JP7344565B2 - 未分化細胞検出法 - Google Patents
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Description
本発明は、未分化細胞検出法に関する。
再生医療に用いる分化細胞集団中における未分化iPS細胞の残存/混入を検出、評価することは癌化リスクの観点から極めて重要である。これまでに、未分化iPS細胞の残存/混入を検出、評価する手法は定量PCR(qPCR)によるiPS細胞特異的遺伝子の検出法（非特許文献１）、分化細胞を未分化細胞の培養維持条件で再培養することによる方法（非特許文献２）が報告されている。
従来技術の中で、再培養法は、混入する未分化iPS細胞からコロニーを形成させるため正確性が高いという利点が有る一方、検出までに1週間以上かかることから、定量PCRを用いた方法が簡便・迅速に実施可能な点で優れている。
しかしながら、これまでに報告のあるLIN28（非特許文献１）は発現の低い臓器/組織の分化細胞（網膜色素上皮細胞）が有る一方で、肝細胞などの分化細胞やiPS細胞から分化誘導した細胞では発現が見られることから、様々な分化細胞を対象にした未分化iPS細胞の残存/混入の検出には利用できないという課題が有った。
PLoS One. 2014 27;9(10):e110496.
PLoS One. 2012;7(5):e37342.
本発明は、網膜色素上皮細胞以外の分化細胞を対象とした場合にも、未分化細胞の残存/混入を検出可能なマーカー遺伝子を提供することを目的とする。
本発明者らは、様々な分化細胞を対象とし、普遍的に未分化iPS細胞の残存/混入を検出可能なマーカー遺伝子の同定を行った。
マーカー遺伝子に必要な要件として、
１. 未分化iPS細胞で特異的に発現している。
２. 未分化iPS細胞以外の他の細胞系譜での発現が極めて低いこと。
というだけでは不十分で、これに加え
３. 未分化iPS細胞で極めて高く発現していることが、分化細胞中にごく少数存在しても検出可能にするために必要であることを基準とした。
１. 未分化iPS細胞で特異的に発現している。
２. 未分化iPS細胞以外の他の細胞系譜での発現が極めて低いこと。
というだけでは不十分で、これに加え
３. 未分化iPS細胞で極めて高く発現していることが、分化細胞中にごく少数存在しても検出可能にするために必要であることを基準とした。
そこで、この基準を満たす未分化iPS細胞に高発現し、分化した内胚葉細胞において発現が0.1%以下となる遺伝子としてESRG, SFRP2, VSNL1, THY1, SPP1, USP44及びCNMD（LECT1）を見出した。これら遺伝子を用いることで、従来の指標では評価不可能であった臓器/組織の分化細胞に対して、未分化iPS細胞の残存/混入を0.005%まで検出することが可能となった。さらにこれらのマーカー遺伝子は中胚葉、および外胚葉へ分化した細胞においても発現が0.1%以下となることから、内胚葉、中胚葉、外胚葉のいずれの分化細胞においても、未分化iPS細胞の残存/混入を検出可能なマーカーであると考えられる。
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）分化細胞集団における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
（２）未分化細胞が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)であり、分化細胞集団が前記未分化細胞から分化した細胞の集団である（１）記載の方法。
（３）分化細胞集団が、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞の集団である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）内胚葉の分化細胞が、肝内胚葉細胞である（３）記載の方法。
（５）中胚葉の分化細胞が、横中隔間充織細胞、間葉系細胞又は血管内皮細胞である（３）記載の方法。
（６）外胚葉の分化細胞が、神経幹細胞、神経堤細胞又は神経細胞である（３）記載の方法。
（７）遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）遺伝子の発現レベルをqPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry又は質量分析で測定する（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することによって、安全性の高い未分化細胞株を選別する方法。
（１０）未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はiPSC）株又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)株である（９）記載の方法。
（１１）未分化細胞株がｉＰＳ細胞株である（１０）記載の方法。
（１２）分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
（１３）分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するために、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。
（１４）ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出可能な試薬及び／又はプロモーター活性を測定可能な試薬を含む、未分化細胞を検出するためのキット。
（１５）遺伝子の発現を検出可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である（１４）記載のキット。
（１６）遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである（１４）記載のキット。
（１）分化細胞集団における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
（２）未分化細胞が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)であり、分化細胞集団が前記未分化細胞から分化した細胞の集団である（１）記載の方法。
（３）分化細胞集団が、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞の集団である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）内胚葉の分化細胞が、肝内胚葉細胞である（３）記載の方法。
（５）中胚葉の分化細胞が、横中隔間充織細胞、間葉系細胞又は血管内皮細胞である（３）記載の方法。
（６）外胚葉の分化細胞が、神経幹細胞、神経堤細胞又は神経細胞である（３）記載の方法。
