JP7710705B2

JP7710705B2 - 硫酸多糖を生産するシアノバクテリア及びシアノバクテリア由来硫酸多糖の生産方法

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Publication number: JP7710705B2
Application number: JP2020148194A
Authority: JP
Inventors: 海成前田; 昌彦池内
Original assignee: Tokyo University of Agriculture
Current assignee: Tokyo University of Agriculture
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2025-07-22
Anticipated expiration: 2040-09-03
Also published as: JP2022042685A

Description

本発明は硫酸多糖を生産するシアノバクテリア及びシアノバクテリア由来硫酸多糖の生産方法に関する。

多糖は単糖が鎖状に連なった構造をもつ、核酸、タンパク質と並んで非常に重要な生体高分子であり、単糖組成や修飾の違いにより多様性に富む。硫酸多糖は硫酸基により修飾された酸性多糖の一種であり、動物、真核藻類、古細菌、シアノバクテリアに存在する。それらは生物の様々な重要な機能に関わるだけでなく、増粘剤や保水剤、医薬品（抗癌、抗ウィルス、抗凝固剤）として近年注目されている(Hayashi, 2008)。現在、微生物由来の硫酸多糖は、藻類やシアノバクテリア等の細菌の野生株が産生したものを回収・精製する方法、もしくは非硫酸多糖を化学触媒で硫酸化する方法により得られている。

例えば、国際公開第２００３／０２３０４５号には、海洋に生息するワカメ藻体の表面より分離されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＷＡＫ－１菌株を栄養源含有培地に接種・培養し、その培養物からアルコールなどの有機溶媒で処理し沈殿画分として得られる、硫酸多糖類の生産方法が開示されている（特許文献１）。

国際公開第２００３／０２３０４５号

バクテリアの細胞外多糖については研究が進んでおり様々な合成系が明らかにされてきた(Becker et al., 1998, Schmid et al., 2015)。しかしながら、シアノバクテリアの硫酸多糖合成系は不明である。また、硫酸多糖の存在が知られている代表的なシアノバクテリアは、細胞外多糖が形質転換の大きな障害となる、内在の制限修飾系が強力で外来DNAを分解してしまう、ゲノムがマルチコピーであるといった実情のため形質転換が困難である。この２点が生物工学的生産法確立の障害となっている。

そこで、本発明では、シアノバクテリア由来の硫酸多糖の生産法を確立し、硫酸多糖の大量生産や組成改変を目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するため、硫酸多糖の合成系に関与する遺伝子群を同定し、その中の転写制御に関わる遺伝子を制御するための手段を検討したところ、著量の硫酸多糖を培地中に蓄積させることができるとの知見を得た。

本発明は係る知見に基づくものであり、硫酸多糖を生産するシアノバクテリアであって、硫酸多糖合成系遺伝子と、硫酸多糖合成制御系遺伝子とを備え、前記硫酸多糖合成制御系遺伝子が、転写制御因子をコードする遺伝子と、レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子と、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子とから構成され、前記転写制御因子をコードする遺伝子、前記レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子、前記センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子のいずれか１つの転写の活性化が制御されてなる、シアノバクテリアを提供するものである。

また、本発明は、硫酸多糖を生産する方法であって、前記シアノバクテリアを培養する工程を含む、硫酸多糖の生産方法を提供するものである。

本発明によれば、シアノバクテリア由来の硫酸多糖を効率よく生産することができる。

形質転換体（Δ6803P株）を培養した培養液中に生産されたブルーム様粘性細胞塊が形成される様子を継時的に観察した画像である。粘性物質を分析するための分画法を説明するための図である。 6803P株のsll5052 ～slr5054破壊株における粘性細胞塊形成能を観察した結果を示す画像である。 6803P株のsll5052 ～slr5054破壊株が生産した粘性物質を分析した結果を示す図である。 6803Pの硫酸多糖合成遺伝子クラスターを示す図である。制御関連遺伝子破壊株における硫酸多糖蓄積量（Ａ）とブルーム形成（Ｂ）の結果を示す図である。リアルタイムPCRによりxssQおよびxssS破壊による主要xss遺伝子の転写変動を検討した結果を示す図である。

