststoff-Träger in Form von Kügelchen ("beads"), Granulaten, Fasern, Scheibchen, Folien, Stäbchen und derglei­ chen mit dem die definierte Polynucleotidsequenz enthaltenden Amplifikationsansatz in Kontakt gebracht werden. Die Form des Kunststoff-Trägers und das Ausmaß der Aktivierung des Kunst­ stoff-Trägers (ganz oder nur bestimmte Teilbereiche davon) kann wie gewünscht oder je nach Anforderungen für den jeweili­ gen Anwendungszweck des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Polynucleotide gewählt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vielen Bereichen ange­ wandt werden. So kann beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus einer sehr geringen, d. h. nicht konventionell nachweisbaren Menge einer Polynucleotidsequenz eine merklich größere Menge der Polynucleotidsequenz hergestellt und auf einfache Weise gewonnen werden. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierte Polynucleotidsequenz, insbesondere eine durch die PCR amplifizierte DNA, ist weiterhin hervorra­ gend für Klonierungszwecke und andere gentechnologische Anwen­ dungen geeignet. Ein weiteres Anwendungsgebiet wird durch die Nucleinsäure-Sequenzanalyse der durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierten Polynucleotidsequenz geboten.

Falls gewünscht und je nach Anforderungen an die Reinheit der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens amplifizierten Poly­ nucleotidsequenz im Hinblick auf den jeweiligen Anwendungs­ zweck, d. h. je nach dem, ob die amplifizierte Polynucleotidse­ quenz im isolierten Zustand vorliegen muß oder nicht, können die durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierten und hergestellten Polynucleotide auf dem Kunststoff-Träger ver­ bleiben, oder-die Polynucleotide können von dem Kunststoff- Träger in einem weiteren Verfahrensschritt entfernt werden. Zum Entfernen der Polynucleotide von dem Kunststoff-Träger kann die auf hydrophobe Wechselwirkung beruhende Bindung zwi­ schen den Polynucleotiden und dem Kunststoff-Träger durch ge­ eignete chemische Mittel, z. B. durch Lösungsmittel, aufgebro­ chen werden. Ggf. kann auch der Kunststoff-Träger durch pas­ sende Lösungsmittel vollständig gelöst werden. In beiden ge­ nannten Fällen liegen dann die synthetisierten Polynucleotide in flüssigem Medium vor, so daß diese dann durch dem Fachmann geläufige Reinigungsmethoden isoliert werden.

Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Polynucleotid­ sequenz an fester Phase, bei dem die nachzuweisende Poly­ nucleotidsequenz nach dem oben beschriebenen Verfahren ampli­ fiziert und gleichzeitig an den Kunststoff-Träger als feste Phase gebunden wird und anschließend nachgewiesen bzw. be­ stimmt wird. Somit ist das oben beschriebene Verfahren zur Am­ plifikation einer Polynucleotidsequenz Bestandteil dieses Ver­ fahrens zum Nachweis der Polynucleotidsequenz, so daß die oben ausgeführten Erläuterungen auch für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gelten.

Für die Bestimmung der amplifizierten und an der festen Phase gebundenen Polynucleotidsequenz bieten sich zahlreiche Metho­ den an. Bei der Bestimmung erfolgt ein qualitativer oder quan­ titativer Nachweis der amplifizierten Polynucleotide.

Für die grob-quantitative Bestimmung von amplifizierter DNA kann beispielsweise ein Fluoreszenznachweis mit DNA-spezifi­ schen Fluoreszenzfarbstoffen, wie z. B. Ethidiumbromid, DAPI oder den bis-Benzimidazol-Farbstoff 33258 Hoechst (s. V.W. Burns in Photochem. Photobiol. Rev. 5, Seiten 87 bis 103 (1980)), angewandt werden.

Vorzugsweise wird jedoch das erfindungsgemäße Nachweisverfah­ ren so durchgeführt, daß die nachzuweisende Polynucleotidse­ quenz mittels der PCR amplifiziert wird, und zwar unter Ver­ wendung von entweder markierten Primern und/oder markierten Nucleotiden, mit dem Zweck, daß die Markierungen durch die je­ weiligen Bausteine (Primer und/oder Nucleotide) durch die PCR in die synthetisierten Polynucleotide eingebaut werden. Die somit eingebauten Markierungen können anschließend leicht be­ stimmt werden und sind eine Funktion für die Menge der gebil­ deten Polynucleotide. Mit Hilfe passender Standard-Vergleichs­ werten können somit quantitative Nachweisbestimmungen einer zu bestimmenden Polynucleotidsequenz auf einfache Weise durchge­ führt werden.

