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JP7766595B2 - ＤｕｏＣＡＲによりがんを処置するための組成物および方法 - Google Patents

ＤｕｏＣＡＲによりがんを処置するための組成物および方法

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JP7766595B2 JP2022529859A JP2022529859A JP7766595B2 JP 7766595 B2 JP7766595 B2 JP 7766595B2 JP 2022529859 A JP2022529859 A JP 2022529859A JP 2022529859 A JP2022529859 A JP 2022529859A JP 7766595 B2 JP7766595 B2 JP 7766595B2
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Description

発明の詳細な説明
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１９年１１月２２日出願の米国特許出願第１６／６９２，９５７号に対する優先権を主張し、これは、２０１９年９月１８日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／５１７３４号に対する優先権を主張し、これは次に、２０１８年８月２１日出願の米国特許出願第１６／０７８，２６９号の一部継続出願である２０１８年９月１８日出願の米国特許出願第１６／１３４，７３５に対する優先権を主張し、これは次に、２０１７年９月１日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／４９９２３号に対する優先権の利益を主張し、これは次に、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年９月２日出願の米国仮特許出願第６２／３８２，７９１号に対する優先権の利益を主張し、それらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の分野
本出願は、がんの分野、特に、機能的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも２つのベクターを含む組成物、および患者特異的な免疫療法におけるその使用方法に関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１１月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、３６６キロバイトのサイズである。
発明の背景
がんは、ヒトの健康に対する最も致命的な脅威の１つである。米国だけで、がんは毎年ほぼ１３０万人の新たな患者が罹患し、心血管疾患に次いで２番目に多い死因であり、死亡数の約４分の１を占めている。固形腫瘍が、これらの死亡のほとんどの原因である。ある特定のがんの医学的処置においては顕著な進歩があったものの、全てのがんについての５年全生存率は過去２０年間で約１０％しか改善しなかった。がんまたは悪性腫瘍は、制御されずに迅速に転移および成長し、処置を非常に困難にする。現代のがん処置における難しさの１つは、がんの生検および診断の間に経過する時間、ならびに患者の有効な処置である。この時間の間に、患者の腫瘍は、妨げられずに成長し得、その結果、疾患は、処置が適用される前に、さらに進行している。このことは、がんの進行および転帰に負の影響を及ぼす。
キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）は、３つの本質的な単位を含むハイブリッド分子である：（１）細胞外抗原結合性モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフ（Ｌｏｎｇ ＡＨ、Ｈａｓｏ ＷＭ、Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年；２巻（４号）：ｅ２３６２１頁）。ＣＡＲの抗原結合性モチーフは一般に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最小の結合性ドメインである単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）を基にして作られる。代替の抗原結合性モチーフとして、例えば、受容体リガンド（即ち、ＩＬ－１３は、腫瘍が発現するＩＬ－１３受容体に結合するように操作されている）、インタクトな免疫受容体、ライブラリー由来ペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）も操作されている。ＣＡＲ発現のための代替の細胞標的（例えば、ＮＫまたはガンマ－デルタＴ細胞）も開発中である（Ｂｒｏｗｎ ＣＥら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２年；１８巻（８号）：２１９９～２０９頁；Ｌｅｈｎｅｒ Ｍら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２年；７巻（２号）：ｅ３１２１０頁）。ＣＡＲベクターを形質導入するための最も活性なＴ細胞集団を定義すること、最適な培養および増殖の技術を決定すること、ならびにＣＡＲタンパク質構造自体の分子的詳細を定義することに関して、いまだにかなりのなすことが残っている。
ＣＡＲの連結モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインとするか、または伸長された可撓性リンカーとなるように設計することができる。ＩｇＧの定常ドメインに由来するものなどの構造モチーフを使用して、ｓｃＦｖ結合性ドメインをＴ細胞原形質膜表面から離れて延在させることができる。これは、結合性ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近い一部の腫瘍標的にとって重要であり得る（例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２にとって；Ｏｒｅｎｔａｓら、未公開の観察）。今日まで、ＣＡＲにおいて使用されるシグナル伝達モチーフは常にＣＤ３－ζ鎖を含んでいるが、それは、このコアモチーフが、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルであるからである。最初に報告された第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達モチーフを含有する第３世代ＣＡＲでも同様に使用された（Ｚｈａｏ Ｙら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８３巻（９号）：５５６３～７４頁）。新たなテクノロジーの進歩に伴い、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体に連結されたビーズによるＴ細胞の活性化、ＣＤ２８由来のカノニカルな「シグナル２」の存在がＣＡＲ自体によってコードされる必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を使用して、第３世代ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターよりも優れているわけではないことが見出され、また、白血病のマウスモデルにおいては第２世代ベクターを超える明らかな利益は得られなかった（Ｈａｓｏ Ｗ、Ｌｅｅ ＤＷ、Ｓｈａｈ ＮＮ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ、Ｙｕａｎ ＣＭ、Ｐａｓｔａｎ ＩＨ、Ｄｉｍｉｔｒｏｖ ＤＳ、Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ、Ｂａｒｒｅｔｔ ＤＭ、Ｗａｙｎｅ ＡＳ、Ｍａｃｋａｌｌ ＣＬ、Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１３年；１２１巻（７号）：１１６５～７４頁；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮら Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（１２号）：２７０９～２０頁）。これは、第２世代ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ（Ｌｅｅ ＤＷら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、ＬＡ；１２月７～１０日、２０１３年）およびＣＤ１３７／ＣＤ３－ζシグナル伝達形式（Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（８号）：７２５～３３頁）のＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床的成功によって裏付けられている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続シグナルを提供することができる（Ｙｖｏｎ Ｅら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９年；１５巻（１８号）：５８５２～６０頁）。ＣＡＲ Ｔ細胞集団が培養された培養条件も、等しく重要である。
がんに対するＣＡＲ療法のより広範で有効な適応における現在の課題は、説得力のある標的の不足に関する。細胞表面抗原への結合因子を創出することは、現在容易に達成可能であるが、正常組織を見逃しながら腫瘍に対して特異的な細胞表面抗原を発見することは、依然として厄介な課題である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞により高い標的細胞特異性を与えるための１つの潜在的な方法は、コンビナトリアルＣＡＲアプローチを使用することである。１つのシステムでは、ＣＤ３－ζとＣＤ２８シグナル単位が、同じ細胞において発現される２つの異なるＣＡＲコンストラクト間で分割される；別のシステムでは、２つのＤｕｏＣＡＲが、同じＴ細胞において発現されるが、一方はより低い親和性を有し、したがって第２のＣＡＲの完全な活性のために代替的ＣＡＲが最初に結合されることを必要とする（Ｌａｎｉｔｉｓ Ｅら Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１３年；１巻（１号）：４３～５３頁；Ｋｌｏｓｓ ＣＣら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１巻（１号）：７１～５頁）。免疫療法剤としての単一のｓｃＦｖベースのＣＡＲの生成のための第２の課題は、腫瘍細胞の不均一性である。少なくとも１つのグループは、標的抗原陰性集団の成長を回避することを期待して、エフェクター細胞集団が複数の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を同時に標的化する、神経膠芽腫のためのＣＡＲ戦略を開発している（Ｈｅｇｄｅ Ｍら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３年；２１巻（１１号）：２０８７～１０１頁）。
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、合成生物学における新たな領域になっている；複数のプロモーターおよび遺伝子産物は、これらの高度に強力な細胞を腫瘍微小環境に導くことが想定され、ここで、Ｔ細胞は、負の調節シグナルを免れることができ、かつ有効な腫瘍死滅を媒介できる。ＡＰ１９０３による誘導性カスパーゼ９コンストラクトの薬物誘導性二量体化を介した望ましくないＴ細胞の排除は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチが薬理学的に始動され得る１つの手段を実証している（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ Ａら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（１８）：１６７３～８３頁）。デコイ受容体の発現によるトランスフォーミング成長因子－βの負の調節効果に対して免疫性であるエフェクターＴ細胞集団の創出は、エフェクターＴ細胞が最適な抗腫瘍活性のために操作され得る程度をさらに実証している（Ｆｏｓｔｅｒ ＡＥら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年；３１巻（５号）：５００～５頁）。
したがって、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体と類似した様式でＴ細胞活性化を誘発できるようであるが、今日までのＣＡＲベースのテクノロジーの臨床適用に対する主要な障害は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の限定的なｉｎ ｖｉｖｏ増殖、注入後の細胞の迅速な消失、期待外れの臨床活性、根本的な医学的疾患または状態の再発、およびかかるＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用するがんの診断およびタイムリーな処置の間に経過する必要以上の時間である。
したがって、上述の欠点なしにがん特異的な意図する治療的特質を示し得るＣＡＲベースの治療を使用するがんの処置のための組成物および方法を発見する、当該分野における緊急かつ長年にわたる要求が存在する。
本発明は、機能的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも２つのベクターを含む組成物、ならびにがん、および他の疾患および／または状態を処置するために使用され得る患者特異的な免疫療法におけるその使用方法を提供することによって、これらの要求に対処する。
特に、本明細書に開示および記載される本発明は、少なくとも２つのベクターをコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物を提供し、各ベクターは、機能的ＤｕｏＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、この免疫療法組成物は、自家リンパ球を形質導入するために使用されて、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進するために、患者に直接注入して戻され得る活性な患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞集団が生成し、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす。
発明の概要
２つ以上のベクターが形質導入されたリンパ球を含む新規養子免疫療法組成物、ならびにがん、および他の疾患および状態を処置するために使用することができる患者特異的な併用免疫療法におけるその使用方法が本明細書で提供される。
したがって、一態様では、Ｄｕｏキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、ならびにＤｕｏＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターをコードする核酸分子が本明細書で提供される。例えば対象におけるがんを処置するための、開示されるＤｕｏＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、宿主細胞、および核酸分子を使用する方法も提供される。
一態様では、少なくとも２つのベクター（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、ベクターのうち１つにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）は、同一ではなく、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
一実施形態では、少なくとも３つのベクター（ＴＲｉｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
一実施形態では、少なくとも４つのベクター（ＱｕａｔｒｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
さらに別の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のベクター（例えば、「ｎＣＡＲ」）をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、各独自の数のｎＣＡＲは、本明細書で「ｎＣＡＲ」（例えば、ＤｕｏＣＡＲ、ＴｒｉｏＣＡＲ、ＱｕａｔｒｏＣＡＲ、ＰｅｎｔａＣＡＲ、ＨｅｘａＣＡＲ、ＨｅｐｔａＣＡＲ、ＯｃｔａＣＡＲ、ＮｏｎａＣＡＲ、およびＤｅｃａＣＡＲなど）と呼ばれる独自のＣＡＲ組成物を構成するＣＡＲ産物にアセンブルされる時に定められる。
一実施形態では、（ａ）細胞において機能的である核酸配列をそれぞれ含む少なくとも２つのベクターを含み；（ｂ）各ベクターが、機能的ＣＡＲ分子をコードし；（ｃ）各ＣＡＲが、少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され；（ｄ）ベクターのうち１つにおける少なくとも１つの結合性ドメインが、同一ではなく；（ｅ）少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、（ａ）細胞において機能的である核酸配列をそれぞれ含む少なくとも２つのベクターを含み；（ｂ）各ベクターが、機能的ＣＡＲ分子をコードし；（ｃ）各ＣＡＲが、少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクターにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）が、同一ではなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組合せが、ベクターそれぞれの間で同一ではなく；（ｆ）少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、２つ以上のベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、免疫療法組成物が提供される。
一実施形態では、各ベクターが１つよりも多い機能的ＣＡＲをコードする、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、１つまたは複数のシグナル伝達モチーフの組合せが、１つまたは複数のベクターにおいて同一である、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、１つまたは複数の多重結合性ドメインが、１つまたは複数のベクターにおいて同一である、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、リンパ球集団（複数可）が、自家Ｔ細胞、または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーペプチドが先行する、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＨＣと組み合わされたＰＲＡＭＥペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ） ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９） ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（単鎖ＴＣＲコンストラクトを含む）抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲ、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲのリンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、ＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦｃイプシロンＲ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ－１、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ－４、またはそれらの任意の組合せの機能的シグナル伝達ドメインを含む、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、単一のベクターが、組み込みのためのＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせて、全てのキメラ抗原受容体をコードするために使用される（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ヘルペスベクター、ＰＯＸベクター、ＲＮＡ、プラスミド、コスミド、または任意のウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、各ベクターが、単独、あるいはトランスフェクション試薬、または非限定的な例が電気穿孔であるＲＮＡもしくはＤＮＡを細胞に送達する方法と組み合わされる、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターである、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、少なくとも１つのベクターが、細胞において核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、免疫療法組成物が提供される。
別の実施形態では、核酸分子が、内因性遺伝子の発現を阻害するまたは欠失させる、免疫療法組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、活性な患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が、リンパ球の採取または腫瘍生検の１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日、または１か月以内に生成し、活性な患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を、がんに罹患している患者に注入して戻すことができ、かつｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進することができ、患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞集団の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、免疫療法組成物が提供される。
一態様では、上述のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子が本明細書で提供される。
本発明の免疫療法組成物の患者特異的な自家リンパ球集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一態様では、ＤｕｏＣＡＲは、診断、がん患者の無増悪生存期間などの処置転帰のモニタリングおよび／もしくは予測における使用のため、またはかかる処置の進行をモニタリングするために、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、開示されるＤｕｏＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターなどのベクター中に含まれ得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクター、またはそれらの組合せである。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのある特定の実施形態では、２つ以上のレンチウイルスベクターは、例えば、限定としてではなく、両種指向性マウス白血病ウイルス［ＭＬＶ－Ａ］、ヒヒ内在性ウイルス（ＢａＥＶ）、ＧＰ１６４、テナガザル白血病ウイルス［ＧＡＬＶ］、ＲＤ１１４、ネコ内在性ウイルスレトロウイルス由来ＧＰ、および水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ］、麻疹ウイルス、家禽ペストウイルス［ＦＰＶ］、エボラウイルス［ＥｂｏＶ］、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス［ＬＣＭＶ］）非レトロウイルス由来ＧＰを含む、異なるウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、ならびに例えば、限定としてではなく、ＭＬＶ－Ａ ＧＰの細胞質尾部（ＴＲと称される）に融合されたＧＡＬＶまたはＲＤ１１４ ＧＰの細胞外および膜貫通ドメインをコードするキメラＧＰを含む、それらのキメラバリアントでシュードタイプ化される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーターまたはそれらの任意の組合せであるプロモーターをさらに含む。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、自殺スイッチによって、ＣＡＲ Ｔ細胞の発現を制御するため、またはＣＡＲ－Ｔ細胞を排除するために、１または複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物が含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに改変され得る。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の態様では、ＤｕｏＣＡＲをコードする核酸分子（複数可）を含む宿主細胞もまた提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、対象から得られた初代Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、釣り合いを気にせずに患者の産物から直接精製された選択されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球である。別の実施形態では、産物中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は特異的である。別の実施形態では、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、調節性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）、誘導調節性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）、サプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）、幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を含む表現型マーカーによって同定されるＴ細胞の特異的サブセットが利用される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の集団を含む抗腫瘍有効量の免疫療法組成物を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、少なくとも２つのベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、各ベクターが、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せが、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）が、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の集団を含む抗腫瘍有効量の免疫療法組成物を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各ベクターが、機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが、少なくとも１つの結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され；（ｄ）ベクターのうち１つにおける少なくとも１つの結合性ドメインが、同一ではなく；（ｅ）少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の集団を含む抗腫瘍有効量の免疫療法組成物を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各ベクターが、機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが、少なくとも１つの結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクターにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）が、同一ではなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組合せが、ベクターそれぞれの間で同一ではなく；（ｆ）少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、２つ以上のベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物が提供される。
一実施形態では、がんは、１または複数の化学療法剤に対して非応答性の難治性がんである。がんは、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、がんは、血液学的がん、例えば、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、もしくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）または多発性骨髄腫、あるいはそれらの任意の組合せを含む。
さらに別の実施形態では、がんは、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターで形質導入され、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が生成し、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、自家リンパ球細胞集団を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数のレンチウイルスベクターで形質導入されて、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が生成し、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、自家Ｔ細胞集団を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、活性な患者特異的な自家抗腫瘍ＤｕｏＣＡＲを含むリンパ球細胞を作製する方法が提供される。この方法は、抗原に特異的に結合する２つ以上のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のベクターまたは核酸分子をリンパ球細胞に形質導入し、それによって、活性な患者特異的な自家抗腫瘍ＤｕｏＣＡＲを含むリンパ球細胞を作製するステップを含む。
さらに別の態様では、ＲＮＡ操作されたリンパ球細胞の集団を生成する方法であって、２つ以上のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを対象の細胞集団中に導入し、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成するステップを含み、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、方法が提供される。
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数のレンチウイルスベクターで形質導入され、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する抗腫瘍有効量の自家リンパ球細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす、方法が提供される。
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターで形質導入されて、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進するために患者に直接注入して戻すことができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する抗腫瘍有効量の自家リンパ球細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす、方法が提供される。
一実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、少なくとも２つのベクターであって、各ベクターが、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せが、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）が、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、ベクター、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、ベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法が提供される。
別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み；（ｂ）各ベクターが、機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが、少なくとも１つの結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され；（ｄ）ベクターのうち１つにおける少なくとも１つの結合性ドメインが、同一ではなく；（ｅ）少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
さらに別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み；（ｂ）各ベクターが、機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが、少なくとも１つの結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクターにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）が、同一ではなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組合せが、ベクターそれぞれの間で同一ではなく；（ｆ）少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記ベクターにおいて共有結合的に連結されており、２つ以上のベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、遺伝子改変されたリンパ球は、自家Ｔ細胞リンパ球であり、自家または同種Ｔ細胞リンパ球は、悪性腫瘍疾患の再発を予防または改善するために、患者に直接注入して戻される。
ある特定の他の実施形態では、遺伝子改変されたリンパ球は、自家Ｔ細胞リンパ球であり、自家リンパ球は、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進するために、患者に直接注入して戻され、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞リンパ球の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす。
さらに別の実施形態では、Ｔ細胞は、特異的活性化または記憶に関連する表面マーカーの発現によって事前選択されている。
さらに別の実施形態では、Ｔ細胞は造血幹細胞ドナーに由来し、手順は造血幹細胞移植の状況で行われる。
ある特定の実施形態では、リンパ球細胞が、特異的活性化または記憶に関連する表面マーカーの発現によって事前選択されている、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、リンパ球細胞が、Ｔ細胞であり、造血幹細胞ドナーに由来し、手順が造血幹細胞移植の状況で行われる、方法が本明細書で提供される。
さらに別の態様では、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作された患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の持続性の集団を生成する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載される１つまたは複数の患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）をそれを必要とするヒト患者に投与するステップを含み、患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の持続性の集団、またはリンパ球細胞の子孫の集団は、ヒト中で、投与後、少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、２年間、または３年間、持続する。
一実施形態では、ヒト中の子孫リンパ球細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。
本明細書に記載される方法の態様および実施形態の全てにおいて、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する上述のがん、疾患、障害または状態のいずれかは、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ免疫療法組成物のうち１または複数を含む患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）を使用して、処置または予防または改善され得る。
さらに別の態様では、上記患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）を含むＤｕｏＣＡＲ免疫療法組成物を作製するためのキット、または上記対象において、腫瘍抗原の上昇した発現と関連するがん、疾患、障害もしくは状態のいずれかを予防、処置もしくは改善するためのキットであって、上に開示された核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは組成物のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せを含むコンテナ、およびキットを使用するための指示書を含むキットが提供される。
本発明の組成物および方法は、ＤｕｏＣＡＲの生成および利用を参照して例示しているが、組成物および方法が、ＴｒｉｏＣＡＲおよびＱｕａｔｒｏＣＡＲの作成および利用を含むことを具体的に意図することが本明細書で企図される。
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、少なくとも１つのベクターをコードする１つまたは複数の単離された核酸を含み、前記ベクターが、ＤｕｏＣＡＲをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（即ち、マルチシストロン性核酸、または１つよりも多い転写物をもたらす核酸）をもたらす核酸配列を含み、２つ以上の同一ではない抗原標的に結合する能力をもたらし、それによって、前記ベクターを発現する単一細胞に存在する複数の抗原特異性を生じる。
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、上記少なくとも２つのベクターをコードする１つまたは複数の単離された核酸を含み、各ベクターが、可溶性バインダー（タグ化ｓｃＦｖ、または抗タグバインダーに連結されたｓｃＦｖなど）の共インキュベーションまたは共投与の際に機能的キメラ抗原受容体を再構成するする機能的タグまたは抗タグ結合性部分（ＡＴ－ＣＡＲ）をさらにコードし、それによって、２つのベクターの組合せが、２つ以上の同一ではない抗原結合性ドメインに結合する能力をもたらし、これらの２つのベクターを発現する細胞に存在する複数の抗原特異性を生じる。
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、上記少なくとも２つのベクターをコードする１つまたは複数の単離された核酸を含み、各ベクターが、可溶性バインダー（タグ化ｓｃＦｖ、または抗タグバインダーに連結されたｓｃＦｖなど）の共インキュベーションまたは共投与の際に機能的キメラ抗原受容体を再構成するする機能的タグまたは抗タグ結合性部分（ＡＴ－ＣＡＲ）をコードし、各ベクターが、複数の抗原特異性をもたらす可溶性タンパク質または構造が改変されたタンパク質と結合することができる独自のタグ（または、抗タグ）を発現するか、あるいは各ベクターが、タグ化（または、抗タグ化）バインダーの抗原結合性ドメインへの細胞内シグナル伝達モチーフがコードされるＡＴ－ＣＡＲの特異的連結をもたらす唯一の可溶性結合性ドメインと結合する独自のタグ（または抗タグ）を発現する。
ＤｕｏＣＡＲベクターの製造のための非限定的な実施形態では、上記で言及される実施形態および態様に開示される組成物および方法のそれぞれは、２つのベクターを、別々に作製し、次いで、続けてまたは同時に、Ｔ細胞に添加することができる。別の非限定的な実施形態では、２つ以上のベクターのプラスミドＤＮＡを、産生細胞のトランスフェクションの前もしくはその間に混合して、または細胞ゲノムの産生中に組み込んで、複数のＤｕｏＣＡＲベクター粒子を含むウイルスベクターの混合物を産生することができ、その後、患者のＴ細胞の形質導入および遺伝子改変のために使用することができる。
本明細書で具体的に企図されるＤｕｏＣＡＲ、ＴｒｉｏＣＡＲ、およびＱｕａｔｒｏＣＡＲの種々の態様および実施形態それぞれのために、機能的ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、９、２１、２５、２９、３１、３５、３９、４３、４７、４９、５１、５３、５５、５９、６１、１０９、１１１、１１３、もしくは１１５、またはそれらの任意の組合せのヌクレオチド配列を含む。
本明細書で具体的に企図されるＤｕｏＣＡＲ、ＴｒｉｏＣＡＲ、およびＱｕａｔｒｏＣＡＲの種々の態様および実施形態それぞれのために、各ベクターは、配列番号４、１０、２２、２６、３０、３２、３６、４０、４４、４８、５０、５２、５４、５６、６０、６２、１１０、１１２、１１４、もしくは１１６、またはそれらの任意の組合せのアミノ酸配列を含む機能的ＣＡＲをコードする。
上記の患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）、キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現する２つ以上のレンチウイルスベクター、宿主細胞、および方法は、本明細書に詳細に記載される具体的な態様および実施形態を超えて有用であることが理解される。本開示の前述の特色および利点は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになる。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読んだ場合に、より良好に理解されるであろう。本発明を例証する目的のために、現在好ましい実施形態を図面に示す。しかし、本発明が、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
