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JP7762563B2 - タウタンパク質のモジュレーションのための方法および組成物 - Google Patents

タウタンパク質のモジュレーションのための方法および組成物

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JP7762563B2 JP2021518063A JP2021518063A JP7762563B2 JP 7762563 B2 JP7762563 B2 JP 7762563B2 JP 2021518063 A JP2021518063 A JP 2021518063A JP 2021518063 A JP2021518063 A JP 2021518063A JP 7762563 B2 JP7762563 B2 JP 7762563B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４０，１６２号の利益を請求し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、アルツハイマー病などのタウオパチーの処置および／または防止のためを含む、タウ発現をモジュレートするための組成物および方法の分野にある。
神経原線維変化（ＮＦＴ）において蓄積し得る微小管結合タンパク質（ＭＡＰＴとも称される）である、タウタンパク質の異常なレベルおよび／または凝集は、集合的に、タウオパチーと称される、いくつかの状態に関与している。これらのものとしては、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ、Benussi et al. (2015) Front Aging Neurosci. 7:171を参照されたい）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、難治性遺伝性てんかん（例えば、ドラベ症候群、Gheyara et al. (2014) Ann Neurol 76:443-456を参照されたい）、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ、Scholz and Bras (2015) Int J. Mol Sci 16(10):24629-24655を参照されたい）が挙げられる。以前の研究により、脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した成体マウスにおけるタウタンパク質発現の低減が、タウタンパク質レベルの完全な、または部分的な低減を引き起こし、また、発作強度に関して、化学的に誘導される発作から、処置されたマウスを保護することが示された（DeVos et al. (2013) J of NeuroSci 33(31):12887）。ＡＤにおいては、例えば、脳内のタウＮＦＴの存在と、認知低下との間に直接の相関がある（Spires-Jones and Hyman (2014) Neuron 82:756）。
また、ミスフォールディングされた、高リン酸化タウタンパク質はニューロンによって、より容易に取り込まれ、脳を通じて疾患を伝播し得るため、タウタンパク質はプリオンのような特性を有し得ること、ＡＤ患者の脳から単離されるこのミスフォールディングされたタウタンパク質が、マウスニューロンによって容易に取り込まれ得ることも示唆された（Takeda et al. (2015) Nat Comm doi:10.1038/ncomms9490；Hyman (2014) Neuron 82:1189）。トランスジェニックマウスモデルにおける神経原線維変化と関連するヒトタウタンパク質の内嗅皮質に限定された発現は、マウスタウタンパク質のミスフォールディングおよびニューロン中でのそのタウタンパク質の凝集をもたらし、検出可能なヒトタウタンパク質を発現しなかった（de Calignon et al. (2012) Neuron 73:685-697）。この研究は、ミスフォールディングされたヒトタンパク質がミスフォールディングを「播種」し、マウスタンパク質の凝集を引き起こすことができることを示唆する。さらに、内因性マウスタウの遺伝的減少または喪失は、突然変異ヒトタウ導入遺伝子の過剰発現によって引き起こされる神経病理毒性に対して保護的である（Wegmann et al. (2015) EMBO J. 34(24):3028-41）。
推定で５３０万人の米国人が、アルツハイマー病（ＡＤ）を有し、米国における死因のトップ１０のうちの１つになっており、２０５０年までに、世界で１億６２０万人がこの疾患を有するであろうと見積もられている（van Dijk et al. (2015) Front Neurosci 9:173）。この疾患は、女性に多く見られ（症例の２／３）、アフリカ系またはヒスパニック系の人々は、白人系の人々よりもＡＤを発症する可能性がより高い。ＡＤの原因は、遺伝（特に、症例の５％を占める早発型について）ならびに環境因子およびライフスタイル因子と関連すると考えられる。典型的には、この疾患は、６０代半ばの人において診断される。しかし、診断が行われる時までに、この疾患は数年またはさらには数十年にわたって進行してきている。この疾患は、長期間かけて進行し、今までのところ、疾患の効果を抑制する、または逆転させる治療的介入は同定されていない。
疾患関連遺伝子の抑制または活性化は、操作された転写因子の使用によって達成されてきた。操作された亜鉛フィンガー転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を設計および使用する方法は、十分に報告されており（例えば、米国特許第６，５３４，２６１号を参照されたい）、より近年では、転写活性化因子様エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ－ＴＦ）と、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピートＣａｓ９に基づく転写因子（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－ＴＦ）の両方も記載されている（Kabadi and Gersbach (2014) Methods 69(2):188-197の概説を参照されたい）。標的遺伝子の非限定例としては、ホスホランバン（Zhang et al. (2012) Mol Ther 20(8):1508-1515）、ＧＤＮＦ（Langaniere et al. (2010) J. Neurosci 39(49):16469）およびＶＥＧＦ（Liu et al. (2001) J Biol Chem 276:11323-11334）が挙げられる。さらに、遺伝子の活性化は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－アセチルトランスフェラーゼ融合物の使用によって達成された（Hilton et al. (2015) Nat Biotechnol 33(5):510-517）。遺伝子発現を抑制する操作されたＴＦ（リプレッサー）は、ハンチントン病（ＨＤ）などのトリヌクレオチド障害の処置において有効であることも示されている。例えば、米国特許第８，９５６，８２８号および米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号を参照されたい。米国特許出願公開第２０１８／０１５３９２１号は、タウモジュレーターを開示している。
しかしながら、タウオパチーの診断、防止、および／または処置のための改善された組成物および方法が、依然として必要である。かくして、ＡＤを含むタウオパチーの防止および／または処置のための組成物および方法が、本明細書で記載される。
アルツハイマー病（ＡＤ）などの１つまたは複数のタウオパチーを診断、防止および／または処置するための方法および組成物が本明細書で開示される。特に、操作された転写因子リプレッサー（タウタンパク質発現を抑制する）を含む、ＡＤなどの少なくとも１つのタウオパチーを処置するためにタウアレルを改変する（例えば、その発現をモジュレートする）ための方法および組成物が、本明細書で提供される。さらに、これらの方法および組成物を使用して、ＡＤ、ＦＴＤ、ＰＳＰ、ＣＢＤおよび／または発作を含む、他のタウオパチーの処置および／または防止のためにＭＡＰＴアレルを改変することができる。さらに、２つ以上のタウリプレッサーの使用は、単一のリプレッサーの使用と比較して、驚くべき、かつ予想外の相乗効果を提供する。特に、タウオパチーを有する対象におけるタウタンパク質凝集体をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で検出する、低減させる、および／または除去するための方法および組成物が、本明細書で提供される。
かくして、インビボでのタウ発現をモジュレートするのに使用するための微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の遺伝子モジュレーターが、本明細書に記載される。モジュレーターは、ＭＡＰＴ遺伝子中の少なくとも１２個のヌクレオチドの標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインと、機能ドメイン（例えば、転写調節ドメイン（抑制ドメインもしくは活性化ドメインなど）またはヌクレアーゼドメイン）とを含む少なくとも１つの融合分子を含む。限定されるものではないが、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ－エフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）、単一ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ系の）、アルゴノートタンパク質などを含む、任意のＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、すなわち、タウアレルに特異的に結合するＺＦＰと、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）とを含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインは、限定されるものではないが、５７８９０、６５９１８、５７９３０と命名されたＺＦＰを含む、表１に示されるタンパク質中の認識ヘリックスを有する。本明細書に記載の組成物および方法のいずれかにおいては、２つ以上の遺伝子モジュレーターが使用される（例えば、５７８９０と組み合わせた６５９１８）。２つ以上の融合タンパク質は、異なる標的部位に結合し、同じか、または異なる機能ドメインを含んでもよい。２つ以上のタウリプレッサーは、単一のリプレッサーの使用と比較して、驚くべき、かつ予想外の相乗効果を提供することができる。あるいは、本明細書に記載の２つ以上の融合タンパク質は、同じ標的部位に結合するが、異なる機能ドメインを含んでもよい。一部の例では、３つ以上の融合タンパク質が使用され、他の例では、４つ以上の融合タンパク質が使用されるが、他の例では、５つ以上の融合タンパク質が使用される。好ましい実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の融合タンパク質が、核酸（例えば、ｒＡＡＶ）として細胞に送達される。１つまたは複数の核酸（例えば、ＡＡＶベクター）を使用して、本明細書に記載のタウリプレッサーを送達することができる。ある特定の実施形態では、タウリプレッサーは、リプレッサーをコードする配列が２Ａ（例えば、Ｔ２ａ）配列によって隔てられている単一の核酸ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）によって運ばれる２つ以上のタウリプレッサーを含む。これらの実施形態では、２つ以上のタウリプレッサーをコードする配列は、任意の順序にあってもよい（例えば、６５９１８リプレッサー－Ｔ２ａ－５７８９０リプレッサーまたは５７８９０リプレッサー－Ｔ２Ａ－６５９１８リプレッサー）。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、標的遺伝子の発現の抑制を引き起こす。一部の実施形態では、２つの融合タンパク質は、それぞれのタンパク質がそのままで活性であるが、組み合わせた場合、抑制活性が相加的である用量で投与される。好ましい実施形態では、２つの融合タンパク質は、いずれもそのままでは活性でないが、組み合わせた場合、抑制活性が相乗的である用量で投与される。
本明細書に記載の遺伝子モジュレーターを、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の形態、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を含む医薬組成物を含む任意の形態で対象に提供することができる。
一部の態様では、遺伝子モジュレーター（またはその成分、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質）は、ポリヌクレオチド形態で提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子モジュレーター（リプレッサー）をコードする）のいずれかを含む遺伝子デリバリーベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込み能力がある、もしくは組込み欠損レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、当業界で公知のＡＡＶベクター変異体（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号および第７，１９８，９５１号；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０６号）などの、限定されるものではないが、１つまたは複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、これらのベクターの偽型（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９としてなど）を含む、少なくとも１つのＡＡＶベクター（またはその偽型もしくは変異体）上で運ばれる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血液脳関門を横断することができるＡＡＶ変異体である（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子モジュレーター（または同じか、もしくは異なるポリヌクレオチド上の１つもしくは複数のその成分）をコードする、ウイルスおよび非ウイルス遺伝子デリバリー媒体（例えば、ｍＲＮＡ、プラスミド、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、Ａｄベクターとして）を含む、１つまたは複数のベクターを含むタウの遺伝子モジュレーターが、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡを化学的に修飾してもよい（例えば、Kormann et al. (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157を参照されたい）。他の態様では、ｍＲＮＡは、キャップ（例えば、ＡＲＣＡキャップ（米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい））を含んでもよい。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの混合物を含んでもよい（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号を参照されたい）。
１つもしくは複数の遺伝子モジュレーター、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、および／または１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体を含む医薬組成物および単離された細胞も提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、２つ以上の遺伝子モジュレーターを含む。例えば、ある特定の組成物は、調節配列に作動可能に連結された、本明細書に記載されるタウをモジュレートするＺＦＰ、ＣａｓまたはＴＡＬＥのうちの１つをコードする配列を含む核酸と共に、薬学的に許容される担体または希釈剤を含み、調節配列は細胞中での核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされるＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥは、突然変異型または野生型ＭＡＰＴアレルに特異的である。一部の実施形態では、医薬組成物は、突然変異型または野生型ＭＡＰＴアレルをモジュレートするＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥを含む。タンパク質に基づく組成物は、本明細書に開示される１つまたは複数のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴＡＬＥと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む。
他の実施形態では、それを必要とする対象に、１つもしくは複数のポリヌクレオチド、１つもしくは複数の遺伝子デリバリー媒体、および／または医薬組成物を提供することなどにより、対象におけるＭＡＰＴ発現を抑制するための方法および使用が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、タウオパチーの処置および／または防止などのために、対象におけるＭＡＰＴ発現を抑制するために使用される（例えば、対象におけるタウの量を減少させることによる）。本明細書に記載の組成物は、脳内（限定されるものではないが、前頭葉皮質、前頭前野皮質、頭頂葉皮質、後頭葉皮質、限定されるものではないが、内嗅皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳を含む側頭葉皮質を含む）および脊髄（限定されるものではないが、腰部、胸部および頸部領域を含む）で長期間（４週間、３ヶ月、６ヶ月～１年以上）にわたってタウレベルを低下させる。本明細書に記載の組成物を、限定されるものではないが、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、眼窩（眼窩後方（ＲＯ））、鼻内および／または嚢内投与などの任意の投与手段によって対象に提供することができる。本明細書に記載の１つまたは複数の組成物（例えば、遺伝子モジュレーター、ポリヌクレオチド、医薬組成物および／または細胞）ならびにこれらの組成物の使用のための使用説明書を含むキットも提供される。
かくして、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、アルツハイマー病または発作などのタウオパチーを処置および／または防止するための方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質（またはポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質を含む医薬組成物）を、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはその組合せを使用して送達することができる組成物を含む。本明細書に記載の組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞ならびに／またはこれらのタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／もしくは細胞を含む医薬組成物）の投与は、限定されるものではないが、ＡＤ、タウオパチーまたは発作と関連する任意の臨床症状の改善または除去ならびにＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン、アストロサイト、ミエリンなど）の機能および／または数の増大を含む、治療（臨床）効果をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、タウ遺伝子および／またはタンパク質発現を（本明細書に記載の人工リプレッサーを受けていない対照と比較して）少なくとも３０％、または４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％、または少なくとも９５％または９５％を超えて減少させる。一部の実施形態では、少なくとも５０％の減少が達成される。
デリバリーは、カニューレまたは他の任意のデリバリー技術の使用によるなど任意の好適な手段による、任意の脳領域、例えば、海馬または内嗅皮質に対するものであってよい。任意のＡＡＶベクターが、ベクターによって直接投与されない脳領域への順行性および逆行性軸索輸送によるなど、対象の脳へのリプレッサーの幅広いデリバリーを提供し得る（例えば、果核へのデリバリーは、皮質、黒質、視床などの他の構造へのデリバリーをもたらす）。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。投与は、単回用量、または同時に与えられる一連の用量、または複数回投与（投与間の任意のタイミングでの）にあってもよい。
さらに、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、リプレッサーを、所望の効果を提供する任意の濃度（用量）で送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーは、１０，０００～５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）でアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して送達される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、２５０～１，０００（またはその間の任意の値）の感染多重度（ＭＯＩ）でレンチウイルスベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、０．０１～１，０００ｎｇ／１００，０００細胞（またはその間の任意の値）のプラスミドベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、０．０１～３０００ｎｇ／細胞数（例えば、５０，０００～２００，０００（例えば、１００，０００）細胞（またはその間の任意の値）のｍＲＮＡとして送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、１Ｅ１０～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍｌ（またはその間の任意の値）で脳実質に１～３００μｌの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、１Ｅ１０～１Ｅ１４ ＶＧ／ｍｌ（またはその間の任意の値）でＣＳＦに０．５～１０ｍｌの固定容量のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して送達される。
かくして、他の態様では、対象におけるタウオパチー（例えば、ＡＤ）を防止および／または処置する方法であって、１つまたは複数のＡＡＶベクターを使用して、タウアレルのリプレッサーを対象に投与することを含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、限定されるものではないが、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、鼻内、眼窩後方、または嚢内デリバリーを含む任意のデリバリー方法によってＣＮＳ（脳および／またはＣＳＦ）に投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、対象の実質（例えば、海馬および／または内嗅皮質）中に直接投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、静脈内（ＩＶ）投与される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、投与は、１回行ってもよく（単回投与）、または投与１回あたり同じか、もしくは異なる用量で複数回（投与間の任意の時間で）行ってもよい。複数回投与する場合、同じか、または異なる、投与様式の投与量および／またはデリバリー媒体を使用してもよい（例えば、ＩＶおよび／またはＩＣＶで投与される異なるＡＡＶベクター）。方法は、全て、方法を施されていない対象と比較して、または方法を施される前の対象自身と比較して、対象における、例えば、ＡＤを有する対象のＡＤニューロンにおける、タウの凝集を低減させる（例えば、タウ凝集に特徴的なＮＦＴを低減させる）方法；ニューロンもしくはニューロンの集団（例えば、ＡＤニューロンもしくはＡＤニューロンの集団）におけるアポトーシスを低減させる方法；ニューロンの過剰興奮性を低減させる方法；アミロイドベータ誘導毒性（例えば、シナプス喪失および／もしくは神経突起変性）を低減させる方法；ならびに／またはＡＤ対象における１つもしくは複数の認知機能の喪失を低減させる方法を含む。かくして、本明細書に記載の方法は、以下の１つまたは複数：神経毒性、病理学的タウ種（例えば、ＮＦＴもしくはリン酸化タウ）、ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）、ＣＳＦタウ、グリオーシス、変性神経突起、脊髄喪失、興奮毒性、皮質および海馬の縮小、特定のタウオパチーによって影響される領域と関連する体積変化、樹状タウ蓄積、認知（例えば、齧歯類モデルにおける放射状アーム迷路およびモリスの水迷路、恐怖条件付けなど）および／または運動障害を含む、タウオパチーのバイオマーカーおよび／または症状の低減をもたらす。