（７）遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）遺伝子の発現レベルをqPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry又は質量分析で測定する（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することによって、安全性の高い未分化細胞株を選別する方法。
（１０）未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はiPSC）株又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)株である（９）記載の方法。
（１１）未分化細胞株がｉＰＳ細胞株である（１０）記載の方法。
（１２）分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。
（１３）分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するために、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。
（１４）ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出可能な試薬及び／又はプロモーター活性を測定可能な試薬を含む、未分化細胞を検出するためのキット。
（１５）遺伝子の発現を検出可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である（１４）記載のキット。
（１６）遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである（１４）記載のキット。
本発明により、分化細胞集団中における未分化細胞の残存／混入を検出、評価することができ、再生医療に用いる分化細胞の癌化リスクを低減することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018‐115025の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018‐115025の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、分化細胞集団における、ESRG ( HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC) Official Full Name: embryonic stem cell related; NCBI Reference Sequence: NR_027122.1など)、VSNL1(HGNC Official Full Name : visinin like 1; NCBI RefSeq: NM_003385.4など)、THY1(HGNC Official Full Name : Thy-1 cell surface antigen; NCBI RefSeq: NM_001311160.1など)、SFRP2(HGNC Official Full Name : secreted frizzled related protein 2; NCBI RefSeq: NM_003013.2 )、SPP1(HGNC Official Full Name : secreted phosphoprotein 1; NCBI RefSeq: NM_000582.2)、USP44(HGNC Official Full Name : ubiquitin specific peptidase 44 ; NCBI RefSeq: NM_001042403.2 )及びCNMD(HGNC Official Full Name : chondromodulin ; NCBI RefSeq: NM_001011705.1)よりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法を提供する。
検出の対象とする未分化細胞は、多能性を有する細胞であるとよく、例えば、未分化細胞は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞(EG細胞)である。
分化細胞集団を構成する細胞は、未分化細胞以外の細胞であればよく、多能性を有さないことが好ましく、例えば、検出の対象とする未分化細胞から分化した細胞である。
分化細胞集団は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉のいずれの分化細胞の集団であってもよい。
分化細胞集団を構成する細胞が内胚葉細胞又は内胚葉由来の細胞などの内胚葉の分化細胞である場合、好ましいマーカー遺伝子は、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDであり、分化細胞集団を構成する細胞が中胚葉細胞又は中胚葉由来の細胞などの中胚葉の分化細胞である場合、好ましいマーカー遺伝子は、ESRG、SFRP2及びCNMDであり、分化細胞集団を構成する細胞が外胚葉細胞又は外胚葉由来の細胞などの外胚葉の分化細胞である場合、好ましいマーカー遺伝子は、ESRG及びCNMDである。
内胚葉の分化細胞としては、肝内胚葉細胞などを例示することができるが、これに限定されるわけではない。
後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した肝内胚葉細胞（分化細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出した。この肝内胚葉細胞は、iPS細胞より肝細胞への分化誘導処理を行ってから10日目のiPSC‐HE（Hepatic Endoderm）（Nature 499:481-484 (2013); 特許第6124348号「組織及び臓器の作製方法」）と呼ばれる肝前駆細胞である。qPCRによる測定によれば、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDは、肝内胚葉細胞集団中のiPS細胞の検出に有効なマーカー遺伝子であると思われる。
中胚葉の分化細胞としては、横中隔間充織細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した間葉系細胞（分化細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出した。この間葉系細胞は、iPS細胞より間葉系細胞への分化誘導処理を行ったiPSC-STM/MC（iPS細胞由来横中隔間充織細胞／iPS細胞由来間葉系細胞(septum transversum mesenchyme /mesenchymal cells)）（Cell Rep. 21:2661-2670.(2017)）と呼ばれる間葉系幹／前駆細胞（中胚葉由来の細胞）であり、CD166陽性であり血管内皮のマーカーであるCD31（PECAM1）を発現しない細胞である。qPCRによる測定によれば、ESRG、SFRP2及びCNMDは、間葉系細胞集団中のiPS細胞の検出に有効なマーカー遺伝子であると思われる。