別々の商業実体として産生され得る４つの産物（実施例１から４）を示す図である。これらのＤｕｏＣＡＲのセットは、３つの白血病関連抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を発現するヒトＢ細胞悪性腫瘍を標的化するために創出することができる。産物１では、２つの遺伝子ベクターを、活性化Ｔ細胞集団を共形質導入するために使用する。第１のベクターは、ＣＤ８膜貫通領域によって接続された単一の細胞内ドメイン（ｚ、ＣＤ３ゼータ鎖）に連結された２つの抗原結合性ドメイン（ＣＤ１９、ＣＤ２０）をコードする（８）。第２のベクターは、ＣＤ２２結合性ドメインおよび２つのシグナル伝達ドメイン（ＢＢ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ由来；およびｚ）をコードする。実施例２の第２の産物は、ＣＤ２８およびｚシグナル伝達ドメインに連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０結合性ドメインを有する第１のベクターを特徴とする。第２のベクターは、ＣＤ２２結合性ドメイン、ならびにＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインをコードし、第３世代ＣＡＲベクターのシグナル伝達パッケージ（３つの異なるシグナル伝達ドメイン）を本質的に反復した。実施例３の第３の産物では、第１のベクターは、ＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインに連結されたＣＤ２０およびＣＤ２２結合性ドメインをコードし、第２のベクターは、ＣＤ２８およびｚシグナル伝達ドメインに連結されたＣＤ１９結合性ドメインをコードする。実施例４の第４の産物では、第１のベクターは、ＣＤ２０およびＣＤ２２結合性ドメイン、ならびにＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインをコードする。第２のベクターは、ＣＤ１９結合性ドメインおよびｚシグナル伝達ドメインをコードする。 Ｂ細胞悪性腫瘍を標的化する治療用産物のためにＤｕｏＣＡＲに組み合わされ得る全ての潜在的な単一の構成要素を示す図である。命名法は図１におけるものと同一である。 炎症性疾患または自己免疫疾患、および感染性疾患を含む複数の治療上の要求に適用することができるＤｕｏＣＡＲについての一般化された模式図を示す図である。図では、ａ－ＣＤＸ、ａ－ＣＤＹ、ａ－ＣＤＺは、それぞれ、３つの異なる標的抗原ＣＤＸ、ＣＤＹ、およびＣＤＺに特異的な抗原結合性ドメインを指す。ＣＡＲの細胞内の態様は全て、ＣＤ８リンカー、およびＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、または４－１ＢＢシグナル伝達ドメインのいずれかに連結された膜貫通ドメインを含む（図１における通り）。単一ベクターに対するこれらの２つのベクター（例えば、例ＡプラスＦ、ここで、抗原Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＣＤ３－ゼータおよび４－１ＢＢを介して細胞内シグナル伝達を提供しながら、標的化される）のうちいずれかの具体的な組合せは、具体的な治療上の要求に従って規定される。 ２つの抗原が各ベクターによって標的化されるＤｕｏＣＡＲのセットについての一般化された模式図を示す図である。図３におけるものと同一のベクターは、それらの具体的な文字の呼称を保持する（図３および図４のＡは同じである）。新たな４番目の抗原結合性ドメインは、ａ－ＣＤＷによって示される。４つの抗原を標的にする１つの産物は、Ａ＋Ｔ ＤｕｏＣＡＲのセットである。この例では、細胞外抗原のＣＤＸ、ＣＤＹ、ＣＤＺ、およびＣＤＷは、ＣＤ３－ゼータおよびＣＤ２８細胞内シグナルの両方を提供しながら、標的化される。 本発明のＤｕｏＣＡＲ（図５Ｅ、５Ｆ、および５Ｇ）と比較した文献における現在のＣＡＲ（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄ）を示す図である。リンカーおよび膜貫通ドメイン（単一の塗りつぶしなしのボックス）に接続された単一の結合性ドメイン（別個の特異性をそれぞれ有する、対の黒色、塗りつぶしなし、または縞模様の球）の発現を誘導するＣＡＲ発現ベクターを創出することができる。図では、太い灰色線は、血漿細胞膜を示す。この図では、対の黒色の球は抗ＣＤ１９－ｓｃＦｖを示し、対の塗りつぶしなしの球は抗ＣＤ２０－ｃｓＦｖを示し、対の縞模様の球は抗ＣＤ２２－ｓｃＦｖを示し、全て、アミノ酸配列、例えば、ＧＧＧＧＳの多量体（１、２、３、４、５、または６反復）を接合させることによって連結される。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、およびＣＤ３－ゼータ鎖由来の細胞内のリンパ球シグナル伝達ドメインは、示されるように、組み合わせることができる。（図５Ａ）単一ＣＡＲでは、単一の結合性ドメインは、膜貫通および２つのシグナル伝達ドメインと組み合わされて、第２世代ＣＡＲが創出される。（図５Ｂ）分割ＣＡＲでは、２つの異なるバインダーが、単一のシグナル伝達ドメインと共に発現され、これは、２つの異なる抗原の認識の際に、有効なＴ細胞シグナル伝達にするように組み合わされなければならない。（図５Ｃ）タンデムＣＡＲでは、２つの結合性ドメインは、単一のシグナル伝達ドメインに連結される。この場合では、いずれかのドメインの結合が、完全なＴ細胞の活性化を誘導する。（図５Ｄ）１つのベクター由来の複数ＣＡＲでは、２つの完全な機能的ＣＡＲが、単一ベクターから発現され、唯一の抗原とそれぞれ結合することができる。（図５Ｅ）対照的に、ＤｕｏＣＡＲは、２つのベクターで構成され、可能性があるシグナル伝達ドメインの複数の組合せと共に少なくとも３つの結合性ドメインを発現する。ＤｕｏＣＡＲを識別する本質的な特色は、２つ以上の転写物の発現、結合性ドメインの多重度（少なくとも１つが多重標的化する）、および２つの発現された細胞表面タンパク質のうち少なくとも１つの完全に機能的なシグナル伝達特徴である。（図５Ｆ）ＤｕｏＣＡＲの単一特異性可溶性バインダーフォーマットでは、ベクターによってコードされるＣＡＲ部分は、膜貫通および細胞内シグナル伝達モチーフもコードするタグまたは抗タグモチーフを発現する（ＣＡＲベースのベクター、細胞内モチーフに関して同一ではない）。ベースのベクターは、抗原と相互作用するｓｃＦｖドメイン、およびＣＡＲベースのタンパク質それ自身への結合を媒介するタグまたは抗タグモチーフの両方を含む可溶性タンパク質と結合する。可溶性タンパク質がＣＡＲベースのタンパク質に結合したら、ＤｕｏＣＡＲ［（Ｅ）における通り］によって媒介される抗腫瘍活性を媒介する同じ構造上の特徴が再構成される。（図５Ｇ）ＤｕｏＣＡＲの二重特異性可溶性バインダーフォーマットでは、唯一の可溶性バインダーが唯一のベースのベクターに結合することができるように、二重特異性の「タグ」－「抗タグ」相互作用は独特である。この例では、ベースのベクターにおける黒色のひし形、および可溶性二重ｓｃＦｖタンパク質における角形バインダーは、「ビオチン」－「抗ビオチン」相互作用を示し得、第２のＣＡＲベースのベクターにおける黒色の三日月形は、単一特異性のｓｃＦｖ構造における黒色の楕円形と相互作用し、「ＦＩＴＣ」－「抗ＦＩＴＣ」相互作用を示し得る。 第２世代（２つの共刺激ドメイン）および第３世代（３つの共刺激ドメイン）のフォーマットの間で異なるＣＡＲ発現ベクターで形質導入された初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲコンストラクトの細胞表面発現レベルを示すグラフである。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：ＣＡＲなし（偽）、第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ａ－２８ｚ）、第３世代ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ａ－２８ＢＢｚ）、および代替の第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ａ－ＢＢｚ）を発現するように形質導入した。ＣＡＲの表面発現のレベルは、フローサイトメトリーによって検出され、ｙ軸の平均蛍光強度（ＭＦ）として報告される。全てのコンストラクトが全く同じＣＡＲ結合性ドメインを発現したにもかかわらず、両方の第２世代ＣＡＲのＭＦＩは、非常に明るかった。 ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ細胞表面発現を示す図である。ヒトＴ細胞を、ＩＬ－２存在下においてＣＤ３－ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴＲａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、２つのベクター（一方はタンデムＣＤ２０－ＣＤ１９ ＣＡＲをコードし、もう一方は単一ＣＤ２２ ＣＡＲをコードする、したがって、２＋１ Ｄｕｏ－Ｓｅｔフォーマット）で形質導入し、次いで、染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を使用して、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１９－、ＣＤ２０－、またはＣＤ２２－ｓｃＦｖドメインの発現について分析した。対の縦列は、ＣＤ２０およびＣＤ１９ ｓｃＦｖについて左の縦列に、ＣＤ２２およびＣＤ１９ ｓｃＦｖについて右の縦列に、二重染色を示す。１行目は、形質導入されていない（ＵＴＤ）Ｔ細胞を示し、したがって結合を示さない。２行目は、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ＣＤ２８およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０＿ＣＤ２９ ＣＡＲベクターをコードするＬＶで形質導入されたＴ細胞を示す（２０－１９－２８ｚ）。二重染色は、ＣＤ２０およびＣＤ１９の結合について見られるが（左のパネル）、ＣＤ１９の結合のみ右パネルに見られる。３行目は、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに細胞内４－１ＢＢおよびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２２ ＣＡＲベクターで形質導入されたＴ細胞を示す（２２－ＢＢｚ）。二重染色は、ＣＤ１９またはＣＤ２０で見られず（左のパネル）、ＣＤ２２に結合することができる細胞の単一の集団のみ見られる（右のパネル）。４行目では、Ｔ細胞は、２行目および３行目の両方のベクターで構成されるＤｕｏＳｅｔで形質導入される。ＤｕｏＳｅｔのみが、３つのＣＡＲコード結合性ドメイン全てを発現する（細胞の４２％がＣＤ２０＿１９を発現し（左のパネル）、３８％がＣＤ２２およびＣＤ１９結合性ドメインを発現する（右のパネル））。ＣＤ２２およびＣＤ１９ ｓｃＦｖは、ＤｕｏＳｅｔを含む２つの別個の膜貫通タンパク質それぞれ上にあるので、３８％は、この例では、真のＤｕｏＳｅｔを発現する集団を示す。 ＤｕｏＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。図７に記載されるように、単一のＣＡＲ構成要素（２０＿１９－２８ｚまたは２２－ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（２０＿１９－２８ｚ＋２２－ＢＢｚ）で形質導入されたヒトＴ細胞を、４つの異なるエフェクター対標的比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、示される通り）で、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて使用した。ＣＡＲ－Ｔ標的として使用される白血病細胞株は、Ｒａｊｉ（３つ全ての標的抗原を発現する）、ＲＥＨ（３つ全ての標的抗原を発現する）、Ｋ５６２（対照、標的発現なし）、Ｋ５６２－ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ５６２－ＣＤ２０（ＣＤ２０を発現する）、およびＫ５６２－ＣＤ２２（ＣＤ２２を発現する）であった。ＤｕｏＣＡＲ形質導入細胞（２０－１９－２８ｚ＋２２－ＢＢｚ、２＋１ ＤｕｏＳｅｔ）のみが、白血病細胞株（ＲａｊｉおよびＲＥＨ）および３つ全ての単一発現Ｋ５６２標的細胞株（Ｋ５６２－ＣＤ１９、Ｋ５６２－ＣＤ２０、Ｋ５６２－ＣＤ２２）の両方に対する高い細胞溶解活性を示した。 ＬＶ調製の２つの異なる方法によって達成される初代ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ細胞表面発現を示す図である。図７におけるものと同じ方法およびデータ分析を使用し、次いで、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２に特異的なＤｕｏＣＡＲ（１つのＣＡＲがタンデムＣＤ２０およびＣＤ１９バインダーであり、第２のＣＡＲがＣＤ２２バインダーで構成される、２＋１ ＤｕｏＳｅｔ）で形質導入された細胞を創出した。１列目のデータは、ＣＤ１９およびＣＤ２０バインダーの発現についてのフローサイトメトリー分析を示すが、２列目は、それぞれ、左下、左上、右上、および右下の象限に、非形質導入、単独ＣＤ２２－ＣＡＲ形質導入、ＣＤ２２およびＣＤ２０＿１９ ＣＡＲによる二重形質導入、ならびにタンデムＣＤ２０＿１９ ＣＡＲによる単独形質導入に対応する４つの異なる集団に対する、ＤｕｏＣＡＲ発現細胞においてＣＡＲとして存在するＣＤ２２およびＣＤ１９バインダーについてのフローサイトメトリー分析を示す。２つのＬＶ形質導入法（共形質導入）および単一ＬＶ形質導入法（共トランスフェクション）の両方とも、類似のＤｕｏＣＡＲ染色パターンを与え、３０％を超えるＴ細胞集団が、両方のＣＡＲ細胞表面タンパク質を発現することによって、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２に特異的であった。 ＤｕｏＣＡＲ２シストロン性コンストラクトの略図を示す図である。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトは、２Ａペプチドによって分離された２つのＣＡＲ鎖の配列を含む単一の２シストロン性オープンリーディングフレームから発現される。１つのＣＡＲは、インフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたＣＤ２２ ｓｃＦｖ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される（図１０Ａ）。別のＣＡＲは、タンデムＣＤ２０ ＣＤ１９ ｓｃＦｖベースの標的化ドメイン、続いてＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される（図１０Ｂ）。 フローサイトメトリーによって測定される、ＤｕｏＣＡＲ発現ベクターで形質導入された初代ヒトＴ細胞におけるＳｅｔ １の２シストロン性ＤｕｏＣＡＲおよび対照の細胞表面発現を示す図である。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号２２２８（２０１９タンデムＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００、２２０９、２２１８、２２２５、２２２７（ＣＤ２２ ＣＡＲバリアント）、コンストラクト番号（ＣＤ２２に標的化される１つのＣＡＲ鎖、ならびにＣＤ２０およびＣＤ１９腫瘍抗原に標的化される別のタンデムＣＡＲ鎖を含む２５１５、２５２０、２５２１２シストロン性ＣＡＲ）を発現するように形質導入した。示される二連のプロットにおいて、ＣＡＲ２２発現をＹ軸に示し、タンデム２０１９ＣＡＲ鎖を表すＣＡＲ１９発現をＸ軸に示す。陽性細胞パーセンテージを各象限に示す。データは、別個の健康なドナーからのＴ細胞における３つの形質導入実験を代表するものである。 Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共インキュベートされた２シストロン性ＤｕｏＣＡＲのセット１のサイトカイン応答を示すグラフである。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号２２２８（－２０１９タンデムＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００（－ＣＤ２２ ＣＡＲ）、コンストラクト番号２５１５、２５２０、２５２１を発現するように形質導入した。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞および対照を、三重陽性Ｒａｊｉ細胞と共に一晩インキュベートし、次いで上清を採取し、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ－２についてＥＬＩＳＡによって分析した。Ｎ＝３、＋／－ＳＤ。別個のドナーからのＴ細胞における３つの単独実験を代表する１つの実験を示す。 フローサイトメトリーによって測定される、ＤｕｏＣＡＲ発現ベクターで形質導入された初代ヒトＴ細胞におけるＳｅｔ ２の２シストロン性ＤｕｏＣＡＲおよび対照の細胞表面発現を示す図である。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号１４９７（－２０１９タンデムＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００（－ＣＤ２２ ＣＡＲ）、ＣＤ２２に標的化される１つのＣＡＲ鎖、ならびにＣＤ２２およびＣＤ１９腫瘍抗原に標的化される別のタンデムＣＡＲ鎖を含む２シストロン性ＣＡＲのコンストラクト番号Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７を発現するように形質導入した。示される二連のプロットにおいて、ＣＡＲ２２発現をＹ軸に示し、タンデム２０１９ＣＡＲ鎖を表すＣＡＲ１９発現をＸ軸に示す。陽性細胞に対するパーセンテージを各象限に示す。データは、３人の別個の健康なドナーからのＴ細胞における３つの形質導入実験を代表するものである。 Ｓｅｔ ２の２シストロン性ＤｕｏＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。単一ＣＡＲ構成要素（ＬＴＧ１４９７、２０＿１９－２８ｚ、またはＬＴＧ２２００、２２－ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７、２０＿１９－２８ｚ＋２２－ＢＢｚをコードする）で形質導入されたヒトＴ細胞を、４つの異なるエフェクター対標的比（１０：１、５：１、２．５：１、示される通り、コンストラクト名称の「Ｄ」および数字表示の間のゼロは簡素化のために省略した）で、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて使用した。ＣＡＲ－Ｔ標的として使用される白血病細胞株は、Ｒａｊｉ（３つ全ての標的抗原を発現する）、Ｒｅｈ（３つ全ての標的抗原を発現する）、３９２Ｔ（３つ全ての標的抗原を欠く）であった。ＤｕｏＣＡＲは、Ｅ：Ｔ依存性の様式で、三重陽性細胞株を溶解し、標的陰性２９３Ｔ細胞株では溶解は起こらなかった。 ２シストロン性ＤｕｏＣＡＲセット２発現Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。単一ＣＡＲ構成要素（ＬＴＧ１４９７、２０＿１９－２８ｚ、またはＬＴＧ２２００、２２－ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７、２０＿１９－２８ｚ＋２２－ＢＢｚをコードする）で形質導入されたヒトＴ細胞を、４つの異なるエフェクター対標的比（１０：１、５：１、２．５：１、示される通り、コンストラクト名称の「Ｄ」および数字表示の間のゼロは簡素化のために省略した）で、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて使用した。ＣＡＲ－Ｔ標的として使用される単一陽性腫瘍細胞株は、Ｋ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ２０（ＣＤ２０を発現する）、およびＫ２２（ＣＤ２２を発現する）であった。３つの単一陽性腫瘍細胞株を、所望の単一抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２）およびホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定な形質導入によって、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２発現を天然で欠いている親Ｋ５６２赤白血病株のバックグラウンドで開発した。ＤｕｏＣＡＲは、Ｅ：Ｔ依存性の様式で、単一陽性細胞株を溶解し、バックグラウンドレベルを上回る溶解は、不一致の抗原標的化ドメイン（ＣＡＲ ２２、ＬＴＧ ２２００対Ｋ１９およびＫ２０、タンデムＣＡＲ ２０１９、ＬＴＧ １４７９対Ｋ２２）を有するＣＡＲ対照によって媒介されなかった。 Ｒａｊｉ腫瘍細胞と共に共インキュベートされたか、または腫瘍の非存在下でインキュベートされた（ＣＡＲ単独）、２シストロン性ＤｕｏＣＡＲバージョン２のサイトカイン応答を示すグラフである。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：ＣＡＲなし（ＵＴＤ）、コンストラクト番号２２７３（－２０１９タンデム単鎖ＣＡＲ）、コンストラクト番号２２００（ＣＤ２２単鎖ＣＡＲ）、コンストラクト番号Ｄ４４、Ｄ４７（それぞれ、Ｄ００４４およびＤ００４７ ＣＡＲコンストラクトを参照、コンストラクト名称の「Ｄ」および数字表示の間のゼロは簡素化のために省略した）を発現するように形質導入した。ＤｕｏＣＡＲおよびＴ細胞および対照を、三重陽性Ｒａｊｉ細胞と共に一晩インキュベートし、次いで上清を採取し、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ－２についてＥＬＩＳＡによって分析した。Ｎ＝３、＋／－ＳＤ。別個のドナーからのＴ細胞における３つの単独実験を代表する１つの実験を示す。 共トランスフェクションまたは共形質導入によってＤｕｏＣＡＲを生成するための同じ細胞または細胞の集団における共発現のために組み合わされ得る２つのＣＡＲ鎖の略図を示す図である。１つのＣＡＲ鎖は、インフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたＣＤ２２ ｓｃＦｖ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される。別のＣＡＲ鎖は、タンデムＣＤ２０ ＣＤ１９ ｓｃＦｖベースの標的化ドメイン、続いてＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される。 フローサイトメトリーによって測定される、ＬＶを産生する２つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成したＤｕｏＣＡＲ発現ベクター調製物、または個々に形質導入された単一ベクター対照（上のパネル）で形質導入された初代ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲおよび対照の細胞表面発現を示す図である。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：コンストラクト番号２２７３、２２２８（－２０１９タンデムＣＡＲ）、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、ＣＤ２２ ＣＡＲ、およびＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３）を発現するように形質導入した。示される散布図において、ＣＡＲ２２発現をＹ軸に示し、タンデム２０１９ＣＡＲ鎖を表すＣＡＲ１９発現をＸ軸に示す。陽性細胞に対するパーセンテージを各象限に示す。３人のドナーからのＴ細胞を使用する３つの実験についての代表的なデータ。 ＤｕｏＣＡＲ細胞または単鎖ＣＡＲ対照の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウイルスベクターを産生する２つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成した。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：コンストラクト番号２２７３（－２０１９単鎖タンデムＣＡＲ）；コンストラクト番号Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３（－ＣＤ２２単鎖ＣＡＲ）；および同じＣＡＲ Ｔ産物において２つの単一ＣＡＲ鎖の組合せによって生成したＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、数字表示における「Ｄ」は簡素化のために省略）を発現するように、得られるＤｕｏＣＡＲベクターまたは単鎖ＣＡＲ対照で形質導入した。得られるＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ、Ｒｅｈ）またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重陰性対照株２９３Ｔであるネイティブ白血病株に対して、２つの異なるエフェクター対標的比（１０：１、５：１、示される通り）で、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて分析した（図１９Ａ）。ネイティブ標的株ＲａｊｉおよびＲｅｈを、全てのＤｕｏＣＡＲ群のコンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３（数字表示における「Ｄ」は簡素化のために省略）による単鎖ＣＡＲコンストラクトによって、および単鎖ＣＡＲ対照によって、溶解した。対照的に、ＤｕｏＣＡＲおよび単一ＣＡＲ対照は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重陰性株２９３Ｔに対して細胞溶解性ではなく、ＣＡＲコンストラクトの標的特異性を実証した。ＤｕｏＣＡＲは、３つの標的抗原を同時に標的化するので、標的特異性の問題にさらに対処するために、ＤｕｏＣＡＲを、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２発現を天然で欠いているＫ５６２赤白血病細胞のバックグラウンドにおいて作製されたトランスジェニック単一陽性腫瘍株に対して試験した。ＣＡＲ－Ｔ標的として使用される単一陽性腫瘍細胞株は、Ｋ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ２０（ＣＤ２０を発現する）、およびＫ２２（ＣＤ２２を発現する）であった、図１９Ｂ。ＤｕｏＣＡＲは、Ｅ：Ｔ依存性の様式で、単一陽性細胞株を溶解し、ＤｕｏＣＡＲの全ての標的化ドメインが機能し、それらの同族標的分子に特異的であることを示した（図１９Ｂ）。さらに、不一致の抗原標的化ドメイン（ＣＡＲ ２２、ＬＴＧ ２２００対Ｋ１９およびＫ２０、タンデムＣＡＲ ２０１９、ＬＴＧ １４７９対Ｋ２２）を有するＣＡＲ単鎖対照は、特異的な溶解活性を有していなかった（図１９Ｂ）。 ＤｕｏＣＡＲ細胞または単鎖ＣＡＲ対照の抗腫瘍細胞溶解活性を示すグラフである。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウイルスベクターを産生する２つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成した。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：コンストラクト番号２２７３（－２０１９単鎖タンデムＣＡＲ）；コンストラクト番号Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３（－ＣＤ２２単鎖ＣＡＲ）；および同じＣＡＲ Ｔ産物において２つの単一ＣＡＲ鎖の組合せによって生成したＤｕｏＣＡＲ（コンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、数字表示における「Ｄ」は簡素化のために省略）を発現するように、得られるＤｕｏＣＡＲベクターまたは単鎖ＣＡＲ対照で形質導入した。得られるＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉ、Ｒｅｈ）またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重陰性対照株２９３Ｔであるネイティブ白血病株に対して、２つの異なるエフェクター対標的比（１０：１、５：１、示される通り）で、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて分析した（図１９Ａ）。ネイティブ標的株ＲａｊｉおよびＲｅｈを、全てのＤｕｏＣＡＲ群のコンストラクト番号Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３（数字表示における「Ｄ」は簡素化のために省略）による単鎖ＣＡＲコンストラクトによって、および単鎖ＣＡＲ対照によって、溶解した。対照的に、ＤｕｏＣＡＲおよび単一ＣＡＲ対照は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２三重陰性株２９３Ｔに対して細胞溶解性ではなく、ＣＡＲコンストラクトの標的特異性を実証した。ＤｕｏＣＡＲは、３つの標的抗原を同時に標的化するので、標的特異性の問題にさらに対処するために、ＤｕｏＣＡＲを、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２発現を天然で欠いているＫ５６２赤白血病細胞のバックグラウンドにおいて作製されたトランスジェニック単一陽性腫瘍株に対して試験した。ＣＡＲ－Ｔ標的として使用される単一陽性腫瘍細胞株は、Ｋ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ２０（ＣＤ２０を発現する）、およびＫ２２（ＣＤ２２を発現する）であった、図１９Ｂ。ＤｕｏＣＡＲは、Ｅ：Ｔ依存性の様式で、単一陽性細胞株を溶解し、ＤｕｏＣＡＲの全ての標的化ドメインが機能し、それらの同族標的分子に特異的であることを示した（図１９Ｂ）。さらに、不一致の抗原標的化ドメイン（ＣＡＲ ２２、ＬＴＧ ２２００対Ｋ１９およびＫ２０、タンデムＣＡＲ ２０１９、ＬＴＧ １４７９対Ｋ２２）を有するＣＡＲ単鎖対照は、特異的な溶解活性を有していなかった（図１９Ｂ）。 Ｒａｊｉ１３Ｇ１１、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋クローンに反応したＤｕｏＣＡＲ細胞または単鎖ＣＡＲ対照のサイトカイン放出活性を示すグラフである。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウイルスベクターを産生する２つの移入プラスミドの共トランスフェクションによって生成した。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：コンストラクト番号２２７３（－２０１９タンデムＣＡＲ）；コンストラクト番号Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３（－ＣＤ２２ ＣＡＲ）；および３つのＤｕｏＣＡＲ（Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３、図２０、群のラベルにおける「Ｄ」は簡素化のために省略）を発現するように、単鎖ＣＡＲ対照ベクターの得られるＤｕｏＣＡＲベクターで形質導入した。得られるＣＡＲ Ｔ細胞を、１０のＥ：Ｔ比で三重陽性Ｒａｊｉ腫瘍株と終夜混合し、培養上清を、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ－２について分析した。全てのＤｕｏＣＡＲコンストラクトは、Ｒａｊｉ細胞に反応して、高いレベルの３つのサイトカインを生産した。Ｒａｊｉ標的の非存在下でインキュベートされたＣＡＲ Ｔ細胞で構成されるＤｕｏＣＡＲ単独対照は、Ｒａｊｉ１３Ｇ１１細胞に反応して感知できるサイトカインを産生せず、サイトカイン応答が標的特異的であることが実証された（図２０）。 ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を同時に標的化するＤｕｏＣＡＲ、ならびにタンデムおよび単一ＣＡＲ対照の構築を示す図である。各ＤｕｏＣＡＲは、第１世代、または第２世代の単一標的化ＣＤ２２ ＣＡＲと共に共発現されるタンデムＣＤ２０およびＣＤ１９二重標的化ＣＡＲで構成される。２つのＣＡＲコンストラクトは、２シストロン性フォーマットで共発現され、リボソームスキップ部位２Ａ配列によって連結されて、化学量論的に等しい２つのＣＡＲ鎖の発現を確実にする。この２シストロン性発現カセットの性質のために、両方のＣＡＲ鎖は、各形質導入Ｔ細胞において共発現される。（図２１Ａ）三重標的化抗ＣＤ２０および抗ＣＤ１９抗ＣＤ２２ ＤｕｏＣＡＲのＤ９３は、２０－１９タンデムＳｃＦｖ、ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ｚ活性化ドメイン、続いて２Ａ配列で構成され、次に、単一標的化ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ｚ活性化ドメインから構成される。ＤｕｏＣＡＲのＤ９４は、ＩＣＯＳ共刺激ドメインのＯＸ４０ドメインでの置換を除いて、Ｄ９３として構築される。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ９５は、ＩＣＯＳ共刺激ドメインのＣＤ２２ ＣＡＲ鎖への付加を除いて、Ｄ９４として構築される。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ９６は、Ｄ９５コンストラクトにおけるＯＸ４０共刺激ドメインのＣＤ２７共刺激ドメインでの置換を除いて、コンストラクトＤ９５として構成される。全てのコンストラクトは、ＣＤ８由来ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。タンデムコンストラクトの１４９７および単一ＣＡＲコンストラクトのＤ８９、Ｄ９２、１５３８、１４９７は、機能的対照を示す。（図２１Ｂ）１つのタンデムＣＡＲ鎖および１つの単一ＣＡＲ鎖が同じＴ細胞において共発現されるＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞、タンデムＣＡＲ、第２世代の単一ＣＡＲ（共刺激ドメインなし）、および第１世代の単一ＣＡＲ（共刺激ドメインなし）を模式的に示す。 ヒト初代Ｔ細胞におけるＤｕｏ－ＣＡＲ ＴコンストラクトのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、Ｄ９６、およびタンデムＣＡＲの１４９７（比較）の表面発現。ＣＡＲ Ｔ発現は、フローサイトメトリーにより決定した。材料および方法において記載されるように、Ｔ細胞を、ＩＬ－２存在下においてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ＣＤ３ ＣＤ２８試薬で活性化し、ＭＯＩ８０でＬＶを形質導入した。培養８日目に、３つの染色方法、即ち、ＣＤ１９ Ｆｃに続いて抗Ｆｃ－ＡＦ６４７、ＣＤ２０ビオチン試薬に続いてストレプトアビジンＰＥ、またはＣＤ２２－ｈｉｓ試薬に続いて抗ｈｉｓ－ＰＥ染色の１つを使用して、ＣＡＲ表面発現について生存形質導入Ｔ細胞（７－ＡＡＤ陰性）を検定した。図２２Ａ。４つの実験からの１つの代表的な形質導入実験を示す。ＣＤ１９標的化ｓｃＦｖに対するＣＤ２０標的化ｓｃＦｖの発現を上のパネルに示し、ＣＤ１９標的化ｓｃＦｖの発現に対するＣＤ２２標的化ｓｃＦｖの発現を下のパネルに示す。形質導入において使用したＬＶを、各縦列の上部に示す。ＣＡＲ Ｔ陽性集団のパーセンテージを、ヒストグラムの各象限に示す。図２２Ｂ。異なるドナーからのＴ細胞において行った４つの形質導入実験についての平均ＤｕｏＣＡＲ発現パーセンテージ±ＳＥＭを示す。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ＣＡＲ１９＋ＣＡＲ２２＋細胞と規定し、各細胞において共発現される２つのＤｕｏＣＡＲ鎖の同時検出を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＡＲ Ｔ細胞傷害性を示すグラフである。ルシフェラーゼが安定に形質導入されたＲａｊｉ １３Ｇ１１ ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋、ＲＥＨ ＣＤ１９＋ＣＤ２０ｌｏｗＣＤ２２＋、またはＣＤ１９－ＣＤ２２－細胞株（２９３ＴまたはＫ５６２）を使用して、ルシフェラーゼ系細胞傷害性アッセイを行った。ＤｕｏＣＡＲのＤ１～Ｄ４、タンデムＣＡＲの１４９７、または単一ＣＡＲのＤ８９およびＤ９２による標的細胞の特異的溶解を、図２３Ａ）Ｒａｊｉ細胞、図２３Ｂ）Ｒｅｈ細胞、図２３Ｃ）Ｋ５６２細胞、または図２３Ｄ）２９３Ｔ細胞について示す。陰性対照であるＵＴＤ非形質導入Ｔ細胞を含めた。ＣＡＲ Ｔ細胞と標的腫瘍細胞を、記載するエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（ｘ軸）で一晩共インキュベートした。エラーバーは、３回の技術反復実験からの平均値を表す。３人のドナーからのＴ細胞における３つの単独実験を代表する１つの実験を示す。バーは、３人の別個のドナーからのＣＡＲ Ｔ細胞を用いて行った３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＤ値を示す。 白血病細胞株に反応したＣＡＲ Ｔサイトカイン放出。ｘ軸に記載するＣＡＲ－Ｔによる、Ｒａｊｉ白血病株と１０：１のＥ：Ｔ比で一晩共培養後のサイトカインのＩＬ－２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの産生を、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。バーは、３つの反復実験試料の平均＋ＳＤを表す。データは、３人の別個のドナーからのＣＡＲ Ｔ細胞を用いて行った３つの独立した実験を代表するものである。 ＤｕｏＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。Ｒａｊｉ腫瘍を保持するＮＳＧマウスを、ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞のＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６、またはタンデムＣＡＲの１４９７、または単一ＣＡＲのＤ８９もしくはＤ９２で処置した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍接種の７日後に、マウス当たりＣＡＲ Ｔ細胞５００万個（図２５Ａ）またはマウス当たりＣＡＲ Ｔ細胞２００万個（図２５Ｂ）の用量のいずれかで、ｉ．ｖ．注射した。腫瘍量を、示された日に、生物発光によって評価した。群当たりＮ＝６マウス、平均放射輝度±ＳＥＭを示す。 ＣＤ２２ ＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞（図２６Ａ～２６Ｄ）、および親Ａ４３１陰性対照株、または抗原逃避クローンを示すＣＤ１９、ＣＤ２０、もしくはＣＤ２２のいずれかの発現を欠くように操作されたＲａｊｉ白血病株クローン、および比較のための親Ｒａｊｉ株（図２６Ｅ～Ｈ）の特異性を確認するために、１つの標的抗原だけを過剰発現するように形質導入されたＡ４３１腫瘍株クローンに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＡＲ Ｔ細胞傷害性を示すグラフである。全ての標的株は、ホタルルシフェラーゼを安定に発現した。バーは、３人の別個のドナーからのＣＡＲ Ｔ細胞を用いて行った３つの独立した実験を代表する１つの実験からの３通りの定量の平均±ＳＥＭ値を表す。 腫瘍抗原逃避のモデルにおけるＤｕｏＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。ＮＳＧマウスに、等割合のＲａｊｉ ＣＤ１９ｎｅｇ、Ｒａｊｉ ＣＤ２０ｎｅｇ、Ｒａｊｉ ＣＤ２２ｎｅｇ、および親Ｒａｊｉクローンの混合物を接種した。Ｒａｊｉ腫瘍を、ＣＤ１９、ＣＤ２０、もしくはＣＤ２２抗原を標的化することができるＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞のＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、もしくはＤ９６、または単一ＣＡＲ対照：ＣＡＲ２２ Ｄ９２、ＣＡＲ１９ １５３８、もしくはＣＡＲ２０ １４９５で処理した。Ｔ細胞を、腫瘍接種の７日後に、マウス当たりＣＡＲ Ｔ細胞５００万個の用量で、ｉ．ｖ．注射し、腫瘍量を、示された日に、生物発光によって評価した。群当たりＮ＝６マウス、平均放射輝度±ＳＥＭを示す。
詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方を指す。例えば、用語「１つの抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「１つの抗原を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を排除することなく、「１つの抗原を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。語句「および／または」とは、「および」または「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値は、特記しない限り、おおよそであり、便宜的に提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特に適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
用語「約」とは、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定された値から＋／－２０％、＋／－１０％、またはより好ましくは＋／－５％、または＋／－１％、またはさらにより好ましくは＋／－０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示される方法を実施するために適切である。
特記しない限り、本明細書の技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、１９９９年；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５年；および他の類似の参考文献中に見出すことができる。
本発明は、疾患および／または状態、ならびに血液学的悪性腫瘍および固形腫瘍を含むがこれらに限定されないがんを処置するための組成物および方法に関する。本発明は、１つまたは複数のＤｕｏＣＡＲを発現するように２つ以上のベクターで形質導入されたＴ細胞の養子細胞移入の患者特異的な腫瘍特異的戦略に関する。
本発明は、より詳細には、キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクターに関するだけでなく、ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで形質導入された宿主細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞）、レンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、および例えば対象におけるがんを処置するためにも提供されるそれを使用する方法にも関する。
驚くべきことに、かつ予想外にも、ここで、自家リンパ球細胞集団が単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターで形質導入される場合に、患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を含む免疫療法組成物が、抗腫瘍免疫療法薬として非常に有効であることが発明者によって発見された。単一または複数のＣＡＲを発現する少なくとも２つ以上のレンチウイルスベクターの使用は、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進するようであり、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらす。
本明細書に記載されるかかる活性な患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞集団は、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進するために、患者に直接注入して戻すことができ、患者特異的な抗腫瘍Ｔ細胞の持続は、患者特異的な様式で、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの寛解、またはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの組合せをもたらす。これは、治療用細胞集団の効率的な増殖および迅速な縮小も含む。
したがって、その最も広い態様では、この養子免疫療法の新規性は、ＣＡＲ発現ベクターの組合せの使用にある。識別する特色は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体を発現する単一ベクター従来の使用に反して、ＤｕｏＣＡＲ手法が、複数の抗原特異性およびｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍Ｔ細胞活性のための最適なシグナル伝達の両方を付与することである。３つ以上の抗原が効率的に標的化されるシステムを創出することは、腫瘍がん細胞が腫瘍転移および／または腫瘍再発をもたらす逃避バリアントを生じることを可能にする単一またはタンデム手法よりもはるかに優れている。各ベクターにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）の特異的な組合せが同一ではない単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のベクターの使用は、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組合せ（複数可）が、ベクターそれぞれの間で同一ではない要件と相まって、かかるｄｕｏレンチウイルスベクター由来ＣＡＲで形質導入された遺伝子改変された１つまたは複数のリンパ球集団が、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖を促進することができる患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生じ、患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞の持続が、患者特異的な様式で、腫瘍もしくはがんの安定化、低減、排除、もしくは寛解、および／または腫瘍もしくはがんの再発の予防もしくは改善、あるいはそれらの任意の組合せをもたらすことを確実にする働きをする。
一態様では、少なくとも２つのベクター（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、ベクターのうち１つにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）は、同一ではなく、それによりベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。
別の態様では、少なくとも２つのベクター（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物が提供され、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、但し前記免疫療法組成物は、図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、または（Ｄ）にそれぞれ示される、単一ＣＡＲ、分割ＣＡＲ、タンデムＣＡＲ、または複数ＣＡＲを特異的に除外する。
本発明のＤｕｏＣＡＲレンチウイルスベクター改変Ｔ細胞で達成される、免疫療法有効性、および腫瘍もしくはがんの再発の予防または改善は、単独の従来のＣＡＲ設計で達成されるものよりも有意に大きく、かつ相乗的である。それは、ｉｎ ｖｉｖｏ増殖の増加と相関する生物学的治療利益のこの独自の組合せであり、患者特異的な抗腫瘍リンパ球細胞の持続は、従来のＣＡＲベースのＴ細胞免疫療法と比較して、腫瘍もしくはがんの安定化、低減、排除、もしくは寛解をもたらす。
リンカーおよび膜貫通ドメイン（単一の塗りつぶしなしのボックス）に接続された単一の結合性ドメイン（別個の特異性をそれぞれ有する、黒色、塗りつぶしなし、または縞模様の球、図５）の発現を誘導するＣＡＲ発現ベクターを創出することができる。以下の図５は、本発明のＤｕｏＣＡＲに対する従来のＣＡＲの比較を示す。図５では、太い灰色線は、血漿細胞膜を示す。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、およびＣＤ３－ゼータ鎖由来の細胞内のリンパ球シグナル伝達ドメインは、示されるように、組み合わせることができる。本文書におけるＣＤ３シグナル伝達ドメインの全ての例および使用において、１、２、もしくは３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のいずれかの、その中のチロシン残基の選択的突然変異誘発、またはそのＩＴＡＭモチーフをもはやリン酸化のための標的ではなくする他のかかる突然変異による変更によるＣＤ３ゼータ鎖の改変が含まれる。単一ＣＡＲ（図５Ａ）では、単一の結合性ドメインは、膜貫通および２つのシグナル伝達ドメインと組み合わされる。分割ＣＡＲ（図５Ｂ）では、２つの異なるバインダーは、有効にシグナル伝達するように組み合わされなければならない単一のシグナル伝達ドメインと共に発現される。タンデムＣＡＲ（図５Ｃ）では、２つの結合性ドメインは、単一のシグナル伝達ドメインに連結されている。１つのベクター由来の複数ＣＡＲ（図５Ｄ）では、２つの完全な機能的ＣＡＲは、単一ベクターから発現される。本発明のＤｕｏ－ＣＡＲ（例えば、図５Ｅ）は、少なくとも２つのベクターをコードし、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている。本発明のＤｕｏＣＡＲを識別する本質的な特色は、２つ以上のベクターの使用、結合性ドメインの多重度、および２つの発現された細胞表面タンパク質のうち少なくとも１つの完全に機能的なシグナル伝達特徴（ｉｎ ｖｉｖｏのＴ細胞増殖に関連する）である。
別の態様では、ＤｕｏＣＡＲは、治療用Ｔ細胞集団によって媒介される腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用される。免疫応答は少なくとも３つの方法で増強される。
第１に、Ｔ細胞に身体における増殖および生存のための追加シグナルを提供することによって、本発明のＤｕｏＣＡＲは、自己抗原（例えば、ＣＤ１９）に遭遇する際に、Ｔ細胞集団を刺激することにより治療用Ｔ細胞集団の持続を可能にし、その喪失に、患者は耐えることができるが、依然として、これは、腫瘍組織それ自体には存在しない治療用細胞集団のために刺激シグナルを提供する働きをする。第３世代のＤｕｏＣＡＲ（単一の細胞外Ｉｇ様バインダーに連結された３つの共刺激ドメインを細胞内で発現する）が、２つの細胞内共刺激ドメインを発現するＤｕｏＣＡＲのものと比較して、治療用Ｔ細胞において良好に発現されないことは周知である／確立されている。例えば、以下の図６では、初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲコンストラクトの発現レベルは、第２世代（２つの共刺激ドメイン）および第３世代（３つの共刺激ドメイン）のコンストラクトの間で異なる。Ｔ細胞を、以下のＣＡＲ：ＣＡＲなし（偽）、第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ａ－２８ｚ）、第３世代ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ａ－２８ＢＢｚ）、および代替の第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ－Ａ－ＢＢｚ）を発現するように形質導入した。ＣＡＲの表面発現のレベルは、フローサイトメトリーによって検出され、ｙ軸の平均蛍光強度（ＭＦ）として報告される。全てのコンストラクトが全く同じＣＡＲ結合性ドメインを発現したにもかかわらず、両方の第２世代ＣＡＲのＭＦＩは、非常に明るかった。