一部の態様では、細胞中の病原性タウ種の量を減少させるための方法および組成物が提供される。一部の実施形態では、方法は、高リン酸化タウの低減をもたらす。一部の例では、高リン酸化タウの低減は、可溶性タウまたは粒状タウの低減をもたらす。他の実施形態では、病原性タウ種の低減は、本明細書に記載のものの方法に従って、および／または本明細書に記載のものの組成物を用いて処置されていない細胞または対象と比較して、タウ凝集を減少させ、神経原線維変化（ＮＦＴ）の低減を引き起こす。さらなる実施形態では、細胞中で観察されるＮＦＴの量を逆転させる方法が提供される。さらなる実施形態では、本発明の方法および組成物は、対象の脳内での病原性タウ種（例えば、ＮＦＴ、高リン酸化タウ）の増殖の遅延を引き起こす。一部の実施形態では、脳をわたる病原性タウの増殖は停止し、他の実施形態では、脳をわたる病原性タウの増殖は逆転する。さらなる実施形態では、脳におけるアミロイドβ斑と関連する変性神経突起の数が減少する。一部の実施形態では、変性神経突起の数は、年齢を一致させた野生型の脳に見出されるレベルまで減少する。さらなる実施形態では、対象の脳内のアミロイドβ斑と関連する高リン酸化タウを低減させるための方法および組成物が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、対象への投与後、本明細書に記載の遺伝子モジュレーター（遺伝子リプレッサー）をコードする配列（例えば、ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ）はゲノム中に挿入される（組み込まれる）が、他の実施形態では、リプレッサーをコードする配列はエピソームに保持される。一部の例では、ＴＦ融合物をコードする核酸は、内因性プロモーターが発現を駆動するように、プロモーターを含むセーフハーバー部位に挿入される（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組込みにより）。他の実施形態では、リプレッサー（ＴＦ）ドナー配列は、セーフハーバー部位に挿入され（ヌクレアーゼ媒介性組込みにより）、ドナー配列は、リプレッサーの発現を駆動するプロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードする配列は、デリバリー後、染色体外（エピソーム）に保持され、異種プロモーターを含んでもよい。プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーター配列は広く発現されるが、他の実施形態では、プロモーターは組織または細胞／型特異的である。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、神経細胞に特異的である。他の好ましい実施形態では、選択されるプロモーターは、それが低発現を有することを特徴とする。好ましいプロモーターの非限定例としては、神経特異的プロモーターＮＳＥ、シナプシン、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定例としては、ＣＭＶ、ＣＡＧおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許出願公開第２０１５／０２６７２０５号に記載された自己調節性プロモーターの使用を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、方法は、対象の１つまたは複数のＡＤニューロン中のタウアレルの、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、９８％以上、または９９％以上の抑制をもたらすことができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および組成物を使用してタウオパチーを防止および／または処置する方法が記載される。ある特定の実施形態では、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＭＡＰＴ遺伝子発現および／またはタウタンパク質レベルをモジュレートする（例えば、抑制する）人工転写因子（例えば、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ－ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ－ＴＦ）、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦ、適宜、６５９１８、５７８９０、および／または５７９３０と命名されたＺＦＰを含むＺＦＰ－ＴＦ）の使用は、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、痙攣性疾患および／または大脳皮質基底核変性症）の防止および／または処置のために使用され、好ましくは、タウオパチーの症状は、適宜、対象の脳内の神経性もつれ（ｎｅｕｒａｌ ｔａｎｇｌｅ）の発生を低減させることによって、低減または除去される。本明細書に記載の方法および使用のいずれかにおいて、人工転写因子は、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９）などのウイルスベクターによって、例えば、静脈内で、対象のＣＮＳ（例えば、脳もしくは脊髄）に送達されるか、またはＣＮＳに、適宜、対象の脳の一方もしくは両方の半球の線条体もしくは海馬に送達される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＣＭＶまたはシナプシン（ＳＹＮ）プロモーターを含む。さらなる実施形態では、人工転写因子は、霊長類の対象の脳内のＭＡＰＴ遺伝子発現および／またはタウレベルを、未処置の対象と比較して、５０％以上、適宜、７０％以上、最大で９９％低下させる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、人工転写因子は、半球あたり６Ｅ１１のｒＡＡＶベクターゲノムで、ＣＭＶまたはＳＹＮプロモーターを含むＡＡＶベクターによって運ばれる。
１つまたは複数のＡＡＶタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）ならびに／または本明細書に記載のタウモジュレーターの成分を含む、および／もしくはモジュレーター（もしくはその成分）をコードするポリヌクレオチドを含むキットも提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロン）、試薬（例えば、ＣＳＦ中のタウタンパク質を検出および／もしくは定量するための）ならびに／または本明細書に記載の方法を含む、使用のための使用説明書をさらに含んでもよい。
かくして、ＭＡＰＴ発現を抑制する２つ以上の人工亜鉛フィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）（例えば、５７８９０または５７９３０と組み合わせた６５９１８と命名されるＺＦＰ）を含む組成物が、本明細書で提供される。２つ以上のＺＦＰ－ＴＦを含む組成物は、ＭＡＰＴ発現を、単一のリプレッサーおよび／または未処置の対照（対象）と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上抑制してもよい。組成物は、典型的には、１つまたは複数のウイルス（例えば、ＡＡＶ９などのＡＡＶ）ベクター、例えば、両方のＺＦＰ－ＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む単一のＡＡＶベクターまたはそれぞれのＺＦＰ－ＴＦをコードする別々のＡＡＶベクターによって運ばれ得るポリヌクレオチドによってコードされる、２つ以上のＺＦＰ－ＴＦをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。限定されるものではないが、ＣＭＶおよび／またはシナプシン（ＳＹＮ）プロモーターを含む、任意のプロモーターを使用して、ＺＦＰ－ＴＦの発現を駆動することができる。それを必要とする対象におけるタウオパチー（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、痙攣性疾患および／または大脳皮質基底核神経節変性症）の防止および／または処置のために、本明細書に記載の１つまたは複数の組成物（例えば、２つ以上のＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む１つまたは複数のＡＡＶベクター）を使用することができ、適宜、対象の脳内での神経性もつれの発生を低減させることによって、適宜、タウオパチーの症状が低減または除去される。組成物を、対象に、静脈内的に、またはＣＮＳに（例えば、対象の脳の一方または両方の半球の線条体または海馬に）投与することができ、適宜、１つまたは複数のＡＡＶベクターは、半球あたり約１Ｅ１０～６Ｅ１１のｒＡＡＶベクターゲノムで投与される。組成物の２つ以上のＺＦＰ－ＴＦの発現は、霊長類の対象の脳内のＭＡＰＴ遺伝子発現および／またはタウレベルを、未処置の対象と比較して５０％以上、適宜、７０％以上、最大で９９％低下させる。
図１は、本明細書に記載のタウリプレッサーで処置された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の尾側海馬から採取された例示的試料（「パンチ０８８」）中でのタウ発現およびＺＦＰ転写物レベルを描写するグラフである。上のプロットは正規化されたタウ発現（％）を示し、下のプロットはＺＦＰ ｍＲＮＡコピー（転写物／ｎｇ ＲＮＡ）を示す。グラフの左半分は、試験におけるそれぞれの動物の左半球から得られたパンチ０８８に由来するデータを表し、右半分は、試験におけるそれぞれの動物の右半球から得られたパンチ０８８に由来するデータを示す。異なるコンストラクトにおいて使用されたプロモーターを下に沿って示し、「ＣＭＶ」はＣＭＶプロモーターの使用を示し、「ＳＹＮ」はシナプシンプロモーターの使用を示す。
図２は、本明細書に記載のタウリプレッサーで処置されたＮＨＰから採取された例示的試料（尾側海馬から採取された上パネル中の「パンチ０８８」および吻側海馬から採取された下パネル中の「パンチ０３５」）中でのタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰ ｍＲＮＡレベル（コピー／ｎｇｍＲＮＡ）を示す。
図３は、示されたＮＨＰ脳試料（海馬に由来する「パンチ０３７」、「パンチ０３９」および「パンチ０６１」）の、ＺＦＰレベルおよびスケール化されていないタウタンパク質発現レベル（上パネル）、３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化されたタウタンパク質発現レベル（中央パネル）、または検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してスケール化されたタウタンパク質発現レベル（下パネル）を描写するグラフを示す。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）（左軸）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰ ｍＲＮＡレベル（コピー／ｎｇｍＲＮＡ）（右軸）を示す。
図４は、本明細書に記載のタウリプレッサーで処置された例示的なＮＨＰ対象（ＮＨＰ０７）における吻側から尾側の順の様々な脳スライス（各半球における５、６、７、８、および９）から採取された７４個のパンチに由来するタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）（左軸）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰ ｍＲＮＡレベル（コピー／ｎｇｍＲＮＡ）（右軸）を示す。
図５Ａおよび図５Ｂは、対照および処置されたＮＨＰ対象におけるタウ発現およびＺＦＰレベルおよび対応するＭＲＩ画像を描写する。図５Ａは、脳スライス７に由来するパンチに焦点を当てた、タウ発現およびＺＦＰレベルを示すグラフであり、対照（左パネルに示される「媒体」）ならびにリプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーターによって駆動され、リプレッサーがＴ２Ａ切断ペプチドによって連結されたＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）によって運ばれるタウリプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象中の皮質および海馬を示す。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰ ｍＲＮＡレベル（コピー／ｎｇｍＲＮＡ）を示す。図５Ｂは、注射路のレベルでの同じ対照（左パネル）および処置された（右パネル）対象に由来するＭＲＩスキャンを描写する。同時輸注されたガドリニウムトレーサーが両半球の海馬領域中で明らかである。
図６Ａ～図６Ｅは、対照および処置されたＮＨＰ対象から採取された試料中のタウ発現およびＺＦＰレベルを描写するグラフである。図６Ａは、対照の対象（ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２およびＮＨＰ０３）に由来する結果を示す。図６Ｂは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８－８９０」）によって駆動されるＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）によって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置されたＮＨＰ対象（ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５およびＮＨＰ０６）に由来する結果を示す。図６Ｃは、リプレッサー（９１８および８９０）の発現がＣＭＶプロモーター（「ＣＭＶ．９１８－８９０」）によって駆動されるＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）によって運ばれる遺伝子リプレッサー６５９１８（「９１８」）および５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ０７およびＮＨＰ０８）（左パネル）、ならびにリプレッサー（９３０）の発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９３０」）によって駆動されるＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）によって運ばれる遺伝子リプレッサー５７９３０（「９３０」）で処置された対象（ＮＨＰ０９およびＮＨＰ１０）（右パネル）に由来する結果を示す。図６Ｄは、リプレッサーの発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．８９０」）によって駆動されるＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）によって運ばれる５７８９０（「８９０」）で処置された対象（ＮＨＰ１１、ＮＨＰ１２およびＮＨＰ１３）に由来する結果を示す。図６Ｅは、リプレッサーの発現がシナプシン（ＳＹＮ１）プロモーター（「ＳＹＮ１．９１８」）によって駆動されるＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）によって運ばれる６５９１８（「９１８」）で処置された対象（ＮＨＰ１４およびＮＨＰ１５）に由来する結果を示す。それぞれのパネルにおける上のプロットは、正規化されたタウ抑制（％）を示し、それぞれのパネルにおける下のプロットは、ＺＦＰ ｍＲＮＡレベル（コピー／ｎｇｍＲＮＡ）を示す。
図７は、示されたＮＨＰ脳試料（Ｘ軸上のパンチＩＤ）の、ＺＦＰレベルおよびスケール化されていないタウ発現レベルの複合分析（上パネル）、または３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化されたタウ発現（中央パネル）、または検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してスケール化されたタウ発現（下パネル）を描写するグラフである。左パネルは、対照の対象（「媒体」）を示し、右パネルは、全ての処置された対象（「全てのＡＡＶ処置されたＮＨＰ」）を示す。
図８は、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してタウ発現をスケール化する方法を使用する、対照（左グラフ）および処置された対象（右グラフ）におけるタウ発現（上パネル）およびＺＦＰレベル（下パネル）の複合分析を描写するグラフである。
図９は、示された対照および処置された対象の左（左パネル）および右（右パネル）半球におけるタウ発現を描写するグラフである。「ＶＥＨ」は、媒体のみを投与された対照の対象を示す；「ＳＹＮ９１８－８９０」は、発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、６５９１８および５７８９０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターを受ける対象を指す；「ＣＭＶ９１８－８９０」は、発現がＣＭＶプロモーターによって駆動される、６５９１８および５７８９０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターを受ける対象を指す；「ＳＹＮ９３０」は、発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、５７９３０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターを受ける対象を指す；「ＳＹＮ８９０」は、発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、５７８９０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターを受ける対象を指す；ならびに「ＳＹＮ９１８」は、発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、６５９１８遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターを受ける対象を指す。この分析のために、正規化されたタウ発現を、それぞれのパンチについて、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物から測定されたタウレベルの平均に対してスケール化した。
図１０は、示されたＮＨＰ対象におけるＺＦＰ転写物レベルが、１Ｅ４ ＺＦＰ転写物（コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）よりも低い（左パネル）；１Ｅ４～１Ｅ５ 転写物（コピー／ｎｇのｍＲＮＡ）である（中央パネル）；および１Ｅ５の転写物（コピー／ｎｇｍＲＮＡ）よりも高い（右パネル）、タウ発現レベルを描写するグラフである。左半球におけるレベルを上パネルに示し、右半球におけるレベルを下パネルに示す。この分析のために、所与のパンチに関する正規化されたタウ発現を、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物から測定されたタウレベルの平均に対してスケール化した。
図１１は、示されたＮＨＰ対象におけるＺＦＰ転写物レベルが、ＺＦＰ転写物レベルについて示される（左上パネル）、１Ｅ４ ＺＦＰ転写物（コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）よりも低い（左下パネル）；１Ｅ４～１Ｅ５ 転写物（コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）である（右上パネル）；および１Ｅ５ 転写物（コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）よりも高い（右下パネル）、左および右半球におけるタウ発現レベルを描写するグラフである。この分析のために、所与のパンチに関する正規化されたタウ発現を、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物から測定されたタウレベルの平均に対してスケール化した。
図１２は、対照の対象（左パネル－「媒体」）および発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、６５９１８および５７８９０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターで処置された対象（「ｈＳＹＮ１．５７８９－６５９１８」）における、タウ発現およびＺＦＰ転写物レベルを示す相関プロットを描写するグラフである。絶対量測定に関するＺＦＰ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの限界は、定量下限（ＢＬＯＱ）によって示される約１Ｅ２ 転写物／ｎｇ ｍＲＮＡである。この分析のために、タウ発現を、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してスケール化する。
図１３は、示された処置群に関する示されたＺＦＰ転写物レベルでのタウ発現を示す相関プロットである。この分析のために、それぞれのパンチに関するタウ発現レベルを、３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化する。上パネルは、全てのＺＦＰ ｍＲＮＡレベルにわたる関係を示す；下パネルは、タウ減少と関連するＺＦＰ発現の範囲のみ、約１Ｅ４～１Ｅ６ ＺＦＰ転写物／ｎｇｍＲＮＡを示す。また、Ｒ２乗およびＰ値も示す。この分析のために、タウ発現を、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してスケール化する。
図１４は、対照の対象（左パネル－「媒体」）および発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、６５９１８および５７８９０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターで処置された対象（「ｈＳＹＮ１．５７８９－６５９１８」）における、タウ発現およびＺＦＰ転写物レベルを示す相関プロットである。絶対量測定に関するＺＦＰ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの限界は、定量下限（ＢＬＯＱ）によって示される約１Ｅ２ 転写物／ｎｇ ｍＲＮＡである。図１２とは対照的に、この分析のために、タウ発現レベルを、３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化する。
図１５は、示された処置群に関する示されたＺＦＰ転写物レベルでのタウ発現を示す相関プロットである。この分析のために、それぞれのパンチに関するタウ発現レベルを、３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化する。上パネルは、全てのＺＦＰ ｍＲＮＡレベルにわたる関係を示す；下パネルは、タウ減少と関連するＺＦＰ発現の範囲のみ、約１Ｅ４～１Ｅ６ ＺＦＰ転写物／ｎｇｍＲＮＡを示す。また、Ｒ２乗およびＰ値も示す。図１３とは対照的に、この分析のために、タウ発現レベルを、３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化する。
図１６は、対照の対象（左パネル－「媒体」）および発現がシナプシンプロモーターによって駆動される、６５９１８および５７８９０遺伝子リプレッサーをコードするＡＡＶベクターで処置された対象（「ｈＳＹＮ１．５７８９－６５９１８」）における、タウ発現およびＺＦＰ転写物レベルを示す相関プロットである。絶対量測定に関するＺＦＰ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの限界は、定量下限（ＢＬＯＱ）によって示される約１Ｅ２ 転写物／ｎｇ ｍＲＮＡである。この分析のために、タウ発現レベルを、未処置の、またはＺＦＰ陰性の動物中でのベースラインタウレベルに関して補正するためにスケール化しなかった。
図１７は、示された処置群に関する示されたＺＦＰ転写物レベルでのタウ発現を示す相関プロットである。この分析のために、それぞれのパンチに関するタウ発現レベルを、３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化する。上パネルは、全てのＺＦＰ ｍＲＮＡレベルにわたる関係を示す；下パネルは、タウ減少と関連するＺＦＰ発現の範囲のみ、約１Ｅ４～１Ｅ６ ＺＦＰ転写物／ｎｇ ｍＲＮＡを示す。また、Ｒ２乗およびＰ値も示す。この分析のために、タウ発現レベルを、未処置の、またはＺＦＰ陰性の動物中でのベースラインタウレベルに関して補正するためにスケール化しなかった。
図１８Ａ～図１８Ｄは、本明細書に記載のタウＺＦＰ－ＴＦで処置されたヒト化タウマウスに由来する結果を描写する棒グラフである。図１８Ａは、示されたコンストラクトで処置されたマウスの相対（左グラフ）および絶対（右グラフ）ＺＦＰレベルを示す。示されるように、６５９１８と５７８９０との相乗的組合せで処置されたマウスは、５７８９０のみよりも２倍高い発現レベルを示した。図１８Ｂは、示されたコンストラクトで処置されたマウスにおける、ヒトタウ（「ｈＴＡＵ」、左グラフ）、マウスタウ（「ｍＴＡＵ」、中央グラフ）およびＧＦＰ（右グラフ）発現レベルを示す。示されるように、ヒトタウｍＲＮＡは、５７８９０による約６０％の抑制と比較して、６５９１８－Ｔ２ａ－５７８９０によって約９０％抑制された。同様に、マウスタウｍＲＮＡは、５７８９０のみによる約８１％の抑制と比較して、６５９１８－Ｔ２ａ－５７８９０によって約８７％抑制された。図１８Ｃは、示された条件下で処置されたヒト化タウマウスにおけるｈＴＡＵ（左グラフ）およびヒトＳａｉｔｏｈｉｎ（「ｈＳＴＨ」、右グラフ）の発現を描写する。ＳＴＨがタウ内に入れられ、したがって、２つの遺伝子が同時に調節されるという事実と一致して、類似するレベルのヒトタウおよびＳＴＨ減少が観察された。図１８Ｄは、示されたコンストラクトで処置されたヒト化タウマウスのＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー）（左グラフ）、ＩＢＡ１（ミクログリアマーカー）（中央グラフ）およびＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）（右グラフ）の発現レベルを示す。
図１９Ａ～図１９Ｃは、ＣＭＶまたはシナプシン（ＳＹＮ）プロモーターのいずれかを含むＺＦＰ－ＴＦコンストラクトから発現された示されたタウ特異的ＺＦＰ－ＴＦを用いた処置後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）中でのミクログリアおよびアストロサイトマーカーの発現レベルの増大を描写するグラフである。図１９Ａおよび図１９Ｂは、ミクログリアのマーカーである、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ１）レベルを示す。ミクログリア活性化は、炎症応答を示す。図１９Ｃは、アストロサイト活性化（ＧＦＡＰレベルによって測定される）を示す。示されるように、ＳＹＮプロモーターを含むコンストラクトについてはいずれも、ミクログリアまたはアストロサイトレベルのＺＦＰ依存的上昇は見られなかったが、ＣＭＶプロモーターを含むコンストラクトに関してはミクログリアおよびアストロサイトマーカーが上昇した。
図２０Ａおよび図２０Ｂは、示されたように処置された霊長類の左（「Ｌ」）および右（「Ｒ」）半球におけるＩＢＡ１（図２０Ａ）およびＧＦＡＰ（図２０Ｂ）のバルクレベルを示すグラフである。示されるように、ＩＢＡ１およびＧＦＡＰレベルはＮＨＰ間で変化するが、いずれの処置群についても大きなバルク効果は観察されなかった。