また、後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した血管内皮細胞（分化細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出した。この血管内皮細胞は、iPS細胞より血管内皮細胞への分化誘導処理を行ったiPSC-EC（iPS細胞由来血管内皮細胞(endothelial cells)）（Cell Rep. 21:2661-2670.(2017)）と呼ばれる血管内皮前駆細胞（中胚葉由来の細胞）であり、血管内皮のマーカーであるCD31（PECAM1）、CD144のタンパクの発現が免疫染色法で確認でき、遺伝子発現解析ではPECAM1、CDH5、KDR、CD34などの血管内皮マーカーの発現が高く見られ、分化誘導前のiPS細胞と比較して10倍から100倍以上の発現が見られるものである。qPCRによる測定によれば、ESRG、SFRP2及びCNMDは、血管内皮細胞集団中のiPS細胞の検出に有効なマーカー遺伝子であると思われる。
外胚葉の分化細胞としては、神経幹細胞、神経堤細胞、神経細胞などを例示することができるが、これに限定されるわけではない。
後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した神経幹細胞（分化細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出した。この神経幹細胞は、iPS細胞より神経幹細胞への分化誘導処理を行ったNSC（iPS細胞由来神経幹細胞（Neural stem cells））（Stem Cell Reports. 5:1010-1022. (2015)）と呼ばれる神経幹細胞（外胚葉由来の細胞）である。qPCRによる測定によれば、ESRG及びCNMDは、神経幹細胞集団中のiPS細胞の検出に有効なマーカー遺伝子であると思われる。
また、後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した神経細胞（Imaizumi et al, Stem Cell Reports, 5:1-13, 2015）（外胚葉由来の細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出した。qPCRによる測定によれば、ESRG及びCNMDは、神経細胞集団中のiPS細胞の検出に有効なマーカー遺伝子であると思われる。
さらに、後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した神経堤細胞（Menendez L. et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 108(48):19240-5. 2011）（外胚葉由来の細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出したところ、同様の結果が得られた。
また、後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した神経細胞（Imaizumi et al, Stem Cell Reports, 5:1-13, 2015）（外胚葉由来の細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出した。qPCRによる測定によれば、ESRG及びCNMDは、神経細胞集団中のiPS細胞の検出に有効なマーカー遺伝子であると思われる。
さらに、後述の実施例では、iPS細胞から分化誘導した神経堤細胞（Menendez L. et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 108(48):19240-5. 2011）（外胚葉由来の細胞）の集団中に混入させたiPS細胞（未分化細胞）を検出したところ、同様の結果が得られた。
また、後述の実施例では、STEMdiff Trilineage Differentiation Kit（STEMCELL Technologies 社)を用いて三胚葉由来のそれぞれに分化誘導した細胞におけるマーカー遺伝子の発現もqPCRにより検出した。
本発明において、分化細胞及び未分化細胞は、ヒトあるいはヒト以外のいかなる動物に由来するものであってもよい。
遺伝子の発現レベルは、遺伝子から転写されたmRNAの量あるいはmRNAから翻訳されたタンパク質の量として測定することができる。具体的には、遺伝子の発現レベルは、qPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry、質量分析などで測定することができる。
ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が確認された場合、その分化細胞集団中には未分化細胞が存在すると判定することができる（未分化細胞の検出）。
本明細書において、「検出」とは、存在が確認されることをいうが、「検出」には、非存在の確認も含まれる。
本発明の方法により、0.1%以下の検出感度、例えば、0.025%, 0.01%, 場合によっては、0.005%, 0.0025%の検出感度で、分化細胞集団中の未分化細胞を検出しうる。検出感度は、後述の実施例に記載のスパイク試験により調べることができる。
未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することにより、安全性の高い未分化細胞株を選別することも可能となる。よって、本発明は、未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することによって、分化誘導後に未分化細胞が残存しにくい、安全性の高い未分化細胞株を選別する方法を提供する。
選別の対象とする未分化細胞株は、多能性を有する細胞株であるとよく、例えば、未分化細胞株は、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）株、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞)株であり、ｉＰＳ細胞株が好ましい。
また、分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定して、その組織における未分化細胞を検出してもよい。よって、本発明は、分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル及び／又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法も提供する。組織は、分化細胞をモデル動物へ長期間（例えば、４～５４週間、好ましくは、８～２４週間）移植して形成されたものであるとよい。
本発明により、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDは、分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するためのマーカー遺伝子として使用できることが明らかとなった。よって、本発明は、分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するために、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法を提供する。