別個のベクターＣＡＲコンストラクト上に第３のＴ細胞を活性化する配列を提供することによって、発明者は、Ｔ細胞表面におけるＣＡＲの発現の減少の不利益を被ることなく、３つの共刺激ドメインを発現する利点を取り戻すことが可能である。
第２の態様では、本発明のＤｕｏＣＡＲは、免疫抑制効果を媒介する腫瘍以外の細胞型を標的化してもよい。例えば、ＣＤ１９発現Ｂ細胞が腫瘍病変に存在し、抗腫瘍免疫も阻害する場合、ＩＬ－４または他のメディエーターの産生によるように、免疫抑制性細胞集団であるＤｕｏＣＡＲ発現腫瘍特異的Ｔ細胞集団の使用に対する第２の利益も除去される。
例えば、免疫抑制性Ｂ細胞が固形腫瘍病変内に存在する場合、これらは、Ｂ細胞特異的ＤｕｏＣＡＲ（ＣＤ１９特異的ＤｕｏＣＡＲなど）の使用によって排除され得る。免疫抑制性線維芽細胞様細胞が存在する場合、これらは、間質特異的ＤｕｏＣＡＲによって（例えば、線維芽細胞活性化タンパク質－アルファ（ＦＡＰ）を標的化することによって）除去され得る。奇形の脈管構造が、有効な免疫応答の欠如の原因となる場合、これらの種類の血管またはリンパ管の特異的標的（抗ＶＥＧＦＲなど）に特異的なＤｕｏＣＡＲは、治療結果も改善し得る。
第３の態様では、本発明のＤｕｏＣＡＲは、腫瘍の遠位にある、即ち、身体における別の区画に存在する、免疫抑制性集団を標的化する。例えば、腫瘍病変それ自体、または局所リンパ節もしくは骨髄のいずれかに存在し得る、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を標的化するためにＤｕｏＣＡＲを使用することである。腫瘍流入領域リンパ節は、免疫活性化または免疫抑制の遺伝子座のいずれかであり得ることが十分に確立されている。これは、リンパ節の全体的な炎症トーン、およびリンパ節への移動前の遠位の樹状細胞分化に依存する。腫瘍流入領域リンパ節が、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、または樹状細胞などの誤分化した抗原提示細胞と集合する場合、これらの細胞型を標的化するＤｕｏＣＡＲは、腫瘍それ自体の遠位であるが、治療結果も改善し得る。がん特異的なＤｕｏＣＡＲの免疫療法適用を越えて、ＤｕｏＣＡＲの第２の適用は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の予防または処置であろう。腫瘍学ベースの適用からの相違は、調節性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）、または誘導調節性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）、またはＴｈ－２様免疫応答を促進する条件で培養される他の細胞が、細胞性基質であることである。腫瘍学的適用では、Ｔｈ－１様細胞は細胞性基質である。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、アレルギー性の気道、腸、または他の粘膜炎症、または皮膚のアレルギーと同じぐらい多様な治療適用において、トランスフォーミング成長因子－ベータ（ＴＦＧ－ベータ）などの免疫阻害性サイトカインを産生するＣＡＲ改変リンパ球の存在は、自己免疫または炎症を駆動する疾患を改善する幅広い寛容原性シグナルを発揮する働きをする。この手法は、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷性脳損傷、パーキンソン病、およびＣＴＥ（繰り返す脳振盪または微小の脳震盪による慢性外傷性脳症）などの末梢または中枢神経系（ＣＮＳ）の神経学的炎症状態を含む。この手法は、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）などの進行性の瘢痕性疾患も含む。
炎症性疾患の処置では、組織抗原に特異的なリンパ球、炎症を起こした細胞の表面上のマーカーの窮迫、またはミスホールディングされたタンパク質（タウタンパク質、またはベータ－アミロイドなど）は、これらの標的に特異的なＤｕｏＣＡＲ発現ベクターを生成することによって創出される。アルツハイマーのための単一抗体ベースの療法は、既に臨床開発中である（即ち、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙによるソラネズマブ、およびＢｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．によるアデュカヌマブ）。アルツハイマー病において、単量体のまたは凝集したベータ－アミロイドに対する抗体は、細胞表面タンパク質に対するバインダーの代わりに、ＣＡＲフォーマットで使用され得る。ＭＨＣ分子に結合したタウタンパク質またはタウ－ペプチドに対するバインダーは、ＣＡＲのための結合性モチーフとして使用することもできる。リンパ球の特異的な末梢組織へのホーミングを媒介する受容体も、ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ集団に対して局所特異的にするために、ＣＡＲフォーマットに含まれ得る。特異的組織、およびサイトカイン配列、またはサイトカインもしくはケモカイン受容体、またはバインダーへのリンパ球炎症を駆動することが公知の接着受容体ドメインは、ＣＡＲドメインの一部として使用され得る。ＣＤ４４およびインテグリンアルファ－４などの接着分子は、リンパ球をＣＮＳに標的化することが公知であり、したがって、リンパ球集団のＣＮＳ移動挙動を媒介することが公知の接着分子由来のドメインを含めることは、ＣＡＲ発現リンパ球を疾患の領域に標的化するためにも使用され得る。同じことは、腸（即ち、ＭＡｄＣＡｍ－１に対するバインダー、ＣＣＲ９の発現、または抗ＣＣＬ２５など）、肺（即ち、Ｐ－セレクチン、またはメソセリン）、皮膚（即ち、Ｅ－セレクチンに対するバインダー）、または他の粘膜表面についても合致する。
この手法を使用するために、炎症状態を有するか、またはアルツハイマー病などの疾患が炎症病理学の緩和によって処置され得る患者は、クリニックに入院し、末梢血が採取される。Ｔｒｅｇは、免疫磁気ビーズ（調節性Ｔ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって直接選択され得るか、または適切なサイトカイン環境における培養によって誘導され得る。次いで、これらのＴｒｅｇまたはｉＴｒｅｇは、ＤｕｏＣＡＲベクターで形質導入され、必要により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖される（ＴＲｅｇ増殖キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。ＤｕｏＣＡＲ結合性ドメインは、組織特異的ホーミング、および抗ベータアミロイドなどの疾患関連バインダーを媒介する抗体または受容体に由来する。そのようにして生成された操作された免疫エフェクター細胞は、適切な部位を標的化し、それらのＴｈ２またはＴｒｅｇ分化パターンと一致するサイトカインを産生する。ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲ受容体の活性化の際に特異的遺伝子ペイロードを分泌するように操作することができることも公知である。ベクターから発現されるＤｕｏＣＡＲペイロードに加えて、ａ）Ａ－ベータＤＰ（アミロイドベータ分解プロテアーゼ）、ｂ）マトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ－９、およびＣＯＰＤにおけるＭＭＰ９阻害剤など）、ｃ）プラーク形成を妨げるペプチドまたは可溶性抗体様バインダー、およびｄ）サイトカイン（ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０など）などの追加の治療用タンパク質またはペプチドが、操作されたＴ細胞によって発現または分泌され得る。
ｍｉＲＮＡも、Ｔ細胞機能を調節する細胞内で発現され得る。ｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－３１６２、ｍｉＲ－１２０２、ｍｉＲ－１２４６およびｍｉＲ－４２８１、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１７－９２である。また、ｍｉＲＮＡへのｓｈＲＮＡも開発され得る。例は、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５０、およびｍｉＲ－１０７に標的化されるｓｈＲＮＡであり、これは、通常、ＰＤ１に結合し、その発現を増加させる。
腫瘍学ベースの適用、ならびに炎症性疾患および自己免疫疾患ベースの適用を超えて、ＤｕｏＣＡＲテクノロジーの第３の適用は、ウイルス、細菌、または真菌抗原に特異的な治療用リンパ球集団の生成である。したがって、Ｂ細胞悪性腫瘍のために記載される腫瘍学的適用に関して、感染性疾患の標的化は、微生物抗原の認識に基づいて、感染体またはそれらが存在する疾患組織に対する免疫保護活性または免疫治療活性をＤｕｏＣＡＲ産物が媒介することを可能にする。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの手法とは異なって、Ｔ細胞受容体それ自体が、ペプチドがコードされる病原体の認識を媒介する場合、ＤｕｏＣＡＲ手法は、形質導入Ｔ細胞集団に対する抗体様認識（即ち、抗原プロセシングを必要としない）を与えるＣＡＲベクターフォーマットにおいて発現される結合タンパク質を利用する。治療用Ｔ細胞集団の活性化は、感染細胞の排除、および微生物抗原が細胞関連ではない場合には、感染体に対して開始される有効な免疫応答を可能にする可溶性メディエーター様インターフェロン－ガンマの放出を可能にする、免疫活性化遺伝子座をもたらす。
例えば、ＨＩＶは、非常に変わりやすいことが公知であり、さらに具体的なクレードまたは科に分類することができ、クレード特異的ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ、ｇｐ１２０）に対する抗体を創出することができる。ＤｕｏＣＡＲ手法を使用して、３つ以上のクレード特異的抗体様バインダーは、広い抗ＨＩＶ免疫活性をもたらすＣＡＲコンストラクトに含まれる。ウイルスタンパク質に加えて、細菌タンパク質を標的化することができる。現在の医学の課題は、医療の場において多くの場合に生じる抗生物質耐性細菌の処置である。これらは、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、ＫＰＣ（肺炎桿菌カルバペネマーゼ産生グラム陰性菌、またＣＲＫＰ）などを含む。クレブシエラ属の細胞表面抗原は、Ｏ抗原（９バリアント）およびＫ抗原（およそ８０バリアント）を含む。Ｏ抗原のスペクトラムは、多くのＫ抗原のように、小さいＤｕｏＣＡＲライブラリーで容易にカバーされ得る。使用のために、異なるＫまたはＯ血清型に結合する抗体を特徴とするＣＡＲコンストラクトが創出され、これらのＣＡＲベクターは、腫瘍学的適用に関して、単離および活性化されたＴｈ１様エフェクター細胞集団を形質導入するために使用される。真菌疾患において、Ｌ．Ｃｏｏｐｅｒら（Ｋｕｍａｓｅｓａｎ，Ｐ．Ｒ．、２０１４年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１１１巻：１０６６０頁）の研究は、ヒト細胞において通常発現される真菌結合タンパク質であるデクチン－１が、ＣＡＲとして再構成され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで真菌成長を制御するために使用することができることを実証した。ヒト疾患のアスペルギルス症は、重度の免疫抑制個体において起こり、真菌のＡ．フミガーツスによって引き起こされる。複数の群が、アスペルギルス属の細胞表面の抗原成分に特異的なモノクローナル抗体を産生し、このようにして、真菌表面上の３つ以上のアスペルギルス属抗原を標的化するＤｕｏＣＡＲによる養子免疫療法への扉が開かれる。したがって、これらの感染性疾患の適用の全てにおいて、微生物抗原に対する免疫グロブリン様バインダーを創出する能力は、複数の抗原が、ＣＡＲ発現エフェクターリンパ球集団によって標的化されることを可能にする。
ＤｕｏＣＡＲ、抗体およびその抗原結合性断片、コンジュゲート、ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞、開示されたＤｕｏＣＡＲを使用する処置の方法、組成物およびキットのさらなる記載と共に、それらの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの記載を含む本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用され得るＤｕｏＣＡＲの詳細な記載は以下である。本発明の組成物および方法は、ＤｕｏＣＡＲの生成および利用を参照して例示しているが、組成物および方法が、ＴｒｉｏＣＡＲおよびＱｕａｔｒｏＣＡＲの作成および利用を含むことを具体的に意図することが本明細書で企図される。
Ａ．キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ中の存在として）
本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲは、少なくとも２つのベクターを含み、各ベクターは、機能的ＣＡＲをコードし、それによって、ベクターの組合せは、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフ、抗原に結合することができる少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、ならびに少なくとも１つの細胞内ドメインに共有結合的に連結されている。
ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された、抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＤｕｏＣＡＲの特徴には、非ＭＨＣ拘束様式で、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。非ＭＨＣ拘束的な抗原認識は、ＤｕｏＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、そうして、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＤｕｏＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
本明細書に開示するように、ＤｕｏＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、限定としてではなく、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。一部の例では、活性化ドメインは、リン酸化の特異的部位の突然変異によって弱毒化され得、即ち、ＣＤ３ゼータ鎖中のＩＴＡＭモチーフは、このようにして、そのドメインによって媒介されるシグナル伝達の程度を注意深く調節する。
１．細胞外ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲは、さもなければ抗原結合性ドメインまたは部分と呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
一実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合性ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合性ドメインの選択は、処置される特定の型のがんに依存する。腫瘍抗原は、当該分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ受容体、ＩＧＦ－ＩＩ受容体、ＩＧＦ－Ｉ受容体ならびにメソセリンが含まれる。本明細書に開示される腫瘍抗原は、例として含まれるにすぎない。このリストは、排他的である意図はなく、さらなる例が、当業者に容易に明らかである。
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１または複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧＰ １００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれるがこれらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、およびＣＤ３７は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、イディオタイプ）は、限定的な成功で、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されている。
腫瘍抗原の型は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に独自であり、身体中の他の細胞上には存在しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に独自ではなく、その代わり、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であり得、または正常細胞上では非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上ではかなり高いレベルで発現される抗原であり得る。
ＴＳＡまたはＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；過剰発現された胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きいタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３／ＣＡ ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。
好ましい実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＭＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。さらに別の実施形態では、タグまたは抗タグ結合性ドメインを含むＤｕｏＣＡＲが本明細書に提供される。
標的化される所望の抗原に依存して、ＣＡＲは、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合性ドメインを含むように操作され得る。例えば、ＣＤ１９が標的化される所望の抗原である場合、ＣＤ１９に特異的な抗体またはそのｓｃＦｖ小断片が、ＣＡＲ中に組み込まれた抗原結合性ドメインとして使用され得る。
例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９を標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶであり、ここで、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号２７に示される配列を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ部分は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。第２の例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ＣＤ２０を標的化する。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ２０ＳｃＦｖであり、抗ＣＤ２０ＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号１に明記する配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ２０ＳｃＦｖ部分は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。第３の例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ＣＤ２２を標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶであり、ここで、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号７に示される配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶ部分は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、例えば、限定としてではなく、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－ＬＰ）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスおよびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科［例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよびポックスウイルス）もしくはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原、またはそれらの任意の組合せを含む非ＴＳＡまたは非ＴＡＡに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
本発明の別の態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌株に由来する抗原に結合することが可能なＣＡＲが提供される。特に、感染性細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ．の細菌株（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉまたはＭ．ｇｏｒｄｏｎｅａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉに由来する抗原、またはそれらの組合せに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
２．膜貫通ドメイン
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲでは、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された１つまたは複数の膜貫通ドメインを含む。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、膜貫通ドメインの細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、単離された核酸分子が提供される。
一部の場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するために、選択され得るまたはアミノ酸置換により得る。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦｃイプシロンＲ、またはそれらの任意の組合せに由来し得る（即ち、それらの膜貫通領域（複数可）を少なくとも含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端において見出される。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間での連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットまたはトリプルアラニンモチーフは、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１１の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
一部の場合には、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１３の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
任意の特定の作用機構に限定する意図はないが、本発明の本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用される例示的なＤｕｏＣＡＲと関連する増強された治療機能の可能な理由には、例えば、限定としてではなく、ａ）より効率的なシグナル伝達を可能にする、原形質膜内での改善された側方の動き、ｂ）脂質ラフトなどの原形質膜マイクロドメイン内の優れた位置、およびＴ細胞活性化と関連する膜貫通シグナル伝達カスケードと相互作用するより高い能力、ｃ）抑制性もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きによる、原形質膜内の優れた位置、例えば、ＣＤ４５などのホスファターゼとあまり近接していないこと、もしくはそれとのより少ない相互作用、およびｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（即ち、免疫シナプス）への優れたアセンブリー、またはそれらの任意の組合せが含まれると考えられる。
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の一実施形態では、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲにおいて使用するための非限定的な例示的な膜貫通ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを駆動するために使用され得るＴＮＦＲＳＦ１６およびＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメイン、ならびに／またはキメラ抗原受容体および使用の方法というタイトルの２０１５年１０月９日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第６２／２３９，５０９号に開示されるリンカーもしくはスペーサードメイン、ならびに特に、表Ｉに列挙される腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー内に列挙される他のＴＮＦＲＳＦメンバーを含んで、割り当てられたＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の物質番号ＬＥＮ＿０１５ＰＲＯを含む。
３．スペーサードメイン
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲでは、スペーサードメインは、細胞外ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結させるように、および／またはＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６７号、米国特許第４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進すると予測されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位中のセリンおよびスレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。
スペーサードメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域を含むアミノ酸番号１３７～２０６（配列番号１５）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５～１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５～３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７～１５２の全体または一部が使用され得る。また、スペーサードメインとして、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖（ＣＨ１領域またはＣＬ領域、例えば、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するペプチド）の定常領域の一部が使用され得る。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であり得る。
さらに、ＣＡＲでは、シグナルペプチド配列が、Ｎ末端に連結され得る。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５～３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして上で言及されるタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドがＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用され得る。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号５に示されるリーダー（シグナルペプチド）配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが中に置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される限りにおいて、かかる短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語、細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
ＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させるように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体もしくはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルが、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要とされることは公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言われ得る：ＴＣＲを介した抗原依存的な一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
本明細書に開示されるＣＡＲにおいて特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。ＩＴＡＭの具体的な非限定的な例には、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、００２２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。本明細書に記載されるＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ３ゼータ中のＩＴＡＭモチーフのうち１、２、または３つは、突然変異、または別のアミノ酸によるチロシン残基の置換によって弱毒化される。
好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体で、またはＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。かかる共刺激分子の具体的な非限定的な例には、ＣＤ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。したがって、本明細書の開示は、４－１ＢＢを共刺激シグナル伝達エレメントとして主に例示するが、他の共刺激エレメントが本開示の範囲内である。
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定された順序で、互いに連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８および４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１７に示される核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１９に示される核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
５．ＤｕｏＣＡＲのさらなる記載
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能的部分」とは、ＣＡＲに関して使用する場合、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲの１または複数の任意の一部または断片を指し、この一部または断片は、それがその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持する、ＣＲＡの一部を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％またはそれ超を構成し得る。
機能的部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、または両方の末端において、さらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識し、がんを検出し、がんを処置または予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用する場合、親ＣＡＲに対する実質的なまたは著しい配列同一性または類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、それがそのバリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲに対して、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％またはそれ超、アミノ酸配列が同一であり得る。
機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、親ＣＡＲと比較して増加される。
ＤｕｏＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、これには、ある特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を置換する酸性／負に荷電した極性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を置換する非極性側鎖を有するアミノ酸、塩基性／正に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を置換する塩基性／正に荷電した極性アミノ酸、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を置換する極性側鎖を有する非荷電アミノ酸、ベータ分岐側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｅ、ＴｈｒおよびＶａｌ）を置換するベータ分岐側鎖を有するアミノ酸、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を置換する芳香族側鎖を有するアミノ酸などであり得る。
ＣＡＲは、本明細書に記載される特定されたアミノ酸配列（単数または複数）から本質的になり得、その結果、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物学的活性を著しくは変化させない。
ＤｕｏＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、任意の長さであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み、但し、ＤｕｏＣＡＲ（またはその機能的部分もしくは機能的バリアント）は、それらの生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持する。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超アミノ酸長であり得る。
ＤｕｏＣＡＲ（本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１または複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、－アミノ ｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－ヒドロキシプロリンおよびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、－アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびａ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが含まれる。
ＤｕｏＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、もしくは酸付加塩へ変換および／または任意選択で二量体化もしくは重合、あるいはコンジュゲートされ得る。
ＤｕｏＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。ＤｕｏＣＡＲは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、Ｃｈａｎら、Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２０００年；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｉｄ，Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、２０００年；Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２００１年；および米国特許第５，４４９，７５２号などの参考文献に記載されている。キメラ抗原受容体を作製する方法、そのような受容体を含むＴ細胞、およびかかる使用（例えば、がんの処置のため）は、当該分野で公知であり、本明細書にさらに記載される（例えば、その各々が、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８巻：４号、６６６～６６８頁；Ｍｏｒｇａｎら、２０１０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１０年２月２３日にオンラインで公開、１～９頁；Ｔｉｌｌら、２００８年、Ｂｌｏｏｄ、１巻１２号：２２６１～２２７１頁；Ｐａｒｋら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２９巻：５５０～５５７頁、２０１１年；Ｇｒｕｐｐら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、３６８巻：１５０９～１５１８頁、２０１３年；Ｈａｎら、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．、６巻：４７頁、２０１３年；Ｔｕｍａｉｎｉら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、１５巻、１４０６～１４１７頁、２０１３年；Ｈａｓｏら、（２０１３年） Ｂｌｏｏｄ、１２１巻、１１６５～１１７４号；ＰＣＴ公開の国際公開第２０１２／０７９０００号、国際公開第２０１３／１２６７２号；および米国特許出願公開第２０１２／０２１３７８３号を参照されたい）。例えば、開示されるキメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子は、開示されるＣＡＲを作るために、Ｔ細胞などの宿主細胞を形質導入するために使用される発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）に含まれ得る。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を使用する方法は、対象からＴ細胞を単離するステップ、キメラ抗原受容体をコードする発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）によりＴ細胞を形質導入するステップ、および処置のために、例えば、対象中の腫瘍の処置のために、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与するステップを含む。
Ｂ．抗体および抗原結合性断片
一実施形態は、本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書で開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインもしくは部分をさらに提供する。本明細書で使用する場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲ Ｔ細胞」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＡＲの抗体由来の標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。
本明細書で使用する場合、「抗原結合性ドメイン」は、抗体およびその抗原結合性断片を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、およびそれらの抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、当該分野で公知のインタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持するそのバリアントおよび断片が含まれる。
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。一部の例では、モノクローナル抗体は、単一クローンのＢリンパ球によって産生された抗体、または単一の抗体（またはその抗原結合性断片）の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞、もしくはその子孫によって産生された抗体である。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有さない保存的アミノ酸置換を有し得る。モノクローナル抗体の産生の例示的な方法は公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１３年）を参照のこと。
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。
各重鎖および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメインを含有する；例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、９１頁（２００７年）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６～４４８頁、１９９３年；Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３巻：７３３～７３６頁、１９９６年を参照のこと）。「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗原結合性断片、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを位置付けアラインさせるように機能する。
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（ＪＭＢ ２７３巻、９２７～９４８頁、１９９７年；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＬｅｆｒａｎｃら（「ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻：５５～７７頁、２００３年；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）に記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へ）と呼ばれ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であるが、ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。重鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。
「抗原結合性断片」は、同族抗原を特異的に認識する能力を保持する全長抗体の部分、ならびにかかる部分の種々の組合せである。抗原結合性断片の非限定的な例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれる。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性断片、または組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成された抗原結合性断片が含まれる（例えば、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１～２巻、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、２０１０年を参照のこと）。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、適切なポリペプチドリンカーによって連結された１または複数の抗体（複数可）のＶＨおよびＶＬドメインを遺伝学的に融合された単鎖分子として含有する遺伝子操作された分子である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３～４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５巻：５８７９～５８８３頁、１９８８年；Ａｈｍａｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ、ＩＤｒｕｇｓ、１３巻：５４３～５４９頁、２０１０年を参照のこと）。ｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ｓｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（ＶＨドメイン－リンカードメイン－ＶＬドメイン；ＶＬドメイン－リンカードメイン－ＶＨドメイン）を有するｓｃＦｖが使用され得る。
ｄｓＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変鎖は、鎖の会合を安定化させるために、ジスルフィド結合を導入するように変異されている。ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異的抗体であるダイアボディもまた含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０巻：６４４４～６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１～１１２３頁、１９９４年を参照のこと）。
抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異的抗体）などの、遺伝子操作された形態もまた含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４～１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７年もまた参照のこと。