１．組換えシアノバクテリア
（１）組換えシアノバクテリアの作製
本発明の第一の態様は、硫酸多糖を効率よく生産する組換えシアノバクテリアであって、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子が破壊された、組換えシアノバクテリアを提供する。

本発明に用いることのできるシアノバクテリアの種類としては、例えば、シネコシスティス属（Synechocystis）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、アカリオクロリス属（Acaryochloris）、クロコスファエラ属（Crocosphaera）、アファノテーセ属(Aphanothece)、アナベナ属（Anabaena）、ノストック属(Nostoc)、リブラリア属(Rivularia)、アルスロスピラ属(Arthrospira)、シアノテーセ属(Cyanothece)、ミクロキスティス属(Microcystis)、オシラトリア属(Oscillatoria)、又はレプトリングビア属(Leptolyngbya)に属するシアノバクテリアであり、好ましくはシネコシスティス属（Synechocystis）、アファノテーセ属(Aphanothece)、オシラトリア属(Oscillatoria)、シアノテーセ属(Cyanothece)、クロコスファエラ属（Crocosphaera）、アナベナ属（Anabaena）又はノストック属(Nostoc)を挙げることができる。中でも、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803 substr. PCC-P株は、形質転換操作が非常に容易である点で好ましい。

センサーヒスチジンキナーゼとは、リン酸化を介したシグナル伝達に関わる酵素でありシアノバクテリアに多く存在する。本発明の組換えシアノバクテリアは硫酸多糖の合成を制御している特定の酵素をノックアウトし、硫酸多糖の大量生産を可能とするものである。

センサーヒスチジンキナーゼをノックアウトする方法は、種々の遺伝子工学的な手法を採用することができるが、例えば、薬剤耐性遺伝子カセットを含む外来DNAとの相同組み換えによるノックアウト法を挙げることができる。なお、シアノバクテリアはマルチコピーゲノム、つまりゲノムが複数コピー存在するため、破壊対象の遺伝子もゲノムの数だけ存在する。そのため、破壊株は僅かに野生型ゲノムも検出されることもあるが、本実施形態においては、全てのセンサーヒスチジンキナーゼがノックアウトされた破壊株のほか、顕著な表現型が出ていれば僅かに野生型ゲノムも検出される組換え株もセンサーヒスチジンキナーゼがノックアウトされた破壊株に含めることとする。

本発明の組換えシアノバクテリアは、顕著な硫酸多糖生産能を有する。また本発明の組換えシアノバクテリアは硫酸多糖を顕著に培地中に放出するため、回収が容易である。従って、本発明の組換えシアノバクテリアを適切な条件で培養し、次いで分泌された硫酸多糖を回収すれば、効率のよい硫酸多糖生産を実現することができる。

（２）培養方法
組換えシアノバクテリアの培養は、一般に、BG-11培地（J Gen Microbiol., 1979, 111:1-61）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。硫酸多糖生産には、細胞の代謝が活性化するまで培養することが好ましく、例えば、1～7日間、通気攪拌培養又は振とう培養することが好適である。本発明で作製されたセンサーヒスチジンキナーゼのノックアウト株は硫酸多糖を顕著に蓄積するため寒天培地上で硬いバイオフィルムを形成する。そのため、それを元に液体培養を開始する際はよく懸濁してから播種することが好ましい。また、液体培養中の撹拌が弱いと早い段階で細胞が凝集塊を形成してしまい増殖に支障が出るため、通気攪拌培養と振とう培養のいずれにせよ強く撹拌することが好ましい。

（３）回収方法
上記培養により、シアノバクテリアは硫酸多糖を生産し、当該硫酸多糖を培地中に放出する。また、培地中に硫酸多糖が蓄積した状態で培養液を静置すると、細胞と硫酸多糖が凝集し液面にブルームのような粘性細胞塊を形成する。分泌された硫酸多糖を回収する場合、前者であれば培養液全体から、後者であれば粘性細胞塊から、ろ過、遠心分離等により細胞等の固形分を除去し、残った液体成分を回収した後、吸引濾過等によりフィルターに硫酸多糖を回収又は精製すればよい。本発明による硫酸多糖の生産方法では、硫酸多糖がシアノバクテリアの細胞外に分泌されるので、硫酸多糖回収のために細胞を破壊する必要がない。硫酸多糖回収後に残った細胞は、繰り返し硫酸多糖生産に使用することができる。