図２１は、示された条件下で処置された対象におけるＺＦＰに対するハウスキーピング遺伝子ＥＩＦ４ａ２の正規化された発現を描写するグラフである。示されるように、いずれかの処置群におけるハウスキーピング遺伝子（ＥＩＦ４Ａ２）およびＺＦＰ発現のレベルと相関しなかった。
図２２は、示された条件下でのヒトｉＰＳＣ由来（ＩＰＳ）ニューロン中での総タウタンパク質レベルを描写するグラフである。「モック」は、空のＡＡＶベクターをトランスフェクトされた細胞を指す；「対照」は、タウを標的としないＺＦＰをコードするＡＡＶベクターをトランスフェクトされた細胞を指す；「５７９３０」は、５７９３０リプレッサーをコードするＡＡＶベクターで処置された細胞を指す；「５７８９０」は、５７８９０リプレッサーをコードするＡＡＶベクターで処置された細胞を指す；「６５９１８」は、６５９１８リプレッサーをコードするＡＡＶベクターで処置された細胞を指す；ならびに「６５９１８／５７８９０」は、６５９１８および５７８９０リプレッサーの両方をコードするＡＡＶベクターで処置された細胞を指す。ＺＦＰリプレッサーをコードする全てのＡＡＶコンストラクトが、リプレッサーのシナプシンプロモーター（ＳＹＮ１）駆動性発現を含んでいた。タウタンパク質レベルを、ＡＡＶベクター投与の３２日後にＥＬＩＳＡによって評価した。
タウオパチーの防止および／または処置のための組成物および方法が本明細書に開示される。特に、本明細書に記載の組成物および方法は、ＭＡＰＴ（タウ）タンパク質の発現を抑制して、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、痙攣性疾患および／または大脳皮質基底核神経節変性症などのタウオパチーを防止または処置するために使用される。ＭＡＰＴリプレッサー（例えば、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ－ＴＦ）、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ＴＦを含むＭＡＰＴモジュレーティング転写因子などの、ＭＡＰＴモジュレーティング転写因子）は、例えば、タウオパチー（例えば、ＡＤ）を有する対象の脳内でのタウの凝集を低減させること、および神経性もつれの発生を低減させることによって、タウオパチーの効果および／または症状が低減されるか、または除去されるように、ＣＮＳを改変する。好ましい実施形態では、ＭＡＰＴモジュレーティング転写因子は、ＡＡＶなどのウイルスベクターによって脳に送達される。ＡＡＶは、脳へのデリバリーによく適していることが示されており、したがって、ＭＡＰＴモジュレーティング転写因子を送達するためのこれらのウイルスベクターの使用は、タウタンパク質の不適切な発現および、それによる凝集と関連するアルツハイマー病などの疾患の処置にとって特に有用である。
微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）は、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、および前頭側頭型認知症などのいくつかの神経変性障害の発症と密接に関連している。遺伝子およびアンチセンスに基づくタウ低下手法はマウスにおいては有効であり、良好に許容されるが、単回投与、細胞内タウ標的療法の開発は、依然として長年にわたる目標である。亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）設計およびＡＡＶデリバリーにおける進歩は、神経変性疾患のための１回のＤＮＡ標的療法の新しい可能性を生み出した。マウス、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、およびヒトタウ転写調節エレメントを標的とするＺＦＰリプレッサーを、ＡＡＶベクターを使用してマウスおよびＮＨＰの脳に送達した。ＭＡＰＴを標的とするＺＦＰは、マウスおよびヒトタウを最大で９９％減少させたが、一次およびｉＰＳＣニューロン中ではオフターゲット遺伝子調節は検出されなかった。成体マウスへの海馬内ＺＦＰデリバリーは、９０％を超えるタウ減少をもたらした。静脈内ＺＦＰ投与は、脳全体にわたってタウレベルを５０～７０％減少させた。ＺＦＰ発現およびマウスタウ減少は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、少なくとも６ヶ月安定であり、オフターゲットは検出されず、ＣＳＦ－タウの８０％を超える低下をもたらし、変性神経突起を５０％減少させた。両側性のリアルタイムＭＲＩによりガイドされた脳定位固定法を使用して、ＺＦＰをＮＨＰの海馬に送達したが、それらは良好に許容され、海馬および内嗅皮質において最大で８０％を超えるタウの低下をもたらした。ＺＦＰレベルは、タウの減少と強く相関していた。ＺＦＰの効力、効能、特異性および忍容性は、それらがヒトタウオパチーの処置のために持続的なタウの下方調節を達成することを示す。
一般
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途指摘しない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および分析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当業者の知識の範囲内にある関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989およびThird edition, 2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987およびその定期的アップデート；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、線状または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定と解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含してもよい。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対を形成するであろう。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有的相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は一般に、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指し、結合親和性の増大は、より低いＫｄと相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、自身に結合することができる（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または異なるタンパク質もしくは複数のタンパク質の１つもしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１より多い型の結合活性を有してもよい。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数の亜鉛フィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復ユニット」（「リピート」とも称される）は、典型的には、長さ３３～３５アミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌に由来する。（例えば、Swarts et al. (2014) Nature 507(7491):258-261、G. Sheng et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652を参照されたい）。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡなどの、必要とされる全ての成分である。「組換え」とは、限定されるものではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含む、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同組換え修復メカニズムによる細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こる、特殊な形態のそのような交換を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として種々公知であるが、これは、それがドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらすからである。いかなる特定の理論にも束縛されないが、そのような移行は、切断された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、「合成に依存する鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを含んでもよい。そのような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
ｓｇＲＮＡなどのＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを、例えば、選択された標的部位に結合するｓｇＲＮＡの設計により、または天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つもしくは複数のアミノ酸の変更）により、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤの操作により、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作された亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然には存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインを操作するための方法の非限定例は、設計および選択である。「設計された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、設計／組成が主に合理的な基準に起因する天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、存在するＺＦＰ設計および結合データのデータベース保存情報中の情報を処置するための置換規則およびコンピュータアルゴリズムの適用を含む。「選択された」亜鉛フィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、産生が主に、ファージディスプレイ、相互作用捕捉またはハイブリッド選択などの経験的プロセスに起因する、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，７４６，８３８号；第７，２４１，５７３号；第６，８６６，９９７号；第７，２４１，５７４号；および第６，５３４，２６１号を参照されたい；また、国際特許出願公開ＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状または分枝状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２～１０，０００ヌクレオチド長（またはその間もしくは上記の任意の整数値）、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチド長のものであってもよい。
「標的部位」または「標的配列」は、結合にとって十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。
「外因性」分子は、細胞中には通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入することができる分子である。「細胞中での通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。かくして、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成熟筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能性バージョンまたは正常に機能している内因性分子の機能不全バージョンを含んでもよい。
外因性分子は、特に、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるような低分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体などの高分子、または上記分子の１つもしくは複数を含む任意の複合体であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分枝状または環状であってもよく、任意の長さのものであってもよい。核酸は、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞中に存在しない染色体を含んでもよい。外因性分子を細胞中に導入するための方法は、当業者には公知であり、限定されるものではないが、脂質媒介性導入（すなわち、中性および陽イオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥデキストラン媒介性導入およびウイルスベクター媒介性導入が挙げられる。また、外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子であってもよいが、細胞が由来するものとは異なる種に由来してもよい。例えば、ヒト核酸配列を、元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞系に導入することができる。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階の特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含んでもよい。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含んでもよい。
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であってもよく、または異なる化学型の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例としては、限定されるものではないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、１つまたは複数の活性化ドメインとの融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例としては、限定されるものではないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合物、および副溝結合剤と核酸との融合物が挙げられる。この用語はまた、ポリヌクレオチド成分がポリペプチド成分と会合して、機能的分子を形成する系（例えば、単一ガイドＲＮＡが機能ドメインと会合して遺伝子発現をモジュレートするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）も含む。
細胞中での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質のデリバリーの結果生じるか、またはポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞へのデリバリーによって生じてもよい。ｔｒａｎｓスプライシング、ポリペプチドの切断およびポリペプチドのライゲーションを、細胞中でのタンパク質の発現に含ませてもよい。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドのデリバリーのための方法は、本開示の他の箇所に提示される。
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも称される）は、ＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦのアミノ、カルボキシまたはアミノおよびカルボキシ末端領域に組み込まれるドメインである。これらのドメインは、トリヌクレオチド反復ドメインのより大きい路が、野生型数の長さを有するより短い路と比較して多量体化されたＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦによって選択的に結合するようになるような、複数のＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦユニットの多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例としては、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインが適切なコンフォメーションをとって、低分子または外部リガンドの存在下でのみ、別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にする低分子によって、多量体化ドメインを調節することもできる。このように、外因性リガンドを使用して、これらのドメインの活性を調節することができる。
「遺伝子」は、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（上記参照）、ならびに調節配列がコード配列および／または転写される配列に隣接するかどうかに関係なく、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域を含む。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションは、限定されるものではないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含んでもよい。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活化、無作為突然変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子不活化とは、本明細書に記載のＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の低減を指す。かくして、遺伝子不活化は、部分的または完全であってもよい。
「遺伝子モジュレーター」とは、１つまたは複数の遺伝子の発現および／または配列を変更する任意の分子を指す。遺伝子モジュレーターの非限定例としては、標的遺伝子に結合し、その発現を変更する転写因子（本明細書に記載の人工転写因子など）および標的遺伝子の配列を改変し、次いで、その発現を変更するヌクレアーゼ（例えば、挿入および／または欠失による標的の不活化）が挙げられる。かくして、遺伝子モジュレーターは、遺伝子リプレッサー（遺伝子発現を抑制する、および／もしくは不活化する）または遺伝子活性化因子であってもよい。
「目的の領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子内または遺伝子に隣接する遺伝子または非コード配列などの、細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えのためのものであってもよい。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在してもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレイラー配列もしくはイントロンなどの転写される非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流にある非転写領域内にあってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ぐらいの小さいもの、または最大で２，０００ヌクレオチド対の長さのもの、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
「真核」細胞としては、限定されるものではないが、菌類細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」（または「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、両方の成分が正常に機能し、少なくとも１つの成分が、他の成分のうちの少なくとも１つに対して及ぼされる機能を媒介することができる可能性を許容するように成分が配置される、２つ以上の成分（配列エレメントなど）の並列を参照して互換的に使用される。実例として、プロモーターなどの転写調節配列は、その転写調節配列が１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とｃｉｓに作動可能に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続的ではないにも拘わらず、コード配列に作動可能に連結される転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結された」とは、それぞれの成分が、他の成分との連結において、それがそのように連結されていなかった場合に実行したであろうものと同じ機能を実行するという事実を指してもよい。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合分子に関して、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインとは、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、作動可能な連結にある。遺伝子発現を調節することができるドメインに融合されたＺＦＰは、「ＺＦＰ－ＴＦ」または「亜鉛フィンガー転写因子」と集合的に称されるが、遺伝子発現を調節することができるドメインに融合されたＴＡＬＥは、「ＴＡＬＥ－ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と集合的に称される。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合（「ＺＦＮ」または「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」）、融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとは、作動可能に連結されている。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）、融合ポリペプチド中で、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとは、作動可能に連結されている。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、単一ガイドＲＮＡ）が活性化ドメインに融合された融合分子に関して、融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインと、活性化ドメインとは、作動可能に連結されている。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチド中で、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができるが、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとは、作動可能に連結されている。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を依然として保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い、少ない、もしくはそれと同じ数の残基を有してもよく、および／または１つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有してもよい。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当業界で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断を、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ausubel et al., supraを参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、同時免疫沈降、２ハイブリッドアッセイまたは遺伝的と生化学的との両方の相補性によって決定することができる。例えば、Fields et al. (1989) Nature 340:245-246；米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許出願公開ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指令することができ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを意味する。かくして、この用語は、クローニング、および発現媒体、ならびに組込みベクターを含む。
「リポーター遺伝子」または「リポーター配列」とは、好ましくは、必須ではないが、日常的なアッセイにおいて容易に測定されるタンパク質産物をもたらす任意の配列を指す。好適なリポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖および／または遺伝子増幅（例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ）の増強を媒介するタンパク質が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、１または複数コピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。「発現タグ」は、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結されていてもよいリポーターをコードする配列を含む。
本明細書および実施形態を通して、単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述される整数または整数の群を含めることを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されるであろう。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの文献が本明細書で引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれかが当業界における共通一般知識の一部を形成するとの承認を構成するものではない。本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される用語「およそ」または「約」は、記述される参照値と類似する値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別途記述しない限り、または文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向に（より大きい、またはより小さい）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内、またはそれ未満にある値の範囲を指す。