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生され得、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻：１２７５～１２８１頁（１９８９年）に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４巻：２４３～２４６頁（１９９３年）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻：５４４～５４６頁（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８年；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２年）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）；その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％またはそれ超遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を５０％またはそれ超遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。
「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）抗体または抗原結合性断片由来の１または複数のＣＤＲを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％またはそれ超同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分は、おそらくはＣＤＲを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。
「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、１つのヒト抗体由来の１または複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）配列を含むが、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて配列を創出するためのテクノロジーを使用して、またはトランスジェニック動物を使用して、同定および単離され得る（例えば、Ｂａｒｂａｓら Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ．第１版 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００４年 Ｐｒｉｎｔ．；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７～１１２５頁、２００５年；Ｌｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０～４５９頁、２００８年を参照のこと）。
抗体は、１または複数の結合部位を有し得る。１よりも多い結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有するが、二重特異的または二機能性抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、これには、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどが含まれる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、以下、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号Ａｌ、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照のこと）。
また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などを含み得る。
Ｃ．コンジュゲート
本明細書に開示される患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、または本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に対して特異的なモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、当業者に公知のいくつもの手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの薬剤にコンジュゲートされ得る。共有結合および非共有結合の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片へのエフェクター分子または検出可能なマーカーの共有結合的連結が存在する分子を含むがこれらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射活性剤、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓ、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）種々のエフェクター分子および検出可能なマーカーが使用され得ることを理解する。
特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合性断片に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（－ＮＨ２）またはスルフヒドリル（－ＳＨ）基を含有し、これらは、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合を生じるための、抗体上の適切な官能基との反応のために利用可能である。あるいは、抗体または抗原結合性断片は、さらなる反応性官能基を曝露または結合するために誘導体化される。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能なものなどの、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を含み得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーに結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方への共有結合を形成することが可能である。適切なリンカーは、当業者に周知であり、これには、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して（例えば、システインへのジスルフィド連結を介して）構成成分アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に結合され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６，７号、米国特許第４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境中で、抗体または抗原結合性断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーを放出させる。さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、例えば、抗体分解によって放出される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａ）内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。しかし、リンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長、例えば、１～２、１～３、２～５、３～１０、３～１５、１～５、１～１０、１～１５アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得、その全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側での活性薬物の放出を生じることが公知である（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３巻：６７～１２３頁を参照のこと）。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンＢによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る（例えば、フェニルアラニン－ロイシンまたはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシンリンカー）。かかるリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。具体的な実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン－シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン－リシンリンカーである（例えば、バリン－シトルリンリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、即ち、ある特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド（ｃｉｓ－ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；米国特許第５，８２４，８０５号；米国特許第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３巻：６７～１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１４６５３～１４６６１頁を参照のこと）。かかるリンカーは、血液中などの中性のｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回るｐＨでは不安定である。ある特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当該分野で公知であり、これには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）－、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成され得るものが含まれる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７巻：５９２４～５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８巻：９２８０～９２９０頁、２００８年を参照のこと）。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照のこと。
さらに他の具体的な実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５巻：１３８７～９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１２９９～１３０４頁）または３’－Ｎ－アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１３０５～１２頁）である。
さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、抗体分解によって放出される（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞外環境中での切断に対して抵抗性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境中（例えば、血漿中）に存在する場合、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が切断される。リンカーが細胞外環境中での切断に対して抵抗性であるか否かは、例えば、目的のリンカーを含有するコンジュゲートを、所定の期間（例えば、２、４、８、１６または２４時間）にわたって血漿と共にインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって決定され得る。コンジュゲート中で使用され得る種々の例示的なリンカーは、ＷＯ２００４／０１０９５７、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されており、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲのコンジュゲート、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合性部分、および１または複数の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドラスタチン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トリコテシンおよびＣＣ１０６５ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体が提供される。
マイタンシノイド毒素部分としての使用に適切なマイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）化合物は、当該分野で周知であり、公知の方法に従って天然供給源から単離され得、遺伝子操作技術（Ｙｕら（２００２年）ＰＮＡＳ ９９巻：７９６８～７９７３頁を参照のこと）、または公知の方法に従って合成により調製されたマイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）およびマイタンシノールアナログを使用して産生され得る。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびＣ－３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；および米国特許第４，３７１，５３３号に開示されており，その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第５，４１６，０６４号；米国特許第６，４４１，１６３号および欧州特許ＥＰ０ ４２５ ２３５ Ｂ１に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
さらなる毒素が、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合性部分と共に使用され得る。例示的な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ヒマ毒、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素Ａ～Ｆが含まれる。これらの毒素は、当該分野で周知であり、多くは、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。企図される毒素には、これらの毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと）。
サポリンは、リボソーム複合体の６０Ｓ部分を不活性化することによってタンパク質合成を破壊する、Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素である（Ｓｔｉｒｐｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：４０５～４１２頁、１９９２年）。しかし、この毒素は、細胞中への特異的進入のための機構を有さず、したがって、細胞によって効率的に取り込まれるために、内在化される細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合性断片へのコンジュゲートを必要とする。
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素における使用のためのジフテリア毒素は、非特異的毒性を低減または排除するために変異される。完全な酵素活性を有するが非特異的毒性が顕著に低減された、ＣＲＭ１０７として公知の変異体は、１９７０年代以降公知であり（ＬａｉｒｄおよびＧｒｏｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９巻：２２０頁、１９７６年）、ヒト臨床試験において使用されてきた。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照のこと。
ヒマ毒は、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。ヒマ毒の例については、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ、およそ６５ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量に従って、ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される２つの形態で存在する（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｌａｕｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２６６巻：５４３頁、１９７２年）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅を担う。Ｂ鎖は、ヒマ毒を細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２４９巻：６２７～６３１頁、１９７４年および米国特許第３，０６０，１６５号）。
リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素としての使用のために標的化分子にコンジュゲートされてきた（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：２６５～７０頁、１９９９年を参照のこと）。例示的なリボトキシン、例えば、α－サルシン（α－ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら、Ｇｅｎｅ １９０巻：３１～５頁、１９９７年；ならびにＧｏｙａｌおよびＢａｔｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５巻２部：２４７～５４頁、２０００年で議論されている。カリチアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ中にアポトーシスをもたらす二本鎖切断を生じさせて、エンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２巻：１０７０～８７頁、１９８９年を参照のこと）。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１巻：７３５～４１頁、２０００年を参照のこと）。
アブリンは、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含む。毒性素であるアブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３ｋＤおよび６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖ＡおよびＢから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害する；Ｂ鎖（アブリン－ｂ）は、Ｄ－ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１０９５頁、１９８８年；およびＯｌｓｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０巻：３３０～３３５頁、１９７８年を参照のこと）。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に対して特異的なモノクローナル抗体、その抗原結合性断片はまた、検出可能なマーカー；例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、コンピューター体軸断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ ａｘｉａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）塩化物、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた使用される。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出のために有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどにもコンジュゲートされ得る。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分が、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別できる反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出され得る。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、視覚的に検出可能な着色反応産物をもたらす。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、ビオチンとコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることに留意すべきである。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、ガドリニウムなどの常磁性薬剤とコンジュゲートされ得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性薬剤もまた、標識として使用される。抗体は、ランタニド（例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合性断片はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識され得る。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射標識は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射標識は、ｘ線、発光スペクトルまたは他の診断技術によって本明細書に開示された抗原および抗原発現細胞のうち１または複数を検出するために使用され得る。さらに、放射標識は、対象における腫瘍の処置のため、例えば、神経芽細胞腫の処置のために、毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が含まれるがこれらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
かかる検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、発せられた照明を検出するために光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、発色標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。
Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載されるＤｕｏＣＡＲ、抗体またはその抗原結合性部分（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本発明の一実施形態によってさらに提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態では、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣｕｏＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされるＣＡＲ細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する少なくとも１つのリポカリン系の抗原結合性抗原（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）（アンチカリン）を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列が先行する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含むがこれに限定されない抗原を標的化する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのある特定の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ） ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９） ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳｏ－１ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一態様では、本明細書に提供されるＤｕｏＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、細胞外抗原結合性ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、膜貫通ドメインをコードする核酸配列が、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、コードされる膜貫通ドメインが、１０以下であるが少なくとも１つの改変、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するその配列を含むアミノ酸配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の実施形態では、コードされるＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
本明細書に開示されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の実施形態では、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらなる実施形態では、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、リーダー配列またはシグナルペプチド配列をさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン改変され得る。特定の理論に束縛されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換し、そうして翻訳効率を増加させることを含み得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害する二次ｍＲＮＡ構造を低減させ得、そうして翻訳効率を増加させる。
本発明の実施形態では、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメインをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＤｕｏＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
「核酸」は、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般に、一本鎖または二本鎖の、合成のまたは天然供給源から得られた（例えば、単離および／または精製された）ものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結を含有し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。一部の実施形態では、核酸は、いずれの挿入、欠失、逆位および／または置換も含まない。しかし、一部の場合には、本明細書で議論されるように、核酸は、１または複数の挿入、欠失、逆位および／または置換を含むことが適切であり得る。
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の２つのさもなければ分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的合成によって、またはより一般的には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成される場合が多い。核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学的合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変型ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換されたアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６－ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうち１または複数は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）などの会社から購入できる。
核酸は、ＤｕｏＣＡＲまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかと縮重するヌクレオチド配列、または縮重配列の組合せを含み得る。
一実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸もまた提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシーの条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーの条件には、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３～１０塩基）を偶然に有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、またはいくつかの散在するミスマッチしか含有しないポリヌクレオチドを識別する条件が含まれる。相補性のかかる小領域は、１４～１７またはそれ超塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーの条件には、例えば、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によって、約５０～７０℃の温度で提供されるような、低塩および／または高温条件が含まれる。かかる高いストリンジェンシーの条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど忍容せず、本発明のＤｕｏＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが理解される。
本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％またはそれ超、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。
一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に取り込まれ得る。これに関して、一実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、コンストラクトが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、およびベクターが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。
しかし、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、一本鎖または二本鎖の、合成または一部天然供給源から得られたものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、またはその両方の型の連結を含み得る。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写も複製も邪魔しない。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、繁殖および増殖のためもしくは発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択され得る。
バクテリオファージベクター、例えば、λυΤΙ Ο、λυΤΙ １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４およびλΝΜΙ １４９もまた使用され得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、特に、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻（８号）：１４５３～１４６４頁（２００９年）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。クリニックにおいて使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、限定としてではなく、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ｐｌｃのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６～４６７頁（１９７３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６年）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３巻：９７頁（１９８１年）を参照のこと）。
トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍら、上記を参照のこと）、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２巻：４７９～４８８頁（１９８０年）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：７４２～７５１頁（１９８８年）を参照のこと）、リポソーム媒介性遺伝子移入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２～６９０頁（１９８８年）を参照のこと）、脂質媒介性形質導入（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：７４１３～７４１７頁（１９８７年）を参照のこと）および高速微小推進剤（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０～７３頁（１９８７年）を参照のこと）が含まれる。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または直鎖状である発現ベクターのコンストラクトは、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮に入れて、必要に応じて、ベクターが導入される宿主細胞の型（例えば、細菌、真菌、植物または動物）に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限部位を含み得る。
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする、１または複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なもしくはかかるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列において見出されるプロモーターであり得る。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製され得る。
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死なせる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に薬物などの薬剤に対する感受性を付与する遺伝子、または細胞が薬剤と接触した場合もしくは薬剤に曝露された場合にその細胞を死なせる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｕｔｔｏｎ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと）、これには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびニトロレダクターゼが含まれる。
一実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得る、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であり得る、即ち、ヒトなどの生物から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、即ち、懸濁物中で成長する細胞であり得る。適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＨ５ａ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅または複製することを目的とすると、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、ＤＨ５ａ細胞であり得る。組換えＣＡＲを産生することを目的とすると、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に起源し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞は、Ｔ細胞であり得る。
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発達段階のものでもあり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるＤｕｏＣＡＲは、適切な非Ｔ細胞において使用され得る。かかる細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、多能性幹細胞から生成されたＮＫ細胞およびＴ様細胞などである。
本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、一実施形態によって提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、ここで、集団は主に、組換え発現ベクターを含む（例えば、それらから本質的になる）宿主細胞を含む。集団はまた、細胞のクローン性集団であり得、ここで、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞は、その組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。
ＤｕｏＣＡＲ（その機能的部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）および抗体（その抗原結合性部分を含む）は、単離および／または精製され得る。例えば、精製（または単離）された宿主細胞の調製物は、宿主細胞が身体内のその天然環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は精製され、その結果、宿主細胞は、調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％を示す。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％もしくは約８０％よりも上であり得、または約１００％であり得る。
Ｅ．処置の方法
患者特異的な自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲは、哺乳動物において疾患を処置または予防する方法において使用され得ることが企図される。これに関して、一実施形態は、ＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、ならびに／または医薬組成物を、哺乳動物においてがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法を提供する。上述のＤｕｏＣＡＲの追加の使用方法は、上記に開示されている。
一実施形態は、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲを投与するステップの前に、哺乳動物をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。リンパ枯渇の例には、非骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、全身照射などが含まれ得るがこれらに限定されない。
宿主細胞、または細胞の集団が投与される方法を目的として、細胞は、哺乳動物にとって同種または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自家である。本明細書で使用する場合、同種とは、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を意味する。１または複数の遺伝子座において遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種材料は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体に後に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を意味する。
本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物、例えば、ウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目由来であり得る。哺乳動物は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであり得る。哺乳動物は、霊長目、新世界ザル（Ｃｅｂｏｉｄ）目もしくはサル（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル（ｍｏｎｋｅｙ））または類人猿（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）目（ヒトおよび類人猿（ａｐｅ））のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
これらの方法に関して、がんは、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（例えば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（例えば、髄芽腫）、乳房がん、肛門、肛門管もしくは肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ－慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がんならびに尿管がんのいずれかを含む任意のがんであり得る。
用語「処置する」および「予防する」ならびにそれらから派生した単語は、本明細書で使用する場合、１００％または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益な効果または治療効果を有すると認識する、種々の程度の処置または予防が存在する。これに関して、この方法は、任意の量または任意のレベルの、哺乳動物におけるがんの処置または予防を提供し得る。
さらに、この方法によって提供される処置または予防には、処置または予防されているがんなどの疾患の１または複数の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発病を遅延させることを包含し得る。
別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、（ａ）哺乳動物由来の１または複数の細胞を含む試料を、ＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、または医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）複合体を検出するステップであって、複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
試料は、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって得られ得る。生検は、個体からの組織および／または細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織および／または細胞に対する実験を実施するために、個体から組織および／または細胞を収集することであり得る。この実験には、個体がある特定の状態もしくは疾患状態を有するかどうか、および／またはある特定の状態もしくは疾患状態に罹患しているかどうかを決定するための実験が含まれ得る。状態または疾患は、例えば、がんであり得る。
哺乳動物における増殖障害、例えばがんの存在を検出する方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、または細胞全体溶解物の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、タンパク質全体画分、または核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、これらの細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の臓器または組織の細胞であり得る。
接触させるステップは、哺乳動物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。好ましくは、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。
また、複合体の検出は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体もしくはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、上に開示される放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などで標識され得る。
標的細胞を認識する能力および抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３巻：５０７～５１３頁（１９９９年）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ－ａ）またはインターロイキン２（ＩＬ－２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：４４１５～４４２３頁（２００５年）に記載されるように、細胞傷害性の測定によって評価され得る。
別の実施形態は、本発明のＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体もしくはその抗原結合性部分、および／または医薬組成物の使用、哺乳動物におけるがんなどの増殖障害の処置または予防を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれかであり得る。