一実施の形態として本発明の組換えシアノバクテリアを用いて硫酸多糖を生産したところ、BG11液体培地で２日間培養した培養上清において、野生株の約19倍の硫酸多糖を生産することができた。

２．低温誘導
（１）シアノバクテリア
本発明の第二の態様は、硫酸多糖を効率よく生産し、硫酸多糖合成系遺伝子群が低温により誘導されるシアノバクテリアを用いた硫酸多糖生産法である。

本発明に用いることのできるシアノバクテリアの種類としては、前記１（１）に示したものと同一である。例えば、シネコシスティス属（Synechocystis）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、アカリオクロリス属（Acaryochloris）、クロコスファエラ属（Crocosphaera）、アファノテーセ属(Aphanothece)、アナベナ属（Anabaena）、ノストック属(Nostoc)、リブラリア属(Rivularia)、アルスロスピラ属(Arthrospira)、シアノテーセ属(Cyanothece)、ミクロキスティス属(Microcystis)、オシラトリア属(Oscillatoria)、又はレプトリングビア属(Leptolyngbya)に属するシアノバクテリアであり、好ましくはシネコシスティス属（Synechocystis）、アファノテーセ属(Aphanothece)、オシラトリア属(Oscillatoria)、シアノテーセ属(Cyanothece)、クロコスファエラ属（Crocosphaera）、アナベナ属（Anabaena）又はノストック属(Nostoc)を挙げることができる。中でも、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803 substr. PCC-P株は、既にトランスクリプトーム解析により、低温による硫酸多糖合成系の転写制御が実証されている点で好ましい。

低温という環境刺激は、センサーヒスチジンキナーゼXssSによって感知され下流のXssR、XssQに伝えられ、転写制御因子であるXssQによって硫酸多糖合成系Xssの転写が制御されることにより、硫酸多糖の大量生産を可能とするものである。

低温という環境刺激をシアノバクテリアに与える方法は、培養温度条件を至適生育温度より１０度ほど低い温度に設定することによる。ただし、扱うシアノバクテリア種ごとに至適な低温条件は検討が必要である。

本発明を用いることで、シアノバクテリアは至適生育条件と比較して高い硫酸多糖生産能を発揮する。また本発明のシアノバクテリアは硫酸多糖を顕著に培地中に放出するため、その回収は容易である。従って、本発明のシアノバクテリアを培養し、次いで分泌された硫酸多糖を回収すれば、効率のよい硫酸多糖生産を実現することができる。

（２）培養方法
一般に、BG-11培地（J Gen Microbiol., 1979, 111:1-61）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。硫酸多糖生産には、細胞の代謝が活性化するまで培養することが好ましく、例えば、1～7日間、通気攪拌培養又は振とう培養することが好適である。本発明では、この培養期間中の温度を低温にする。本発明を利用したシアノバクテリアは硫酸多糖を多く蓄積するため、液体培養中の撹拌が弱いと早い段階で細胞が凝集塊を形成してしまい増殖に支障が出るため、通気攪拌培養と振とう培養のいずれにせよ強く撹拌することが好ましい。

（３）回収方法
硫酸多糖の回収は上述した１（３）と同様の方法で実施することができる。上記培養により、シアノバクテリアは硫酸多糖を生産し、当該硫酸多糖を培地中に放出する。また、培地中に硫酸多糖が蓄積した状態で培養液を静置すると、細胞と硫酸多糖が凝集し液面にブルームのような粘性細胞塊を形成する。分泌された硫酸多糖を回収する場合、前者であれば培養液全体から、後者であれば粘性細胞塊から、ろ過、遠心分離等により細胞等の固形分を除去し、残った液体成分を回収した後、吸引濾過等によりフィルターに硫酸多糖を回収又は精製すればよい。本発明による硫酸多糖の生産方法では、硫酸多糖がシアノバクテリアの細胞外に分泌されるので、硫酸多糖回収のために細胞を破壊する必要がない。硫酸多糖回収後に残った細胞は、繰り返し硫酸多糖生産に使用することができる。

一実施の形態として本発明の培養法を用いて硫酸多糖を生産したところ、BG11液体培地で２日間培養した培養上清において、通常培養条件の約３倍の硫酸多糖を生産することができた。