タウおよびアルツハイマー病
タウタンパク質は、１６個のエクソンを含むＭＡＰＴ遺伝子によってコードされる。興味深いことに、エクソン１、４、５、７、９、１１および１２は構成的に発現されるのに対して、エクソン２、３および１０は、成体脳における６つの異なるタウタンパク質アイソフォームの存在をもたらす、代替的にスプライシングされる変異体に由来するタウタンパク質種中に存在し得る。タウは、タンパク質のＣ末端半分中に３または４回反復チューブリン結合モチーフを介して微小管に結合し、タウ４Ｒ（４個のチューブリン結合モチーフ）がタウ３Ｒよりも強く微小管と相互作用すると考えられる小管を安定化すると考えられる。３Ｒの４Ｒに対する比は、一般的には安定であるが、病的状態の影響を受け得る。微小管と相互作用するタウ形態はリン酸化され、高リン酸化はタウの微小管からの剥離を引き起こすと考えられる。高リン酸化タウは、細胞中で隔離された後、タンパク質中のコンフォメーション変化および凝集をもたらし得る。これらの凝集体は、病原性神経原線維変化（ＮＦＴ）の形成における初期段階であり得るが、高リン酸化タウは、神経原線維変化中に存在する場合に加え、可溶性形態でも病原性であり得る（Bodea et al. (2016) J of Neurochem 138(Suppl 1):71-94）。ＮＦＴは、ＡＤの初期段階においては内嗅皮質および内側側頭葉に限定され、疾患の重篤な臨床症状が現れる時までに、ＮＦＴは脳中に広がる。豊富なＮＦＴの存在と一致して、アミロイド斑の幅広い分布も起こる。事実、皮質におけるアミロイド沈着はタウ伝播速度の増大および脳の遠位領域へのＮＦＴの拡散をもたらすと考えられる。タウのもつれが拡散するにつれて、ニューロンの喪失の同時的増加がある（Pooler et al. (2015) Acta Neuropathol Commun 3:14, doi:10.1186/s40478-015-0199-x）。
タウは、リン酸化され得る９５個のアミノ酸残基を有し、タウのリン酸化を担い得るいくつかのキナーゼが同定されており、それらは、グリコーゲンシンターゼ－３、サイクリン依存性キナーゼ５、ＭＡＰＫファミリーのメンバー、細胞外で調節されるキナーゼ、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼおよび微小管親和性調節キナーゼ（Bodea (2016) ibid）などの、新しい治療剤のための可能性がある標的候補であり得る。
アミロイドβタンパク質（Ａβ）は、老人斑の主な構成要素であり、ＮＦＴと共に、アルツハイマー病の神経病理学的確認の顕著な特徴である。Ａβは、３９～４２アミノ酸の鎖を有するペプチドである；４２個のアミノ酸はより強く凝集体を形成し、疾患の発症に関与すると考えられ、アミロイド仮説の基礎となっている（脳内のＡβの蓄積がＡＤの主因であるという提唱、概説については、Hardy and Selkoe (2002) Science 297:353を参照されたい）。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、遍在性の、グリコシル化、硫酸化、およびリン酸化された内在性膜タンパク質のタンパク質分解的切断の生成物である（Sorrentino et al. (2014) FEBS Lett 588:641-652）。しかしながら、ＡＤをもたらす病因は非常に複雑であり、Ａβ蓄積の病因が異常なタウ挙動において役割を果たし得ることが明らかになっている（Ando et al. (2016) PLoS Genet 12(3):e1005917）。
脳内のタウの減少は、ＡＤの病理を改善することが示されている。マウスＡＤモデルにおけるタウ導入遺伝子発現の調節された抑制は、導入遺伝子に結合したタウ凝集体の減少ならびに高リン酸化タウおよびＮＦＴの濃度の低下を示した。事実、この研究はまた、全体的なＮＦＴの喪失も示し、これは、ＮＦＴの蓄積が可逆性であり得ることを示している（Polydoro et al. (2013) J of Neurosci 33(33):13300-13311）。さらに、海馬内投与によりＡＡＶを介して直接送達された細胞内抗タウ抗体を用いて実施された研究により、不溶性タウ種、ＮＦＴの減少および未処置のマウスモデルにおいて観察される海馬萎縮のレスキューが示された（Liu et al. (2016) J Neurosci 36(49):12425-12435）。
ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に記載の方法は、タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子中の標的配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物、例えば、タウモジュレーティング転写因子を利用する。任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥ）またはＤＮＡ結合ポリヌクレオチド（例えば、単一ガイドＲＮＡ）を、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができる。かくして、タウ遺伝子の遺伝子モジュレーター（リプレッサー）が記載される。
ある特定の実施形態では、タウリプレッサーまたはその中のＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者には公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ならびに国際特許出願公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
タウ標的部位は、典型的には、少なくとも１個の亜鉛フィンガーを含むが、複数の亜鉛フィンガー（例えば、２、３、４、５、６個以上のフィンガー）を含んでもよい。通常、ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４、５または６個のフィンガーを含むが、一部のＺＦＰは、８、９、１０、１１、または１２個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２～１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識するが、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、そのドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、一緒に連結された２つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む。かくして、これらの亜鉛フィンガーは、８、９、１０、１１、１２個以上のフィンガーを含んでもよい。一部の実施形態では、２つのＤＮＡ結合ドメインは、１個のＤＮＡ結合ドメインが４、５、または６個の亜鉛フィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインが追加の４、５、または５個の亜鉛フィンガーを含むような、伸長可能な可撓性リンカーによって連結される。一部の実施形態では、リンカーは、フィンガーアレイが８、９、１０、１１または１２個以上のフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むような標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーなどの非定型リンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの調節ドメインに融合され、「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ」構造と考えてよい。これらの実施形態の特定例は、可撓性リンカーと連結され、ＫＯＸリプレッサーに融合された２つのＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」および２つのＺＦＰ－ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して一緒に融合された「ＺＦＰ－ＫＯＸ－ＺＦＰ－ＫＯＸ」と称してもよい。
操作された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新しい結合特異性を有してもよい。操作方法としては、限定されるものではないが、合理的設計および様々な型の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、それぞれの３つ組または４つ組のヌクレオチド配列が、特定の３つ組または４つ組の配列に結合する亜鉛フィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連する、３つ組（または４つ組）のヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有された米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
さらに、これらの、および他の参考文献に開示されたように、亜鉛フィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー亜鉛フィンガータンパク質を、例えば、長さ５アミノ酸以上のリンカーなどの任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。また、長さ６アミノ酸以上の例示的リンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。
ＺＦＰを、１つまたは複数の転写調節（例えば、抑制ドメイン）に作動可能に結合（連結）して、ＺＦ－ＴＦ（例えば、リプレッサー）を形成させることができる。また、方法および組成物を使用して、例えば、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号に記載されたＺＦＰ骨格に対する突然変異によって、オフターゲット部位として知られる、他の意図しない切断部位と比較してその意図される標的に対するＺＦＰの特異性を増大させることもできる。かくして、本明細書に記載のタウリプレッサーは、１つもしくは複数のそのＤＮＡ結合ドメイン骨格領域中に突然変異および／またはその転写調節ドメイン中に１つもしくは複数の突然変異を含んでもよい。これらのＺＦＰは、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用することができるＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸に対する突然変異を含んでもよいが、それらはＤＮＡ認識ヘリックス中に変化を含まない。かくして、本発明は、ヌクレオチド標的特異性にとって必要とされないＺＦＰ骨格中に陽イオン性アミノ酸残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格中のこれらの突然変異は、陽イオン性アミノ酸残基を、中性または陰イオン性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格中のこれらの突然変異は、極性アミノ酸残基を、中性または非極性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。好ましい実施形態では、突然変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－５）、（－９）および／または位置（－１４）で導入される。一部の実施形態では、亜鉛フィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に１つまたは複数の突然変異を含んでもよい。さらなる実施形態では、マルチフィンガー亜鉛フィンガータンパク質中の１つまたは複数の亜鉛フィンガーは、（－５）、（－９）および／または（－１４）に突然変異を含んでもよい。一部の実施形態では、（－５）、（－９）および／または（－１４）でのアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異される。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの、エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼをホーミングする認識配列が公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388；Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118；Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228；Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180；Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabs catalogueも参照されたい。さらに、エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼをホーミングするＤＮＡ結合特異性を、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962；Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659；Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８を参照されたい。
「両手型（Ｔｗｏ ｈａｎｄｅｄ）」亜鉛フィンガータンパク質は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスターが、介在アミノ酸によって隔てられ、２つの亜鉛フィンガードメインが２つの不連続の標的部位に結合するタンパク質である。両手型の亜鉛フィンガー結合タンパク質の例は、４個の亜鉛フィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３個のフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置する、ＳＩＰ１である（Remacle et al. (1999) EMBO Journal 18 (18):5073-5084を参照されたい）。これらのタンパク質中の亜鉛フィンガーのそれぞれのクラスターは、ユニークな標的配列に結合することができ、２つの標的配列間の間隔は、多くのヌクレオチドを含んでもよい。両手型ＺＦＰは、例えば、一方または両方のＺＦＰに融合された、機能ドメインを含んでもよい。かくして、機能ドメインを一方または両方のＺＦＰの外部に結合するか、またはＺＦＰの間に配置してもよい（両方のＺＦＰに結合する）ことが明らかであろう。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然には存在しない）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質は、米国特許出願公開第２０１８／０１５３９２１号に示されたタウ標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドに結合する。タウ標的部位に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質のＲＶＤは、天然に存在する、または天然には存在しないＲＶＤであってもよい。米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号を参照されたい。
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原性細菌は、重要作物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。キサントモナスの病原性は、植物細胞中に２５種を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらのうち、注入されるタンパク質は、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）である（Kay et al. (2007) Science 318:648-651を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメインとを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、キサントモナス・カンペストグリスｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ． Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）に由来するＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136および国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬＥは、それぞれのリピートがこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含有する、タンデムリピートの中央ドメインを含有する。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Schornack et al. (2006) J Plant Physiol 163(3):256-272を参照されたい）。さらに、病原性細菌ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子は、ラルストニア・ソラナセアルム次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００におけるキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出された（Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメイン中に１，５７５ｂｐの欠失がある点が異なる。しかしながら、両遺伝子産物とも、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質との４０％未満の配列同一性を有する。
これらのＴＡＬＥの特異性は、タンデムリピート中に見出される配列に依存する。反復配列は、約１０２ｂｐを含み、リピートは典型的には、互いに９１～１００％相同である（Bonas et al., ibid）。リピートの多型性は通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変性２残基のアイデンティティーと、ＴＡＬＥの標的配列中の連続するヌクレオチドのアイデンティティーとの間には、１体１の対応があると考えられる（Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501およびBoch et al. (2009) Science 326:1509-1512を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードが決定され、１２および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに、ＮＮがＡまたはＧに、ＮＧがＴに結合するという具合であった。これらのＤＮＡ結合リピートは、リピートの新しい組合せおよび数を有するタンパク質にアセンブリーされて、新しい配列と相互作用することができる人工転写因子が作製された。さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１３／０１９６３７３号は、Ｎキャップポリペプチド、Ｃキャップポリペプチド（例えば、＋６３、＋２３１もしくは＋２７８）および／または新規（非定型）ＲＶＤを有するＴＡＬＥを記載している。
例示的なＴＡＬＥは、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、二量体化および／または多量体化ドメイン、例えば、コイルドコイル（ＣＣ）および二量体化亜鉛フィンガー（ＤＺ）を含む。米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。
さらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡ、例えば、第２０１５００５６７０５号に開示されたｓｇＲＮＡを含む。
真核生物ＲＮＡｉ経路と似ていると仮説を立てられた古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路の存在に関する説得力のある証拠が最近明らかになった（概説については、Godde and Bickerton (2006) J. Mol. Evol. 62:718-729；Lillestol et al. (2006) Archaea 2:59-72；Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7；Sorek et al. (2008) Nat. Rev. Microbiol. 6:181-186を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として知られる経路は、２つの進化的に、そしてしばしば、物理的に連鎖した遺伝子座：系のＲＮＡ成分をコードする、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードする、ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じると提唱されている（Jansen et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575；Makarova et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:482-496；Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7；Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e60）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機構のタンパク質成分との有意な配列類似性を共有しないが、類似する予測された機能を有する（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼなど）（Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサーアレイと関連していることが多い。４０種を超える異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系間に遍在すると考えられる。ｃａｓ遺伝子の特定の組合せおよびリピート構造を使用して、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプが定義されたが（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｙ．ｐｅｓｔ、Ｎ．ｍｅｎｉ、Ｄ．ｖｕｌｇ、Ｔ．ｎｅａｐ、Ｈ．ｍａｒｉ、Ａ．ｐｅｒｎ、およびＭ．ｔｕｂｅ）、これらのいくつかはリピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連している。１つより多いＣＲＩＳＰＲサブタイプが、単一のゲノム中に存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散在的分布は、系が微生物進化中に水平遺伝子導入にかけられることを示唆している。
最初はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続工程において標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレ－ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介し、そこで、プロセシングはＣａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅＩＩＩによって起こる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のためのさらなる要件である、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間でのワトソン・クリック塩基対形成によって、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに指向させる。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡもまた、それがその３’末端でｃｒＲＮＡと塩基対を形成し、この結合がＣａｓ９活性を誘発するので、存在していなければならない。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおいて、将来の攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの外来ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、次いで、（ｉｉｉ）ＲＮＡにより媒介性される外来核酸の阻害を含む。かくして、細菌細胞中では、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与している。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、多くの様々な細菌に見出されている。Fonfara et al. (2013) Nuc Acid Res 42(4):2377-2590による公共利用可能なゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索により、３４７種の細菌中にＣａｓ９オルトログが発見された。さらに、このグループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣａｓ９オルトログを使用して、ＤＮＡ標的のインビトロでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を証明した。かくして、用語「Ｃａｓ９」とは、Ｃａｓ９をコードする遺伝子が任意の好適な細菌に由来するものであってもよい、ＤＮＡ結合ドメインと、２つのヌクレアーゼドメインとを含むＲＮＡ依存性ＤＮＡヌクレアーゼを指す。