局所および全身投与を含む任意の投与方法が、開示された治療剤のために使用され得る。例えば、外用、経口、静脈内などの血管内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内および皮下投与が使用され得る。特定の投与様式および投薬レジメンは、症例の特徴（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的かどうか）を考慮して、担当の臨床医によって選択される。１よりも多い薬剤または組成物が投与されている場合、１または複数の投与経路が使用され得る；例えば、化学療法剤は、経口投与され得、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートまたは組成物は、静脈内投与され得る。投与方法には、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞、コンジュゲート、抗体、抗原結合性断片または組成物が、非毒性の薬学的に許容される担体、例えば、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、固形油、オレイン酸エチルまたはリポソーム中に提供される注射が含まれる。一部の実施形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍発達の傾向があると疑われる領域に、抗体または抗原結合性断片を適用することによって使用され得る。一部の実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合性断片を含む医薬調製物の持続性の腫瘍内（または腫瘍近傍）放出が有益であり得る。他の例では、コンジュゲートが、角膜に点眼薬として外用で、または目に硝子体内で適用される。
開示された治療剤は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示された治療剤は、単一の用量でまたは複数用量のスケジュールで投与され得る。複数用量のスケジュールは、処置の主要な過程が、１よりも多い別々の用量、例えば１～１０用量と、その後の、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じて引き続く時間間隔で与えられる他の用量とによるものであり得るスケジュールである。処置は、数日～数か月またはさらには数年の期間にわたる、１日用量または複数の１日用量の化合物（複数可）を含み得る。したがって、投薬レジームはまた、処置される対象の特定の要求に基づいて少なくとも一部決定され、投与する実務者の判断に依存する。
抗体またはコンジュゲートの典型的な投薬量は、約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
特定の例では、対象には、複数の１日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも２連続日、１０連続日など、例えば、数週間、数か月または数年の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物、ＤｕｏＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞またはさらなる薬剤のうち１または複数を含む治療組成物が投与される。一例では、対象には、少なくとも３０日、例えば、少なくとも２か月、少なくとも４か月、少なくとも６か月、少なくとも１２か月、少なくとも２４か月または少なくとも３６か月の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物またはさらなる薬剤が投与される。
一部の実施形態では、開示された方法は、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて、手術、放射線療法および／または化学療法薬を（例えば、連続的に、実質的に同時にまたは同時に）対象に提供することを含む。かかる薬剤および処置の方法および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。さらなる薬剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得る、または当業者によって実験的に決定される通りであり得る。かかる化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ、（１９９２年）Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄにも記載されている。
一部の実施形態では、併用治療は、治療有効量のさらなるがん阻害剤の、対象への投与を含み得る。併用治療で使用され得るさらなる治療剤の非限定的な例には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子ならびに血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の適切な抗がん剤または抗血管新生剤は、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗体、抗原結合性断片またはコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
併用免疫療法のためのさらなる化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーのメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ；腫瘍親和性感光色素、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブおよびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。かかる薬剤の選択および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法、またはＴ細胞が治療レベルに増殖される当該分野で公知の他の方法を使用して活性化および増殖される細胞は、抗ウイルス療法のシドホビルおよびインターロイキン－２などの薬剤による処置、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても公知）、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置が含まれるがこれらに限定されない任意の数の関連する処置様式と併用して（例えば、その前、それと同時、またはその後）、患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭ ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と併用して使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼのカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）か、または成長因子誘導シグナル伝達のために重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ ６６巻：８０７～８１５頁、１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ ７３巻：３１６～３２１頁、１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ ５巻：７６３～７７３頁、１９９３年）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨＴなどの抗体と併用して（例えば、その前、それと同時、またはその後）、患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法、続いて末梢血幹細胞移植による標準処置を受けてもよい。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖された細胞は、外科手術の前または後に投与される。
患者に投与される上記の処置の投薬量は、処置される状態の正確な性質、および処置のレシピエントにより変わる。ヒト投与のための投薬量の調整は、当該分野で許容される実施に従って行うことができる。ＣＡＭＰＡＴＨについての用量は、例えば、一般に、成人患者に対して１～約１００ｍｇの範囲であり、通常、１～３０日の期間、毎日投与される。好ましい１日用量は、１日当たり１～１０ｍｇであるが、一部の例では、最大で１日当たり４０ｍｇのより高い用量が使用されてもよい。
併用療法は、相乗作用を提供し得、相乗的であることが証明され得る、即ち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することから生じ得る効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）共製剤化され、併用される単位投薬製剤と同時に投与もしくは送達される場合；（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）一部の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互に送達される場合、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって連続的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に、交代の間、有効投薬量の各活性成分が、連続的に、即ち、順次に投与されるが、併用療法では、有効投薬量の２以上の活性成分が一緒に投与される。
一実施形態では、本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片またはそのコンジュゲートの有効量が、抗がん処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートがそれぞれのがん細胞上で発現された抗原と免疫複合体を形成するのに十分な量の時間が経過した後で、免疫複合体が検出される。免疫複合体の存在（または非存在）は、処置の有効性を示す。例えば、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の増加は、その処置が有効でないことを示し、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の減少は、その処置が有効であることを示す。
Ｆ．バイオ医薬組成物
担体（例えば、薬学的に許容される担体）中に、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲ、または本明細書に開示された１もしくは複数の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む、遺伝子治療、免疫療法、養子免疫療法および／または細胞療法における使用のためのバイオ医薬組成物または生物製剤組成物（本明細書で以下「組成物」）が、本明細書で提供される。これらの組成物は、対象への投与のために単位投薬形態で調製され得る。所望の転帰を達成するための投与の量およびタイミングは、処置を行う臨床医の裁量である。これらの組成物は、全身（例えば、静脈内）または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。一例では、開示されたＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲートは、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、腫瘍、例えば、限定としてではなく、神経芽細胞腫の、例えば、処置および検出などのために使用される。一部の例では、これらの組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、例えば、病理学的血管新生の検出にも使用される。
投与のための組成物には、水性担体などの薬学的に許容される担体中に溶解されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片の溶液が含まれ得る。例えば緩衝食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理学的条件に近付くのに必要な薬学的に許容される補助的物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのかかる投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかとなる。
静脈内投与のための典型的な組成物は、１日当たり対象１人当たり約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇの抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート（あるいは対応する用量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５年）などの刊行物中により詳細に記載されている。
ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液中でも提供される。次いで、ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの溶液が、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され、一部の場合には、０．５～１５ｍｇ／体重ｋｇの投薬量で投与される。抗体または抗原結合性断片およびコンジュゲート薬物の投与では、当該分野でかなりの経験が利用可能である；例えば、抗体薬物は、１９９７年のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）の承認以降、米国で市販されている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片およびそれらのコンジュゲートは、静注または静脈内ボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が、より低いレベルで投与される引き続く維持用量と共に投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の抗体または抗原結合性断片（または対応する用量の、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）が、およそ９０分の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に忍容された場合に３０分の期間にわたって注入される４～８週間にわたる２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が注入され得る。
制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または粒状の系として作製され得る。タンパク質送達系の広い概説については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９５年）を参照のこと。粒状の系には、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物などの治療的タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子の至る所に分散される。約１μｍよりも小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子だけが静脈内投与されるように、およそ５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋内投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２１９～３４２頁（１９９４年）；ならびにＴｉｃｅおよびＴａｂｉｂｉ、Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３１５～３３９頁（１９９２年）を参照のこと。
ポリマーは、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート組成物のイオン制御された放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ、Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６巻：５３７～５４２頁、１９９３年）。例えば、ブロックコポリマーであるｐｏｌａｘａｍｅｒ ４０７は、低温で粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、体温では半流動性ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン－２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９巻：４２５～４３４頁、１９９２年；およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４巻（２号）：５８～６５頁、１９９０年）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御された放出のための微小担体として使用されてきた（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２巻：２１５～２２４頁、１９９４年）。さらに別の態様では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御された放出および薬物標的化に使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９３年））。治療的タンパク質の制御された送達のための多数のさらなる系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
Ｇ．キット
一態様では、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲを使用するキットもまた提供される。例えば、対象における腫瘍を処置するためのキットまたは本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲのうち１もしくは複数を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製するためのキット。キットは、典型的には、本明細書に開示される、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１よりも多くが、キット中に含まれ得る。
キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。
ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を処置もしくは予防する方法、またはＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法における、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、治療的製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／またはかかる警告についての情報を含む、治療的製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。教材は、電子的形態（例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク）で書かれ得、または視覚的（例えば、動画ファイル）であり得る。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
実施例
本発明は、以下の添付される図面、および上記を含む１７～２７頁の開示内に示されるＤｕｏＣＡＲの例によってさらに例証され、これらの例は決してその範囲に制約を課すものとして解釈すべきではない。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。
種々の詳細を、上記で概説した例示的な実行と併せて記載したが、種々の変更、改変、変形、改善および／または実質的な等価物は、公知であるか、またはそれが現在予期されているもしくは予測され得るかに関わらず、上述の開示を検討する際に明らかになり得る。
本文中に引用したそれぞれの出願と特許、および（訴訟中のそれぞれの交付済特許、「出願引用文書」を含めた）それぞれの出願と特許中で引用されたそれぞれの文書または参照文献、およびこれらの出願と特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張するそれぞれのＰＣＴと外国出願または特許、およびそれぞれの出願引用文書中で引用もしくは参照されたそれぞれの文書は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施する際に利用することができる。より一般的には、文書または参照文献は本文中、特許請求の範囲の前の参照文献一覧中、または本文自体中のいずれかに引用され、それぞれのこれらの文書または参照文献（「本明細書中引用参照文献」）、および（任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた）それぞれの本明細書中引用参照文献中に引用されたそれぞれの文書または参照文献は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれる。
一部の具体的実施形態の前述の記載によって、他者が、本発明の知識を適用することによって、一般的概念から逸脱せずに、具体的実施形態などの様々な適用例に関して容易に変更または適合させることができるのに充分な情報を与え、したがってこのような適合および変更形態は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内と理解すべきであり、理解することが意図されている。本明細書で利用する語句または述語は、限定の目的ではなく記載の目的であることは理解される。図面および記載中、例示的実施形態を開示しており、特異的用語が利用された可能性はあるが、他に言及しない限り、それらは限定の目的ではなく一般的および叙述的な意味でのみ使用され、したがって特許請求の範囲もそのように限定されない。さらに当業者は、本明細書で論じた方法の、ある特定ステップは別の順序で順に並べることができ、またはステップを組み合わせることができることを理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は本明細書で開示した詳細な実施形態に限られないことが意図される。当業者は、ごく普通の実験を使用した、本明細書に記載した本発明の実施形態の多くの均等物を理解し、把握することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲によって包含される。
実施例の説明
５つの実施例が提供され、それによって、ＬＶ形質導入ヒトＴ細胞集団の表面における３つの機能的結合性ドメインの発現、および異なる共刺激細胞内ドメインの組合せが、ＤｕｏＳｅｔテクノロジーの実現可能性を証明し（実施例１）、３つの異なる白血病抗原に対するこの集団の機能活性が、その有効性を証明する（実施例２）。共トランスフェクション、両方のＤｕｏＣＡＲ鎖をコードする単一ＬＶ産物（２つのＣＡＲをコードするプラスミドとのパッケージング系の共トランスフェクションによって生成する）によるａｋａ形質導入で生成したＤｕｏＣＡＲの発現および機能の比較を実施例３に記載する。実施例４では、共トランスフェクション法によって生成したＬＶで形質導入されたＤｕｏＣＡＲ、および２つのＤｕｏＣＡＲ鎖がリボソームスキップ部位によって分離されている単一コンストラクトによってコードされる２シストロン性ＤｕｏＣＡＲが、形質導入の効率および機能について比較される。
このテクノロジーが基づき、ＤｕｏＣＡＲにおいてＤｕｏＳｅｔ構成要素として含まれ得る単一特異性ＣＡＲの例は、配列番号３のヌクレオチド配列および配列番号４のアミノ酸配列の単一ＣＤ２０標的化ベクターＬＴＧ１４９５を含む。第２の例は、配列番号９のヌクレオチド配列および配列番号１０のアミノ酸配列の、ＣＤ２２に特異的な単一特異性ＣＡＲ ＬＴＧ２２００である。ＤｕｏＣＡＲの創出において重要な分子の態様は、非冗長性の適合配列の包含、および予期されない組換えまたは細胞内会合が起こらないような形質導入Ｔ細胞におけるこれらの配列の評価である。これは、ベクターの産生細胞株、または標的細胞集団の両方で起こり得る。この理由のために、ＤｕｏＣＡＲの状況に適合することが公知のバリアントＣＡＲ構造を含めた。これらは、それぞれ、配列番号２９のヌクレオチド配列、および配列番号３０のアミノ酸配列に記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ ＬＴＧ１４９４を含む。この配列は、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０７）、Ｗｈｉｔｌｏｗ Ｍ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６巻：９８９～９９５頁を参照されたい）と呼ばれるｓｃＦＶ４の重鎖および軽鎖を接合するよく説明されているリンカーを含む。一部の場合では、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、それぞれ、配列番号３１のヌクレオチド配列および配列番号３２のアミノ酸配列のＬＴＧ１５３８におけるように、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲフォーマットにおいて、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーと置換された。別の例では、代替の膜貫通ドメインを有するＣＡＲが創出された。それぞれ、配列番号２１のヌクレオチド配列および配列番号２２のアミノ酸配列の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＴＧ１５６２は、ＣＤ４（ＣＤ８とは対照的に）膜貫通ドメインを利用する。同様に、それぞれ配列番号４９のヌクレオチド配列および配列番号５０のアミノ酸配列の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＴＧ１５６３は、ＴＮＦＲＳＦ１９由来の代替の膜貫通を有する。ＤｕｏＣＡＲはまた、固形腫瘍、例えば、メソセリン腫瘍抗原を発現するものに標的化され得る。例えば、抗メソセリン免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの２０１７年１月９日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第６２／４４４，２０１号、および割り当てられたＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の物質番号ＬＥＮ＿０１７に開示される、それぞれ、配列番号３７のヌクレオチド配列および配列番号３８のアミノ酸配列のｓｃＦＶバインダーは、メソセリンのために創出され、これは、それぞれ、配列番号３９のヌクレオチド配列および配列番号４０のアミノ酸配列の機能的ＣＡＲに組み込まれ得、それによって、ＤｕｏＣＡＲ療法に組み込まれ得る。ｓｃＦｖ配列に加えて、単鎖抗原バインダー（ｓｃＦｖとは対照的に）は、ＤｕｏＣＡＲ適用に組み込まれ得る。例えば、抗ＣＤ３３免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの２０１７年３月２４日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第６２／４７６，４３８号、および割り当てられたＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の物質番号ＬＥＮ＿０１８に開示される、それぞれ、配列番号４１のヌクレオチド配列および配列番号４２のアミノ酸配列のＣＤ３３特異的重鎖のみのバインダーは、ＣＤ３３発現悪性腫瘍を標的化する、それぞれ、配列番号４３のヌクレオチド配列および配列番号４４のアミノ酸配列の機能的ＣＡＲのＬＴＧ１９０６に組み込まれ得る。ＤｕｏＣＡＲ治療適用の一例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＴＳＬＰＲ抗原を発現する白血病の処置である。この場合では、ＬＴＧ１４９６またはＬＴＧ１４９７（それぞれ、配列番号３５、２６）は、それぞれ配列番号４７のＴＳＬＰＲ特異的ＣＡＲ（ＬＴＧ１７８９）および配列番号４８のアミノ酸配列と組み合わせることができ、これは、配列番号４５のヌクレオチド配列および配列番号４６のアミノ酸配列のＴＳＬＰＲ特異的ｓｃＦＶドメインから創出された。
ＤｕｏＣＡＲ治療適用の別の例は、ＣＤ３８抗原を発現するがんの処置である。例えば、抗ＣＤ３８免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの２０１８年１１月３０日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第６２／７７３，９４０号；および割り当てられたＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の物質番号ＬＥＮ＿０２６に開示される、ＣＤ３８特異的バインダーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、出願人の同時係属している仮特許出願第６２／７７３，９４０号に開示される、ＣＤ３８発現悪性腫瘍を標的化する１つまたは複数の機能的ＣＡＲに組み込まれ得る。
ＤｕｏＣＡＲ治療適用の別の例は、ＣＤ１２３抗原を発現するがんの処置である。例えば、抗ＣＤ１２３免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法というタイトルの２０１９年９月２０日出願の出願人の同時係属している米国特許出願第１６／５７８，０６３号；および割り当てられたＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の物質番号ＬＥＮ＿０２４に開示され；および２０１８年９月２０日出願の仮特許出願第６２／７３４，１０６号の優先権の利益を主張する、ＣＤ１２３特異的バインダーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、出願人の同時係属している米国特許出願第１６／５７８，０６３号に開示される、ＣＤ１２３発現悪性腫瘍を標的化する１つまたは複数の機能的ＣＡＲに組み込まれ得る。
ＤｕｏＣＡＲ治療適用の別の例は、ＢＣＭＡ抗原を発現するがんの処置である。例えば、多発性骨髄腫および他のＢＣＭＡ陽性悪性腫瘍の処置のための完全ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞というタイトルの２０１９年５月３０日出願の出願人の同時係属している仮特許出願第６２／８５４，５７４号；および割り当てられたＬｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の物質番号ＭＢＧ＿１３に開示される、ＢＣＭＡ特異的バインダーは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、出願人の同時係属している仮特許出願第６２／８５４，５７４号に開示される、ＢＣＭＡ発現悪性腫瘍を標的化する１つまたは複数の機能的ＣＡＲに組み込まれ得る。
このテクノロジーが基づくタンデムＣＡＲ（配列番号２３のヌクレオチド配列および配列番号２４のアミノ酸配列に記載される２つのｓｃＦｖドメインを含む）の例は、配列番号２５のヌクレオチド配列および配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤ２０＿ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＴＧ１４９７を含む。一部の場合では、２つのバインダーの順序を逆転させることで、標的細胞における良好なＤｕｏＣＡＲ発現を提供し得る。したがって、配列番号２５のヌクレオチド配列および配列番号２６のアミノ酸配列に示される、ＣＤ１９ ｓｃＦｖがより近位であるＬＴＧ１４９７、ならびに配列番号３３のヌクレオチド配列および配列番号３４のアミノ酸配列に示される、ＣＤ１９ ｓｃＦｖが膜に対してより遠位であるＬＴＧ１４９６は両方とも、ＤｕｏＣＡＲを含むＤｕｏＳｅｔのメンバーの１つとして使用することができる。
実施例１および２において利用される方法：
細胞株（ＰＢＭＣおよび標的）
全ての細胞株および試薬は、特記しない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓｓ、ＶＡ）から購入した。バーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、急性リンパ性白血病細胞株であるＲＥＨ、および慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で補充したＲＰＭＩ－１６４０培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔは、１０％の熱不活化ＦＢＳで補充したダルベッコ改変イーグル培地において繁殖させた。
野生型腫瘍株に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を安定に形質導入した後、クローン化し、ルシフェラーゼ陽性クローンを選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを生成した。マウス適合Ｒａｊｉ－ｌｕｃ株を、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）にホタルルシフェラーゼを安定に発現するＲａｊｉクローンを移植すること、陽性選択（ＣＤ１９マイクロビーズ、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または陰性選択（マウス細胞枯渇キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のいずれかによって移植されたＲａｊｉ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をマウス脾臓から単離すること、培養において増殖させること、および高発現のホタルルシフェラーゼを有するクローンの選択を容易にするために再クローン化することによって、生成した。Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ、Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ、ＯＫ）において、書面によるドナーの同意を得て、健康なボランティアから全血が採取された。加工されたバフィーコートをＯＢＩから購入した。ＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の１：１混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する正の選択によって、バフィーコートからＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性ヒトＴ細胞を精製した。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の創出－ＤｕｏＣＡＲを含む発現ベクター
ＣＡＲ抗原結合性ドメインのＳｃＦｖの配列は、ＣＤ１９に対するマウスハイブリドーマＦＭＣ－６３（ＦＭＣ－６３：ＡＡ１～２６７、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＨＭ８５２９５２．１）およびＶＬおよびＶＨの全体配列のＣＤ２０に対するＬｅｕ－１６［１］に由来していた。ＣＤ２２ ｓｃＦｖ結合を、公的に利用可能な配列から創出した。各抗体のｓｃＦｖを、インフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン（ＡＡ１２３～１９１、Ｒｅｆ配列ＩＤ ＮＰ＿００１７５９．３）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＡＡ２１４～２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ Ｑ０７０１１）トランス活性化ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ＡＡ５２～１６３、Ｒｅｆ配列ＩＤ：ＮＰ＿０００７２５．１）に連結することにより、タンデムＣＡＲ１９＿２０またはＣＡＲ２０＿１９を生成した。１９Ａおよび２０ＡのｓｃＦｖ領域を、可動性鎖間リンカー（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１０８）、続いてＣＤ８、４－１ＢＢ、およびＣＤ３ゼータドメインによって配列中で連結した。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列を、［２］に記載されるように、全てのコンストラクトに含めた。ＣＡＲコンストラクト配列を、コドン最適化し（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、ヒトＥＦ－１αプロモーターの調節下にある第３世代レンチウイルスプラスミド骨格（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローン化した。［３］に以前に記載されるように、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター（ＬＶ）を含む上清を生成した。採取されたペレット化レンチウイルス上清を、－８０℃で保管した。
初代Ｔ細胞形質導入：
正常なドナーからの選択されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞を、４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２で補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（無血清）において、０．３～２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、３日目に、１０ｕｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを一晩形質導入し、４日目に培地を交換した。５日目に、培養物を、２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２で補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地に移し、１０～１３日目の採取まで繁殖させた。
免疫エフェクターアッセイ：細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞５，０００個を種々のエフェクター対標的比でＣＡＲ Ｔ細胞と混合し、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を各ウェルに添加し、生じた発光を、ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）において分析し、秒あたりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）および１％Ｔｗｅｅｎ－２０を加えた標的のみのウェル（最小ＣＰＳ）を使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的な溶解パーセントを、（１－（試料ＣＰＳ－最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ－最小ＣＰＳ））として算出した。
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーのための全ての細胞染色試薬は、特記しない限り、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからであった。１００万個のＣＡＲ Ｔ形質導入細胞を、培養物から採取し、低温の染色緩衝液（０．５％のウシ血清アルブミンを有するＡｕｔｏＭＡＣＳ溶液）中で２回洗浄し、４℃で５分間、３５０×ｇでペレットにした。形質導入Ｔ細胞におけるＣＡＲ表面発現を、最初に、４℃で３０分間、タンパク質Ｌ－ビオチンコンジュゲート（ストック １ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で染色し、続いて２回の洗浄、および４℃で３０分間、ストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲート（ストック：１．０ｍｌ、１：２００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色することによって検出した。陰性対照として、ストレプトアビジン－ＰＥのみで染色された非形質導入細胞および形質導入細胞を使用した。抗ＣＤ４抗体を用いて、ＣＡＲ Ｔ陽性集団のＣＤ４とＣＤ８の比を決定し、第２のインキュベーションステップの間に添加した。死滅した細胞は７ＡＡＤ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により除外した。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液２００μｌで再懸濁させた。特異的ＤｕｏＳｅｔ ＣＡＲ Ｔ染色を、ＩＬ－２存在下において、ＤｕｏＳｅｔベクターで形質導入されたＣＤ３－ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴＲａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化されたヒトＴ細胞において行い、抗体に対する染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を使用して、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１９－、ＣＤ２０－、またはＣＤ２２－ｓｃＦｖドメインの発現について分析した。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ活性を、１ｕｇ／試料で使用されるＣＤ１９－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出し、０．７５ｕｇ／試料のヤギ抗ヒトＦｃ－ガンマ－Ｒ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で染色した。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ活性を、０．１１ｕｇ／試料のＣＤ２０－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出し、０．２ｕｇ／試料のｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｐＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で検出した。抗ＣＤ２２ ｓｃＦｃ活性を、０．１ｕｇ／試料のＣＤ２２－Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で検出し、抗－Ｈｉｓ ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で検出した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）において行った。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴付けを、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、ＣＤ２０ ＶｉｏＢｌｕｅ、およびＣＤ２２－ＡＰＣ抗体を使用して行った。死滅した細胞は７ＡＡＤ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により分析から除外した。
実施例１
初代ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ（２＋１ ＤｕｏＳｅｔ）の発現
原理の証拠として、２つのＣＡＲ－Ｔベクターで構成されるＤｕｏＳｅｔを創出した。セットの１メンバーは、ＣＤ８膜貫通、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインに連結されたタンデムＣＤ２０＿ＣＤ１９結合性ドメインを発現した（ＬＴＧ２２２８）、配列番号５１および配列番号５２。ＤｕｏＳｅｔの第２のメンバーは、ＣＤ８膜貫通、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインに連結された単一ＣＤ２２バインダーを有するＣＡＲコンストラクトであった（ＬＴＧ２２００）、配列番号９および配列番号１０。図７において、対の縦列は、ＣＤ２０およびＣＤ１９ ｓｃＦｖについて左の縦列に、ＣＤ２２およびＣＤ１９ ｓｃＦｖについて右の縦列に、二重染色を示す。１行目は、形質導入されていない（ＵＴＤ）Ｔ細胞を示し、したがって結合を示さない。２行目は、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ＣＤ２８およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０＿ＣＤ１９ ＣＡＲベクターをコードするＬＶで形質導入されたＴ細胞を示す（２０－１９－２８ｚ）。二重染色は、ＣＤ２０およびＣＤ１９の結合について見られるが（左のパネル）、ＣＤ１９の結合のみ右パネルに見られる。３行目は、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ならびに細胞内４－１ＢＢおよびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２２ ＣＡＲベクターで形質導入されたＴ細胞を示す（２２－ＢＢｚ）。二重染色は、ＣＤ１９またはＣＤ２０で見られず（左のパネル）、ＣＤ２２に結合することができる細胞の単一の集団のみ見られる（右のパネル）。４行目では、Ｔ細胞は、２行目および３行目の両方のベクターで構成されるＤｕｏＳｅｔで形質導入される。ＤｕｏＳｅｔのみが、３つのＣＡＲコード結合性ドメイン全てを発現する（細胞の４２％がＣＤ２０＿１９を発現し（左のパネル）、３８％がＣＤ２２およびＣＤ１９結合性ドメインを発現する（右のパネル））。ＣＤ２２およびＣＤ１９ ｓｃＦｖは、ＤｕｏＳｅｔを含む２つの別個の膜貫通タンパク質それぞれ上にあるので、３８％は、この例では、真のＤｕｏＳｅｔを発現する集団を示す。
実施例２
共形質導入法によって生成するＤｕｏＣＡＲを発現するヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性
３つの白血病抗原を同時に標的化するＤｕｏＣＡＲを発現するヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性（参照、ＤｕｏＣＡＲ発現の特徴について図７を参照されたい）。ＣＤ２０＿１９タンデムＣＡＲおよびＣＤ２２特異的単一ＣＡＲ（実施例１におけるようにして調製）で構成されるＤｕｏＳｅｔを、標的として白血病細胞株およびモデル細胞株を使用する細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて、エフェクターＴ細胞集団として使用した。単一のＣＡＲ構成要素（２０＿１９－２８ｚまたは２２－ＢＢｚ）またはＤｕｏＣＡＲ（２０＿１９－２８ｚ＋２２－ＢＢｚ）で形質導入されたヒトＴ細胞を、４つの異なるエフェクター対標的比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、示される通り）で、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて使用した（参照、図８を参照されたい）。ＣＡＲ－Ｔ標的として使用される白血病細胞株は、Ｒａｊｉ（３つ全ての標的抗原を発現する）、ＲＥＨ（３つ全ての標的抗原を発現する）、Ｋ５６２（対照、標的発現なし）、Ｋ５６２－ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ５６２－ＣＤ２０（ＣＤ２０を発現する）、およびＫ５６２－ＣＤ２２（ＣＤ２２を発現する）であった。ＤｕｏＣＡＲ形質導入細胞（２０－１９－２８ｚ＋２２－ＢＢｚ）のみが、白血病細胞株（ＲａｊｉおよびＲＥＨ）および３つ全ての単一発現Ｋ５６２標的細胞株（Ｋ５６２－ＣＤ１９、Ｋ５６２－ＣＤ２０、Ｋ５６２－ＣＤ２２）の両方に対する高い細胞溶解活性を示した。これは、Ｄｕｏテクノロジーが、同じエフェクターＴ細胞集団において、３つの白血病抗原を同時に独自に標的化することができることを実証し、したがって、一度に１つよりも多いまたは２つの標的抗原を標的化することを可能にすることによって、優れた抗新生物活性を実証し、このようにして、逃避突然変異体（１つもしくは２つの抗原を欠くか、または下方調節する細胞クローン、これが免疫除去を逃避する）を生じる悪性腫瘍の可能性を減少させる。最後の結果は、抗原喪失バリアントの逃避および副産物により、患者の治癒率が高くなり、これは、最終的には再発する。