また、本発明は、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出可能な試薬及び／又はプロモーター活性を測定可能な試薬を含む、未分化細胞を検出するためのキットを提供する。
遺伝子の発現を検出可能な試薬としては、プライマー、プローブ及び抗体などを挙げることができ、例えば、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAを特異的に増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーのセット、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAに特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）から翻訳されたタンパク（翻訳産物）に特異的に結合する抗体である。オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAのヌクレオチド配列中の標的配列（通常、５０～１８０ｂｐ程度）を増幅できるものであるとよく、標的配列の両末端と相補的な配列を有するように設計されるとよい。オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、例えば、１５～３５ヌクレオチドであるとよく、１８～２７ヌクレオチドが好ましい。ヌクレオチドプローブは、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物（mRNA）又はcDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであるとよく、前記mRNA又はcDNAのヌクレオチド配列の一部又は全部又はそれに相補的な配列を有するように設計されるとよい。ストリンジェントな条件は適宜決定することができる。ヌクレオチドプローブの長さは、通常１０００ヌクレオチド以下、好ましくは、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは、１４～３０ヌクレオチドである。ヌクレオチドプローブは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本明細書において、抗体とは、全長抗体の他、Fab、F(ab)’2、ScFv、Diabody、VH、VL、Sc(Fv)2、Bispecific sc(Fv)2、Minibody、ScFv-Fc monomer、ScFv-Fc dimerなどの低分子化されたものも含む概念である。プローブや抗体は、固相（例えば、基板、ビーズ、膜など）上に固定されていてもよい。
本発明の試薬は標識されてもよい。例えば、プライマーは、蛍光物質や消光物質などにより標識されていてもよく、プローブ及び抗体は、放射性同位元素、酵素、発光物質、蛍光物質、ビオチンなどで標識されてもよい。また、ターゲット分子（本発明では、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現産物であるタンパク）に特異的に結合する一次抗体の反応後、この一次抗体に結合する二次抗体を反応させて、ターゲット分子の検出を行う場合には、二次抗体を標識するとよい（一次抗体は標識しない）。
遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬としては、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターなどを挙げることができる。レポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、GFPなどの蛍光タンパク質、CD抗原などの細胞膜に発現するタンパク質などを例示することができる。ベクターはプラスミドベクターが好ましい。
本発明のキットは、さらに、プライマーで検出するための試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、マグネシウムイオン、ｄＮＴＰｓ、プローブなど）、プローブで検出するための試薬（バッファー、抗体、基質など）、抗体で検出するための試薬（二次抗体、基質、バッファーなど）、遺伝子のプロモーター活性を測定するための試薬（バッファー、発光基質、抗体など）、器具（反応容器、ピペットなど）、キットの使用説明書、対照用の試料、測定結果を解析するための対照データなどを含んでもよい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
Materials and Methods
●iPSC
京都大学および東京大学から提供されたものを使用した（TkDA3-4,1231A3,1383D2,1383D6およびFf01）。
●中胚葉細胞（Mesoderm）分化
未分化iPSCをラミニンコートディッシュにROCK阻害剤（Y-27632）存在下で1～2x10^4 cells/cm2の密度で播種し、DMEM F12+B27+CHIR+BMP4存在下で4日間培養し、この細胞を中胚葉細胞(Mesoderm)とした。
●外胚葉細胞（Ectoderm）分化
未分化iPSCをラミニンコートディッシュにROCK阻害剤（Y-27632）存在下で1x10^5 cells/cm2の密度で播種し、DMEM F12+KSR+2-ME+ EGF+2 bFGF+SB431542+BIO存在下で7日間培養し、この細胞を外胚葉細胞(Ectoderm)とした。あるいはKBM-NSC+B27+bFGF+ hLIF+CHIR99021+SB431542存在下で7日間培養しても外胚葉細胞(Ectoderm)が得られる。
●未分化残存
iPSCから分化させた細胞中に残存している未分化細胞を定量するため、我々はTano et al.の方法を応用した。簡潔にまとめると、まず分化させた細胞をトリプシンを用いて剥がし、24-well plateにおいてROCK inhibitor入りStemFit中に1.6x10^5 cells/wellで播種後、毎日StemFitで培地交換しながら37℃で培養した。一週間後、免疫染色を行い、ポジティブなコロニーの数をカウントした。
●コロニーカウント
免疫染色したサンプルを顕微鏡で写真撮影し、撮影した写真について目視でコロニー数を数えた。未分化iPSCコロニー１コロニーを１つの未分化iPS細胞由来として残存未分化iPS細胞数とした。
●Hepatocyte分化
未分化iPS細胞をラミニンコートディッシュにROCK阻害剤（Y-27632）存在下で５~10x10^4 cells/cm2の密度で播種し、RPMI＋B２７＋アクチビンA+Wnt3A存在下で6日間培養し、この細胞を胚体内胚葉細胞(DE)とした。さらにKO-DMEM＋KSR＋DMSO＋2-Mercaptoethanol存在下で4日間培養し肝内胚葉細胞（HE)とした。