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する：一方のヌクレアーゼドメインはＨＮＨエンドヌクレアーゼと類似するが、他方はＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインと類似する。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡと相補的であるＤＮＡ鎖を切断するが、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖の切断を担うと考えられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ただ１つのヌクレアーゼドメインが機能的であり、Ｃａｓニッカーゼを作出するように操作することができる（Jinek et al. (2012) Science 337:816を参照されたい）。酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的突然変異によって、またはそれが最早機能的でなくなるようなドメインの一部もしくは全部のトランケーションによって、ニッカーゼを生成することができる。Ｃａｓ９は２つのヌクレアーゼドメインを含むため、この手法はいずれかのドメイン上で行ってもよい。二本鎖切断を、２つのそのようなＣａｓ９ニッカーゼの使用によって標的ＤＮＡ中で達成することができる。ニッカーゼは、ＤＮＡの１つの鎖をそれぞれ切断し、２つの使用は二本鎖切断を生成するであろう。
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要件を、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Jinek et al., ibidおよびCong et al. (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓに結合したＲＮＡと、標的ＤＮＡとの間で形成される場合、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を誘導して、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質と、ＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡ依存性ゲノム編集のために使用されてきたが（Ramalingam et al. (2013) Stem Cells and Development 22(4):595-610を参照されたい）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率で、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集にとって有用であった（Hwang et al. (2013) Nature Biotechnology 31(3):227）。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主要産物は、インベーダー標的配列を含有する短いＲＮＡであると考えられ、経路におけるその仮説的役割に基づいて、ガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と呼ばれる（Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7；Hale et al. (2008) RNA, 14:2572-2579）。ＲＮＡ分析により、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が反復配列内で切断されて、個々のインベーダー標的配列およびフランキングするリピート断片を含有する約６０～７０ｎｔのＲＮＡ中間体を遊離することが示される（Tang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99:7536-7541；Tang et al. (2005) Mol. Microbiol. 55:469-481；Lillestol et al. (2006) Archaea 2:59-72；Brouns et al. (2008) Science 321:960-964；Hale et al. (2008) RNA, 14:2572-2579）。古細菌ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）では、これらの中間体ＲＮＡは、豊富な、安定した約３５～４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡにさらにプロセシングされる（Hale et al. (2008) RNA, 14:2572-2579）。
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要件を、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Jinek et al. (2012) Science 337:816およびCong et al. (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓに結合したＲＮＡと、標的ＤＮＡとの間で形成される場合、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を誘導して、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質と、ＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡ依存性ゲノム編集のために使用されてきたが（Ramalingam, ibidを参照されたい）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率で、インビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集にとって有用であった（Hwang et al. (2013) Nature Biotechnology 31 (3):227を参照されたい）。
キメラまたはｓｇＲＮＡを、任意の所望の標的と相補的な配列を含むように操作することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上、またはそれより長い。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満、またはそれより短い。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号に示されたタウ標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドに結合する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するために、形態Ｇ［ｎ１９］の標的、次いで、形態ＮＧＧまたはＮＡＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対する２２塩基の相補性を含む。かくして、１つの方法では、ｓｇＲＮＡを、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列と、関連ゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種）の参照配列とを整列させること；（ｉｉ）ＺＦＮ半部位間のスペーサー領域を同定すること；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を同定すること（１つを超えるそのようなモチーフがスペーサーと重複する場合、スペーサーに対して中心にあるモチーフが選択される）；（ｉｖ）ｓｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することによって、目的の遺伝子中の公知のＺＦＮ標的の利用によって設計することができる。この方法は、有利には、証明されたヌクレアーゼ標的に依拠する。あるいは、単にＧ［ｎ２０］ＧＧ式に従う好適な標的配列を同定することによって、目的の任意の領域を標的とするように、ｓｇＲＮＡを設計することができる。相補性領域と共に、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の尾部領域に及ぶ追加のヌクレオチドを含んでもよい（Hsu et al. (2013) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647を参照されたい）。尾部は、＋６８～＋８５ヌクレオチド、またはその間の任意の数のものであってもよいが、好ましい長さは、＋８５ヌクレオチドである。トランケートされたｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ－ｇＲＮＡ」を使用することもできる（Fu et al. (2014) Nature Biotech 32(3):279を参照されたい）。ｔｒｕ－ｇＲＮＡでは、相補性領域は、１７または１８ヌクレオチド長に減少する。
さらに、ＰＡＭ配列が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用するＮＧＧ（Hsu 2013, ibid）の代替手段としてのＮＡＧであってもよい、代替的なＰＡＭ配列を使用することもできる。さらなるＰＡＭ配列はまた、初期のＧを欠くものを含んでもよい（Sander and Joung (2014) Nature Biotech 32(4):347）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓによりコードされるＣａｓ９ ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌源に由来するＣａｓ９タンパク質に特異的な他のＰＡＭ配列を使用することができる。例えば、以下に示されるＰＡＭ配列（Sander and Joung, ibidおよびEsvelt et al. (2013) Nat Meth 10(11):1116から適合させた）は、これらのＣａｓ９タンパク質に特異的である：
種 ＰＡＭ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＮＡＧ
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＮＧＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＧＧＮＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ ＮＧ
かくして、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するための好適な標的配列を、以下のガイドラインに従って選択することができる：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇ。あるいは、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従ってもよい。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌に由来するＣａｓ９タンパク質については、代替的なＰＡＭがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭ配列に置換される同じガイドラインを使用することができる。
最も好ましいのは、潜在的なオフターゲット配列を回避する特異性の可能性が最も高い標的配列を選択することである。以下の属性：ｉ）使用されるＣａｓ９タンパク質との、機能することが知られるＰＡＭ配列が後ろにある標的配列における類似性；ｉｉ）所望の標的配列から３個より少ないミスマッチを有する類似する標的配列；ｉｉｉ）ミスマッチが全て、ＰＡＭ近位領域よりもむしろＰＡＭ遠位領域に位置する（「シード」領域（Wu et al. (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889）と呼ばれることもある、ＰＡＭにすぐ隣接する、または近いヌクレオチド１～５が、認識にとって最も重要であり、したがって、シード領域中に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、少なくともｓｇＲＮＡによって認識される可能性があることを示すいくつかの証拠がある）、ｉｉ）と類似する標的配列；およびｉｖ）ミスマッチが連続した間隔を有さないか、または４ヌクレオチドを超える間隔を有する、類似する標的配列（Hsu 2013, ibid）を考慮することによって、これらの望ましくないオフターゲット配列を同定することができる。かくして、上記のこれらの基準を使用して、用いられるどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系についてもゲノム中の潜在的なオフターゲット部位の数の分析を実施することによって、ｓｇＲＮＡのための好適な標的配列を同定することができる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系が使用される。フランシセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ）において同定された、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞中でロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１とＣａｓ９は、そのガイドＲＮＡおよび基質特異性などの多くの態様において異なる（Fagerlund et al. (2015) Genom Bio 16:251を参照されたい）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との大きな差異は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを使用せず、かくして、ｃｒＲＮＡのみを必要とするということである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドのリピートおよび２３～２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、二次構造を保持する配列変化を許容する、単一のステムループを含有する。さらに、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも有意に短く、ＦｎＣｐｆ１に関するＰＡＭの要件は、置換された鎖上の５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９とＣｐｆ１は両方とも標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を生成するが、Ｃａｓ９はそのＲｕｖＣおよびＨＮＨ様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端の切断を生成する一方、Ｃｐｆ１はＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側に互い違いの切断をもたらす。Ｃｐｆ１は重要なシード領域から離れて互い違いの切断を生成するため、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、したがって、Ｃｐｆ１が、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位を切断し続けることができることを確保する。かくして、本明細書に記載の方法および組成物では、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との両方を含むことが理解される。かくして、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の両方を指し、ヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子系の両方を含む。
一部の実施形態では、他のＣａｓタンパク質を使用することができる。一部の例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸおよびＣａｓＹが挙げられ；操作された、および天然のその変異体（Burstein et al. (2017) Nature 542:237-241）、例えば、ＨＦ１／ｓｐＣａｓ９（Kleinstiver et al. (2016) Nature 529:490-495；Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome 28(7):247-261）；スプリットＣａｓ９系（Zetsche et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142）、インテイン－エクステイン系に基づくｔｒａｎｓスプライシングされたＣａｓ９（Troung et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8）；ミニ－ＳａＣａｓ９（Ma et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985）が挙げられる。かくして、本明細書に記載の方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」は、天然のものと、操作されたものの両方の、全てのＣａｓ変異体タンパク質を含むことが理解される。かくして、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」とは、ヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を指す。
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと定性的生物特性を共有する化合物である。「機能的誘導体」としては、限定されるものではないが、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられるが、但し、それらは対応する天然配列ポリペプチドと生物活性を共有する。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有的改変体、およびその融合物の両方を包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の単一の生物特性を含んでもよい。他の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の生物特性のサブセットを含んでもよい。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、限定されるものではないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合物、共有的改変体が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得られるか、または化学的に合成されるか、またはこれらの２つの手順の組合せによって得られるものであってよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生する、もしくは内因性Ｃａｓと同じか、もしくは異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。一部の場合、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
特定の遺伝子（セーフハーバー遺伝子を含む）に標的化される例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号に開示されている。
かくして、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインと共に、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
タウ遺伝子モジュレーター
タウＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に記載の方法における使用のために、任意のさらなる分子（例えば、ポリペプチド）に融合するか、またはそうでなければそれと結合してもよい。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたは単一ガイドＲＮＡ）と、異種調節（機能）ドメイン（またはその機能的断片）とを含む融合分子を用いる。
ある特定の実施形態では、タウモジュレーターの機能ドメインは、転写調節ドメインを含む。一般的なドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、がん遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再配列酵素ならびにその関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびその修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）、タンパク質分解修飾因子（デユビキチナーゼ、リガーゼ、デグロン）ならびにその関連する因子および修飾因子が挙げられる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。
活性化を達成するための好適なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Hagmann et al. (1997) J. Virol. 71:5952-5962を参照されたい）、核ホルモン受容体（例えば、Torchia et al. (1998) Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383を参照されたい）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Bitko & Barik (1998) J. Virol. 72:5610-5618およびDoyle & Hunt (1997) Neuroreport 8:2937-2942）；Liu et al. (1998) Cancer Gene Ther. 5:3-28）、またはＶＰ６４（Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33）などの人工キメラ機能ドメイン、およびデグロン（Molinari et al. (1999) EMBO J. 18:6439-6447）が挙げられる。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２、およびＣＴＦ１（Seipel et al. (1992) EMBO J. 11:4961-4968）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347；Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275；Leo et al. (2000) Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89；McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12；Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283；およびLemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、限定されるものではないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－７、および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29；Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99；Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309；Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429；Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8；Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44；およびHobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353を参照されたい。
タウリプレッサーを作製するために使用することができる例示的な抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454；Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446；Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450；およびRobertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、限定されるものではないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321；およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