実施例３
共トランスフェクション法によって生成するＤｕｏＣＡＲを発現するヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性
本出願に記載されるＤｕｏＣＡＲテクノロジーは、遺伝子ベクターによってコードされる１つよりも多い膜貫通タンパク質から２つよりも多い抗原特異性を発現する、治療用リンパ球、この実施例ではヒトＴ細胞の集団を生成する。この実施例では、これは、２つの異なる手段によって達成される。図９は、「非形質導入」、「共形質導入」および「共トランスフェクション」というラベル付きの３行のデータを含む。図９は、図７におけるようにして生成された２つの縦列のデータを含み、ここで、１列目は、ＣＤ２０およびＣＤ１９特異的な特異的結合の発現についてフローサイトメトリーによって分析され、２列目は、ＣＤ２２およびＣＤ１９結合活性の発現についてフローサイトメトリーによって分析される。１行目のデータにおいて、非形質導入ヒトＴ細胞が示される。結合活性は、ＣＡＲ由来結合活性のＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２組換えタンパク質指標について見られず、ＤｕｏＣＡＲ発現がないことを実証する。２行目において、「共形質導入」を使用して、ＤｕｏＣＡＲを生成した。このデータセットでは、２つのＬＶを使用して、活性化Ｔ細胞を同時に形質導入した。図７におけるように、ＤｕｏＣＡＲを含むＤｕｏＳｅｔ中の１つのＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達モチーフに連結されたタンデムＣＤ２０およびＣＤ１９バインダーであり、他のＣＡＲは、４－１ＢＢおよびＣＤ３－ゼータシグナル伝達モチーフに連結されたＣＤ２２バインダーであった。縦列１における右上象限は、ＣＤ２０およびＣＤ１９ ｓｃＦｖ活性についての単一染色の非常に特異的なパターンを示す。これは、同じ表面糖タンパク質における両方のバインダーにより、したがって、それらは、等しい強度で共発現され、見られる非常に特異的な線状パターンを生じる。共形質導入データの２番目の縦列において、２つの糖タンパク質が各細胞において均一なパターンで発現されない場合に、より伝統的なパターンが見られる。したがって、４つの異なる集団のパターンが見られる。左下象限において、どちらのバインダーも発現しない細胞が見られる。左上において、ＣＤ２２ ＣＡＲのみを発現する細胞が見られる。右下象限において、ＣＤ２０＿ＣＤ１９タンデムＣＡＲのみを発現する細胞が見られる。最後に、右上象限において、ＤｕｏＣＡＲを含むＣＡＲ ＤｕｏＳｅｔの両方のメンバーを発現する細胞が見られる。
下の行において、ＤｕｏＣＡＲを発現する細胞集団は、異なる様式で生成する。独立して創出された２つのＬＶ調製物をＴ細胞形質導入の時に使用する共形質導入法とは異なって、「共トランスフェクション」は、２つの骨格プラスミド（ＤｕｏＣＡＲを含む２つのＣＡＲをコードする）が、ＬＶ産生のために２９３Ｔパッケージング細胞株に同時にトランスフェクトされる方法を指す。この第３世代ＬＶ系を含むヘルパープラスミドは、両方の方法で同一である。共トランスフェクション法の利点は、両方のＣＡＲをコードするベクターを含むＬＶの単一調製物が創出されることである。データから見られ得るように、共トランスフェクション法を使用することで、２行目の共形質導入法と比較して、ＣＤ２０－ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲの発現のほぼ同一のパターンが見られる。２列目のデータの右上象限における共トランスフェクションによって作製されたＬＶによって誘導される両糖タンパク質についての染色パターン（ＣＤ２２－ＣＡＲについてＣＤ２２、ＣＤ２０＿ＣＤ１９ ＣＡＲについてＣＤ１９共染色）は、両方の方法が、有効にＤｕｏＣＡＲを生成することを実証する。
参照文献：
１）Ｗｕ、Ａ．Ｍ．ら、Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１年 １４巻（１２号）：１０２５～１０３３頁。
２）Ｈａｓｏ、Ｗ．ら、Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ－ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｂｌｏｏｄ、２０１３年 １２１巻（７号）：１１６５～１１７４頁。
３）Ｋｕｒｏｄａ，Ｈ．ら、Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９年 １５７巻（２号）：１１３～１２１頁。
実施例４
共トランスフェクション法によって生成したＤｕｏＣＡＲと２シストロン性ＤｕｏＣＡＲコンストラクトとの比較
実施例４において利用される方法：
細胞株（ＰＢＭＣおよび標的）：全ての細胞株および試薬は、特記しない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓｓ、ＶＡ）から購入した。バーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、急性リンパ性白血病細胞株であるＲＥＨ、および慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で補充したＲＰＭＩ－１６４０培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔは、１０％の熱不活化ＦＢＳで補充したダルベッコ改変イーグル培地において繁殖させた。
野生型腫瘍株に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を安定に形質導入した後、クローン化し、ルシフェラーゼ陽性クローンを選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを生成した。マウス適合Ｒａｊｉ－ｌｕｃ株を、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）にホタルルシフェラーゼを安定に発現するＲａｊｉクローンを移植すること、陽性選択（ＣＤ１９マイクロビーズ、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または陰性選択（マウス細胞枯渇キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のいずれかによって移植されたＲａｊｉ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をマウス脾臓から単離すること、培養において増殖させること、および高発現のホタルルシフェラーゼを有するクローンの選択を容易にするために再クローン化することによって、生成した。Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ、Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ、ＯＫ）において、書面によるドナーの同意を得て、健康なボランティアから全血が採取された。加工されたバフィーコートをＯＢＩから購入した。ＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の１：１混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する正の選択によって、バフィーコートからＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性ヒトＴ細胞を精製した。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の創出－ＤｕｏＣＡＲを含む発現ベクター：
ＣＡＲ抗原結合性ドメイン、ＳｃＦｖ、配列は、ＣＤ１９に対するマウスハイブリドーマＦＭＣ－６３（ＦＭＣ－６３：ＡＡ１～２６７、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＨＭ８５２９５２．１）およびＶＬおよびＶＨの全体配列のＣＤ２０に対するＬｅｕ－１６［１］に由来していた。いくつかの抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ結合配列を使用した。各抗体のｓｃＦｖを、インフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン（ＡＡ１２３～１９１、Ｒｅｆ配列ＩＤ ＮＰ＿００１７５９．３）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＡＡ２１４～２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ Ｑ０７０１１）トランス活性化ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ＡＡ５２～１６３、Ｒｅｆ配列ＩＤ：ＮＰ＿０００７２５．１）に連結することにより、タンデムＣＡＲ１９＿２０またはＣＡＲ２０＿１９を生成した。１９Ａおよび２０ＡのｓｃＦｖ領域を、可動性鎖間リンカー（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１０８）、続いてＣＤ８、４－１ＢＢ、およびＣＤ３ゼータドメインによって配列中で連結した。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列を、［２］に記載されるように、全てのコンストラクトに含めた。２シストロン性ＣＡＲ設計において、２つのＣＡＲ鎖は、リボソームスキップ部位２Ａによって分離された同じ発現カセット内でコードされた。ＣＡＲコンストラクト配列を、コドン最適化し（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、ＭＳＣＶのヒトＥＦ－１αプロモーターの調節下にある第３世代レンチウイルスプラスミド骨格（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローン化した。［３］に以前に記載されるように、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター（ＬＶ）を含む上清を生成した。共トランスフェクション実験のために、ＤｕｏＣＡＲ鎖それぞれをコードする当量の２つの移入プラスミドを混合し、ヘルパープラスミドと一緒に、トランスフェクションステップの間にＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞株に適用し、生じるウイルスベクター調製物を、初代ヒトＴ細胞の形質導入のために使用した。採取されたペレット化レンチウイルス上清を、－８０℃で保管した。
初代Ｔ細胞形質導入：正常なドナーからの選択されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞を、４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２で補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（無血清）において、０．３～２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、３日目に、１０ｕｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを一晩形質導入し、４日目に培地を交換した。５日目に、培養物を、２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２で補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地に移し、１０～１３日目の採取まで繁殖させた。
免疫エフェクターアッセイ：細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞５，０００個を種々のエフェクター対標的比でＣＡＲ Ｔ細胞と混合し、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を各ウェルに添加し、生じた発光を、ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）において分析し、秒あたりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）および１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を加えた標的のみのウェル（最小ＣＰＳ）を使用してアッセイ範囲を決定した。特異的な溶解のパーセントを（１－（試料ＣＰＳ－最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ－最小ＣＰＳ））として算出した。
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーのための全ての細胞染色試薬は、特記しない限り、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからであった。１００万個のＣＡＲ Ｔ形質導入細胞を、培養物から採取し、低温の染色緩衝液（０．５％のウシ血清アルブミンを有するＡｕｔｏＭＡＣＳ溶液）中で２回洗浄し、４℃で５分間、３５０×ｇでペレットにした。形質導入Ｔ細胞におけるＣＡＲ表面発現を、最初に、４℃で３０分間、タンパク質Ｌ－ビオチンコンジュゲート（ストック １ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で染色し、続いて２回の洗浄、および４℃で３０分間、ストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲート（ストック：１．０ｍｌ、１：２００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色することによって検出した。陰性対照として、ストレプトアビジン－ＰＥのみで染色された非形質導入細胞および形質導入細胞を使用した。抗ＣＤ４抗体を用いて、ＣＡＲ Ｔ陽性集団のＣＤ４とＣＤ８の比を決定し、第２のインキュベーションステップの間に添加した。死滅した細胞は７ＡＡＤ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により除外した。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液２００μｌで再懸濁させた。特異的ＤｕｏＳｅｔ ＣＡＲ Ｔ染色を、ＩＬ－２存在下において、ＤｕｏＳｅｔベクターで形質導入されたＣＤ３－ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴＲａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化されたヒトＴ細胞において行い、抗体に対する染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２を使用して、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１９－、ＣＤ２０－、またはＣＤ２２－ｓｃＦｖドメインの発現について分析した。
抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ活性を、１ｕｇ／試料で使用されるＣＤ１９－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出し、０．７５ｕｇ／試料のヤギ抗ヒトＦｃ－ガンマ－Ｒ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で染色した。抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ活性を、０．１ｕｇ／試料のＣＤ２０－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出し、０．２ｕｇ／試料のストレプトアビジンＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で検出した。抗ＣＤ２２ ｓｃＦｃ活性を、０．１ｕｇ／試料のＣＤ２２－Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で検出し、抗－Ｈｉｓ ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で検出した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）において行った。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴付けを、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、ＣＤ２０ ＶｉｏＢｌｕｅ、およびＣＤ２２－ＡＰＣ抗体を使用して行った。死滅した細胞は７ＡＡＤ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により分析から除外した。
２Ａリボソームスキップ配列を使用する２シストロン性ＤｕｏＣＡＲの生成
上記の実施例２および実施例３に記載される共形質導入および共トランスフェクションの手法に加えて、ＤｕｏＣＡＲは、３つの血液学的腫瘍抗原のＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２を同時に標的化し、かつ異なる共刺激ドメインを特徴とし、単一のｍＲＮＡ転写物からの２つのＣＡＲ鎖の同時発現は、自己切断エレメント２Ａの使用によって容易にすることができる。２Ａエレメントは、ｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳の間にリボソームスキップを媒介し、このようにして、等モル比の２つの異なるＣＡＲタンパク質鎖の産生を可能にする。この実施例では、１つのＣＡＲ鎖は、インフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたＣＤ２２ ｓｃＦｖ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される。第２のＣＡＲ鎖は、タンデムＣＤ２０ ＣＤ１９ ｓｃＦｖベースの標的化ドメイン、続いてＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される。２つの設計は、ＣＡＲ鎖の順序が異なり、例えば、１つの設計では、ＣＤ２２ ＣＡＲが、最初に、２Ａエレメント、およびタンデム２０１９ ＣＡＲが続き、逆もまた同様である（図１０）。
最初に、ＥＦ１ａプロモーターの制御下でＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２抗原を同時に標的化する４つの２シストロン性ＤｕｏＣＡＲ設計のセットを、上記に記載されるように、構築した（セット１、以下の表１）。
ＤｕｏＣＡＲフォーマットにおけるＣＤ２２標的化ＣＡＲ部分の最適な発現を容易にするために、ＣＤ２２標的化ＣＡＲ鎖を、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ配列の１６Ｐ８または１６Ｐ１７の１つに組み込んだ。ＣＤ２２ ｓｃＦｖ Ｍ９７１は、比較対照として使用され、非形質導入細胞（ＵＴＤ）はＣＡＲ陰性対照としての役割を果たした。ＣＤ２０－ＣＤ１９標的化ＣＡＲ鎖およびＣＤ２２標的化ＣＡＲ鎖の共発現は、上記に記載されるように、２Ａリボソームスキップ配列によって容易になった。個々にコードされるＣＡＲ鎖を、発現対照として含めた。健康なドナーからのヒト初代Ｔ細胞を、各ＤｕｏＣＡＲまたは単一のＣＡＲ対照をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。Ｔ細胞培養増殖の終了の際に、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって評価した。同じ細胞におけるタンデムＣＤ２０－ＣＤ１９ ＣＡＲ鎖およびＣＤ２２－ＣＡＲ鎖の共発現を表すＤｕｏＣＡＲ群（ＬＴＧ２５１５、ＬＴＧ２５２０、ＬＴＧ２５２１）におけるＣＡＲ２０＋ＣＡＲ２２＋二重陽性細胞のパーセンテージは、比較的低く、２８％（ＬＴＧ２５１５、ＬＴＧ２５２０）～９％（ＬＴＧ２５２１）の範囲であった（図１１）。対照的に、個々のＣＡＲ対照の発現は、ＣＤ２２標的化コンストラクト（ＬＴＧ２２００）について約７２％、タンデムＣＤ２０－ＣＤ１９標的化ＣＡＲ（ＬＴＧ ２２２８、図１１）について約３８％で、かなり高かった。次いで、ＤｕｏＣＡＲの機能性をサイトカイン放出アッセイにおいて試験した。対照のＤｕｏＣＡＲエフェクター細胞を、１０のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で、Ｒａｊｉ標的細胞と一晩混合した。インキュベーション期間の最後に、細胞培養上清を採取し、分泌されたＴ細胞サイトカインのＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ－２について検定した（図１２）。腫瘍標的細胞の非存在下の類似の条件下でインキュベートされたエフェクターを、自発的サイトカイン放出のための追加の対照として使用した。Ｒａｊｉ腫瘍細胞とＣＡＲエフェクターとの共インキュベーションは、全てのコンストラクトについて、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、およびＴＮＦａの強い上方調節を生じた。特に、ＣＡＲは、自発的にサイトカインを産生しなかった。しかし、図１１において見られるように、サイトカイン分泌の高さは、陽性対照のＣＡＲ２２ ＬＧＴ２２００と比較して、全てのＤｕｏＣＡＲコンストラクトについてより低い傾向であり、タンデム２０１９ ＣＡＲ ＬＧＴ２２２８は、ＤｕｏＣＡＲの比較的中程度の発現による可能性がある。
単一ＣＡＲ対照（図１１、図１２）と比較して中程度のＤｕｏＣＡＲ発現およびサイトカイン応答は、大きなペイロードサイズが、本配置におけるＤｕｏＣＡＲ発現の効率に有害な影響を与え得ることを示唆した。ＤｕｏＣＡＲ形質導入の効率を改善するために、選択ＤｕｏＣＡＲ配列を必要によりコドン再最適化し、発現カセットを、改善された２シストロン性発現のためのＭＳＣＶ内部プロモーターの制御下で新しい発現骨格に再クローン化した（セット２、表１）。
レンチウイルスベクターを、各新ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのために作製し、ＣＡＲ Ｔ細胞を材料および方法に記載されるように、形質導入および増殖させた。ＤｕｏＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーにより決定した。ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＤｕｏＣＡＲの２つの鎖を共発現する細胞を示す（図１３）。ここで、高い形質導入効率は、ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ００４４（ＭＳＣＶ＿２０－１９－２８ｚ－２Ａ－１６ｐ８－ＢＢｚ）およびＤ００４７（ＭＳＣＶ＿１６ｐ８－ＢＢｚ－２Ａ－２０－１９－２８ｚ）について達成され、両方とも抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ １６Ｐ８を含む（図１３、それぞれ、５１％および４５％）。予想外にも、比較対照のｍ９７１ ＣＤ２２ ｓｃＦｖを含むＤｕｏＣＡＲのＤ００４３は、遠位の配向で十分に発現されたが（ＭＳＣＶ＿２０－１９－２８ｚ－２Ａ－ｍ９７１－ＢＢｚ、４６％陽性）、逆の配向では発現を示さなかった（Ｄ００４６、ＭＳＣＶ＿ｍ９７１－ＢＢｚ－２Ａ－２０－１９－２８ｚ）。したがって、ＤｕｏＣＡＲ設計に含まれるｓｃＦｖ配列の選択、ならびに配列のコドン最適化および発現骨格の選択は全て、最適なＤｕｏＣＡＲ発現のために重大な意味を持つ。
ＤｕｏＣＡＲセット２形質導入Ｔ細胞の細胞傷害機能を、腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２の変化する発現によるパネル腫瘍株に対する一晩死滅アッセイにおいて検定した。全ての株を、ホタルルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入し、死滅アッセイを、材料および方法に記載するように、行った。最初に、ＤｕｏＣＡＲを、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋と、非ホジキンリンパ腫のＲａｊｉ、または急性リンパ芽球性白血病のＲｅｈ細胞、またはＣＤ１９－ＣＤ２０－ＣＤ２２－のヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞株と混合した（図１５）。ＣＡＲ ２０－１９－２８ｚおよびＣＤ２２ ＣＡＲ １６ｐ８－ＢＢｚ ＣＡＲを２シストロン的にコードするＤｕｏＣＡＲのＤ００４４およびＤ００４７、ならびに単一のＣＡＲ ２２対照のＬＴＧ２２００、ならびにタンデムＣＡＲ対照の２０－１９ ＬＴＧ１４９７だけでなく、非形質転換Ｔ細胞対照（ＵＴＤ）も含めた（図１４）。コンストラクトＤ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、およびＤ００４７は、簡素化のために、それぞれ、Ｄ４３、Ｄ４４、Ｄ４６、およびＤ４７と図の凡例に示す（図１４）。エフェクターおよび標的細胞を、２．５、５、または１０の比で、三連で一晩インキュベートし、次いで、プレートを、採取し、ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬で展開し、生存している腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を、ルミノメトリーによって決定した。全体として、ＣＡＲ細胞溶解機能は、ＤｕｏＣＡＲ発現と相関した（図１３）。 ＤｕｏＣＡＲのＤ００４７およびＤ００４４は、陽性対照のＤｕｏＣＡＲのＤ００４３のように、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２三重陽性腫瘍株のＲａｊｉおよびＲｅｈを強力に溶解したが、準最適で発現されるコンストラクトＤ００４６は、比較的低い溶解機能を有していた（図１４）。ＣＤ１９－ＣＤ２０－ＣＤ２２－三重陰性株の溶解は、いずれのＣＡＲコンストラクトによっても引き起こされず、同族抗原に対するＣＡＲ媒介溶解の特異性を強調した。
ＤｕｏＣＡＲコンストラクトの特異性をさらに描写するために、それぞれ、Ｋ１９、Ｋ２０、Ｋ２２と呼ばれる、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２抗原のいずれかを発現するトランスジェニックＫ５６２株を生成した（図１５）。単一陽性腫瘍株による共インキュベーションアッセイにおいて、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を標的化するＣＡＲ鎖を特徴とするＤｕｏＣＡＲのＤ４４およびＤ４７は、エフェクター対標的比依存性の様式で、各標的株を強力に溶解し、それらの機能において、比較対照であるＤｕｏＣＡＲのＤ００４３と類似していた（図の凡例中のコンストラクトの数字表示は、それぞれ、Ｄ００４３、Ｄ００４４、Ｄ００４６、Ｄ００４７からＤ４３、Ｄ４４、Ｄ４６、およびＤ４７に短縮した－図１５）。タンデム２０１９ ＣＡＲ（１４９７）を発現する対照Ｔ細胞は、腫瘍株Ｋ１９およびＫ２０を溶解したが、Ｋ２２においてわずかなバックグラウンドの溶解効果のみを有していた（最も高い１０のＥ：Ｔ比で１０％未満の溶解）。単一ＣＤ２２対照ＣＡＲは、Ｋ２２腫瘍細胞を強力に溶解したが、Ｋ２０細胞において機能を有しておらず、Ｋ１９細胞においてバックグラウンドの溶解のみを示した（最も高い１０：１のＥ：Ｔで１０％の溶解）。したがって、この実験系は、高精度で、各腫瘍抗原に対するＣＡＲ反応性の試験を可能にする。要約すると、ＤｕｏＣＡＲのＤ００４４およびＤ００４７は両方とも、それらの腫瘍標的化ドメインそれぞれが、この単一抗原発現試験系において機能的であることを実証した（図１５）。
ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのサイトカイン放出応答を特徴付けるために、ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞調製物のＤ００４４、Ｄ００４７（図の凡例：それぞれ、Ｄ４４、Ｄ４７）それぞれとＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋とを、Ｒａｊｉ腫瘍細胞と１０のＥ：Ｔ比で一晩混合し、培養上清を、Ｔ細胞サイトカインのＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ－２について、ＥＬＩＳＡによって分析した（図１６）。単一ＣＡＲ２２コンストラクトのＬＴＧ２２００、およびタンデム２０１９ ＣＡＲコンストラクトのＬＴＧ２２７３を比較のために含め、陰性対照として非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を使用した。並行して、各群からのＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍細胞の非存在下であるが類似の条件下でインキュベートして、自発的サイトカイン放出について試験した（図１６）。コンストラクトは、サイトカインの自発的な放出を生じなかったが、ＤｕｏＣＡＲのＤ４４およびＤ４７は両方とも、Ｒａｊｉ標的との共インキュベーション後に、これらのＤｕｏＣＡＲコンストラクトの効力を強調する、ＩＬ－２、ＩＦＮｇ、およびＴＮＦａの強い誘導を呈したことを見出した。特に、同じ細胞における２つの鎖の同時の共発現にもかかわらず、自発的サイトカイン放出の完全な非存在によって裏付けられるように、持続性シグナル伝達の証拠は検出されなかった（図１６）。
３つの異なる腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２を標的化し、異なる優遇機能を有する共刺激ドメインを持つ２つのＣＡＲ鎖で構成される２シストロン性ＤｕｏＣＡＲの開発の成功を達成することで、課題は、類似するコンストラクトが他の手法によって生成され得るかどうかを問うた。同じＯＲＦ内の別個のＣＡＲ鎖の２シストロン性発現の成功は、複数の最適化および改良のステップを必要とし、配列のそれぞれの新たなセットに独特である。対照的に、レンチウイルスベクターの製造の間またはＣＡＲ Ｔ形質導入の間に２つのＣＡＲ配列を組み合わせることは、より普遍的な手法、およびＴ細胞形質導入のための単一のレンチウイルス調製物を使用しながら、同じ細胞または同じＴ細胞集団において発現されるＣＡＲの組合せを創出するための高速の方法を提示し得る。この実施例では、ＤｕｏＣＡＲ手法におけるように、１つのＣＡＲ鎖は、インフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインに連結されたＣＤ２２ ｓｃＦｖ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される。第２のＣＡＲ鎖は、タンデムＣＤ２０ ＣＤ１９ ｓｃＦｖベースの標的化ドメイン、続いてＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインで構成される（図１７）。共トランスフェクション手法において、１つのＣＡＲ鎖をそれぞれコードする２つの移入プラスミドを、標準プロトコールに従って（材料および方法を参照されたい）、一緒に混合し、ベクター産生ステップの間にヘルパープラスミドと組み合わせる。得られるレンチウイルス調製物は、このようにして、２つのＣＡＲ鎖の混合物をコードする。この手法を使用して、２つのＣＡＲ鎖を同時にコードするレンチウイルス調製物のセットを生成した（以下の表２）。
ＭＳＣＶプロモーターの制御下のｓｃＦｖ １６Ｐ１７、１６Ｐ８、１６Ｐ１３ ＣＡＲ２２－４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ（それぞれ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）、およびＭＳＣＶの制御下のタンデムＣＡＲ２０１９－２８－ＣＤ３ゼータ（ＬＴＧ ２２７３）を利用するＣＡＲ２２のための移入プラスミドを構築した。各ＣＡＲ鎖を単独でコードするレンチウイルスベクターを、並行して産生した。全てのＤｕｏＣＡＲ共トランスフェクション調製物について高力価（１０１０ＴＵ／ｍｌ、示さない）が日常的に達成され、この手法の効率性を強調した。
ＤｕｏＣＡＲ機能を最適化するために、ｓｃＦｖ １６Ｐ１７、１６Ｐ８、および１６Ｐ１３で構成される一連のＣＡＲ２２コンストラクトを、ＭＳＣＶプロモーターの制御下で設計し（それぞれ、コンストラクトＤ１、Ｄ２、Ｄ３）、ＤｕｏＣＡＲ共トランスフェクションの組合せのためにＭＳＣＶプロモーターによっても駆動されるタンデムＣＡＲ ２０１９（ＬＴＧ２２７３）を使用した（表２および図１８）。レンチウイルスベクターを、ＣＤ２２ ＣＡＲプラスミドのうち１つとのＬＴＧ２２７３の共トランスフェクションによって調製し、高い感染力価を与えた（示さない）。各ＬＶを、健康なドナーＴ細胞の形質導入のために、２０の感染多重度（ＭＯＩ）で使用し、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって決定した（図１８）。単一ＣＡＲ対照をコードするＬＶで形質導入された全ての対照群は、高いＣＡＲ発現を与えた（Ｄ１について４５％、Ｄ２について８２％、Ｄ３について８２％、２２７３について８７％（示さない））。驚くべきことに、かつ予想外にも、共トランスフェクションの組合せにおいて、群Ｄ２＋７３およびＤ３＋７３は、２つのＣＡＲ鎖の効率的でほぼ同一の共発現を与えたが（５１％）、Ｄ１＋７３の組合せは、共発現しなかった（２．８％ ＣＡＲ＋）、図１８。これらのＤｕｏＣＡＲが溶解機能を持つかどうかを決定するために、腫瘍株のパネルにおける各群からのＣＡＲ Ｔ細胞を試験した（図１９、群Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３のラベルにおいて、「Ｄ」は簡素化のために省略した）。全てのＤｕｏＣＡＲ調製物は、三重陽性腫瘍株のＲａｊｉおよびＲｅｈを効率的に溶解したが、三重陰性株の２９３Ｔは溶解せず、ＤｕｏＣＡＲの特異性を裏付けた（図１９Ａ）。加えて、全てのＤｕｏＣＡＲは、単一抗原の腫瘍株Ｋ１９、Ｋ２０、およびＫ２２に対するバックグラウンドを上回る溶解機能を示したが、不一致の標的化ドメインを有する単一対照ＣＡＲは、特異的溶解を示さなかった：Ｋ１９においてＤ１からＤ３；Ｋ２０においてＤ１からＤ３、Ｋ２２において２２７３を参照されたい（図１９Ｂ）。次いで、特異的腫瘍標的との共インキュベーションの際にサイトカインを誘導するＤｕｏＣＡＲの能力を検定した。（図２０；群Ｄ１＋２２７３、Ｄ２＋２２７３、Ｄ３＋２２７３のラベルにおいて、「Ｄ」は簡素化のために省略した）。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞、単一ＣＡＲ対照、および非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、三重ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋のＲａｊｉ腫瘍細胞と混合し、一晩インキュベートした。並行して、腫瘍非存在下のＣＡＲ Ｔ細胞を、類似の条件下でインキュベートして、自発的サイトカイン放出を除外した。インキュベーション期間の最後に、培養上清を、サイトカインのＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、およびＩＬ－２について、ＥＬＩＳＡによって検定した（図２０）。全てのＣＡＲ群は、Ｒａｊｉとの共インキュベーションの際に、高いＩＦＮｇレベルを生じた。一部の単一ＣＤ２２ ＣＡＲ対照は、中程度の自発的ＩＦＮｇ放出を有していたが（Ｄ２、Ｄ３）、ＤｕｏＣＡＲは自発的にＩＦＮｇを産生せず、ＤｕｏＣＡＲについての潜在的に高い安全域を示唆した。ＩＬ－２およびＴＮＦａ発現も、ＣＡＲ ２２７２を除いて、全てのＣＡＲ群において、Ｒａｊｉの共インキュベーションによって高く誘導された（図２０）。
要約すると、ＬＶ調製、およびＴ細胞形質導入における生じるＬＶ調製物の適用の間の個々のＣＡＲ鎖の共トランスフェクションによる、機能的で高特異的なＤｕｏＣＡＲの生成が本明細書に記載される。さらに、単一標的抗原（Ｋ１９、Ｋ２０、Ｋ２２）のみを発現するトランスジェニック細胞株を使用して、ＣＡＲ標的化ドメインそれぞれが、機能的であり、標的発現腫瘍細胞に対してＤｕｏＣＡＲ機能を惹起することができることを実証した。驚くべきことに、かつ予想外にも、わずかな組合せのみが、堅固なＣＡＲ発現および強力な細胞傷害機能の両方を実証することが可能であり、したがって、ＤｕｏＣＡＲ設計は、自明なものではない。
実施例５
２シストロン性ＤｕｏＣＡＲは、リンパ腫腫瘍を強力に根絶させる。
実施例５において使用される材料および方法：
（ａ）細胞株
バーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、および慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓｓ、ＶＡ）から購入した。ＲＥＨ白血病株は、ＤＳＭＺ（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、ドイツ国）から購入した。細胞は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で補充したＲＰＭＩ－１６４０培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓株２９３Ｔは、ＡＴＣＣから購入した（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）。野生型腫瘍株に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を安定に形質導入した後、クローン化し、ルシフェラーゼ陽性クローンを選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンを生成した。Ｒａｊｉ １３Ｇ１１クローンは、ルシフェラーゼが形質導入されたＲａｊｉ細胞をマウスにおいて継代することにより生成し、その増殖能力について選択した。Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ）において、書面によるドナーの同意を得て、健康なボランティアから全血が採取された。加工されたバフィーコートをＯＢＩ（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ、ＯＫ）から購入した。ＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の１：１混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する正の選択によって、バフィーコートからＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性ヒトＴ細胞を精製した。
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の創出－発現ベクター
ＤｕｏＣＡＲコンストラクトを、１つのタンデムＣＤ１９およびＣＤ２０標的化ＣＡＲ、ならびに１つの単一ＣＤ２２標的化ＣＡＲの２シストロン性配列組み込みとして設計した。同じｍＲＮＡ鋳型からの２つのＣＡＲコンストラクトの２シストロン性発現は、リボソームスキップエレメント２Ａによって容易になった。ＣＡＲ抗原結合シグナルおよびタンデムドメインは、ヒト抗ＣＤ２２単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、または以前に記載されたタンデム２０－１９標的化ｓｃＦｖ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｄ．ら、（２０１７年）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ、５巻（１号）、４２頁）に由来した。ＣＡＲ Ｔコード配列を、バインダー配列を、インフレームでＣＤ８ａ連結および膜貫通ドメイン（ａａ１２３～１９１、Ｒｅｆ配列ＩＤ ＮＰ＿００１７５９．３）に連結させることによって生成した。ＣＡＲコンストラクトのＣ末端セグメントは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ａａ５２～１６３、Ｒｅｆ配列ＩＤ： ＮＰ＿０００７２５．１）を含んでいた。一部の設計は、ヒト４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、またはＣＤ２７タンパク質に由来する共刺激ドメインも含んでいた。ＣＡＲコンストラクト配列を、第３世代のレンチウイルスプラスミド骨格（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローニングした。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター（ＬＶ）を含む上清を生成し、レンチウイルスベクターを含む上清を遠心処理することによってベクターをペレットにして、－８０℃で保管した。
（ｃ）初代Ｔ細胞精製および形質導入
製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のプロトコールに従うＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の免疫磁性ビーズ選択を使用して、全血またはバフィーコート（書面によるドナーの同意を有する民間提供者から購入）から、健康なボランティア由来のヒト初代Ｔ細胞を精製した。Ｔ細胞を、２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地で、０．３～２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、２日目に、１０ｕｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを一晩形質導入し、３日目に培地を交換した。２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地において、８～１０日目の採取まで、培養物を繁殖させた。
（ｄ）免疫エフェクターアッセイ（ＣＴＬおよびサイトカイン）
細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞５，０００個を種々のエフェクター対標的比でＣＡＲ Ｔ細胞と合わせ、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を各ウェルに添加し、生じた発光を秒あたりのカウントとして定量化した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）および１％Ｔｗｅｅｎ－２０を加えた標的のみのウェル（最小ＣＰＳ）を使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的な溶解パーセントを、（１－（試料ＣＰＳ－最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ－最小ＣＰＳ））として算出した。１０：１のＥ：Ｔ比の共培養物からの上清を取り出し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２濃度について分析した。
（ｅ）フローサイトメトリー分析
細胞染色では、ＣＡＲ Ｔ形質導入細胞５０万個を培養物から採取し、０．５％のウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充した低温のＡｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＣＤ１９－ＦｃおよびＣＤ２０－ビオチンまたはＣＤ１９－ＦｃおよびＣＤ２２－Ｈｉｓペプチドに続いて二次ペプチド特異的蛍光コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色することにより、ＣＡＲ表面発現を検出した。供給業者のプロトコールにより、表示があった場合は、ＶｉｏＢｌｕｅフルオロフォアにコンジュゲートされた抗ＣＤ４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した。陰性対照として非形質導入細胞を使用した。全ての研究で、死滅した細胞は７ＡＡＤ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により除外した。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液２００ｕｌで再懸濁させた。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でフローサイトメトリー分析を実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータプロットを作成した。
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２を標的化する三価ＤｕｏＣＡＲの生成
三価ＤｕｏＣＡＲを、タンデム２０１９標的化ＣＡＲ鎖を２２標的化ＣＡＲ鎖にＰ２Ａリボソームスキップエレメントにより連結することによって構築した。４つの異なるＤｕｏＣＡＲコンストラクトを、最適化共形質導入実験において前に同定された最良の組合せに基づいて設計した。最適化研究は、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、もしくはＣＤ２７共刺激ドメインを含むか、または共刺激ドメインを含まない各ＣＡＲ部分（即ち、ＣＤ２０／１９タンデムＣＡＲおよびＣＤ２２単一ＣＡＲ）を、単独または組み合わせて試験することを含んでいた。試験される特異的パラメーターは、ＣＡＲ発現レベルおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性であった。Ｄ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６と呼ばれるＤｕｏＣＡＲコンストラクトの構造を、図２１Ａに示す。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ９３は、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的化するタンデムｓｃＦｖバインダードメイン、ＣＤ８由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン、続いてＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζ活性化ドメインで構成された。このＣＡＲコンストラクト配列は、Ｐ２Ａリボソームスキップエレメントにより、ＣＤ２２を標的化する第１世代ＣＡＲに連結され、このようにして、２シストロン性の三重標的化ＤｕｏＣＡＲを創出した（図２１）。２Ａリボソームスキップエレメントの使用は、以下のＣＡＲの特質を確実にする：（ｉ）均一な細胞産物の産生、および（ｉｉ）個々の細胞内での２つのＣＡＲ部分の化学量論的に等しい発現；その組合せが最適な抗腫瘍機能を達成する。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ９４は、ＩＣＯＳ共刺激ドメインをＯＸ４０ドメインで置換したこと除いて、Ｄ９３と同一であった。コンストラクトＤ９５は、Ｄ９４のものと同一であるＣＤ２０およびＣＤ１９タンデム標的化ＯＸ４０ｚ ＣＡＲ鎖、続いて第２世代のＣＤ２２ ＣＡＲ鎖とＩＣＯＳ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζ活性化ドメインで構成された。最後に、ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ９６は、ＣＤ２７共刺激ドメインを有するＣＤ２０およびＣＤ１９タンデム標的化ＣＡＲ鎖、続いてＣＤ２２標的化単一ＣＡＲ鎖とＩＣＯＳ共刺激ドメインと各ＣＤ３ζ活性化ドメインを含んでいた（図２１Ａ）。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトは、レンチウイルスベクターにコードされ、ヒト初代Ｔ細胞に形質導入された。ＤｕｏＣＡＲは、３つの異なるコンストラクトおよびドナーの間で３０％～７０％のＣＡＲ Ｔ＋細胞の範囲で、Ｔ細胞において堅固に発現された（図２２Ａ、２２Ｂ）。