３．レスポンスレギュレーター遺伝子又は転写制御因子遺伝子の発現強化
（１）作製方法
本発明の第三の態様は、硫酸多糖を効率よく生産する組換えシアノバクテリアであって、硫酸多糖合成制御系を構成するレスポンスレギュレーターと転写制御因子をコードする遺伝子が発現強化された、組換えシアノバクテリアを提供する。

本発明に用いることのできるシアノバクテリアの種類は前記１（１）に示したものと同一である。例えば、シネコシスティス属（Synechocystis）、トリコデスミウム属（Trichodesmium）、アカリオクロリス属（Acaryochloris）、クロコスファエラ属（Crocosphaera）、アファノテーセ属(Aphanothece)、アナベナ属（Anabaena）、ノストック属(Nostoc)、リブラリア属(Rivularia)、アルスロスピラ属(Arthrospira)、シアノテーセ属(Cyanothece)、ミクロキスティス属(Microcystis)、オシラトリア属(Oscillatoria)、又はレプトリングビア属(Leptolyngbya)に属するシアノバクテリアであり、好ましくはシネコシスティス属（Synechocystis）、アファノテーセ属(Aphanothece)、オシラトリア属(Oscillatoria)、シアノテーセ属(Cyanothece)、クロコスファエラ属（Crocosphaera）、アナベナ属（Anabaena）又はノストック属(Nostoc)を挙げることができる。中でも、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803 substr. PCC-P株は、形質転換操作が非常に容易である点で好ましい。

レスポンスレギュレーターはリン酸化を介したシグナル伝達に関わるタンパク質であり、シアノバクテリアに多く存在する。ほとんどの場合センサーヒスチジンキナーゼからシグナルを受け取りさらに下流にシグナル伝達する役割を担う。転写制御因子は生物の転写制御に関わるタンパク質の一群であり、非常に多様であるが、本発明で扱うものは特定のセンサーヒスチジンキナーゼとレスポンスレギュレーターからなる二成分制御系からシグナルを受け取り、硫酸多糖合成系の転写制御をおこなう、シアノバクテリア特有の転写制御因子である。本発明の組換えシアノバクテリアは硫酸多糖の合成を制御している特定のレスポンスレギュレーターであるxssR遺伝子と転写制御因子であるxssQ遺伝子を発現強化することで、硫酸多糖の大量生産を可能とするものである。

レスポンスレギュレーター又は転写制御因子を発現強化する方法は、種々の遺伝子工学的な手法を採用することができるが、例えば、薬剤耐性遺伝子カセット、強力な転写活性を持つプロモーター配列、発現強化する遺伝子、ターミネーター配列を含む外来DNAとの相同組み換えによる対象ゲノム上のニュートラルサイトへの導入法を挙げることができる。

（２）培養方法
組換えシアノバクテリアの培養は、一般に、BG-11培地（J Gen Microbiol., 1979, 111:1-61）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。硫酸多糖生産には、細胞の代謝が活性化するまで培養することが好ましく、例えば、1～7日間、通気攪拌培養又は振とう培養することが好適である。本発明で作製されたレスポンスレギュレーターXssR又は転写制御因子XssQの発現強化株は硫酸多糖を顕著に蓄積するため寒天培地上で硬いバイオフィルムを形成する。そのため、それを元に液体培養を開始する際はよく懸濁してから播種することが好ましい。また、液体培養中の撹拌が弱いと早い段階で細胞が凝集塊を形成してしまい増殖に支障が出るため、通気攪拌培養と振とう培養のいずれにせよ強く撹拌することが好ましい。

一実施の形態として本発明の組換えシアノバクテリアを用いて硫酸多糖を生産したところ、BG11液体培地で２日間培養した培養上清において、野生株の約20倍の硫酸多糖を生産することができた。

以下、具体的な実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されない。

１．形質転換体の作製
形質転換体の作製に当たり、ホストとして、完全ゲノム解読済みのモデルシアノバクテリアであるシネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803 substr. PCC-P株（以下6803P株）を用いた。

形質転換に用いた形質転換用プラスミドは先行研究論文と同様の手法により作製した(J. Biotechnol., 2018, 276:25-33). 簡潔には以下の手順であり、相同組み換えによる目的遺伝子領域の置換をおこなった。