Entsprechend können auch andere Amplifikationsansätze als die PCR angewandt werden, um Markierungen über entsprechende, mar­ kierte Bausteine in die gebildeten Polynucleotide, einzubauen und somit einen einfachen Nachweis zu ermöglichen.

Durch die Verwendung des speziell aktivierten Kunststoff-Trä­ gers wird eine bisher nicht erreichte, hervorragende Trennung zwischen einerseits in die Polynucleotidsequenz eingebauten Markierungen und andererseits in den eingesetzten, niedermole­ kularen Bausteinen vorliegenden Markierungen bewirkt, indem die in die Polynucleotide eingebauten Markierungen fest an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers gebunden werden, während die niedermolekularen, markierten Bausteine im wesent­ lichen in der flüssigen Phase verbleiben. Eventuell schwach mit der festen Phase assoziierte, markierte niedermolekulare Bausteine können leicht im Anschluß an die Amplifikationsreak­ tion durch geeignete Waschschritte vollständig entfernt wer­ den, so daß sich ein spezifischer Nachweis der Polynucleotid­ sequenz mit hohem Signal : Rausch-Verhältnis ergibt.

Die Trennung zwischen der festen Bindung der synthetisierten Polynucleotide und der Nicht-Bindung der ggf. markierten nie­ dermolekularen Bausteine kann durch die Zugabe eines Detergens verbessert werden, wobei die Menge des zugesetzten Detergens den jeweiligen Bedingungen (Art des aktivierten Trägers, Art und Menge der Bausteine, Länge der Primer und der syntheti­ sierten Polynucleotide usw.) im Rahmen des fachmännischen Kön­ nens angepaßt werden können.

Zum Zweck der Markierung können jegliche Arten von Markierun­ gen verwendet werden, die dem Fachmann aus dem Stand der Tech­ nik hinreichend bekannt sind. Geeignet sind beispielsweise Ra­ diomarkierungen, wie ³H-, ¹²⁵J- und ³²P-markierte Nucleotide und Primer; Markierungen mit Chromophoren, Fluorophoren; zeit­ verzögerte Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-erzeugende Mar­ kierungssysteme; insbesondere Markierungen mit Reporter­ gruppen, wie Haptenen bzw. Biotin, welche Nachweisbestimmungs­ methoden immunchemischer Art oder mit dem Biotin-Avi­ din/Streptavidin-System ermöglichen. Als Hapten-markierte Nucleotid-Bausteine haben sich beispielsweise Brom- und Digi­ toxigenin-modifizierte Nucleosidtriphosphate (insbesondere BrdU und Dig-dUTP) in der Praxis bewährt. Selbstverständlich können auch Kombinationen verschiedener Markierungsarten ange­ wandt werden, insbesondere dann, wenn mehrere definierte Polynucleotidsequenzen in einem Ansatz nachgewiesen werden sollen.

Bei Verwendung markierter Bausteine (Primer und/oder Nucleotide) zur Amplifikation und zum späteren Nachweis der amplifizierten Polynucleotidsequenz werden diese vorzugsweise in Kombination mit nicht-markierten Analoga der Bausteine in die Amplifikationsreaktion eingesetzt. Geeignete Verhältnisse zwischen den markierten Bausteinen und den nicht-markierten Analoga sind bekannt (s. obige Literaturstellen von H.A. Er­ lich et al. und T. Maniatis et al.). Häufig ist es auch er­ wünscht, die markierten Bausteine nur in bestimmten Stufen der Amplifikationszyklen, insbesondere in den letzten Amplifika­ tionszyklen oder sogar nur im letzten Amplifikationszyklus zu­ zusetzen.

Unter den immunchemischen Bestimmungsmethoden, zu denen auch das Biotin-Avidin/Streptavidin-System gezählt werden kann, stehen dem Fachmann eine große Auswahl aus dem Stand der Tech­ nik zur Verfügung und es bestehen in dieser Hinsicht keine Li­ mitierungen. Beispielsweise sind Fluoreszenz-Immunoassays (FIA) und Enzym-Immunoassays (EIA) geeignet. Das erfindungsge­ mäße Nachweisverfahren ist insbesondere dann sehr einfach, aber auch sehr empfindlich, wenn Hapten- bzw. Biotin-Markie­ rungen angewandt werden, deren Einbau in die synthetisierten Polynucleotide durch Enzym-Immunoassays bestimmt werden, ins­ besondere in Verbindung mit einem Antikörper-Nachweisreagenz, welches mit einem Enzym konjugiert ist, das präzipitierende Nachweisfarbstoffe bildet, die sich auf dem Kunststoff-Träger am Ort der Polynucleotidbindung niederschlagen. Nähere Erläu­ terungen zu geeigneten Nachweisbestimmungsmethoden, insbeson­ dere durch immunchemische Techniken, werden in den oben ge­ nannten, anhängigen PCT-Anmeldungen Nr. 92/02256 und Nr. 92/02432, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, gege­ ben.