加えて、単一標的化ＣＡＲおよびタンデム標的化ＣＡＲを含むいくつかの対照ＣＡＲコンストラクトを構築した（図２１Ａ）。単一標的化ＣＡＲは、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、または抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖのいずれか、続いてＣＤ３ｚ活性化ドメインに直接連結されるか（Ｄ９２、ＣＡＲ２２、第１世代）、または共刺激ドメインも組み込む（Ｄ８９、１５３８、１４９５、第２世代）かのいずれかのＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインを含んでいた、図２１Ａ。１４９７ ＣＡＲと呼ばれるＣＤ２０およびＣＤ１９を標的化するタンデム対照ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ｚ活性化ドメインにインフレームで連結されたタンデムＣＤ２０－ＣＤ１９ ｓｃＦｖで構成された。タンデム対照コンストラクトのＤ８８、Ｄ９０、Ｄ９１は、４－１ＢＢ共刺激ドメインの、それぞれ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、またはＣＤ２７ドメインによる置換を除いて、タンデムＣＡＲ １４９７として設計された（示さない）。これらのコンストラクトは、３つ全ての抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を発現する未改変腫瘍に対する抗腫瘍活性を示すが、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６とは対照的に、タンデムコンストラクトは、ＣＤ１９およびＣＤ２０に対して二重陰性の腫瘍細胞の抗原逃避を防ぐことができない。Ｔ細胞内のＣＡＲ鎖のポジショニングおよび組成を、図２１Ｂにおいて、ＤｕｏＣＡＲ、タンデムＣＡＲ、ならびに第１世代および第２世代の単一ＣＡＲ Ｔ細胞について模式的に示す。全ての単一およびタンデムＣＡＲコンストラクトは、レンチウイルス形質導入によって、ヒト初代Ｔ細胞において堅固な発現を達成した。
ＤｕｏＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、腫瘍標的を強力かつ特異的に溶解する
構築されたＤｕｏＣＡＲの機能性を評価するために、構築されたＤｕｏＣＡＲを、一晩死滅アッセイのために、ルシフェラーゼ発現標的腫瘍株と混合した。抗原陽性株のＮＨＬ株Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋）、およびＢ－ＡＬＬ株Ｒｅｈ（ＣＤ１９＋ＣＤ２０ｌｏｗＣＤ２２＋）を使用して、抗原特異的な様式で、腫瘍細胞を溶解するＤｕｏＣＡＲの能力を試験した。両方ともＣＤ１９－ＣＤ２０－ＣＤ２２－である陰性対照株の骨髄性白血病Ｋ５６２およびヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔも含めた（図２３）。
タンデムＣＡＲの１４９７、ならびに単一ＣＡＲ対照のＤ８９およびＤ９２、第２および第１世代のＣＤ２２標的化ＣＡＲは、それぞれ、比較のために含めた。
ＣＡＲ Ｔ細胞および標的細胞を、１０：１、５：１、または２．５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で混合し、インキュベーション期間の終了時に、特異的溶解を、材料および方法に記載されるように、各条件について算出した。
全ての単一およびタンデムＣＡＲは、Ｅ：Ｔ依存性の様式で、標的陽性腫瘍株のＲａｊｉおよびＲｅｈを溶解した（図２３Ａ、２３Ｂ）。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトは、全てのＥ：Ｔ比で、標的化抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を発現する標的細胞株を強力に溶解した（図２３Ａ、２３Ｂ）。ＣＤ１９およびＣＤ２０抗原を標的化するタンデム対照ＣＡＲ １４９７は、Ｒａｊｉ細胞におけるＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６と比較して、試験されたＥ：Ｔ比で、比較的中程度の腫瘍溶解をもたらした（図２３Ａ）。比較すると、Ｒｅｈ細胞において、１４９７の溶解効力は、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６の溶解効力と同様であった（図２３Ｂ）。単一標的化ＣＡＲ２２コンストラクトのＤ８９およびＤ９２は、ＣＤ２２抗原陽性標的株のＲａｊｉおよびＲｅｈに対して、最も強力な腫瘍細胞キラーである傾向であった。対照的に、最も高い１０のＥ：Ｔ比で２７％の非特異的溶解を生じるＫ５６２細胞における単一標的化ＣＡＲ２２コンストラクトのＤ９２を除いて（図２３Ｃ）、ＤｕｏＣＡＲコンストラクトまたは対照は、標的陰性腫瘍株のＫ５６２および２９３Ｔを溶解しなかった（図２３Ｃ、２３Ｄ）。したがって、ＤｕｏＣＡＲは、抗原陽性標的株の溶解において、１４９７タンデムコンストラクトと、同様に良好な性能であるか、またはそれよりも優れており、抗原陰性株においてバックグラウンドの溶解を生じず、抗原依存性を実証した。特に、Ｋ５６２細胞における単一ＣＡＲ ２２、Ｄ９２の非特異的溶解活性にもかかわらず、ＤｕｏＣＡＲコンストラクトのＤ１およびＤ２へのＤ９２配列の組み込みは、ＤｕｏＣＡＲによる非特異的標的溶解をもたらさない。したがって、ＤｕｏＣＡＲ設計は、第１世代のＣＡＲ Ｄ９２において見られる望ましくない自発的溶解活性を弱めると思われる（図２３Ｃ）。
ＤｕｏＣＡＲのサイトカイン応答
標的細胞に応答するＤｕｏＣＡＲのサイトカイン産生を特徴付けるために、上清を、一晩のインキュベーション後、ＤｕｏＣＡＲのＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋ Ｒａｊｉ標的細胞との共培養物から収集した。培養上清中のＴ細胞の炎症促進性および恒常性サイトカインであるＩＬ－２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した（図２４、青色のバー）。ＣＡＲ陰性対照として、同じドナーおよびバッチからの非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を含めた。さらに、作動させる標的細胞の非存在下でＣＡＲ Ｔ細胞による可能性がある自発的サイトカイン放出のための対照に、各ＣＡＲ Ｔ細胞群を、Ｒａｊｉ標的なしでもインキュベートした（図２４、薄灰色のバー）。ＤｕｏＣＡＲ、ならびに単一およびタンデム対照ＣＡＲは、ＵＴＤと比較して、標的Ｒａｊｉ細胞に応答して、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの産生を強く誘導したが、しかし、ＤｕｏＣＡＲ株またはＣＡＲ対照は、標的細胞の非存在下で、これらの可溶性因子の自発的放出の傾向はなかった（図２４）。
ＤｕｏＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２ Ｒａｊｉ腫瘍を効率的に溶解する
ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原陽性標的細胞に対するＤｕｏＣＡＲの細胞傷害性およびサイトカイン放出機能性を確立し、次いで、ＤｕｏＣＡＲ機能を、ｉｎ ｖｉｖｏで実証した。ホタルルシフェラーゼで安定に形質導入されたＲａｊｉ細胞のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス異種移植を利用した。ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６だけでなく、タンデム対照ＣＡＲの１４９７、ならびに単一対照のＤ８９およびＤ９２を含めた（図２５Ａ）。腫瘍保持マウスに、研究７日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞５００万個、またはそれぞれＣＡＴ Ｔ細胞２００万個、または用量を一致させたＵＴＤ対照のいずれかを投与し、腫瘍拒絶を、研究２８日目まで、定期的に生物発光イメージングによって測定した（図２５Ａおよび２５Ｂ）。マウス当たり５００万個の細胞の高ＣＡＲ Ｔ用量レジメンにおいて、ＤｕｏＣＡＲは、１４日目以降、Ｒａｊｉ腫瘍の進行を強力に抑制したが、腫瘍単独群（ＴＡ）、および非形質導入Ｔ細胞群（ＵＴＤ）における腫瘍は、衰えることなく進行した。ＴＡおよびＵＴＤ陰性対照と比較して、ＤｕｏＣＡＲならびに単一およびタンデムＣＡＲ対照によって媒介される腫瘍抑制は、統計学的に有意であった。ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、ならびに単一ＣＡＲのＤ８９およびＤ９２は、研究期間にわたって、最も高い腫瘍縮小を生じる傾向であったが、ＤｕｏＣＡＲのＤ９５、およびタンデムＣＡＲの１４９７は、ＣＡＲコンストラクトのなかで、最も効力が低い傾向であった。しかし、この投薬量レベルでの個々のＣＡＲコンストラクトの間の差は、統計学的に有意ではなかった（図２５Ａ）。ＤｕｏＣＡＲコンストラクト間の小さな相違をより良く指摘するため、およびそれらが低用量レジメンで機能し続けるかどうかを試験するために、Ｒａｊｉ保持マウスに、それぞれのＣＡＲ Ｔ細胞２００万個を投与した（図２５Ｂ）。低ＣＡＲ Ｔ用量にもかかわらず、全てのＣＡＲコンストラクトは、このレベルのＴＡおよびＵＴＤ対照と比較して、Ｒａｊｉ腫瘍量を有意に制御した。ＤｕｏＣＡＲコンストラクトまたは対照ＣＡＲは、他のＣＡＲよりも有意に良好ではなかったが、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３およびＤ９４は、良好な腫瘍制御を維持する傾向であり、ＤｕｏＣＡＲのＤ９６は、他のＣＡＲよりも効力が低い傾向であった（図２５Ｂ）。注目すべきは、タンデムＣＡＲ群の１４９７における腫瘍縮小は、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３～Ｄ９６と比較して、遅いと思われ、この状況において、ＤｕｏＣＡＲコンストラクトの可能性がある優位性を示唆した（図２５Ｂ）。加えて、単一ＣＡＲのＤ９２は、高い効力と一致して、他のＣＡＲコンストラクトよりも速く腫瘍量を低減する傾向であったが、抗原陽性および抗原陰性の腫瘍標的株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害実験において、このコンストラクトについてより低い特異性も観察された（図２３）。
三重特異性ＤｕｏＣＡＲは、抗腫瘍機能のために単一抗原のみを必要とし、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２のいずれかの腫瘍抗原喪失のモデルにおいて、抗原が消去された標的細胞を強力に死滅させる。
ＤｕｏＣＡＲがＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２２＋の強力な拒絶を媒介したことを実証したことで、ｉｎ ｖｉｖｏの野生型Ｒａｊｉ異種移植は、２００万個のＣＡＲ Ｔ＋細胞／マウスの低用量レジメンでさえ、ＤｕｏＣＡＲの活性化を引き起こす各単一抗原の十分性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検証された。この実験に含まれるＣＡＲコンストラクトを図２１Ａに模式的に示す。実験群は、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６、タンデムＣＡＲ対照の１４９７、ならびにそれぞれ、ＣＤ２２、ＣＤ１９およびＣＤ２０抗原を標的化する単一ＣＡＲ対照のＤ９２、１５３８、および１４９５を含んでいた（図２６）。
ＤｕｏＣＡＲは、論理的［ＯＲ］ゲートコンストラクトとして機能すると推定され、例えば、３つの標的化抗原のうちいずれか１つまたは複数の存在は、ＣＡＲ活性化および抗腫瘍機能を引き起こすために十分である。次いで、３つの反応性のそれぞれが、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９３、Ｄ９５、およびＤ９６において無傷であることを確認した。この目的で、Ｂ細胞表面分子を天然で欠いているＡ４３１扁平上皮癌株を、ＣＤ１９、またはＣＤ２０、またはＣＤ２２のいずれかを安定に発現するように操作した。腫瘍溶解の定量化を容易にするために、各標的Ａ４３１株は、ホタルルシフェラーゼも安定に発現した。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞および対照ＣＡＲを、１つの抗原のみを発現するＡ４３１クローンのそれぞれに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイにおいて試験し、親Ａ４３１の親株を、標的陰性の対照として含めた（図２６Ａ～２６Ｄ）。
ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９３、Ｄ９５、およびＤ９６は、ＣＤ１９（図２６Ａ）、ＣＤ２０（図２６Ｂ）、またはＣＤ２２（図２６Ｃ）の単一抗原のみをそれぞれ発現する腫瘍を効率的に溶解したが、これらの標的分子の発現を欠く親株Ａ４３１は溶解しなかった（図２６Ｄ）。同族抗原発現を有する標的細胞のＤｕｏＣＡＲによる腫瘍溶解は、エフェクター対標的比に依存し、ＤｕｏＣＡＲコンストラクトの詳細な特異性を実証した。予想通り、単一ＣＡＲは、そのクローンが標的化抗原の発現を欠く場合に、標的クローンを溶解できなかった。株Ａ１９は、単一ＣＡＲの１９、１５３８によって溶解されたが、単一ＣＡＲ標的化ＣＤ２２－Ｄ９２、または標的化ＣＤ２０を－１４９５によって溶解されなかった（図２６Ａ）。同様に、標的株Ａ２０は、ＣＡＲ２０ １４９５によって溶解されたが、単一ＣＡＲのＣＤ２２－Ｄ９２またはＣＤ１９ ＣＡＲ－１５３８によって溶解されなかった（図２６Ｂ）。さらに、それぞれ、ＣＤ１９およびＣＤ２０標的化ＣＡＲの１５３８および１４９５ではないが、ＣＤ２２標的化単一ＣＡＲのＤ９２およびＤ８９のみ、Ａ２２標的株を溶解した（図２６Ｃ）。この腫瘍株におけるＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２の発現の欠如と一致して、コンストラクトは親株Ａ４３１を溶解しなかった（図２６Ｄ）。したがって、ＤｕｏＣＡＲは、他の２つの抗原とは無関係に、単離された形態で、標的抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２のうちそれぞれ１つと反応性であった。さらに、単離物中の各単一抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２の存在は、ＤｕｏＣＡＲの機能を引き起こすのに十分であった。
次いで、腫瘍抗原逃避のモデルであるＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２のいずれかの消去された発現を有するＲａｊｉクローンにおいて、ＤｕｏＣＡＲは、３つの標的化分子のいずれか１つの欠如にもかかわらず、標的細胞を溶解することができ（図２６Ｅ～２６Ｇ）、溶解の大きさは、３つ全ての抗原の発現が無傷であった親Ｒａｊｉ株のＤｕｏＣＡＲ溶解と同等であった（図２６Ｈ）。対照的に、単一標的化ＣＡＲは、それらの毒族標的が存在したクローンに対してのみ溶解性であった。具体的には、単一ＣＡＲの２０および２２、Ｄ９２および１４９５は、単一ＣＡＲの１９、１５３８ではそうではないが、Ｒａｊｉ １９ＫＯを溶解し（図２６Ｅ）、単一ＣＡＲの１９およびＣＡＲ２２は、ＣＡＲ ２０はそうではないが、Ｒａｊｉ ２０ＫＯを溶解し（図２６Ｆ）、単一ＣＡＲの１９および２０は、ＣＡＲ２２はそうではないが、Ｒａｊｉ ２２ ＫＯ株を溶解した（図２６Ｇ）。比較すると、単一ＣＡＲ対照のＤ９２、１５３８、または１４９５は、３つ全ての標的抗原を発現する親Ｒａｊｉクローンの溶解においてどんな影響も示さなかった（図２６Ｈ）。これらの結果は、標的化抗原の１つの発現を欠く標的化腫瘍細胞におけるＤｕｏＣＡＲの優位性を実証する。
標的化抗原のうち１つまたは複数の発現が、減少または完全に消失する場合の腫瘍抗原逃避、および腫瘍の不均一性、一方で、単一薬剤／ＣＡＲは、標的化抗原の不均一な発現により、腫瘍細胞集団をその全体的に標的化することができず、ＣＡＲ Ｔ免疫療法の大きな障害のままである。それらの標的抗原の一部の発現を失った腫瘍と戦うＤｕｏＣＡＲの能力を実証するために、異種の異種移植腫瘍モデルを作製した（図２７）。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼ陽性の抗原欠失Ｒａｊｉクローン：Ｒａｊｉ １９ＫＯ、Ｒａｊｉ ２０ＫＯ、Ｒａｊｉ ２２ＫＯ、および親Ｒａｊｉクローンの等しい割合の混合物を移植した。腫瘍移植の７日後、マウスを、５００万個のＣＡＲ Ｔ＋ＤｕｏＣＡＲ細胞、またはＣＤ１９、ＣＤ２０、もしくはＣＤ２２を標的化する単一ＣＡＲ対照で処置した。腫瘍量を、生物発光によって測定した。際立って、研究の１４日目以降に始まって、ＤｕｏＣＡＲのＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、またはＤ９６は、異種Ｒａｊｉ腫瘍を完全に拒絶した。対照的に、単一標的化ＣＡＲのＣＡＲ１９－１５３８、ＣＡＲ２０－１４９５、またはＣＡＲ２２－Ｄ９２を受けているマウスにおいて、腫瘍は成長を続けた（図２７）。
要約すると、高機能的な三重標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の産生が可能な４つの新規なＤｕｏＣＡＲ設計のＤ９３、Ｄ９４、Ｄ９５、およびＤ９６が本明細書に記載される。ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞は、高特異性で、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２抗原に対して反応性であり、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２の異なる発現を有する散在性ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおける極めて強力な機能および完全な腫瘍拒絶を実証したが、単一標的化ＣＡＲは、腫瘍抗原逃避のこのモデルにおいて、腫瘍の進行を防ぐことができなかった。したがって、ＤｕｏＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原不均一な腫瘍集団に立ち向かい、腫瘍抗原逃避を軽減するための新規な解決手段を提示し、このようにして、ＣＡＲ Ｔ処置患者集団における臨床転帰を改善する機会を提供する。
配列表に対する言及
本出願は、「配列表」というタイトルのＰＤＦファイルにより、米国特許商標庁受理官庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表は参照により組み込まれる。
本開示の配列
以下に列挙する核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で規定されるように、ヌクレオチド塩基用の標準的な略語、およびアミノ酸用の３文字コードを使用して示される。各核酸配列のうち一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示される鎖を参照することによって含まれるものと理解される。添付の配列表では：
配列番号１は、ＣＤ２０反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１４９５）のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAA
配列番号２は、ＣＤ２０反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１４９５）のアミノ酸配列である。
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK
配列番号３は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９５（ＬＰ－１４９５－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９５（ＬＰ－１４９５－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５は、リーダー／シグナルペプチド配列のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCG
配列番号６は、リーダー／シグナルペプチド配列のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号７は、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ２２００）のヌクレオチド配列である。
CAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCA
配列番号８は、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ２２００）のアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAA
配列番号９は、ＣＡＲ ＬＴＧ２２００（ＬＰ－２２００－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号１０は、ＣＡＲ ＬＴＧ２２００（ＬＰ－２２００－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１は、ＤＮＡ ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である。
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
配列番号１２は、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号１３は、ＤＮＡ ＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列である。
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTAC
配列番号１４は、ＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列である。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
配列番号１５は、アミノ酸番号１３７～２０６のヒンジおよびＣＤ８アルファの膜貫通領域のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ－００１７５９．３）である。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号１６は、ヒトＩｇＧ ＣＬ配列のアミノ酸配列である。
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号１７は、４－１ＢＢのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である。
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
配列番号１８は、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号１９は、ＣＤ３－ゼータのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
配列番号２０は、ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列である。
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２１は、ＣＡＲ ＬＴＧ１５６２（ＬＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンカー－ＣＤ４ｔｍ－４－１ＢＢ－ＣＤ３－ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGATATTCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCGAGCCTGGGCGATCGCGTGACCATTAGCTGCCGCGCGAGCCAGGATATTAGCAAATATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGATGGCACCGTGAAACTGCTGATTTATCATACCAGCCGCCTGCATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAACCTGGAACAGGAAGATATTGCGACCTATTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCGTATACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTACCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCGGATTATGGCGTGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCGCGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCAGCGAAACCACCTATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGACCATTATTAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGACCGATGATACCGCGATTTATTATTGCGCGAAACATTATTATTATGGCGGCAGCTATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGTGCAGCCGATGGCGCTGATTGTGCTGGGCGGCGTGGCGGGCCTGCTGCTGTTTATTGGCCTGGGCATTTTTTTTTGCGTGCGCTGCCGCCCGCGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCGCTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC
配列番号２２は、ＣＡＲ ＬＴＧ１５６２（ＬＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２３は、ＣＤ２０＿１９反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１４９７二重特異性バインダー）のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCA
配列番号２４は、ＣＤ２０＿１９反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１４９７二重特異性バインダー）のアミノ酸配列である。
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA
配列番号２５は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９７（ＬＰ－ＬＴＧ１４９７－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ－ＣＤ２０ ＶＨ－（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２６は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９７（ＬＰ－ＬＴＧ１４９７－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ－ＣＤ２０ ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２７は、ＣＤ１９に対するＳｃＦＶのヌクレオチド配列である。
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
配列番号２８は、ＣＤ１９に対するｓｃＦＶのアミノ酸配列である。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号２９は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９４（ＬＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACACTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCTCCACGAGCGGCTCCGGGAAGCCTGGTTCCGGGGAAGGCTCCACTAAGGGTGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACATCCGTGACAGTCAGCTCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３０は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９４（ＬＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDTDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３１は、ＣＡＲ ＬＴＧ１５３８（ＬＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－シグナル（ＬＴＩ再操作ＣＤ１９ ＣＡＲ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGCACTTCGGTGACTGTGTCAAGCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３２は、ＣＡＲ ＬＴＧ１５３８（ＬＰ－ＣＤ１９バインダー－ＣＤ８リンク－ＣＤ８ｔｍ－シグナル（ＬＴＩ再操作ＣＤ１９ ＣＡＲ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３３は、ＣＤ１９＿２０反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１４９６）のヌクレオチド配列である。
GACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCA
配列番号３４は、ＣＤ１９＿２０反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１４９６）のアミノ酸配列である。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAA
配列番号３５は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９６（ＬＰ－ＬＴＧ１４９６－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ－ＣＤ１９ ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）５ ＣＤ２０ ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ ＶＬ ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３６は、ＣＡＲ ＬＴＧ１４９６（ＬＰ－ＬＴＧ１４９６－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ－ＣＤ１９ ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ ＶＨ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ２０ ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ ＶＬ－ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３７は、メソセリン反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１９０４）のヌクレオチド配列である。
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGT
配列番号３８は、メソセリン反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１９０４）のアミノ酸配列である。
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLG
配列番号３９は、ＣＡＲ ＬＴＧ１９０４（ＬＰ－１９０４－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４０は、ＣＡＲ ＬＴＧ１９０４（ＬＰ－１９０４－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４１は、ＣＤ３３反応性単鎖結合性ドメインＶＨ－４（ＬＴＧ１９０６）のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号４２は、ＣＤ３３反応性単鎖結合性ドメインＶＨ－４（ＬＴＧ１９０６）のアミノ酸配列である。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSS
配列番号４３は、ＣＡＲ ＬＴＧ１９０６（ＬＰ－ＶＨ４－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４４は、ＣＡＲ ＬＴＧ１９０６（ＬＰ－ＶＨ４－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４５は、ＴＳＬＰＲ反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１７８９）のヌクレオチド配列である。
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGATCTGGGTCCGGTACTGACTACAGCCTCACCATTAGAAACCTTGAACAGGAGGACATCGCAACTTATTTCTGCCAACAGGTCTATACTCTGCCGTGGACCTTCGGCGGAGGTACCAAACTGGAGATTAAGTCCGG
配列番号４６は、ＴＳＬＰＲ反応性ｓｃＦｖ結合性ドメイン（ＬＴＧ１７８９）のアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKS
配列番号４７は、ＣＡＲ ＬＴＧ１７８９（ＬＰ－３Ｇ１１－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４８は、ＣＡＲ ＬＴＧ１７８９（ＬＰ－３Ｇ１１－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４９は、ＣＡＲ ＬＴＧ１５６３（ＬＰ－ＣＤ１９－ＴＮＦＲＳＦ１９ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTCACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTCCCTCACCCCGCCTTTCTGCTTATCCCGGACATTCAGATGACACAGACCACCTCGAGCTTGTCCGCGTCGCTGGGCGATCGCGTGACCATCTCCTGCCGGGCCTCCCAAGACATTTCAAAGTATCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCGGACGGAACCGTGAAACTGCTGATCTACCATACCAGCCGCCTGCACTCCGGCGTGCCGTCCCGCTTCTCCGGATCGGGTTCCGGAACTGACTACTCACTGACTATCTCCAACTTGGAACAAGAGGACATCGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAATACCCTTCCCTACACCTTCGGGGGGGGTACCAAGCTGGAGATCACTGGGGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGGAGCGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCAGGACTCGTGGCGCCATCCCAGTCCCTGTCGGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTCCCCGATTACGGAGTGTCATGGATTAGGCAACCCCCAAGAAAAGGGCTGGAATGGCTCGGAGTGATCTGGGGCTCCGAAACCACCTACTACAACTCGGCGCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTGTTCTTGAAGATGAACAGCTTGCAGACCGACGATACCGCAATCTACTACTGTGCCAAGCACTATTACTACGGGGGGTCTTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACCTCCGTGACTGTGTCGTCCGCGGCCGCGCCCGCCCCTCGGCCCCCGACTCCTGCCCCGACGATCGCTTCCCAACCTCTCTCGCTGCGCCCGGAAGCATGCCGGCCCGCCGCCGGTGGCGCTGTCCACACTCGCGGACTGGACTTTGATACCGCACTGGCGGCCGTGATCTGTAGCGCCCTGGCCACCGTGCTGCTGGCGCTGCTCATCCTTTGCGTGATCTACTGCAAGCGGCAGCCTAGGCGAAAGAAGCTCCTCTACATTTTCAAGCAACCCTTCATGCGCCCCGTGCAAACCACCCAGGAGGAGGATGGATGCTCATGCCGGTTCCCTGAGGAAGAAGAGGGCGGTTGCGAGCTCAGAGTGAAATTCAGCCGGTCGGCTGACGCCCCGGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGGCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGATCCGGAAATGGGCGGAAAGCCAAGGCGGAAGAACCCGCAGGAAGGTCTTTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATTGGGATGAAGGGAGAAAGACGGAGGGGAAAGGGACATGACGGACTTTACCAGGGCCTGAGCACTGCCACGAAGGACACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCGCTGCCGCCTCGG
配列番号５０は、ＣＡＲ ＬＴＧ１５６３（ＬＰ－ＣＤ１９－ＴＮＦＲＳＦ１９ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFDTALAAVICSALATVLLALLILCVIYCKRQPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５１は、ＣＡＲ ＬＴＧ２２２８（ＬＰ－ＣＤ２０＿ＣＤ１９－ＣＤ８ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号５２は、ＣＡＲ ＬＴＧ２２２８（ＬＰ－ＣＤ２０＿ＣＤ１９－ＣＤ８ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５３は、Ｄ００４３のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGCTTCTATTAGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号５４は、Ｄ００４３のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５５は、Ｄ００４４のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号５６は、Ｄ００４４のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５９は、Ｄ００４６のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGCAAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTGAGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGACGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAGTAGACATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCGGAAGTCCAGCTCCAGCAAAGCGGAGCCGAACTCGTGAAGCCGGGGGCCTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCATCCGGCTACACCTTCACTAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACTCCGGGTCAAGGGCTGGAGTGGATTGGGGCGATCTACCCGGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAAAAGTTCAAGGGGAAGGCTACTCTTACGGCGGACAAGTCGTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCGGCGGACTACTACTGCGCCCGGAGCAACTACTACGGTTCCTCCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGTGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGATCAGGCGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCCGCAATCCTTTCGGCCTCCCCCGGAGAGAAGGTCACGATGACTTGCAGGGCTTCGTCCTCCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCCGGGTCGTCGCCTAAGCCGTGGATCTACGCTACCTCAAACCTGGCTTCCGGCGTCCCTGCGCGGTTCAGCGGCTCGGGGAGCGGTACCTCATACTCACTCACCATCTCCCGGGTGGAGGCCGAAGATGCGGCCACCTATTATTGCCAACAGTGGTCCTTCAATCCGCCCACCTTCGGGGGGGGAACCAAGCTCGAGATCAAGGGGGGTGGCGGCTCAGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGTGGCTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGGTCCGATATCCAAATGACCCAGACTACTAGCTCGTTGAGCGCCTCGCTCGGCGACAGAGTGACCATTAGCTGCAGGGCATCCCAGGACATTTCAAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGAACTGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACTCCGGAGTCCCGTCGAGATTTTCCGGCTCCGGAAGCGGAACCGATTATTCGCTCACCATTTCTAACCTGGAACAGGAGGACATTGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAACACTCTGCCTTACACCTTTGGTGGCGGAACCAAGTTGGAAATTACCGGCTCCACCTCCGGATCCGGAAAGCCTGGATCCGGAGAGGGATCAACCAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGGCCCGGCCTTGTCGCCCCGAGCCAGTCCTTGTCCGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTGCCGGACTACGGGGTGTCCTGGATCCGCCAGCCGCCTCGCAAGGGCCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGGGATCCGAAACGACTTACTACAACTCGGCCCTCAAGTCGAGGCTCACTATTATCAAGGACAACTCGAAGTCCCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCGCTGCAAACCGACGACACAGCGATCTACTACTGTGCAAAGCATTACTACTACGGAGGCAGCTACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACTGTCTCTAGCGCTAGCGCGACCACTACGCCCGCCCCCCGCCCACCTACCCCCGCCCCGACCATTGCGAGCCAACCGTTGTCACTCCGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCTGGAACCTGTGGAGTCCTGCTGCTCTCCCTCGTGATCACTCTGTACTGCCGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCCCGGGTCAAGTTTTCCCGGTCTGCCGACGCTCCGGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAATCTGGGTCGGAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCAGAAATGGGAGGAAAGCCTCGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGCGCAGAGGGAAGGGACATGACGGCCTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCGACTAAGGACACCTACGATGCCCTTCATATGCAAGCACTCCCTCCGCGC