遺伝子破壊株の作製においては、pPCRscriptベクターを鋳型としてベクター領域をPrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymeraseを用いたPCR法により増幅した断片、6803P株ゲノムを鋳型として目的遺伝子領域の上流側約1000 bpに相当する領域を同様に増幅した断片、任意のプラスミドを鋳型として薬剤耐性遺伝子カセット領域を同様に増幅した断片、6803P株ゲノムを鋳型として目的遺伝子領域の下流側約1000 bpに相当する領域を同様に増幅した断片の計４断片をIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kitを用いて結合し、大腸菌に形質転換した。

遺伝子発現強化株の作製においては、pPCRscriptベクターにあらかじめ6803用のニュートラルサイト(IS203領域もしくはslr0846近傍領域)上流1000bp、強力なtrcプロモーター、rrnBターミネーター、ニュートラルサイト下流1000bpがこの順にクローニングされたプラスミドを鋳型としてベクター領域を増幅した断片と、目的遺伝子領域を増幅した断片をIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kitを用いて結合し、大腸菌に形質転換した。目的プラスミドは一般的なアルカリ-SDS法により抽出および精製した。

得られたプラスミドの6803P株への形質転換は自然形質転換法を用いた。通気撹拌培養しOD₇₃₀ = 0.5～1.0 となった菌体培養液300μLに対し形質転換用プラスミド2μLを無混和し、ニトロセルロースメンブレンをのせたBG11寒天培地(薬剤なし)上に塗布した。通常白色光下で1～2日回復培養した後、形質転換体の選抜用薬剤を含むBG11寒天培地にメンブレンを移動した。1～2週間ほどで形質転換体のコロニーが得られた。選抜に用いたスペクチノマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールの薬剤濃度は全て20μg/mLであった。数代継代培養したのち、シアノバクテリアマルチコピーゲノムの全てに目的の相同組み換えが完了したかをPCR法によって確認した。本発明において使用したプライマーの一覧を表１～表３に示す。得られた形質転換体は以下の硫酸多糖解析用サンプルとして用いた。

２．硫酸多糖の生産
野生株と得られた形質転換体を使用し、以下の要領で硫酸多糖を生産した。寒天培地上で維持した各株を薬剤入りBG11液体培地に播種し通気撹拌培養し、これを前培養とした。次に、OD₇₃₀が1.0～2.0となった前培養液を用い、50 mL BG11液体培地中にOD₇₃₀＝0.2 となるように菌体を播種し、本培養を開始した。寒天培養、液体培養ともに通常培養温度は31℃でおこなった。低温条件のみ、本培養を野生株の至適温度より11℃低い20℃でおこなった。硫酸多糖は培養中常に培地中に放出された。以下の実験では本培養開始から二日後に硫酸多糖を回収した。

6803P株培養液の通気撹拌培養を止めると、図１に示すように初めのうちは培養液全体に懸濁していた培養物が、時間の経過とともに徐々に液面に集まった。このブルームのような粘性細胞塊の形成は、細胞外粘性物質にトラップされた光合成由来の気泡を浮力として、細胞と粘性物質が浮上することに起因した。

なお、この現象は、同種の別株であるシネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC 6803 substr. GT（以下6803GT株）では見られなかった。

３．粘性物質の分析
得られた粘性物質を分析するため、図２に示す簡便な分画法を構築した。まず遠心分離（10,000 ×g、10分）により菌体を除去した。次にPTFEメンブレンフィルター（Merck社製、孔径0.45μm）を用いて遠心上清を吸引濾過することで、メンブレンに粘性物質をトラップした。そして、1 mLほどの超純水を滴下したメンブレンから、ピンセットを用いて粘性物質を剥がし取り回収した（図２中粘性物質画分）。定量解析にはこの状態のサンプルを用いた。下記の組成分析に供したサンプルは、さらに遠心分離（20,000 ×g、10分）により微細なゴミを除いた後に、セルロース透析チューブを用いて超純水2 Lに対して一晩、3時間、3時間の計3回透析をおこなった。さらに、フリーズドライ装置FDU-810 (EYELA社製)を用いて凍結乾燥をおこない、これを組成分析サンプルとした。