●免疫染色
未分化細胞を検出するため、多能性マーカーの一次抗体SOX2, TRA-1-60 (Cell Signaling Technologies)とそれに対応する二次抗体(Thermo Fisher Scientific)を用いて免疫染色を行った。4%パラホルムアルデヒドを15分間処理することで細胞を固定した。PBSで2回洗浄後、0.1% TritonX-100 in PBS (PBST)を加えて10分間処理することで細胞膜を透過させた。その後5% FBS in PBSTを用いてブロッキング処理した。1時間後ブロッキングバッファーを取り除き、適切に希釈した一次抗体溶液を添加して4℃でovernight処理した。その後PBSで3回洗浄し、希釈した二次抗体溶液を添加して遮光下室温で1時間静置した。最後にPBSで3回洗浄し、アパチ封入剤（和光純薬）を添加して観察に用いた。
●顕微鏡（キーエンスなど）
オールインワン蛍光顕微鏡 BZ-X710にて明視野、青色蛍光、緑色蛍光、赤色蛍光を対物レンズ4倍、10倍で1well全体を撮影した。
●qPCR
細胞よりPureLink RNA Mini Kit(Thermo FIsher)を用いてRNA抽出を行い、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher)を用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、下記のプライマーおよびUniversal Probe Library(Roche)を用いてqPCRを行った。
ESRG
Forward: tgggatggagccatagaagt（配列番号１）
Reverse: tgggtctttcaagaagttcctc（配列番号２）
Probe: #52
VSNL1
Forward: gaactgttgagttttatcattttcgt（配列番号３）
Reverse: caggggccagtttgctatt（配列番号４）
Probe: #60
THY1
Forward: cagaacgtcacagtgctcaga（配列番号５）
Reverse: gaggagggagagggagagc（配列番号６）
Probe: #66
SFRP2
Forward: gctagcagcgaccacctc（配列番号７）
Reverse: tttttgcaggcttcacatacc（配列番号８）
Probe: #83
SPP1
Forward: gagggcttggttgtcagc（配列番号９）
Reverse: caattctcatggtagtgagttttcc（配列番号１０）
Probe: #18
USP44
Forward: ccctcagaccagaatgcttta（配列番号１１）
Reverse: cattgcagtgtacccagaacc（配列番号１２）
Probe: #9
LECT1(CNMD)
Forward: actcacaagccttcaatcctg（配列番号１３）
Reverse: tctagggtcgaatgtcatgct（配列番号１４）
Probe: #18
●スパイク実験
分化誘導した細胞に対して、未分化維持培養しているiPS細胞を図に記載の比率で混入し、未分化残存試験、qPCR等を実施した。
●統計
Student's t検定によりp値0.05以下を有意差有りとした。相関係数はピアソンの積相関係数に基づき算出した。
〔実施例１〕
Materials and Methods
●iPSC
京都大学および東京大学から提供されたものを使用した（TkDA3-4,1231A3,1383D2,1383D6およびFf01）。
●中胚葉細胞（Mesoderm）分化
未分化iPSCをラミニンコートディッシュにROCK阻害剤（Y-27632）存在下で1～2x10^4 cells/cm2の密度で播種し、DMEM F12+B27+CHIR+BMP4存在下で4日間培養し、この細胞を中胚葉細胞(Mesoderm)とした。
●外胚葉細胞（Ectoderm）分化
未分化iPSCをラミニンコートディッシュにROCK阻害剤（Y-27632）存在下で1x10^5 cells/cm2の密度で播種し、DMEM F12+KSR+2-ME+ EGF+2 bFGF+SB431542+BIO存在下で7日間培養し、この細胞を外胚葉細胞(Ectoderm)とした。あるいはKBM-NSC+B27+bFGF+ hLIF+CHIR99021+SB431542存在下で7日間培養しても外胚葉細胞(Ectoderm)が得られる。
●未分化残存
iPSCから分化させた細胞中に残存している未分化細胞を定量するため、我々はTano et al.の方法を応用した。簡潔にまとめると、まず分化させた細胞をトリプシンを用いて剥がし、24-well plateにおいてROCK inhibitor入りStemFit中に1.6x10^5 cells/wellで播種後、毎日StemFitで培地交換しながら37℃で培養した。一週間後、免疫染色を行い、ポジティブなコロニーの数をカウントした。
●コロニーカウント
免疫染色したサンプルを顕微鏡で写真撮影し、撮影した写真について目視でコロニー数を数えた。未分化iPSCコロニー１コロニーを１つの未分化iPS細胞由来として残存未分化iPS細胞数とした。
●Hepatocyte分化
未分化iPS細胞をラミニンコートディッシュにROCK阻害剤（Y-27632）存在下で５~10x10^4 cells/cm2の密度で播種し、RPMI＋B２７＋アクチビンA+Wnt3A存在下で6日間培養し、この細胞を胚体内胚葉細胞(DE)とした。さらにKO-DMEM＋KSR＋DMSO＋2-Mercaptoethanol存在下で4日間培養し肝内胚葉細胞（HE)とした。
●免疫染色
未分化細胞を検出するため、多能性マーカーの一次抗体SOX2, TRA-1-60 (Cell Signaling Technologies)とそれに対応する二次抗体(Thermo Fisher Scientific)を用いて免疫染色を行った。4%パラホルムアルデヒドを15分間処理することで細胞を固定した。PBSで2回洗浄後、0.1% TritonX-100 in PBS (PBST)を加えて10分間処理することで細胞膜を透過させた。その後5% FBS in PBSTを用いてブロッキング処理した。1時間後ブロッキングバッファーを取り除き、適切に希釈した一次抗体溶液を添加して4℃でovernight処理した。その後PBSで3回洗浄し、希釈した二次抗体溶液を添加して遮光下室温で1時間静置した。最後にPBSで3回洗浄し、アパチ封入剤（和光純薬）を添加して観察に用いた。
●顕微鏡（キーエンスなど）
オールインワン蛍光顕微鏡 BZ-X710にて明視野、青色蛍光、緑色蛍光、赤色蛍光を対物レンズ4倍、10倍で1well全体を撮影した。
●qPCR
細胞よりPureLink RNA Mini Kit(Thermo FIsher)を用いてRNA抽出を行い、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher)を用いて逆転写反応によりcDNAを合成し、下記のプライマーおよびUniversal Probe Library(Roche)を用いてqPCRを行った。