配列番号６０は、Ｄ００４６のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRVDMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６１は、Ｄ００４７のヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGCAAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTGAGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGACGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAGTAGACATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCGGAAGTCCAGCTCCAGCAAAGCGGAGCCGAACTCGTGAAGCCGGGGGCCTCCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCATCCGGCTACACCTTCACTAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACTCCGGGTCAAGGGCTGGAGTGGATTGGGGCGATCTACCCGGGCAACGGCGACACCTCCTACAACCAAAAGTTCAAGGGGAAGGCTACTCTTACGGCGGACAAGTCGTCCAGCACCGCATACATGCAACTCTCCTCCCTGACCTCCGAGGACTCGGCGGACTACTACTGCGCCCGGAGCAACTACTACGGTTCCTCCTACTGGTTCTTCGACGTGTGGGGTGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGATCAGGCGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCCGCAATCCTTTCGGCCTCCCCCGGAGAGAAGGTCACGATGACTTGCAGGGCTTCGTCCTCCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCCGGGTCGTCGCCTAAGCCGTGGATCTACGCTACCTCAAACCTGGCTTCCGGCGTCCCTGCGCGGTTCAGCGGCTCGGGGAGCGGTACCTCATACTCACTCACCATCTCCCGGGTGGAGGCCGAAGATGCGGCCACCTATTATTGCCAACAGTGGTCCTTCAATCCGCCCACCTTCGGGGGGGGAACCAAGCTCGAGATCAAGGGGGGTGGCGGCTCAGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGTGGCTCGGGCGGCGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGGTCCGATATCCAAATGACCCAGACTACTAGCTCGTTGAGCGCCTCGCTCGGCGACAGAGTGACCATTAGCTGCAGGGCATCCCAGGACATTTCAAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGAACTGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACTCCGGAGTCCCGTCGAGATTTTCCGGCTCCGGAAGCGGAACCGATTATTCGCTCACCATTTCTAACCTGGAACAGGAGGACATTGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAACACTCTGCCTTACACCTTTGGTGGCGGAACCAAGTTGGAAATTACCGGCTCCACCTCCGGATCCGGAAAGCCTGGATCCGGAGAGGGATCAACCAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGGCCCGGCCTTGTCGCCCCGAGCCAGTCCTTGTCCGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTGCCGGACTACGGGGTGTCCTGGATCCGCCAGCCGCCTCGCAAGGGCCTGGAGTGGCTCGGCGTGATCTGGGGATCCGAAACGACTTACTACAACTCGGCCCTCAAGTCGAGGCTCACTATTATCAAGGACAACTCGAAGTCCCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCGCTGCAAACCGACGACACAGCGATCTACTACTGTGCAAAGCATTACTACTACGGAGGCAGCTACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACTGTCTCTAGCGCTAGCGCGACCACTACGCCCGCCCCCCGCCCACCTACCCCCGCCCCGACCATTGCGAGCCAACCGTTGTCACTCCGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCCGGGGACTGGACTTCGCATGCGACATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCTGGAACCTGTGGAGTCCTGCTGCTCTCCCTCGTGATCACTCTGTACTGCCGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCCCGGGTCAAGTTTTCCCGGTCTGCCGACGCTCCGGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAATCTGGGTCGGAGAGAAGAGTACGATGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCAGAAATGGGAGGAAAGCCTCGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGACTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGCGCAGAGGGAAGGGACATGACGGCCTGTACCAGGGTCTGAGCACCGCGACTAAGGACACCTACGATGCCCTTCATATGCAAGCACTCCCTCCGCGC
配列番号６２は、Ｄ００４７のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRVDMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６５は、Ｄ０００１のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTTCAACAGAGTGGGCCGGGACTGGTGAAACACTCCCAAACACTTTCTCTGACGTGCGCTATATCAGGTGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCTGCGTGGAACTGGATTCGACAATCTCCCAGTCGCGGGTTGGAATGGCTGGGACGAACATATTATCGGTCTAAGTGGTATAACGATTATGCTGTATCTGTTAAATCTCGAATTACGATTAATCCTGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTCCAGTTGAACTCAGTCACACCGGAAGACACTGCGGTCTACTATTGCGCTCAAGAAGTCGAGCCACATGATGCATTCGACATCTGGGGCCAGGGAACGATGGTCACCGTCAGCAGTGGCGGCGGCGGATCTGGGGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGAGGATCAGACATACAAATGACGCAGAGTCCCTCAAGTGTGTACGCGAGTGTGGGGGATAAGGTAACTATTACGTGCAGAGCGTCACAGGATGTTAGTGGATGGCTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCTTGCTCCACAGCTCCTTATCAGTGGTGCTTCTACACTTCAGGGCGAGGTTCCGAGTAGATTCTCTGGTTCTGGATCTGGTACTGACTTCACTCTTACAATTTCTTCTTTGCAACCAGAAGACTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGGCCAAATACTTCCCTTATACATTTGGCCAAGGTACCAAGTTGGAGATAAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号６６は、Ｄ０００１のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKHSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPHDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVYASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLISGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６７は、Ｄ０００２のヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号６８は、Ｄ０００２のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号６９は、Ｄ０００３のヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCCATTAGCGGGAACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTTGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAGGTGCCATCACGCTTCTCCGGAGGTGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGACAAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号７０は、Ｄ０００３のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGNSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７３は、ＬＴＧ２２７３のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号７４は、ＬＴＧ２２７３のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７５は、ＬＴＧ２２００のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号７６は、ＬＴＧ２２００のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７７は、ＧＭＣＳＦリーダーペプチドのヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCC
配列番号７８は、ＧＭＣＳＦリーダーペプチドのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号７９は、ＣＤ８ａリーダーペプチドのヌクレオチド配列である。
ATGGCCCTGCCCGTCACTGCGCTGCTTCTTCCACTTGCGCTTCTGCTGCACGCAGCGCGCCCG
配列番号８０は、ＣＤ８ａＦリーダーペプチドのアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARP
配列番号８１は、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である。
GCGGCCGCTACCACAACCCCTGCGCCCCGGCCTCCTACCCCCGCACCCACGATTGCTTCTCAACCTCTTTCACTCCGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCAGCCGGGGGTGCCGTCCACACACGGGGACTCGACTTCGCTTGTGATATATATATTTGGGCGCCCCTGGCCGGCACTTGTGGAGTTCTTTTGCTCTCTCTTGTTATCACATTGTACTGC
配列番号８２は、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
AAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号８３は、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメインのヌクレオチド配列である。
AAGCGAGGTAGGAAGAAATTGCTTTACATTTTTAAGCAGCCGTTCATGCGACCAGTACAGACTACTCAAGAAGAAGATGGGTGCTCTTGTCGGTTCCCGGAAGAAGAAGAGGGTGGTTGCGAGTTG
配列番号８４は、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメインのアミノ酸配列である。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号８５は、ＣＤ２８共刺激ドメインのヌクレオチド配列である。
CGGTCGAAGCGCTCAAGACTGCTGCACTCAGACTACATGAACATGACTCCTCGGCGGCCGGGGCCGACTCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCACCCCCGAGAGATTTCGCGGCCTACCGCTCC
配列番号８６は、ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列である。
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号８７は、ＣＤ３ゼータのヌクレオチド配列である。
AGGGTGAAGTTCTCCCGCTCTGCCGACGCACCGGCATATCAGCAGGGACAAAACCAGCTCTACAACGAATTGAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTCGATAAGCGGCGGGGTCGCGACCCAGAAATGGGAGGCAAACCGCGCAGGAAAAATCCACAGGAGGGACTTTATAACGAACTTCAAAAGGATAAGATGGCAGAGGCATACAGCGAAATCGGGATGAAAGGCGAGAGAAGAAGGGGGAAAGGGCACGATGGTCTTTACCAGGGGCTTTCTACCGCGACGAAGGATACCTACGATGCTCTCCATATGCAAGCACTTCCTCCTAGA
配列番号８８は、ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列である。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号８９は、フューリンＰ２Ａフューリン（Ｆｕｒｉｎ Ｐ２Ａ ｆｕｒｉｎ）のヌクレオチド配列である。
CGGGCAAAGCGGGGCTCAGGGGCGACTAACTTTTCACTGTTGAAGCAGGCCGGGGATGTGGAGGAGAATCCTGGTCCTAGAGCTAAGCGAG
配列番号９０は、フューリンＰ２Ａフューリン（Ｆｕｒｉｎ Ｐ２Ａ ｆｕｒｉｎ）のアミノ酸配列である。
RAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKR
配列番号９５は、１６Ｐ１７ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＨのヌクレオチド配列である。
CAGGTACAGCTTCAACAGAGTGGGCCGGGACTGGTGAAACACTCCCAAACACTTTCTCTGACGTGCGCTATATCAGGTGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCTGCGTGGAACTGGATTCGACAATCTCCCAGTCGCGGGTTGGAATGGCTGGGACGAACATATTATCGGTCTAAGTGGTATAACGATTATGCTGTATCTGTTAAATCTCGAATTACGATTAATCCTGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTCCAGTTGAACTCAGTCACACCGGAAGACACTGCGGTCTACTATTGCGCTCAAGAAGTCGAGCCACATGATGCATTCGACATCTGGGGCCAGGGAACGATGGTCACCGTCAGCAGT
配列番号９６は、１６Ｐ１７ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＨのアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKHSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPHDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号９７は、１６Ｐ１７ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＬのヌクレオチド配列である。
GACATACAAATGACGCAGAGTCCCTCAAGTGTGTACGCGAGTGTGGGGGATAAGGTAACTATTACGTGCAGAGCGTCACAGGATGTTAGTGGATGGCTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCTTGCTCCACAGCTCCTTATCAGTGGTGCTTCTACACTTCAGGGCGAGGTTCCGAGTAGATTCTCTGGTTCTGGATCTGGTACTGACTTCACTCTTACAATTTCTTCTTTGCAACCAGAAGACTTTGCGACTTATTACTGCCAACAGGCCAAATACTTCCCTTATACATTTGGCCAAGGTACCAAGTTGGAGATAAAG
配列番号９８は、１６Ｐ１７ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＬのアミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSVYASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLISGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIK
配列番号９９は、１６Ｐ８ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＨのヌクレオチド配列である。
CAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCC
配列番号１００は、１６Ｐ８ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＨのアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号１０１は、１６Ｐ８ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＬのヌクレオチド配列である。
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAG
配列番号１０２は、１６Ｐ８ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＬのアミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIK
配列番号１０３は、１６Ｐ１３ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＨのヌクレオチド配列である。
CAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCCATTAGCGGGAACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGTCCCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCC
配列番号１０４は、１６Ｐ１３ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＨのアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGNSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号１０５は、１６Ｐ１３ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＬのヌクレオチド配列である。
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTTGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAGGTGCCATCACGCTTCTCCGGAGGTGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGACAAGGCACTAAGCTGGAAATCAAG
配列番号１０６は、１６Ｐ１３ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ ＶＬのアミノ酸配列である。
DIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGQGTKLEIK
配列番号１０７は、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーのアミノ酸配列である。
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
配列番号１０８は、可動性鎖間リンカーのアミノ酸配列である。
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号１０９は、ＬＴＧ ２９４８ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９３ ＣＡＲ２０１９ ＩＣＯＺｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTGAAGTTTAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTAAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号１１０は、ＬＴＧ ２９４８ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９３ ＣＡＲ２０１９ ＩＣＯＺｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１１は、ＬＴＧ ２９４９ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９４ ＣＡＲ２０１９ ＯＸ４０ｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCAGCACCGAGACCGCCAACCCCCGCGCCTACCATCGCAAGTCAACCACTTTCTCTCAGGCCTGAAGCGTGCCGACCTGCAGCTGGTGGGGCAGTACATACCAGGGGTTTGGACTTCGCATGTGACGTGGCGGCAATTCTCGGCCTGGGACTTGTCCTTGGTCTGCTTGGTCCGCTCGCAATACTTCTGGCCTTGTACCTGCTCCGCAGAGACCAAAGACTTCCGCCCGACGCCCACAAGCCCCCAGGAGGAGGTTCCTTCAGAACGCCTATACAAGAAGAACAAGCAGATGCCCACTCTACCCTGGCTAAAATCAGGGTGAAGTTTAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTAAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号１１２は、ＬＴＧ ２９４９ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９４ ＣＡＲ２０１９ ＯＸ４０ｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１３は、ＬＴＧ ２９５０ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９５ ＣＡＲ２０１９ ＯＸ４０ｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ ＩＣＯＳｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCAGCACCGAGACCGCCAACCCCCGCGCCTACCATCGCAAGTCAACCACTTTCTCTCAGGCCTGAAGCGTGCCGACCTGCAGCTGGTGGGGCAGTACATACCAGGGGTTTGGACTTCGCATGTGACGTGGCGGCAATTCTCGGCCTGGGACTTGTCCTTGGTCTGCTTGGTCCGCTCGCAATACTTCTGGCCTTGTACCTGCTCCGCAGAGACCAAAGACTTCCGCCCGACGCCCACAAGCCCCCAGGAGGAGGTTCCTTCAGAACGCCTATACAAGAAGAACAAGCAGATGCCCACTCTACCCTGGCTAAAATCAGGGTGAAGTTTAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号１１４は、ＬＴＧ ２９５０ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９５ ＣＡＲ２０１９ ＯＸ４０ｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ ＩＣＯＳｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１５は、ＬＴＧ ２９５１ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９６ ＣＡＲ２０１９ ２７ｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ ＩＣＯＳｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCAACGGCGCAAATACCGCTCCAATAAAGGCGAAAGTCCGGTAGAACCCGCAGAACCTTGCCACTACAGTTGTCCCAGAGAAGAAGAGGGTTCTACAATACCTATTCAAGAGGACTATAGGAAACCAGAGCCCGCATGTAGTCCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGGCGCGCGAAACGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGGAATATTATGGCTCTGCCTGTTACGGCACTGCTCCTTCCGCTTGCATTGTTGTTGCACGCAGCGCGGCCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCTAGCGCAACCACTACGCCTGCTCCGCGGCCTCCAACGCCCGCGCCCACGATAGCTAGTCAGCCGTTGTCTCTCCGACCAGAGGCGTGTAGACCGGCCGCTGGCGGAGCCGTACATACTCGCGGACTCGACTTCGCTTGCGACATCTACATTTGGGCACCCTTGGCTGGGACCTGTGGGGTGCTGTTGCTGTCCTTGGTTATTACGTTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTCAAATTTTCCAGGTCCGCAGATGCCCCCGCGTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTTTACAACGAACTGAACCTGGGTCGCCGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGAAGGGGGAGGGACCCTGAGATGGGAGGGAAACCTCGCAGGAAAAACCCGCAGGAAGGTTTGTACAACGAGTTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACTCTGAAATAGGGATGAAGGGAGAGAGACGGAGAGGAAAAGGCCATGATGGCCTTTACCAGGGCTTGAGCACAGCAACAAAGGATACTTACGACGCTCTTCACATGCAAGCTCTGCCACCACGG
配列番号１１６は、ＬＴＧ ２９５１ ＤｕｏＣＡＲ Ｄ９６ ＣＡＲ２０１９ ２７ｚ ２Ａ ＣＡＲ２２ ＩＣＯＳｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKRNIMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKASATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１７は、Ｄ０８８ ＣＡＲ２０１９ ＩＣＯＳｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号１１８は、Ｄ０８８ ＣＡＲ２０１９ ＩＣＯＳｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１９は、Ｄ０８９ ＣＡＲ２２ ＩＣＯＳｚのヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCTGGCTGACAAAAAAGAAGTATTCATCTAGTGTACATGATCCGAACGGTGAATACATGTTCATGCGCGCGGTGAACACGGCCAAGAAGAGCAGACTGACCGACGTAACCCTTAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号１２０は、Ｄ０８９ ＣＡＲ２２ ＩＣＯＳｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１２１は、Ｄ０９０ ＣＡＲ２０１９ ＯＸ４０ｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACGACCACTCCAGCACCGAGACCGCCAACCCCCGCGCCTACCATCGCAAGTCAACCACTTTCTCTCAGGCCTGAAGCGTGCCGACCTGCAGCTGGTGGGGCAGTACATACCAGGGGTTTGGACTTCGCATGTGACGTGGCGGCAATTCTCGGCCTGGGACTTGTCCTTGGTCTGCTTGGTCCGCTCGCAATACTTCTGGCCTTGTACCTGCTCCGCAGAGACCAAAGACTTCCGCCCGACGCCCACAAGCCCCCAGGAGGAGGTTCCTTCAGAACGCCTATACAAGAAGAACAAGCAGATGCCCACTCTACCCTGGCTAAAATCAGGGTGAAGTTTAGCCGGTCAGCTGATGCACCTGCATATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAATGAGCTGAACCTCGGACGAAGAGAGGAGTACGACGTGTTGGACAAAAGACGAGGTAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCGAGAAGAAAAAACCCACAAGAAGGGCTTTATAATGAGCTTCAGAAAGATAAGATGGCAGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAGGGCGAAAGAAGGAGGGGCAAAGGACACGACGGTCTCTACCAAGGCCTCAGCACGGCTACCAAAGATACGTATGACGCATTGCATATGCAGGCATTGCCGCCCCGC
配列番号１２２は、Ｄ０９０ ＣＡＲ２０１９ ＯＸ４０ｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１２３は、Ｄ０９１ ＣＡＲ２０１９ ＣＤ２７ｚのヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCAACGGCGCAAATACCGCTCCAATAAAGGCGAAAGTCCGGTAGAACCCGCAGAACCTTGCCACTACAGTTGTCCCAGAGAAGAAGAGGGTTCTACAATACCTATTCAAGAGGACTATAGGAAACCAGAGCCCGCATGTAGTCCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号１２４は、Ｄ０９１ ＣＡＲ２０１９ ＣＤ２７ｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１２５は、Ｄ９２ ＣＡＲ２２ｚのヌクレオチド配列である。
ATGTTGCTGCTCGTGACCTCGCTCCTTCTGTGCGAGCTGCCCCATCCGGCTTTTCTGCTCATCCCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGTCCTGGACTGGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGAGCCTGACTTGCGCAATTAGCGGGGACTCAGTCTCGTCCAATTCGGCGGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTCACCATCAAGGGGCCTGGAATGGCTCGGGCGCACTTACTACCGGTCCAAATGGTATACCGACTACGCCGTGTCCGTGAAGAATCGGATCACCATTAACCCCGACACCTCGAAGAACCAGTTCTCACTCCAACTGAACAGCGTGACCCCCGAGGATACCGCGGTGTACTACTGCGCACAAGAAGTGGAACCGCAGGACGCCTTCGACATTTGGGGACAGGGAACGATGGTCACAGTGTCGTCCGGTGGAGGAGGTTCCGGAGGCGGTGGATCTGGAGGCGGAGGTTCGGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCGGTGTCCGCATCCGTGGGCGATAAGGTCACCATTACCTGTAGAGCGTCCCAGGACGTGTCCGGATGGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCTTGGCTCCTCAACTGCTGATCTTCGGCGCCAGCACTCTTCAGGGGGAAGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCCGGTTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAACAGGCCAAGTACTTCCCCTATACCTTCGGAAGAGGCACTAAGCTGGAAATCAAGGCGGCCGCAACCACTACACCAGCTCCGCGGCCACCCACCCCAGCACCAACAATAGCCAGTCAGCCTTTGTCTCTGAGACCTGAGGCTTGTCGACCCGCTGCAGGTGGGGCAGTTCATACTCGGGGTCTTGATTTCGCCTGCGATATATATATTTGGGCCCCCCTGGCGGGCACGTGTGGGGTGCTCCTTCTTTCACTCGTAATTACTCTTTACTGTAGGGTTAAGTTCTCACGATCCGCCGATGCGCCAGCATACCAACAGGGACAGAACCAACTTTATAATGAGCTGAATCTTGGTCGCAGGGAAGAATATGATGTACTTGATAAACGCAGAGGCCGGGATCCCGAGATGGGAGGGAAACCTCGGAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAATGAATTGCAAAAAGATAAAATGGCTGAAGCTTATTCAGAGATTGGAATGAAAGGCGAGCGGAGAAGAGGAAAAGGGCACGACGGGCTTTACCAAGGACTGTCCACCGCGACAAAGGACACGTACGACGCCCTTCATATGCAGGCGCTTCCTCCACGA
配列番号１２６は、Ｄ９２ ＣＡＲ２２ｚのアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYTDYAVSVKNRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAQEVEPQDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQDVSGWLAWYQQKPGLAPQLLIFGASTLQGEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKYFPYTFGRGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Claims (30)

  1. １つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するための組成物であって、
    前記組成物は、少なくとも１つのマルチシストロン性ベクターをコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を含み、各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの機能的ＣＡＲをコードし、前記マルチシストロン性ベクターのうち少なくとも１つにおける少なくとも１つの結合性ドメインが、同一ではなく、それによって、マルチシストロン性ベクターの組合せが、２つ以上の同一ではない機能的ＣＡＲ分子の発現をもたらし、各機能的ＣＡＲ分子が、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結された少なくとも１つの結合性ドメインをコードする、組成物。
  2. １つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するための組成物であって、
    （ａ）前記組成物は、少なくとも１つのマルチシストロン性ベクターであって、各マルチシストロン性ベクターが、細胞において機能的である核酸配列を含む、マルチシストロン性ベクターを含み；
    （ｂ）各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む機能的ＣＡＲ分子をコードし；
    （ｃ）各機能的ＣＡＲ分子が、少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；
    （ｄ）前記機能的ＣＡＲ分子のうち１つにおける前記少なくとも１つの結合性ドメインが、同一ではなく；
    （ｅ）前記少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記機能的ＣＡＲ分子において共有結合的に連結されている、
    組成物。
  3. １つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するための組成物であって、
    （ａ）前記組成物は、少なくとも１つのマルチシストロン性ベクターであって、各マルチシストロン性ベクターが、細胞において機能的である核酸配列を含む、マルチシストロン性ベクターを含み；
    （ｂ）各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む１つまたは複数の機能的ＣＡＲをコードし；
    （ｃ）各機能的ＣＡＲ分子が、少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；
    （ｄ）各ＣＡＲにおける前記少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）が、別の機能的ＣＡＲ分子における少なくとも１つの結合性ドメインと同一ではなく；
    （ｅ）前記少なくとも１つのシグナル伝達モチーフが、マルチシストロン的に共発現された前記機能的ＣＡＲ分子それぞれの間で同一ではなく；
    （ｆ）前記少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されている、
    組成物。
  4. 各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む１つよりも多い機能的ＣＡＲをコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記リンパ球集団（複数可）が、自家Ｔ細胞、または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記機能的ＣＡＲ分子の少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記機能的ＣＡＲ分子の少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記機能的ＣＡＲ分子の少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、前記ＣＡＲの前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって前記膜貫通ドメインに接続されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記機能的ＣＡＲ分子の細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーペプチドが先行する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ） ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９） ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳｏ－１ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記機能的ＣＡＲ分子のリンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、前記膜貫通ドメインに連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記機能的ＣＡＲ分子が、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 単一のウイルスベクターが、組み込みのためのＣＲＩＳＰＲシステムと組み合わせて、全てのキメラ抗原受容体をコードするために使用される（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ヘルペスベクター、ＰＯＸベクター、またはコスミドベクター）、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 各マルチシストロン性ベクターが、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 少なくとも１つのマルチシストロン性ベクターが、細胞において核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記核酸分子が、内因性遺伝子の発現を阻害するまたは欠失させる、請求項２０に記載の組成物。
  22. 抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、少なくとも１つのマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む機能的ＣＡＲをコードし、前記マルチシストロン性ベクターのうち１つにおける少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）が、同一ではなく、それによって、マルチシストロン性ベクターの組合せが、２つ以上の同一ではない結合性ドメインの発現をもたらし、各マルチシストロン性ベクターがコードする結合性ドメイン（複数可）が、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の同一ではない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、医薬組成物。
  23. 抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、（ａ）１つまたは複数のマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各機能的ＣＡＲ分子が、少なくとも１つの結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフで構成され；（ｄ）前記マルチシストロン性ベクターのうち１つにおける前記少なくとも１つの結合性ドメインが、同一ではなく；（ｅ）前記少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、マルチシストロン性ベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
  24. 抗腫瘍有効量のヒトリンパ球細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、（ａ）１つまたは複数のマルチシストロン性ベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各マルチシストロン性ベクターが、配列番号１１０、１１２、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含む機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各機能的ＣＡＲ分子が、少なくとも１つの結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクターにおける前記少なくとも１つの結合性ドメイン（複数可）が、同一ではなく；（ｅ）前記少なくとも１つのシグナル伝達モチーフの組合せが、前記マルチシストロン性ベクターそれぞれの間で同一ではなく；（ｆ）前記少なくとも１つの結合性ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが、各前記マルチシストロン性ベクターにおいて共有結合的に連結されており、１つまたは複数のマルチシストロン性ベクターの組合せが、１つまたは複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
  25. 前記リンパ球細胞が、血液学的がんを有するヒトのＴ細胞である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記血液学的がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
  27. 前記白血病が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
  28. 前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
  29. 前記血液学的がんが多発性骨髄腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
  30. ヒトがんが、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
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