一部の例では、ドメインは、染色体のエピジェネティック調節に関与する。一部の実施形態では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、およびＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔ１０９などの、Ａ型核局在化ドメインである（Berndsen and Denu (2008) Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689）。他の例では、ドメインは、クラスＩ（ＨＤＡＣ－１、２、３、および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７および９）、ＨＤＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ６および１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－１１）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても知られる；ＳＩＲＴ１～７）などのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）である（Mottamal et al. (2015) Molecules 20(3):3898-3941を参照されたい）。一部の実施形態において使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、その例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂ１、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－α、ＰＫＣβ１、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦおよびＣＫ２が挙げられる。一部の実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔ１、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７およびＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択することができる。一部の実施形態では、ＳＵＭＯ化およびビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８および１２）を使用することもできる（概説については、Kousarides (2007) Cell 128:693-705を参照されたい）。
融合分子は、当業者には周知のクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインと、機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）とを含む。融合分子はまた、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０ミディアムＴ抗原に由来するものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンなど）を含んでもよい。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、転写の読み枠が融合物の成分間で保存されるように設計される。
一方では機能ドメインのポリペプチド成分（またはその機能的断片）と、他方では非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との融合物は、当業者には公知の生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。例えば、Pierce Chemical Company (Rockford, IL) Catalogueを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの融合物を作製する方法および組成物が記載されている。Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935。同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦおよびポリペプチド成分機能ドメインと結合した、ｓｇＲＮＡ核酸成分を含むヌクレアーゼも、当業者には公知であり、本明細書に詳述される。
融合分子を、当業者には公知のように、薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985；および共同所有された国際特許出願公開ＷＯ００／４２２１９を参照されたい。
融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合したら、遺伝子の転写に影響することができる様々な異なる成分のいずれかから、融合分子の機能成分／ドメインを選択することができる。したがって、機能成分は、限定されるものではないが、活性化因子、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーなどの様々な転写因子ドメインを含んでもよい。
ある特定の実施形態では、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼドメインとを含み、その操作された（ＺＦＰもしくはＴＡＬＥもしくはｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図される核酸標的を認識することができる機能的実体を作出する、またはヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ結合部位の近くでのＤＮＡの切断を引き起こすヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくはＴＡＬＥヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を作出する。この切断は、タウ遺伝子の不活化（抑制）をもたらす。かくして、タウリプレッサーは、タウヌクレアーゼも含む。
かくして、本明細書に記載の方法および組成物は、広く適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含んでもよい。ヌクレアーゼの非限定例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；異種切断ドメインを含むメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインと結合したｓｇＲＮＡ）を含んでもよく、またはあるいは、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。
ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来してもよい。本明細書に記載のタウＤＮＡ結合ドメインに融合することができる好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非限定例としては、任意の制限酵素、例えば、ＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）に由来するドメインが挙げられる。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、切断活性にとって二量体化を必要とする切断ハーフドメインである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号、第８，４０９，８６１号および第７，８８８，１２１号を参照されたい。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のためには２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来するものであってよく、またはそれぞれの切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来するものであってもよい。さらに、２つの融合タンパク質の、その対応する標的部位への結合が、切断ハーフドメインを、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成できる互いの空間的配向に置くように、２つの融合タンパク質のための標的部位が互いに関して配置されるのが好ましい。
ヌクレアーゼドメインはまた、任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメインに由来してもよいが、切断活性を、限定されるものではないが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの本明細書に記載のヌクレアーゼと共に使用することもできる。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらのものは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを、ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する一本鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用することができるか、またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがメガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに関して位置する場所に応じて、二本鎖切断を生成することができる（Beurdeley et al. (2013) Nat Comm 4:1762, DOI: 10.1038/ncomms2782）。
他の実施形態では、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、メガヌクレアーゼ切断ドメインとを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない（Boissel et al. (2013) Nucl Acid Res:1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224を参照されたい）。
さらに、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインも、ＤＮＡ結合機能を示してもよい。任意のＴＡＬＥＮを、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つもしくは複数のメガ－ＴＡＬと共に１つもしくは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮもしくはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））および／またはＺＦＮと共に使用することができる。
さらに、切断ドメインは、例えば、オフターゲット切断効果を低減させるか、または除去する必須のヘテロ二量体の形成のために、野生型と比較して１つまたは複数の変更を含んでもよい。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、および第８，６２３，６１８号を参照されたい。
本明細書に記載のヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）中に二本鎖または一本鎖切断を生成してもよい。一本鎖切断（「ニック」）の生成は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７０３，４８９号および第９，２００，２６６号に記載されており、１つのヌクレアーゼドメインの触媒ドメインの突然変異がどのようにニッカーゼをもたらすかを記載している。
かくして、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
あるいは、ヌクレアーゼを、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位でインビボで集合させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照されたい）。そのようなスプリット酵素の成分を、別々の発現コンストラクト上で発現させるか、または個々の成分が、例えば、自己切断性２Ａペプチド（例えば、Ｔ２Ａ）もしくはＩＲＥＳ配列によって分離された１つのオープンリーディングフレーム中で連結することができる。成分は、個々の亜鉛フィンガードメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
ヌクレアーゼを、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１１９号に記載された酵母に基づく染色体系において、使用前に活性についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現コンストラクトを、当業界で公知の方法を使用して容易に設計することができる。
融合タンパク質（またはその成分）の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（脱抑制）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってもよい。好ましいプロモーターの非限定例としては、神経特異的プロモーターＮＳＥ、シナプシン、ＣＡＭＫｉｉａおよびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定例としては、ＣＡＳおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許出願公開第２０１５／０２６７２０５号に記載された自己調節性プロモーターの使用（タウＤＮＡ結合ドメインのための高親和性結合部位の含有による）を含む。
ある特定の実施形態では、対象における使用のためのタウモジュレーターは、５７８９０、６５９１８および／または５７９３０と命名されるＺＦＰを含む。ある特定の実施形態では、単一のＺＦＰタウリプレッサーと比較して相乗効果をもたらす２つ以上のそのようなタウモジュレーター（例えば、５７８９０および６５９１８ ＺＦＰリプレッサー；５７８９０および５７９３０ ＺＦＰリプレッサー；６５９１８および５７９３０；５７８９０、６５９１８および５７９３０）が、タウの抑制ならびにタウオパチーの症状の改善を含む、ＡＤなどのタウオパチーの処置および／または防止のために対象に提供される。
デリバリー
タンパク質および／またはポリヌクレオチド（例えば、タウモジュレーター）ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、例えば、ｍＲＮＡによるタンパク質の注入および／または発現コンストラクト（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクターなど）の使用などの、任意の好適な手段によって、標的細胞に送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーは、限定されるものではないが、ＡＡＶ９（米国特許第７，１９８，９５１号を参照されたい）、米国特許第９，５８５，９７１号に記載のＡＡＶベクターなどの、ＡＡＶベクターを使用して送達される。
本明細書に記載の亜鉛フィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
限定されるものではないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどの任意のベクター系を使用することができる。また、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号；第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターはいずれも、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質コード配列を含んでもよいと考えられる。かくして、１つまたは複数のタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）が細胞中に導入される場合、タンパク質成分および／またはポリヌクレオチド成分をコードする配列は、同じベクターまたは異なるベクター上で運ばれ得る。複数のベクターを使用する場合、それぞれのベクターは、１つもしくは複数のタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその成分をコードする配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ベクター系は、ＡＡＶベクター、例えば、米国特許第９，５８５，９７１号または米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０６号に記載されたＡＡＶ９またはＡＡＶ変異体である。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織中に操作されたタウモジュレーターをコードする核酸を導入することができる。そのような方法を使用して、そのようなリプレッサー（またはその成分）をコードする核酸をインビトロで細胞に投与することもできる。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボでの遺伝子療法における使用のために投与される。非ウイルスベクターデリバリー系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどのデリバリー媒体と複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクターデリバリー系は、細胞へのデリバリー後に、エピソーム性ゲノムまたは組み込まれたゲノムを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含んでもよい。遺伝子療法手順の概説については、Anderson (1992) Science 256:808-813；Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217；Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166；Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175；Miller (1992) Nature 357:455-460；Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988)；Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36；Kremer & Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995)；およびYu et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26を参照されたい。
核酸の非ウイルスデリバリーの方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、微量注射、ビオリスティクス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強性取込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションを、核酸のデリバリーのために使用することもできる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸を、ｍＲＮＡとして送達する。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡの安定性を増大させるためには、キャップ付ｍＲＮＡの使用が好ましい。特に好ましいのは、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップアナログ）キャップまたはその変異体である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。
さらなる例示的な核酸デリバリー系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）である。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適である陽イオン脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの国際特許出願公開ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４に記載のものが挙げられる。デリバリーは、細胞（エクスビボでの投与）または標的組織（インビボでの投与）に対するものであってよい。
イムノリピド複合体などの標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者には周知である（例えば、Crystal (1995) Science 270:404-410 (1995)；Blaese et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297；Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389；Remy et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654；Gao et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722；Ahmad et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820；米国特許第４，１８６，１８３号；第４，２１７，３４４号；第４，２３５，８７１号；第４，２６１，９７５号；第４，４８５，０５４号；第４，５０１，７２８号；第４，７７４，０８５号；第４，８３７，０２８号；および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
さらなるデリバリー方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣデリバリー媒体（ＥＤＶ）中に送達される核酸のパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに対する特異性を有する、二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に持って行った後、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞中に持って行かれる。細胞に入ったら、その内容物が放出される（MacDiarmid et al. (2009) Nature Biotechnology 27(7):643を参照されたい）。
操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸のデリバリーのためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与することができる（インビボ）か、またはそれらを使用してインビトロで細胞を処理し、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のデリバリーのための従来のウイルスに基づく系としては、限定されるものではないが、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中への組込みは、挿入される導入遺伝子の長期的発現をもたらすことが多い、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いて行うことができる。さらに、高い形質導入効率は、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されてきた。
外来エンベロープタンパク質を組み込むこと、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、レトロウイルスの指向性を変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高いウイルス力価をもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６～１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング能力を有するｃｉｓ作用性の長い末端反復を含む。後に、治療遺伝子を標的細胞中に組み込んで、持続的な導入遺伝子発現をもたらすために使用される、ベクターの複製およびパッケージングのためには、最小限のｃｉｓ作用性ＬＴＲで十分である。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せ（例えば、Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66:2731-2739；Johann et al. (1992) J. Virol. 66:1635-1640； Sommerfelt et al. (1990) Virol. 176:58-59；Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378；Miller et al. (1991) J. Virol. 65:2220-2224；国際特許出願公開ＷＯ１９９４／０２６８７７を参照されたい）が挙げられる。
一過的発現が好ましい適用では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率を可能にし、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られた。このベクターを、比較的単純な系で大量に生産することができる。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生において、ならびにインビボおよびエクスビボでの遺伝子療法手順のために、細胞に標的核酸を形質導入するために使用される（例えば、West et al. (1987) Virology 160:38-47；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許出願公開ＷＯ９３／２４６４１；Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801；Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260；Tratschin et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081；Hermonat & Muzyczka (1984) PNAS 81:6466-6470；およびSamulski et al. (1989) J. Virol. 63:03822-3828を含む、いくつかの刊行物に記載されている。