ESRG
Forward: tgggatggagccatagaagt（配列番号１）
Reverse: tgggtctttcaagaagttcctc（配列番号２）
Probe: #52
VSNL1
Forward: gaactgttgagttttatcattttcgt（配列番号３）
Reverse: caggggccagtttgctatt（配列番号４）
Probe: #60
THY1
Forward: cagaacgtcacagtgctcaga（配列番号５）
Reverse: gaggagggagagggagagc（配列番号６）
Probe: #66
SFRP2
Forward: gctagcagcgaccacctc（配列番号７）
Reverse: tttttgcaggcttcacatacc（配列番号８）
Probe: #83
SPP1
Forward: gagggcttggttgtcagc（配列番号９）
Reverse: caattctcatggtagtgagttttcc（配列番号１０）
Probe: #18
USP44
Forward: ccctcagaccagaatgcttta（配列番号１１）
Reverse: cattgcagtgtacccagaacc（配列番号１２）
Probe: #9
LECT1(CNMD)
Forward: actcacaagccttcaatcctg（配列番号１３）
Reverse: tctagggtcgaatgtcatgct（配列番号１４）
Probe: #18
●スパイク実験
分化誘導した細胞に対して、未分化維持培養しているiPS細胞を図に記載の比率で混入し、未分化残存試験、qPCR等を実施した。
●統計
Student's t検定によりp値0.05以下を有意差有りとした。相関係数はピアソンの積相関係数に基づき算出した。
Results
・肝臓ではLIN28は未分化iPSCの指標とならない。
LIN28(LIN28A)遺伝子はiPSCから網膜色素上皮細胞(RPE)を分化誘導した際の残存未分化iPSCの指標となることが報告されている(Kuroda T. et al., PLoS ONE 7(5):e37342.(2012)）。マウス発生段階の肝臓でのLIN28Aの発現を見ると、成体(8w)と比べE13.5まで発現が高いことが明らかとなった(図１)。内胚葉細胞であるiPS細胞由来の胚体内胚葉細胞(DE)および肝内胚葉細胞(HE)においても未分化iPS細胞と比べほとんど減少が見られないことが明らかとなった(図２）。
・iPS細胞で特異的に高発現する遺伝子の抽出
iPS細胞由来肝細胞において利用可能な残存未分化iPSCの指標となるマーカー遺伝子の抽出を目的に、マウス発生段階のマイクロアレイ解析およびiPS細胞由来肝細胞の分化誘導過程のシングルセルRNAシークエンス解析を実施し、未分化iPS細胞で特異的かつ高発現しており、分化細胞において発現が低い遺伝子を複数抽出した。抽出した遺伝子についてqPCRによりiPS細胞で発現が高く、分化細胞で発現が低下する遺伝子を抽出した(図３)。
・未分化コロニー形成による未分化細胞残存の定量
図３において抽出したマーカー遺伝子の発現が実際の未分化iPS細胞の残存数と相関するか否か検討する目的で、まず、文献情報(Tano K et al., PLoS One. 2014 ;9(10):e110496)に基づき、未分化iPS細胞の残存数の評価手法の最適化を実施した(図４、５）。分化誘導したiPS細胞由来肝前駆細胞(HE)をもちいて、図4,5で最適化した条件により未分化残像試験を実施し、残存未分化細胞数を算出し、qPCRでのマーカー遺伝子発現との相関解析を行った（図６）。新規残存未分化hiPSCマーカー発現量は未分化hiPSC混入率と高い相関を示した。
・各マーカー遺伝子の検出限界の検討（未分化iPSCスパイク試験）
分化誘導したiPS細胞由来肝前駆細胞(HE)に対して、未分化維持培養しているiPS細胞を記載の比率で混入し、qPCRを実施した（図７）。その結果、従来法(LIN28A)と比べ１０００倍以上の検出感度を達成した。
・中胚葉、外胚葉の分化細胞における未分化残存試験
中胚葉由来の細胞として、iPS細胞より分化誘導した横中隔間充織細胞(iPSC-STM)および血管内皮細胞(iPSC-EC)における未分化iPS細胞の残存試験及びqPCRを用いたマーカー遺伝子の発現を検討した。iPSC-STMおよびiPSC-ECどちらにおいてもESRG、SFRP2及びCNMDが未分化細胞が残存していない分化細胞において減少しており、残存未分化マーカーとして使用できると考えられた(図８，９)。外胚葉由来の細胞として、iPS細胞より分化誘導した神経幹細胞(iPSC-NSC)及び神経細胞（Neuron）における未分化iPS細胞の残存試験及びqPCRを用いたマーカー遺伝子の発現を検討した。iPSC-NSC及びNeuronにおいてESRG及びCNMDが未分化細胞が残存していない分化細胞において減少しており、残存未分化マーカーとして使用できると考えられた(図10)。一方で、LIN28Aの発現は低下しなかったことから、iPS細胞由来神経幹細胞及び神経細胞（Neuron）においても残存未分化細胞とLIN28Aの発現に相関が無いことが明らかとなった。iPS細胞より分化誘導した神経堤細胞（NCC）のqPCRによる測定でも、同様の結果が得られた（図11）。
・STEMdiffTM Trilineage Differentiation Kitにより作製した分化細胞における未分化残存試験
さらに汎用的にiPS細胞由来の分化誘導細胞における残存未分化細胞のマーカーとなることを示すために、市販の分化誘導キット（Stem Cell Technologies社STEMdiff Trilineage Differentiation Kit）を用いて分化誘導した細胞を用いて検討した(図12)。その結果、iPS細胞より分化誘導した内胚葉由来細胞では残存未分化細胞が観察されたが、マーカー遺伝子発現も残存数に相関して高かった。したがって、iPS細胞より分化誘導した内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞のいずれの細胞系譜においても残存未分化細胞数とマーカー発現の相関が見られた(図13, 14）。
・肝臓ではLIN28は未分化iPSCの指標とならない。
LIN28(LIN28A)遺伝子はiPSCから網膜色素上皮細胞(RPE)を分化誘導した際の残存未分化iPSCの指標となることが報告されている(Kuroda T. et al., PLoS ONE 7(5):e37342.(2012)）。マウス発生段階の肝臓でのLIN28Aの発現を見ると、成体(8w)と比べE13.5まで発現が高いことが明らかとなった(図１)。内胚葉細胞であるiPS細胞由来の胚体内胚葉細胞(DE)および肝内胚葉細胞(HE)においても未分化iPS細胞と比べほとんど減少が見られないことが明らかとなった(図２）。
・iPS細胞で特異的に高発現する遺伝子の抽出