Wenn dies gewünscht wird oder falls dies erforderlich ist, können, um die Spezifität des erfindungsgemäßen Nachweisver­ fahrens zu erhöhen, weitere Schritte an die Amplifikation der definierten Polynucleotidsequenz angeschlossen werden. In der Regel sollten Waschschritte zum Abwaschen unspezifisch gebun­ dener, leicht mit der Oberfläche des Kunststoff-Trägers asso­ ziierter Markierungssubstanzen durchgeführt werden. Eine be­ sonders hohe Spezifität des Nachweises definierter Polynucleo­ tidsequenzen wird dadurch erreicht, daß die amplifizierte und an den Kunststoff-Träger gebundene Polynucleotidsequenz mit­ tels der Nucleinsäure-Hybridisierungstechnik bestimmt wird. Bei dieser Technik erfolgt die Detektion über markierte Nucleinsäure-Sonden, welche spezifisch an die nachzuweisende Polynucleotidsequenz oder an Teilbereiche dieser Polynucleo­ tidsequenz binden. Die Nachweisbestimmung erfolgt in diesem Fall wiederum durch eine geeignete Markierung, welche die Nucleinsäure-Sonde trägt, wobei die oben genannten Markie­ rungsarten auch hier angewandt werden können.

Einen Überblick über die Nucleinsäure-Hybridisierungstechnik geben U. Landegren et al., Science 242, Seiten 229 bis 237 (1988), J. Meinkoth und G. Wahl in Analytical Biochemistry 138, Seiten 267 bis 284 (1984) und B.D. Hames und S.J. Higgins in "Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach", IRL Press (1985).

Bei dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren sollte darauf ge­ achtet werden, daß in allen Schritten, die nach dem Amplifi­ zierungsschritt in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren
durchgeführt werden, wenn dies erforderlich ist oder gewünscht wird, Emulgatoren bzw. Detergentien in den Inkubationsansätzen vorhanden sind. Dies gilt beispielsweise für die Wasch­ schritte, die immunchemischen inkubationsschritte, die Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktionen und die Enzym- Substrat- Detektionsreaktionen. Dies unterbindet wirksam die unspezifi­ sche Bindung markierter Nachweisreagenzien an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers verursacht jedoch nicht die Abdissoziation der Polynucleotide vom aktivierten Träger. Ge­ eignete Emulgatoren bzw. Detergentien umfassen beispielsweise Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoyyethanol), Tween 20 (Polyoxyethylensorbiton), SDS (Natriumdodecylsulfat), nicht­ ionische, anionische oder kationische Tenside, Borate und Sei­ fen.

Claims (10)

1. Verfahren zur Amplifikation einer Polynucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynucleotidsequenz in Gegenwart eines Kunststoff-Trägers amplifiziert wird, wobei mindestens ein Teil der mit der Polynucleotidsequenz in Kontakt tretenden Oberfläche des Kunststoff-Trägers aktiviert wurde durch Erhöhung des Oberflächeninhalts, so daß die amplifizierte Polynucleotidsequenz an die aktivierte Oberfläche des Kunststoff-Trägers gebunden wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den Kunststoff-Träger ein Material verwendet wird, das eine Matrix aus Copolymer oder Polymerblend aufweist, und der Kunststoff-Träger durch ein Lösungsmittel aktiviert wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynucleotidsequenz durch die Polymerase- Kettenreaktion amplifiziert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Amplifikation ein zur Amplifikation der Polynucleotidsequenz erforderlicher Primer an den Kunststoff-Träger gebunden wird und die zu amplifizierende Polynucleotidsequenz an den Primer anhybridisiert wird.

5. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer amplifizierten Menge einer Polynucleotidsequenz.

6. Verfahren zum Nachweis einer Polynucleotidsequenz an fester Phase, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynucleotidsequenz nach einem der Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4 amplifiziert und an den Kunststoff-Träger als feste Phase gebunden wird und die amplifizierte Polynucleotidsequenz anschließend bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynucleotidsequenz mittels der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von markierten Primern amplifiziert wird und daß die Polynucleotidsequenz durch den Einbau des markierten Primers bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynucleotidsequenz mittels der Polymerase-Kettenraktion unter Verwendung von markierten Nucleotiden amplifiziert wird und daß die Polynucleotidsequenz durch den Einbau der markierten Nucleotide bestimmt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte Polynucleotidsequenz mittels immunoenzymatischer Detektion bestimmt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte und an den Kunststoff-Träger gebundene Polynucleotidsequenz mittels der Nucleinsäure-Hybridisierungs­ technik bestimmt wird.