少なくとも６つのウイルスベクター手法が、臨床試験における遺伝子導入のために現在利用可能であり、形質導入剤を産生するためのヘルパー細胞系に挿入される遺伝子による欠損ベクターの補完を含む手法を使用する。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al. (1995) Blood 85:3048-305；Kohn et al. (1995) Nat. Med. 1:1017-102；Malech et al. (1997) PNAS 94(22):12133-12138）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験において使用された初めての治療用ベクターであった（Blaese et al. (1995) Science 270:475-480）。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ－Ｓパッケージベクターについて観察された（Ellem et al. (1997) Immunol Immunother. 44(1):10-20；Dranoff et al. (1997) Hum. Gene Ther. 1:111-2）。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴型２ウイルスに基づく有望な代替的な遺伝子デリバリー系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットを挟むＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入される細胞のゲノム中への組込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子デリバリーは、このベクター系にとっての鍵となる特徴である（Wagner et al. (1998) Lancet 351(9117):1702-3、Kearns et al. (1996) Gene Ther. 9:748-55）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／９およびＡＡＶ２／６などの偽型化されたＡＡＶを、本発明に従って使用することもできる。血液脳関門を横断することができる新規ＡＡＶ血清型を、本発明に従って使用することもできる（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号を参照されたい）。好ましい実施形態では、ＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９の変異体および偽型を含む）が使用される。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を、高力価で産生させ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染させることができる。多くのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作される；続いて、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をｔｒａｎｓに供給するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉中に見出されるものなどの非分裂性の分化した細胞を含む、インビボの複数の型の組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を含んでいた（Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-9）。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Rosenecker et al. (1996) Infection 24(1):5-10；Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 971083-1089；Welsh et al. (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-18；Alvarez et al. (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997)；Topf et al. (1998) Gene Ther. 5:507-513；Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089が挙げられる。
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成させるために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングする、Ψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞系によって生成される。典型的には、ベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（適用可能な場合）にとって必要とされる最小限のウイルス配列、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットで置き換えられる他のウイルス配列を含有する。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってｔｒａｎｓに供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みにとって必要とされるＡＡＶゲノムに由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有するが、ＩＴＲ配列を欠く、細胞系中にウイルスＤＮＡをパッケージングする。細胞系はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染を、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減させることができる。
多くの遺伝子療法適用においては、特定の組織型に対する高い特異度で遺伝子療法ベクターを送達することが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するようにウイルスベクターを改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られる受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Han et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができると報告したが、その組換えウイルスはヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染する。この原理を、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞対に拡張することができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を展示するように、繊維性ファージを操作することができる。上の説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。そのようなベクターを、特定の標的細胞による取込みを促進する特異的取込み配列を含有するように操作することができる。
遺伝子療法ベクターを、個々の患者への投与により、典型的には、以下に記載されるような、全身投与（例えば、海馬、皮質、線条体などの脳の任意の領域を含む脳への直接注入を含む、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内、嚢内、脳室内、または頭蓋内輸注）または局所適用により、インビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などのエクスビボの細胞、または普遍的なドナー造血幹細胞に送達した後、通常は、ベクターを組み込んだ細胞に関する選択の後、細胞を患者に再度移植することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、インビボで直接送達される。組成物（細胞、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）を、限定されるものではないが、脳または脊髄への直接注射などを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与することができる。限定されるものではないが、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体および／または皮質などの、脳の１つまたは複数の領域を標的化することができる。あるいは、またはＣＮＳデリバリーに加えて、組成物を、全身投与することができる（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、皮下、髄腔内、嚢内、脳室内および／または頭蓋内輸注）。本明細書に記載の組成物を対象に直接送達するための方法および組成物（ＣＮＳへの直接デリバリーを含む）としては、限定されるものではないが、針アセンブリーによる直接注射（例えば、定位固定注射）が挙げられる。そのような方法は、例えば、脳への組成物（発現ベクターを含む）のデリバリーに関する、米国特許第７，８３７，６６８号および第８，０９２，４２９号ならびに米国特許出願公開第２００６／０２３９９６６号に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
投与される有効量は、患者間で、また、投与の様式および投与部位に応じて変化するであろう。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって最良に決定され、当業者であれば、適切な投与量を容易に決定することができる。十分な時間にわたって組込みおよび発現をさせた後（典型的には、例えば、４～１５日）、治療ポリペプチドの血清または他の組織でのレベルの分析および投与前の初期レベルとの比較は、投与される量が低すぎる、正しい範囲内にある、または高すぎるかどうかを決定するであろう。初期およびその後の投与のための好適なレジメンも可変性であるが、典型的には、初期投与の後、必要に応じて、その後の投与である。その後の投与を、毎日から毎年から数年毎の範囲の可変的な間隔で投与することができる。ある特定の実施形態では、
ヒト脳に直接的にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してＺＦＰを送達するためには、線条体あたり、約１ｘ１０１０～５ｘ１０１５（またはその間の任意の値）個のベクターゲノムの用量範囲を適用することができる。上述の通り、投与量は、他の脳構造および異なるデリバリープロトコールのために変化してもよい。脳に直接的にＡＡＶベクターを送達する方法は、当業界で公知である。例えば、米国特許第９，０８９，６６７号；第９，０５０，２９９号；第８，３３７，４５８号；第８，３０９，３５５号；第７，１８２，９４４号；第６，９５３，５７５号；および第６，３０９，６３４号を参照されたい。
診断、研究、または遺伝子療法（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再輸注による）のためのエクスビボでの細胞トランスフェクションは、当業者には周知である。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、少なくとも１つのタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその成分をトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再度輸注して戻される。好ましい実施形態では、タウモジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸は、ＡＡＶ９を使用して送達される。他の実施形態では、タウモジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡの安定性を増大させるためには、キャップ付ｍＲＮＡの使用が好ましい。特に好ましいのは、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップアナログ）キャップまたはその変異体である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。エクスビボでのトランスフェクションにとって好適である様々な細胞型が、当業者には周知であり（例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)ならびに患者から細胞を単離および培養する方法の考察に関するその中に引用された参考文献を参照されたい）。
一実施形態では、幹細胞が、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエクスビボでの手順において使用される。幹細胞を使用する利点は、それらをインビトロで他の細胞型に分化させることができること、またはそれらが骨髄に生着する哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用して、臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロでＣＤ３４＋細胞を分化させるための方法は、公知である（Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702を参照されたい）。
幹細胞は、公知の方法を使用して形質導入および分化のために単離されている。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（パンＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの、望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパンすることによって、骨髄細胞から単離される（Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702を参照されたい）。
一部の実施形態では、改変された幹細胞を使用することもできる。例えば、アポトーシスに対して耐性にされた神経幹細胞を、幹細胞が本発明のＺＦＰ ＴＦをも含有する治療組成物として使用することができる。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞中で、ＢＡＸもしくはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮ（米国特許第８，５９７，９１２号を参照されたい）を使用して、ＢＡＸおよび／もしくはＢＡＫ、または再度、例えば、カスパーゼ－６特異的ＺＦＮを使用して、カスパーゼ中で破壊されるものをノックアウトすることにより、生じてもよい。これらの細胞に、タウ遺伝子を調節することが知られるＺＦＰ ＴＦまたはＴＡＬＥ ＴＦをトランスフェクトすることができる。
治療的ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、限定されるものではないが、注射、輸注、局所適用およびエレクトロポレーションなどの、ある分子を、血液または組織細胞との最終的な接触に導入するために通常使用される任意の経路による。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者には利用可能かつ周知であり、１より多い経路を使用して、特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりも即時的かつ有効な反応をもたらし得ることが多い。
造血幹細胞中にＤＮＡを導入するための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。導入遺伝子の、造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入にとって有用なベクターとしては、３５型アデノウイルスが挙げられる。
導入遺伝子の、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入にとって好適なベクターとしては、非組込みレンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388；Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471；Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880；Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって一部決定される。したがって、以下に記載されるような、利用可能な医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照されたい）。
上述の通り、開示される方法および組成物を、限定されるものではないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞などの任意の型の細胞中で使用することができる。タンパク質発現のための好適な細胞系は、当業者には公知であり、限定されるものではないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、スポドプテラ・フギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）などの昆虫細胞、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｓｃｈｉａ）およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌細胞が挙げられる。これらの細胞系の子孫、変異体および誘導体を使用することもできる。好ましい実施形態では、方法および組成物は、脳細胞に、例えば、線条体に直接送達される。
ＣＮＳ障害のモデル
ＣＮＳ障害の試験を、非ヒト霊長類（例えば、パーキンソン病（Johnston and Fox (2015) Curr Top Behav Neurosci 22: 221-35）；筋萎縮性側索硬化症（Jackson et al. (2015) J. Med Primatol: 44(2):66-75）、ハンチントン病（Yang et al. (2008) Nature 453(7197):921-4）；アルツハイマー病（Park et al. (2015) Int J Mol Sci 16(2):2386-402）；発作（Hsiao et al. (2016) E Bio Med 9:257-77））、イヌ科（例えば、ＭＰＳ ＶＩＩ（Gurda et al. (2016) Mol Ther 24(2):206-216）；アルツハイマー病（Schutt et al. (2016) J Alzheimers Dis 52(2):433-49）；発作（Varatharajah et al. (2017) Int J Neural Syst 27(1):1650046））およびマウス（例えば、発作（Kadiyala et al. (2015) Epilepsy Res 109:183-96）；アルツハイマー病（Li et al. (2015) J Alzheimers Dis Parkin 5(3) doi 10:4172/2161-0460））などの動物モデル系において実行することができる（概説：Webster et al. (2014) Front Genet 5 art 88, doi:10.3389f/gene.2014.00088）。これらのモデルは疾患の特定の症状セットを精査するのに有用であり得るため、ＣＮＳ疾患を完全に再現する動物モデルが存在しない場合であっても、これらのモデルを使用することができる。このモデルは、本明細書に記載の治療方法および組成物（遺伝子リプレッサー）の効能および安全性プロファイルを決定するのに役立ち得る。
適用
本明細書に記載のＭＡＰＴ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏなど）を含む本明細書に記載のタウモジュレーター（例えば、タウリプレッサー）、およびそれらをコードする核酸を、様々な適用のために使用することができる。これらの適用としては、ＭＡＰＴ結合分子（ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む）が、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルスベクターを使用して対象に投与され、対象内の標的遺伝子の発現をモジュレートするために使用される治療方法が挙げられる。モジュレーションは、抑制、例えば、ＡＤ疾患状態に寄与しているタウ発現の抑制の形態にあってもよい。あるいは、モジュレーションは、内因性細胞遺伝子の発現の活性化または発現の増加が疾患状態を改善することができる場合、活性化の形態にあってもよい。さらなる実施形態では、モジュレーションは、例えば、ＭＡＰＴ遺伝子の不活化のための、切断による（例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼによる）抑制であってもよい。上記の通り、そのような適用のために、ＭＡＰＴ結合分子、またはより典型的には、それらをコードする核酸を、薬学的に許容される担体と共に、医薬組成物として製剤化する。
ＭＡＰＴ結合分子、またはそれらをコードするベクターを単独で、または他の好適な成分（例えば、リポソーム、ナノ粒子または当業界で公知の他の成分）と共に、吸入により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらを「噴霧」することができる）にすることができる。エアロゾル製剤を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される推進剤の中に入れることができる。例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路などによる、非経口投与にとって好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有してもよい、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。例えば、静脈内輸注、経口、局所、腹腔内、膀胱内、眼窩後方（ＲＯ）、頭蓋内（例えば、限定されるものではないが、海馬および／もしくは皮質などの脳の任意の領域に）、嚢内または髄腔内投与により、組成物を投与することができる。化合物の製剤を、アンプルおよびバイアルなどの、単回用量または複数回用量の密閉容器中で提供することができる。注射溶液および懸濁液を、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
患者に投与される用量は、長時間にわたって患者における有益な治療応答をもたらすのに十分なものであるべきである。用量は、用いられる特定のＭＡＰＴ結合分子の効能およびＫｄ、標的細胞、および患者の状態、ならびに処置しようとする患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
以下の実施例は、ＭＡＰＴモジュレーターが亜鉛フィンガータンパク質を含む本開示の例示的実施形態に関する。これは例示だけのためのものであり、限定されるものではないが、ＴＡＬＥ－ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、さらなるＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、さらなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む、他のＭＡＰＴモジュレーター（例えば、リプレッサー）を使用することができることが理解されるであろう。以下に例示されるような標的部位に結合するこれらのモジュレーターを、当業者には公知の方法を使用して容易に取得することができることが理解されるであろう。同様に、以下の実施例は、デリバリー媒体が任意のＡＡＶベクターである例示的実施形態に関するものであるが、任意のウイルス（Ａｄ、Ｌｖなど）または非ウイルス（プラスミド、ｍＲＮＡなど）を使用して本明細書に記載のタウリプレッサーを送達することができることが理解されるであろう。
実施例１
インビボでのＭＡＰＴの抑制
米国特許出願公開第２０１８／０１５３９２１号に記載されたＭＡＰＴ（タウ）標的部位に特異的な亜鉛フィンガータンパク質を、以下のように使用した。
本明細書に記載の全てのＺＦＰを、ＫＲＡＢ抑制ドメインに作動可能に連結して、ＺＦＰ－ＴＦを形成させたところ、全てＭＡＰＴ発現を抑制した。
霊長類タウ特異的ＺＦＰ－ＴＦを、カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において試験して、霊長類におけるタウ発現の抑制を観察する（非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデル）。カニクイザルを、自動給水系を装備したステンレススチール製のケージ中で飼育する。試験は、Ｆｉｎａｌ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｔｉｔｌｅ ９）およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎの現行バージョンの全ての適用可能なセクションを順守する。
表１のＺＦＰ－ＴＦリプレッサーを、本質的には、米国特許出願公開第２０１８０１５３９２１号に記載のように、ＳＹＮ１プロモーターまたはＣＭＶプロモーターと共に、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ２／９、またはその変異体）中にクローニングした。使用したＡＡＶベクターは、Ｔ２Ａペプチドによって連結された６５９１８および５７８９０を含むリプレッサーの発現を駆動するＳＹＮ１プロモーターを有するベクター（ＳＹＮ９１８－８９０）；Ｔ２Ａペプチドによって連結された６５９１８および５７８９０を含むリプレッサーの発現を駆動するＣＭＶプロモーターを有するベクター（ＣＭＶ９１８－８９０）；５７９３０を含むリプレッサーの発現を駆動するＳＹＮ１プロモーターを有するベクター（ＳＹＮ９３０）；５７８９０を含むリプレッサーの発現を駆動するＳＹＮ１プロモーターを有するベクター（ＳＹＮ８９０）；および６５９１８を含むリプレッサーの発現を駆動するＳＹＮ１プロモーターを有するベクター（ＳＹＮ９１８）を含んでいた。
１５のＮＨＰ対象を、以下の表に示されるように処置した。
この実験では、ｈＳＹＮ１またはＣＭＶにより誘導されるＺＦＰ ＴＦを含むＡＡＶ９ベクターを、左半球には６Ｅ１１ ｖｇで、および右半球には６Ｅ１１ ｖｇで送達する。動物は、左半球では６０μＬの容量で単回用量の被験物質、および右半球では６０μＬの単回用量を受けた。全ての被験物質について、用量の濃度は、１Ｅ１３ ｖｇ／ｍＬであった。