この方法で得られた粘性物質を定量解析した結果、タンパク質や核酸はほとんど検出されず、多糖が検出された。さらに、上記組成分析サンプルを東レリサーチセンターに委託し組成分析した結果、表４に示すように、この多糖は硫酸多糖であることが明らかになった。

４．硫酸多糖の合成系の同定
得られた硫酸多糖の合成系を同定した。発明者は、多糖合成に重要な因子の破壊株を、上記１に記載した方法と同様の方法で多数作製した。そして、上記２に記載した培養方法で培養し、粘性細胞塊形成能を指標にスクリーニングした。

その結果の一部を図３、図４に示す。図３に示すように、野生株（図３中、「WT」と表記する）は粘性細胞塊が形成されることが観察されたが、6803P株のpSYSMプラスミド上にある遺伝子領域sll5052 ～slr5054 の破壊株（図３中、「Δsll5052 ～slr5054」と表記する）においては、ブルーム様細胞塊は形成されなかった。また、上記３に記載した方法で粘性物質を定量解析した結果、図４に示すように、粘性物質画分中の総糖量が有意に減少していることが明らかになった。これらの結果から、sll5052 ～slr5054が硫酸多糖合成に関与する遺伝子と考えられた。

図５は、6803P株の硫酸多糖合成遺伝子クラスターを示す図である。白色は合成関連遺伝子、灰色は制御関連遺伝子、黒色は機能未知遺伝子を示す。図５に示すように、制御関連の遺伝子は、pSYSM上の巨大な遺伝子クラスター上に存在した。そして、この遺伝子クラスター上には多糖合成・制御に関係すると推測される遺伝子が集積していた。

表５に、硫酸多糖合成遺伝子クラスター内遺伝子の一覧を示す。合成に関わると推定された個々の遺伝子の破壊株を作製し表現型を解析した結果（data not shown）、ほぼ全ての遺伝子の硫酸多糖合成への寄与が示された。

この結果をもとに、発明者はこの遺伝子クラスターをxss (extracellular sulfated polysaccharide biosynthesis)と命名した。xssクラスター内には、多糖合成に関わる遺伝子、硫酸基転移酵素の遺伝子、転写制御因子の遺伝子、二成分制御系の遺伝子が存在した。バクテリアの多糖合成系はWzx/Wzy型、ABCトランスポーター型、合成酵素型の大きく３つに分けられるが(Schmid et al., 2015)、xssクラスターにはWzx/Wzy型に特徴的な遺伝子群が存在した。一方でWzx/Wzy型合成系において糖鎖を細胞外に排出するための外膜孔を形成するタンパク質であるOPXをコードする遺伝子はxssクラスター上に存在しなかった。しかし、破壊株を用いた実験から、染色体上に存在するOPX遺伝子sll1581が硫酸多糖の合成に必要であることが示されたため（図６（Ａ）中のΔsll1581）、この遺伝子をxssTと命名した。以上の検討の結果、新規硫酸多糖と、その合成に関わる遺伝子群が同定された。

５．各種遺伝子破壊株の硫酸多糖の生産
xssクラスターには制御系の因子が３つ存在する。XssQはアミノ酸配列から転写制御因子と推測された。XssRとXssSは、バクテリアにおいて一般的な制御系である二成分制御系の因子であり、XssSがセンサーヒスチジンキナーゼ、XssRがレスポンスレギュレーターと推測された。

そこで、各遺伝子の破壊株を上記１に記載の方法で作製し、上記２の培養方法に従い、これらの遺伝子の破壊株について表現型を調べた。図６は、制御関連遺伝子破壊株における硫酸多糖蓄積量（Ａ）と粘性細胞塊形成（Ｂ）の結果を示す図である。

図６（Ａ）に示すように、xssQとxssRそれぞれの破壊株（ΔxssQとΔxssR）では硫酸多糖の蓄積がほとんど見られなかった。一方で、xssSの破壊株（ΔxssS）では硫酸多糖の蓄積量が野生株（WT）の約19倍に増加していた。このΔxssS株に更にxssK-Mの破壊形質転換をおこなった株(ΔxssS+ΔxssK-M)は硫酸多糖蓄積を示さなくなった。また、xssRとxssQの二重破壊株（ΔxssR-S）では硫酸多糖蓄積が見られなかった。加えてxssR発現強化株（OX-xssR）とxssQ発現強化株（OX-xssQ）のどちらでもxssS破壊株と同様の硫酸多糖の高蓄積が確認された。以上の結果により、xssSがxssRを介してxssQを抑制的に制御することで、硫酸多糖合成を抑制していることが示唆された。