iPS細胞由来肝細胞において利用可能な残存未分化iPSCの指標となるマーカー遺伝子の抽出を目的に、マウス発生段階のマイクロアレイ解析およびiPS細胞由来肝細胞の分化誘導過程のシングルセルRNAシークエンス解析を実施し、未分化iPS細胞で特異的かつ高発現しており、分化細胞において発現が低い遺伝子を複数抽出した。抽出した遺伝子についてqPCRによりiPS細胞で発現が高く、分化細胞で発現が低下する遺伝子を抽出した(図３)。
・未分化コロニー形成による未分化細胞残存の定量
図３において抽出したマーカー遺伝子の発現が実際の未分化iPS細胞の残存数と相関するか否か検討する目的で、まず、文献情報(Tano K et al., PLoS One. 2014 ;9(10):e110496)に基づき、未分化iPS細胞の残存数の評価手法の最適化を実施した(図４、５）。分化誘導したiPS細胞由来肝前駆細胞(HE)をもちいて、図4,5で最適化した条件により未分化残像試験を実施し、残存未分化細胞数を算出し、qPCRでのマーカー遺伝子発現との相関解析を行った（図６）。新規残存未分化hiPSCマーカー発現量は未分化hiPSC混入率と高い相関を示した。
・各マーカー遺伝子の検出限界の検討（未分化iPSCスパイク試験）
分化誘導したiPS細胞由来肝前駆細胞(HE)に対して、未分化維持培養しているiPS細胞を記載の比率で混入し、qPCRを実施した（図７）。その結果、従来法(LIN28A)と比べ１０００倍以上の検出感度を達成した。
・中胚葉、外胚葉の分化細胞における未分化残存試験
中胚葉由来の細胞として、iPS細胞より分化誘導した横中隔間充織細胞(iPSC-STM)および血管内皮細胞(iPSC-EC)における未分化iPS細胞の残存試験及びqPCRを用いたマーカー遺伝子の発現を検討した。iPSC-STMおよびiPSC-ECどちらにおいてもESRG、SFRP2及びCNMDが未分化細胞が残存していない分化細胞において減少しており、残存未分化マーカーとして使用できると考えられた(図８，９)。外胚葉由来の細胞として、iPS細胞より分化誘導した神経幹細胞(iPSC-NSC)及び神経細胞（Neuron）における未分化iPS細胞の残存試験及びqPCRを用いたマーカー遺伝子の発現を検討した。iPSC-NSC及びNeuronにおいてESRG及びCNMDが未分化細胞が残存していない分化細胞において減少しており、残存未分化マーカーとして使用できると考えられた(図10)。一方で、LIN28Aの発現は低下しなかったことから、iPS細胞由来神経幹細胞及び神経細胞（Neuron）においても残存未分化細胞とLIN28Aの発現に相関が無いことが明らかとなった。iPS細胞より分化誘導した神経堤細胞（NCC）のqPCRによる測定でも、同様の結果が得られた（図11）。
・STEMdiffTM Trilineage Differentiation Kitにより作製した分化細胞における未分化残存試験
さらに汎用的にiPS細胞由来の分化誘導細胞における残存未分化細胞のマーカーとなることを示すために、市販の分化誘導キット（Stem Cell Technologies社STEMdiff Trilineage Differentiation Kit）を用いて分化誘導した細胞を用いて検討した(図12)。その結果、iPS細胞より分化誘導した内胚葉由来細胞では残存未分化細胞が観察されたが、マーカー遺伝子発現も残存数に相関して高かった。したがって、iPS細胞より分化誘導した内胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞のいずれの細胞系譜においても残存未分化細胞数とマーカー発現の相関が見られた(図13, 14）。
Discussion
再生医療応用に資するiPS(ES)細胞由来分化細胞における未分化細胞の混入の検出および排除は、すべてのiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保における重要な課題である。これまでに網膜色素上皮細胞(RPE)におけるLIN28Aの発現検証による迅速な未分化細胞の混入評価が報告されているが、肝臓においてはマウス発生過程においてLIN28Aが発現しており、実際にヒトiPS細胞から分化誘導した細胞においてもLIN28Aの発現が観察され、またこの発現が実際に分化細胞中に残存する未分化細胞の有無と相関しないことが明らかとなった。そこで、iPS細胞由来肝細胞における残存未分化細胞のマーカーを複数抽出した。これらのマーカーは内胚葉由来細胞である肝細胞だけでなく、iPS細胞より分化誘導した中胚葉細胞、中胚葉由来の横中隔間充織細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞においても残存未分化細胞の指標となることが明らかとなった。さらに、iPS細胞より分化誘導した外胚葉細胞、外胚葉由来の神経幹細胞、神経堤細胞、神経細胞においても残存未分化細胞と発現が相関するマーカーが含まれることが明らかとなった。一方で、LIN28Aの発現は低下しなかったことから、iPS細胞由来神経幹細胞においてもLIN28Aが残存未分化細胞の指標とならないことが明らかとなった。以上のことから、今回抽出した複数のマーカー遺伝子を用いた残存未分化iPS細胞の検出手法が、様々なiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保のための簡便・迅速なツールとなると期待される。
再生医療応用に資するiPS(ES)細胞由来分化細胞における未分化細胞の混入の検出および排除は、すべてのiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保における重要な課題である。これまでに網膜色素上皮細胞(RPE)におけるLIN28Aの発現検証による迅速な未分化細胞の混入評価が報告されているが、肝臓においてはマウス発生過程においてLIN28Aが発現しており、実際にヒトiPS細胞から分化誘導した細胞においてもLIN28Aの発現が観察され、またこの発現が実際に分化細胞中に残存する未分化細胞の有無と相関しないことが明らかとなった。そこで、iPS細胞由来肝細胞における残存未分化細胞のマーカーを複数抽出した。これらのマーカーは内胚葉由来細胞である肝細胞だけでなく、iPS細胞より分化誘導した中胚葉細胞、中胚葉由来の横中隔間充織細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞においても残存未分化細胞の指標となることが明らかとなった。さらに、iPS細胞より分化誘導した外胚葉細胞、外胚葉由来の神経幹細胞、神経堤細胞、神経細胞においても残存未分化細胞と発現が相関するマーカーが含まれることが明らかとなった。一方で、LIN28Aの発現は低下しなかったことから、iPS細胞由来神経幹細胞においてもLIN28Aが残存未分化細胞の指標とならないことが明らかとなった。以上のことから、今回抽出した複数のマーカー遺伝子を用いた残存未分化iPS細胞の検出手法が、様々なiPS(ES)細胞由来細胞加工製品の安全性の確保のための簡便・迅速なツールとなると期待される。
References:
・Kuroda T. et al., PLoS ONE 7(5):e37342.(2012)
・Tano et al., PLoS One. 2014 27;9(10):e110496.