２８日後、動物を犠牲にし、脳を取り出し、氷冷ＰＢＳ中の冠状ブレインマトリックス中に入れた。脳を３ｍｍの冠状スライス厚にスライスした（約１７個のスライスに分割した）。一部の脳スライス（右および左半球）を、組織病理検査およびインサイチューハイブリダイゼーション分析のために１０％中性緩衝化ホルマリン中で保存した。他の全ての脳スライス（右および左半球）を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中に入れ、約２４時間冷蔵した後、所定の脳鋳型に従って２～３ｍｍ直径のパンチを収集した。パンチをｑＲＴ－ＰＣＲおよび生体分布分析のために処理した。さらに、タウタンパク質分析のためにＣＳＦを収集した。
海馬および内嗅皮質領域を含むスライスを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、タウ、ＺＦＰ、グリアおよび神経細胞マーカー、ならびにハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを分析した。結果は、ＺＦＰ－ＴＦがＡＡＶによって海馬領域に送達され、タウ発現の低減をもたらしたことを示している。
図１および図２は、示された対象において示されたベクターを使用した海馬パンチ０８８および０３５のタウ抑制およびＺＦＰ ｍＲＮＡレベル（コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）の例示的結果を示す。
図３は、示されたパンチ試料と、スケール化なし（上パネル）、３つの媒体処置された動物の平均に対するスケール化（中央パネル）、または検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均タウ発現に対するスケール化（下パネル）を含む、所与のパンチに関するベースラインタウレベルを確立するために評価された３つの方法とに由来する結果を示す。示されるように、いずれかの方法によるスケール化は、１５全部の動物にわたってベースラインレベルをより良好に近似し、第３の方法（ＺＦＰ発現を示さないＮＨＰに対するスケール化）は、一部の事例（例えば、パンチ０３７）では、試験における１５の動物にわたってタウベースラインをいくらかより良好に代表する。
図４は、ＡＡＶ ＣＭＶ９１８－８９０で処置された対象ＮＨＰ０７におけるタウモジュレーションおよびＺＦＰレベルを示す。この分析のために、正規化されたタウ発現を、それぞれのパンチについて、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物から測定されたタウレベルの平均に対してスケール化した。次いで、ＮＨＰ０７に関するそれぞれのパンチに由来するデータを抽出し、分析された脳切片に従ってグループ化した。示されるように、ＮＨＰ０７は、ある特定の脳試料においてタウ抑制を示した。
図５Ａは、対照の対象（媒体、ＮＨＰ０１）およびＡＡＶ ＳＹＮ９１８－８９０で処置された対象（ＮＨＰ０４）（上パネル）におけるタウ発現およびＺＦＰレベルの比較を示し、図５Ｂは、スライス７に由来するＭＲＩ結果を示す。この分析のために、正規化されたタウ発現を、それぞれのパンチについて、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物から測定されたタウレベルの平均に対してスケール化した。
示されるように、媒体処置されたＮＨＰは、検出可能なタウ減少もＺＦＰ発現も有していなかった。対照的に、ＮＨＰ０４は、右半球におけるスライス７において検出可能なＺＦＰ発現を示し、これも２つの中央海馬パンチと相関していた。ＺＦＰカバレッジの増加およびタウ減少は、右半球における切片８および９について観察され、脳のこれらのレベルに由来するＭＲＩデータと良好に相関していた。
図６は、対照の対象（図６Ａ；ＮＨＰ０１、ＮＨＰ０２、ＮＨＰ０３）；ＡＡＶ ＳＹＮ１．９１８－８９０で処置された対象（図６Ｂ；ＮＨＰ０４、ＮＨＰ０５、ＮＨＰ０６）；ＡＡＶ ＣＭＶ．９１８－８９０で処置された対象（図６Ｃ；ＮＨＰ０７、ＮＨＰ０８）；ＡＡＶ ＳＹＮ１．９３０で処置された対象（図６Ｃ；ＮＨＰ０９、ＮＨＰ１０）；ＡＡＶ ＳＹＮ１．８９０で処置された対象（図６Ｄ；ＮＨＰ１１、ＮＨＰ１２、ＮＨＰ１３）；およびＳＹＮ１．９１８で処置された対象（図６Ｅ；ＮＨＰ１４、ＮＨＰ１５）におけるタウ発現およびＺＦＰレベルの結果を示す。
図７は、スケール化なし（上パネル）、３つの媒体処置された動物の平均に対するスケール化（中央パネル）、またはＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均タウ発現に対するスケール化（下パネル）を含む、所与のパンチに関するベースラインタウレベルを確立するための３つの方法を評価する全動物にわたる全パンチに関する複合分析を示す。示された対象（左パネルに示される媒体ＮＨＰ対象）および全てのＡＡＶ処置された対象（右パネル）に由来する結果を示す。示されるように、いずれかの方法によるスケール化は、１５全部の動物にわたってベースラインレベルをより良好に近似し、第３の方法（ＺＦＰ発現を示さない媒体およびＺＦＰ処置されたＮＨＰに対するスケール化）は、試験における３つの媒体処置された、および１２のＺＦＰ処置された動物にわたってタウベースラインをいくらかより良好に代表する。
この分析のために、正規化されたタウ発現を、それぞれのパンチについて、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物から測定されたタウレベルの平均に対してスケール化した。図８は、両方ともスケール化されたタウ発現レベル（上）および絶対ＺＦＰ転写物レベル（コピー／ｎｇ ｍＲＮＡ）に関する、示された対象（左パネルに示される媒体ＮＨＰ対象）および全てのＡＡＶ処置された対象（右パネル）からの結果を示す。図９は、示された対象の左および右半球に由来するタウ発現の結果を示す。図１０および１１は、１Ｅ４未満のＺＦＰ転写物が存在していた（図１０の左パネル、図１１の左下パネル）；１Ｅ４～１Ｅ５のＺＦＰ転写物が存在していた（図１０の中央パネル；図１１の右上パネル）；１Ｅ５を超えるＺＦＰ転写物が存在していた（図１０の右パネル；図１１の右下パネル）示された動物および全てのレベルのＺＦＰ転写物（図１１の左上パネル）の結果を示す。示されるように、低レベルのＺＦＰ発現を示す大多数のパンチは、有意なタウ減少を有しない。しかしながら、１Ｅ４～１Ｅ５のＺＦＰ転写物／ｎｇ ｍＲＮＡのパンチは、一部の処置については中間のタウ減少を有し、１Ｅ５以上の転写物／ｎｇ ｍＲＮＡを有するものは、さらにより高いタウ減少を有する。
図１３、図１５および図１７は、示されたように処置された対象におけるＺＦＰレベル（転写物／ｎｇ ｍＲＮＡ）の関数としての正規化されたタウ発現のパーセントを示す。図１３は、タウ発現を、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してスケール化する結果を示す。図１５は、タウ発現を、媒体処置された動物のみの平均に対してスケール化する結果を示す；図１７は、タウ発現を、ベースラインタウレベルに調整するためにスケール化しなかった結果を示す。スケール化の方法に関係なく、データは、５つのＺＦＰ処置のうちの４つ、すなわち、ＡＡＶ ＳＹＮ１．６５９１８－５７８９０、ＡＡＶ ＣＭＶ．６５９１８－５７８９０、ＡＡＶ ＳＹＮ１．５７８９０、ＡＡＶ ＳＹＮ１．６５９１８について、ＺＦＰ発現レベルとタウ減少との間に有意な相関があることを示している。最も高い程度のタウ減少は、ＡＡＶ ＳＹＮ１．６５９１８－５７８９０およびＡＡＶ ＣＭＶ．６５９１８－５７８９０処置に関して達成され、一部のパンチは８０％を超えるタウ減少を示した。
図１２、図１４および図１６は、媒体（左パネル）または発現がシナプシン１プロモーターによって駆動される５７８９０および６５９１８ ＺＦＰ－ＴＦリプレッサーをコードするＡＡＶベクター（右パネル）のいずれかで処置されたＮＨＰ対象に関する、タウ発現とＺＦＰレベルとの相関プロットを示す。絶対量測定に関するＺＦＰ ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの限界は、定量下限（ＢＬＯＱ）によって示される約１Ｅ２の転写物／ｎｇ ｍＲＮＡである。図１２は、タウ発現を、検出可能なＺＦＰ発現を示さない、媒体処置された動物およびＺＦＰ処置された動物の平均に対してスケール化する結果を示す。図１４は、タウ発現レベルを３つの媒体処置された動物の平均に対してスケール化する分析を示す。図１６は、タウ発現レベルを、タウベースラインレベルについて補正するためにスケール化しなかった分析を示す。示されるように、タウの抑制は、存在するＺＦＰ－ＴＦの量と相関していた。
実施例２
ヒト化タウマウスモデルにおけるタウ抑制
また、タウオパチーのＰ３０１Ｌ突然変異ヒトタウ（Ｐ３０１Ｌ）トランスジェニックマウスモデル（ｒＴｇ４５１０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）およびｈＴａｕマウスモデル（Ｂ６．Ｃｇ－Ｍａｐｔｔｍｌ（ＥＧＦＰ）ＫｌｔＴｇ（ＭＡＰＴ）８ｃＰｄａｖ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）におけるタウ減少を、本明細書に記載の遺伝子リプレッサーの投与後に評価した。ｈＴａｕマウスは、ＷＴヒトＭＡＰＴ遺伝子を発現し、さらに、内因性（マウス）Ｍａｐｔ遺伝子がノックアウトされ、ＧＦＰ発現コンストラクトで置き換えられている。処置群は、以下の表に示される通りであった。
測定された評価項目は以下の通りであった：ＲＴ－ｑＰＣＲによるＺＦＰおよびタウｍＲＮＡ発現レベル；ＲＴ－ｑＰＣＲによるＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、ＮｅｕＮ ｍＲＮＡ発現レベル；ＲＴ－ｑＰＣＲによるＳａｉｔｏｈｉｎ（ＳＴＨ）ｍＲＮＡ発現レベル（ＳＴＨはヒトタウ遺伝子のエクソン９と１０との間のイントロン中に位置する、類人猿およびヒトにおけるタンパク質コード遺伝子である；例えば、Conrad et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A. 99(11):7751-7756を参照されたい）；ならびにタウタンパク質レベル。
図１８Ａ～図１８Ｄに示されるように、５７８９０と６５９１８との相乗的対形成（ＡＡＶ９．ｈＳＹＮ．６５９１８－Ｔ２ａ－５７８９０）は、５７８９０（ＡＡＶ９．ｈＳＹ１．５７８９０）単独よりも少なくとも２倍高いＺＦＰ発現レベルをもたらした。図１８Ａを参照されたい。さらに、５７８９０および６５９１８をコードするコンストラクトを投与されたヒト化タウマウスでは、ヒトタウｍＲＮＡは、５７８９０のみをコードするコンストラクトを投与されたマウスにおける約６０％の抑制と比較して、約９０％の抑制により抑制された（マウスタウｍＲＮＡ発現は、５７８９０と６５９１８との組合せによって約８７％および５７８９０によって約８１％抑制された）。図１８Ｂを参照されたい。同様の結果は、ヒトＳａｉｔｏｈｉｎ（ｈＳＴＨ）のＲＴ－ｑＰＣＲ分析後に得られたが、５７８９０のみを使用した場合の約６８％と比較して、５７８９０と６５９１８との相乗的組合せによって約８８％抑制された。図１８Ｃを参照されたい。ＩＢＡ１およびＧＦＡＰレベルは、対照と比較して両処置群において上昇したが、ＮｅｕＮレベルは群間で有意に異ならなかった。図１８Ｄを参照されたい。
さらに、リプレッサーの臨床および治療有効性を、ＡＤのこのおよび他のマウスモデル（例えば、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄ９、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）においてさらに評価して、以下の１つまたは複数：ＲＮＡｓｃｏｐｅ ＩＳＨ分析（ＺＦＰ、ヒトタウ、およびマウスタウの単一細胞分析、例えば、Carstens et al. (2016) J Neurosci. 36(23):6312-6320を参照されたい）；ＩＨＣ ＺＦＰ／タウ分析（例えば、Zeitler et al. (2019) Nature Medicine 25:1131-1142を参照されたい）；神経毒性、グリオーシス、変性神経突起、脊髄喪失、興奮毒性、皮質および海馬の縮小、樹状タウ蓄積、認知（例えば、放射状アーム迷路およびモリスの水迷路、恐怖条件付けなど）および運動障害を含む、タウオパチーのバイオマーカーおよび症状の低減があるかどうかを決定する。例えば、Bryan et al., (2009) Chapter 1: Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations in Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. 2nd edition, ed. Buccafusco, Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francisを参照されたい。さらに、化学誘導性発作モデル、例えば、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ、例えば、Meyers et al. (1975) Epilepsia 16(2):257-67を参照されたい）またはカイネート（Ferraro et al. (1997) Mamm Genome 8:200-208）などの興奮毒性化合物で処置された野生型マウスを、本明細書に記載の遺伝子リプレッサーの投与後、４～８週で評価して、タウ減少が、発作と関連する死亡、発作までの潜伏期間の延長、および／または発作の重症度の低減を含む、発作に対する保護効果を提供するかどうかも決定する。
実施例３
神経炎症応答
ＭＡＰＴリプレッサーＺＦＰ－ＴＦでインビボで処置された霊長類を、ミクログリアおよびアストロサイトマーカーの発現レベルについても評価した。特に、実施例１に記載のようなパンチを、ＩＢＡ１およびＧＦＡＰ発現に関してＲＴ－ｑＰＣＲ試薬を使用して評価した。さらに、Ｅ１Ｆ４Ａハウスキーピング遺伝子のレベルも、処置された霊長類において評価した。簡単に述べると、脳パンチを、０．６ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および２個の３．２ｍｍスチールビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含有する１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに氷上で移した。
以下のパラメーター：５サイクル、９０ｓの持続時間、２５．１の周波数を使用して、４℃でＱｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを使用して、組織を溶解した。簡単に遠心分離した後、７０μＬの１－ブロモ－３－クロロプロパンを、ＲＴで各試料に添加した。試料を１０秒間ボルテックスし、４℃で１０分、１２，０００ｘｇで遠心分離し、各試料に由来する１２０μＬの水性相を、９６ウェルプレートのウェルに移した。６０μＬのイソプロピルアルコールおよび１２μＬのＭａｇＭａｘ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、水性相試料を含有する各試料ウェルに添加した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＭａｇＭａｘキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って組織溶解物からＲＮＡを単離した。１００μＬの溶出したＲＮＡを、磁気スタンドを使用して磁気ビーズから分離した。
ＲＮＡの収率および品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して評価した。全試料について、ｃＤＮＡを、１０μＬのＲＮＡおよび１０μＬのＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（１０ｘＲＴ緩衝剤、１０ｘランダムプライマー、２５ｘ ｄＮＴＰミックス、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ酵素、およびＲＮＡｓｅ非含有水）と共に、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して調製した。逆転写を、以下のプログラム：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分、および４℃で保持を使用して、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｂｉｏｒａｄサーマルサイクラー上で実施した。Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡをヌクレアーゼ非含有水中で１０倍希釈し、４μＬの希釈したＤＮＡを、それぞれ１０μＬのＰＣＲ反応液に添加した。各試料を、技術的４回反復においてアッセイした。カスタムＴａｑｍａｎプライマー：プローブアッセイを、この試験において使用した。２ｘＦａｓｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ）マスターミックスを、タウ／ＥＩＦ４ａ２／ＡＴＰ５ｂトリプレックスアッセイのために使用し、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を、他のアッセイのために使用した。ｑＰＣＲサイクリング条件は以下の通りであった：Ｑｉａｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘマスターミックス→９５℃で５分、９５℃で４５秒、６０℃で４５秒、プレートリード、４０サイクル；Ｂｉｏｒａｄ ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄマスターミックス→９５℃で９０秒、９５℃で１２秒、６０℃で４０秒、プレートリード、４２サイクル。
図１９Ａ～図１９Ｃに示されるように、ＩＢＡ１およびＧＦＡＰ分析により、シナプシンプロモーターを含むＡＡＶコンストラクトで処置されたいずれの霊長類においても、ミクログリアまたはアストロサイトマーカーレベルのＺＦＰ依存的上昇は示されなかった。しかしながら、ＣＭＶプロモーターを含むＡＡＶコンストラクトで処置された霊長類は、アストロサイトマーカーレベルの上昇を示した。かくして、ニューロン特異的シナプシンプロモーターを含むコンストラクトを霊長類に投与した場合、ＺＦＰ依存的神経炎症応答は観察されなかった。
さらに、図２０Ａおよび図２０Ｂに示されるように、ＩＢＡ１（図１９Ａ）またはＧＦＡＰ（図１９Ｂ）に関する大きなバルク効果は、いずれの処置群についても観察されなかった。
さらに、図２１に示されるように、ＺＦＰ ＭＡＰＴリプレッサーで処置された霊長類において、ハウスキーピング遺伝子（ＥＩＦ４Ａ２）のレベルと、ＺＦＰ発現との間に相関はなかった。ＺＦＰ発現またはタウ減少に起因する毒性はいずれも、ＺＦＰレベルが増大するにつれて、Ｅ１Ｆ４Ａ２レベルの低下に付随して起こる。
かくして、本明細書に記載の相乗的タウリプレッサーは、神経炎症応答を惹起することなく、インビボでタウを効率的に抑制する（対照と比較して最大で９０％以上）。
実施例４
タウタンパク質レベル
また、タウタンパク質レベルを、本明細書に記載のリプレッサーを受ける細胞および対象において試験した。
簡単に述べると、ニューロン（人工多能性幹細胞由来）を、上記のＡＡＶベクターによって投与し、処置された対象から採取された細胞またはパンチ中のタウタンパク質レベルを、標準的な技術を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。簡単に述べると、ヒトＩＰＳＣに由来するニューロンを、１Ｅ５ ＶＧ／細胞の用量で、単一のＺＦＰまたは相乗的６５９１８／５７８９０組合せをコードするＡＡＶ６ベクターによって投与した（ｎ＝４回反復）。細胞を３２日間培養し、標準的な技術を使用するＥＬＩＳＡによってタウタンパク質レベルについて評価した。
図２２に示されるように、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン中の、タウの総タンパク質に対する比は、本明細書に記載のタウリプレッサーで処置された細胞中で有意に低下した。特に、５７９３０リプレッサーは単独で、タウタンパク質発現を、対照と比較して５分の１未満に減少させた；５７８９０リプレッサーは単独で、タウタンパク質発現を２分の１に減少させた；６５９１８リプレッサーは単独で、タウ発現を２分の１未満に減少させた；および相乗的６５９１８－５７８９０は、タウタンパク質発現を対照と比較して１０分の１未満に減少させた。タウタンパク質レベルを、標準的なＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、上記の実施例２に記載のように処置されたヒト化タウマウスモデルのＣＳＦおよび／または脳ホモジェネートにおいても評価した。ヒトタウタンパク質の５０％の減少が、６週で、対照（媒体）と比較して、６５９１８－５７８９０相乗効果対に関して見られた。６５９１８－５７８９０対はまた、５７８９０のみを投与された動物と比較して、ヒトタウタンパク質レベルを減少させた。さらに、タウタンパク質レベルは、処置後、８～１２週間以上を含む、動物におけるより後の時点でさらに低下した。
かくして、本明細書に記載のタウリプレッサーは、インビトロおよびインビボでタウタンパク質レベルを減少させる。
この試験は、タウＺＦＰ－ＴＦ試薬が、霊長類の脳内のタウ発現を抑制する（治療レベルを含む）ことを示している。
本明細書に記載の全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は明確な理解のための実例および例としていくらか詳細に提供されてきたが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更形態および修飾形態を実行することができることが当業者には明らかであろう。したがって、前記説明および実施例は、限定と解釈されるべきではない。

Claims (16)

  1. ＭＡＰＴ発現を抑制する第１および第２の人工亜鉛フィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を含む組成物であって、
    第１の人工ＺＦＰ－ＴＦが、ｔｇＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴｇｇｃｇｇａｇａ（配列番号１）の大文字のヌクレオチドに結合し、および
    第２の人工ＺＦＰ－ＴＦが、ｃｇＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧｃＧＧＴＧＧＣｇｇｃｇｇｃｇ（配列番号２）の大文字のヌクレオチドに結合し、
    配列番号１および配列番号２に結合する第１および第２の人工ＺＦＰ－ＴＦの結合が、ＭＡＰＴ遺伝子発現の相乗的な抑制をもたらし、
    （Ａ）第２の人工ＺＦＰ－ＴＦが、（ｉ）それぞれ配列番号８から１３を含み（ｉｉ）Ｆ１およびＦ５は位置（－５）にアルギニンからグルタミンへの置換を含む６個の亜鉛フィンガー領域Ｆ１からＦ６を含むＤＮＡ結合ドメインを含む、および
    （Ｂ）第１の人工ＺＦＰ－ＴＦが、それぞれ配列番号３、４、５、６、５、および７を含む６個の亜鉛フィンガー領域Ｆ１からＦ６を含むＤＮＡ結合ドメインを含む、組成物。
  2. ＭＡＰＴ発現を抑制する第１および第２の人工亜鉛フィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）を含む組成物であって、
    第１の人工ＺＦＰ－ＴＦが、ｔｇＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴｇｇｃｇｇａｇａ（配列番号１）の大文字のヌクレオチドに結合し、および
    第２の人工ＺＦＰ－ＴＦが、ｃｇＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧｃＧＧＴＧＧＣｇｇｃｇｇｃｇ（配列番号２）の大文字のヌクレオチドに結合し、
    配列番号１および配列番号２に結合する第１および第２の人工ＺＦＰ－ＴＦの結合が、ＭＡＰＴ遺伝子発現の相乗的な抑制をもたらし、
    （Ａ）第２の人工ＺＦＰ－ＴＦが、それぞれ配列番号８から１３を含む６個の亜鉛フィンガー領域Ｆ１からＦ６を含むＤＮＡ結合ドメインを含む、および
    （Ｂ）第１の人工ＺＦＰ－ＴＦが、それぞれ配列番号３、４、５、６、５、および７を含む６個の亜鉛フィンガー領域Ｆ１からＦ６を含むＤＮＡ結合ドメインを含む、組成物。
  3. 請求項１または２に記載の第１および第２の人工ＺＦＰ－ＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のウイルスベクターを含む組成物。
  4. １つまたは複数のウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項３に記載の組成物。
  5. １つのＡＡＶベクターが、第１および第２の人工ＺＦＰ－ＴＦをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の組成物。
  6. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９ベクターである、請求項５に記載の組成物。
  7. １つまたは複数のウイルスまたはＡＡＶベクターが、ＣＭＶまたはシナプシン（ＳＹＮ）プロモーターを含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. それを必要とする対象におけるタウオパチーの防止および／または処置のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、痙攣性疾患および／または大脳皮質基底核神経節変性症を予防および／または処置するための、請求項８に記載の組成物。
  10. 第１および第２の人工ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含むＡＡＶベクターを含み、
    対象に投与されると、人工ＺＦＰ－ＴＦが対象のＣＮＳに送達される、
    請求項８または９に記載の組成物。
  11. ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９ベクターである、請求項１０に記載の組成物。
  12. ＡＡＶベクターが、静脈内に、またはＣＮＳに投与される、請求項４～７および１０～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. ＡＡＶベクターが、対象の脳の一方または両方の半球における線条体または海馬に投与される、請求項１２に記載の組成物。
  14. 第１および第２の人工ＺＦＰ－ＴＦの発現が、霊長類の対象の脳内のＭＡＰＴ遺伝子発現および／またはタウレベルを、未処置の対象と比較して５０％以上低下させる、請求項８から１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 組成物の人工転写因子が、半球あたり１ｘ１０１０～６ｘ１０１１の間のｒＡＡＶベクターゲノムで、ＣＭＶまたはＳＹＮプロモーターを含む１つまたは複数のＡＡＶベクターによって運ばれる、請求項８から１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
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