表４に示すように、xssS破壊株において高蓄積した硫酸多糖の組成分析結果は野生株のものとは異なった。シアノバクテリアには１種に複数の細胞外多糖が存在することが一般的であるため、xssS破壊株ではxss遺伝子群によって合成される硫酸多糖の蓄積量が激増したことによりその組成が顕著に反映されていると考えられる。

６．リアルタイム定量PCRによる測定
XssQは転写制御因子と推測されたため、主要xss遺伝子の転写との関連性をリアルタイム定量PCRにより調べた。リアルタイム定量PCRの手順は以下である。

硫酸多糖回収と同じタイミングで、細胞を遠心分離(5000 × g、4°C、10分)により回収した。RNA抽出はRNeasy Mini kit for bacteria (Qiagen社)を用いてキット推奨のプロトコルに基づいておこなった。cDNAの作製は、PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser(Takara社製)を用いた。リアルタイム定量PCR反応はTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo社製)とThermal Cycler Dice Real Time System II (Takara社製)を用いておこなった。遺伝子発現レベル比較における内部標準にはrnpB遺伝子を用いた。使用したプライマーを表６に示す。

硫酸多糖高蓄積株であるxssS破壊株において一部遺伝子の転写量の増加傾向が、硫酸多糖非蓄積株であるxssQ破壊株において一部遺伝子の転写量の著しい減少傾向が確認された（図７）。

この結果から、当該硫酸多糖の合成は転写制御因子XssQによる一部のxss遺伝子の転写制御によりコントロールされていると考えられた。また、本発明の硫酸多糖高蓄積株は、XssSのノックアウトによる抑制の解除などによりxss遺伝子の転写レベルが増強されたことに起因すると推測された。

７．低温における硫酸多糖の蓄積量の測定
過去の6803P株のトランスクリプトーム研究において、今回転写量の大きな変動が確認された遺伝子群が低温（20℃）において転写誘導されることが示されていた（Kopf et al. 2014）。そこで、２に記載した操作の本培養を20℃でおこない他の株同様に定量解析することで、低温における硫酸多糖の蓄積量を測定した結果、野生株の通常培養温度(31℃)における蓄積量と比較して約３倍に増加していた（図６、表７）。

この結果は、センサーであるXssSが感知している環境刺激が低温である可能性を示唆している。つまり、センサーヒスチジンキナーゼの遺伝子破壊が困難な種であっても、低温に晒すことで硫酸多糖合成系を活性化し硫酸多糖生産性を向上させることができる可能性が示された。

Claims

硫酸多糖を生産するシアノバクテリアであって、
硫酸多糖合成系遺伝子と、硫酸多糖合成制御系遺伝子とを備え、
前記硫酸多糖合成制御系遺伝子が、転写制御因子をコードする遺伝子と、レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子と、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子とから構成され、
前記転写制御因子をコードする遺伝子、前記レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子、前記センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子のいずれか１つの転写の活性化が制御されてなり、
前記シアノバクテリアが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかを満たす、シアノバクテリア。
（ａ）前記センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子がxssS遺伝子であり、該xssS遺伝子が破壊されてなる
（ｂ）前記レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子がxssR遺伝子であり、該xssR遺伝子が発現強化されてなる
（ｃ）前記転写制御因子をコードする遺伝子がxssQ遺伝子であり、該xssQ遺伝子が発現強化されてなる
前記シアノバクテリアが、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）PCC6803 substr．PCC-P株である、請求項１に記載のシアノバクテリア。
硫酸多糖を生産する方法であって、
請求項１又は２に記載のシアノバクテリアを培養する工程を含む、硫酸多糖の生産方法。
請求項３に記載の硫酸多糖を生産する方法であって、
前記培養工程の後に、前記シアノバクテリアと培養上清とを遠心分離により分離する工程と、
前記上清を濾過により硫酸多糖を吸引濾過により分取する工程と、
を含む、硫酸多糖の生産方法。