・Kuroda T. et al., PLoS ONE 7(5):e37342.(2012)
・Tano et al., PLoS One. 2014 27;9(10):e110496.
〔実施例２〕
本発明のマーカー遺伝子の発現制御に関わるプロモーター領域の制御下にレポータータンパク質遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子、あるいはマウスCD4遺伝子など細胞表面に発現し抗体等を用いて特異的に発現検出可能な遺伝子など)を組み込むことにより、本発明のマーカー遺伝子の発現を直接検出しなくても残存する未分化細胞を検出することが可能となる。
本発明のマーカー遺伝子の発現制御に関わるプロモーター領域の制御下にレポータータンパク質遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子、あるいはマウスCD4遺伝子など細胞表面に発現し抗体等を用いて特異的に発現検出可能な遺伝子など)を組み込むことにより、本発明のマーカー遺伝子の発現を直接検出しなくても残存する未分化細胞を検出することが可能となる。
〔実施例３〕
複数のiPS細胞株について目的の細胞および、3胚葉分化誘導キットなどを用いて分化誘導した細胞について本発明のマーカー遺伝子の発現を評価し、マーカー遺伝子の発現が低くなるiPS細胞株を選別することによって安全性が高い未分化細胞株を選別することが可能となる。
複数のiPS細胞株について目的の細胞および、3胚葉分化誘導キットなどを用いて分化誘導した細胞について本発明のマーカー遺伝子の発現を評価し、マーカー遺伝子の発現が低くなるiPS細胞株を選別することによって安全性が高い未分化細胞株を選別することが可能となる。
〔実施例４〕
分化細胞をモデル動物へ長期移植して生着している細胞を採取し、本発明のマーカー遺伝子の発現をqPCR等により検出あるいは〔実施例2〕に記載の方法によって検出することにより、形成された組織における未分化細胞を検出する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
分化細胞をモデル動物へ長期移植して生着している細胞を採取し、本発明のマーカー遺伝子の発現をqPCR等により検出あるいは〔実施例2〕に記載の方法によって検出することにより、形成された組織における未分化細胞を検出する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本発明は、再生医療に用いる分化細胞に残存/混入した未分化細胞の検出、評価に利用できる。
＜配列番号１～１４＞
プライマーのDNA配列を示す。
プライマーのDNA配列を示す。
Claims (13)
- 下記の(i)～(iii)よりなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、未分化ｉＰＳ細胞を0.1%以下の検出感度で検出する方法。
(i)内胚葉の分化細胞集団における、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、
(ii)中胚葉の分化細胞集団における、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
(iii)外胚葉の分化細胞集団における、ESRG及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること - 内胚葉の分化細胞が、肝内胚葉細胞である請求項１記載の方法。
- 中胚葉の分化細胞が、横中隔間充織細胞、間葉系細胞又は血管内皮細胞である請求項１記載の方法。
- 外胚葉の分化細胞が、神経幹細胞、神経堤細胞又は神経細胞である請求項１記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する請求項１～４のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルをqPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry又は質量分析で測定する請求項１～５のいずれかに記載の方法。
- 下記の(ai)～(aiii)よりなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、安全性の高い未分化ｉＰＳ細胞を選別する方法。
(ai)ｉＰＳ細胞から分化誘導された内胚葉の分化細胞における、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、
(aii)ｉＰＳ細胞から分化誘導された中胚葉の分化細胞における、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
(aiii)ｉＰＳ細胞から分化誘導された外胚葉の分化細胞における、ESRG及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること - 下記の(bi)～(biii)よりなる群より選択される少なくとも１つの工程を含む、未分化ｉＰＳ細胞を検出する方法。
(bi)ｉＰＳ細胞から分化誘導された内胚葉の分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、
(aii)ｉＰＳ細胞から分化誘導された中胚葉の分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、及び
(aiii)ｉＰＳ細胞から分化誘導された外胚葉の分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること - 内胚葉又は中胚葉の分化細胞集団中に存在する未分化ｉＰＳ細胞を0.1%以下の検出感度で検出するために、ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。
- 外胚葉の分化細胞集団中に存在する未分化ｉＰＳ細胞を0.1%以下の検出感度で検出するために、ESRG及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。
- ESRG、SFRP2及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出可能な試薬を含む、内胚葉又は中胚葉の分化細胞集団中に存在する未分化ｉＰＳ細胞を0.1%以下の検出感度で検出するためのキット。
- ESRG及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出可能な試薬を含む、外胚葉の分化細胞集団中に存在する未分化ｉＰＳ細胞を0.1%以下の検出感度で検出するためのキット。
- 遺伝子の発現を検出可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である請求項１１又は１２に記載のキット。
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